KR100406268B1 - A therapeutical composition for angiogenesis-related diseases containing Arginine Deiminase - Google Patents

Abstract

본 발명은 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 사람의 혈관내피세포(HUVEC)를 이용한 모세혈관과 같은 관구조 형성 억제실험 및 혈관신생억제 효능을 측정하는 인 비보(in vivo) 어세이인 계태자융모요막(CAM) 어세이와 마우스 마트리젤 모델을 이용하여, 미코플라즈마 아르기니니(Mycoplasma arginini)로부터 정제하거나 유전자 재조합 방법으로 제조한 아르기닌 디이미네이즈가 혈관신생을 억제하는 작용이 있음을 밝혔다. 또한 제조된 아르기닌 디이미네이즈에 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 활성화된 고분자를 결합시킴으로써 반감기 증가 및 항원성을 감소시키면서 효과적으로 혈관신생을 억제할 수 있는 방법을 제시하였다.The present invention relates to a composition for treating diseases caused by angiogenesis with an arginine diimide as an active ingredient. Arginine purified from Mycoplasma arginini or prepared by genetic recombination using an in vivo assay to measure efficacy, using a CAM assay and a mouse Matrigel model Diimidase has been shown to act to inhibit angiogenesis. In addition, by binding an activated polymer such as polyethylene glycol (PEG) to the prepared arginine diimides has been proposed a method that can effectively inhibit angiogenesis while increasing half-life and antigenicity.

Description

아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물{A therapeutical composition for angiogenesis-related diseases containing Arginine Deiminase}A therapeutical composition for angiogenesis-related diseases containing Arginine Deiminase}

본 발명은 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for the treatment of diseases caused by angiogenesis comprising arginine diimides as an active ingredient.

혈관신생(Angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정으로, 정상적으로는 배아의 발달(embryonic development)시, 상처의 치유, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화때만 일어나며 그 외의 정상적인 조건에서는 거의 일어나지 않는 현상이다. 그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못할 때 계속 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있는데, 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증이 있고 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염등이 있으며, 관절염과 같은 만성 염증성 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환이 있으며, 종양에서 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다(Ophthalmol 102, 1261-1262, 1995; J Am Acad Derm 34(3):486-497, 1996; Circultion 93(4):632-682, 1996; Cell 86: 353-364, 1996).Angiogenesis is a process in which new capillaries are formed from existing microvascular vessels. Normally, they occur only during embryonic development, wound healing, and periodic changes in the female genital system. It rarely happens. However, there are diseases caused by continuous pathological growth when angiogenesis is not controlled autonomously. Diseases related to angiogenesis in pathological conditions include hemangioma, angiofibroma, angioplasty and cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, angiogenesis, Ophthalmologic diseases caused by edema and angiogenesis include corneal graft angiogenesis, neovascular glaucoma, diabetic retinopathy, neovascularized corneal disease, spot degeneration, pterygium, retinal degeneration, posterior capsular fibrosis, granuloconjunctivitis And chronic inflammatory diseases such as arthritis, psoriasis, capillary dilatation, purulent granulomas, seborrheic dermatitis, acne, and dermatological diseases such as acne. Cancer growth and metastasis in tumors are dependent on angiogenesis (Ophthalmol 102, 1261-). 1262, 1995; J Am Acad Derm 34 (3): 486-497, 1996; Circultion 93 (4): 632-682, 1996; Cell 86: 353-364, 1996).

혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성, 이로 인한 혈관의 재구성을 수반한다. 혈관신생은 생리적으로는 황체형성이나 태반형성의 경우에 나타나는 것이고, 비정상적인 혈관신생으로 인한 질병은 상기 여러가지 질환의 발병이나 진행과정에 깊이 관련되어 있다. 따라서, 이들 질환의 예방 또는 치료를 위하여 혈관생성을 억제하는 물질을 찾아내려는 연구가 활발히 진행되고 있다.The process in which angiogenesis occurs usually involves degradation of the vascular basement membrane due to proteases, migration of vascular endothelial cells, formation of lumen by proliferation and differentiation of vascular endothelial cells, and thereby reconstitution of blood vessels. Angiogenesis occurs physiologically in the case of corpus luteum formation or placental formation, and diseases due to abnormal angiogenesis are deeply related to the development or progression of the various diseases. Therefore, studies are actively underway to find substances that inhibit angiogenesis for the prevention or treatment of these diseases.

염증성 질환으로 대표적인 관절염은 자가면역 이상이 원인이나 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하여 싸이토카인의 도움으로 활액세포와 혈관내피세포가 활액강에서 증식하여 관절판누스를 형성하여 관절의 쿠션역할을 하는 연골과 같은 정상조직을 파괴하며 병이 진행된다(Koch AE , Polverini PJ and Leibovich SJ; Arth Rheum 29, 471-479(1986) : Stupack DG,Storgard CM and Cheresh DA; Braz J Med Biol Res 32, 578-581(1999) : Koch AE; Atrhritis Rheum 41, 951-962(1998)).Arthritis, a representative inflammatory disease, is caused by autoimmune abnormalities, but as the disease progresses, chronic inflammation in the synovial cavity between the joints induces angiogenesis. The disease progresses by destroying normal tissues such as cartilage, which acts as a cushion for joints (Koch AE, Polverini PJ and Leibovich SJ; Arth Rheum 29, 471-479 (1986): Stupack DG, Storgard CM and Cheresh DA). Braz J Med Biol Res 32, 578-581 (1999): Koch AE; Atrhritis Rheum 41, 951-962 (1998).

해마다 전세계적으로 수백만명이 실명하게 되는 안과질환의 근본 원인 중의 하나는 혈관신생이다(Jeffrey MI and Takayuki A; J Clin Invest 103, 1231-1236(1999)). 노인에게 일어나는 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장과 각막성 신생혈관과 같은 질병은 적어도 부분적으로는 혈관신생이 원인이 되는 질병들이다(Adamin AP, Aiello LP and D'Amato RA; Angiogenesis 3, 9-14(1999)). 그 중 당뇨병성 망막증은 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 것이다.Angiogenesis is one of the root causes of ocular disease that causes millions of blindness worldwide each year (Jeffrey MI and Takayuki A; J Clin Invest 103, 1231-1236 (1999)). Diseases such as macular degeneration, diabetic retinopathy, retinopathy of premature infants, neovascular glaucoma and corneal neovascularization in the elderly are at least partly caused by angiogenesis (Adamin AP, Aiello LP and D'Amato RA; Angiogenesis 3, 9-14 (1999)). Among them, diabetic retinopathy is a complication of diabetes, in which capillaries in the retina invade the vitreous body and eventually become blind.

눈은 가장 혈관이 없는 조직이어서 혈관이 성장하게 된다는 것은 실명을 의미한다. 혈관신생에 의한 안과 질환은 적당한 치료제가 없어 현재 스테로이드나 항생제를 사용하다가 더 진행되면 혈관을 소작(cautery)시키거나 광응혈(photocoagulation) 시키지만 효과가 일시적이며 혈관 증식을 막지 못하므로 재발하게 된다. 따라서 혈관신생을 막아야 근본적인 치료를 할 수 있다.The eye is the most bloodless tissue and the blood vessels grow, which means blindness. Ocular diseases caused by angiogenesis do not have a suitable treatment and currently use steroids or antibiotics and further progress to cautery or photocoagulation of blood vessels, but the effects are temporary and do not prevent blood vessel proliferation. Therefore, to prevent the angiogenesis can be a fundamental treatment.

붉은 반점과 인설의 피부가 특징인 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데 치유되지 않으며 고통과 기형을 수반한다. 정상인 경우 각질세포가 한 달에 한번 증식하는데 비해 건선 환자는 적어도 일주일에 한번 증식한다. 이런 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어 날 수밖에 없다(Folkman J; J Invest Dermatol 59, 40-48(1972)). 혈관신생 억제제는 이러한 건선의 새로운 치료제로 적용할 수 있다.Psoriasis, which is characterized by red spots and skin, is also a chronic proliferative disease of the skin. It does not heal and involves pain and malformations. In normal cases, keratinocytes proliferate once a month, whereas psoriasis patients proliferate at least once a week. This rapid proliferation requires a lot of blood supply and thus angiogenesis is active (Folkman J; J Invest Dermatol 59, 40-48 (1972)). Angiogenesis inhibitors can be applied as novel therapeutics for such psoriasis.

암세포의 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 암세포가 혈관신생을 하지 못하거나, 혈관으로 출입을 할 수 없으면 대부분의 암은 직경이 1∼2mm 이상을 넘게 자라지 못하고 원발성 위치에 국소화된 채로 남아 있을 것이다 (Folkman and Tyler; Cancer Invasion and metastasis: Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, 1977, PP:94-103).Angiogenesis of cancer cells plays an important role in the growth and metastasis of cancer cells. If cancer cells fail to angiate or enter and exit blood vessels, most cancers will not grow to more than 1 to 2 mm in diameter and remain localized in the primary position (Folkman and Tyler; Cancer Invasion and metastasis: Biologic mechanisms and Therapy (SB Day ed.) Raven press, New York, 1977, PP: 94-103).

암의 혈관신생은 고형의 암을 향하여 기존의 혈관들로부터 모세 혈관이 뻗어나가는 과정을 통하여 일어나며, 이를 전자 현미경으로 관찰하면 일정한 패턴을 볼 수 있는데, 암으로부터의 혈관 신생 자극에 대한 반응으로 기존의 혈관, 특히 모세 혈관후의 세정맥주위의 기저막이 분해되고, 그 다음은 혈관내피세포가 혈관으로부터 나와 암을 향해 이동한다. 이때 뒤에 따르는 세포는 DNA 합성과 세포분화를 하여 일단 미성숙한 새로운 혈관이 연장되면 가지를 만들고 혈관의 계제(loop)를 형성하면서 관형성의 과정을 거쳐 완전한 혈관조직망을 형성한다. 마지막으로 모세혈관이 기저막 또는 혈관주위 세포층에 의해 둘러 싸여져서 성숙한 모세혈관상을 형성한다(Ausprunk and Folkman; Microvasc Res 14, 53-65(1977); Burger, Chandler and Kintworth, Lab. Invest 48, 169-180(1983)).Angiogenesis of cancer occurs through a process in which capillaries extend from existing blood vessels toward solid cancer, which can be seen by electron microscopy, and a pattern is observed in response to angiogenesis stimulation from cancer. Blood vessels, particularly the basement membrane around the lavage after the capillary vessels, are broken down, and then vascular endothelial cells exit from the vessels and travel towards cancer. At this time, the cells followed by DNA synthesis and cell differentiation, once immature new blood vessels are extended, form branches and form a loop of blood vessels, forming a complete vascular network through tubular processes. Finally, the capillaries are surrounded by the basement membrane or perivascular cell layer to form mature capillary images (Ausprunk and Folkman; Microvasc Res 14, 53-65 (1977); Burger, Chandler and Kintworth, Lab. Invest 48, 169-). 180 (1983).

혈관신생은 종양에 두가지 중요한 역할을 하는데, 첫째는 일차종양과 전이된 이차종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 것이고, 둘째는 종양까지 침투한 신생 모세혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 주어 암세포가 온몸에 퍼져 전이(Metastasis)가 되게 한다. 전이란 암세포가일차 종양괴로부터 분리되어 해부학적으로 먼 곳에 있는 조직이나 장기에 착상하여 성장하는 현상이다[Sularbaker, Weingard and Roseman; Cancer Invasion and Metastasis(L.A. Liotta and I.R. Hart ed.) Boston, Nijhoff. 1982. PP 427-465]. 현재 임상에서는 암의 치료성적을 향상시키기 위하여 화학요법이나 면역요법들을 이용하고 있는데, 이러한 치료방법이 일부 종양에서 어느 정도 효과를 거두고는 있지만 암환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이때문이다. 암환자 사망의 주 원인은 전이이며, 혈관신생에 의해 암조직까지 침투한 혈관을 따라 전이가 일어나므로 혈관신생은 암의 성장과 전이에 필수적이다. 따라서 혈관신생을 억제하면 전이를 막을 수 있다.Angiogenesis plays two important roles in tumors: firstly, it provides the nutrition and oxygen needed for the growth and proliferation of primary and metastasized secondary tumors; It gives them a chance to get into and spread cancer cells all over the body to become metastasis. Metastasis is the growth of cancer cells from primary tumor masses and implanted into anatomically distant tissues or organs [Sularbaker, Weingard and Roseman; Cancer Invasion and Metastasis (L.A. Liotta and I. R. Hart ed.) Boston, Nijhoff. 1982. PP 427-465. Currently, the clinic is using chemotherapy or immunotherapy to improve the treatment outcome of cancer. Although these treatments have some effects in some tumors, they do not contribute to the survival rate of cancer patients. Because of the transition. The main cause of death of cancer patients is metastasis. Angiogenesis is essential for cancer growth and metastasis because metastasis occurs along the blood vessels that penetrate the cancer tissue by angiogenesis. Therefore, inhibiting angiogenesis can prevent metastasis.

그동안 발견 또는 합성된 혈관신생 억제제로서는 혈관 내피세포의 증식을 억제하는 미생물 대사산물 푸마길린(fumagillin)과 이의 유도체인 AGM-1470, 혈소판인자-4(Platelet factor-4)와 이의 합성 펩티드, 허비마이신 A(Herbimycin A), 콜라게나아제 활성을 억제하는 테트라사이클린계 항생물질 등이 알려져 있다.Angiogenesis inhibitors that have been discovered or synthesized in the past include microbial metabolite fumagillin and its derivatives AGM-1470, platelet factor-4 and its synthetic peptide, herbimycin, which inhibit the proliferation of vascular endothelial cells. A (Herbimycin A) and tetracycline antibiotics that inhibit collagenase activity are known.

아르기닌 디이미네이즈가 인비트로(in vitro) 또는 인비보(in vivo) 실험결과 암세포 성장억제에 효과가 있다는 보고들이 많이 있으나(Takaku et al., 1992; 1995; Komada et al., 1997; Misawa et al., 1994; Miyazaki et al., 1990; Sugimura et al., 1992) 새로운 혈관 생성, 즉 혈관신생에 연관되어 있다는 연구 보고는 아직까지 없었다.Arginine diimides have been reported to be effective in inhibiting cancer cell growth in vitro or in vivo (Takaku et al., 1992; 1995; Komada et al., 1997; Misawa et. al., 1994; Miyazaki et al., 1990; Sugimura et al., 1992). There have been no reports of new blood vessel formation, or angiogenesis.

본 발명은 최초로 아르기닌 디이미네이즈의 혈관신생 억제 용도를 밝혀내었다.The present invention has for the first time found the use of arginine diimides to inhibit angiogenesis.

또한 본 발명은 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하여 혈관신생과 관련된 질병의 예방 및 치료하는 방법으로 일반적으로 단백질을 의약품으로 사용함에 있어서 생물학적 반감기나 항원성등의 문제점을 해결하기 위하여 합성고분자와 결합시키는 것을 포함하고 있다.In addition, the present invention is a method of preventing and treating diseases related to angiogenesis by using arginine diimides as an active ingredient. In general, in order to solve problems such as biological half-life or antigenicity in using protein as a medicine, it is combined with synthetic polymers. It includes making it.

단백질은 체내 투여 후 쉽게 가수분해되거나 효소에 의해 단시간에 파괴되어 생체내 이용율이 낮으며, 반복 사용시 면역 반응이 유도되어 생성된 항체의 생리활성 중화작용으로 인해 생명을 위협할 정도의 과민 반응(hypersensitivity)이 유발될 뿐만 아니라 망상세포의 내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의한 소실(clearance)이 증가된다는 것이다.Proteins are easily hydrolyzed after in vivo administration or destroyed in a short time by enzymes, resulting in low bioavailability, and life-threatening hypersensitivity reactions due to the physiological neutralization of antibodies produced by inducing immune responses upon repeated use. ) Is not only induced but also increases the clearance caused by the reticuloendothelial system (RES) of reticular cells.

미국특허 제 4179337호는 펩타이드와 폴리펩타이드를 분자량이 500~20000 정도의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, 이하 "PEG"라 한다) 또는 수용성 폴리머에 결합시켜 생물학적 활성을 유지하면서 항원성과 항면역성이 감소된 펩타이드-고분자 결합체에 대해 언급하였다.U.S. Pat.No.4179337 discloses peptides with reduced antigenicity and anti-immunity while maintaining biological activity by binding peptides and polypeptides to polyethylene glycols having a molecular weight of about 500 to 20000 (hereinafter referred to as "PEG") or water-soluble polymers. -Polymer conjugates are mentioned.

아부초스키 등(Abuchowski et al., Cancer Biochem Biophys., 7, 175-186, 1984)은 PEG와 결합된 여러 가지 단백질들이 혈장에서 체내 반감기가 증가되고 면역원성이 감소됨을 증명하였으며, 또한 데이비스 등(Davis et al., Lancet, 2, 281-283, 1981)은 유리카제(uricase)가 PEG와 결합시에 체내 반감기가 증가되고 요산의 대사시 부작용이 감소됨을 증명하였다. 이러한 결과로부터 생물학적으로 활성이 있는 펩타이드나 단백질 물질에 대한 PEG 결합은 체내 반감기를 연장하고 용해도를 증가시키며 체내에서의 면역 반응을 감소시키는 효과를 가져올 수 있음이 확인되었다.Abuchowski et al., Cancer Biochem Biophys., 7, 175-186, 1984 demonstrated that PEG-binding proteins increase body half-life and decrease immunogenicity in plasma. (Davis et al., Lancet, 2, 281-283, 1981) demonstrated that uricase increases the half-life in the body when combined with PEG and reduces side effects in uric acid metabolism. From these results, it was confirmed that PEG binding to biologically active peptides or protein substances may have effects to prolong half-life in the body, increase solubility, and reduce immune responses in the body.

본 발명은 종래 항암 효과가 있는 것으로 알려져 왔으나 혈관신생 억제제로서 작용한다는 것이 밝혀지지 않았던 아르기닌 디이미네이즈의 혈관신생 억제작용을 최초로 밝혀냄으로써 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생과 관련된 다양한 종류의 질병의 예방 및/또는 치료제를 제공하려는 것이다.The present invention has been known to have an anti-cancer effect in the prior art, but by first revealing the angiogenesis inhibitory effect of arginine diimides, which have not been found to act as angiogenesis inhibitors, various types of angiogenesis involving arginine diimides as an active ingredient. It is intended to provide a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease.

또한, 본 발명은 아르기닌 디이미네이즈를 PEG와 같은 활성화된 고분자와 결합시킴으로써 생체 내로의 도입시 발생하는 면역원성 등의 문제점을 해결하여 PEG-아르기닌 디이미네이즈를 포함한 조성물을 관절염치료제 뿐아니라, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염 및 신생혈관에 의한 각막질환과 같은 혈관신생에 의한 안과질환의 치료제 및 혈관종, 혈관섬유종, 건선, 모세관확장증, 화농성육아증, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환과 항암제, 전이억제제 등 혈관신생에 의한 각종 질환의 예방 및/또는 치료제로 사용하려는 것이다.In addition, the present invention solves problems such as immunogenicity caused by incorporation of arginine diimides with activated polymers such as PEG, so that the composition containing PEG-arginine diimides to treat arthritis as well as diabetes Therapeutic and hemangiomas of ocular diseases such as retinopathy of premature infants, retinopathy of premature infants, neovascular glaucoma, degeneration, spot degeneration, pterygium, retinal degeneration, posterior capsular fibrosis, granulomatous conjunctivitis and neovascular disease It is intended to be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases caused by angiogenesis such as hemangiofibromas, psoriasis, capillary dilatation, purulent granulomatosis, seborrheic dermatitis, acne and anticancer agents and metastasis inhibitors.

도 1a는 사람의 혈관내피세포(HUVEC)의 관형성에 대한 아르기닌 디이미네이즈의 영향 실험 대조군(아르기닌 디이미네이즈 0㎍/㎖) 사진.Figure 1a is a photograph of the experimental control (arginine diiminease 0 ㎍ / ㎖) effect of arginine diiminase on the formation of human vascular endothelial cells (HUVEC).

도 1b는 사람의 혈관내피세포(HUVEC)의 관형성에 대한 아르기닌 디이미네이즈의 영향 실험(아르기닌 디이미네이즈 10㎍/㎖ 처리) 사진.1B is a photograph showing the effect of arginine diiminase on the formation of human vascular endothelial cells (HUVEC) (arginine diiminease treatment 10 μg / ml).

도 1c는 사람의 혈관내피세포(HUVEC)의 관형성에 대한 아르기닌 디이미네이즈의 영향 실험(아르기닌 디이미네이즈 1㎍/㎖ 처리) 사진.Fig. 1c is a photograph showing the effect of arginine diiminase on the formation of human vascular endothelial cells (HUVEC) (arginine diiminease 1 μg / ml treatment).

도 1d는 사람의 혈관내피세포(HUVEC)의 관형성에 대한 아르기닌 디이미네이즈의 영향 실험(아르기닌 디이미네이즈 0.4㎍/㎖ 처리) 사진.FIG. 1D is a photograph showing the effect of arginine diiminase on argonogenesis of human vascular endothelial cells (HUVEC) (arginine diiminase 0.4 μg / ml treatment). FIG.

도 2는 사람의 혈관내피세포(HUVEC)의 관형성에 대한 아르기닌 디이미네이즈의 억제능을 나타내는 그래프.Figure 2 is a graph showing the inhibitory ability of arginine diimides to the tubulation of human vascular endothelial cells (HUVEC).

도 3은 계태자 융모요막 어세이(CAM Assay)를 통해 재조합 아르기닌 디이미네이즈의 혈관신생 억제작용을 나타낸 사진.Figure 3 is a photograph showing the angiogenesis inhibitory effect of recombinant arginine diimides via a fetal calculus assay (CAM Assay).

도 4는 마우스 마트리젤 모델을 이용하여 재조합 아르기닌 디이미네이즈의 혈관신생 억제효능을 측정한 결과를 나타내는 그래프.Figure 4 is a graph showing the results of measuring the angiogenesis inhibitory effect of recombinant arginine diiminease using a mouse Matrigel model.

도 5는 미코플라즈마 아르기니니로부터 유래한 아르기닌 디이미네이즈를 PCR을 이용하여 돌연변이를 유발하는 과정을 도시한 것.Figure 5 illustrates the process of inducing mutations using arginine diimides derived from Mycoplasma arginini using PCR.

도 6은 도 5의 과정을 통하여 얻어진 아르기닌 디이미네이즈의 염기서열을 도시한 것.Figure 6 shows the nucleotide sequence of arginine diimides obtained through the process of FIG.

도 7은 SDS-PAGE를 통하여 과발현된 재조합 타이오레독신(thioredoxin) 결합 아르기닌 디이미네이즈(67 kDa) 및 정제된 재조합 아르기닌 디이미네이즈(45kDa)의 분자량을 측정한 사진.Figure 7 is a photograph measuring the molecular weight of recombinant thioredoxin binding arginine diimides (67 kDa) and purified recombinant arginine diimides (45 kDa) overexpressed via SDS-PAGE.

도 8은 네이티브 PAGE(Native-PAGE) 분석을 통하여 아르기닌 디이미네이즈가 90kDa의 이량체(dimer) 형태로 존재함을 확인하는 사진.8 is a photograph confirming that arginine diimides exist in the dimer form of 90kDa through native PAGE (Native-PAGE) analysis.

도 9는 pH 변화에 따른 재조합 아르기닌 디이미네이즈의 활성도 변화를 나타낸 것.Figure 9 shows the change in activity of recombinant arginine diimides with pH changes.

도 10은 온도 변화에 따른 재조합 아르기닌 디이미네이즈의 활성도 변화를 나타낸 것.Figure 10 shows the change in activity of recombinant arginine diimides with temperature changes.

도 11은 41℃에서의 재조합 아르기닌 디이미네이즈의 활성도 변화를 나타낸 것.Figure 11 shows the change in activity of recombinant arginine diimides at 41 ℃.

도 12a는 사람 혈관내피세포(HUVEC)의 관형성에 대한 PEG-아르기닌 디이미네이즈의 영향 실험 대조군(PEG-아르기닌 디이미네이즈 0 ㎍/㎖ 처리) 사진.FIG. 12A is a photograph of the experimental control (PEG-arginine diiminase 0 μg / ml treatment) effect of PEG-arginine diiminase on tubulation of human vascular endothelial cells (HUVEC). FIG.

도 12b는 사람 혈관내피세포(HUVEC)의 관형성에 대한 PEG-아르기닌 디이미네이즈의 영향 실험 (PEG-아르기닌 디이미네이즈 10 ㎍/㎖ 처리) 사진.12B is a photograph of the effect of PEG-arginine diimides (PEG-arginine diimides 10 μg / ml treatment) on the tubulation of human vascular endothelial cells (HUVEC).

도 13a는 사람 혈관내피세포(HUVEC)의 관형성에 대한 PEG-아르기닌 디이미네이즈의 영향 실험 (PEG-아르기닌 디이미네이즈 1 ㎍/㎖ 처리) 사진.FIG. 13A is a photograph showing the effect of PEG-arginine diiminase (PEG-arginine diiminease 1 μg / ml treatment) on tubular formation of human vascular endothelial cells (HUVEC).

도 13b는 2 mM 아르기닌 존재하에 사람 혈관내피세포(HUVEC)의 관형성에 대한 PEG-아르기닌 디이미네이즈의 영향 실험 (PEG-아르기닌 디이미네이즈 1 ㎍/㎖ 처리) 사진.FIG. 13B is a photograph showing the effect of PEG-arginine diimidase (PEG-arginine diminase 1 μg / ml treatment) on tubular formation of human vascular endothelial cells (HUVEC) in the presence of 2 mM arginine.

도 14는 계태자 융모요막 어세이(CAM Assay)를 통해 PEG-아르기닌 디이미네이즈의 혈관신생억제 작용을 나타낸 사진.Figure 14 is a photograph showing the angiogenesis inhibitory effect of PEG-arginine diimidase through the chick assay choryolysis (CAM Assay).

도 15는 마우스 마트리젤 모델을 이용하여 PEG-아르기닌 디이미네이즈의 혈관신생 억제효능을 측정한 결과를 나타내는 그래프.15 is a graph showing the results of measuring the angiogenesis inhibitory effect of PEG-arginine diimidase using the mouse Matrigel model.

본 발명은 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물, 더욱 바람직하게는 아르기닌 디이미네이즈는 미코플라즈마 속 미생물과 같은 미생물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention is a composition for the treatment of diseases caused by angiogenesis with an arginine diimide as an active ingredient, more preferably arginine diimides is a disease treatment by angiogenesis, characterized in that separated from microorganisms such as microorganisms of the genus Mycoplasma It relates to a composition for.

또한, 본 발명은 재조합 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물에 관한 것으로서, 바람직하게는 서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드, 그의 유도체 또는 그의 등가물에 의하여 코딩되는 재조합 아르기닌 디이미네이즈에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a composition for the treatment of diseases caused by angiogenesis, which comprises recombinant arginine diimides as an active ingredient, preferably a recombinant arginine diimide encoded by a polynucleotide of SEQ ID NO: 9, a derivative thereof or an equivalent thereof It's about naise.

본 발명의 또다른 구성은 분리되거나 재조합 방법으로 제조된 아르기닌 디이미네이즈에 PEG와 같은 활성화된 고분자를 결합시킴으로써 효과적으로 혈관신생을 억제할 수 있는 의약용 조성물에 관한 것이다.Still another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition capable of effectively inhibiting angiogenesis by binding an activated polymer such as PEG to an arginine diimise prepared by an isolated or recombinant method.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 미코플라즈마 아르기니니(Mycoplasma arginini)로부터 이온교환 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피 등을 이용하여 아르기닌 디이미네이즈를 정제하고 활성을 측정하였다.The present inventors purified arginine diimides and measured the activity from Mycoplasma arginini using ion exchange chromatography and adsorption chromatography.

또한, 본 발명자들은 미코플라즈마 아르기니니로부터 게놈 DNA를 분리하여 PCR을 수행한 후 유전자를 플라스미드 pBluescript KS(+)에 클로닝하였다. 이때 미코플라즈마 속 미생물에서의 특이한 트립토판 코돈을 대장균에서 과발현시키기 위하여 TGG로 바꾸어 주었다. 상기와 같이 얻어지고 검증된 아르기닌 디이미네이즈 유전자를 pET-32a 대장균 과발현 벡터에 클로닝하고 대장균(BL21)에 pET-32a/ADI를 삽입하여 형질변환된 대장균을 선별하고 대량 배양하였으며, 재조합 아르기닌 디이미네이즈를 과발현시키고 정제하였다.In addition, the present inventors performed PCR by separating genomic DNA from Mycoplasma arginini and cloned the gene into plasmid pBluescript KS (+). At this time, the tryptophan codon of the mycoplasma microorganism was changed to TGG to overexpress in E. coli. The obtained and tested arginine diminase gene was cloned into the pET-32a Escherichia coli overexpression vector, and pET-32a / ADI was inserted into Escherichia coli (BL21) to select transformed Escherichia coli and cultured in large quantities. Naze was overexpressed and purified.

또한, 정제되거나 재조합 방법으로 제조된 아르기닌 디이미네이즈와 활성화된 폴리에틸렌 글리콜을 교반하여 다양한 PEG-ADI 결합체를 제조하였다.In addition, various PEG-ADI conjugates were prepared by stirring purified arginine diimides and activated polyethylene glycol prepared by recombinant methods.

위와 같이 정제되거나 재조합된 아르기닌 디이미네이즈, PEG결합된 아르기닌 디이미네이즈의 혈관신생 억제효과를 측정하기 위하여 사람의 혈관내피세포에 의한 모세혈관과 같은 관구조 형성억제에 미치는 영향을 관찰하였다. 또한 혈관신생억제 효능을 측정하는 인비보 어세이인 계태자융모 요막(CAM) 어세이와 마우스 마트리젤 모델을 이용하여 아르기닌 디이미네이즈의 혈관신생 억제작용을 밝혀내었다.In order to measure the angiogenesis inhibitory effect of the purified or recombinant arginine diimides and PEG-bound arginine diimides as described above, the effect on the inhibition of the formation of capillaries such as capillaries by human vascular endothelial cells was observed. In addition, the angiogenesis inhibitory assay was performed using an in vivo assay to measure the effects of angiogenesis, and the mouse matrigel CAM assay and mouse matrigel model.

즉, 마트리젤을 젤화시킨 다음 마트리젤 위에서 사람의 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial cell;HUVEC)들을 배양하면 혈관형성의 한 과정으로 생각할 수 있는 관 형성이 일어나게 되는데, 이때 아르기닌 디이미네이즈를 10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 0.4 ㎍/㎖ 농도로 각각 처리하였을 때 관형성을 농도 의존적으로 강하게 억제하여 튜브를 형성한 세포들이 제대로 형체를 갖추지 못하는 결과를 보였다.In other words, after gelling Matrigel and culturing human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) on Matrigel, tube formation that can be thought of as a process of angiogenesis occurs, in which arginine diimides 10 When treated at concentrations of ㎍ / ㎖, 1 ㎍ / ㎖ and 0.4 ㎍ / ㎖, respectively, the tube-forming cells showed a strong concentration-dependent inhibition of tube formation, resulting in poor shape.

또한, 혈관신생을 측정하는 인 비보(in vivo) 실험인 계태자융모 요막(CAM) 어세이를 시행하여 아르기닌 디이미네이즈가 혈관신생을 억제하는 작용이 있음을 밝혔다.In addition, an in vivo experiment to measure angiogenesis was performed by the fetal calavaria ureter (CAM) assay, which revealed that arginine diimiase has an effect on inhibiting angiogenesis.

본 발명의 아르기닌 디이미네이즈는 혈관신생 의존성 질환의 예방 및 치료제로서 이용될 수 있다.The arginine diimides of the present invention can be used as a prophylactic and therapeutic agent for angiogenic dependent diseases.

상기와 같이 미생물로부터 정제되거나 유전자 재조합 방법으로 제조된 아르기닌 디이미네이즈, 또는 이들의 활성화된 고분자와 결합된 형태는 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 액제 등의 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시 증류수로 재조제하여 사용할 수 있는 주사용 건조분말 등의 주사용 제제, 연고제, 크림제, 액제 등의 국소적용형 제제, 서방성 제제 등 다양한 제제로 제형화시킬 수 있다. 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 담체로는 약제학적 분야에서 통상적인 것으로, 예를 들면 경구투여용 제제의 경우, 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등이 있으며, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Eaton PA]에 기재되어 있다. 이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 흉골내 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 또는 직장, 비측내, 흡입 및 안구내로 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.05 - 200 ㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.Arginine diimides, which are purified from microorganisms or prepared by genetic recombination as described above, or forms combined with activated polymers thereof, may be combined with a carrier generally acceptable in the pharmaceutical field, and purified by a conventional method. Preparations for oral administration such as powders, granules, suspensions and solutions, injectable solutions or suspensions, or injectable preparations such as dry powders for injection which can be reconstituted with distilled water at the time of injection, ointments, creams, solutions, etc. It can be formulated into a variety of formulations, such as topical formulations, sustained release formulations. Carriers that can be used in the compositions of the present invention are conventional in the pharmaceutical field, for example, for oral preparations, binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, Pigments or perfumes; and injections include preservatives, analgesics, solubilizers, stabilizers, and the like, and topical administration agents include bases, excipients, lubricants, and preservatives. Suitable formulations known in the art are described in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Eaton PA. Pharmaceutical preparations thus prepared may be administered orally as desired, or parenterally, i.e., administration or rectal, nasal, including intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intrasternal and intraarterial injections and infusions. It can be applied topically, by inhalation and intraocularly, and the dose can be administered in one to several doses of 0.05-200 mg / kg daily dose. Dosage levels for a particular patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, time of administration, method of administration, rate of excretion, severity of the disease, and the like.

또한, 본 발명에서는 아르기닌 디이미네이즈에 활성화된 고분자를 결합시켜 혈관신생억제에 효과를 갖는 물질을 제공하기 위하여 사용할 수 있는 고분자로는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol, PPG), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene, POE), 폴리트리메틸렌글리콜(polytrimethylene glycol), 폴리락트산(polylactic acid) 및 그 유도체, 폴리아크릴산 및 그 유도체, 폴리(아미노산), 폴리(비닐 알코올), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리포스파진(polyphosphazenes), 폴리(L-라이신)[poly(L-lysine)], 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide, PAO), 폴리사카라이드(polysaccharide) 등의 수용성 고분자 및 덱스트란(dextran), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리아크릴 아마이드(polyacryl amide) 등의 비면역성 고분자 중에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.In the present invention, the polymer that can be used to bind the activated polymer to the arginine diimide to provide a material having an effect on inhibiting angiogenesis, polyethylene glycol (polyethylene glycol, PEG), polypropylene glycol (polypropylene glycol, PPG), polyoxyethylene (POE), polytrimethylene glycol, polylactic acid and its derivatives, polyacrylic acid and its derivatives, poly (amino acids), poly (vinyl alcohol), polyurethane water-soluble polymers and dextran such as polyurethane, polyphosphazenes, poly (L-lysine), polyalkylene oxide (PAO), polysaccharide (non-immune polymers such as dextran, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol (PVA), polyacryl amide) One or more may be used.

본 발명에서는 분자량이 약 200 내지 100000 범위에 있는 고분자를 반응에 사용할 수 있으며, 1000 에서 45000 범위의 분자량을 갖는 고분자를 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, a polymer having a molecular weight in the range of about 200 to 100000 can be used for the reaction, and it is preferable to use a polymer having a molecular weight in the range of 1000 to 45000.

본 발명의 단백질-고분자 결합체의 제조시, 사용하는 효소와 활성화된 고분자의 몰비는 약 1:1 내지 1:100이며, 1:1 내지 1:50인 것이 바람직하다. 또한, 효소 한 분자당 활성화된 고분자가 1 - 30개 결합된 펩타이드-고분자 결합체가 생성될 수 있다.In preparing the protein-polymer conjugate of the present invention, the molar ratio of the enzyme to be used and the activated polymer is about 1: 1 to 1: 100, preferably 1: 1 to 1:50. In addition, a peptide-polymer conjugate may be produced in which 1-30 activated polymers are bound per molecule of enzyme.

본 발명의 효소와 활성화된 고분자의 결합 반응은 반응온도 0 - 25 ℃, pH 6부터 pH 9정도의 0.1M 인산 완충용액(phosphate buffer)에서 수분 내지 12시간동안 진행된다.The coupling reaction between the enzyme and the activated polymer of the present invention is carried out for several minutes to 12 hours in a 0.1 M phosphate buffer at a reaction temperature of 0-25 ° C. and pH 6 to pH 9.

고분자의 활성화 방법은 먼저 고분자가 모노메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)[monomethoxy-polyethylene glycol), mPEG]과 같은 폴리알킬렌옥사이드(polyalkylene oxide, 이하 PAO라 한다)가 되도록 하고, 이 PAO의 다른 부분을 반응성을 가진 반응기로 전환하여 이루어진다. 활성화된 고분자는 라이신의 ε-아민기와 반응하여 펩타이드-고분자 결합체를 형성하며, 라이신의 아민기외에도 단백질 내의 카르복실기, 활성화된 카르보닐기, 산화된 당 및 메르캅토(mercapto)기가 고분자와의 접합 부분으로 사용될 수 있다.The method of activating the polymer is first to make the polymer be a polyalkylene oxide (hereinafter referred to as PAO) such as monomethoxy-polyethylene glycol (mPEG), and the other part of the PAO. Is converted to a reactive reactor. The activated polymer reacts with the ε-amine group of lysine to form a peptide-polymer conjugate, and in addition to the amine group of lysine, carboxyl groups, activated carbonyl groups, oxidized sugars, and mercapto groups in the protein are used as a junction with the polymer. Can be.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 좀더 구체적으로 설명하고자 한다. 아래의 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. The following examples illustrate the present invention and the scope of the present invention is not limited by the examples.

<실시예 1> 아르기닌 디이미네이즈의 정제Example 1 Purification of Arginine Diimidase

아르기닌 디이미네이즈를 미코플라즈마 아르기니니(Mycoplasma arginini)로부터 정제하기 위하여 미코플라즈마 아르기니니 배지로는 20% 말 혈청(horse serum), 2.5% 효모 추출물(yeast extract), 1% L-아르기닌을 포함하는 PPLO 브로쓰(broth)를 사용하였다.To purify arginine diimides from Mycoplasma arginini, mycoplasma arginini medium was treated with 20% horse serum, 2.5% yeast extract, 1% L-arginine. PPLO broth was used.

배양된 세포는 15,000g에서 20분동안 원심분리하여 침전시켰다. 침전된 세포는 30ml의 10mM 인산칼륨 완충용액(Potassium phosphate, pH7.0)에 부유시켜 같은 방법으로 2회 수세하였다.Cultured cells were precipitated by centrifugation at 15,000 g for 20 minutes. Precipitated cells were suspended in 30 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (Potassium phosphate, pH7.0) and washed twice with the same method.

마침내 얻어진 세포 침전물을 10ml의 10mM 인산칼륨 완충용액(pH7.0)에 현탁시킨 후 낮은 온도(ice bath)에서 15분동안 20kHz로 초음파처리(sonication)하고,원심분리하여 상층액을 취하여 정제과정에 들어갔다. 정제에 있어서의 모든 과정은 4℃ 콜드챔버(cold chamber)에서 시행하였다.Finally, the obtained cell precipitate was suspended in 10 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), sonicated at 20 kHz for 15 minutes at a low temperature (ice bath), centrifuged, and the supernatant was taken for purification. Went in. All procedures for purification were performed in a 4 ° C. cold chamber.

먼저 세포용출액(cell lysate)을 미리 10mM 인산칼륨 완충용액(pH7.0)으로 평형이 맞추어진 DEAE 음이온 교환수지 컬럼에 통과시켰다. 비특이적인 결합을 최소화하기 위하여 컬럼 용량의 최소 3배 정도로 수세하고, 0M∼1M NaCl로 염 농도구배(salt gradient)를 걸어 분획하였다. 각각의 분획들에 대하여 아르기닌 디이미네이즈 활성을 측정하여 활성이 있는 분획을 찾아내었다.First, the cell lysate was passed through a DEAE anion exchange resin column previously equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). To minimize nonspecific binding, the cells were washed at least three times the column volume, and fractionated by salt gradient with 0M to 1M NaCl. Arginine diiminase activity was measured for each fraction to find an active fraction.

활성이 있는 것으로 확인된 분획들을 모아 다시 0∼80% 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate)로 침전시켜 펠렛을 모았다. 이것을 1M 암모늄 설페이트에 녹인 후, 미리 1M 암모늄 설페이트로 평형이 맞추어진 페닐 세파로즈 컬럼(Phenyl sepharose column)을 통과시키고, 1M∼0M 암모늄 설페이트 역농도구배를 걸어 분획하였다. 각 분획에 대하여 활성을 측정하여 활성이 있는 분획을 모은 뒤 10mM 인산칼륨 완충용액에서 14시간 투석하였다.Fractions identified as active were collected and precipitated again with 0-80% ammonium sulfate to collect pellets. This was dissolved in 1M ammonium sulphate, passed through a phenyl sepharose column previously equilibrated with 1M ammonium sulphate, and fractionated by 1M-0M ammonium sulphate backwash. Activity was measured for each fraction, and the active fractions were collected and dialyzed for 14 hours in 10 mM potassium phosphate buffer.

이것을 미리 10mM 인산칼륨 완충용액에 평형되어진 아르기닌 세파로즈 흡착컬럼에 통과시키고 평형완충액으로 수세한 후, 0M ~ 1.5M NaCl로 염 농도구배를 걸었다. 얻어진 각각의 분획에 대하여 활성을 측정하고 아르기닌 디이미네이즈의 순수 정제를 확인한 후, 분획을 모아 울트라필트레이션 유니트(ultrafilteration unit;YM10)를 이용하여 농축 및 탈염하였다.This was passed through an arginine Sepharose adsorption column previously equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer, washed with equilibration buffer, and a salt concentration gradient was applied between 0M and 1.5M NaCl. Activity was measured for each of the obtained fractions and confirmed pure purification of arginine diimides. The fractions were collected, concentrated and desalted using an ultrafiltration unit (YM10).

<실시예 2> 아르기닌 디이미네이즈 활성 측정Example 2 Determination of Arginine Diimidase Activity

미코플라즈마 아르기니니 아르기닌 디이미네이즈는 아르기닌을 기질로 하여 이미노기(imine-group)를 떨어뜨리는 활성을 가진 효소로써, 그 산물로 시트룰린이 생성된다. 이러한 성질을 이용하여 생성된 시트룰린의 양을 측정함으로, 아르기닌 디이미네이즈의 활성을 간접적으로 측정할 수가 있다.Mycoplasma arginine arginine diiminase is an enzyme having an activity of degrading imine groups by arginine as a substrate, and the product produces citrulline. By measuring the amount of citrulline produced using this property, it is possible to indirectly measure the activity of arginine diimidase.

아르기닌 디이미네이즈에 의해 생성된 시트룰린의 양을 발색반응을 통하여 측정하는 방법은 Boyde와 Rahmatulah(1980)의 방법을 사용하였다. 0.1ml의 효소용액에 0.1M 인산칼륨 완충용액(pH7.0), 10mM L-아르기닌을 더하여 1ml의 반응용액을 만든 후, 37℃에서 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 반응액에 5%의 TCA 용액을 첨가하여 단백질을 제거하고(deproteinize) 원심분리하였다.A method of measuring the amount of citrulline produced by arginine diimides through color reaction was used by the method of Boyde and Rahmatulah (1980). 0.1M potassium phosphate buffer solution (pH7.0) and 10mM L-arginine were added to 0.1ml enzyme solution to make 1ml reaction solution, and the reaction was carried out at 37 ° C for 5 minutes. After the reaction, 5% TCA solution was added to the reaction solution to deproteinize and centrifuge.

상층액 중 0.1ml을 취하여 새 튜브에 옮긴 후 2ml의 acid ferric solution(550ml 이온제거수(deionized water), 200ml concentrated phosphoric acid, 250ml 황산, 150mg ferric chloride)와 1ml 다이아세틸 모녹심 용액(diacetyl monoxime solution; 5mg thiosemicarbazide, 50ml deionized water, 250mg diacetyl monoxime)을 첨가하고, 끓는 물에 5분동안 끓였다. 실온에서 5분간 식힌 후 530nm 파장에서 흡광도 값을 읽었다. 이때 1mM의 시트룰린 용액을 희석하여 스탠다드로 삼았다.Take 0.1 ml of the supernatant and transfer to a new tube. 2 ml of acid ferric solution (550 ml deionized water, 200 ml concentrated phosphoric acid, 250 ml sulfuric acid, 150 mg ferric chloride) and 1 ml diacetyl monoxime solution. 5 mg thiosemicarbazide, 50 ml deionized water, 250 mg diacetyl monoxime) was added and boiled in boiling water for 5 minutes. After cooling for 5 minutes at room temperature, absorbance values were read at a wavelength of 530 nm. At this time, 1 mM citrulline solution was diluted to be a standard.

미코플라즈마 아르기니니 600mg으로부터 총단백질 7mg을 회수하였으며, DEAE sepharose, Phenyl- 및 Arginine sepharose 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용하여 약 250㎍의 아르기닌 디이미네이즈를 정제하였다. 37℃에서 1분동안 1μmole의 아르기닌을 시트룰린으로 변화시키는데 요구되는 효소의 양을 1unit로 정의하였을 때정제된 아르기닌 디이미네이즈의 특이 활성도(specific activity)는 단백질 mg당 약 31.36unit를 나타내었다. 이 때 반응조건은 0.1M 인산칼륨 용액, pH 7.4, 10 mM L-아르기닌이었다.About 7 mg of total protein was recovered from 600 mg of mycoplasma arginini, and about 250 µg of arginine diimise was purified using DEAE sepharose, Phenyl- and Arginine sepharose column chromatography. When the amount of enzyme required to convert 1 μmole of arginine to citrulline for 1 minute at 37 ° C. was defined as 1 unit, the specific activity of the purified arginine diimidase was about 31.36 units per mg protein. At this time, the reaction conditions were 0.1M potassium phosphate solution, pH 7.4, 10 mM L-arginine.

<실시예 3> 재조합 아르기닌 디이미네이즈의 제조Example 3 Preparation of Recombinant Arginine Diimidase

1. 아르기닌 디이미네이즈 유전자의 코돈 사용(codon usage) 전환1. Codon Usage Conversion of Arginine Diimidase Gene

미코플라즈마 아르기니니(Mycoplasma arginini)로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하여, 아르기닌 디이미네이즈의 특이 프라이머(specific primer)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; 이하 "PCR"이라 함)을 수행한 후, pBluescript KS(+)에 클로닝하였다.Genomic DNA is isolated from Mycoplasma arginini and polymerase chain reaction (PCR) using specific primers of arginine diimides . Was carried out and cloned into pBluescript KS (+).

미코플라즈마에서의 코돈 사용(codon usage)은 특이하게도 TGA 정지코돈(stop codon)을 트립토판(Trp)으로 인식하며(Misawa et al., 1994), 대장균(E. coli)에서 과발현시키기 위하여 TGA 코돈을 대장균(E. coli)의 트립토판(Trp) 코돈인 TGG로 바꾸어 주었다.Codon usage in mycoplasma specifically recognizes TGA stop codons as tryptophan (Trp) (Misawa et al., 1994), and TGA codons for overexpression in E. coli . E. coli tryptophan (Trp) codon was converted to TGG.

아르기닌 디이미네이즈 유전자에는 총 5군데의 TGA 코돈이 있으며 이중 마지막 TGA 코돈은 처음 PCR 수행시 3'-프라이머에 삽입함으로 미리 변이(mutation)시켰다. 나머지 4군데의 TGA 변이를 위하여 변이시킬 위치를 포함하는 각각의 안티센스(antisense) 및 센스(sense) 올리고누클레오타이드를 총 8가지 합성하여 오버랩 익스텐션(overlap extension) 방법(Steffan et al., 1989)으로 PCR을 이용한 위치지정 변이(site-directed mutagenesis)를 시행하였다. 최종적으로 얻어진 산물은pBluescript KS(+)에 클로닝하고, 정확한 변이 및 다른 점변이(point mutation)를 확인하기 위하여 DNA 서열결정(sequencing)을 실시하여 검증하였으며(도 6, 서열번호 9), 프라이머 서열은 다음과 같다.There are a total of five TGA codons in the arginine diminase gene, of which the last TGA codon was previously mutated by inserting the 3'-primer in the first PCR. A total of eight antisense and sense oligonucleotides, each containing a position to be mutated for the remaining four TGA mutations, were synthesized in total by the overlap extension method (Steffan et al., 1989). Site-directed mutagenesis using PCR was performed. The final product was cloned into pBluescript KS (+) and verified by DNA sequencing to confirm correct and other point mutations (FIG. 6, SEQ ID NO: 9), primer sequence Is as follows.

#1 sense; 5'-AAACTAATTAACACCCCGTGGTACTACGACCCTT-3'(서열번호 1)# 1 sense; 5'-AAACTAATTAACACCCCGTGGTACTACGACCCTT-3 '(SEQ ID NO: 1)

antisense; 5'-AAGGGTCGTAGTACCACGGGGTGTTAATTAGTTT-3'(서열번호 2)antisense; 5'-AAGGGTCGTAGTACCACGGGGTGTTAATTAGTTT-3 '(SEQ ID NO: 2)

#2 sense; 5'-GCAATTAACGTTCCGAAATGGACCAACTTAATGCACT-3'(서열번호 3)# 2 sense; 5'-GCAATTAACGTTCCGAAATGGACCAACTTAATGCACT-3 '(SEQ ID NO: 3)

antisense; 5'-AGTGCATTAAGTTGGTCCATTTCGGAACGTTAATTGC-3'(서열번호 4)antisense; 5'-AGTGCATTAAGTTGGTCCATTTCGGAACGTTAATTGC-3 '(SEQ ID NO: 4)

#3 sense; 5'-ATGCACTTAGACACCTGGCTGACCATGTTAGACAAG-3'(서열번호 5)# 3 sense; 5'-ATGCACTTAGACACCTGGCTGACCATGTTAGACAAG-3 '(SEQ ID NO: 5)

antisense; 5'-CTTGTCTAACATGGTCAGCCAGGTGTCTAAGTGCAT-3'(서열번호 6)antisense; 5'-CTTGTCTAACATGGTCAGCCAGGTGTCTAAGTGCAT-3 '(SEQ ID NO: 6)

#4 sense; 5'-GTATTTAAATTCTGGGATTATGACTTAG-3'(서열번호 7)# 4 sense; 5'-GTATTTAAATTCTGGGATTATGACTTAG-3 '(SEQ ID NO: 7)

antisense 5'-CTAAGTCATAATCCCAGAATTTAAATAC-3'(서열번호 8)antisense 5'-CTAAGTCATAATCCCAGAATTTAAATAC-3 '(SEQ ID NO: 8)

2. 대장균에서의 과발현 및 정제 2 . Overexpression and Purification in Escherichia Coli

상기 검증된 아르기닌 디이미네이즈(ADI) 유전자를 대장균에서 과발현시키기 위하여 pET-32a 대장균 과발현 벡터(Novagen, USA)에 클로닝하였다(도 5). 대장균(BL21)에 pET32a/ADI("ADI"는 "아르기닌 디이미네이즈"의 약자로서 본 명세서에서 혼용함)를 삽입하여 형질 변환된 대장균을 선별한 후 이를 대량 배양하였다. IPTG(1mM)를 사용하여 재조합 아르기닌 디이미네이즈를 과발현하였으며, SDS-PAGE를 통하여 분자량이 약 63kDa이 됨을 확인하였다(도 7의 레인 a). 과발현된 재조합 아르기닌 디이미네이즈의 대부분이 불용체를 형성함을 확인하였고, 불용체를 모아 구아니딘-HCl(Guanidine-HCl)을 이용하여 변성시킨 후 장시간(48시간) 중화하였다.The validated arginine diminase (ADI) gene was cloned into pET-32a Escherichia coli overexpression vector (Novagen, USA) for overexpression in E. coli (FIG. 5). PET32a / ADI (“ADI” is an abbreviation of “arginine diiminase”) is inserted into Escherichia coli (BL21) to select transformed Escherichia coli, and then cultured them. Recombinant arginine diimides were overexpressed using IPTG (1 mM), and the molecular weight was confirmed to be about 63 kDa through SDS-PAGE (lane a in FIG. 7). It was confirmed that most of the overexpressed recombinant arginine diimides form insolubles, and the insolubles were collected and denatured using guanidine-HCl and neutralized for a long time (48 hours).

중화된 아르기닌 디이미네이즈 용액을 이온교환수지와 친화수지의 컬럼 크로마토그래피를 시행하여 분획화한 후 활성을 보이는 분획을 모았다. 모아진 활성 분획은 SDS-PAGE 분석을 통하여 대장균에서 최초 과발현된 아르기닌 디이미네이즈의 분자량과 다소 차이를 보이는, 분자량이 약 45kDa 정도가 되는 단백질의 순수 정제를 확인하였다(도 7의 레인 b).The neutralized arginine diminase solution was fractionated by column chromatography of an ion exchange resin and an affinity resin, and then fractions showing active activity were collected. The collected active fractions were confirmed by pure SDS-PAGE analysis of pure protein having a molecular weight of about 45 kDa, which is slightly different from the molecular weight of the first overexpressed arginine diminase in E. coli (lane b of FIG. 7).

정제된 아르기닌 디이미네이즈에 대하여 N-말단 아미노산 서열 분석을 통하여 pET-32a 벡터에서 유래한 S-Tag 내의 아미노산 서열중 일부분이 자아 절단된 형태임을 확인하였다. 또한 네이티브 PAGE(Native-PAGE) 및 겔 컬럼 크로마토그래피(Sephacryl S-100) 분석을 통하여 아르기닌 디이미네이즈가 90kDa의 이량체(dimer) 형태로 존재함을 확인하였다(도 8).N-terminal amino acid sequence analysis of the purified arginine diminase confirmed that a part of the amino acid sequence in the S-Tag derived from the pET-32a vector was self-cut. Native PAGE (Native-PAGE) and gel column chromatography (Sephacryl S-100) analysis showed that arginine diimides existed in the dimer form of 90 kDa (FIG. 8).

33 . 재조합 아르기닌 디이미네이즈의 활성 및 안정성 분석. Activity and Stability Analysis of Recombinant Arginine Diimidase

정제된 재조합 아르기닌 디이미네이즈의 활성 측정은 아르기닌을 기질로 생성된 시트룰린의 양을 측정하는 방법을(Boyde et al., 1980) 사용하였고 재조합 아르기닌 디이미네이즈 는 미코플라즈마로부터 정제된 아르기닌 디이미네이즈와 비슷한 활성을 보였으며, pH7.4의 20mM 인산 칼륨 등장액 조건에서 최적 온도는 41℃ (도 9), 최적 pH는 6.4 (도 10)가 됨을 확인하였다. 또한, pH 7.4, 41℃조건에서48시간까지 70%의 안정성을 유지했다(도 11).Determination of the activity of purified recombinant arginine diimides was carried out using a method of measuring the amount of citrulline produced by arginine as a substrate (Boyde et al., 1980), and recombinant arginine diimides were purified arginine diimides from mycoplasma. It showed similar activity with, the optimum temperature was 41 ℃ (Fig. 9), the optimum pH was 6.4 (Fig. 10) under 20mM potassium phosphate isotonic acid pH 7.4 conditions. In addition, the stability of 70% was maintained for 48 hours at pH 7.4 and 41 degreeC conditions (FIG. 11).

<실시예 4> 마트리젤(Matrigel)에서 HUVEC 세포의 관형성에 대한 아르기닌 디이미네이즈의 영향Example 4 Effect of Arginine Diimidase on Tubular Formation of HUVEC Cells in Matrigel

혈관신생에 대한 효과를 간접적으로 알 수 있는 인비트로(in vitro) 실험으로써 사람의 혈관 내피세포에 의한 모세혈관과 같은 구조 형성에 미치는 영향을 관찰하였다. 관형성(Tube Formation) 실험을 시행하기 위하여 우선 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell) 세포를 얻는 실험을 시행하였다.In vitro experiments, indirectly indicative of the effects on angiogenesis, examined the effects of capillary-like structures on human vascular endothelial cells. In order to conduct a tube formation experiment, first, an experiment was performed to obtain human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) cells.

즉, 제왕절개수술로 얻은 신선한 사람의 탯줄에서 정맥의 내피세포를 분리한 후 혈관내피세포를 배양한 후 VIII 인자의 항체를 이용한 세포면역학적 염색으로 HUVEC 세포를 성공적으로 분리하였음을 확인한 후 이 분리된 혈관내피세포를 마트리젤(Matrigel)상에서 배양하였다. 마트리젤을 젤화시킨 다음 마트리젤 위에서 내피세포들을 배양하면 2차원적 관형성을 하는데, 37℃에서 16∼18시간 배양후에 관찰되는 망상의 관구조는 혈관형성의 한 과정으로 생각할 수 있으며, 이때 아르기닌 디이미네이즈를 10㎍/㎖, 1㎍/㎖ 및 0.4㎍/㎖ 농도로 각각 처리하였을 때 나타나는 결과를 관찰함으로써 아르기닌 디이미네이즈가 혈관신생에 미치는 영향을 간접적으로 확인하였다(도 2, 표 1). 이때 아르기닌 디이미네이즈는 실시예 1과 같이 미코플라즈마 아르기니니로부터 정제된 것을 사용하였다.In other words, the endothelial cells of the veins were isolated from the umbilical cord of fresh humans obtained by caesarean section, cultured vascular endothelial cells, and confirmed that HUVEC cells were successfully isolated by cytokinetic staining using antibody of factor VIII. Vascular endothelial cells were cultured on Matrigel. After gelling Matrigel and culturing endothelial cells on Matrigel, two-dimensional tubular formation occurs. The reticular tubular structure observed after incubation at 37 ° C. for 16-18 hours can be thought of as a process of angiogenesis. The effects of arginine diimides on angiogenesis were indirectly confirmed by observing the results of treatment of diimides at concentrations of 10 μg / ml, 1 μg / ml and 0.4 μg / ml, respectively (FIG. 2, Table 1). ). At this time, arginine diimides were used as purified from mycoplasma arginini as in Example 1.

아르기닌 디이미네이즈를 10㎍/㎖으로 처리하였을 때 관형성을 강하게 억제하여 튜브를 형성한 세포들이 제대로 형체를 갖추지 못하는 결과를 보였다(도 1b).아르기닌 디이미네이즈를 1㎍/㎖ 및 0.4㎍/㎖ 농도로 각각 처리하였을 때에도 대조군에 비해서 관형성을 억제하여 튜브가 끊어지는 것을 보였으며(도 1c, d참조), 형성된 튜브의 면적을 Image-Pro Plus(Media Cybernetics)로 분석하였을 때 대조군에 비하여 표1에서 보는 바와 같이 농도 의존적으로 관형성을 억제하였다.Treatment with arginine diimides at 10 μg / ml resulted in strong inhibition of tube formation, resulting in poorly shaped cells (FIG. 1B). Arginine diimides were 1 μg / ml and 0.4 μg. In the case of treatment at / ml concentration, the tube was inhibited by the inhibition of tube formation compared to the control group (see FIGS. 1C and d), and the area of the formed tube was analyzed in the control group when analyzed by Image-Pro Plus (Media Cybernetics). As shown in Table 1, the formation of the tube was inhibited in a concentration-dependent manner.

아르기닌 디이미네이즈의 농도Concentration of Arginine Diimidase 관형성 면적(%)Pipe formation area (%) 대조군Control 100100 0.4㎍/㎖0.4 µg / ml 75.775.7 1㎍/㎖1 µg / ml 28.128.1 10㎍/㎖10 µg / ml 15.815.8

<실시예5> 혈관신생을 측정하는 계태자융모 요막(CAM) 어세이Example 5 Congenital Villi Urinary (CAM) Assay for Measuring Angiogenesis

닭의 수정란을 습도 70% 이상, 온도 37℃의 항온항습기에서 3일간 부화시킨 후 알부민을 26게이지(gauge) 주사기로 2∼3ml 정도 뽑아내고 수분 증발을 막기 위해 투명 테이프로 봉한 다음 수정란 중앙부에 드릴로 크기 1 x 1 cm정도의 윈도우(window)를 만들었다. 실시예 3과 같이 재조합 방법으로 제조된 아르기닌 디이미네이즈 1㎍을 증류수 10㎕에 녹여 써마녹스 디스크(Thermanox disc; Miles Scientific사 제품)에 떨어뜨리고 건조시킨 다음 윈도우를 통해 노출된 융모요막 위에 올려 놓고 투명 테이프로 봉하고 37℃ 항온항습기에서 3일간 부화시켰다.Incubate the chicken eggs for 3 days in a thermo-hygrostat with a humidity of more than 70% and a temperature of 37 ° C, extract 2 to 3 ml of albumin with a 26-gauge syringe, seal it with transparent tape to prevent evaporation of water, and drill in the center of the fertilized egg. We made a window about 1 x 1 cm in size. 1 μg of arginine diiminase prepared by recombinant method in Example 3 was dissolved in 10 μl of distilled water, dropped onto a Thermanox disc (manufactured by Miles Scientific), dried, and placed on the exposed chorionic membrane through the window. Sealed with a transparent tape and incubated for 3 days in a 37 ℃ thermostat.

요막강내에 분포하는 혈관과 구분하기 위하여 26게이지 주사기를 이용하여인트라리피드(Intralipid)를 요막강 내에 주입하여 요막강내에 분포한 혈관을 가린 다음 융모요막에 분포한 혈관변화를 비교하였다.Intralipid was injected into the urea cavity by using a 26-gauge syringe to distinguish it from blood vessels distributed in the ureteral cavity, and the blood vessels distributed in the ureteral cavity were then compared.

그 결과 도 3에서 보는바와 같이 대조군은 수정란의 융모요막의 혈관신생이 영향받지 않았으나 아르기닌 디이미네이즈 1㎍에 의하여 모세혈관의 형성이 다른 부분에 비하여 현저히 억제되었음을 확인할 수 있었으며 아르기닌 디이미네이즈 1㎍을 사용하였을때 수정란의 88%가 혈관신생을 억제하였다.As shown in FIG. 3, the control group was not affected by angiogenesis of chorionic villus of fertilized egg, but it was confirmed that capillary formation was significantly inhibited by 1 ㎍ of arginine diiminease and 1 ㎍ of arginine diiminease. 88% of the fertilized eggs inhibited angiogenesis.

<실시예 6> 혈관신생을 측정하는 동물실험(마우스 마트리젤 모델)Example 6 Animal Experiments Measuring Angiogenesis (Mouse Matrigel Model)

혈관신생을 정량적으로 측정할 수 있는 동물실험인 마우스 마트리젤 모델(Mouse matrigel model)을 이용하여 아르기닌 디이미네이즈의 혈관신생억제 효능을 측정하였다. 6~8주의 C57BL/6 마우스에 마트리젤(Matrigel, Collaborative Biomedical Products사) 0.4ml와 혈관신생유도인자인 basic FGF(Fibroblast Growth Factor) 1-100ng/ml 및 헤파린 20-100units/ml 을 혼합하여 피하주사하면 강한 혈관신생이 유도된다. 이때 마트리젤에 실시예 3과 같이 재조합 방법으로 제조된 아르기닌 디이미네이즈를 마리당 8.9 ㎍ 함유시켜 아르기닌 디이미네이즈를 포함하지 않은 대조군과 비교하였다.Angiogenesis inhibitory efficacy of arginine diimidase was measured using a mouse matrigel model, an animal experiment capable of quantitatively measuring angiogenesis. Subcutaneously mix 6 ml of Matrigel (Matrigel, Collaborative Biomedical Products) with 1-100ng / ml of basic FGF (Fibroblast Growth Factor) and 20-100units / ml of heparin in 6-8 weeks C57BL / 6 mice. Injection causes strong angiogenesis. At this time, 8.9 μg of arginine diimidase prepared by the recombinant method in Matrigel was contained in maritrigel, and compared with the control group without arginine diimidase.

3~5일 후 표피를 제거하여 마트리젤을 조심스럽게 회수한 후 드랩킨시약(Drabkin reagent, Sigma)을 이용하여 헤모글로빈 함량을 측정한 결과 표 2에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 혈관신생을 강력히 억제하였다.After 3-5 days, the epidermis was removed to carefully collect the Matrigel, and then the hemoglobin content was measured using a Drabkin reagent (Sigma). As shown in Table 2, angiogenesis was strongly inhibited compared to the control group. .

구분division 헤모글로빈 함량(g/㎗)Hemoglobin content (g / ㎗) 대조군Control 66.4 ±27.666.4 ± 27.6 아르기닌 디이미네이즈Arginine Diimides 2.5 ±0.172.5 ± 0.17

<실시예 7> PEG5000-ADI의 제조Example 7 Preparation of PEG5000-ADI

아부초우스키 등(Abuchowskiet al,Cancer Biochem. Biophys.7, 175-86, 1984)의 방법에 따라 PEG(MW 5000)로부터 모노메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)을 제조하여 PEG의 하이드록시기 하나를 보호하고, 여기에 포스젠(phosgene) 및 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide)를 가하여 석시닐-N-하이드록시석신이미드 에스테르(succinyl-N-hydroxysuccinimide ester, 이하 SS-PEG라 한다)형으로 활성화 시켰다. 상기 활성화된 SS-PEG 2 mg을 0.1M 인산 완충용액(pH 8.0)에 용해시키고, 여기에 0.2 ml의 미코플라즈마 아르기니니로부터 정제하거나 유전자 재조합방법으로 제조한 아르기닌 디이미나제(이하ADI라 한다) 5mg/ml, 0.1 M 인산 완충용액, pH 8.0 를 가하여 실온에서 30분 동안 교반하였다. 0.1M의 글라이신(glycine)을 첨가하여 반응을 중단시킨 다음, 반응하지 않은 아르기닌 디이미네이즈와 PEG를 pH 7.4의 PBS(phosphate buffered saline)를 이용한 투석법(dialysis)으로 제거함으로써, PEG5000-ADI를 제조하였다.Monomethoxy-poly (ethylene glycol) was prepared from PEG (MW 5000) according to the method of Abuchowski et al , Cancer Biochem. Biophys . 7 , 175-86, 1984, and a hydroxyl group of PEG And succinyl-N-hydroxysuccinimide ester (hereinafter referred to as SS-PEG) by adding phosgene and N-hydroxysuccinimide thereto. Type). 2 mg of the activated SS-PEG was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0), and purified from 0.2 ml of mycoplasma arginine or prepared by genetic recombination, arginine diimiase (hereinafter referred to as ADI). 5 mg / ml, 0.1 M phosphate buffer and pH 8.0 were added and stirred at room temperature for 30 minutes. PEG5000-ADI was removed by adding 0.1 M glycine to stop the reaction and then removing unreacted arginine diminase and PEG by dialysis using PBS (phosphate buffered saline) at pH 7.4. Prepared.

<실시예 8> 가지형(Branched) PEG25000-ADI의 제조Example 8 Preparation of Branched PEG25000-ADI

Branched PEG2(MW 5000)COOH를 석시니미딜 석시네이트(succinimidyl succinate)로 활성화시키고, 활성화된 가지형 SS-PEG2 5 mg을 사용하여 branched PEG25000-ADI를 제조하였다. 모든 과정은 상기 실시예7 의 방법에 따라 수행되었다.Branched PEG2 (MW 5000) COOH was activated with succinimidyl succinate and branched PEG25000-ADI was prepared using 5 mg of activated branched SS-PEG2. All procedures were performed according to the method of Example 7 above.

<실시예 9> PEG220000-ADI의 제조Example 9 Preparation of PEG220000-ADI

Branched PEG2(MW 20000)COOH를 활성화시키고, 활성화된 branched PEG220000 10 mg을 사용하여 branched PEG220000-sCT를 제조하였다. 모든 과정은 상기 실시예7 의 방법에 따라 수행되었다. Branched PEG2 (MW 20000) COOH was activated and branched PEG220000-sCT was prepared using 10 mg of activated branched PEG220000. All procedures were performed according to the method of Example 7 above.

<실시예 10> pH에 따른 PEG-ADI의 제조Example 10 Preparation of PEG-ADI According to pH

pH 5 내지 pH 9의 0.1 M 인산 완충용액 각각에 6.8 l의 ADI(10 mg/ml)과 10 l의 SS-PEG5000 (10 mg/ml)을 첨가하고 30분 동안 실온에서 교반하였다. 1 M의 글라이신 5 l를 넣어 반응을 중단시키고, 반응하지 않은 ADI와 PEG를 pH 7.4의 PBS를 이용한 투석법으로 제거함으로써, PEG-ADI를 제조하였다.To each 0.1 M phosphate buffer, pH 5-9, 6.8 l of ADI (10 mg / ml) and 10 l of SS-PEG5000 (10 mg / ml) were added and stirred at room temperature for 30 minutes. 5 L of 1 M glycine was added to stop the reaction, and PEG-ADI was prepared by removing unreacted ADI and PEG by dialysis using PBS at pH 7.4.

<실시예 11> SS-PEG/ADI 몰비에 따른 PEG-ADI의 제조Example 11 Preparation of PEG-ADI According to SS-PEG / ADI Molar Ratio

6.8 l의 ADI(10 mg/ml)에 ADI:SS-PEG 몰비가 1:10, 1:20, 1:50, 1:100이 되도록 SS-PEG용액 10 l를 첨가하여 4개의 반응물을 만들었다. 모든 과정은 상기 실시예7 의 방법에 따라 수행되었다.Four reactants were prepared by adding 10 l of SS-PEG solution to 6.8 l of ADI (10 mg / ml) such that the ADI: SS-PEG molar ratio was 1:10, 1:20, 1:50, 1: 100. All procedures were performed according to the method of Example 7 above.

<실시예 12> PEG-ADI의 효소 활성측정Example 12 Determination of Enzyme Activity of PEG-ADI

상기 실시예 7 에서 11 까지 제조한 PEG-ADI의 효소활성을 측정하기 위하여 실시예3 과 동일한 방법으로 효소활성을 측정한 결과 PEG-ADI는 아르기닌 디이미네이즈의 효소활성을 모두 PEG를 결합시키기 전의 아르기닌 디이미네이즈가 가졌던 효소활성의 80% 이상을 가지고 있었으며 이들 PEG-ADI가 혈관신생억제 활성을 가지고 있는지 확인하기 위하여 이중 가장 대표적인 PEG5000-ADI를 가지고 혈관신생억제 실험을 진행하였다.In order to measure the enzyme activity of PEG-ADI prepared in Examples 7 to 11, the enzyme activity was measured in the same manner as in Example 3, and PEG-ADI was used to determine the enzymatic activity of arginine diimidase before binding PEG. At least 80% of the enzyme activity of arginine diimides was examined. Angiogenesis inhibition experiments were conducted with PEG5000-ADI to determine whether PEG-ADI had angiogenesis inhibitory activity.

<실시예 13> PEG-ADI의 HUVEC 세포의 관형성에 대한 영향Example 13 Effect of PEG-ADI on Tubulation of HUVEC Cells

사람의 혈관내피세포(HUVEC)를 젤화시킨 마트리젤(Matrigel)상에서 배양시킬 때 PEG-ADI를 10㎍/㎖ 을 처리하여 37℃에서 16∼18시간 배양후에 내피세포들의 망상의 관형성을 관찰한 결과 아르기닌 디이미네이즈에 고분자 PEG를 결합시킨 PEG-ADI는 10㎍/㎖ 농도로 각각 처리하였을 때 관형성을 강하게 억제하여 튜브를 형성한 세포들이 대조군에 비하여 제대로 형체를 갖추지 못하는 결과를 보였다(도 12a, 12b). 또한 PEG-ADI를 1㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때에도 관형성을 강하게 억제하였으며, PEG-ADI에 의한 관형성 억제가 세포의 NO의 기질인 아르기닌을 고갈시킴으로서 억제하는 것인가를 확인하기 위하여 1㎍/㎖의 PEG-ADI를 처리할 때 함께 아르기닌 2mM을 첨가하였을때는 관형성 억제효과가 반전되어 대조군과 비슷한 관형성을 하였다(도 13a, 13b).When culturing human vascular endothelial cells (HUVEC) on gelled Matrigel, PEG-ADI was treated with 10 µg / ml, and the endothelial tube formation was observed after 16-18 hours at 37 ° C. As a result, PEG-ADI, in which polymer PEG was bound to arginine diiminase, strongly inhibited tube formation when treated at 10 μg / ml concentration, resulting in poor tube formation compared to the control group. 12a, 12b). In addition, when PEG-ADI was treated at a concentration of 1 μg / ml, the tube formation was strongly inhibited, and the inhibition of the formation of PEG-ADI by depletion of arginine, which is a substrate of NO in cells, was confirmed to be 1 μg / ml. When 2 mM arginine was added together with the treatment of ml-PEG-ADI, the inhibitory effect on the formation of tubules was reversed, resulting in similar tubular formation (Figs. 13A and 13B).

<실시예 14> PEG-ADI의 계태자융모 요막(CAM) 어세이Example 14 Fetal Villi Urinary (CAM) Assay of PEG-ADI

PEG-ADI의 혈관신생 억제효능을 측정하는 생체내 어세이인 계태자융모 요막(CAM) 어세이를 실시예 5의 방법과 동일하게 시행하였다. 대조군으로생리식염수만 처리한 수정란은 모세혈관에 아무 변화가 없었으나 PEG-ADI 1 ㎍을 수정란에 처리한 것은 수정란의 81% (n=16)가 혈관신생을 억제하였다(도14).In vivo Assays to Measure the Angiogenesis Inhibitory Effect of PEG-ADI A fetal villi ureter (CAM) assay was performed in the same manner as in Example 5. In the fertilized eggs treated only with physiological saline as a control group, there was no change in capillaries, but when 1 μg of PEG-ADI was applied to the fertilized eggs, 81% (n = 16) of the fertilized eggs inhibited angiogenesis (FIG. 14).

<실시예 15> 동물실험 (마우스 마트리젤 모델)에서 PEG-ADI의Example 15 PEG-ADI in Animal Experiments (Mouse Matrigel Model)

혈관신생억제 효능Angiogenesis Inhibitory Effect

혈관신생을 정량적으로 측정할 수 있는 동물실험인 마우스 마트리젤 모델(Mouse matrigel model)을 이용하여 실시예 6과 동일한 방법으로 PEG-ADI의 혈관신생억제 효능을 측정하였다. 마트리젤에 PEG-ADI 를 마리당 2㎍을 함유시켜 대조군과 비교하였다. 3~5일 후 표피를 제거하여 헤모글로빈 함량을 측정한 결과 표 3 에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 혈관신생을 50% 정도 억제하였다(도15).Angiogenesis inhibitory efficacy of PEG-ADI was measured in the same manner as in Example 6 using a mouse matrigel model, an animal experiment capable of quantitatively measuring angiogenesis. Matrigel contained 2 μg PEG-ADI per horse compared with the control group. After 3-5 days, the epidermis was removed to measure the hemoglobin content. As shown in Table 3, angiogenesis was suppressed by 50% compared to the control group (FIG. 15).

구분division 헤모글로빈 함량(g/㎗)Hemoglobin content (g / ㎗) 대조군Control 212±187212 ± 187 PEG-ADIPEG-ADI 106±142106 ± 142

상기와 같이 사람의 혈관내피세포(HUVEC)를 이용한 관형성 및 계태자 융모요막 어세이(CAM), 동물실험인 마우스 마트리젤 모델을 통하여 미코플라즈마 아르기니니로부터 정제하거나 유전자 재조합방법으로 제조한 아르기닌 디이미나제 와 아르기닌 디이미네이즈에 PEG가 결합된 PEG-ADI 모두 혈관신생 억제 효능이 있음을 확인할 수 있었다.Arginine purified from mycoplasma arginini or manufactured by genetic recombination method through the use of human vascular endothelial cells (HUVEC) and tubular chorionic villus assay (CAM) and animal mouse mouse Matrigel model as described above. PEG-ADI, in which PEG-bonded diamines and arginine diimides, were found to be effective in inhibiting angiogenesis.

본 발명에 따른 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 함유하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물는 현저한 사람 혈관 내피세포의 관형성 억제작용을 나타내고, 인비보 어세이인 계태자융모요막 어세이와 마우스 마트리젤 모델에서도 현저한 혈관신생 억제효과를 나타내어 혈관신생-의존성 질환의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있으며 아르기닌 디이미네이즈를 PEG와 같은 활성화된 고분자와 결합시켜 단백질을 의약품화시킬 수 있다.Composition for the treatment of diseases caused by angiogenesis containing arginine diimides according to the present invention exhibits remarkable inhibitory effect on the formation of tubular endothelial cells of human vascular endothelial cells, and in vivo assays of the fetal calcinus choriocapillary assay and mouse matrigel In the model, it shows a significant inhibitory effect on angiogenesis, which can be useful for the prevention and treatment of angiogenesis-dependent diseases. In addition, arginine diimides can be combined with activated polymers such as PEG to pharmaceutic proteins.

Claims (9)

아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물.A composition for the treatment of diseases caused by angiogenesis comprising arginine diimides as an active ingredient. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물.According to claim 1, wherein the composition for the treatment of diseases by angiogenesis, characterized in that it contains a pharmaceutically acceptable carrier. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈관종, 혈관섬유종, 관절염, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름 등과 같은 혈관신생으로 인한 질환의 예방제, 치료제, 또는 전이 억제제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물.The hemangioma, hemangiofibrosis, arthritis, diabetic retinopathy, retinopathy of premature infants, neovascular glaucoma, corneal disease caused by neovascularization, degenerative plaques, degeneration of spots, pterygium, retinal degeneration, posterior lens A composition for the treatment of diseases caused by angiogenesis, characterized in that it is used as a prophylactic, therapeutic, or metastasis inhibitor for diseases caused by angiogenesis such as fibrosis, granuloconjunctivitis, psoriasis, capillary dilator, purulent granulomas, seborrheic dermatitis, acne and the like. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아르기닌 디이미네이즈는 미코플라즈마 속 미생물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물.The composition for treating diseases caused by angiogenesis according to claim 1 or 2, wherein arginine diimides are isolated from mycoplasma microorganisms. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아르기닌 디이미네이즈는 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물.The composition for treating diseases by angiogenesis according to claim 1 or 2, wherein arginine diimides are recombinant proteins. 삭제delete 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성화된 고분자를 결합한 것을 특징으로 하는 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물.The composition for treatment of disease by angiogenesis according to claim 1 or 2, wherein the activated polymer is bound to an arginine diimidase. 제7항에 있어서, 고분자로는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 폴리트리메틸렌 글리콜(polytrimethylene glycol), 폴리락트산(polylactic acid) 및 그 유도체, 폴리아크릴산 및 그 유도체, 폴리(아미노산), 폴리(비닐 알코올), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리포스파진(polyphosphazenes), 폴리(L-라이신)[poly(L-lysine)], 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide), 폴리사카라이드(polysaccharide), 덱스트란(dextran), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리아크릴 아마이드(polyacryl amide) 중에서 1 이상을 선택하는 것을 특징으로 하는 아르기닌 디이미네이즈를 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물.The method of claim 7, wherein the polymer is polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyethylene, polytrimethylene glycol, polylactic acid and derivatives thereof, Polyacrylic acid and its derivatives, poly (amino acid), poly (vinyl alcohol), polyurethane, polyphosphazenes, poly (L-lysine), poly (L-lysine), polyalkylene oxides ( at least one selected from polyalkylene oxide, polysaccharide, polysaccharide, dextran, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, and polyacryl amide A composition for the treatment of diseases by angiogenesis, comprising arginine diimides as an active ingredient. 제7항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 함유한 것을 특징으로 하는 혈관신생에 의한 질환 치료용 조성물.8. The composition for treating diseases caused by angiogenesis according to claim 7, which contains a pharmaceutically acceptable carrier.