KR100399377B1

KR100399377B1 - Method and assay device for analyzing gdnf protein

Info

Publication number: KR100399377B1
Application number: KR10-2001-7003851A
Authority: KR
Inventors: 팍스게리엠; 웬두안치; 징슈키안
Original assignee: 암젠 인코포레이티드
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 2003-09-26
Also published as: KR100409099B1

Abstract

본 발명은 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)에 관한 것으로, 이 GDNF 는 중추신경계와 말초신경계의 다양한 세포 형태에 대하여 광범위한 스펙트럼의 생물학적 활성을 보이는 강력한 뉴로트로핀이다. 또한 본 발명은 GDNF 에 대해 높은 친화성을 갖는 수용체의 클로닝과 그것의 특징 및 GDNF 단백질의 분석 방법 및 검정 기구에 관한 것이다. 이 분자가 수용체계에서 맨 처음으로 공지된 성분이기 때문에 GDNF 수용체(GDNFR)라 명명되었다. 본원에는 GDNFR 단백질 산물의 핵산 서열과 아미노산 서열이 기술되어 있다. 시그널 펩티드 기능을 하는 소수성 도메인이 아미노 말단에서 발견되는 한편, 카르복시 말단의 제 2 소수성 도메인은 세포 막에 대한 수용체 결합에 관계한다. 막투과 도메인과 세포질 부위의 결핍은, GDNFR 이 막투과 시그널을 매개하기 위해 하나 또는 그 이상의 보조 분자를 필요로 함을 나타내는 것이다. GDNFR mRNA 는 신경계와 비 - 신경 조직에 광범위하게 분포하며, GDNF 분포와 유사하다.The present invention relates to glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), which is a potent neurotropin that exhibits a broad spectrum of biological activity against various cell types in the central and peripheral nervous systems. The present invention also relates to the cloning of receptors having high affinity for GDNF, its features and methods and assays for analyzing GDNF proteins. It was named GDNF receptor (GDNFR) because it is the first known component in the receptor system. Described herein are nucleic acid sequences and amino acid sequences of GDNFR protein products. Hydrophobic domains that function as signal peptides are found at the amino terminus, while the second hydrophobic domain at the carboxy terminus is involved in receptor binding to the cell membrane. The lack of a transmembrane domain and cytoplasmic site indicates that GDNFR requires one or more accessory molecules to mediate the transmembrane signal. GDNFR mRNA is widely distributed in the nervous system and non-neural tissues and is similar to the GDNF distribution.

Description

ＧＤＮＦ 단백질의 분석방법 및 검정 기구{METHOD AND ASSAY DEVICE FOR ANALYZING GDNF PROTEIN}METHOD AND ASSAY DEVICE FOR ANALYZING GDNF PROTEIN}

본 발명은 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF) 수용체에 관한 것이며, GDNF 수용체(GDNFR)를 코드하는 핵산과 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 GDNF 단백질의 분석방법 및 검정 기구에 관한 것이다.The present invention relates to glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) receptors and provides nucleic acid and amino acid sequences encoding the GDNF receptor (GDNFR). The invention also relates to methods of assay and assay of GDNF proteins.

신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자Glial cell line-derived neurotrophic factor

신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)는 원래 중뇌의 도파민작용성 신경원의 생존을 강화시키는 강력한 신경영양성 인자로서 랫 B49 세포로부터 분리하여 클로닝하였다[Lin 등의 Science, 260, 1130 - 1132, 1993 참조]. 최근의 연구에서는 이 분자가, 중추신경계와 말초신경계의 일부 신경원 형태에 대하여 영향을 미치는 등의 다른 다양한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 중추신경계(CNS)에 있어서, GDNF 는 포유동물의 안면과 척수 운동신경원의 축삭절단 - 유도 사멸을 막고[Li 등의 Proceedings Of The National Academy Of Sciences, U.S.A., 92, 9771 - 9775, 1995 ; Oppenheim 등의 Nature, 373, 344 - 346, 1995 ; Yan 등의 Nature, 373, 341 - 344, 1995 ; Henderson 등의 Science, 266, 1062 - 1064, 1994 ; Zurn 등의 Neuroreport, 6, 113 - 118, 1994 참조], 자연적으로 프로그램된 세포 사멸로부터 조류의 운동신경원을 보호하는 것으로 나타났다[Oppenheim 등의 1995 상기문헌 참조]. GDNF 를 국부 투여하면 축삭절단 - 유도 변성으로부터 흑질 도파민작용성 신경원을 보호하거나[Kearns 및 Gash, Brain Research, 672, 104 - 111, 1995 ; Beck 등의 Nature, 373, 339 - 341, 1995 참조], 신경독 - 유도 변성으로부터 흑질 도파민작용성 신경원을 보호하는 것으로 나타났다[Sauer 등의 Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A., 92, 8935 - 8939, 1995 ; Tomac 등의 Nature, 373, 335 - 339, 1995 참조]. 또한, GDNF 를 국부 투여하면 도파민작용성 신경원이 성장하고 도파민, 노르아드레날린 및 세로토닌 양이 증가하며 운동 동작이 향상되는 것으로 나타났다[Tomac 등의 1995 상기문헌 참조].Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) was originally cloned from rat B49 cells as a potent neurotrophic factor that enhances the survival of dopaminergic neurons in the midbrain [Lin et al. Science, 260, 1130-1132, 1993]. ]. Recent studies have shown that the molecule exhibits a variety of other biological activities, including effects on some neuronal types in the central and peripheral nervous systems. In the central nervous system (CNS), GDNF prevents axon-induced apoptosis of the facial and spinal motor neurons in mammals [Li et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences, U.S.A., 92, 9771-9775, 1995; Nature, 373, 344-346, 1995 by Oppenheim et al .; Yan et al. Nature, 373, 341-344, 1995; Science, 266, 1062-1064, 1994 to Henderson et al .; Zurn et al., Neuroreport, 6, 113-118, 1994], which have been shown to protect algae motor neurons from naturally programmed cell death (Oppenheim et al., 1995, supra). Topical administration of GDNF protects the choroidal dopaminergic neurons from axon-induced degeneration [Kearns and Gash, Brain Research, 672, 104-111, 1995; Nature, 373, 339-341, 1995, Beck et al., Have been shown to protect nitric dopaminergic neurons from neurotoxin-induced degeneration [Proceedings Of The National Academy Of Sciences USA, 92, 8935-8939, 1995]. ; See Nature, 373, 335-339, 1995 to Tomac et al.]. In addition, topical administration of GDNF has been shown to increase dopamine-functional neurons, increase dopamine, noradrenaline and serotonin levels, and improve motor activity (see Tomac et al., 1995, supra).

보다 최근에는, GDNF 가 뇌의 노르아드레날린성 신경원과 푸르키니에 세포에 대한 잠재적인 영양 인자인 것으로 보고되었다. 외생적으로 가한 GDNF 가 시험관내에서 푸르키니에 세포 배의 형태학적 분화와 생존을 효율적으로 강화시키는 반면에[Mount 등의 Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A., 92, 9092 - 9096, 1995 참조], GDNF 를 발현하는 섬유아세포를 전위적으로 이식하면 6 - 히드록시도파민 - 유도 변성을 막고 생체내 성숙한 노르아드레날린성 신경원의 표현형을 발현시켰다[Arenas 등의 Neuron, 15, 1465 - 1473, 1995 참조]. 말초신경계에서, GDNF 는 배근신경절(DRG)과 삼차신경절내 배의 감각신경원 소집단 뿐만 아니라절상신경절, 모양체신경절 및 교감신경절내 신경원의 생존을 돕는 것으로 나타났다[Trupp 등의 Journal Of Cell Biology, 130, 137 - 148, 1995 ; Ebendal 등의 Journal Of Neuroscience Research, 40, 276 - 284, 1995 ; Oppenheim 등의 1995 상기문헌 ; Yan 등의 1995 상기문헌 ; Henderson 등의 1994 상기문헌 참조]. 또한 GDNF 는 배양한 상경신경절(SCG) 신경원에서 혈관작용성 장 펩티드와 프리프로타치키닌 - A(preprotachykinin - A) mRNA 의 발현을 촉진시켜 SCF 신경원의 표현형에 영향을 미치고 속상구조 성장을 유도하는 것으로 보고되었다[Trupp 등의 1995 상기참조].More recently, GDNF has been reported to be a potential nutrient for brain noradrenaline neurons and Purkinie cells. While exogenous GDNF effectively enhances morphological differentiation and survival of Purkinie cell embryos in vitro (see Mount et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences USA, 92, 9092-9096, 1995), Transplantation of fibroblasts expressing GDNF prevented 6-hydroxydopamine-induced degeneration and expressed the phenotype of mature noradrenaline neurons in vivo (see Neuros, 15, 1465-1473, 1995). In the peripheral nervous system, GDNF has been shown to help the survival of neurons in the ganglion, ciliary and sympathetic ganglia, as well as in the sensory neuronal subpopulations of the dorsal root ganglia (DRG) and trigeminal ganglia (Trupp et al., Journal Of Cell Biology, 130, 137). 148, 1995; Journal of Neuroscience Research, 40, 276-284, 1995; 1995, supra, Oppenheim et al .; 1995, supra; See, 1994, Henderson et al., Supra. In addition, GDNF stimulates the expression of vascular functional intestinal peptides and preprotachykinin-A mRNAs in cultured SCG neurons, influencing the phenotype of SCF neurons and inducing the growth of pituitary structures. [Trupp et al. 1995 supra].

GDNF 는 신경계의 다수의 상이한 세포 형태와 구조에서 발현되었다. CNS 에서의 GDNF mRNA 발현은 흑질 도파민작용성 신경지배의 주요 표적인, 성장중인 랫과 성숙한 랫의 선조체 및 해마, 피질, 시상, 중격, 소뇌, 척수와 연수를 포함한 광범위한 다른 부위에서 역전사효소 폴리메라제 연쇄 반응법(RT - PCR)에 의해 관찰되었다[Arenas 등의 상기문헌 1995 ; Poulsen 등의 Neuron, 13, 1245 - 1252, 1994 ; Springer 등의 Experimental Neurology, 124, 401 - 412, 1993 ; Schaar 등의 Experimental Neurology, 124, 368 - 371, 1993 참조]. 인체의 경우 GDNF 전사물은 선조체에서도 검출되는데, 유미(caudate)에서 가장 많이 검출되고 피각에서는 보다 적은 양으로 검출되었다. 해마, 피질, 척수에서도 검출가능한 양이 나타났으나, 소뇌에서는 검출되지 않았다[Schaar 등의 Experimental Neurology,130, 387 - 393, 1994 ; Springer 등의 1994 상기문헌 참조]. 말초에서의 GDNF mRNA 는 생후 1 일된 랫의 DRG 와 SCG, 좌골신경 및 신생 쉬반 세포의 일차 배양액에서 발현되는 것으로 보고되었다[Trupp 등의 1995 상기문헌 ; Hoffer 등의 Neuroscience Letters, 182, 107 - 111, 1994 ; Henderson 등의 1994 상기문헌 ; Springer 등의 1994 상기문헌 참조]. 더욱이 최근의 연구에서, GDNF 전사물은 생후의 고환과 신장, 배의 위스커 패드, 위 및 피부를 포함한 비 - 신경원 조직 주변에서도 광범위하게 발현되는 것으로 나타났다. 배 근육, 부신과 지아 및 생후의 폐, 간과 난소에서도 보다 적은 수준의 발현이 검출되었다. 그러나 GDNF 의 비 - 신경원 발현에 대한 생물학적 중요성은 아직 분명하지 않다.GDNF has been expressed in many different cell types and structures of the nervous system. GDNF mRNA expression in the CNS is a major target of nitric dopaminergic neurodominance in the striatum of the developing and mature rats and in a wide variety of other sites, including the hippocampus, cortex, thalamus, septum, cerebellum, spinal cord and medulla. By chain reaction method (RT-PCR) [Arenas et al., 1995; Neuron, 13, 1245-1252, 1994; Poulsen et al .; Experimental Neurology, 124, 401-412, 1993; See Experimental Neurology, 124, 368-371, 1993 by Schaar et al.]. In humans, GDNF transcripts are also detected in striatum, most frequently detected in caudate and less in crust. Detectable amounts were also found in the hippocampus, cortex and spinal cord, but not in the cerebellum [Schaar et al. Experimental Neurology, 130, 387-393, 1994; Spring 1994 et al., Supra. Peripheral GDNF mRNA has been reported to be expressed in primary cultures of DRG and SCG, sciatic nerve and neoplastic Shivan cells in rats 1 day old [Trupp et al. 1995; Neuroscience Letters, 182, 107-111, 1994; 1994 by Henderson et al .; Spring 1994 et al., Supra. Furthermore, recent studies have shown that GDNF transcripts are widely expressed around non-neuronal tissues, including postnatal testes and kidneys, abdominal whisker pads, stomach and skin. Lesser levels of expression were also detected in the abdominal muscles, adrenal glands, and postnatal lungs, liver and ovaries. However, the biological significance for non-neuronal expression of GDNF is not yet clear.

GDNF 단백질 산물의 제조와 특징에 관한 상세한 설명은 1994년 5월 23일자로 제출된 미국 특허 출원 번호 제 08/182,183 호 및 그것의 모출원(또한 1992년 9월 17일자 출원된 PCT/US92/07888, WO 93/06116 및 공개 번호가 제 EP 610 254 호인 유럽 특허 출원 번호 제 92921022.7 호 참조)에 기술되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용한다. 부가적인 GDNF 단백질 산물은 1995년 9월 28일자 출원된 계류중인 미국 특허 출원 번호 제 08/535,681 호에 기술되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용한다. 본원에 사용한 바와 같이, 용어 'GDNF 단백질 산물' 은 생물학적으로 활성인 합성 또는 재조합 GDNF 단백질과 유사체를 비롯하여 화학적으로 변이시킨 그것의 유도체도 포함한다. GDNF 유사체에는 절두된 GDNF 단백질과 같은 결실 변이체 뿐만 아니라 GDNF 의 삽입 변이체와 치환 변이체가 포함된다. 또한 인체 GDNF 단백질과 실질적으로 상동인 GDNF 단백질도 포함된다.A detailed description of the preparation and characteristics of GDNF protein products can be found in US patent application Ser. No. 08 / 182,183 filed May 23, 1994 and its parent application (see also PCT / US92 / 07888, filed Sep. 17, 1992). , WO 93/06116 and publication number EP 610 254, European Patent Application No. 92921022.7), which is incorporated herein by reference. Additional GDNF protein products are described in pending US patent application Ser. No. 08 / 535,681, filed Sep. 28, 1995, which is incorporated herein by reference. As used herein, the term 'GDNF protein product' also includes chemically modified derivatives thereof, including analogs and biologically active synthetic or recombinant GDNF proteins. GDNF analogs include insertional and substitutional variants of GDNF, as well as deletion variants such as truncated GDNF proteins. Also included are GDNF proteins that are substantially homologous to human GDNF proteins.

GDNF 치료GDNF Treatment

GDNF 치료는 하나 또는 그 이상의 신경 세포 형태의 생존 및/또는 고유 기능을 위태롭게 하는 상태에서 야기되는 신경 손상 치료에 유용하다. 이러한 신경 손상은 매우 다양한 원인에 의해 발생할 수 있다. 신경 손상은 다음과 같은 이유로 인해 하나 또는 그 이상의 형태에서 발생할 것이다 : (1) 손상 부위 근처의 축삭 돌기 및/또는 신경세포체 변성의 원인이 되는 물리적 손상 ; (2) 발작처럼 신경계 일부에 대한 혈류의 일시적이거나 영구적인 중단 ; (3) 암치료를 위한 화학치료제(예를들어, 시스플라티눔) 또는 AIDS 치료를 위한 디데옥시사이티딘(ddc) 같은 신경독에 대한 의도적인 노출이나 우연적 노출 ; (4) 당뇨병이나 신기능부전 같은 만성 대사 질환 ; 또는 (5) 파킨슨병, 알쯔하이머병 및 근위축성측삭경화증(ALS)과 같은 신경변성 질환으로서 이는 특정 신경 집단의 변성에 의해 야기된다.GDNF therapy is useful for treating nerve damage resulting from conditions that jeopardize the survival and / or intrinsic function of one or more neuronal cell types. Such nerve damage can be caused by a wide variety of causes. Nerve damage may occur in one or more forms for the following reasons: (1) physical damage that causes axonal projections and / or neuronal cell degeneration near the site of injury; (2) temporary or permanent interruption of blood flow to parts of the nervous system, such as seizures; (3) intentional or accidental exposure to neurotoxins such as chemotherapeutic agents (eg, cisplatinum) for treating cancer or dideoxycytidine (ddc) for treating AIDS; (4) chronic metabolic diseases such as diabetes or renal failure; Or (5) neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis (ALS), which are caused by degeneration of certain nerve populations.

일부 연구에서는, GDNF 치료가 파킨슨병의 흑질 중 도파민작용성 신경원의 변성과 같은 신경변성 조건을 치료하는 데 특히 유용한 것으로 나타났다. 현재 유일한 파킨슨병 치료는 선조체에서 도파민 수준을 증가시킴으로써 이 질환의 정도를 경감시키는 것이다. GDNF 치료의 기대 효과는 단지 선조체내 도파민작용성 신경 말단에서 도파민작용성 신경전달을 증가시키는 것(증상 완화) 뿐만 아니라 변성 과정이 진행되는 것을 완화시키거나 심지어는 중지시키고 손상된 흑질선조체 경로를 복구하여 그 기능을 회복시키는 것이다. GDNF 는 또한 환자의 도파민작용성 신경 세포의 손상 형태나 부적절한 작용을 치료하는 데 사용할 수 있다. 이러한 손상이나 기능부전은 정신분열증이나 그외의 정신병에서 발생할 수 있다. 이러한 증상에 대한 유일한 치료는 징후에 의한 것이며 도파민 수용체나 도파민 흡수 부위에 작용하는 약물을 필요로 하는데, 이는 수용체 - 생산 신경원 집단을 자극하는 도파민작용성 신경원의 부적절한 작용이 질병 진행에 관계한다는 사실과 양립된다.In some studies, GDNF treatment has been shown to be particularly useful for treating neurodegenerative conditions, such as the degeneration of dopaminergic neurons in the black matter of Parkinson's disease. Currently, the only treatment for Parkinson's disease is to reduce the extent of the disease by increasing dopamine levels in the striatum. The expected effect of GDNF treatment is not only to increase dopaminergic neurotransmission at the end of the striatum dopaminergic nerve endings (mitigate symptoms), but to mitigate or even stop the progression of the degeneration process and repair damaged impaired striatum To restore its function. GDNF can also be used to treat injured forms or inappropriate actions of dopamine functional neurons in a patient. This injury or dysfunction may occur in schizophrenia or other psychosis. The only treatment for these symptoms is symptomatic and requires drugs that act on the site of dopamine receptors or dopamine uptake, which suggests that improper action of dopamine-functional neurons that stimulate receptor-producing neuronal populations is involved in disease progression. Compatible.

수용체Receptor

인슐린, 혈소판 유래 성장 인자, 상피 성장 인자와 그것의 상관물, 섬유아세포 성장 인자, 다양한 인터루킨, 조혈 성장 인자 및 모양체 신경영양 인자에 대한 수용체를 포함한 단백질 인자에 반응하고 그것에 대한 결합을 조절하는 다수의 수용체를 특정화하고 분자적으로 클로닝하였다[미국 제 5,426,177 호 참조]. 연구 결과, 일부 수용체가 다수의 (관련) 성장 인자에 결합할 수 있는 한편, 경우에 따라 동일한 인자가 다수의 (관련) 수용체에 결합하여 그것을 활성화시킬 수 있는 것으로 나타났다[예를들어, Lupu 등의 Science, 249 : 1552 - 1555, 1990 ; Dionne 등의 EMBO J., 9 : 2685 - 2692, 1990 ; Miki 등의 Science, 251 : 72 - 75, 1991 참조]. 대부분의 수용체는 단백질 인자를 특이하게 결합시키는 세포외 부분이나 도메인, 세포막을 메우는 막통과 도메인 및 수용체의 세포외 부분에 대한 단백질 인자의 결합으로 시그널 트랜스덕션이 시작되는 것에 관계하는 세포내 도메인을 갖는지에 따라 광범위하게 특정할 수 있다. 다수의 수용체가 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되지만, 다른 수용체는 높은 친화성을 갖는 그들의 단백질 인자와 결합하고 결합후에 기능적으로 반응할 수 있도록 둘 또는 그 이상의 개별적인 아단위를 필요로 한다[예를들어, Hempstead 등의 Science, 243 : 373 - 375, 1989 ; Hibi 등의 Cell, 63 : 1149 - 1157, 1990 참조].Multiple receptors that respond to and regulate binding to protein factors including insulin, platelet derived growth factors, epidermal growth factors and their correlates, fibroblast growth factors, various interleukins, hematopoietic growth factors, and ciliary neurotrophic factors Was characterized and molecularly cloned (see US 5,426,177). Studies have shown that some receptors can bind to multiple (related) growth factors, while in some cases the same factor can bind to and activate multiple (related) receptors [eg, Lupu et al. Science, 249: 1552-1555, 1990; EMBO J., 9: 2685-2692, 1990 to Dionne et al .; See Science, 251: 72-75, 1991 to Miki et al.]. Most receptors have extracellular domains or domains that specifically bind protein factors, transmembrane domains that fill the cell membrane, and intracellular domains that are involved in initiating signal transduction by binding of protein factors to the extracellular portion of the receptor. It can be specified broadly according to. Although many receptors consist of a single polypeptide chain, other receptors require two or more individual subunits to bind to their protein factors with high affinity and to functionally react after binding [eg, Hempstead Science, 243: 373-375, 1989; See Cell, 63: 1149-1157, 1990 by Hibi et al.].

주어진 수용체의 세포외 부분과 세포내 부분은 다른 수용체의 상응 부위와 공통적인 구조적 모티프를 공유하는데, 이것은 상이한 수용체 간의 진화론적·기능상 관계를 나타낸다. 이들은 전혀 상관이 없을 수도 있고 특정한 일반 도메인 구조의 반복적인 이용을 단순히 반영할 수도있다. 예를들어, 서로 관련되지 않은 인자와 결합하는 각각의 상이한 수용체는 그것의 세포외 부분내 '면역글로불린' 도메인을 사용하는 반면, 그외의 수용체는 그것의 인자 - 결합 부위에 '시토킨 수용체' 도메인을 사용한다[예를들어, Akira 등의 The FASEB J., 4 : 2860 - 2867, 1990 참조]. 세포외 결합 도메인이 다른 다수의 수용체(따라서 상이한 인자에 결합됨)는 인자 결합으로 활성화되는 티로신 - 특이 단백질 키나아제를 코드하는 관련 세포질내 도메인을 함유한다[예를들어, Ullrich 및 Schlessinger, Cell, 61 : 203 - 212, 1990 참조]. 시그널 트랜스덕션 과정을 '활성화시키는' 인자 - 결합에 의한 메카니즘은 수용체 티로신 키나아제인 경우 조차도 잘 인지되어 있지 않다. 세포내 도메인이 그 기능이 알려지지 않은 도메인을 코드하거나 결합 성분이 기능을 알 수 없는 제 2 단백질과 관련된 다른 수용체일 경우, 시그널 트랜스덕션의 활성화를 특정하여 기술할 수 없다.The extracellular and intracellular portions of a given receptor share common structural motifs with corresponding sites of other receptors, which represent evolutionary and functional relationships between different receptors. These may be irrelevant at all or may simply reflect the repetitive use of a particular general domain structure. For example, each different receptor that binds to factors that are not related to each other uses an 'immunoglobulin' domain in its extracellular portion, while other receptors use a 'cytokine receptor' domain at its factor-binding site. (See, eg, The FASEB J., 4: 2860-2867, 1990 by Akira et al.). Many receptors with different extracellular binding domains (and therefore bound to different factors) contain related intracellular domains that encode tyrosine-specific protein kinases that are activated by factor binding [eg, Ullrich and Schlessinger, Cell, 61 : 203-212, 1990]. Mechanisms by factor-binding that 'activate' the signal transduction process are not well recognized even in the case of receptor tyrosine kinases. If the intracellular domain codes for a domain whose function is unknown or the binding component is another receptor associated with a second protein whose function is unknown, the activation of signal transduction cannot be specified.

생체내 GDNF 의 작용 방식은 본 분야에서 분명하게 밝혀져 있지 않은데, 그 이유 중 하나는 GDNF 수용체에 대한 정보가 없기 때문이다. 두 연구팀은 각각 흑색질내 도파민작용성 신경원이 선조체 투여 [¹²⁵I] - 표지 GDNF 를 역수송할 수 있을 것이라고 밝혔다[Tomac 등의 Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America,92, 8274 - 8278, 1995 ; Yan 등의 1995 상기참조]. 척수 운동신경원, DRG 감각신경원 및 망막신경절의 B 층에 존재하는 신경원에 의한 [¹²⁵I] - GDNF 의 역수송 또한 관찰되었다. 이러한 역수송 현상은 모두 100 - 배 또는 그 이상 농도의 비표지 GDNF 에 의해 특이하게 저해되는데, 이것은 포화시킬 수 있는 수용체 - 매개 수송 과정임을 시사한다. 매우 낮은 농도의 시험관내에서, 재조합 GDNF 는 배양시킨 도파민작용성 신경원의 생존을 강화하고 도파민 흡수를 촉진시키는 것으로 나타났다. 이들 신경원에 대하여 관찰된 GDNF 의 반최대 유효 농도(EC₅₀)는 0.2 내지 1.6 pM 이다[Lin 등의 1993 상기참조]. 또한 GDNF 는 낮은 농도에서 분리되는 운동신경원의 생존을 촉진시키는 것으로 나타났다. 운동신경원에 대하여 보고된 GDNF 의 EC₅₀은 5 ~ 10 fM 으로서, 도파민작용성 신경원에 대한 EC₅₀보다 훨씬 낮다[Henderson 등의 1994 상기참조].The mode of action of GDNF in vivo is not clear in the art, as one of the reasons is that there is no information about the GDNF receptor. The two teams, respectively, found that dopaminergic neurons in the melanoma could reverse transport of striatum [ ¹²⁵ I] -labeled GDNFs [Tomac et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America, 92, 8274-8278]. , 1995; Yan et al., 1995, supra. Reverse transport of [ ¹²⁵ I] -GDNF by neurons present in the B layer of spinal motor neurons, DRG sensory neurons, and retinal ganglia was also observed. All of these back transport phenomena are specifically inhibited by 100-fold or higher concentrations of unlabeled GDNF, suggesting that this is a receptor-mediated transport process that can be saturated. In very low concentrations in vitro, recombinant GDNF has been shown to enhance the survival and promote dopamine uptake of cultured dopaminergic neurons. The half maximal effective concentration (EC ₅₀ ) of GDNF observed for these neurons is 0.2 to 1.6 pM (see, Lin et al., 1993, supra). GDNF has also been shown to promote survival of motor neurons isolated at low concentrations. The EC ₅₀ of GDNF reported for motor neurons is 5-10 fM, much lower than the EC ₅₀ for dopaminergic neurons (see above, Henderson et al. 1994).

이러한 관찰 결과는 총괄적으로 이들 세포에서 발현되는 GDNF 수용체가 매우 높은 리간드 결합 친화성을 가짐을 나타내는 것이다. TGF - β 군에 속하는 멤버와 유사하게, 상이한 세포 집단에 대하여 GDNF 가 여러 조직에 광범위하게 분포하고 다양한 생물학적 기능을 하는 것은 GDNF 에 대하여 상이한 형태의 수용체 또는 수용체 복합체가 존재함을 시사한다. E10 병아리의 교감신경원에 대한 [¹²⁵I] - GDNF 의 포화 정상 상태 결합과 경쟁적인 결합은, 이들 신경원이 도파민작용성 신경원과 운동신경원에서 관찰되는 부위와는 다른 GDNF 결합 부위를 가짐을 나타냈다. 이들 결합 부위에 대한 GDNF 의 반최대 포화 농도와 반최대 저해 농도는 1 ~ 5 nM 범위로 존재한다[Trupp 등의 1995 상기참조]. 마찬가지로, P1 랫 SCG 교감신경원의 생존을 돕는 GDNF 의 EC₅₀은 나노몰(nanomolar) 범위인 것으로 보고되었다[Trupp 등의 1995 상기참조].These observations collectively indicate that the GDNF receptors expressed in these cells have very high ligand binding affinity. Similar to members belonging to the TGF-β group, the wide distribution of GDNF in different tissues and different biological functions for different cell populations suggests that different forms of receptors or receptor complexes exist for GDNF. Competitive binding with saturation steady-state binding of [ ¹²⁵ I] -GDNF to sympathetic neurons of E10 chicks indicated that these neurons had different GDNF binding sites than sites observed in dopaminergic neurons and motor neurons. The half-maximal saturation and half-maximal inhibitory concentrations of GDNF for these binding sites exist in the range of 1 to 5 nM (see above, 1995 by Trupp et al.). Likewise, the EC ₅₀ of GDNF, which aids in the survival of P1 rat SCG sympathetic neurons, has been reported to be in the nanomolar range (see above in Trupp et al 1995).

GDNF 가 그 자신이 세포에 영향을 미칠 수 있도록 시그널 트랜스덕션을 활성화시키는 메카니즘을 보다 잘 이해하기 위하여, 이 단백질 인자에 대한 결합을 중재하고 이 인자에 반응하는 수용체를 확인하는 것이 바람직할 것이다. 또한 GDNF 치료일 경우, GDNF 시그널 트랜스덕션을 돕거나 촉진시키는 보조 분자의 생산을 확인하고 그것이 가능하도록 하는 것이 바람직하다. 더욱이, GDNF 에 대한 단백질 수용체를 확인함으로써 진단 용도로 적용할 수 있게 되는데, 예를들어 그들 각각이 GDNF 단백질 치료에 유용한 지를 결정하는 데 도움이 된다. 또한 GDNF 에 대한 단백질 수용체는, 수용체에 결합하여 원하는 생물학적 활성을 초래하는 부가적인 분자를 확인하는 검정에 있어서 핵심 성분일 수 있다.To better understand the mechanism by which GDNF activates signal transduction so that it can affect the cell itself, it would be desirable to identify receptors that mediate binding to and respond to these protein factors. In the case of GDNF treatment, it is also desirable to confirm and enable the production of auxiliary molecules that aid or promote GDNF signal transduction. Furthermore, identifying protein receptors for GDNF can be applied for diagnostic purposes, for example to help determine whether each of them is useful for GDNF protein treatment. Protein receptors for GDNF may also be a key component in assays that identify additional molecules that bind to the receptor and result in the desired biological activity.

본 발명은 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 도시한 아미노산 서열을 갖는 신경영양성 인자 수용체 단백질 뿐만 아니라 생물학적으로 동가치인 유사체를 코드하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명의 신경영양성 인자 수용체 단백질과 단백질 산물은 본원에서 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자 수용체(GDNFR) 단백질과 단백질 산물로 규정된다. 신규한 GDNFR 은 특이하고도 높은 친화력으로 GDNF 를 결합시키는 능력과 GDNF 의 시그널 트랜스덕션 효과를 중재하거나 강화시키는 분자 복합체의 일부로서 작용하는 능력에 따라 기능적으로 특정된다. GDNFR 단백질 산물은 일반적으로 가용성 수용체 단백질로서 제공되며 실질적으로 순수한 형태로 존재한다.The present invention provides nucleic acid sequences encoding not only neurotrophic factor receptor proteins having the amino acid sequences shown in FIGS. 2 and 4 (SEQ ID NOS: 2 and 4) but also biologically equivalent analogues. Neurotrophic factor receptor proteins and protein products of the invention are defined herein as glial cell line-derived neurotrophic factor receptor (GDNFR) proteins and protein products. The novel GDNFRs are functionally characterized by their ability to bind GDNF with specific and high affinity and to act as part of a molecular complex that mediates or enhances the signal transduction effects of GDNF. GDNFR protein products are generally provided as soluble receptor proteins and exist in substantially pure form.

한 양상에 있어서, 본 발명은 재조합 유전공학 기술에 의해 GDNFR 단백질 산물을 생산하는 것에 관한 것이다. 선택적인 실시형태에 있어서, GDNFR 단백질은 화학적인 기술에 의해 합성되거나 재조합 기술과 화학적 기술을 연합하여 합성된다.In one aspect, the invention relates to the production of GDNFR protein products by recombinant genetic engineering techniques. In alternative embodiments, the GDNFR protein is synthesized by chemical techniques or by combining recombinant and chemical techniques.

본 발명의 다른 양상에 있어서, GDNFR 단백질은 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 형태로 제조될 수 있다. GDNFR 단백질 유도체는 일반적으로 GDNFR 단백질에 수용성 중합체를 결합시킴을 포함한다.예를들어, GDNFR 단백질은 수성 환경에서 GDNFR 단백질이 덜 침전되도록 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜과 결합된다.In another aspect of the invention, the GDNFR protein may be prepared in glycosylated or unglycosylated form. GDNFR protein derivatives generally include binding a water soluble polymer to the GDNFR protein. For example, the GDNFR protein is associated with one or more polyethylene glycols to less precipitate the GDNFR protein in an aqueous environment.

본 발명의 또다른 양상은 GDNFR 단백질을 코드하는 다양한 폴리누클레오티드를 포함한다. 이 핵산 서열은 진핵 숙주 세포나 원핵 숙주 세포에서 GDNFR 을 발현시키기 위해 사용하는데, 여기에서 발현 산물이나 그것의 유도체는 GDNF 에 결합하는 능력에 의해 특정화되며 도파민작용성 세포에 의한 도파민 흡수를 증가시키는 등의 GDNF 활성을 매개할 수 있는 복합체를 형성한다. 폴리누클레오티드는 또한 세포 치료나 유전자 치료에도 사용할 수 있다. 적합한 핵산 서열은 특히 도면에 나타나 있는 서열 뿐만 아니라 동의 서열, 자연발생적인 대립형질 변이체와 본 발명을 토대로 변이시킨 서열을 포함한다.Another aspect of the invention includes various polynucleotides encoding GDNFR proteins. This nucleic acid sequence is used to express GDNFR in eukaryotic or prokaryotic host cells, where the expression product or derivative thereof is characterized by its ability to bind GDNF, increasing dopamine uptake by dopamine-functional cells, and the like. It forms a complex that can mediate GDNF activity. Polynucleotides can also be used for cell therapy or gene therapy. Suitable nucleic acid sequences include in particular the sequences shown in the figures, as well as synonymous sequences, naturally occurring allelic variants and sequences mutated based on the present invention.

전형적인 핵산 서열은 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 갖는 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는, 신경영양성 인자 수용체 단백질 및 그것의 생물학적으로 동가치인 유사체를 코드하는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다음을 포함한다 : (a) 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 갖는 신경영양성 인자 수용체(GDNFR)를코드하는, Met¹내지 Ser⁴⁶⁵를 코드하는 누클레오티드를 포함하는 도 1(서열 1) 또는 Met¹내지 Ser⁴⁶⁸을 코드하는 누클레오티드를 포함하는 도 3(서열 3)에 나타나 있는 서열 ; (b) (a) 의 상보 서열에 혼성되고 GDNFR 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열 ; 및 (c) 유전 암호의 동의성이 없다면, (a) 의 상보 서열에 혼성되고 GDNFR 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열. 일반적으로 핵산 서열을 증폭시키거나 발현시키는 능력을 갖는 하나 또는 그 이상의 작동 요소와 작동적으로 결합하는 핵산 서열과 같은 벡터가 본원에 기술되어 있다. 이러한 벡터를 함유하는 숙주 세포 또한 본 발명에서 고려할 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 COS - 7 세포와 같은 포유동물 세포와 E. coli 같은 박테리아 세포 중에서 선택한다.Typical nucleic acid sequences include the amino acid sequences shown in FIGS. 2 and 4 (SEQ ID NOS: 2 and 4) having the ability to complex with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) to mediate cellular responses to GDNF. Sequences encoding factor receptor proteins and their biologically equivalent analogs. Such sequences include: (a) Met ¹ to, which, in combination with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), encode a neurotrophic factor receptor (GDNFR) that has the ability to mediate cellular responses to GDNF. The sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) comprising a nucleotide encoding Ser ⁴⁶⁵ or FIG. 3 (SEQ ID NO: 3) comprising a nucleotide encoding Met ¹ to Ser ⁴⁶⁸ ; (b) a nucleic acid sequence that hybridizes to the complementary sequence of (a) and encodes an amino acid sequence having GDNFR activity; And (c) a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence that hybridizes to the complementary sequence of (a) and has GDNFR activity, unless the genetic code is synonymous. Generally described herein are vectors such as nucleic acid sequences that operably bind to one or more operating elements having the ability to amplify or express nucleic acid sequences. Host cells containing such vectors are also contemplated in the present invention. In general, the host cell is selected from mammalian cells such as COS-7 cells and bacterial cells such as E. coli.

본 발명의 다른 양상은 증폭 조절 서열 및/또는 발현 조절 서열과 작동적으로 결합하는 GDNFR 단백질을 코드하는 폴리누클레오티드 함유 벡터를 포함한다. 원핵 숙주 세포와 진핵 숙주 세포는 모두 GDNFR 단백질로 안정하게 형질전환되거나 형질감염될 수 있다. 또한 본 발명은 GDNFR 단백질의 재조합 생산을 포함하는데, 여기에서 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포는 적당한 영양 배지에서 성장시키며 이 세포에서 발현되는 GDNFR 은 선택적으로 숙주 세포 및/또는 영양 배지에서 분리한다. 본 발명은 유전자 치료나 세포 치료시 GDNFR 을 코드하는 폴리누클레오티드와 이러한 폴리누클레오티드를 내포하는 벡터의 용도를 포함한다.Another aspect of the invention includes a polynucleotide containing vector encoding a GDNFR protein that operably binds to an amplification control sequence and / or an expression control sequence. Both prokaryotic and eukaryotic host cells can be stably transformed or transfected with GDNFR protein. The present invention also encompasses recombinant production of GDNFR proteins, wherein the transformed or transfected host cells are grown in a suitable nutrient medium and the GDNFR expressed in these cells is optionally isolated from the host cell and / or nutrient medium. The present invention includes the use of polynucleotides encoding GDNFR and vectors containing such polynucleotides in gene therapy or cell therapy.

숙주 세포는 인체 이식에 대한 그것의 적합성에 따라 선택할 수 있는데, 이러한 이식 세포는 본 발명의 신경영양성 인자 수용체를 발현하여 분비한다. 숙주 세포는 인체 이식에 적합한 반투막으로 둘러싸여 있다. 숙주 세포는 생체외에서 형질전환되거나 형질감염될 수 있다. 신경 손상을 치료하는 전형적인 기구는 다음을 포함한다 : (a) 이식에 적합한 반투막 ; 및 (b) 막 내부에서 캡슐로 보호되는, 본원에 기술한 신경영양성 인자 수용체를 발현하여 분비하는 세포. 막은 신경영양성 인자 수용체 단백질에는 투과성이지만 캡슐화된 세포에 해로운 물질에 대해서는 비투과성인 물질 중에서 선택한다.Host cells can be selected according to their suitability for human transplantation, which transplant cells express and secrete the neurotrophic factor receptors of the invention. The host cell is surrounded by a semipermeable membrane suitable for human transplantation. Host cells can be transformed or transfected ex vivo. Typical instruments for treating nerve damage include: (a) semipermeable membranes suitable for transplantation; And (b) cells that express and secrete the neurotrophic factor receptors described herein, which are encapsulated inside the membrane. The membrane is selected from substances that are permeable to neurotrophic factor receptor proteins but are impermeable to substances that are harmful to encapsulated cells.

본 발명의 신경영양성 인자 수용체의 재조합 생산방법 또한 본 발명에 기술되어 있다. 일반적인 방법은 다음을 포함한다 : (a) 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 갖는 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 나타낸 아미노산 서열과 같은 것으로서, 본 발명의 신경영양성 인자 수용체 또는 그것의 생물학적으로 동가치인 유사체를 코드하는 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포를 배양하고 ; (b) 상기 신경영양성 인자 수용체가 숙주 세포에 의해 발현되기에 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 보존하고 ; (c) 선택적으로, 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 상기 신경영양성 인자 수용체를 분리한다. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 박테리아 발현이 포함된다면, 이 방법은 신경영양성 인자 수용체를 되접는 단계가 더 포함된다.Methods for recombinant production of neurotrophic factor receptors of the invention are also described herein. General methods include: (a) the amino acid sequence shown in FIGS. 2 and 4 (SEQ ID NOS: 2 and 4) having the ability to mediate cellular responses to GDNF in complex with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). Culturing a host cell containing a nucleic acid sequence encoding a neurotrophic factor receptor of the invention or a biologically equivalent analog thereof; (b) preserving said host cell under conditions suitable for said neurotrophic factor receptor to be expressed by the host cell; (c) Optionally, isolate said neurotrophic factor receptor expressed by said host cell. Host cells can be prokaryotic or eukaryotic. If bacterial expression is involved, the method further includes folding back the neurotrophic factor receptor.

본 발명은 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 갖는, 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 분리정제된 단백질 및 그것의 생물학적으로 동가치인 유사체를 포함한다. 전형적인 유사체는 도 2(서열 2)에 나타낸 Ser¹⁸내지 Pro⁴⁴⁶, Asp²⁵내지 Leu⁴⁴⁷및 Cys²⁹내지 Cys⁴⁴²아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 도 4(서열 4)에 나타낸 Met¹⁷내지 Pro⁴⁴⁹및 Cys²⁹내지 Cys⁴⁴³아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 본 발명의 단백질은 글리코실화되거나 그렇지 않을 수 있으며, 재조합 기술이나 화학 합성에 의해 생산될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 아미노산 서열을 포함한 수용체 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함한다.The present invention provides an isolated purified protein comprising the amino acid sequence shown in FIGS. 2 and 4 (SEQ ID NOS: 2 and 4), having the ability to complex with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) to mediate cellular responses to GDNF. And biologically equivalent analogs thereof. Typical analogues include proteins comprising the Ser ¹⁸ to Pro ⁴⁴⁶ , Asp ²⁵ to Leu ⁴⁴⁷ and Cys ²⁹ to Cys ⁴⁴² amino acid sequences shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) and Met ¹⁷ to Pro ⁴⁴⁹ and Cys shown in FIG. 4 (SEQ ID NO: 4). Proteins including the amino acid sequence of ²⁹ to Cys ⁴⁴³ , including but not limited to. Proteins of the invention may or may not be glycosylated and may be produced by recombinant technology or chemical synthesis. The invention also includes nucleic acid sequences encoding receptor proteins comprising such amino acid sequences.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질 수용체와 함께 제약학적으로 용인가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물에 대해서도 기술하고 있다. 그외의 다양한 제제형 물질은 제조, 보관, 취급, 운반이 용이하고 및/또는 효능에 좋도록 하기 위해 사용한다.The present invention also describes pharmaceutical compositions containing a pharmaceutically acceptable carrier with the protein receptor of the present invention. A variety of other formulation materials are used to facilitate manufacture, storage, handling, transport, and / or efficacy.

본 발명의 다른 양상은 GDNFR 유전자와 단백질의 치료학적 용도를 포함한다. 예를들어, 순환성 또는 가용성 GDNFR 단백질 산물은 GDNF 막투과 시그널 활성을 강화시킴으로써 신경계 질환이나 손상을 치료하기 위해 단독으로 또는 GDNF 와 배합하여 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질과 제약학적 조성물은 도파민작용성 신경 세포의 부적절한 기능, 파킨슨병, 알쯔하이머병 및 근위축성측삭경화증 치료에 사용할 수 있다. 선택적으로, 재조합 GDNFR 유전자는 근위축성측삭경화증을 앓고 있는 환자의 운동신경원 처럼 GDNF 에 대한 감수성을 증가시킴으로써 유익해지는 조직 세포내로 삽입시킬 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, GDNFR 은 GDNF 활성이 해로운 것으로 여겨지는 경우에 GDNF 활성을 차단하기 위해 사용할 수 있다. GDNFR 은 관찰되는 GDNF 효과가 GDNFR 에서 비롯됨을 입증하는 데 사용할 수 있다.Another aspect of the invention involves the therapeutic use of GDNFR genes and proteins. For example, circulating or soluble GDNFR protein products may be used alone or in combination with GDNF to treat neurological disease or injury by enhancing GDNF transmembrane signaling activity. Thus, the proteins and pharmaceutical compositions of the present invention can be used to treat inadequate function of dopaminergic neurons, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, the recombinant GDNFR gene can be inserted into tissue cells that benefit by increasing sensitivity to GDNF, such as motor neurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. In another embodiment, GDNFR can be used to block GDNF activity when GDNF activity is deemed detrimental. GDNFR can be used to demonstrate that the observed GDNF effect is derived from GDNFR.

본 발명의 또다른 양상에 있어서, GDNFR 프로브는 정상 상태나 질환 상태에서 GDNF 에 대하여 반응하는 세포와 조직을 확인하는 데 사용한다. 선택적으로, 프로브는 GDNF - 관련 장애를 앓고 있는 환자에게서 비정상적인 GDNFR 발현을 검출하는 데 사용된다.In another aspect of the invention, GDNFR probes are used to identify cells and tissues that respond to GDNF in a normal or diseased state. Optionally, probes are used to detect abnormal GDNFR expression in patients suffering from GDNF-related disorders.

본 발명의 다른 양상에 있어서, 항체 프로브 뿐만 아니라 핵산을 포함한 GDNFR 프로브는 GDNFR - 관련 분자를 확인하는 데 사용할 수 있다. 예를들어, 본 발명은 GDNFR 과 복합체를 이루어 GDNFR 기능에 관계하는 분자를 제공한다. 다른 예로서, GDNFR 과 동일하지는 않지만 항원적으로 상동이거나 교차반응성인 수용체 분자를 제공한다.In another aspect of the invention, GDNFR probes, including nucleic acids as well as antibody probes, can be used to identify GDNFR-related molecules. For example, the present invention complexes with GDNFR to provide molecules that are involved in GDNFR function. As another example, there is provided a receptor molecule that is not identical to GDNFR but is antigenically homologous or cross-reactive.

또한 본 발명은 수용체를 토대로 한 GDNF 의 결합 검정 및 기능 검정을 개발하였다. 예를들어 GDNF 활성 검출 검정계는 고수준의 GDNFR 을 발현하여 GDNF 또는 GDNF - 유사 분자의 농도가 매우 낮은 경우 조차도 매우 민감한 세포를 포함한다. 또다른 실시형태에 있어서, 가용성 GDNFR 은 GDNF 나 GDNF - 유사 분자의 존재를 검출하거나 그것에 결합시키는 데 사용한다.The present invention also developed binding assays and functional assays of GDNFs based on receptors. For example, GDNF activity detection assay systems express high levels of GDNFR to include highly sensitive cells even when the concentration of GDNF or GDNF-like molecules is very low. In another embodiment, soluble GDNFR is used to detect or bind to the presence of GDNF or GDNF -like molecules.

부가적으로 본 발명은 GDNFR 의 생리학적 기능을 연구하기 위한 실험 모델계를 제공한다. 이러한 계는 동물 모델 뿐만 아니라 항 - GDNFR 항체 또는 올리고누클레오티드 프로브와 관련된 검정을 포함하는데, 예를들어 이러한 동물 모델은 고수준의 GDNF 를 발현하여 GDNF 에 대해지나치게 감수성인 형질전환 동물이나 배의 간세포 기술을 이용하여 외생 GDNFR 유전자를 게놈에서 삭제시킨 유도 동물이다. 항 - GDNFR 항체는 신경영양성 인자 수용체 단백질의 펩티드 부분에 결합할 것이다. 항체는 모노클로날 항체와 폴리클로날 항체를 포함한다. 선택적으로, 이미 존재하는 항체에 대한 면역학적 표식은 검출에 도움이 되는 GDNFR 단백질에 결합할 것이다. 이러한 표식은 Flag(IBI/이스트만 코닥)와 myc 서열을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 그외에 폴리히스티딘 같은 표식 서열은 금속 킬레이트 컬럼 상에서 검출 및 정제하는 데에도 사용되었다.In addition, the present invention provides an experimental model system for studying the physiological function of GDNFR. Such systems include assays involving anti-GDNFR antibodies or oligonucleotide probes, as well as animal models, for example, these animal models express high levels of GDNF to allow for transgenic animals or embryonic hepatocyte technology that is overly sensitive to GDNF. It is an induced animal in which the exogenous GDNFR gene was deleted from the genome. The anti-GDNFR antibody will bind to the peptide portion of the neurotrophic factor receptor protein. Antibodies include monoclonal antibodies and polyclonal antibodies. Optionally, immunological markers for already existing antibodies will bind to the GDNFR protein to aid in detection. Such markers include, but are not limited to, Flag (IBI / Eastman Kodak) and myc sequences. In addition, labeling sequences such as polyhistidine have also been used for detection and purification on metal chelate columns.

본 발명의 부가적인 양상과 이점은 본 발명을 실시하는 것에 관하여 자세히 기술되어 있는 하기 상세한 설명을 참조하여 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다.Additional aspects and advantages of the invention will be apparent to those skilled in the art with reference to the following detailed description, which is described in detail with respect to the practice of the invention.

도 1a - 1h 는 인체 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자 수용체(GDNFR)를 코드하는 핵산 서열(서열 1)을 나타낸 것이다. 완전한 길이의 GDNFR 단백질의 아미노산 서열은 핵산 540 내지 1934 에 의해 코드된다.1A-1H show nucleic acid sequences encoding the human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor (GDNFR) (SEQ ID NO: 1). The amino acid sequence of the full length GDNFR protein is encoded by nucleic acids 540-1934.

도 2 는 완전한 길이의 GDNFR 단백질의 아미노산 서열(서열 2)이다.2 is an amino acid sequence of a full length GDNFR protein (SEQ ID NO: 2).

도 3a - 3g 는 랫의 GDNFR 을 코드하는 핵산 서열(서열 3)이다. 완전한 길이의 GDNFR 단백질 아미노산 서열은 핵산 302 내지 1705 에 의해 코드된다.3A-3G are nucleic acid sequences encoding GDNFR of rats (SEQ ID NO: 3). The full length GDNFR protein amino acid sequence is encoded by nucleic acids 302-1705.

도 4 는 완전한 길이의 랫 GDNFR 단백질의 아미노산 서열(서열 4)이다.4 is the amino acid sequence of the full length rat GDNFR protein (SEQ ID NO: 4).

도 5a - 5v 는 인체 GDNFR 의 콘센서스 서열 뿐만 아니라 다수의 클론에서 생산된 GDNFR cDNA 서열의 일부를 비교정렬시킨 것이다.5A-5V compare and align some of the consensus sequences of human GDNFR as well as the GDNFR cDNA sequences produced in multiple clones.

도 6 은 뉴로 - 2A 유래 세포주가 GDNFR 을 발현함을 확인하는 것이다.Figure 6 confirms that the neuro-2A-derived cell line expresses GDNFR.

도 7a - 7b 는 GDNFR 발현 세포에 대한 [¹²⁵I]GDNF 의 평형 결합 결과를 나타낸 것이다.7A-7B show the results of equilibrium binding of [ ¹²⁵ I] GDNF to GDNFR expressing cells.

도 8 은 GDNFR 발현 세포에서 발현되는 GDNFR 과 Ret 에 대한 [¹²⁵I]GDNF 의 화학적 교차 결합 결과를 나타낸 것이다.8 shows the results of chemical cross-linking of [ ¹²⁵ I] GDNF to GDNFR and Ret expressed in GDNFR expressing cells.

도 9a - 9c 는 GDNFR 발현 세포에 의한 c - Ret 자기인산화 유도 결과를 나타낸 것이다.9a-9c show the results of c-Ret autophosphorylation induced by GDNFR expressing cells.

도 10a - 10b 는 GDNF 와 가용성 GDNFR 에 의한 c - Ret 자기인산화 유도 결과를 나타낸 것이다.10a-10b show the results of c-Ret autophosphorylation induced by GDNF and soluble GDNFR.

도 11 은 Ret - Fc 융합 단백질에 의한 c - Ret 자기인산화 저해 결과를 나타낸 것이다.11 shows the results of c-Ret autophosphorylation inhibition by Ret-Fc fusion protein.

도 12 는 운동신경원내 GDNF 에 의한 c - Ret 자기인산화 유도 결과를 나타낸 것이다.12 shows the results of c-Ret autophosphorylation induced by GDNF in motor neurons.

도 13 은 GDNFR 과 Ret 에 의해 매개되는 GDNF 시그널 모델을 나타낸 것이다.Figure 13 shows the GDNF signal model mediated by GDNFR and Ret.

신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)는 중추신경계와 말초신경계 둘다의 각각의 세포 형태에 대하여 광범위한 생물학적 활성을 보이는 강력한 신경영양성 인자이다. 이 GDNF 는 형질전환 성장 인자 - β(TGF - β) 아군과는 관계가 먼(상동성이 20 % 미만임) 글리코실화되고 디술피드 결합된 이량체이다. 도파민작용성 신경원과 그외의 신경원집단의 생존을 강화시키는 GDNF 의 능력은 파킨슨병 뿐만 아니라 다른 형태의 신경손상이나 기능부전 치료에 대한 그것의 치료학적 잠재력을 나타낸다.Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) is a potent neurotrophic factor that exhibits a wide range of biological activities for each cell type of both the central and peripheral nervous systems. This GDNF is a glycosylated and disulfide-linked dimer that has no relation to the transforming growth factor-β (TGF-β) subgroup (less than 20% homology). GDNF's ability to enhance the survival of dopaminergic neurons and other neuronal populations has shown its therapeutic potential for the treatment of Parkinson's disease as well as other forms of neurological damage or dysfunction.

GDNF 의 분포와 생물학적 활성에 대한 폭넓은 연구와는 대조적으로, 세포에 GDNF 가 결합하는 것을 매개하여 세포내 시그널과 세포 반응을 매개하는 수용체(들)을 확인한 보고서는 없었다. 본 발명은 출생후 랫의 망막 세포를 배양하여 그 표면에서 처음으로 높은 친화성을 갖는 수용체가 발견됨을 기초로 한다. 이 수용체는 도파민작용성 신경원 및 운동신경원, 중뇌 도파민작용성 신경원[Lin 등의 1993 상기참조 ; Sauer 등의 1995 상기참조 ; Kearns 및 Grash, 1995 상기참조 ; Beck 등의 1995 상기참조 ; Tomac 등의 1995a 상기참조], 안면 운동신경원과 척수 운동신경원[Li 등의 1995 상기참조 ; Oppenheim 등의 1995 상기참조 ; Yan 등의 1995 상기참조 ; Zurn 등의 1994 상기참조 ; Henderson 등의 1994 상기참조]에서 발견된 수용체의 GDNF 결합 친화성에 필적할 만한 예상 GDNF 결합 친화성을 갖는다. 이 수용체 분자가 GDNF 수용체계에서 제일 먼저 알려진 성분이므로 GDNF 수용체(GDNFR)라 명명하였다. 본 발명은 또한 GDNFR 단백질의 발현 클로닝과 특징에 대해 최초로 기술한 것이다. 재조합 수용체를 발현하도록 변이시킨 세포는 높은 친화력으로 GDNF 에 결합한다.In contrast to extensive research on the distribution and biological activity of GDNF, there have been no reports identifying receptor (s) that mediate intracellular signaling and cellular responses by mediating the binding of GDNF to cells. The present invention is based on the culturing of retinal cells in rats after birth and the first discovery of receptors with high affinity on their surface. These receptors are known as dopamine functional neurons, motor neurons, and midbrain dopamine functional neurons [Lin et al., 1993; See, 1995, Sauer et al .; Kearns and Grash, 1995, supra; See, Beck et al., 1995; 1995a, supra at Tomac et al., Et al., 1995; See, 1995, Oppenheim et al .; See 1995, Yan et al .; See, 1994, Zurn et al .; 1994, see Henderson et al., Supra, with predicted GDNF binding affinity comparable to the GDNF binding affinity of the receptor. Since this receptor molecule is the first known component in the GDNF receptor system, it was named GDNF receptor (GDNFR). The present invention is also the first to describe the expression cloning and characterization of GDNFR proteins. Cells mutated to express recombinant receptors bind GDNF with high affinity.

도파민 섭취 검정과 배양 세포에 대한 [¹²⁵I] - GDNF 결합을 이용하여 랫의 광수용체 세포 표면에서 GDNF 에 대한 고친화성 수용체를 검출하였다. 실시예에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 광수용체 세포 연구로 GDNF 수용체의 발현 클로닝에 의해 cDNA 클론을 분리할 수 있었다. GDNFR 의 핵산 서열은 31 개의 시스테인 잔기와 세 개의 잠재적인 N - 글리코실화 부위를 갖는 468 개 아미노산으로 구성된 단백질을 코드한다. 랫 cDNA 클론의 핵산 서열은 랫 수용체와 아미노산 수준에서 거의 동일한 것으로 밝혀진 그것의 인체 동족체를 분리하는 데 사용되었다. 인체 GDNFR cDNA 서열은 모든 위치에 시스테인 잔기를 가지며 랫 수용체에 비해 보존적인 잠재적 N - 글리코실화 부위를 갖는 465 개 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드한다. 이렇게 1 차 서열이 고도로 보존되는 것은 이 수용체가 GDNF 의 생물학적 기능에 중요한 역할을 함을 시사한다.Dopamine uptake assays and [ ¹²⁵ I] -GDNF binding to cultured cells were used to detect high affinity receptors for GDNF at the surface of photoreceptor cells in rats. As described in more detail in the Examples, photoreceptor cell studies were able to isolate cDNA clones by cloning expression of the GDNF receptor. The nucleic acid sequence of GDNFR encodes a protein consisting of 468 amino acids with 31 cysteine residues and three potential N-glycosylation sites. The nucleic acid sequence of the rat cDNA clone was used to isolate its human homologue which was found to be nearly identical at the rat receptor and at the amino acid level. The human GDNFR cDNA sequence encodes a protein of 465 amino acids with cysteine residues at all positions and with a conservative potential N-glycosylation site relative to the rat receptor. This highly conserved primary sequence suggests that this receptor plays an important role in the biological function of GDNF.

상기한 바와 같이, 많은 수용체는 세 개의 주요 도메인을 갖는다 : 단백질 인자에 특이하게 결합하는 세포외 또는 세포 표면 도메인 ; 세포막을 메우는 막투과 도메인 ; 및 일반적으로 단백질 인자가 세포외 도메인에 결합할 때 시그널 트랜스덕션을 개시하는 데 관계하는 세포내 또는 세포질 도메인. 그러나, GDNFR 은 공지된 모든 단백질(예를들어, 수용체 키나아제 또는 시토킨 수용체에서 발견되는 콘센서스 서열)의 서열 특징이나 구조적 특징과 관계가 없으며 세포질 도메인이 결핍되어 있고 막투과 도메인의 C - 말단 변이 잔기 특성이 결핍되어 있으며, 하기에 보다 상세히 기술된 바와 같이 글리코실 - 포스파티딜이노시톨(GPI) 결합에 의해 세포막에 결합되는 것으로 결정되었다. 세포내 촉매 도메인이 없으면 막투과 시그널에서 중요한 기능이 저해되기는 하나, 높은 결합 친화성을 갖는 서열과 진화 서열의 강한 보존성은 이 수용체가 GDNF 기능에 중요한 것임을 시사하였다.As noted above, many receptors have three major domains: extracellular or cell surface domains that specifically bind to protein factors; A transmembrane domain filling the cell membrane; And generally intracellular or cytoplasmic domains involved in initiating signal transduction when protein factors bind to the extracellular domain. However, GDNFR is independent of the sequence or structural features of all known proteins (e.g., consensus sequences found in receptor kinases or cytokine receptors), lacks cytoplasmic domains and C-terminal variations of the transmembrane domain. It was determined that it lacks residue properties and is bound to the cell membrane by glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) binding as described in more detail below. The absence of intracellular catalytic domains inhibits important functions in transmembrane signals, but the strong conservedness of sequences with high binding affinity and evolutionary sequences suggests that this receptor is important for GDNF function.

GDNFR 은 세포질 도메인이 결핍되어 있기 때문에, 막투과 시그널에서 어떤 역할을 담당하는 보조 분자 중 하나 또는 그 이상과 함께 작용해야 한다. GDNF 유전자가 결핍된 형질전환 동물은 살아남지 못하였고 신장이 없는 것으로 밝혀졌다. c - ret 프로토 - 종양유전자가 결핍된 형질전환 마우스[Schuchardt 등의 Nature, 367, 380 - 383, 1994 참조]도 유사한 표현형을 갖는 것으로 밝혀졌다. c - ret 프로토 - 종양유전자는 그것의 정상적인 기능이 이제껏 밝혀지지 않았던 수용체 티로신 키나아제(RTK)를 코드한다. 모든 RTK 는 유사한 토폴로지를 갖는다 : 그것은 세포외 리간드 - 결합 도메인, 막투과 도메인 및 촉매 단백질 - 티로신 키나아제 도메인을 함유하는 세포질 단편을 갖는다. 리간드 결합으로 키나아제 도메인이 활성화되고 세포내 시그널을 매개하는세포내 특이 기질이 인산화된다. 본 발명은 가용형의 GDNFR 이 c - ret 프로토 - 종양유전자에 대한 GDNF 결합을 매개하고 그것의 세포 형태 특이성을 변이시킬 뿐 아니라 GDNF 에 대한 세포 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다는 발견에 관계된 것이다.Because GDNFR lacks a cytoplasmic domain, it must work with one or more of the auxiliary molecules that play a role in transmembrane signals. Transgenic animals lacking the GDNF gene did not survive and were found to be kidneyless. Transgenic mice lacking the c-ret proto-oncogene (see Nature, 367, 380-383, 1994) have been found to have a similar phenotype. The c-ret proto-oncogene encodes a receptor tyrosine kinase (RTK) whose normal function has never been elucidated. All RTKs have a similar topology: it has cytoplasmic fragments containing extracellular ligand-binding domains, transmembrane domains and catalytic protein-tyrosine kinase domains. Ligand binding activates the kinase domain and phosphorylates intracellular specific substrates that mediate intracellular signals. The present invention relates to the discovery that soluble GDNFRs can be used to mediate GDNF binding to c-ret proto-oncogenes and to alter their cell morphology specificity as well as to induce cellular responses to GDNF.

'수용체 알파' 성분이라 명명된 유사 종은 리간드 결합 특이성은 제공하지만 그 자신의 시그널을 변환시키는 능력은 가지고 있지 않다. 이러한 성분은 모양체의 신경영양성 인자(CNTF) 및 인터루킨 - 6(IL - 6) 수용체 계에서 발견된다. CNTF 수용체는 높은 친화력으로 그것의 리간드에 결합하고 소수성인 C - 말단을 가지며 세포질 도메인이 없고 GPI 결합에 의해 세포막에 결합하는데[Davis 등의 1991 참조], 이것은 GDNFR 과는 유사하고 IL - 6 수용체와는 대조적이다. 시그널 트랜스덕션을 매개하기 위하여, CNTF 는 우선 CNTF 수용체에 결합하여 gp 130 에 결합할 수 있는 복합체를 이룬다. 그런 다음 이 불활성 복합체는 LIF 수용체에 결합하여 활성 시그널 복합체를 이룬다[Davis 등의 Science, 260, 1805 - 1807, 1993 참조]. 본 발명에서와 마찬가지로, CNTF 수용체(리간드 특이 결합 성분)는 막에 결합할 필요는 없지만 발생하는 시그널을 위해 존재해야 한다[Economides 등의 Science, 270, 1351 - 1353, 1995 참조].Similar species, termed 'receptor alpha' components, provide ligand binding specificity but do not have the ability to convert their own signals. These components are found in the ciliary neurotrophic factor (CNTF) and interleukin-6 (IL-6) receptor systems. The CNTF receptor binds to its ligand with high affinity, has a hydrophobic C-terminus, lacks a cytoplasmic domain and binds to the cell membrane by GPI binding (see Davids et al. 1991), which is similar to GDNFR and is associated with IL-6 receptors. Is in contrast. To mediate signal transduction, CNTF first binds to the CNTF receptor to form a complex that can bind to gp 130. This inactive complex then binds to the LIF receptor to form an active signal complex (see Davis et al., Science, 260, 1805-1807, 1993). As in the present invention, the CNTF receptor (ligand specific binding component) does not need to bind to the membrane but must be present for the resulting signal (see Ecoomides et al., Science, 270, 1351-1353, 1995).

하기에 더 자세히 기술하는 바와 같이, GDNFR 단백질은 세포 표면에 결합되거나 가용 형태로 제공될 수 있다. 어떤 경우에, GDNFR 단백질은 GDNF 와 리간드 복합체를 이루고 이 리간드 복합체는 세포 표면 수용체에 결합되어 세포내 시그널이 된다. 이런 식으로, GDNFR 의 가용 형태는 GDNF 작용을 강화하고/하거나 세포 - 유형 특이성을 변이시킨다.As described in more detail below, GDNFR proteins may be bound to the cell surface or provided in soluble form. In some cases, the GDNFR protein forms a ligand complex with GDNF that binds to cell surface receptors and becomes an intracellular signal. In this way, the soluble forms of GDNFR enhance GDNF action and / or variate cell-type specificity.

GDNFR 은 모든 공지된 수용체와 관계가 없다. 관련 서열에 대하여 진뱅크 앤 워싱턴 유니버시티 - 머크 데이터베이스(GenBank and Washington University - Merck database) 중에서 외관상 비슷한 것도 없다. 워싱턴 유니버시티 - 머크 EST 데이터베이스에 나타나 있는 발현 서열 표식(EST)은 GDNFR 코딩 부위의 일부분(클론의 5' 말단에서 생성된 521 누클레오티드 서열 중 약 340 누클레오티드)과 75 % 상동이다. 이 클론(진뱅크 취득 번호 #H12981)을 올리고 - dT 프라임 인체 유아 뇌 라이브러리(oligo - dT primed human infant brain library)에서 분리하여 Lafmid BA 벡터(Hillier, L. 등의 아직 발간되지 않은 데이터)내로 직접 클로닝하였다. #H12981 의 3' 말단 서열을 결정하였으나, GDNFR 의 어떤 부분과도 상동성이 없었다. 이 #H12981 클론과 GDNFR 의 상동성은 짧은 부위에서 나타났다 사라졌는데, 이것은 #H12981 클론이 스플라이싱되지 않은 전사물이거나 이것이 원래의 cDNA 전사물이기 보다는 인공적으로 클로닝한 것임을 시사한다.GDNFR is not related to all known receptors. There is no apparent similarity in the GenBank and Washington University-Merck database for the relevant sequences. The expression sequence marker (EST) shown in the Washington University-Merck EST database is 75% homologous to a portion of the GDNFR coding site (about 340 nucleotides of the 521 nucleotide sequence generated at the 5 'end of the clone). Raise this clone (Genbank accession number # H12981) and isolate it from the dT primed human infant brain library and directly into the Lafmid BA vector (data not yet published by Hillier, L., etc.). Cloned. The 3 'terminal sequence of # H12981 was determined, but there was no homology with any portion of GDNFR. Homology of the # H12981 clone and GDNFR appeared and disappeared in a short region, indicating that the # H12981 clone was an unspliced transcript or was cloned artificially rather than the original cDNA transcript.

따라서, 본 발명은 GDNFR 을 발현하는 표적 세포를 선택하는 방법을 제공함으로써 GDNFR 단백질 클로닝을 가능하게 한다. GDNFR 코딩 서열을 많이 제공함으로써, 본 발명에 의해 GDNFR 단백질을 정제할 수 있게 되었고 GDNFR - 코딩 DNA 의 직접적인 클로닝도 가능하게 되었다. GDNFR 핵산 서열과 아미노산 서열에 대한 본 설명으로 다양한 GDNFR 유사체 뿐 아니라 이들의 증식에 필요한 정보가 제공되었다. 이러한 정보로 인해, 본 분야의 숙련자들에게 공지된 방법으로 GDNFR 단백질 산물을 분리하거나 생산할 수 있다. GDNFR 단백질 재조합이나 합성 생산에 대한 다양한 방법도 기술되어 있다.Accordingly, the present invention enables the cloning of GDNFR proteins by providing a method of selecting target cells expressing GDNFR. By providing a large number of GDNFR coding sequences, the present invention has enabled the purification of GDNFR proteins and the direct cloning of GDNFR-encoding DNA. This description of GDNFR nucleic acid sequences and amino acid sequences provided the information necessary for their growth as well as various GDNFR analogs. This information allows for the isolation or production of GDNFR protein products by methods known to those skilled in the art. Various methods for GDNFR protein recombination or synthetic production are also described.

본원에 기술되어 있는 용어 'GDNFR 단백질 산물' 은 생물학적으로 활성인, 정제된 천연, 합성 또는 재조합 GDNFR, GDNFR 유사체(삽입 변이체, 치환 변이체와 결실 변이체를 포함한 GDNFR 변이체 및 동족체) 및 화학적으로 변이시킨 그것의 유도체가 포함된다. GDNFR 유사체는 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 나타낸 GDNFR 아미노산 서열과 실질적으로 상동이다.As used herein, the term 'GDNFR protein product' refers to biologically active, purified natural, synthetic or recombinant GDNFR, GDNFR analogs (GDNFR variants and homologs, including insertional variants, substitutional variants and deletion variants) and those that are chemically modified. Derivatives of GDNFR analogs are substantially homologous to the GDNFR amino acid sequence shown in FIGS. 2 and 4 (SEQ ID NOS: 2 and 4).

본원에 사용된 용어 '생물학적으로 활성' 은 GDNFR 단백질 산물이 높은 친화력으로 GDNF 에 결합하여 GDNF - 유도 시그널 트랜스덕션을 매개하거나 촉진시킴을 의미한다. 본 분야의 숙련자들은 본 명세서에 의해 GDNFR 폴리펩티드 유사체가 도 2 및 4 에 기술된 GDNFR 단백질 산물과 실질적으로 동일한 생물학적 활성도를 갖는지를 결정할 수 있다.The term 'biologically active' as used herein means that the GDNFR protein product binds to GDNF with high affinity to mediate or promote GDNF-induced signal transduction. Those skilled in the art can determine by this specification whether GDNFR polypeptide analogs have substantially the same biological activity as the GDNFR protein products described in FIGS. 2 and 4.

본원에 사용한 용어 '실질적으로 상동' 인 아미노산 서열은 도 2 및 4 에 나타낸 GDNFR 아미노산 서열과 '유사' 하거나 상동인 아미노산 서열을 말하는 것으로 상동 서열은 이 GDNFR 아미노산 서열에 기술된 것과 유사한 생물학적 활성도나 기능을 갖는다. 분자의 3 차원적 입체형태나 활성도에 영향을 끼치지 않으면서, 비교적 다수의 각각의 아미노산 잔기나 군별로 분류된 아미노산 잔기의 위치를 변화시키거나(예를들어, 순서를 바꾸거나 재배열함) 아미노산 서열에서 모두 삭제할 수 있다는 것은 본 분야의 숙련자들이 인식할 수 있을 것이다.As used herein, the term 'substantially homologous' amino acid sequence refers to an amino acid sequence that is 'similar to or homologous' to the GDNFR amino acid sequence shown in FIGS. Has Change (eg, reorder or rearrange) the position of amino acid residues classified by a relatively large number of individual amino acid residues or groups, without affecting the three-dimensional conformation or activity of the molecule It will be appreciated by those skilled in the art that all of the amino acid sequences can be deleted.

본 분야의 숙련자들은 본 명세서에 의해 이러한 변이를 실시할 수 있을 것이다. 이렇게 변이시킨 서열의 확인 방법과 수득 방법은 하기에 보다 상세히 기술되어 있다. 실질적으로 상동인 단백질(펩티드)의 상동 정도는 같거나 70 % 이상(즉, 70 % 내지 100 % 의 상동성) 이 바람직하다. 따라서, '실질적으로 상동인' GDNFR 아미노산 서열은 서열 2 및 4 에 기술한 아미노산 서열과 같거나 70 % 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다. 각각의 상동 정도가 같거나 85 % 를 초과하는 것이 더욱 바람직하며, 같거나 90 % 이상의 상동성을 갖는 것이 보다 바람직하고, 가장 바람직한 것은 같거나 95 % 이상인 것이다.Those skilled in the art will be able to make these variations by the present specification. The method of confirming and obtaining the sequence thus mutated is described in more detail below. The degree of homology of substantially homologous proteins (peptides) is equal or equal to or greater than 70% (ie, homology of 70% to 100%). Thus, it is preferred that the 'substantially homologous' GDNFR amino acid sequence have the same or greater than 70% homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 2 and 4. It is more preferred that each degree of homology is equal or greater than 85%, more preferably equal or greater than 90% homology, most preferably equal or greater than 95%.

본원에 기술한 상동 백분율은, 어떤 단백질 서열을 다른 단백질 서열과 정렬시켜 그 서열에서 발견되는 같거나 유사한 아미노산 잔기의 백분율로 계산한다. 따라서 GDNFR 상동성의 경우, 서열 2 와 4 에 나타나 있는 GDNFR 폴리펩티드의 참고 아미노산 잔기 또는 도면에 나타나 있는 핵산에 의해 코드되는 아미노산 잔기에 대하여 비교 분자의 아미노산 잔기를 두 서열간의 잔기 상동성이 최대가 되도록 적절하게 정렬시켜 서열의 상동성 정도를 결정할 수 있다. 이러한 정렬이 적당한 보존적 잔기 치환을 포함하며 필요한 만큼의 갭을 도입함으로써 비교 서열의 절두와 내부 결실 또는 삽입은 무시한다는 것을 본 분야의 숙련자들은 인지할 것이다 ; 예를들어 Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5 를 참조하라. 여기에서 정렬을 돕기 위해 100 개의 아미노산에 평균 3 개 또는 4 개의 갭을 도입할 수 있다[p.124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., 1972 ; 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 일단 이렇게 정렬시키고 나서, 비교 폴리펩티드내 정렬 잔기의 수를 비교 폴리펩티드내 총 잔기수로 나누어 백분율을 정한다. 본 발명의 GDNFR 서열은 적어도 부분적으로 GDNFR 활성을 갖는 키메라 단백질이나 융합 단백질의 일부를 형성하는 데 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 이러한 단백질의 정렬과 상동성은 GDNFR 활성도와 관련된 융합 단백질이나 키메라 단백질의 부분을 이용하여 결정될 것이다.The percent homology described herein is calculated as the percentage of identical or similar amino acid residues found in that sequence by aligning one protein sequence with another protein sequence. Thus, in the case of GDNFR homology, the amino acid residues of the comparison molecule are appropriate to maximize the residue homology between the two sequences relative to the reference amino acid residues of the GDNFR polypeptides shown in SEQ ID NOS: 2 and 4 or to the amino acid residues encoded by the nucleic acids shown in the figures. Alignment can be used to determine the degree of homology of the sequences. Those skilled in the art will recognize that such alignments include appropriate conservative residue substitutions and ignore truncation and internal deletion or insertion of the comparative sequence by introducing as many gaps as necessary; See, for example, Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. See 5. Here, an average of three or four gaps can be introduced at 100 amino acids to aid alignment [p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., 1972; This document is incorporated herein by reference. Once so aligned, the percentage is determined by dividing the number of alignment residues in the comparison polypeptide by the total number of residues in the comparison polypeptide. It is contemplated that the GDNFR sequences of the present invention may be used to form portions of chimeric proteins or fusion proteins that have at least partially GDNFR activity. The alignment and homology of these proteins will be determined using portions of fusion or chimeric proteins that are associated with GDNFR activity.

실질적으로 상동인 GDNFR 단백질원은 인체 GDNFR 단백질과 매우 상동일 것으로 기대되는 다른 포유동물의 GDNFR 단백질을 포함한다. 예를들어, 본원에 기술한 랫과 인체 GDNFR 단백질간의 상동성은 약 93 % 이다. 실질적으로 상동인 GDNFR 단백질은 서열 2 와 4 의 GDNFR 아미노산 서열에 대한 항체와의 교차 - 반응성에 의하여 포유동물에서 분리할 수 있다. 선택적으로, 실질적으로 상동인 GDNFR 단백질은 서열 2 와 4 의 GDNFR 을 코드하는 유전자 단편이나 유전자와의 혼성화를 통해 분리하거나 서열 2 와 4 에 나타나 있는 핵산 서열의 상보 서열과 혼성시킨 핵산 서열에 의해 발현될 것이다. 적당한 혼성 조건은 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.Substantially homologous GDNFR protein sources include other mammalian GDNFR proteins that are expected to be highly homologous to human GDNFR proteins. For example, the homology between the rat and human GDNFR proteins described herein is about 93%. Substantially homologous GDNFR proteins can be isolated in mammals by cross-reactivity with antibodies to the GDNFR amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 4. Optionally, substantially homologous GDNFR proteins are expressed by hybridization with gene fragments or genes encoding the GDNFRs of SEQ ID NOS: 2 and 4 or by nucleic acid sequences hybridized with the complementary sequences of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NOS: 2 and 4 Will be. Suitable hybridization conditions are described in more detail below.

불순물은 의도하는 목적에 사용하는 본 폴리펩티드의 이용 가치를 떨어뜨리기 때문에 실질적으로 불순물이 없는 GDNFR 단백질 산물을 얻기 위해 신규한 GDNFR 단백질 산물을 전형적으로 분리정제한다. 예를들어, 바람직한 GDNFR 단백질 산물은 다른 인체 단백질성 물질(예를들어, 비 - GDNFR)이나 병리학적 물질이 실질적으로 존재하지 않을 것이다. 바람직하게, GDNFR 단백질 산물 제조에 사용하는 생산 기술에서 기인하여 존재하는 다른 단백질이 GDNFR 단백질 산물에서 약 80 % 제거된다. 더욱 바람직하게, GDNFR 단백질 산물은 다른 단백질의 약 90 % 가 제거된 것이고 약 95 % 가 제거된 것이 특히 바람직하며, 가장 바람직하게는 약 98 % 이상이 제거된 것이다. 부가적으로, 본 발명은 균질의 GDNFR 단백질 제조를 위해 제공되는 폴리누클레오티드의 독특한 이점을 갖는다.Impurities typically degrade new GDNFR protein products to obtain GDNFR protein products that are substantially free of impurities because they impair the utility of the present polypeptides for their intended purposes. For example, preferred GDNFR protein products will be substantially free of other human proteinaceous substances (eg, non-GDNFR) or pathological substances. Preferably, about 80% of the other proteins present due to the production technology used to prepare the GDNFR protein product are removed from the GDNFR protein product. More preferably, the GDNFR protein product is one in which about 90% of the other proteins have been removed and particularly about 95% have been removed, most preferably at least about 98% have been removed. In addition, the present invention has the unique advantage of polynucleotides provided for the production of homogeneous GDNFR proteins.

다양한 GDNFR 변이체는 부가 변이체, 결실 변이체 및 치환 변이체를 포함하여 생각할 수 있다. 예를들어, 일련의 결실 변이체는 GDNFR 단백질의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 아미노산 잔기를 하나 또는 그 이상 제거함으로써 제조할 수 있다. von Heijne 에 의해 기술된 시그널 펩티드 절단 예상 법칙[von Heijne, Nucleic Acids Research, 14, 4683 - 4690, 1986 참조]을 통해 얻은, GDNF 결합에 관련된 GDNFR 단백질의 초기 아미노산 잔기는 도 2(서열 2)의 총 길이의 인체 GDNFR 아미노산 서열에 나타나 있는 바와 같이 Ser¹⁸이다. 아미노산 잔기 Met¹내지 Ser¹⁸은 시그널 펩티드 서열의 일부인 것으로 추정되는 아미노 - 말단 소수성 부위내에 존재하므로, 수용체 단백질의 성숙형에는 포함되지 않는다. 마찬가지로, GDNF 결합에 필요한 것으로 추정되는 GDNFR 단백질의 마지막 아미노산 잔기는 Ser⁴⁴⁶이다. 아미노산 잔기 Leu⁴⁴⁷내지 Ser⁴⁶⁵는 세포 표면에 대한 단백질의 GPI 결합에 관계하는 카르복시 - 말단 소수성 부위에 존재한다. 따라서, Met¹내지 Ser¹⁸및/또는 Leu⁴⁴⁷내지 Ser⁴⁶⁵[도 2(서열 2)를 기준으로] 잔기 중 어떤 것이나 그들 모두는 Ala¹⁹내지 Pro⁴⁴⁶의 '중심' 서열을 제거함으로 인해 GDNFR 단백질에 대한 GDNF 결합에 영향을 미치지 않은 채로 단백질에서 제거될 수 있을 것으로 여겨진다. 또한 공지된 분석 기술을 이용한 N - 말단 절두는 Gly²⁴를 포함하여 Gly²⁴까지 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 제거함을 포함할 것으로 생각된다. 따라서, GDNFR 절두 유사체는 한쪽 말단이나 양 말단에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 결실시킴을 포함하는데, Asp²⁵내지 Pro⁴⁴⁶또는 Leu⁴⁴⁷아미노산 서열은 중심 분자의 기초를 이룬다. 부가적인 GDNFR 유사체는 도 4(서열 4)의 GDNFR 아미노산 서열에 나타나 있는 아미노산 잔기 Ser¹⁸내지 Pro⁴⁴⁹를 포함하는, 즉 아미노산 잔기 Met¹내지 Ser¹⁸및/또는 Pro⁴⁴⁹내지 Ser⁴⁶⁸에 나타나 있는 소수성 부위를 포함하는한쪽 말단이나 양 말단에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 결실시킨 것으로 생각된다.Various GDNFR variants are contemplated, including additional variants, deletion variants and substitution variants. For example, a series of deletion variants can be made by removing one or more amino terminus and / or carboxy terminus amino acid residues of the GDNFR protein. The initial amino acid residues of the GDNFR protein involved in GDNF binding, obtained via the predicted law of signal peptide cleavage described by von Heijne [see von Heijne, Nucleic Acids Research, 14, 4683-4690, 1986], are shown in Figure 2 (SEQ ID NO: 2). Ser ¹⁸ as shown in the full length human GDNFR amino acid sequence. The amino acid residues Met ¹ to Ser ¹⁸ are present in the amino-terminal hydrophobic sites that are presumed to be part of the signal peptide sequence and therefore are not included in the mature form of the receptor protein. Likewise, the last amino acid residue of the GDNFR protein that is assumed to be required for GDNF binding is Ser ⁴⁴⁶ . The amino acid residues Leu ⁴⁴⁷ to Ser ⁴⁶⁵ are present at the carboxy-terminal hydrophobic sites involved in GPI binding of the protein to the cell surface. Thus, any of the residues Met ¹ to Ser ¹⁸ and / or Leu ⁴⁴⁷ to Ser ⁴⁶⁵ [based on FIG. 2 (SEQ ID NO: 2)] or all of them may be present in the GDNFR protein by eliminating the 'center' sequence of Ala ¹⁹ to Pro ⁴⁴⁶ . It is believed that it can be removed from the protein without affecting GDNF binding. Further N Using known analysis techniques-terminal truncated are thought to comprise a removal of one or more amino acid residues including Gly ²⁴ to Gly ^24. Thus, GDNFR truncated analogs include the deletion of one or more amino acid residues at one or both ends, wherein the Asp ^25- Pro ⁴⁴⁶ or Leu ⁴⁴⁷ amino acid sequence forms the basis of the central molecule. Additional GDNFR analogs include amino acid residues Ser ¹⁸ to Pro ⁴⁴⁹ shown in the GDNFR amino acid sequence of FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), ie hydrophobic sites shown at amino acid residues Met ¹ to Ser ¹⁸ and / or Pro ⁴⁴⁹ to Ser ⁴⁶⁸ . It is considered that one or more amino acid residues are deleted at one or both ends including.

부가적으로, 완전한 길이의 서열에서 맨처음 시스테인과 마지막 시스테인 잔기에 달할 때까지 아미노 말단과 카르복시 말단의 한쪽 또는 양 쪽에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 제거할 수 있을 것으로 생각된다. GDNFR 단백질이 적절하게 분자내 결합할 수 있도록 시스테인 잔기를 보유하는 것이 유리하다. 도 2(서열 2)의 완전한 길이의 인체 GDNFR 아미노산 서열에 나타나 있는 바와 같이, Met¹내지 Asp²⁸의 아미노산 잔기 중 일부 또는 전부를, Cys²⁹와 같은 맨처음 시스테인 잔기를 결실시키지 않은 채로 아미노 말단에서 제거할 수 있다. 마찬가지로, Gly⁴⁴³내지 Ser⁴⁶⁵의 아미노산 잔기 중 일부 또는 전부를, Cys⁴⁴²와 같은 마지막 시스테인 잔기를 결실시키지 않고서 카르복시 말단에서 제거할 수 있다. 도 4(서열 4)의 GDNFR 아미노산 서열에 나타나 있는 바와 같이, 아미노산 잔기 Cys²⁹내지 Cys⁴⁴³을 이용하여 즉, 아미노산 잔기 Met¹내지 Asp²⁸및/또는 Ser⁴⁴⁴내지 Ser⁴⁶⁸에 나타나 있는 말단 부위의 일부 또는 전부를 결실시킴으로써 다른 GDNFR 유사체를 제조할 수 있다.Additionally, it is contemplated that one or more amino acid residues may be removed from one or both of the amino terminus and carboxy terminus until the first and last cysteine residues are reached in the full length sequence. It is advantageous to have cysteine residues so that the GDNFR protein can bind appropriately intramolecularly. As shown in the full length human GDNFR amino acid sequence of FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), some or all of the amino acid residues of Met ¹ to Asp ²⁸ may be substituted at the amino terminus without deleting the first cysteine residue such as Cys ²⁹ . Can be removed. Likewise, some or all of the amino acid residues of Gly ⁴⁴³ to Ser ⁴⁶⁵ can be removed at the carboxy terminus without deleting the last cysteine residue such as Cys ⁴⁴² . As shown in the GDNFR amino acid sequence of FIG. 4 (SEQ ID NO: 4), using amino acid residues Cys ²⁹ to Cys ⁴⁴³ , ie, a portion of the terminal sites shown in amino acid residues Met ¹ to Asp ²⁸ and / or Ser ⁴⁴⁴ to Ser ⁴⁶⁸ Or by deleting all of the other GDNFR analogs.

같은 이유로, GDNFR 단백질 기능에 영향을 미치지 않으면서 확인된 아미노산 잔기를 결실시키기 보다는 치환할 수 있는 것으로 본 분야의 숙련자들은 인지할 것이다. 선택적으로, 확인된 아미노산 잔기는 GDNFR 단백질 기능에 영향을 미치지 않으면서 잔기내 삽입이나 말단 부가로 변이시킬 수 있다. 또다른 실시형태에 있어서, 결실, 치환이나 부가 중 하나 또는 그 이상을 연합하여 제조할 수 있다.For the same reason, those skilled in the art will recognize that they can substitute, rather than delete, identified amino acid residues without affecting GDNFR protein function. Optionally, identified amino acid residues can be mutated by insertion or terminal addition within the residue without affecting GDNFR protein function. In another embodiment, one or more of deletions, substitutions or additions can be made in combination.

본 GDNFR 단백질 또는 핵산은 치료용 의약 제조방법이나 치료방법에 사용할 수 있다. 이러한 치료는 GDNFR 단백질 과다 생산을 특징으로 하는 조건을 포함하는데, 여기에서 본 GDNFR, 특히 가용형은 초과분의 GDNF 단백질에 결합하여 그것을 불활성화시킨다. 이러한 치료는, 가용성 수용체를 제조하거나(예를들어, GDNF 결합 도메인의 용도) 이러한 GDNFR 을 함유하는 세포 집단을 제조하여 그것을 필요로 하는 개체에 이 세포를 이식함으로써 실시한다. 또한 본 GDNFR 단백질 산물은 결함이 있는 GDNFR 수용체를 갖는 환자 치료에 이용할 수 있다. 예를들어, 가용성 수용체를 제조 및 수송하거나 이러한 비 - 결함 GDNFR 을 함유하는 세포 집단을 제조하여 이 세포를 개체에 이식함으로써 결함이 있는 GDNFR 을 갖는 개체를 치료할 수 있다. 또는, 각 개체의 GDNF 수용체의 수가 불충분할 수 있으며, 각 개체에 이용할 수 있는GDNF 수용체의 수를 증가시키기 위해 이 수용체를 함유하는 세포를 이식할 수 있다. 이 조성물을 GDNF 수송과 연합하여 사용할 수 있다. c - ret 수용체 티로신 키나아제의 활성에 반응하는 증상 치료에 GDNFR 단백질 산물을 이용할 수 있을 것으로 생각된다.The GDNFR protein or nucleic acid can be used in the preparation or therapeutic method of therapeutic medicine. Such treatment includes conditions characterized by GDNFR protein overproduction, where GDNFR, particularly soluble forms, bind and inactivate excess GDNF protein. Such treatment is carried out by preparing soluble receptors (eg, using GDNF binding domains) or by preparing a population of cells containing such GDNFR and transplanting these cells into individuals in need thereof. The GDNFR protein product can also be used to treat patients with defective GDNFR receptors. For example, an individual with a defective GDNFR can be treated by making and transporting a soluble receptor or by preparing a population of cells containing such non-defective GDNFR and transplanting the cells into the individual. Alternatively, the number of GDNF receptors in each individual may be insufficient, and cells containing these receptors may be transplanted to increase the number of GDNF receptors available to each individual. This composition can be used in conjunction with GDNF transport. It is contemplated that GDNFR protein products may be used to treat symptoms in response to the activity of the c-ret receptor tyrosine kinase.

본 발명의 또다른 양상에 있어서, 신규한 조성물의 다른 이점은 GDNF 단백질 제약학적 조성물을 안정화시키기 위해 GDNFR 을 사용할 수 있는 것이다. 본 발명의 다른 양상에 있어서, GDNFR 은 화합물의 길항물질 활성도를 스크린하는 데 사용할 수 있다.In another aspect of the present invention, another advantage of the novel compositions is the ability to use GDNFR to stabilize GDNF protein pharmaceutical compositions. In another aspect of the invention, GDNFR can be used to screen antagonist activity of a compound.

본 발명의 그외의 양상과 이점은 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다. 예를들어, 부가적인 용도는 신규한 검정계, 형질전환 동물 및 항체 생산을 포함한다.Other aspects and advantages of the invention will be apparent to those skilled in the art. For example, additional uses include novel assay systems, transgenic animals, and antibody production.

연구 모델Research model

본 발명은 본 발명의 GDNFR 분자를 발현하는 세포나 세포주에서 유도되는 생리학적 반응을 측정함으로써 펩티드 또는 비 - 펩티드 화합물에 대한 노출에 의한 GDNF 활성과 유사한 GDNF 활성이 검출되는 검정계를 제공한다. 생리학적 반응은 다음을 포함하지만 이것으로 국한되지는않는 GDNF 의 생물학적 활성을 포함할 것이다 : 도파민 흡수, 신경돌기의 확장, 세포 성장이나 생존 강화 뿐 아니라 특정 핵산 서열(예를들어, 프로모터/인핸서 성분 및 구조 유전자)의 전사 활성, GDNF - 관련 프로세싱, 번역 또는 인산화 및 GDNF 에 의해 직·간접적으로 유도되는 과정으로 인한 2 차 과정 유도, 일부를 제외하고 열거함.The present invention provides assay systems in which GDNF activity similar to GDNF activity by exposure to peptide or non-peptide compounds is detected by measuring physiological responses induced in cells or cell lines expressing the GDNFR molecules of the invention. Physiological responses will include the biological activity of GDNF, including but not limited to: dopamine uptake, neurite expansion, cell growth or survival enhancement, as well as specific nucleic acid sequences (e.g., promoter / enhancer components and Transcriptional activity of structural genes), induction of secondary processes due to GDNF-related processing, translation or phosphorylation, and processes induced directly or indirectly by GDNF, with some exceptions.

예를들어, 모델계는 과도한 GDNF 활성 효과를 연구하기 위해 사용하도록 만든다. 이러한 계에 있어서, GDNF 에 대한 세포 반응은 이렇게 변이되지 않은 세포에 비하여 그 수가 증가한 모델계 세포의 GDNFR 을 조작함으로써 증가시킬 수 있다. 또한 이 계는 정상적으로 GDNFR 을 발현하는 세포에 대하여 증가된 수의 GDNFR 을 선택적으로 제공하도록 개발할 수 있다. GDNFR 이 발현되도록 하기 위해, 적당한 프로모터 서열의 조절하에 GDNFR 유전자를 둔다. 구성 및/또는 조직 특이 프로모터(CNS 신경원 특이 에놀라아제, 신경사상체 및 티로신 수산화효소 프로모터), 유도가능한 프로모터(메탈로티오네인 프로모터와 같은), 인체 면역결핍 바이러스 말단 반복 배열내 UV 활성 프로모터(Valeri 등의 1988, Nature 333 : 78 - 81) 또는 CMV 프로모터(하기 pCMX 에 포함됨)나 발육 조절 프로모터 조절하에 GDNFR 유전자를 두는 것이 바람직하다.For example, the model system can be used to study the effects of excessive GDNF activity. In such systems, cellular responses to GDNF can be increased by manipulating the GDNFR of model line cells with an increased number compared to cells that are not mutated. This system can also be developed to selectively provide an increased number of GDNFRs for cells that normally express GDNFRs. In order for GDNFR to be expressed, the GDNFR gene is placed under the control of an appropriate promoter sequence. Constitutive and / or tissue specific promoters (CNS neuronal specific enolase, neuronal and tyrosine hydroxylase promoters), inducible promoters (such as metallothionein promoters), UV active promoters in human immunodeficiency virus terminal repeat sequences (Valeri) 1988, Nature 333: 78-81) or CMV promoter (included in pCMX below) or developmentally regulated promoter is preferably placed under the GDNFR gene.

세포내 GDNFR 수를 증가시킴으로써, 내생 GDNF 반응을 증가시킬 수있다. 모델계가 GDNF 를 거의 또는 전혀 함유하지 않는다면, GDNF 를 계에 가할 수도 있다. 또한 초과분의 GDNF 활성 효과를 측정하기 위해 모델계에 부가적인 GDNF 를 가하는 것이 바람직하다. 과다발현된 GDNF(또는 분비된 GDNF)는 GDNF 를 이미 발현한 세포의 상승 수준 효과를 연구하는 한 방법일 수 있다.By increasing the number of intracellular GDNFRs, it is possible to increase the endogenous GDNF response. If the model system contains little or no GDNF, GDNF may be added to the system. It is also desirable to add additional GDNF to the model system to measure excess GDNF activity effects. Overexpressed GDNF (or secreted GDNF) may be one way to study the synergistic level effects of cells that have already expressed GDNF.

GDNFR 치료GDNFR Treatment

다른 양상에 있어서, GDNF 반응성을 증가시킴으로써 특정 조건이 유익해질 수 있다. 따라서, GDNF 치료에 민감한 질환을 앓고 있는 환자에게서 GDNFR 의 수나 결합 친화성을 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 이것은 적당한 세포내 재조합 GDNFR 을 선택적으로 발현시키는 유전자 치료를 통해 이루어질 수 있는데, 조직 특이 프로모터나 유도가능한 프로모터에 의해 조절되는 GDNFR 유전자를 사용하거나 재조합 GDNFR 유전자를 운반하는 복제 결함 바이러스로 국부 감염시켜 생산한다.In other aspects, certain conditions may be beneficial by increasing GDNF reactivity. Therefore, it would be desirable to increase the number or binding affinity of GDNFR in patients suffering from diseases susceptible to GDNF treatment. This can be achieved through gene therapy to selectively express the appropriate intracellular recombinant GDNFR, which is produced either locally using a GDNFR gene regulated by a tissue specific promoter or inducible promoter or locally infected with a replication defective virus carrying the recombinant GDNFR gene. .

GDNFR 또는 GDNF/GDNFR 연합 수송으로 완화되는 질환은 근위축성측삭경화증을 포함한 운동신경원 질환, 당뇨병, 파킨슨병, 알쯔하이머병과 관련된 신경학적 질환 및 헌팅톤무도병을 포함하지만 이것으로 국한되지는 않는 것으로 생각된다. GDNFR 또는 GDNF/GDNFR 연합 수송에 이용하기위한 부가적인 적용은 하기하며, 다음의 치료를 더 포함한다 : 망막신경절 세포 변성을 포함한 녹내장이나 그외의 질환 및 증상 ; 감각신경원의 변성이나 손상에 의해 야기되는 감각신경병 ; 광수용체 변성이 일어나고 시각 손실의 원인이 되는 손상 - 관련 망막증, 유전적 망막 변성 및 연령, 질환과 같은 병리학적 증상 ; 및 여러 원인에서 기인하는 청각 손실 예방 및/또는 치료를 위한 모세포와 청각신경원 같은 내이 감각신경원의 손상이나 변성.Diseases ameliorated by GDNFR or GDNF / GDNFR federated transport include, but are not limited to, motor neuron diseases including amyotrophic lateral sclerosis, neurological diseases associated with diabetes, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and Huntington's chorea. Additional applications for use in GDNFR or GDNF / GDNFR federated transport further include the following treatments: glaucoma or other diseases and symptoms, including retinal ganglion cell degeneration; Sensory neuropathy caused by degeneration or damage of sensory neurons; Damages that cause photoreceptor degeneration and cause visual loss-related symptoms such as retinopathy, genetic retinal degeneration and age, disease; And damage or degeneration of inner ear sensory neurons, such as parental cells and auditory neurons, for the prevention and / or treatment of hearing loss due to a variety of causes.

형질전환 동물Transgenic animals

또다른 양상에 있어서, 재조합 GDNFR 유전자는 내생 유전자를 '넉 아웃(knock out)' 시키거나(예를들어, 상동 재조합에 의해) 불활성화 시키는데 사용하며, 그로 인해 GDNFR 결핍 세포, 조직 또는 동물이 형성된다. 예를들어, 재조합 GDNFR 유전자는 GDNFR 을 불활성화시키는 삽입 돌연변이를 내포하도록 변이시킬 수 있다. 적당한 프로모터의 조절하에, 이러한 구성물은 형질감염, 트랜스덕션, 주입 등을 포함한 통상적인 기술을 이용하여 배의 간세포와 같은 세포내로 도입된다. 그런 다음 구성물을 함유하는 세포는 예를들어 G418 내성으로 선택한다. 원래의 GDNFR 유전자가 결핍된 세포를 확인한다(예를들어, 서던 블롯팅이나 노던 블롯팅 또는 발현 검정에 의해). 원래의 GDNFR 유전자가 결핍된 세포는 초기 배세포에 융합되어 GDNFR 결핍 형질전환 동물을 형성한다. 내생 GDNF 를 발현하지 못하는 동물과 이 동물을 비교하면, 두 표현형 중 하나가 완전히 맞아 떨어지거나 그렇지 않음을 알 수 있는데 이것은 부가적인 GDNF - 유사 인자 또는 수용체가 존재함을 의미한다. 이러한 동물은 특이 신경원 집단 또는 그외의 생체내 돌기, GDNF 에 대한 정상적인 의존성을 확인하는 데 사용한다. 따라서, 이러한 집단이나 돌기는 동물이 GDNFR 을 발현하지 못하여 GDNF 에 반응할 수 없다면 영향을 받지 않을 것으로 기대된다.In another aspect, the recombinant GDNFR gene is used to 'knock out' the endogenous gene (eg, by homologous recombination) or thereby inactivate GDNFR deficient cells, tissues or animals. do. For example, recombinant GDNFR genes can be mutated to contain insertional mutations that inactivate GDNFR. Under the control of appropriate promoters, these constructs are introduced into cells, such as embryonic hepatocytes, using conventional techniques, including transfection, transduction, infusion, and the like. The cells containing the construct are then selected for example G418 resistance. Identify cells lacking the original GDNFR gene (eg, by Southern blotting or Northern blotting or expression assays). Cells deficient in the original GDNFR gene are fused to early germ cells to form GDNFR deficient transgenic animals. Comparing this animal with an animal that does not express an endogenous GDNF, one can see that either phenotype is completely mismatched or not, which means that additional GDNF-like factors or receptors are present. Such animals are used to identify specific neuronal populations or other in vivo processes, normal dependence on GDNF. Therefore, these populations or projections are expected to be unaffected if the animals are unable to express GDNFR and therefore cannot respond to GDNF.

진단 적용Diagnostic application

본 발명에 따른 GDNFR 프로브는 정상 상태나 질환 상태에서 GDNF 에 민감한 세포와 조직을 확인하는 데 사용한다. 본 발명은 이러한 세포에서 발현되는 GDNFR 을 검출함으로써 GDNF 에 민감한 세포를 확인하는 방법을 제공한다. GDNFR mRNA 전사 또는 GDNFR 단백질 생산으로 GDNFR 발현을 입증한다. GDNFR 발현은 GDNFR 핵산이나 단백질을 확인하는 프로브를 사용하거나 GDNFR 단백질에 인위적으로 부가되는 '표식' 을 검출함으로써 검출할 수 있다.The GDNFR probe according to the present invention is used to identify cells and tissues sensitive to GDNF in a normal or diseased state. The present invention provides a method for identifying cells that are sensitive to GDNF by detecting GDNFR expressed in such cells. GDNFR mRNA transcription or GDNFR protein production demonstrates GDNFR expression. GDNFR expression can be detected by using probes to identify GDNFR nucleic acids or proteins or by detecting 'markers' that are artificially added to the GDNFR protein.

GDNFR 발현을 검출하는 데 사용하는 프로브 중 하나는 핵산 프로브이며, 이것은 정상소재 혼성화, 노던 블롯 분석 또는 PCR 관련 기술을 포함하지만 이에 국한되지는 않은 본 분야에 공지된 모든 기술에 의해 GDNFR - 코딩 RNA 를 검출하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 핵산 산물은 검출가능한 마커(비오틴처럼 방사성표식 및 비 - 동위원소 표식과 같은)로 표지하여 염색체 지도에서 인체 GDNFR 유전자의 위치 및/또는 모든 관련 유전자군의 위치를 찾아내는 혼성 과정에 사용할 수 있다. 또한 DNA 수준에서 인체 GDNFR 유전자 질환을 확인하는 데에도 사용할 수 있으며 인접 유전자와 그 질환을 확인하는 유전자 마커로도 사용할 수 있다. 본원에서는 이러한 표지 물질을 함유하는 키트도 고려된다.One of the probes used to detect GDNFR expression is a nucleic acid probe, which encodes GDNFR-encoding RNA by any technique known in the art, including, but not limited to, normal hybridization, northern blot analysis, or PCR related techniques. Can be used to detect. Nucleic acid products of the present invention can be labeled with detectable markers (such as radiolabels and non-isotopic markers like biotin) and used in hybrid processes to locate the position of the human GDNFR gene and / or all related gene families on a chromosome map. have. It can also be used to identify human GDNFR genetic disorders at the DNA level and as a genetic marker to identify adjacent genes and their disorders. Kits containing such labeling materials are also contemplated herein.

본 발명의 폴리펩티드 산물은 검출가능한 마커 물질이나 표식(예를들어, 방사능 동위원소, 형광화학 제품 또는 화학발광 제품, 효소 또는 그외에 본 분야의 숙련자들이 입수가능한 표식)과 결합시킴으로써 표지하여 혈액이나 뇨와 같은 액체 시료와 고체 조직에서의 GDNF 검출 및 정량에 유용한 시약을 제공한다. 이러한 산물은 또한 정상 상태나 질병 상태에서 GDNF 에 민감한 세포와 조직을 검출하는 데 사용할 것이다.Polypeptide products of the invention can be labeled by incorporating detectable marker substances or labels (e.g., radioisotopes, fluorescent chemical or chemiluminescent products, enzymes or other labels available to those skilled in the art) to provide blood or urine It provides reagents useful for the detection and quantification of GDNF in liquid samples and solid tissues. These products will also be used to detect cells and tissues that are sensitive to GDNF in normal or diseased states.

실험 시료내 GDNF 의 존재를 검출하거나 GDNF - 유사 분자의 존재를스크린하는 다른 가능한 검정은 고체상에 고정시킨 GDNFR 펩티드와 실험 시료를 접촉시켜 GDNFR 이 결합된 GDNF 를 생산하는 것이다. GDNFR 이 결합된 GDNF 는 GDNF 에 특이하게 표지되는 항체와 같은 검출 시약과 임의적으로 접촉시켜 검출가능한 산물을 생산한다. 이 검정은 실험 시료를 분석하기 위한 검정 기구의 형태에서 발전하였다. 기본형으로서의 이 기구는 GDNFR 을 내포하거나 그것으로 피복된 고체상을 포함한다. GDNF 존재에 대하여 실험 시료를 분석하는 방법은 GDNFR 단백질을 함유하는 검정 시약과 시료를 접촉시킴을 포함하는데, 여기에서 상기 GDNFR 단백질은 실험 시료에 존재하는 GDNF 와 반응하며 GDNF 가 존재함을 나타내는 검출가능한 반응 산물을 생산한다.Another possible assay for detecting the presence of GDNF or screening for the presence of GDNF-like molecules in a test sample is to contact the test sample with a GDNFR peptide immobilized on a solid phase to produce a GDNFR bound GDNF. GDNFs to which GDNFRs bind are optionally contacted with a detection reagent such as an antibody that is specifically labeled for GDNF to produce a detectable product. This assay was developed in the form of an assay instrument for analyzing experimental samples. As a base form, the apparatus includes a solid phase containing or coated with GDNFR. Methods of analyzing a test sample for the presence of GDNF include contacting the sample with an assay reagent containing a GDNFR protein, wherein the GDNFR protein reacts with the GDNF present in the test sample and indicates that the GDNF is present. Produce the reaction product.

본원에서 제공되는 검정 시약도 제조용 키트나 품목의 일부로 포함된다. 패키징 물질 및 현재 제공되는 핵산 서열이나 아미노산 서열 중 하나 또는 그 이상의 제제를 포함하는 제조용 품목도 고려된다. 이러한 패키징 물질은 제제가 생물학적 시료내에서 GDNF, GDNFR 또는 GDNFR 결핍을 검출하는 데 유용함을 나타내는 표식을 포함할 것이다. 이와 같이, 키트는 선택적으로 이러한 실험을 실시하는 물질, 예를들어 혈액, 뇨 또는 조직 시료에 대한 단백질 분석, DNA 나 RNA 혼성화 분석 또는 PCR 분석에 유용한 시약을 포함할 것이다.Assay reagents provided herein are also included as part of the preparation kit or item. Also contemplated are articles of manufacture comprising a packaging material and one or more agents of the currently provided nucleic acid or amino acid sequences. Such packaging materials will include a label indicating that the agent is useful for detecting GDNF, GDNFR or GDNFR deficiency in a biological sample. As such, the kit will optionally include reagents useful for the material conducting these experiments, eg, protein analysis, DNA or RNA hybridization analysis, or PCR analysis of blood, urine, or tissue samples.

항 - GDNFR 항체Anti-GDNFR antibodies

본 발명에 따른 GDNFR 단백질 또는 그것의 단편이나 유도체는 항 - GDNFR 항체를 생산하는 면역원으로 사용할 수 있다. 항 - GDNFR 면역 반응을 일으킬 가능성을 더 높이기 위해서, 면역원성 증가와 관련된 분자 부분을 확인하기 위해 GDNFR 의 아미노산 서열을 분석한다. 예를들어, GDNFR 의 친수성, 표면 확률, 굴곡성, 항원 지수, 양친매성 나사선, 양친매성 쉬트와 이차 구조를 컴퓨터 도표로 나타내어 표면 에피토프를 확인할 수 있도록 아미노산 서열을 컴퓨터로 분석하였다. 대안으로서, 상이한 종의 아미노산 서열과 GDNFR 을 비교하여 상대적으로 비 - 상동 부위를 확인할 수 있다 ; 이 비 - 상동 부위는 다양한 종에 대하여 면역원일 것이다.GDNFR proteins or fragments or derivatives thereof according to the invention can be used as immunogens to produce anti-GDNFR antibodies. To further increase the likelihood of causing an anti-GDNFR immune response, the amino acid sequence of GDNFR is analyzed to identify the molecular moiety associated with increased immunogenicity. For example, the amino acid sequences were analyzed by computer to identify surface epitopes by showing a graphical representation of the hydrophilicity, surface probability, flexibility, antigenic index, amphiphilic helix, amphiphilic sheet, and secondary structure of GDNFR. As an alternative, relatively non-homologous sites can be identified by comparing GDNFRs with amino acid sequences of different species; This non-homologous site will be an immunogen against various species.

단지 연속적인 아미노산 서열이나 GDNFR 내부의 2 차 입체형태의 일부로서 복제되는 폴리펩티드 단편도 생각할 수 있는데, 이 단편은 포유동물 GDNFR 의 활성(예를들어, 면역학적 활성)은 가지며 다른 것(예를들어, GDNF 단백질 결합 활성)은 갖지 않는다. 따라서, 항체 생산은 항 - 펩티드 항체 생산을 포함한다. 하기 전형적인 펩티드는 GDNFR 서열을 이용하여 합성하였다.You can also think of polypeptide fragments that only replicate as part of a contiguous amino acid sequence or as a secondary conformation within GDNFR, which has the activity (eg immunological activity) of mammalian GDNFR and the others (eg , GDNF protein binding activity). Thus, antibody production includes anti-peptide antibody production. The following typical peptides were synthesized using GDNFR sequences.

펩티드 SJP - 6, 7 및 8 은 랫과 인체 GDNFR 에서 확인된다. 펩티드 SJP - 9 와 10 은 랫 서열에서 유도되며 각각은 인체와는 상이한 아미노산이다. 이 펩티드 또는 그외의 GDNFR 부분을 이용하여 본 분야에 공지된 방법으로 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 둘다를 제조할 수 있다.Peptides SJP-6, 7 and 8 are identified in rat and human GDNFR. Peptides SJP-9 and 10 are derived from rat sequences and each is an amino acid different from the human body. This peptide or other GDNFR moiety can be used to prepare both polyclonal and monoclonal antibodies by methods known in the art.

GDNFR 에 대한 모노클로날 항체는 배양액내 연속 세포주에 의해 항체 분자를 생산하는 모든 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를들어, 하이브리도마 기술은 원래 모노클로날 항체를 생산하기 위해 Kohler 와 Milstein 에 의해 개발되었으며(Nature, 256 : 495 - 497, 1975 참조), 트리오마 기술, 인체 B - 세포 하이브리도마 기술(Kozber 등의 Immunology Today 4 : 72, 1983 참조), EBV - 하이브리도마 기술(Cole 등의 in 'Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 'Alan R. Liss, Inc.pp. 77 - 96, 1985 참조) 등이 사용될 수 있다.Monoclonal antibodies against GDNFR can be prepared by any known method for producing antibody molecules by continuous cell lines in culture. For example, hybridoma technology was originally developed by Kohler and Milstein to produce monoclonal antibodies (see Nature, 256: 495-497, 1975), trioma technology, human B-cell hybridoma technology. (See Immunology Today 4: 72, 1983 by Kozber et al.), EBV-hybridoma technology (see Cole et al. In 'Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,' Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96, 1985), etc. This can be used.

인체 모노클로날 항체나 키메라 인체 - 마우스(또는 그외의 다른 종) 모노클로날 항체를 치료 용도를 위해 제조할 수 있으며, 본 분야에 공지된 다수의 모든 기술로 제조할 수 있다(예를들어, Teng 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 80 : 7308 - 7312, 1983 ; Kozber 등의 Immunology Today, 4 : 72 - 79, 1983 ; Olsson 등의 meth. Enzymol., 92 : 3 - 16, 1982 참조). 키메라 항체 분자는 인체 불변 영역을 갖는 마우스 항원 - 결합 도메인을 함유하도록 제조된다(Morrison 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81 : 6851, 1984 ; Takeda 등의 Nature, 314 : 452, 1985 참조).Human monoclonal antibodies or chimeric human-mouse (or other species) monoclonal antibodies can be prepared for therapeutic use and can be prepared by any of a number of techniques known in the art (eg, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 7308-7312, 1983; Immunology Today, Kozber et al., 4: 72-79, 1983; meth.Enzymol., Olsson et al., 92: 3-16, 1982 Reference). Chimeric antibody molecules are prepared to contain a mouse antigen-binding domain with human constant regions (see Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851, 1984; Takeda et al. Nature, 314: 452, 1985). ).

본 분야에서 공지된 여러 방법을 폴리클로날 항체 생산에 이용할 수 있다. 항체 생산을 위해, 토끼, 마우스, 랫 등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 여러 숙주 동물에 GDNFR 단백질이나 그것의 단편이나 유도체를 주사함으로써 그것을 면역화시킬 수 있다. 선택한 숙주 종에 따라, 면역 반응을 증가시키기 위해 여러 보조제를 사용할 수 있다. 유용한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다 : 프로인트 완전 보조제와 불완전 보조제, 수산화 알루미늄 같은 미네랄 겔, 리소레시틴 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모사이아닌, 디니트로페놀 및 BCG(바실레 칼메트 - 구에린)과 코리네박테륨 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 인체 보조제.Several methods known in the art can be used for the production of polyclonal antibodies. For antibody production, several host animals, including but not limited to rabbits, mice, rats, and the like, can be immunized by injecting GDNFR proteins or fragments or derivatives thereof. Depending on the host species chosen, several adjuvants may be used to increase the immune response. Useful auxiliaries include, but are not limited to: Freund's complete and incomplete auxiliaries, mineral gels such as aluminum hydroxide, surface active substances such as lysocithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet het Human supplements such as mocyanine, dinitrophenol and BCG (Basile Calmet-Guerin) and Corynebacterium parvum.

GDNFR 에피토프에 대한 항체의 분자 클론은 공지된 기술에 의해 제조할 수 있다. 재조합 DNA 방법학[예를들어, Maniatis 등의 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982 참조]은 모노클로날 항체 분자나 그것의 항원 결합 부위를 코드하는 핵산 서열을 구성하는 데 사용할 수 있다.Molecular clones of antibodies to GDNFR epitopes can be prepared by known techniques. Recombinant DNA methodology (see, eg, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982) by Maniatis et al. Nucleic acid sequences encoding monoclonal antibody molecules or antigen binding sites thereof Can be used to construct

항체 분자는 공지 기술, 예를들어 면역흡착 또는 면역친화 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법 또는 그것을 연합하여 정제할 수 있다. 본 발명은 항체 분자 뿐 아니라 그것의 단편을 제공한다. 분자의 유전형을 함유하는 항체 단편은 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 예를들어, 이러한 단편은 다음을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다 : 항체 분자의 펩신 절단에 의해 생산될 수 있는 F(ab') 2 단편 ; F(ab') 2 단편의 이황화물 다리를 환원시킴으로써 생산할 수 있는 Fab' 단편 및 파파인과 환원제로 항체 분자를 처리함으로써 생산할 수 있는 Fab 단편.Antibody molecules can be purified by known techniques such as immunosorbent or immunoaffinity chromatography, chromatographic methods such as high performance liquid chromatography, or by combining them. The present invention provides antibody molecules as well as fragments thereof. Antibody fragments containing the genotype of the molecule can be produced by known methods. For example, such fragments include, but are not limited to: F (ab ') 2 fragments that can be produced by pepsin cleavage of antibody molecules; Fab 'fragments that can be produced by reducing the disulfide bridges of F (ab') 2 fragments and Fab fragments that can be produced by treating antibody molecules with papain and a reducing agent.

이러한 선택적인 결합 분자는 GDNFR 단백질의 대안일 수 있으며, 제약학적 조성물로 제형화할 수 있다.Such selective binding molecules may be an alternative to GDNFR proteins and may be formulated into pharmaceutical compositions.

GDNFR 단백질의 재조합 발현Recombinant Expression of GDNFR Protein

본 발명은 GDNFR 단백질을 코드하는 다양한 폴리누클레오티드를 제공한다. 발현 산물이나 그 유도체는, 도파민작용성 세포에 의한 도파민 흡수 증가와 같은 GDNF 활성을 제공하거나 강화시킴으로써 시그널 분자와의 상호작용이 일어나도록 높은 친화성으로 특이하게 GDNF 에 결합하는 능력을 갖는 것이 특징이다. 세포 치료나 유전자 치료에도 폴리누클레오티드를 사용할 수 있다.The present invention provides various polynucleotides encoding GDNFR proteins. Expression products or derivatives thereof are characterized by having the ability to specifically bind GDNF with high affinity such that interaction with signal molecules occurs by providing or enhancing GDNF activity, such as increased dopamine uptake by dopaminergic cells. . Polynucleotides can also be used for cell therapy and gene therapy.

본 발명에 따라, 신규한 GDNFR 단백질과 이 수용체의 전부 또는 일부를 코드하는 DNA 서열이 제공된다. 본 발명의 신규한 핵산 서열은 1 차 구조 입체형태의 적어도 한 부분과 재조합 인체 GDNFR 의 생물학적 특성 중 하나 또는 그 이상을 갖는 폴리펩티드 산물의 진핵 또는 원핵 숙주 세포 발현을 안정시키는 데 유용한 서열을 포함한다. 원하는 코딩 부분이 본 폴리펩티드 생산에 유용하도록 핵산을 분리정제한다. 선택적으로, 하기에 보다 충분히 기술하는 바와 같이 핵산 서열을 진단 목적에 사용할 수 있다. 본 발명의 전형적인 DNA서열은 도 2 와 4 에 나타나 있고 서열 2 와 4 에 기술되어 있는 GDNFR 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함한다. 부가적으로, 본 발명에 기술된 DNA 서열은 특히 다음을 포함한다 : (a) 도 1 과 3 에 나타나 있는 DNA 서열(및 상보 가닥) ; (b) 아부분(a)의 DNA 서열 또는 그 단편과 혼성되는(하기 cDNA 라이브러리 스크리닝 항목에 기술된 혼성 조건이나 그에 상당하는 조건 또는 보다 엄격한 조건하에서) DNA 서열 ; 및 (c) 유전 암호의 동의성을 제외하고는, 아부분(a)의 DNA 서열에 혼성되는 DNA 서열. (b) 와 (c) 에 특히 포함되는 것은 인체 GDNFR 의 대립형질 변이체를 코드하고/하거나 그외의 포유동물 종의 GDNFR 을 코드하는 게놈 DNA 서열과 GDNFR, GDNFR 단편 및 GDNFR 유사체를 코드하는 제조 DNA 서열이며, 이 DNA 서열에 미생물 숙주내 메신저 RNA 의 전사와 번역을 용이하게 하는 코돈을 결합시킬 수 있다. 이렇게 제조한 서열은 본원에 기술한 기술 뿐 아니라 본 분야에 공지된 방법에 따라 용이하게 파악할 수 있다.In accordance with the present invention, novel GDNFR proteins and DNA sequences encoding all or part of these receptors are provided. The novel nucleic acid sequences of the present invention comprise sequences useful for stabilizing eukaryotic or prokaryotic host cell expression of polypeptide products having at least one portion of the primary structural conformation and the biological properties of recombinant human GDNFR. Nucleic acid is purified so that the desired coding moiety is useful for the production of the polypeptide. Optionally, nucleic acid sequences can be used for diagnostic purposes, as described more fully below. Typical DNA sequences of the present invention include nucleic acid sequences encoding the GDNFR amino acid sequences shown in FIGS. 2 and 4 and described in SEQ ID NOs: 2 and 4. In addition, the DNA sequences described herein include, in particular, the following: (a) the DNA sequences (and complementary strands) shown in FIGS. 1 and 3; (b) a DNA sequence that hybridizes with the DNA sequence of subpart (a) or a fragment thereof (under the hybridization conditions or equivalent conditions or more stringent conditions described in the cDNA library screening section below); And (c) a DNA sequence that hybridizes to the DNA sequence of subpart (a), except for the synonym of the genetic code. Particularly included in (b) and (c) are genomic DNA sequences encoding allelic variants of human GDNFR and / or GDNFR of other mammalian species and preparative DNA sequences encoding GDNFR, GDNFR fragments and GDNFR analogs. This DNA sequence can bind a codon that facilitates the transcription and translation of messenger RNA in the microbial host. The sequences thus prepared can be readily identified according to the techniques described herein as well as methods known in the art.

본원에 기술된 방법 또는 그외의 공지된 방법에 따라 실시하는 재조합 발현 기술을, 이 폴리누클레오티드를 생산하고 각각의 GDNFR 단백질을 발현하는 데 사용한다. 예를들어, GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열을 적절한 벡터로 삽입함으로써 본 분야의 숙련자들은 용이하게 원하는 누클레오티드 서열을 대량 생산할 수 있다. 이 서열은 검출 프로브나 증폭 프라이머를 만드는 데 사용할 수 있다. 선택적으로, GDNFR 단백질을 코드하는 폴리누클레오티드를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 적당한 숙주 내로 발현 벡터를 삽입함으로써 원하는 GDNFR 단백질을 대량으로 생산할 수 있다.Recombinant expression techniques, carried out in accordance with the methods described herein or other known methods, are used to produce this polynucleotide and express each GDNFR protein. For example, by inserting a nucleic acid sequence encoding a GDNFR protein into an appropriate vector, one of ordinary skill in the art can readily produce large quantities of the desired nucleotide sequence. This sequence can be used to make detection probes or amplification primers. Optionally, polynucleotides encoding GDNFR proteins can be inserted into the expression vector. By inserting an expression vector into a suitable host, the desired GDNFR protein can be produced in large quantities.

본원에 기술한 바와 같이, 핵산 서열을 증식시키고/시키거나 GDNFR 단백질을 생산하기 위해 사용가능한 숙주/벡터계가 다수 존재한다. 여기에는 플라스미드, 바이러스 벡터, 삽입 벡터, 원핵 숙주와 진핵 숙주가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 본 분야의 숙련자들은 본 발명의 서열을 생산하거나 발현시키기 위해 이형 DNA 를 증식시키거나 발현시킬 수 있는 숙주/벡터계를 사용할 수 있다.As described herein, there are a number of host / vector systems available for propagating nucleic acid sequences and / or producing GDNFR proteins. This includes, but is not limited to, plasmids, viral vectors, insertion vectors, prokaryotic and eukaryotic hosts. Those skilled in the art can use host / vector systems capable of propagating or expressing heterologous DNA to produce or express the sequences of the invention.

이러한 재조합 기술을 사용하여, 순도 높은 본 발명의 GDNFR 단백질을 상업적인 양으로 용이하게 생산한다. 더욱이, 신규한 핵산 서열은 도면에 특이하게 기술한 GDNFR 단백질을 코드하는 동의성 핵산 서열, GDNFR 단백질 변이체를 코드하는 서열 및 이들 핵산 서열에 상보적으로 혼성되는(바람직하게, 엄격한 혼성 조건하에서) 핵산 서열을 포함하는 것으로 본 분야의 숙련자들은 본 명세서를 참조하여 인지할 것이다 [Maniatis 등의 Molecular Cloning(A Laboratory Manual) ; Cold Spring Harbor Laboratory, Pages 387 - 389, 1982 참조]. 전형적인 엄격한혼성 조건은 62 - 67 ℃ 의 4 × SSC 에서 혼성시킨 다음 62 - 67 ℃ 의 0.1 × SSC 에서 약 1 시간동안 세척하는 것이다. 대안으로서의 전형적인 엄격한 혼성 조건은 40 - 45 ℃ 의 45 - 55 % 포름아미드, 4 × SSC 에서 혼성하는 것이다. 완화된 혼성 조건하에서 GDNFR 단백질의 상보 서열에 혼성되고 본 발명의 GDNFR 단백질을 코드하는 DNA 서열 또한 본원에 기술되어 있다. 완화된 혼성 조건의 예는 45 - 55 ℃ 의 4 × SSC 또는 40 - 45 ℃ 의 30 - 40 % 포름아미드로 혼성하는 것이다.Using this recombinant technique, the high purity GDNFR proteins of the present invention are readily produced in commercial quantities. Moreover, the novel nucleic acid sequences are nucleic acid sequences that synergistically hybridize (preferably under stringent hybrid conditions) to synonymous nucleic acid sequences encoding GDNFR proteins, sequences encoding GDNFR protein variants, and those nucleic acid sequences specifically described in the figures. Those skilled in the art will recognize that a sequence is included by reference to Molecular Cloning (A Laboratory Manual) by Manatis et al .; Cold Spring Harbor Laboratory, Pages 387-389, 1982. Typical stringent hybrid conditions are hybridization in 4 × SSC at 62-67 ° C. followed by washing in 0.1 × SSC at 62-67 ° C. for about 1 hour. Typical stringent hybrid conditions as an alternative are those that hybridize in 45-55% formamide, 4 × SSC at 40-45 ° C. Also described herein are DNA sequences that hybridize to the complementary sequences of GDNFR proteins under relaxed hybridization conditions and encode the GDNFR proteins of the invention. Examples of relaxed hybridization conditions are hybridization with 4 × SSC at 45-55 ° C. or 30-40% formamide at 40-45 ° C.

GDNFR 을 코드하는 폴리누클레오티드 제조Polynucleotide Production Encoding GDNFR

본 발명의 명세서를 토대로, 완전한 길이의 GDNFR 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열 또는 그 단편은 화학 합성, cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝, 발현 라이브러리 스크리닝 및/또는 cDNA PCR 증폭을 포함한 다양한 방법으로 용이하게 제조하거나 수득할 수 있으며 이 방법들로 제한되지는 않는다. 핵산 서열을 제조하는 데 유용한 이들 방법과 그외의 방법들은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를들어 Sambrook 등의(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Ausubel 등의 eds(Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, 1994) 및 Berger 와 Kimmel 의(Methods in Enzymology : Guide toMolecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987)에 기술되어 있다. GDNFR 을 코드하는 바람직한 핵산 서열은 포유동물 서열이다.Based on the present disclosure, nucleic acid sequences or fragments thereof encoding full-length GDNFR polypeptides may be readily prepared or obtained by a variety of methods, including chemical synthesis, cDNA or genomic library screening, expression library screening, and / or cDNA PCR amplification. It is possible and may not be limited to these methods. These and other methods useful for preparing nucleic acid sequences are known in the art and are described, for example, in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Eds of Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, 1994) and Berger and Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987). Described. Preferred nucleic acid sequences encoding GDNFR are mammalian sequences.

GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열의 화학 합성은 Engels 등의 (Angew. Chem. Intl. Ed., 28 : 716 - 734, 1989)에 기술된 바와 같이 본 분야에 공지된 방법을 이용하여 이룰 수 있다. 그 중에서도 이러한 방법은 포스포트리에스테르, 포스포르아미디트 및 H - 포스포네이트 핵산 서열 합성 방법을 포함한다. 화학 합성에 바람직한 방법은 표준 포스포르아미디트 화학을 이용한 중합체 - 지지 합성이다. 전형적으로, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 는 그 길이가 수백 염기쌍(bp) 또는 누클레오티드일 것이다. 100 누클레오티드 보다 큰 핵산 서열은 이 방법을 이용하여 수 개의 단편으로 합성할 수 있다. 그런 다음 이 단편들을 서로 결합시켜 완전한 길이의 GDNFR 폴리펩티드를 발현하는 서열 또는 그것의 일부가 되도록 할 수 있다.Chemical synthesis of nucleic acid sequences encoding GDNFR proteins can be accomplished using methods known in the art as described in Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734, 1989). Among others, such methods include phosphoester, phosphoramidite and H-phosphonate nucleic acid sequence synthesis methods. A preferred method for chemical synthesis is polymer-supported synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Typically, the DNA encoding the desired polypeptide will be several hundred base pairs (bp) or nucleotide in length. Nucleic acid sequences larger than 100 nucleotides can be synthesized into several fragments using this method. These fragments can then be joined together so that they are part of or a sequence expressing a full length GDNFR polypeptide.

선택적으로, 적당한 핵산 서열은 적당한 cDNA 라이브러리(즉, 단백질을 발현하는 것으로 여겨지는 조직원 중 하나 또는 그 이상에서 제조한 라이브러리) 또는 게놈 라이브러리(총 게놈 DNA 에서 제조한 라이브러리)를 스크리닝 함으로써 수득한다. cDNA 라이브러리의 원은 일반적으로적당량의 GDNFR 을 발현하는 것으로 여겨지는 조직이다. 일반적으로, 게놈 라이브러리 원은 GDNFR 을 코드하는 유전자를 내포하는 것으로 여겨지는 포유동물 종의 어떤 조직이다. 라이브러리에 존재하는 GDNFR cDNA 또는 유전자와 선택적으로 혼성되는 하나 또는 그 이상의 핵산 프로브(현재 기술된 서열을 토대로 한 올리고누클레오티드, cDNA 또는 게놈 DNA 단편)를 이용하여 GDNFR cDNA/유전자의 존재에 대하여 라이브러리를 스크린할 수 있다. 이러한 라이브러리 스크리닝에 사용하는 전형적인 프로브는 통상 라이브러리를 제조하는 종과 같거나 유사한 종의 GDNFR 핵산 서열 중 소부위를 코드한다. 선택적으로, 프로브는 본원에 기술한 바와 같이 동의적이다.Optionally, appropriate nucleic acid sequences are obtained by screening appropriate cDNA libraries (ie, libraries prepared from one or more of the members of the tissue believed to express the protein) or genomic libraries (libraries prepared from total genomic DNA). The source of the cDNA library is typically the tissue that is believed to express an appropriate amount of GDNFR. Generally, genomic library members are any tissue of a mammalian species that is believed to contain genes encoding GDNFR. Screen the library for the presence of GDNFR cDNAs / genes using one or more nucleic acid probes (oligonucleotides, cDNAs or genomic DNA fragments based on the presently described sequences) that selectively hybridize to GDNFR cDNAs or genes present in the library. can do. Typical probes used for such library screening typically encode small regions of the GDNFR nucleic acid sequences of the same or similar species as the species from which the library is made. Optionally, the probe is synonymous as described herein.

라이브러리 스크리닝은 일반적으로 라이브러리내 클론의 올리고누클레오티드 프로브나 cDNA 를 어닐링함으로써 이루어지는데, 이 스크리닝은 프로브나 프라이머와 상당한 정도의 상동성을 갖는 클론의 결합(혼성화)은 허용하지만 비 - 특이 결합은 방해하는 조건에서 이루어진다. 일반적인 혼성 및 세척 조건은 cDNA 나 올리고누클레오티드 프로브의 크기(즉, 누클레오티드의 수)와 프로브의 동의성에 부분적으로 의존한다. 클론의 수득 가능성은 혼성 용액 제조에 있어서도 고려된다(예를들어, cDNA 를 스크린하느냐 게놈 라이브러리를 스크린하느냐의 여부 ; cDNA 라이브러리라면 관심있는 cDNA 가 고수준으로 존재하는 가능성을 고려).Library screening is typically accomplished by annealing oligonucleotide probes or cDNAs of clones in the library, which allows binding (hybridization) of clones with significant degree of homology with the probe or primer but prevents non-specific binding. Under conditions. General hybridization and wash conditions depend in part on the size of the cDNA or oligonucleotide probe (ie, the number of nucleotides) and the synonym of the probe. The possibility of obtaining clones is also considered in hybrid solution preparation (eg, whether to screen cDNA or genomic libraries; if cDNA libraries consider the possibility of high levels of cDNA of interest).

DNA 단편(예를들어 cDNA)을 프로브로 사용하는 경우, 전형적인 혼성 조건은 Ausubel 등의 eds., 상기문헌에 기술된 조건을 포함한다. 혼성시킨 후, 프로브 크기, 클론에 대한 프로브의 예상 상동성, 스크린할 라이브러리 형태, 스크린할 클론의 수 등과 같은 몇몇 인자에 따라 라이브러리를 함유하는 블롯을 적당한 조건에서 세척한다. 엄격한 세척 용액(보통 이온 세기가 낮고 비교적 높은 온도에서 사용)의 예는 다음과 같다. 이러한 엄격한 세척제는 55 - 65 ℃ 의 0.015 M NaCl, 0.005 M 시트르산나트륨 및 0.1 % SDS 이다. 다른 완충액은 약 40 - 50 ℃ 의 1 mM Na₂EDTA, 40 mM NaHPO₄, pH 7.2 및 1 % SDS 이다. 그외의 엄격한 세척제는 약 50 - 65 ℃ 의 0.2 × SSC 및 0.1 % SDS 이다.When using DNA fragments (eg cDNA) as probes, typical hybridization conditions include those described in Ausubel et al., Eds., Supra. After hybridization, blots containing the library are washed under appropriate conditions depending on several factors, such as probe size, expected homology of the probe to the clone, library form to screen, number of clones to screen, and the like. Examples of stringent cleaning solutions (usually used at relatively high temperatures with low ionic strength) are as follows. Such stringent cleaning agents are 0.015 M NaCl, 0.005 M sodium citrate and 0.1% SDS at 55-65 ° C. Other buffers are 1 mM Na ₂ EDTA, 40 mM NaHPO ₄ , pH 7.2 and 1% SDS at about 40-50 ° C. Other stringent cleaning agents are 0.2 × SSC and 0.1% SDS at about 50-65 ° C.

cDNA 나 게놈 라이브러리를 스크린하는 데 올리고누클레오티드 프로브를 사용할 경우에도 엄격한 세척 조건에 관한 전형적인 프로토콜이 존재한다. 예를들어, 첫 번째 프로토콜은 프로브의 길이에 따라 약 35 ~ 62 ℃ 의 온도에서 6 × SSC 와 0.05 % 피로인산나트륨을 사용한다. 예를들어, 14 개의 염기를 갖는 프로브는 35 - 40 ℃ 에서 세척하고, 17 개의 염기를 갖는 프로브는 45 - 50 ℃ 에서, 20 개 염기 프로브는 52 - 57 ℃ 에서, 23 개 염기 프로브는 57 - 63 ℃ 에서 각각 세척한다. 배경 비 - 특이 결합이 높게 나타날 경우 온도는 2 - 3 ℃ 증가시킬 수 있다. 두 번째 프로토콜은 세척액으로 테트라메틸암모늄클로라이드(TMAC)를 사용한다. 엄격한 세척 용액은 5 M TMAC, 50 mM 트리스 - HCl, pH 8.0 및 0.2 % SDS 이다.Even when oligonucleotide probes are used to screen cDNA or genomic libraries, typical protocols exist for stringent wash conditions. For example, the first protocol uses 6 x SSC and 0.05% sodium pyrophosphate at temperatures between about 35 and 62 ° C, depending on the length of the probe. For example, probes with 14 bases are washed at 35-40 ° C., probes with 17 bases at 45-50 ° C., 20 base probes at 52-57 ° C., 23 base probes at 57- ° C. Each at 63 ° C. Background If the non-specific bonds are high, the temperature can be increased by 2-3 ° C. The second protocol uses tetramethylammonium chloride (TMAC) as the wash. Stringent wash solutions are 5 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 and 0.2% SDS.

GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열을 수득하는 다른 적당한 방법은 폴리메라제 연쇄 반응법(PCR)이다. 이 방법에 있어서, 폴리(A) + RNA 또는 총 RNA 는 GDNFR 을 발현하는 조직에서 추출한다. 그런다음 효소 역전사효소(즉, RT - PCR)를 이용하여 RNA 로 부터 cDNA 를 제조한다. 일반적으로 GDNFR cDNA(올리고누클레오티드)의 각각의 두 부위에 상보적인 두 프라이머를 Taq 폴리메라제와 같은 폴리메라제와 함께 cDNA 에 가하면, 폴리메라제는 두 프라이머 간의 cDNA 부위를 증폭시킨다.Another suitable method of obtaining nucleic acid sequences encoding GDNFR proteins is polymerase chain reaction (PCR). In this method, poly (A) + RNA or total RNA is extracted from tissues expressing GDNFR. Then cDNA is prepared from RNA using enzyme reverse transcriptase (ie RT-PCR). Generally, when two primers complementary to each of two sites of GDNFR cDNA (oligonucleotide) are added to a cDNA with a polymerase such as Taq polymerase, the polymerase amplifies the cDNA site between the two primers.

원하는 GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열 제조방법에 올리고누클레오티드 프라이머나 프로브를 사용해야 할 경우(예를들어, PCR, cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝), 프로브나 프라이머로 선택되는 올리고누클레오티드 서열은 라이브러리 스크리닝이나 PCR 증폭 도중에 발생하는 비 - 특이 결합량을 최소화하기 위해 충분히 길고 분명해야 한다. 프로브나 프라이머의 실제 서열은 보통 본 발명과 관련된 랫의 핵산 서열과 같이 다른 생물체의 같거나 유사한 유전자의 보존된 서열이나 부위 또는 매우 상동인 서열이나 부위를 기초로 한다. 선택적으로, 프로브나 프라이머는 상이한 코돈을 사용하는 것을 제외하고는 완전히 또는 부분적으로 동의적일 수 있다. 즉, 동일한 아미노산 서열을 코드하는 모든 프로브/프라이머 혼합물을 함유한다. 동의성 프로브를 제조하는 대안은 종에 따라 달라지는 일부 또는 모든 코돈 위치에 이노신을 넣는 것이다. 올리고누클레오티드 프로브나 프라이머는 상기한 바와 같이 DNA 화학 합성 방법에 의해 제조할 수 있다.If oligonucleotide primers or probes should be used in the nucleic acid sequence preparation encoding the desired GDNFR protein (e.g., PCR, cDNA or genomic library screening), the oligonucleotide sequence selected as the probe or primer may be used during library screening or PCR amplification. It should be long and clear enough to minimize the amount of non-specific binding that occurs. The actual sequence of the probe or primer is usually based on conserved sequences or sites of the same or similar genes of other organisms or highly homologous sequences or sites, such as the nucleic acid sequences of a rat associated with the present invention. Optionally, the probes or primers may be fully or partially synonymous except using different codons. That is, it contains all probe / primer mixtures that encode the same amino acid sequence. An alternative to making synonymous probes is to put inosine at some or all codon positions depending on the species. Oligonucleotide probes and primers can be prepared by DNA chemical synthesis methods as described above.

GDNFR 을 코드하는 이 핵산 서열을 기초로 한 GDNFR 단백질 뿐 아니라 그 서열의 돌연변이체나 변이체도 본 발명의 범주내에 속하는 것으로 생각된다. 돌연변이 서열이나 변이 서열은 야생형 서열에 비하여 하나 또는 그 이상의 누클레오티드가 치환, 결실 및/또는 부가된 서열을 포함하며 이 서열은 야생형 아미노산 서열에 비하여 아미노산 서열 변이체를 발현한다. 몇몇 경우에 있어서, 자연적인 대립형질 변이에서 기인하는 자연발생적인 GDNFR 아미노산 돌연변이체나 변이체가 존재할 수 있다. 이러한 자연발생적인 돌연변이체나 변이체에 기초한 GDNFR 단백질도 본 발명의 범주내에 속한다. 합성 돌연변이 서열 제조방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를들어 Wells 등의(Gene, 34 : 315, 1985) 및 Sambrook 등의 상기문헌에 기술되어 있다.It is contemplated that not only GDNFR proteins based on these nucleic acid sequences encoding GDNFR, but also mutants and variants of the sequences are within the scope of the present invention. Mutant sequences or variant sequences include sequences in which one or more nucleotides have been substituted, deleted, and / or added relative to the wild type sequence, which expresses amino acid sequence variants relative to the wild type amino acid sequence. In some cases, there may be naturally occurring GDNFR amino acid mutants or variants resulting from natural allelic variations. GDNFR proteins based on these naturally occurring mutants or variants are also within the scope of the present invention. Methods of making synthetic mutant sequences are known in the art and are described, for example, in Wells et al. (Gene, 34: 315, 1985) and Sambrook et al., Supra.

일부 경우에 있어서, 자연발생적인 GDNFR 의 핵산 및/또는 아미노산변이체를 제조하는 것이 바람직하다. 핵산 변이체(여기에서 하나 또는 그 이상의 누클레오티드는 야생형 GDNFR 이나 자연발생적인 GDNFR 과는 다르도록 만들었다)는 부위 특이 돌연변이유발이나 PCR 증폭을 통해 생산하는데, 이때 프라이머는 원하는 점돌연변이를 갖는다(돌연변이 기술에 관하여는 Sambrook 등의 상기문헌과 Ausubel 등의 상기문헌을 참조하라). Engels 등의 상기문헌에 기술된 방법을 이용한 화학 합성은 이러한 변이체를 제조하는 데 사용할 수 있다. 숙련자들에게 공지된 다른 방법도 사용할 수 있다. 바람직한 핵산 변이체는 GDNFR 재조합 생산에 사용하는 숙주 세포에서의 코돈 선호를 설명하는 누클레오티드 치환을 포함한다. 다른 바람직한 변이체는, 야생형에 비해 보존적인 아미노산 치환체를 코드하는 것(예를들어, 여기에서 자연발생적인 아미노산 사슬의 전하나 극성은 다른 아미노산으로 치환하더라도 실질적으로 변하지 않음) 및/또는 GDNFR 에 새로운 글리코실화 부위 및/또는 인산화 부위 중 하나를 생성시킨 것 또는 GDNFR 에 존재하는 글리코실화 부위 및/또는 인산화 부위를 삭제한 것이다.In some cases, it is desirable to prepare nucleic acids and / or amino acid variants of naturally occurring GDNFR. Nucleic acid variants (where one or more nucleotides are made different from wild-type GDNFR or naturally occurring GDNFR) are produced by site-specific mutagenesis or PCR amplification, where the primers have the desired point mutations (in terms of mutation techniques). See Sambrook et al. Supra and Ausubel et al. Supra). Chemical synthesis using the methods described in Engels et al., Supra, can be used to prepare such variants. Other methods known to the skilled person can also be used. Preferred nucleic acid variants include nucleotide substitutions that describe codon preference in host cells for use in GDNFR recombinant production. Other preferred variants include those encoding amino acid substitutions that are conserved relative to the wild type (eg, the translocation or polarity of the naturally occurring amino acid chain is substantially unchanged even if substituted with another amino acid) and / or new glyco to GDNFR Either one of the misfired and / or phosphorylated sites is generated or the glycosylated and / or phosphorylated sites present in GDNFR are deleted.

벡터vector

원하는 GDNFR 단백질을 코드하는 cDNA 나 게놈 DNA 를 클로닝(DNA 증폭)하거나 발현시키기 위해 벡터에 삽입한다. 적당한 벡터는 통상적으로 입수가능하며 또는 특별히 구성할 수도 있다. 가능한 벡터는 코스미드, 플라스미드 또는 변이 바이러스를 포함하지만 이에 국한되지는 않으며 벡터계는 선택 숙주 세포와 양립되어야 한다. 이러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지 또는 pBR322, pUC 이나 Bluescript(등록상표) 플라스미드 유도체(미국 캘리포니아 라 졸라 소재 스트라타진에서 입수)와 같은 플라스미드를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 일렉트로포레이션 또는 그외의 공지 기술에 의해 숙주 세포내로 삽입할 수 있다.The cDNA or genomic DNA encoding the desired GDNFR protein is inserted into the vector for cloning (DNA amplification) or expression. Suitable vectors are commonly available or may be specially constructed. Possible vectors include, but are not limited to, cosmids, plasmids or variant viruses, and the vector line must be compatible with the selected host cell. Such vectors include, but are not limited to, bacteriophages such as lambda derivatives or plasmids such as pBR322, pUC or Bluescript® plasmid derivatives (available from Stratazine, La Jolla, Calif.). Recombinant molecules can be inserted into host cells by transformation, transfection, infection, electroporation or other known techniques.

예를들어 GDNFR - 코딩 핵산 서열은, 다수의 핵산 서열 복제가 이루어지도록 적당한 숙주 세포내로 형질전환되거나 형질감염 또는 감염시키는 데 사용하는 클로닝 벡터 내로 삽입된다. 이것은 상보적인 코히시브 말단을 갖는 클로닝 벡터내로 DNA 단편을 결합시킴으로써 이루어질 수 있다. DNA 를 절단하는 데 사용하는 상보적인 제한 부위가 클로닝 벡터내에 존재하지 않는다면, DNA 분자 말단을 효소적으로 변이시킨다. 결과적으로 생성되는 핵산 서열을 벡터내로 용이하게 삽입시키기 위해, 폴리메라제 연쇄 반응법에 사용하는 올리고누클레오티드 프라이머내로 제한 엔도누클레아제 절단 부위를 도입하는 것이 바람직하다. 선택적으로, 원하는 모든 부위는 DNA 말단에 누클레오티드 서열(링커)을 결합시켜 생산할 수 있다 ; 이러한 결합 링커는 제한 엔도누클레아제 인식 서열을코드하는 특정 화학 합성 올리고누클레오티드를 포함할 것이다. 선택적인 방법에 있어서, 절단된 벡터와 GDNFR - 코딩 핵산 서열은 동종중합체 말단끌기(tailing)에 의해 변이시킨다. 특정 실시형태에 있어서, 분리된 GDNFR 유전자, cDNA 또는 합성 DNA 서열을 삽입한 재조합 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환시키면 유전자가 다중 복제된다. 따라서, 형질전환체를 성장시켜 이 형질전환체에서 재조합 DNA 를 분리하고, 필요에 따라 분리된 재조합 DNA 로 부터 삽입 유전자를 회수함으로써 GDNFR - 코딩 핵산 서열을 대량으로 수득할 수 있다.For example, GDNFR-encoding nucleic acid sequences are inserted into cloning vectors for use in transforming, transfecting or infecting into appropriate host cells such that multiple nucleic acid sequence replications are made. This can be done by binding DNA fragments into cloning vectors with complementary cohesive ends. If the complementary restriction sites used to cleave the DNA are not present in the cloning vector, the ends of the DNA molecules are enzymatically modified. In order to easily insert the resulting nucleic acid sequence into the vector, it is preferable to introduce a restriction endonuclease cleavage site into the oligonucleotide primer used in the polymerase chain reaction method. Alternatively, any desired site can be produced by binding a nucleotide sequence (linker) to the DNA terminus; Such binding linkers will include specific chemical synthetic oligonucleotides encoding restriction endonuclease recognition sequences. In an alternative method, the cleaved vector and the GDNFR-encoding nucleic acid sequence are mutated by homopolymer tailing. In certain embodiments, transforming a host cell with a recombinant DNA molecule inserting an isolated GDNFR gene, cDNA or synthetic DNA sequence results in multiple replication of the gene. Thus, a large amount of GDNFR-encoding nucleic acid sequences can be obtained by growing a transformant to isolate recombinant DNA from the transformant and recovering the insert gene from the isolated recombinant DNA as needed.

적당한 벡터의 선택이나 구성은 1) DNA 증폭에 사용하는지 DNA 발현에 사용하는지 여부 2) 벡터내로 삽입되는 DNA 의 크기 및 3) 이 벡터로 형질전환시키는 숙주 세포(예를들어, 포유동물, 곤충, 효모, 진균, 식물 또는 박테리아 세포)에 좌우될 것이다. 각 벡터는 그것의 기능(DNA 증폭 또는 DNA 발현) 및 사용하려는 숙주 세포와의 적합성에 따른 여러 성분을 함유한다. DNA 발현의 경우, 벡터 성분은 다음 중 하나 또는 그 이상을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다 : 시그널 서열, 복제 기원, 하나 또는 그 이상의 선택 유전자 또는 표식 유전자, 인핸서 성분, 프로모터, 전사 종결 서열 등. 이 성분은 천연원이거나 공지된 방법으로 합성하여 수득할 수 있다. 본 발명의 벡터는 선택된 숙주 세포에서 GDNFR - 코딩 핵산 서열의 증폭이나 발현을 관리하거나 조절하고 또는 그 반대의 영향을 미칠 수 있는 조절 성분 또는 유사 작동 성분, 증폭 성분, 발현 조절 성분 중 하나 또는 그 이상과 작동적으로 결합하는, GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함한다.The choice or construction of a suitable vector may include: 1) whether it is used for DNA amplification or DNA expression; 2) the size of the DNA inserted into the vector, and 3) the host cell transformed with the vector (e.g., mammal, insect, Yeast, fungi, plant or bacterial cells). Each vector contains several components depending on its function (DNA amplification or DNA expression) and compatibility with the host cell to be used. In the case of DNA expression, vector components include, but are not limited to, one or more of the following: signal sequence, origin of replication, one or more selection genes or marker genes, enhancer components, promoters, transcription termination sequences, and the like. This component can be obtained from natural sources or synthesized by known methods. The vector of the present invention may be one or more of a regulatory component or similar operating component, amplification component, expression control component that can control or regulate the amplification or expression of GDNFR-encoding nucleic acid sequences in a selected host cell and vice versa. And a nucleic acid sequence encoding a GDNFR protein that operably binds to it.

GDNFR 핵산 서열 삽입물을 함유하는 발현 벡터는 일반적으로 세 방법에 의해 확인할 수 있다 : (a) DNA - DNA 혼성화 ; (b) '표식' 유전자 기능의 존재 또는 부재 및 (c) 삽입 서열의 발현. 첫 번째 방법에 있어서, 발현 벡터에 외부 핵산 서열이 삽입되었는 지의 여부는 삽입된 GDNFR - 코딩 핵산 서열과 상동인 서열을 함유하는 프로브를 사용한 DNA - DNA 혼성화로 검출할 수 있다. 두 번째 방법에 있어서, 벡터내로 외부 핵산 서열을 삽입시킴으로써 야기되는 특정 '표식' 유전자 기능(예를들어, 티미딘 키나아제 활성, 항생물질에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바쿨로바이러스에서 형성되는 폐쇄체 등)의 존재 또는 부재에 대하여 확인할 수 있다. 예를들어, GDNFR - 코딩 핵산 서열이 벡터의 표식 유전자 서열 내로 삽입된다면, GDNFR 삽입물을 함유하는 재조합체는 표식 유전자 기능의 부재로 확인할 수 있다. 세 번째 방법에 있어서, 재조합 핵산 서열에 의해 발현되는 외부 단백질 산물을 검출함으로써 재조합 발현 벡터를 확인할 수 있다. 이러한 검정은 발현되는 GDNFR 단백질 산물의 물리학적 성질이나 기능상의 특성, 예를들어GDNFR 을 직접 인식하는 GDNF 또는 항체에 대한 GDNFR 단백질의 결합을 토대로 할 수 있다.Expression vectors containing GDNFR nucleic acid sequence inserts can generally be identified by three methods: (a) DNA-DNA hybridization; (b) the presence or absence of 'marker' gene function and (c) expression of the insertion sequence. In a first method, whether an external nucleic acid sequence has been inserted into an expression vector can be detected by DNA-DNA hybridization using a probe containing a sequence homologous to the inserted GDNFR-encoding nucleic acid sequence. In a second method, certain 'marker' gene functions (eg, thymidine kinase activity, antibiotic resistance, transgenic phenotype, closures formed in baculovirus) caused by the insertion of an external nucleic acid sequence into a vector Etc.) can be confirmed. For example, if a GDNFR-encoding nucleic acid sequence is inserted into a marker gene sequence of a vector, the recombinant containing the GDNFR insert can be identified by the absence of marker gene function. In a third method, recombinant expression vectors can be identified by detecting foreign protein products expressed by the recombinant nucleic acid sequence. Such assays may be based on the physical or functional properties of the expressed GDNFR protein product, eg binding of GDNFR protein to GDNF or an antibody that directly recognizes GDNFR.

시그널 서열Signal sequence

시그널 서열은 벡터 성분이거나 벡터내로 삽입되는 GDNFR DNA 의 일부일 것이다. 천연 GDNFR DNA 는 성숙한 GDNFR 단백질을 생성시키기 위해 번역후 프로세싱 중에 절단되는 단백질 아미노 말단에 존재하는 시그널 서열을 코드한다. 천연 시그널 서열을 수반하는 GDNFR 폴리누클레오티드 뿐 아니라 천연 시그널 서열을 이형 시그널 서열로 치환하거나 삭제한 GDNFR 폴리누클레오티드도 본 발명의 범주에 속한다. 선택된 이형 시그널 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 프로세싱되는, 즉 시그널 펩티드에 의해 절단되는 것이다. 천연 GDNFR 시그널 서열을 인식하지도 프로세싱하지도 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 예를들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, 또는 열 - 안정 엔테로톡신 II 리더 중에서 선택한 원핵 시그널 서열로 시그널 서열을 치환한다. 효모 분비의 경우, 효모 인베르타제, 알파 인자 또는 산 포스파타제 리더로 천연 GDNFR 시그널 서열을 치환할 수 있다. 다른 포유동물 시그널 서열이 적당하기는 하나, 포유동물 세포 발현 천연 시그널 서열로 충분하다.The signal sequence may be a vector component or part of a GDNFR DNA inserted into the vector. Native GDNFR DNA encodes the signal sequence present at the protein amino terminus that is cleaved during post-translational processing to produce a mature GDNFR protein. GDNFR polynucleotides carrying natural signal sequences as well as GDNFR polynucleotides in which natural signal sequences are substituted or deleted with heterologous signal sequences are within the scope of the present invention. The heterologous signal sequence selected is one that is recognized and processed by the host cell, ie cleaved by the signal peptide. For prokaryotic host cells that do not recognize or process native GDNFR signal sequences, the signal sequence is replaced with a prokaryotic signal sequence selected from, for example, alkaline phosphatase, penicillinase, or heat-stable enterotoxin II leader. For yeast secretion, yeast invertase, alpha factor or acid phosphatase leader can be used to replace the native GDNFR signal sequence. While other mammalian signal sequences are suitable, mammalian cell expressing natural signal sequences are sufficient.

복제 기원Origin of replication

일반적으로 발현 벡터와 클로닝 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택 숙주 세포에서 벡터를 복제할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 클로닝 벡터에 있어서, 이 서열은 숙주 염색체 DNA 와는 별도로 벡터를 복제시키며 복제 기원이나 자체적으로 복제 서열을 포함한다. 이 서열은 각각의 박테리아, 효모 및 바이러스에 대하여 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322 의 복제 기원은 대부분의 그람 - 음성 박테리아에 적당하며, 여러 가지 기원(예를들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포내 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유동물 발현 벡터에는 필요없다(예를들어, SV40 기원은 그것이 시발 프로모터를 함유한다는 이유만으로 종종 사용된다).Generally, expression vectors and cloning vectors contain nucleic acid sequences capable of replicating the vector in one or more selected host cells. In cloning vectors, this sequence replicates the vector separately from the host chromosomal DNA and contains the origin of replication or the sequence itself. This sequence is well known for each bacteria, yeast and virus. The replication origin of plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, and various origins (e.g., SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are useful for mammalian intracellular cloning vectors. In general, the origin of replication component is not necessary for mammalian expression vectors (eg, SV40 origin is often used only because it contains a starting promoter).

선택 유전자Select gene

발현 벡터와 클로닝 벡터는 선택 유전자를 함유할 것이다. 이 유전자는 형질전환 숙주 세포를 선택 배양 배지에서 성장시킬 때 그것의 생존이나 성장에 필요한 '표식' 단백질을 코드한다. 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 선택 유전자를 함유하지 않을 것이며, 따라서 배양 배지에서 성장하지 못할 것이다. 일반적인 선택 유전자는 (a) 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린과 같은 항생물질이나 그외의 독소에 대한 내성을 부여하고 ; (b) 자가영양 결핍을 보충하거나 ; (c) 배양 배지에서 입수할 수 없는 부족한 영양분을 보충하는 단백질을 코드한다.Expression vectors and cloning vectors will contain the selection gene. This gene encodes the 'marker' protein required for its survival or growth when the transgenic host cell is grown in selective culture medium. Host cells not transformed with the vector will not contain the selection gene and thus will not grow in the culture medium. Common selection genes are: (a) to confer resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline; (b) compensate for autotrophic deficiency; (c) Code for proteins that make up poor nutrition not available in the culture medium.

그외의 선택 유전자는 발현된 유전자를 증폭시키기 위해 사용한다. 증폭은 성장에 중요한 단백질 생산이 더 많이 요구되는 유전자가 재조합 세포내에서 염색체의 연속 생성을 반복하는 과정이다. 포유동물 세포에 적당한 선택 표식의 예에는 디히드로엽산 환원효소(DHFR)와 티미딘 키나아제가 포함된다. 벡터에 존재하는 표식에 의해 형질전환체만이 생존하도록 변이시키는 선택적 압력하에 포유동물 세포 형질전환체를 둔다. 배지내 선택제의 농도가 연속적으로 변화되는 조건하에서 형질전환 세포를 배양함으로써 선택적 압력을 부가하여, 그로 인해 GDNFR 을 코드하는 DNA 와 선택 유전자 둘다를 증폭시킨다. 결과적으로, 증가량의 GDNFR 은 증폭 DNA 로 부터 합성된다.Other selection genes are used to amplify expressed genes. Amplification is the process by which genes that require more production of proteins important for growth repeat the continuous production of chromosomes in recombinant cells. Examples of suitable markers for mammalian cells include dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidine kinase. Mammalian cell transformants are placed under selective pressure that only the transformants survive by the markers present in the vector. Selective pressure is added by culturing the transformed cells under conditions where the concentration of the selection agent in the medium is continuously changed, thereby amplifying both the DNA encoding the GDNFR and the selection gene. As a result, increasing amounts of GDNFR are synthesized from amplified DNA.

예를들어, DHFR 의 경쟁적 길항물질인 메토트렉세이트를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포를 우선 확인한다. 야생형 DHFR 을 사용할 때 적당한숙주 세포는 DHFR 활성이 없는 차이니즈 햄스터 난소 세포주이다[예를들어, Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77(7) : 4216 - 4220, 1980 문헌을 참조하라]. 그런 다음 메토트렉세이트 양을 증가시켜 형질전환 세포를 노출시킨다. 이로써 다중 복제된 DHFR 유전자가 합성되고, 부수적으로 GDNFR 단백질을 코드하는 DNA 처럼 발현 벡터에 존재하는 그외의 다중 복제 DNA 가 합성된다.For example, cells transformed with DHFR selection genes are first identified by culturing all transformants in a culture medium containing methotrexate, a competitive antagonist of DHFR. Suitable host cells when using wild-type DHFR are Chinese hamster ovary cell lines that lack DHFR activity [eg, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77 (7): 4216-4220, 1980.]. The transfected cells are then exposed by increasing the amount of methotrexate. This synthesizes a multi-replicated DHFR gene and additionally synthesizes other multi-replicating DNAs present in the expression vector, such as DNA encoding the GDNFR protein.

프로모터Promoter

본 발명의 발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열에 결합하는 프로모터를 함유한다. 프로모터는 구조 유전자의 개시 코돈 상류(5')에 위치하는 비번역 서열로서(일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내), 예를들어 GDNFR 을 코드하는 특정 핵산 서열의 전사와 번역을 조절한다. 프로모터는 통상적으로 유도 프로모터와 구성 프로모터의 두 군 중 하나로 구분된다. 유도 프로모터는 영양분의 존재나 부재 또는 온도 변화처럼 배양 조건의 일부 변화에 대한 조절하에서 DNA 전사량을 증가시키기 시작한다. 다양한 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 이들 프로모터는, 제한 효소 절단으로 DNA 원에서 프로모터를 제거한 다음 원하는 프로모터 서열을 벡터내로 삽입함으로써 GDNFR 을 코드하는 DNA 에 결합된다. GDNFR DNA 증폭 및/또는 발현을 조절하기 위해서 천연 GDNFR 프로모터 서열을 사용할 수 있다. 그러나 천연 프로모터에 비해 발현 단백질의 순도가 높고 전사량이 더 많으며, 선택한 숙주 세포계와 양립된다면 이형 프로모터가 바람직하다.Expression vectors and cloning vectors of the invention generally contain a promoter that is recognized by the host organism and binds to a nucleic acid sequence encoding a GDNFR protein. A promoter is an untranslated sequence (usually within about 100-1000 bp) located upstream of the start codon (5 ') of a structural gene, for example, to regulate the transcription and translation of a particular nucleic acid sequence encoding GDNFR. Promoters are typically divided into two groups: inducible promoters and constitutive promoters. Inducible promoters begin to increase the amount of DNA transcription under control of some changes in culture conditions, such as the presence or absence of nutrients or changes in temperature. A large number of promoters recognized by various host cells are well known. These promoters are bound to the DNA encoding GDNFR by removing the promoter from the DNA source by restriction enzyme cleavage and then inserting the desired promoter sequence into the vector. Native GDNFR promoter sequences can be used to modulate GDNFR DNA amplification and / or expression. However, heterologous promoters are preferred if the expressed protein is of higher purity, higher in transcription, and compatible with the host cell system chosen.

원핵 숙주에 사용하기에 적당한 프로모터는 베타 - 락타마제와 락토스 프로모터계 ; 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터계 ; 및 tac 프로모터와 같은 혼성 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 그들의 핵산 서열이 공개되어 있으므로, 본 분야의 숙련자들이 필요한 어떤 제한 부위를 제공하기 위해 필요한 만큼의 링커나 어댑터를 이용하여 원하는 DNA 서열에 상기 핵산 서열을 결합시킬 수 있다.Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include beta-lactamase and lactose promoter systems; Alkaline phosphatase and tryptophan (trp) promoter systems; And hybrid promoters such as the tac promoter. Other known bacterial promoters are also suitable. Since their nucleic acid sequences are disclosed, those skilled in the art can bind the nucleic acid sequences to the desired DNA sequences using as many linkers or adapters as necessary to provide any restriction sites needed.

효모에 사용하기에 적당한 프로모터 서열도 본 분야에 널리 알려져 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 사용하는 것이 바람직하다. 포유동물 숙주 세포와 사용하기에 적당한 프로모터는 공지되어 있으며, 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 파울폭스 바이러스(fowlpox virus), 아데노바이러스(adenovirus, 예를들어 아데노바이러스 2), 소의 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 닭의 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 레트로바이러스(retrovirus),B 형 간염 바이러스(hepatitis - B virus) 및 가장 바람직하게는 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40) 같은 바이러스 게놈에서 수득한 프로모터가 포함된다. 그외에 적당한 포유동물 프로모터는 열 - 안정 프로모터와 액틴 프로모터 같은 이형 포유동물 프로모터를 포함한다. CHO 세포내 GDNFR 단백질 생산에 이용할 수 있는 프로모터는 SRa 이다[Takebe 등의 Mol. Cell. Biol., 8(1) : 466 - 472, 1988 참조]. 적당한 발현 벡터는 pDSRa2 이다. 적당한 GDNFR cDNA 를 함유하는 pDSRa2 플라스미드 구성물은 실질적으로 1990년 3월 29일자 출원된, 공동 소유 및 계류중인 미국 특허 출원 번호 제 501,904 호에 기술된 방법에 의해 제조할 수 있다[1990년 5월 18일자 출원된 유럽 특허 출원 번호 제 90305433 호, 공개 번호 EP 398 753, WO 90/14363 (1990) 도 참조, 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용함].Promoter sequences suitable for use in yeast are also well known in the art. Yeast enhancers are preferably used with yeast promoters. Suitable promoters for use with mammalian host cells are known and include polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (eg adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and most preferably Simian Virus 40 Promoters obtained from the same viral genome are included. Other suitable mammalian promoters include heterologous mammalian promoters such as heat-stable promoters and actin promoters. A promoter available for production of GDNFR protein in CHO cells is SRa [Make. Cell. Biol., 8 (1): 466-472, 1988]. A suitable expression vector is pDSRa2. PDSRa2 plasmid constructs containing suitable GDNFR cDNA can be prepared by the methods described in co-owned and pending US Patent Application No. 501,904, filed March 29, 1990 [May 18, 1990] See also European Patent Application No. 90305433, Publication No. EP 398 753, WO 90/14363 (1990), which is incorporated herein by reference.

GDNFR 발현 조절에 중요한 부가적인 프로모터는 다음을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다 : SV40 시발 프로모터 영역(Bernoist 및 Chambon, Nature, 290 : 304 - 310, 1981) ; CMV 프로모터 ; 로우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)의 3' 말단 반복 배열에 내포된 프로모터(Yamamoto 등의 Cell, 22 : 787 - 797 ,1980) ; 허피즈 티미딘 키나아제 프로모터(Wagner 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78 : 144 - 1445, 1981) ; 메탈로티오닌 유전자 조절 서열(Brinster 등의 Nature,296 : 39 - 42, 1982) ; 베타 - 락타마제 프로모터와 같은 원핵 발현 벡터(Villa - Kamaroff 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75 : 3727 - 3731, 1978) ; 또는 tac 프로모터(DeBoer 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80 : 21 - 25, 1983). 그외에 중요한 것은 다음의 동물 전사 조절 부위로서 조직 특이성을 보이며 형질전환 동물에 사용되어 왔다 : 췌장의 선포 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 부위(Swift 등의 Cell, 38 : 639 - 646, 1984 ; Ornitz 등의 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 : 399 - 409, 1986 ; MacDonald, Hepatology, 7 : 425 - 515, 1987) ; 췌장의 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 부위(Hanahan, Nature, 315 : 115 - 122, 1985) ; 임파구양 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 부위(Grosschedl 등의 Cell, 38 : 647 - 658, 1984 ; Adames 등의 Nature, 318 : 533 - 538, 1985 ; Alexander 등의 Mol. Cell. Biol., 7 : 1436 - 1444, 1987) ; 고환, 유방, 임파구양 세포 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 부위(Leder 등의 Cell, 45 : 485 - 495, 1986) ; 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 부위(Pinkert 등의 Genes and Devel., 1 : 268 - 276, 1987) ; 간에서 활성인 알파 - 페토프로테인 유전자 조절 부위(Krumlauf 등의 Mol. Cell. Biol., 5 : 1639 - 1648, 1985 ; Hammer 등의 Science, 235 : 53 - 58, 1987) ; 간에서 활성인 알파 - 1 항트립신 유전자 조절 부위(Kelsey 등의 Genes and Devel., 1 : 161 - 171, 1987) ; 골수성 세포에서 활성인 베타- 글로빈 유전자 조절 부위(Mogram 등의 Nature, 315 : 338 - 340, 1985 ; Kollias 등의 Cell, 46 : 89 - 94, 1986) ; 뇌의 희돌기교세포에서 활성인 마이엘린 염기성 단백질 유전자 조절 부위(Readhead 등의 Cell, 48 : 703 - 712, 1987) ; 골격근에서 활성인 미오신 광사슬 - 2 유전자 조절 부위(Sani, Nature, 314 : 283 - 286, 1985) ; 및 시상하부에서 활성인 성선자극호르몬유리호르몬 유전자 조절 부위(Mason 등의 Science, 234 : 1372 - 1378, 1986).Additional promoters important for regulating GDNFR expression include, but are not limited to: the SV40 starting promoter region (Bernoist and Chambon, Nature, 290: 304-310, 1981); CMV promoter; A promoter (Yamamoto et al., Cell: 22: 787-797,1980) contained in the 3 'terminal repeat sequence of Rous sarcoma virus; Herpiz thymidine kinase promoter (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 78: 144-1445, 1981); Metallothionine gene regulatory sequences (Brinster et al., Nature, 296: 39-42, 1982); Prokaryotic expression vectors, such as the beta-lactamase promoter (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 75: 3727-3731, 1978 to Villa-Kamaroff et al.); Or tac promoters (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-25, 1983 by DeBoer et al.). Other important ones have been used in transgenic animals with tissue specificity as the following animal transcriptional regulatory sites: Elastase I gene regulatory sites (Swift et al Cell, 38: 639-646, 1984) that are active in pancreatic acinar cells. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409, 1986; MacDonald, Hepatology, 7: 425-515, 1987); Insulin gene regulatory sites active in the beta cells of the pancreas (Hanahan, Nature, 315: 115-122, 1985); Immunoglobulin gene regulatory sites active in lymphoid cells (Grosschedl et al., Cells 38: 647-658, 1984; Adames et al. Nature, 318: 533-538, 1985; Alexander et al. Mol. Cell. Biol., 7: 1436-1444, 1987); Mouse breast tumor virus regulatory sites active in testes, breasts, lymphocytes, and mast cells (Leder et al., Cell 45: 485-495, 1986); Albumin gene regulatory sites active in the liver (Pinkert et al., Genes and Devel., 1: 268-276, 1987); Alpha-fetoprotein gene regulatory sites active in the liver (Mol. Cell. Biol., Krumlauf et al., 5: 1639-1648, 1985; Science, 235: 53-58, 1987 by Hammer et al.); Alpha-1 antitrypsin gene regulatory site active in the liver (Kelsey et al. Genes and Devel., 1: 161-171, 1987); Beta-globin gene regulatory sites active in myeloid cells (Mogram et al., 315: 338-340, 1985; Kollias et al., Cells 46: 89-94, 1986); Myelin basic protein gene regulatory sites active in oligodendrocytes of the brain (Readhead et al., Cell 48: 703-712, 1987); Myosin light chain-2 gene regulatory site active in skeletal muscle (Sani, Nature, 314: 283-286, 1985); And gonadotropin-free hormone gene regulatory sites active in the hypothalamus (Mason et al., Science, 234: 1372-1378, 1986).

인핸서 성분Enhancer components

인핸서 서열은, 본 발명의 GDNFR 단백질을 코드하는 DNA 서열이 고등 진핵세포에서 전사되는 것을 증가시키기 위해 벡터내로 삽입한다. 인핸서는 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는 DNA 의 시스 - 액팅 성분으로서, 보통 그 길이는 약 10 - 300 bp 이다. 인핸서는 비교적 일정 방향으로 향하며 위치에 대하여 구애받지 않는다. 그것은 전사 단위의 5' 과 3' 에서 발견되었다. 포유동물 유전자에서 입수가능한 몇몇 인핸서 서열이 공지되어 있다(예를들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파 - 페토프로테인 및 인슐린). 그러나 일반적으로는 바이러스의 인핸서를 사용할 것이다. SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 시발 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서는진핵 프로모터를 활성화하는 전형적인 인핸서 성분이다. 인핸서가 GDNFR DNA 의 위치 5' 또는 3' 에서 벡터내로 스플라이싱되기는 하나, 일반적으로는 프로모터의 5' 부위에 위치한다.Enhancer sequences are inserted into the vector to increase the transcription of the DNA sequence encoding the GDNFR protein of the invention in higher eukaryotic cells. Enhancers are cis-acting components of DNA that act on the promoter to increase transcription, usually about 10-300 bp in length. Enhancers are directed in a relatively constant direction and are independent of position. It was found in 5 'and 3' of the transcription unit. Several enhancer sequences available in mammalian genes are known (eg, globin, elastase, albumin, alpha-fetoprotein and insulin). Generally, however, you will use virus enhancers. SV40 enhancer, cytomegalovirus starting promoter enhancer, polyoma enhancer and adenovirus enhancer are typical enhancer components that activate eukaryotic promoters. Although an enhancer is spliced into a vector at position 5 'or 3' of GDNFR DNA, it is generally located at the 5 'site of the promoter.

전사 종결Warrior Termination

진핵 숙주 세포(효모, 진균류, 곤충, 식물, 동물, 인체 또는 그외의 다세포 유기체의 유핵 세포)에 사용하는 발현 벡터는 전사를 종결시키고 mRNA 를 안정시키는 데 필수적인 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 보통 진핵 DNA 나 cDNA 의 5' 및 경우에 따라서는 3' 비번역 부위에서 입수가능하다. 이 부위는 GDNFR 을 코드하는 mRNA 의 비번역 부위에서 폴리아데닐화 단편으로 전사되는 누클레오티드 단편을 포함한다.Expression vectors for use in eukaryotic host cells (nucleated cells of yeast, fungi, insects, plants, animals, humans or other multicellular organisms) will contain sequences necessary to terminate transcription and stabilize mRNA. Such sequences are usually available at the 5 'and, optionally, 3' untranslated sites of eukaryotic DNA or cDNA. This site includes a nucleotide fragment that is transcribed into a polyadenylation fragment at an untranslated site of mRNA encoding GDNFR.

원하는 GDNFR - 코딩 서열과 함께 상기 나열한 성분 중 하나 또는 그 이상을 함유하는 적당한 벡터의 구성은 표준 결합 기술에 의해 이루어진다. 분리된 플라스미드나 DNA 단편은, 원하는 플라스미드를 만들기 위해 절단하여 짜 맞추고 재결합시킨다. 서열이 정확히 구성되었는 지를 확인하기 위해, 결합 혼합물로 E. coli 를 형질전환시킨 다음 상기한 암피실린 내성이나 테트라사이클린 내성과 같은 공지 방법으로 제대로 된 형질전환체를 선택한다. 형질전환체로부터 플라스미드를 꺼낸 다음 제한 엔도누클레아제 절단으로 분석하고/하거나 원하는 구성물이 존재하는 지 확인하기 위해 서열을 결정한다.The construction of a suitable vector containing one or more of the components listed above with the desired GDNFR-coding sequence is by standard binding techniques. The separated plasmids or DNA fragments are cut, assembled and recombined to produce the desired plasmid. To confirm that the sequence is correctly constructed, E. coli is transformed with the binding mixture and the appropriate transformants are selected by known methods such as ampicillin resistance or tetracycline resistance. The plasmid is removed from the transformant and then analyzed by restriction endonuclease cleavage and / or the sequence is determined to confirm that the desired construct is present.

포유동물 세포내에서 GDNFR 코딩 DNA 를 일시적으로 발현시키는 벡터도 이용할 수 있다. 일반적으로, 일시적인 발현은 숙주 세포에서 효율적으로 복제될 수 있는 발현 벡터의 사용과 관계가 있는데, 숙주 세포는 다수의 발현 벡터 복사물을 축적하면서 교대로 발현 벡터에 의해 코드되는 원하는 단백질을 고수준으로 합성한다. 적당한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함한 일시적 발현계로 인해, 클로닝된 DNA 에 의해 코드되는 단백질이 편리하고도 확실하게 확인되며 바람직한 생물학적·생리학적 특성에 대하여 이 단백질을 신속하게 스크리닝할 수 있다. 따라서, 일시적 발현계는 단백질 변이체 확인에 특히 유용하다.Vectors that transiently express GDNFR encoding DNA in mammalian cells can also be used. In general, transient expression is associated with the use of expression vectors that can be efficiently replicated in a host cell, which host cells synthesize high levels of the desired protein encoded by the expression vector in turn, accumulating multiple copies of the expression vector. . Due to the transient expression system, including the appropriate expression vector and host cell, the protein encoded by the cloned DNA can be conveniently and reliably identified and can be quickly screened for the desired biological and physiological properties. Thus, transient expression systems are particularly useful for identifying protein variants.

숙주 세포의 선택 및 형질전환Selection and transformation of host cells

본 발명은 재조합 GDNFR 발현에 사용하는 핵산 서열로 형질전환시킨 숙주 세포(예를들어, 박테리아 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 식물 세포)를 제공한다. 형질전환 숙주 세포는 핵산 서열을 발현시킬 수 있는 적당한 조건하에서 배양된다. 적당한 숙주 세포의 선택과 형질전환 방법, 배양, 증폭, 스크리닝, 산물 생산, 정제방법은 본 분야에 널리 공지되어 있다. 예를들어, Gething 및 Sambrook, Nature, 293 : 620 - 625(1981) 또는 선택적으로 Kaufman 등의 Mol. Cell. Biol., 5(7) ; 1750 - 1759(1985) 또는 Howley 등의 미국 특허 번호 제 4,419,446 호를 참조하라. 부가적인 물질과 방법의 예를 본원에서 기술한다. 본 분야의 기술자들에게 공지된 적당한 방법에 의해, 형질전환된 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양하고, 발현된 GDNFR 단백질을 선택적으로 배양 배지(또는 세포내에서 발현되었다면 세포)에서 회수하여 분리정제한다.The present invention provides host cells (eg, bacterial cells, mammalian cells, insect cells, yeast cells or plant cells) transformed with nucleic acid sequences for use in recombinant GDNFR expression. The transforming host cell is cultured under suitable conditions capable of expressing the nucleic acid sequence. Methods of selecting and transforming suitable host cells, culturing, amplification, screening, product production, and purification methods are well known in the art. For example, Gething and Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981) or optionally Kaolman et al. Mol. Cell. Biol., 5 (7); 1750-1759 (1985) or US Pat. No. 4,419,446 to Howley et al. Examples of additional materials and methods are described herein. By appropriate methods known to those skilled in the art, transformed host cells are cultured in a suitable medium and the expressed GDNFR protein is selectively recovered and recovered in culture medium (or cells if expressed in the cell).

상이한 숙주 세포는 단백질의 번역 프로세싱, 번역후 프로세싱 및 변이(예를들어, 글리코실화, 절단)에 대하여 특징적이고도 특이한 메카니즘을 갖는다. 원하는 변이와 발현 외부 단백질의 프로세싱이 안전하게 이루어지도록 적당한 세포주나 숙주계를 선택한다. 예를들어, 박테리아계에서의 발현은 비글리코실화된 중심 단백질을 생산하는 데 사용할 수 있다. 효모 발현은 글리코실화된 산물 생산에 사용한다. 포유동물 세포 발현은 이형 GDNFR 단백질의 '천연' 글리코실화가 안전하게 이루어지도록 하기 위해 사용할 수 있다. 게다가, 상이한 벡터/숙주 발현계는 단백질 가수분해 절단과 같은 프로세싱 반응에도 상이한 영향을 미친다.Different host cells have characteristic and specific mechanisms for translational processing, post-translational processing and mutation (eg glycosylation, cleavage) of proteins. Select the appropriate cell line or host system to ensure safe processing of the desired mutations and expression of foreign proteins. For example, expression in the bacterial system can be used to produce aglycosylated central proteins. Yeast expression is used to produce glycosylated products. Mammalian cell expression can be used to ensure that 'natural' glycosylation of heterologous GDNFR proteins occurs safely. In addition, different vector / host expression systems have different effects on processing reactions such as proteolytic cleavage.

본원에 기술된 클로닝 벡터나 발현 벡터에 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 세포 또는 고등 진핵 세포이다. 사상 진균류나 효모와 같은 진핵 미생물은 GDNFR 단백질 발현에 적당한 숙주일 수 있다. 하등 진핵 숙주 미생물 중 사카로마이시스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 베이커 효모가 가장 일반적으로 이용되지만 그외에 다수의 속, 종, 균주를 사용할 수 있을 것으로 공지되어 있다.Suitable host cells for the cloning vector or expression vector described herein are prokaryotic cells, yeast cells or higher eukaryotic cells. Eukaryotic microorganisms such as filamentous fungi or yeast may be suitable hosts for GDNFR protein expression. Of the lower eukaryotic host microorganisms, Saccharomyces cerevisiae or common baker's yeast is the most commonly used, but many other genera, species, and strains are known.

글리코실화된 GDNFR 단백질 발현에 사용하는 숙주 세포는 다세포 유기체에서도 유래된다. 이러한 숙주 세포는 프로세싱 및 글리코실화 활성 복합체일 수 있다. 원칙적으로, 배양균이 식물 세포와 곤충 세포를 포함한 척추동물 세포나 무척추동물 세포를 포함하든 안하든 간에 모든 고등 진핵 세포 배양균을 사용할 수 있다. 배양균(조직 배양균) 내 척추동물 세포의 증식은 공지된 과정이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 SV40 에 의해 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 주(COS 7), 인체 배 신장주(현탁 배양액 내에서의 성장을 위해 서브클로닝한 293 또는 293 세포), 베이비 햄스터 신장 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 세포가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 그외에 적당한 포유동물 세포주는 HeLa, 마우스 L - 929 세포, 스위스(Swiss)에서 유도한3T3 주, Balb - c 또는 NIH 마우스, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.Host cells used for glycosylated GDNFR protein expression are also derived from multicellular organisms. Such host cells may be processing and glycosylation active complexes. In principle, all higher eukaryotic cell cultures can be used, whether or not the cultures contain vertebrate cells or invertebrate cells, including plant and insect cells. Proliferation of vertebrate cells in culture (tissue culture) is a known process. Examples of useful mammalian host cell lines include monkey kidney CV1 strain (COS 7) transformed with SV40, human embryonic kidney strain (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture), baby hamster kidney cells and Chinese hamster ovary cells include, but are not limited to. Other suitable mammalian cell lines include, but are not limited to, HeLa, mouse L-929 cells, 3T3 strains derived from Switzerland, Balb-c or NIH mice, BHK or HaK hamster cell lines.

적당한 숙주 세포에서 원핵 세포도 포함된다. 원핵 숙주 세포는 그람 - 음성 유기체나 그람 - 양성 유기체, 예를들어 E.coli, 비. 섭티리스(B. subtilis) 같은 바실리(Bacilli), 녹농균(P. aeruginosa)과 같은 슈도모나스 종, 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescans)와 같은 박테리아 세포를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 예를들어, 여러가지 E. coli 종(예를들어, HB101, DH5a, DH10 및 MC1061)은 생명공학 분야에서 숙주 세포로 잘 알려져 있다. GDNFR 단백질 생산용으로 현재 바람직한 숙주 세포는 박테리아 세포(예를들어, E. coli)와 포유동물 세포(차이니즈 햄스터 난소 세포, COS 세포 등)이다.Prokaryotic cells are included in suitable host cells. Prokaryotic host cells are Gram-negative organisms or Gram-positive organisms such as E. coli, B. a. Includes, but is not limited to, bacilli, such as B. subtilis, Pseudomonas species, such as P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, or bacterial cells, such as Serratia marcescans. Does not. For example, various E. coli species (eg, HB101, DH5a, DH10 and MC1061) are well known host cells in the biotechnology field. Currently preferred host cells for GDNFR protein production are bacterial cells (eg E. coli) and mammalian cells (Chinese hamster ovary cells, COS cells, etc.).

상기 발현 벡터나 클로닝 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키고 바람직하게 형질전환시킨 다음 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하고 원하는 서열을 코드하는 유전자를 증폭시키기에 적당하도록 배지를 변화시킬 수 있다. 형질감염이나 형질전환은 본 분야의 숙련자들에게 공지되고 관련 숙주 세포에 적당하도록 선택한 표준 기술을 이용하여 실시한다. 예를들어 세포벽이없는 포유동물 세포의 경우, 인산칼슘 침전법을 사용한다. 일렉트로포레이션, 현미주사 및 그외의 공지 기술도 사용할 수 있다.Host cells are transfected with the expression vector or cloning vector, preferably transformed, and then cultured in conventional nutrient media. The medium may be altered to suit the promoter or to select the transformant and to amplify the gene encoding the desired sequence. Transfection or transformation is carried out using standard techniques known to those skilled in the art and chosen to be appropriate for the host host involved. For example, for mammalian cells without cell walls, calcium phosphate precipitation is used. Electroporation, brown rice injection, and other well-known techniques can also be used.

숙주 세포 배양Host Cell Culture

본 발명의 GDNFR 단백질 생산에 사용하는 형질전환 세포는 적당한 배지에서 배양한다. 호르몬 및/또는 그외의 성장 인자(예, 인슐린, 트란스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예, HEPES), 누클레오시드(예, 아데노신 및 티미딘), 항생물질(예, 젠타마이신), 미량원소(최종 농도가 보통 마이크로몰 범위로 존재하는 무기 화합물로 규정됨) 및 포도당이나 그외의 에너지원으로 필요한 만큼 배지를 보충한다. 그외의 보충물은 본 분야의 숙련자들이 인지하는 바와 같이 적당한 농도로 포함될 수 있다. 선택한 숙주 세포에 사용하기 위한, 온도, pH 등과 같은 적당한 배양 조건은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.The transformed cells used for producing GDNFR protein of the present invention are cultured in a suitable medium. Hormones and / or other growth factors (eg insulin, transferrin or epidermal growth factor), salts (eg sodium chloride, calcium, magnesium and phosphate), buffers (eg HEPES), nucleosides (eg adenosine and thymi) Dean), antibiotics (eg gentamicin), trace elements (defined as inorganic compounds whose final concentrations are usually present in the micromolar range), and glucose or other energy sources as necessary. Other supplements may be included at appropriate concentrations as would be appreciated by those skilled in the art. Suitable culture conditions, such as temperature, pH, etc., for use in the host cell of choice are known to those skilled in the art.

일단 GDNFR 단백질이 생산되면, 크로마토그래피(예를들어, 이온 교환, 친화 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도를 포함한 표준 방법 또는 그외의 모든 단백질 정제 표준 기술에 의해 분리정제한다. 특히, GDNFR 단백질은 GDNF 또는 고정 지지체에 결합시킨 항- GDNFR 을 함유하는 친화 컬럼에 결합시킴으로써 분리한다.Once GDNFR proteins are produced, they are separated and purified by standard methods including chromatography (eg, ion exchange, affinity and sizing column chromatography), centrifugation, differential solubility, or any other protein purification standard technique. In particular, GDNFR proteins are isolated by binding to an affinity column containing anti-GDNFR bound to GDNF or a fixed support.

상동 재조합Homologous recombination

GDNFR 단백질은 상동 재조합에 의해 제조하거나 재조합 생산 방법으로 제조하는데, 이 방법은 GDNFR 을 코드하는 DNA 를 이미 함유하는 세포내로 삽입시킨 조절 성분을 이용한다. 예를들어, 상동 재조합 방법은 정상적으로 전사되는 사일런트 GDNFR 유전자 또는 정상이하로 발현되는 유전자를 함유하는 세포를 변이시킴으로써 GDNFR 을 발현하는 세포를 생산하는 데 사용한다. 상동 재조합은 처음에는 전사적으로 활성인 유전자에서 돌연변이를 유발하거나 교정하기 위해 표적 유전자에 대해 개발된 기술이다(Kucherlapati, Prog. in Nacl. Acid Res. and Mol. Biol., 36 : 301, 1989 참조). 기본 기술은 포유동물 게놈의 특정 부위에 특이 돌연변이를 도입하거나(Thomas 등의 Cell, 44 : 419 - 428, 1986 ; Thomas 및 Capecchi, Cell, 51 : 503 - 512, 1987 ; Doetschman 등의 Proc. Natl. Acad. Sci., 85 : 8583 - 8587, 1988 참조) 결함이 있는 유전자내에서 특이 돌연변이를 교정하기 위한(Doetschman 등의 Nature, 330 : 576 - 578, 1987 참조) 방법으로 개발되었다. 전형적인 상동 재조합 기술은 본원에서 참고문헌으로 인용한 U.S. 5,272,071 호(EP 91 90 3051, EP 공개 번호 제 505 500 호 ; PCT/US90/07642, 국제 공개 번호 제 WO91/09955 호)에 기술되어 있다.GDNFR proteins are prepared by homologous recombination or by recombinant production methods, which utilize regulatory elements inserted into cells that already contain DNA encoding GDNFR. For example, homologous recombination methods are used to produce cells expressing GDNFR by mutating cells containing silently transcribed silent GDNFR genes or subnormally expressed genes. Homologous recombination is a technique originally developed for target genes to induce or correct mutations in transcriptionally active genes (see Kucherlapati, Prog. In Nacl. Acid Res. And Mol. Biol., 36: 301, 1989). . The basic technique is to introduce specific mutations in specific regions of the mammalian genome (Cell, et al., Cell et al., 44: 419-428, 1986; Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503-512, 1987; Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8583-8587, 1988) to develop specific mutations in defective genes (see Doetschman et al., Nature, 330: 576-578, 1987). Typical homologous recombination techniques are described in U.S. Pat. 5,272,071 (EP 91 90 3051, EP Publication No. 505 500; PCT / US90 / 07642, International Publication No. WO91 / 09955).

상동 재조합을 통해, 게놈 내로 삽입되는 DNA 서열은 표적 DNA 에 부착됨으로써 중요한 유전자의 특이 부위에 의해 조절될 수 있다. 표적 DNA 는 게놈 DNA 부위에 상보적인(상동인) DNA 이다. 게놈의 특이 부위에 상보적인 표적 DNA 소단편은 DNA 복제 과정중에 모가닥과 접촉되도록 한다. 혼성되는 것이 세포내로 삽입되는 DNA 의 일반적인 성질이므로, 공유 상동 부위를 통해 내생 DNA 의 다른 단편과 재조합된다. 이 상보 가닥이 상이한 DNA 서열이나 돌연변이를 함유하는 올리고누클레오티드에 결합한다면, 그것 역시 재조합 결과 새로 합성된 가닥내로 삽입된다. 교정 기능 결과로서, 새로운 DNA 서열이 주형으로 작용할 수 있다. 따라서, 전이 DNA 가 게놈내로 삽입된다.Through homologous recombination, DNA sequences inserted into the genome can be regulated by specific sites of important genes by attaching to target DNA. Target DNA is DNA that is complementary (homogenous) to genomic DNA sites. Target DNA fragments complementary to specific regions of the genome are brought into contact with the parent strand during the DNA replication process. Because hybridization is a general property of DNA inserted into cells, it is recombined with other fragments of endogenous DNA through covalent homologous sites. If this complementary strand binds to oligonucleotides containing different DNA sequences or mutations, it is also inserted into the newly synthesized strand as a result of recombination. As a result of the calibration function, new DNA sequences can serve as templates. Thus, the transition DNA is inserted into the genome.

본원에 나타나 있는 GDNFR 의 핵산 서열, 프리 - 프로 서열 또는 발현 조절 서열과 같은 특정 유전자 서열이 알려져 있다면, 중요 부위에 결합하는 특이 인식 부위에서 천연 DNA 를 적절히 제한함으로써 유전자의 선택 부위에 상보적인 DNA 단편을 합성하거나 수득할 수 있다. 이 단편은 세포내로 삽입될 때 표적 서열로 작용하며 게놈 내부의 상동 부위에 혼성될 것이다. DNA 복제 도중에 이러한 혼성화가 일어난다면, 이 DNA 단편과 거기에 부착되는 부가적인 서열은 오카자키단편(Okazaki fragment)으로 작용할 것이며 새로 합성된 DNA 딸가닥 내로 백스티치될 것이다.If a particular gene sequence, such as the nucleic acid sequence, pre-pro sequence or expression control sequence of GDNFR as shown herein is known, the DNA fragment complementary to the site of selection of the gene by appropriate restriction of the native DNA at the specific recognition site that binds to the important site Can be synthesized or obtained. This fragment acts as a target sequence when inserted into the cell and will hybridize to homologous sites within the genome. If this hybridization occurs during DNA replication, this DNA fragment and the additional sequence attached to it will act as an Okazaki fragment and backstitch into the newly synthesized DNA daughter strand.

표적 DNA 의 이 단편에 부착되는 것은 GDNFR 단백질 발현에 관련된 DNA 부위이다. 예를들어, 프로모터/인핸서 성분, 억제자 또는 외생 전사 조절 성분이 원하는 GDNFR 단백질을 코드하는 DNA 전사에 영향을 미치기에 충분한 방향과 거리로 숙주 세포 게놈내로 삽입된다. 조절 성분은 GDNFR 을 코드하지는 못하지만, 숙주 세포 게놈에 존재하는 DNA 부분을 조절한다. 따라서, GDNFR 단백질 발현은 GDNFR 유전자 자체를 코드하는 DNA 의 형질감염에 의해서가 아니라, 오히려 내생 유전자 서열에게 GDNFR 단백질의 인식가능한 전사 시그널을 제공하는 DNA 조절 단편과 짝이 되는 표적 DNA(중요한 내생 유전자와 상동인 부위를 함유함)를 사용함으로써 이루어질 수 있다.Attached to this fragment of target DNA is the DNA site involved in GDNFR protein expression. For example, a promoter / enhancer component, suppressor or exogenous transcriptional regulatory component is inserted into the host cell genome in a direction and at a distance sufficient to affect DNA transcription encoding the desired GDNFR protein. The regulatory component does not encode GDNFR but regulates the DNA portion present in the host cell genome. Thus, GDNFR protein expression is not by transfection of the DNA encoding the GDNFR gene itself, but rather by the target DNA (with an important endogenous gene) paired with a DNA regulatory fragment that provides the endogenous gene sequence with a recognizable transcription signal of the GDNFR protein. Containing the homologous moiety).

A.GDNFR 변이체 A. GDNFR Variants

상기한 바와 같이, 본원에 사용한 용어 'GDNFR 유사체' 는 도 2 및 4 에 도시한 서열(서열 2 및 4)을 포함하는 자연발생적인 GDNFR 폴리펩티드의 아미노산 서열내의 잔기로 부터 아미노산이 결실된 폴리펩티드('결실 변이체'), 아미노산이 그 잔기내에 삽입된 폴리펩티드('부가 변이체') 또는 아미노산이 그 잔기 대신 치환된 폴리펩티드('치환 변이체')를 포함한다. 그와 같은 변이체는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 내로 적합한 누클레오티드 변화를 도입시킴으로써, 또는 원하는 폴리펩티드를 시험관내 화학합성함으로써 제조한다. 최종 분자가 GDNFR 활성을 지닌다면, 성숙한 인체 GDNFR 과 같은 아미노산 서열에 대한 많은 결실, 삽입 및 치환의 조합이 이루어질 수 있다는 것을 본 분야의 숙련된 기술자들은 이해할 것이다.As noted above, the term 'GDNFR analog' as used herein refers to a polypeptide having an amino acid deletion from a residue in the amino acid sequence of a naturally occurring GDNFR polypeptide comprising the sequence shown in FIGS. 2 and 4 (SEQ ID NOS: 2 and 4). Deletion variants'), polypeptides in which an amino acid is inserted into a residue ('additional variant') or polypeptide in which an amino acid is substituted for a residue ('substituent variant'). Such variants are prepared by introducing a suitable nucleotide change into the DNA encoding the polypeptide, or by in vitro chemical synthesis of the desired polypeptide. Those skilled in the art will appreciate that a combination of many deletions, insertions and substitutions for amino acid sequences such as mature human GDNFR can be made if the final molecule has GDNFR activity.

GDNFR 아미노산 서열에 관한 본 설명을 기초로 하면, 하나 또는 그 이상의 잔기의 동일성이나 존재위치면에서 도면에 나타낸 입체 형태와 구별되는 일차 입체 형태를 갖는 폴리펩티드의 재조합(예를들어, 미생물) 발현에 사용하기에 적합한 다양한 핵산 서열을 용이하게 고안하고 제조할 수 있다. 도 2 및 4 에 도시한 핵산 서열에 의해 코딩되는 하나 또는 그 이상의 선택 아미노산 잔기를 치환, 삽입 또는 결실시키기 위한 돌연변이유발 기술은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있다(예를들어, 미국 특허 번호 제 4,518,584 호 참조, 이 명세서는 본원에 참고문헌으로 인용됨). 치환 변이체 구성에는 2 가지 주요 변수가 존재한다 : 돌연변이 부위의 존재위치와 돌연변이의 성질. GDNFR 치환 변이체를 고안함에 있어, 돌연변이 부위 및 돌연변이의 성질의 선택은 변형될 GDNFR 특성(들)에 좌우될 것이다. 돌연변이를 위한 부위는, 예를들어 (1) 먼저 보존적 아미노산 변형으로 치환한 다음 획득된 결과에 따라 더 많은 라디칼 선택으로 치환함으로써, (2) 표적 아미노산 잔기를 결실시킴으로써, 또는 (3) 위치가 정해진 부위 부근에 아미노산 잔기를 삽입함으로써 개별적으로나 연속하여 변형시킬 수 있다. 1 내지 30 의 근접 아미노산의 보존적 변화가 바람직하다. N - 말단 및 C - 말단 결실 GDNFR 단백질 변이체는 또한 단백질 분해 효소에 의해 생성될 수 있다.Based on this description of the GDNFR amino acid sequence, it is used for recombinant (eg, microbial) expression of a polypeptide having a primary conformation distinct from the conformation shown in the figures in terms of identity or location of one or more residues. Various nucleic acid sequences suitable for the following can be easily designed and prepared. Mutagenesis techniques for substitution, insertion or deletion of one or more selected amino acid residues encoded by the nucleic acid sequences shown in FIGS. 2 and 4 are known to those skilled in the art (eg, US patents). No. 4,518,584, which is incorporated herein by reference). There are two main variables in the construction of substitutional variants: the location of the mutation site and the nature of the mutation. In designing GDNFR substitutional variants, the choice of mutation site and nature of the mutation will depend on the GDNFR characteristic (s) to be modified. The site for the mutation can be, for example, (1) by first replacing with conservative amino acid modifications and then by more radical selection, depending on the results obtained, (2) by deleting the target amino acid residues, or (3) by Modifications can be made individually or continuously by inserting amino acid residues near defined sites. Conservative changes of 1 to 30 proximal amino acids are preferred. N-terminal and C-terminal deletion GDNFR protein variants may also be produced by proteolytic enzymes.

GDNFR 결실 변이체의 경우, 결실은 일반적으로 약 1 내지 30 근접 잔기, 더 일반적으로는 약 1 내지 10 근접 잔기의 범위이고 전형적으로 약 1 내지 5 근접 잔기이다. N - 말단, C - 말단 및 내부 서열내 결실이 예상된다. GDNFR 의 활성도를 변형시키기 위해 비 - 인체 GDNFR 과 낮은 상동성을 갖는 분자 부위내로 결실을 도입시킬 수 있다. 비 - 인체 GDNFR 서열과 실질적인 상동성을 갖는 부위내 결실이 GDNFR 생물학적 활성도를 더 상당히 변형시킬 것이다. 전형적으로, 영향 받은 도메인, 예를들어 시스테인 교차결합내 GDNFR 단백질 산물의 3 차 구조가 보존되도록 보존적 결실의 수는 선택될 것이다. 결실 변이체의 비제한적 예로는 N - 말단 또는 C - 말단 아미노산 잔기가 결여되어 있는 절단된 GDNFR 단백질 산물을 포함한다. 예를들어, 세포질막에 대한 GDNFR 수용체의 글리코실 - 포스파티딜이노시톨(GPI) 고정과관련된 펩티드 부위를 제거함으로써 가용성 수용체를 제조할 수 있다.In the case of GDNFR deletion variants, deletions generally range from about 1 to 30 proximal residues, more generally about 1 to 10 proximal residues and are typically about 1 to 5 proximal residues. N-terminal, C-terminal and internal sequence deletions are expected. A deletion can be introduced into a molecular site that has low homology with non-human GDNFRs to modify the activity of GDNFR. In situ deletions that have substantial homology with non-human GDNFR sequences will further modify GDNFR biological activity. Typically, the number of conservative deletions will be chosen such that the tertiary structure of the GDNFR protein product in the affected domain, eg, cysteine crosslinking, is preserved. Non-limiting examples of deletion variants include truncated GDNFR protein products that lack N- or C-terminal amino acid residues. For example, soluble receptors can be prepared by removing peptide sites associated with glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) immobilization of the GDNFR receptor to the cytoplasmic membrane.

GDNFR 부가 변이체의 경우, 전형적으로 아미노산 서열부가는 N - 및/또는 C - 말단 융합이나, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 내부 또는 중간 부가 뿐만 아니라 하나의 잔기에서 백 또는 그 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이 범위의 말단 부가를 포함한다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 초기 메티오닌 아미노산 잔기(원하는 폴리펩티드의 첫 번째 아미노산 잔기에 대한 위치 -1 에서)를 포함할 수 있다. 내부 부가는 일반적으로 약 1 내지 10 근접 잔기, 보다 전형적으로는 약 1 내지 5 잔기의 범위이고, 보통은 약 1 내지 3 아미노산 잔기의 범위일 것이다. N - 말단 부가 변이체의 예는, 재조합 숙주세포로 부터 성숙한 GDNFR 의 분비를 촉진시켜 수확이나 생체내이용율이 촉진되도록 GDNFR 의 N - 말단에 이종 N - 말단 시그널 서열을 포함시킨 GDNFR 을 포함한다. 그러한 시그널 서열은 일반적으로 의도된 숙주세포종으로 부터 수득될 것이므로 그 종과 동종일 것이다. 또한 부가는 그외의 신경영양성 인자의 서열로 부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를들어, 결합서열과 함께 또는 결합서열 없이 GDNF 와 GDNFR 의 융합단백질을 생산함으로써 단일 분자의 치료학적 실재를 형성하고자 한다.In the case of GDNFR addition variants, the amino acid sequence is typically a N- and / or C-terminal fusion, or a polypeptide length range containing one or more residues at one residue as well as internal or intermediate additions of single or multiple amino acid residues. Terminal addition of a. Polypeptides of the invention may also include an initial methionine amino acid residue (at position -1 relative to the first amino acid residue of the desired polypeptide). Internal additions will generally range from about 1 to 10 proximal residues, more typically from about 1 to 5 residues, and will usually range from about 1 to 3 amino acid residues. Examples of N-terminal addition variants include GDNFRs that contain heterologous N-terminal signal sequences at the N-terminus of GDNFR to promote secretion of mature GDNFRs from recombinant host cells to promote harvesting or bioavailability. Such signal sequences will generally be homologous to the species as they will be obtained from the intended host cell species. The addition may also include amino acid sequences derived from sequences of other neurotrophic factors. For example, it is intended to form a single molecule therapeutic entity by producing a fusion protein of GDNF and GDNFR with or without a binding sequence.

GDNFR 치환 변이체는 GDNFR 아미노산 서열 중 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 다른 잔기(들)가 삽입된 것이다. 그와 같은 치환 변이체는 대립형질 변이체를 포함하는데, 이 대립형질 변이체는 아미노산 변화를 초래할 수 있거나 초래할 수 없는 종 집단에서의 자연발생적인 누클레오티드 서열 변화를 특징으로 한다. 다른 변이체 형태에서와 같이, 치환 변이체는 하나 또는 그 이상의 다른 위치에서 단일 또는 근접 아미노산 잔기의 치환을 포함할 수 있다.GDNFR substitutional variants are those in which one or more amino acid residues of a GDNFR amino acid sequence have been removed and the other residue (s) inserted at that position. Such substitutional variants include allelic variants, which are characterized by naturally occurring nucleotide sequence changes in a population of species that may or may not result in amino acid changes. As with other variant forms, substitutional variants may include substitution of single or adjacent amino acid residues at one or more other positions.

GDNFR 아미노산 서열의 특이 돌연변이는 글리코실화 부위(예를들어, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴)에 대한 변형을 포함할 수 있다. 임의의 아스파라긴 - 결합 글리코실화 인식 부위에서나 O - 결합 탄수화물 부가에 의해 변형된 분자의 임의의 부위에서 아미노산 치환 또는 결실로 인해 글리코실화의 부재 또는 단지 부분 글리코실화가 초래된다. 아스파라긴 - 결합 글리코실화 인식 부위는 고유의 세포 글리코실화 효소에 의해 특이하게 인식되는 트리펩티드 서열을 포함한다. 이들 트리펩티드 서열은 Asn - Xaa - Thr 이나 아니면 Asn - Xaa - Ser 이되, 여기서 Xaa 는 Pro 이외의 어떠한 아미노산일 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 다에서 다양하게 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 두 번째 위치에서의 아미노산 결실)됨으로써 변형된 트리펩티드 서열에서 비 - 글리코실화가 초래된다. 따라서, 고유하게 변형된 누클레오티드 서열이 발현하면 그 위치에서 글리코실화되지 않는 변이체가 생산된다. 택일적으로, 글리코실화 부위가 부가되도록 GDNFR 아미노산 서열을 변형시킬 수 있다.Specific mutations in the GDNFR amino acid sequence may include modifications to glycosylation sites (eg, serine, threonine or asparagine). Amino acid substitutions or deletions at any asparagine-binding glycosylation recognition site or at any site of the molecule modified by O-linked carbohydrate addition result in the absence or only partial glycosylation of glycosylation. Asparagine-binding glycosylation recognition sites include tripeptide sequences that are specifically recognized by native cellular glycosylation enzymes. These tripeptide sequences are Asn-Xaa-Thr or Asn-Xaa-Ser, where Xaa can be any amino acid other than Pro. Various amino acid substitutions or deletions (and / or amino acid deletions at the second position) at one or both of the first or third amino acid positions of the glycosylation recognition site result in non-glycosylation in the modified tripeptide sequence. . Thus, expression of a uniquely modified nucleotide sequence produces a variant that is not glycosylated at that position. Alternatively, the GDNFR amino acid sequence can be modified to add a glycosylation site.

GDNFR 아미노산 잔기나 돌연변이유발을 위한 부위를 확인하는 한 방법은 Cunningham and Wells(Science, 244 : 1081 - 1085, 1989 참조)가 기술한 바와 같이 '알라닌 스캐닝 돌연변이유발' 이라 부른다. 이 방법에 있어, 아미노산 잔기나 표적 잔기의 기를 확인하여(예를들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu 같은 하전 잔기) 세포내 또는 세포 외부의 주변 수성 환경과 아미노산과의 상호작용에 영향을 미치도록 중성 또는 음전화된 아미노산(알라닌 또는 폴리알라닌이 가장 바람직함)으로 대체한다. 그런 다음 치환 부위에 부가 또는 선택 잔기를 도입함으로써 치환에 대한 기능상 감수성을 나타내는 이들 도메인을 정련시킬 수 있다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 표적 부위를 결정하여 상응 표적 코돈이나 그 DNA 서열의 부위에 대해 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 GDNFR 변이체를 원하는 활성 및 활성도의 최적 조합에 대해 선별한다.One method of identifying GDNFR amino acid residues or sites for mutagenesis is called alanine scanning mutagenesis, as described by Cunningham and Wells (see Science, 244: 1081-1085, 1989). In this method, amino acid residues or groups of target residues are identified (e.g., charged residues such as Arg, Asp, His, Lys, and Glu) to affect the interaction of amino acids with the surrounding aqueous environment in or outside the cell. Replace with a neutral or negatively substituted amino acid (alanine or polyalanine is most preferred). These domains that exhibit functional susceptibility to substitution can then be refined by introducing additional or selective residues at the substitution sites. Thus, a target site for introducing amino acid sequence variations is determined to perform alanine scanning or random mutagenesis of the corresponding target codon or site of its DNA sequence, and the expressed GDNFR variant is selected for the optimal combination of desired activity and activity. do.

치환 돌연변이유발에 가장 흥미있는 부위는, 여러 종의 GDNFR 단백질에서 발견되는 아미노산이 곁사슬 부피, 전하 및/또는 소수성 면에서 실질적으로 다른 부위를 포함한다. 그외의 흥미있는 부위는 여러종으로 부터 수득한, GDNFR - 유사 단백질의 특정 잔기가 동일한 부위이다. 그와 같은 위치는 일반적으로 단백질의 생물학적 활성도에 중요하다. 처음에 이 부위는 비교적 보존적인 방식으로 치환한다. 표 2 의 표제 바람직한 치환 아래에 그와 같은 보존 치환이 나타나 있다. 그와 같은 치환 결과 생물학적 활성도가 변한다면, 더 실질적인 변화(전형적인 치환)를 도입하고/도입하거나 그 외의 부가 또는 결실을 만들어, 결과적으로 생성된 산물을 활성도에 대해 선별한다.Sites of most interest for substitutional mutagenesis include sites where amino acids found in several GDNFR proteins differ substantially in side chain volume, charge, and / or hydrophobicity. Other sites of interest are sites in which certain residues of GDNFR-like proteins, obtained from several species, are identical. Such location is generally important for the biological activity of the protein. Initially this site is substituted in a relatively conservative manner. Such conservative substitutions are shown under the heading Preferred Substitutions in Table 2. If such substitution results in a change in biological activity, more substantial changes (typical substitutions) are introduced and / or other additions or deletions are made, and the resulting product is selected for activity.

아미노산 서열에 대한 보존적 변형(및 암호화 핵산 서열에 대한 상응 변형)으로 인해 자연발생적인 GDNFR 과 기능적 및 화학적 특성이 유사한 GDNFR 단백질 산물이 생산된다고 예상된다. 대조적으로, GDNFR 단백질 산물의 기능적 및/또는 화학적 특성의 실질적인 변형은 다음을 유지하는 효과 면에서 상당히 다른 치환을 선택함으로써 수행할 수 있다 : (a) 치환 부위의 폴리펩티드 골격 구조, 예를들어, 병풍 또는 나선 입체형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 곁사슬 부피. 자연발생적인 잔기는 공동 곁사슬 특성에 기초하여 다음 군으로 나누어질 수 있다 :Conservative modifications to amino acid sequences (and corresponding modifications to coding nucleic acid sequences) are expected to produce GDNFR protein products that are similar in function and chemical properties to naturally occurring GDNFRs. In contrast, substantial modification of the functional and / or chemical properties of the GDNFR protein product can be accomplished by selecting significantly different substitutions in terms of the effect of maintaining the following: (a) the polypeptide backbone structure of the substitution site, eg, a screen Or helical conformation, (b) charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) side chain volume. Naturally occurring residues can be divided into the following groups based on their common side chain properties:

1) 소수성 : 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile ;1) hydrophobic: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) 중성 친수성 : Cys, Ser, Thr ;2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr;

3) 산성 : Asp, Glu ;3) acidic: Asp, Glu;

4) 염기성 : Asn, Gln, His, Lys, Arg ;4) basic: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro ; 및5) residues that influence chain orientation: Gly, Pro; And

6) 방향족성 : Trp, Tyr, Phe.6) Aromaticity: Trp, Tyr, Phe.

비 - 보존적 치환은 이들 군 중 한 군의 일부를 다른 군의 일부와 교환하는 것을 포함한다. 그와 같은 치환 잔기는 비 - 인체 GDNFR 단백질과 상동인 인체 GDNFR 단백질의 부위내에, 또는 그 분자의 비 - 상동 부위내에 도입시킬 수도 있다.Non-conservative substitutions include exchanging a portion of one of these groups for a portion of another group. Such substitution moieties may be introduced into a site of human GDNFR protein that is homologous to a non-human GDNFR protein, or into a non-homologous site of the molecule.

따라서, GDNFR 단백질, 유사체 또는 그 유도체는 일차 아미노산 서열로서, 도 2 및 4 에 도시한 아미노산 서열(서열 2 및 4)의 전부 또는 일부를 함유하는 생물학적 활성 분자를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 이 단백질은 그 서열내 잔기를 생물학적으로 등가인 아미노산 잔기로 치환하여 그 결과 사일런트 변이를 초래하는 변형된 서열을 포함할 것이다. 예를들어, 서열내 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 사일런트 변이를 초래하는, 기능상 동등하게 작용하는 유사 극성을 갖는 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 서열내 아미노산에 대한 치환체는 아미노산이 속하는 군의 다른 일부 중에서 선택할 수 있다. 예를들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루타민산을 포함한다. GDNFR 단백질, 유사체, 또는 그것의 단편이나 유도체는 예를들어, 인산화, 글리코실화, 교차결합, 아실화, 단백질 가수분해, 항체 분자, 막 분자 또는 다른 리간드와의 결합에 의해 번역 중이나 번역후 차별적으로 변형될 수 있다.Thus, GDNFR proteins, analogs or derivatives thereof include, but are not limited to, biologically active molecules containing, as primary amino acid sequences, all or part of the amino acid sequences shown in FIGS. 2 and 4 (SEQ ID NOS: 2 and 4). This protein will include a modified sequence that replaces residues in the sequence with biologically equivalent amino acid residues, resulting in silent mutations. For example, one or more amino acid residues in the sequence may be substituted with other amino acids having similar polarities that function equivalently, resulting in silent mutations. Substituents for amino acids in the sequence may be selected from other parts of the group to which the amino acids belong. For example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. GDNFR proteins, analogs, or fragments or derivatives thereof may be differentiated during or after translation, for example, by phosphorylation, glycosylation, crosslinking, acylation, proteolysis, binding to antibody molecules, membrane molecules or other ligands. It can be modified.

B.GDNFR 유도체 B. GDNFR Derivatives

GDNFR 또는 GDNFR 유사체를 화학적으로 변형시킨 유도체는 본 상세한 설명을 기초로 하여 본 분야의 숙련된 기술자들이 제조할 수 있다. 유도체에 가장 적합한 화학성분은 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체가 단백질에 부착하면 수성 환경, 이를테면 생리학적 환경에서 침전되지 않기 때문에 이 수용성 중합체가 바람직하다. 바람직하게, 이 중합체는 치료학적 산물 또는 조성물 제조를 위해 제약학적으로 용인가능할 것이다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 중합체/단백질 결합체가 치료학적으로 사용될 것인지의 여부, 만일 그렇다면 원하는 투여량, 순환 시간, 단백질 가수분해에 대한 저항과 같은 고려할 사항, 및 그외의 고려할 사항을 기초로 하여 원하는 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 유도체화의 유효성은 유도체를 원하는 형태로(예를들어, 삼투펌프에 의해, 더 바람직하게 주사나 주입에 의해, 또는 경구, 폐 또는 그외의 수송 경로용으로 더 제형화시킨 형태로) 투여하여 그것의 유효성을 측정함으로써 확인할 수 있다.Chemically modified derivatives of GDNFR or GDNFR analogs can be prepared by those skilled in the art based on this detailed description. Most suitable chemical ingredients for the derivatives include water soluble polymers. This water-soluble polymer is preferred because the water-soluble polymer adheres to the protein because it does not precipitate in an aqueous environment, such as a physiological environment. Preferably, the polymer will be pharmaceutically acceptable for preparing the therapeutic product or composition. Those skilled in the art will appreciate that based on whether the polymer / protein combination will be used therapeutically, and if so, the desired dosage, cycle time, considerations such as resistance to proteolysis, and other considerations Polymers may be chosen. The effectiveness of derivatization can be achieved by administering the derivative in the desired form (e.g., by osmotic pump, more preferably by injection or infusion, or in a more formulated form for oral, pulmonary or other transport routes). This can be confirmed by measuring the effectiveness of.

적합한 수용성 중합체로는 다음이 포함되나, 이것으로 국한되지 않는다 : 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리 -1, 3 - 디옥솔란, 폴리 - 1, 3, 6 - 트리옥산, 에틸렌/무수 말레산 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체나 아니면 무작위 공중합체) 및 덱스트란 또는 폴리(n - 비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올류(예를들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그것의 혼합물. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데히드가 물에 안정하므로 제조시 잇점을 가질 수 있다.Suitable water soluble polymers include, but are not limited to: polyethylene glycol, copolymers of ethylene glycol / propylene glycol, carboxymethylcellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, poly-1, 3 Dioxolane, poly-1,3,6-trioxane, ethylene / maleic anhydride copolymer, polyamino acid (homopolymer or random copolymer) and dextran or poly (n-vinyl pyrrolidone) polyethylene glycol, Propropylene glycol homopolymers, prolipropylene oxide / ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols (eg, glycerol), polyvinyl alcohols, and mixtures thereof. Polyethylene glycol propion aldehydes are water stable and may therefore have advantages in manufacturing.

중합체는 어떠한 분자량도 가질 수 있으며, 분지되거나 비분지될 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우, 취급하고 제조하기에 용이하도록 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 의 분자량이 바람직하다(용어 '약' 은 폴리에틸렌 글리콜 제조시, 어떤 분자량은 상태 분자량보다 더 많을 것이고, 어떤 분자량은 상태 분자량보다 더 적을 것이라는 것을 의미함). 원하는 치료학적 프로필(예를들어, 원하는 지속적인 유리 기간 ; 가령 존재한다면, 생물학적 활성도에 대한 효과 ; 취급시 용이함 ; 항원성의 정도나 결여 및 치료학적 단백질이나 변이체에 대한 그외 공지된 폴리에틸렌 글리콜의 효과)에 좌우하여 다른 크기를 이용할 수도 있다.The polymer may have any molecular weight and may be branched or unbranched. For polyethylene glycols, molecular weights of from about 2 kDa to about 100 kDa are preferred to facilitate handling and preparation (the term 'about' when producing polyethylene glycol, which molecular weight will be higher than the state molecular weight, and which molecular weight is the state molecular weight). Means less than). On the desired therapeutic profile (e.g., the desired sustained free period; for example, the effect on biological activity, if present; ease of handling; the degree or lack of antigenicity and the effect of other known polyethylene glycols on therapeutic proteins or variants). Other sizes may be used on the left and right sides.

상기와 같이 부착되는 중합체 분자의 수는 다양할 것이며, 본 분야의 숙련된 기술자들은 기능상 효과를 확인할 수 있을 것이다. 모노 - 유도체화 할 수 있거나, 또는 동일하거나 다른 화학성분(예를들어, 중합체, 이를테면 다른 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜)과 함께 디-, 트리-, 테트라 또는 어떤 유도체 조합을 제공할 수 있다. 반응 혼합물에서의 농도가 다양할 것이므로, 단백질(또는 펩티드) 분자에 대한 중합체 분자의 비율은 다양할 것이다. 일반적으로, 최적 비율(비반응된 단백질이나 과량의 중합체가 존재하지 않는다는 반응의 효능 면에서)은 원하는 유도체화의 정도(예를들어, 모노, 디-, 트리- 등), 중합체가 분지된 것이든지 비분지된 것이든지 간에 선택된 중합체의 분자량, 및 반응조건과 같은 인자들에 의해 결정될 것이다.The number of polymer molecules attached as such will vary, and those skilled in the art will be able to ascertain the functional effect. It can be mono-derivatized or a combination of di-, tri-, tetra or any derivative can be provided with the same or different chemical constituents (eg polymers, eg polyethylene glycols having different molecular weights). Since the concentration in the reaction mixture will vary, the ratio of polymer molecules to protein (or peptide) molecules will vary. In general, the optimal ratio (in terms of the efficacy of the reaction that no unreacted protein or excess polymer is present) determines the degree of derivatization desired (eg, mono, di-, tri-, etc.), that the polymer is branched. Whether unbranched or unbranched, will be determined by factors such as the molecular weight of the selected polymer, and reaction conditions.

폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 그외 화학성분)는 단백질의 기능상 효과 또는 항원 도메인을 고려하여 단백질에 부착시켜야 한다. 본 분야의 숙련된 기술자들에게 유용한 많은 부착방법이 있다. 예를들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 제 EP 0 401 384 호(G - CSF 에 대한 PEG 결합) 참조, 또한 Malik 등의 Exp. Hematol., 20 : 1028 - 1035, 1992(트레실 클로라이드를 사용한 GM - CSF 의 폴리에틸렌 글리콜화) 참조. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜은 반응기, 이를테면 유리 아미노기나 유리 카르복실기에 의해 아미노산 잔기에 공유결합될 수 있다. 반응기란 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합할 수 있는 기이다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기로는 리신 잔기 및 N - 말단 아미노산 잔기가 포함된다. 유리 카르복실기를 갖는 아미노산 잔기로는 아스파르트산 잔기, 글루타민산 잔기 및 C - 말단 아미노산 잔기가 포함된다. 또한 폴리에틸렌 글리콜 분자(들)을 부착시키기 위한 반응기로서 설프히드릴기가 사용될 수 있다. 치료학적 목적을 위해서는 아미노기에서의 부착, 이를테면 N - 말단이나 리신기에서의 부착이 바람직하다. 만일 수용체 결합이 요구된다면, 수용체 결합에 중요한 잔기에서의 부착은 피해야 한다.Polyethylene glycol molecules (or other chemical constituents) should be attached to the protein taking into account the functional effect or antigenic domain of the protein. There are many methods of attachment useful to those skilled in the art. See, for example, EP 0 401 384 (PEG binding to G-CSF), incorporated herein by reference, and also in Exp. Hematol., 20: 1028-1035, 1992 (polyethylene glycolation of GM-CSF with tresyl chloride). For example, polyethylene glycol can be covalently linked to an amino acid residue by a reactor such as a free amino group or a free carboxyl group. A reactor is a group to which activated polyethylene glycol molecules can bind. Amino acid residues having free amino groups include lysine residues and N-terminal amino acid residues. Amino acid residues having free carboxyl groups include aspartic acid residues, glutamic acid residues and C-terminal amino acid residues. Sulhydryl groups can also be used as the reactor for attaching the polyethylene glycol molecule (s). For therapeutic purposes, attachment at amino groups, such as at the N-terminus or lysine group, is preferred. If receptor binding is required, attachment at residues important for receptor binding should be avoided.

N - 말단을 화학적으로 변형시킨 단백질이 특히 바람직하다. 본원 조성물의 실례로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 때, 당업자들은 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자[분자량, 분지(branching) 등에 의함], 반응 혼합물내 단백질(또는 펩티드) 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 수행할 폴리에틸렌 글리콜화 반응의 유형 및 선택된 N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 수득하는 방법 중에서 선택할 수 있다. N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 제제를 수득하는 방법(즉, 필요하다면 다른 모노폴리에틸렌 글리콜화된 성분으로 부터 이 성분을 분리)은 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질 분자 집단으로 부터 N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 정제하는 것이다. 특정 단백질의 유도체화에 유용한 다른 유형의 일차 아미노기(리신 대 N - 말단)의 다른 반응성을 이용하는 환원성 알킬화에 의해 선택적인 N - 말단 화학변형을 수행할 수있다. 적당한 반응조건 하에서, 카르복실기 함유 중합체와 함께 N - 말단에서 단백질의 실질적으로 선택적인 유도체화가 획득된다. 예를들어, 리신 잔기의 e - 아미노기와 단백질의 N - 말단 잔기의 a - 아미노기 간의 pKa 차이의 잇점을 얻을 수 있는 pH 에서 반응을 수행함으로써 단백질을 선택적으로 N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화시킬 수 있다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한 수용성 중합체의 부착은 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 우선적으로 일어나되 다른 반응기, 이를테면 리신 곁사슬 아미노의 유의 변형은 발생되지 않는다. 환원성 알킬화를 이용할 때, 수용성 중합체는 상기한 유형일 수 있으며, 단백질에 결합하기 위한 단일 반응성 알데히드를 가져야 한다. 단일 반응성 알데히드를 포함하는, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드를 사용할 수도 있다.Particular preference is given to proteins with chemically modified N-terminus. When using polyethylene glycol as an example of the compositions herein, those skilled in the art will appreciate that various polyethylene glycol molecules (by molecular weight, branching, etc.), the ratio of polyethylene glycol molecules to protein (or peptide) molecules in the reaction mixture, polyethylene glycolization to be performed The type of reaction and the method of obtaining the selected N-terminally polyethylene glycolated protein can be selected. A method of obtaining an N -terminated polyethylene glycolated formulation (i.e., separating this component from other monopolyethylene glycolated components if necessary) is performed from the N-terminally polyethylene glycolated population of polyethylene glycolated protein molecule groups. To purify the material. Selective N-terminal chemical modifications can be performed by reductive alkylation utilizing other reactivity of other types of primary amino groups (lysine versus N-terminus) useful for derivatization of certain proteins. Under suitable reaction conditions, substantially selective derivatization of the protein at the N-terminus with a carboxyl group-containing polymer is obtained. For example, the protein can be selectively N-terminated polyethylene glycolated by conducting the reaction at a pH that can benefit from the difference in pKa between the e-amino group of the lysine residue and the a-amino group of the N-terminal residue of the protein. . By such selective derivatization, the attachment of the water soluble polymer to the protein is regulated: the binding with the polymer takes place preferentially at the N-terminus of the protein but no significant modification of other reactors, such as lysine side chain amino, occurs. When using reductive alkylation, the water soluble polymer may be of the type described above and must have a single reactive aldehyde to bind to the protein. Polyethylene glycol propionaldehyde, including a single reactive aldehyde, may also be used.

본 발명은 아실 또는 알킬 결합에 의해 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 부착된 GDNFR 또는 그 변이체의 용도 뿐만 아니라 최소한 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합된 원핵 - 발현 GDNFR 또는 그 변이체의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of GDNFR or a variant thereof attached to one or more polyethylene glycol molecules by acyl or alkyl bonds, as well as the use of prokaryotic-expressing GDNFR or a variant thereof bound to at least one polyethylene glycol molecule.

폴리에틸렌 글리콜화는 본 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 폴리에틸렌 글리콜화 반응에 의해서도 수행될 수 있다. Focus onGrowth Factors, 3(2) : 4 -10, 1992 ; 명세서를 본원에서 참고로 인용한 제 EP 0 154 316 호 ; 제 EP 0 401 384 호 및 폴리에틸렌 글리콜화와 관련된 그외 공개문헌들 참조. 폴리에틸렌 글리콜화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 상동성인 반응성 수용성 중합체)를 수반한 아실화 반응이나 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다.Polyethylene glycolation can be carried out by any polyethylene glycolation reaction known in the art. Focus on Growth Factors, 3 (2): 4-10, 1992; EP 0 154 316, the disclosure of which is incorporated herein by reference; See EP 0 401 384 and other publications related to polyethylene glycolation. Polyethylene glycolation can be carried out by acylation or alkylation reactions involving reactive polyethylene glycol molecules (or homologous reactive water soluble polymers).

일반적으로 아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 GDNFR 단백질이나 변이체를 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 활성 에스테르 유도체와 반응시키는 것을 포함한다. GDNFR 단백질이나 변이체의 폴리에틸렌 글리콜화를 수행하기 위해 어떤 공지된 또는 그 이후에 발견된 반응성 PEG 분자를 사용할 수도 있다. 선호되는 활성화 PEG 에스테르는 N - 히드록시숙시니미드(NHS)에 대해 에스테르화된 PEG 이다. 본원에 사용한 바와 같이, '아실화' 란 치료학적 단백질과 PEG 같은 수용성 중합체 간에 다음과 같은 유형의 결합을 제한없이 포함하는 것이다 : 아미드, 카르밤산염, 우레탄 등. Bioconjugate Chem., 5 : 133 - 140, 1994 참조. 반응조건은 폴리에틸렌 글리콜화 기술 분야에 공지되어 있는 어떠한 조건 또는 그 이후에 발견된 조건들 중에서 선택할 수 있으나, 변형되어질 GDNFR 이나 변이체를 불활성화시키는 온도, 용매 및 pH 와 같은 조건은 피해야 한다.Polyethylene glycolation, generally by acylation, involves reacting a GDNFR protein or variant with an active ester derivative of polyethylene glycol (PEG). Any known or later discovered reactive PEG molecule may be used to effect polyethylene glycolation of GDNFR proteins or variants. Preferred activated PEG esters are PEG esterified against N-hydroxysuccinimide (NHS). As used herein, 'acylation' is intended to include, without limitation, the following types of linkages between therapeutic proteins and water soluble polymers such as PEG: amides, carbamates, urethanes, and the like. See Bioconjugate Chem., 5: 133-140, 1994. The reaction conditions may be selected from any of the conditions known in the polyethylene glycolation art or those found thereafter, but conditions such as temperature, solvent and pH to inactivate the GDNFR or variant to be modified should be avoided.

아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 대개 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질이나 변이체를 생성한다. 바람직하게, 연결 결합은 아미드일 것이다. 또한 바람직하게, 결과적으로 생성된 산물은 실질적으로 오직(예를들어, > 95 %) 모노, 디-, 또는 트리- 폴리에틸렌 글리콜화될 것이다. 그러나, 사용하는 특별한 반응 조건에 좌우되는 양으로, 더 높은 정도의 폴리에틸렌 글리콜화된 어떤 종들이 형성될 수도 있다. 원한다면, 특히 투석, 염석, 한외여과, 이온 - 교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피 및 전기 영동을 포함하는 표준 정제 기술에 의해, 혼합물, 특히 비반응 종으로 부터 더 정제된 폴리에틸렌 글리콜화된 종을 분리할 수 있다.Polyethylene glycolation by acylation usually produces poly- polyethyleneglycolated GDNFR proteins or variants. Preferably, the linkage bond will be an amide. Also preferably, the resulting product will be substantially only (eg> 95%) mono, di-, or tri- polyethylene glycolated. However, certain higher degree of polyethylene glycolated species may be formed in an amount depending on the particular reaction conditions used. If desired, the more purified polyethylene glycolated species are separated from mixtures, especially unreacted species, by standard purification techniques, including dialysis, salting, ultrafiltration, ion-exchange chromatography, gel filtration chromatography and electrophoresis. can do.

일반적으로 알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 환원제의 존재하에서 GDNFR 단백질이나 변이체를 PEG 의 말단 알데히드 유도체와 반응시키는 것을 포함한다. 알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화 역시 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질이나 변이체를 생성한다. 또한, GDNFR 단백질이나 변이체(즉, 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질)의 N - 말단의 a - 아미노기에서만 실질적으로 폴리에틸렌 글리콜화가 유리하도록 반응조건을 조작할 수 있다. 모노폴리에틸렌 글리콜화나 폴리폴리에틸렌 글리콜화 중 어느 경우에나, -CH2-NH- 기를 통해 PEG 기가 단백질에 부착되는 것이 바람직하다. 특히 -CH2- 기와 관련하여, 이 유형의결합을 본원에서는 '알킬' 결합이라고 언급한다.Polyethylene glycolation, generally by alkylation, involves reacting a GDNFR protein or variant with a terminal aldehyde derivative of PEG in the presence of a reducing agent. Polyethylene glycolation by alkylation also produces poly- polyethylene glycolated GDNFR proteins or variants. In addition, the reaction conditions can be manipulated such that polyethylene glycolation is advantageous only at the N-terminus a-amino group of the GDNFR protein or variant (ie, mono- polyethylene glycolated protein). In either case of monopolyethylene glycolation or polypolyethylene glycolation, it is preferred that the PEG group is attached to the protein via the -CH2-NH- group. Particularly with regard to the —CH 2 — group, this type of bond is referred to herein as an 'alkyl' bond.

모노폴리에틸렌 글리콜화된 산물을 생산하는 환원성 알킬화에 의한 유도체화는 유도체화에 유용한 다른 유형의 일차 아미노기(리신 대 N - 말단)의 차별적인 반응성을 이용한다. 이 반응은 리신 잔기의 e - 아미노기와 단백질의 N - 말단 잔기의 a - 아미노기 간의 pKa 차이의 잇점을 얻을 수 있는 pH 에서 수행한다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한, 알데히드 같은 반응기를 포함하는 수용성 중합체의 부착은 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 우선적으로 일어나되, 그외 반응기, 이를테면 리신 곁사슬 아미노기의 유의 변형은 발생되지 않는다. 중요한 한 양상에 있어, 본 발명은 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체 분자[실질적으로 오직(즉, > 95 %) 단일 위치에서 중합체 분자가 GDNFR 단백질 또는 변이체에 부착되었음을 의미함]의 실질적으로 균질한 제제의 용도를 예상한다. 특히, 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 경우, 본 발명은 또한 가능한 항원 결합기가 결여되어 있고, GDNFR 단백질이나 변이체에 직접 결합된 폴리에틸렌 글리콜 분자를 갖는 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질이나 변이체의 용도를 포함한다.Derivatization by reductive alkylation to produce monopolyethylene glycolated products utilizes the differential reactivity of other types of primary amino groups (lysine versus N-terminus) useful for derivatization. This reaction is carried out at a pH that allows the benefit of the pKa difference between the e-amino group of the lysine residue and the a-amino group of the N-terminal residue of the protein. By such selective derivatization, the attachment of a water soluble polymer comprising a reactor, such as an aldehyde, to the protein is regulated: the binding with the polymer takes place preferentially at the N-terminus of the protein, but other reactors, such as lysine side chain amino groups Significant deformation of does not occur. In one important aspect, the present invention provides the substantially equivalent of a monopolymer / GDNFR protein (or variant) conjugate molecule, meaning that the polymer molecule has been attached to the GDNFR protein or variant in a substantially only (ie> 95%) single position. Expect the use of homogeneous formulations. In particular, when using polyethylene glycol, the present invention also encompasses the use of polyethylene glycolated GDNFR proteins or variants that lack a possible antigen binding group and have polyethylene glycol molecules directly linked to the GDNFR proteins or variants.

따라서, 본 발명에 따른 GDNFR 단백질 산물은 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질이나 변이체를 포함하는데, 여기서 PEG 기(들)은 아실 또는 알킬기를 통해 부착된다. 상기한 바와 같이, 그와 같은 산물은 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화되거나 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화(예를들어, 2 - 6 개, 바람직하게 2 - 5 개의 PEG 기 함유)될 수 있다. PEG 기는 대개 아미노산의 a 또는 e 아미노기에서 단백질에 부착하지만, 또한 PEG 기는 단백질에 부착된 어떠한 아미노기와도 부착할 수 있는데, 이 아미노기는 적합한 반응 조건하에서 PEG 기에 부착될 수 있도록 충분히 반응성이다.Thus, GDNFR protein products according to the invention include polyethylene glycolated GDNFR proteins or variants, wherein the PEG group (s) are attached via an acyl or alkyl group. As noted above, such products may be mono- polyethylene glycolated or poly- polyethylene glycolated (eg containing 2-6, preferably 2-5 PEG groups). PEG groups are usually attached to a protein at the a or e amino group of an amino acid, but PEG groups can also be attached to any amino group attached to the protein, which amino group is sufficiently reactive to attach to the PEG group under suitable reaction conditions.

아실화 및 알킬화 접근법 둘 다에 사용되는 중합체 분자는 상기한 바와 같은 수용성 중합체 중에서 선택할 수 있다. 선택한 중합체는 단일 반응기, 이를테면 아실화를 위한 활성 에스테르나 알킬화를 위한 알데히드를 갖도록 변형되어야 하는데, 중합체화 정도는 본 발명에 제공된 바와 같이 조절될 수 있다. 전형적인 반응성 PEG 알데히드는 수용성인 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드 또는 그것의 모노 C1 - C10 알콕시 또는 아릴록시 유도체이다(미국 특허 번호 제 5,252,714 호 참조). 중합체는 분지되거나 비분지될 수 있다. 아실화 반응에 있어, 선택한 중합체(들)은 단을 반응 에스테르기를 가져야 한다. 본 환원성 알킬화에 있어, 선택한 중합체(들)은 단일 반응 알데히드기를 가져야한다. 일반적으로, 수용성 중합체는 자연발생적인 글리코실 잔기 중에서는 선택하지 않을 것인데, 왜냐하면 이 글리코실 잔기는 보통 포유동물 재조합 발현계에 의해 더 편리하도록 제조되기 때문이다. 중합체는 어떠한 분자량일 수 있으며, 분지되거나 비분지될 수 있다.The polymer molecules used in both the acylation and alkylation approaches can be selected from water soluble polymers as described above. The polymer selected should be modified to have a single reactor, such as an active ester for acylation or an aldehyde for alkylation, wherein the degree of polymerization can be controlled as provided herein. Typical reactive PEG aldehydes are water soluble polyethylene glycol propionaldehydes or mono C 1 -C 10 alkoxy or aryloxy derivatives thereof (see US Pat. No. 5,252,714). The polymer may be branched or unbranched. In the acylation reaction, the selected polymer (s) must have a reactive ester group. For the present reductive alkylation, the polymer (s) selected should have a single reaction aldehyde group. In general, water soluble polymers will not be selected among naturally occurring glycosyl residues because these glycosyl residues are usually prepared for convenience by the mammalian recombinant expression system. The polymer may be of any molecular weight and may be branched or unbranched.

본원에 사용하기 위한 전형적인 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 본원에 사용한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 다른 단백질, 이를테면 모노 - (C1 - C10) 알콜시 - 또는 알릴록시 - 폴리에틸렌 글리콜을 유도체화하는데 사용되어진 어떠한 형태의 PEG 도 포함하고자 한다.Typical water soluble polymers for use herein are polyethylene glycols. As used herein, polyethylene glycol is intended to include any form of PEG that has been used to derivatize other proteins, such as mono- (C1-C10) alcohol- or allyloxy-polyethylene glycol.

일반적으로, 화학 유도체화는 생물학적 활성 물질을 활성 중합체 분자와 반응시키는 데 사용되는 어떤 적합한 조건하에서도 수행될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질 산물을 제조하는 방법은 대개 다음 단계를 포함할 것이다 : (a) 단백질이 하나 또는 그 이상의 PEG 기에 부착되는 조건하에서 GDNFR 단백질 산물과 폴리에틸렌 글리콜(이를테면 반응 에스테르 또는 PEG 의 알데히드 유도체)을 반응시키는 단계, 및 (b) 반응산물(들)을 수득하는 단계. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적 반응 조건은 공지되어 있는 변수 및 원하는 결과를 기초로 하여 사항에 따라 결정될 것이다. 예를들어, PEG : 단백질의 비가 더 클수록 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 산물의 백분율은 더 크다.In general, chemical derivatization can be carried out under any suitable condition used to react the biologically active substance with the active polymer molecule. Methods of preparing polyethylene glycolated GDNFR protein products will usually include the following steps: (a) GDNFR protein products and polyethylene glycols (such as reactive esters or aldehyde derivatives of PEG) under conditions where the protein is attached to one or more PEG groups ), And (b) obtaining the reaction product (s). In general, the optimum reaction conditions for the acylation reaction will be determined on the basis of known parameters and the desired result. For example, the greater the ratio of PEG to protein, the greater the percentage of poly- polyethylene glycolated product.

모노 - 중합체/GDNFR 단백질 산물의 실질적으로 균질한 집단을 생산하기 위한 환원성 알킬화는 일반적으로 다음 단계를 포함할 것이다 : (a) 상기 GDNFR 단백질이나 변이체의 아미노 말단에서 a - 아미노기의 선택적 변형을 허용하기에 적합한 pH 에서 환원성 알킬화 조건하의 반응성 PEG 분자를 GDNFR 단백질이나 변이체와 반응시키는 단계 ; 및 (b) 반응 산물(들)을 수득하는 단계.Reductive alkylation to produce a substantially homogeneous population of mono-polymer / GDNFR protein products will generally include the following steps: (a) Allowing for selective modification of the a-amino group at the amino terminus of the GDNFR protein or variant. Reacting a reactive PEG molecule with GDNFR protein or variant at reductive alkylation conditions at a pH suitable for the present invention; And (b) obtaining the reaction product (s).

모노 - 중합체/GDNFR 단백질 산물의 실질적으로 균질한 집단에 있어, 환원성 알킬화 반응 조건이란 GDNFR 단백질이나 변이체의 N - 말단에 수용성 중합체 성분을 선택적으로 부착시킬 수 있는 조건을 말한다. 일반적으로 그와 같은 반응 조건은 리신 아미노기와 N - 말단에의 a - 아미노기 간의 pKa 차이를 제공한다(pKa 란 아미노기 중 50 % 는 양자수여되어 있고 50 % 는 그러하지 않은 pH 를 의미함). pH 는 또한 사용할 단백질에 대한 중합체의 비율에 영향을 미친다. 대개, pH 가 낮을 경우, 단백질에 대해 더 많은 과량의 중합체가 요구될 것이다(즉, N - 말단 a - 아미노기가 덜 반응성일 수록, 최적 조건을 획득하기 위해 더 많은 중합체가 필요하다). pH 가 높다면, 중합체 : 단백질 비율은 클 필요가 없다(즉, 더 많은 반응기가 이용될 수 있으므로, 더 적은 중합체 분자가 필요하다). 본 발명을 위한 pH 는 대개 3 - 9, 바람직하게는 3 - 6 범위 이내일 것이다.In a substantially homogeneous population of mono-polymer / GDNFR protein products, reductive alkylation conditions refer to conditions under which the water-soluble polymer component can be selectively attached to the N-terminus of the GDNFR protein or variant. In general, such reaction conditions give a pKa difference between the lysine amino group and the a-amino group at the N-terminus (pKa means pH at which 50% of the amino groups are protonated and 50% are not). pH also affects the ratio of polymer to protein to be used. Usually, when the pH is low, more excess polymer will be required for the protein (ie, the less reactive the N-terminal a-amino group, the more polymer is needed to obtain optimal conditions). If the pH is high, the polymer: protein ratio does not need to be large (ie fewer polymer molecules are needed since more reactors can be used). The pH for the present invention will usually be in the range 3-9, preferably 3-6.

다른 중요한 고려할 사항은 중합체의 분자량이다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 더 클수록 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자는 더 적다. 유사하게, 이들 변수를 최적화할 때 중합체의 분지도 고려해야 한다. 대개, 분자량이 더 클수록(또는 더 많이 분지된 것일 수록) 중합체 : 단백질 비율은 더 크다. 일반적으로, 본원에서 의도하는 폴리에틸렌 글리콜화 반응에 있어, 바람직한 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 이고, 특히 약 12 kDa 내지 약 25 kDa 이 바람직하다. GDNFR 단백질이나 변이체에 대한 수용성 중합체의 비율은 대개 1 : 1 내지 100 : 1 의 범위일 것이고, 바람직하게는 1 : 1 내지 20 : 1(폴리폴리에틸렌 글리콜화의 경우) 및 1 : 1 내지 5 : 1(모노폴리에틸렌 글리콜화의 경우) 일 것이다.Another important consideration is the molecular weight of the polymer. In general, the higher the molecular weight of the polymer, the fewer polymer molecules that can be attached to the protein. Similarly, the branching of the polymer should be taken into account when optimizing these parameters. Usually, the higher the molecular weight (or the more branched), the larger the polymer to protein ratio. In general, for the polyethylene glycolation reactions intended herein, preferred average molecular weights are from about 5 kDa to about 50 kDa, particularly from about 12 kDa to about 25 kDa. The ratio of water soluble polymer to GDNFR protein or variant will usually range from 1: 1 to 100: 1, preferably from 1: 1 to 20: 1 (for polyethylene glycolylation) and from 1: 1 to 5: 1 (For monopolyethylene glycolation).

상기 나타낸 조건을 사용하면, 환원성 알킬화에 의해, 아미노 말단에서 a - 아미노기를 갖는 어떠한 GDNFR 단백질이나 변이체에 대해 중합체의 선택적 부착이 제공될 것이며, 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체의 실질적으로 균질한 제제가 제공될 것이다. 여기에 사용한 용어 '모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체' 란 GDNFR 단백질이나 GDNFR 변이체 단백질 분자에 단일 중합체 분자가 부착되어 구성되는 조성물을 의미한다. 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체는 전형적으로 리신 아미노 곁기가 아니라 N - 말단에 위치한 중합체 분자를가질 것이다. 이 제제는 대개 90 % 이상이 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체일 것이고, 더 보통은 95 % 이상이 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체일 것이며, 나머지 관찰가능한 분자는 비반응된 것(즉, 중합체 성분이 결여되어 있는 단백질)이다. 또한 GDNFR 단백질 산물이 융합 단백질 또는 결합된 GDNFR 및 GDNF 분자를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜화된 분자 제제와 관련될 수 있다고 생각한다.Using the conditions indicated above, reductive alkylation will provide selective attachment of the polymer to any GDNFR protein or variant having an a-amino group at the amino terminus, and substantially homogeneous of the monopolymer / GDNFR protein (or variant) conjugate. One formulation will be provided. As used herein, the term 'monopolymer / GDNFR protein (or variant) conjugate' refers to a composition comprising a single polymer molecule attached to a GDNFR protein or a GDNFR variant protein molecule. Monopolymer / GDNFR protein (or variant) conjugates will typically have polymer molecules located at the N-terminus rather than the lysine amino side groups. This agent will usually be at least 90% monopolymer / GDNFR protein (or variant) conjugate, more usually at least 95% will be monopolymer / GDNFR protein (or variant) conjugate and the remaining observable molecules are unreacted. (Ie, a protein lacking a polymer component). It is also contemplated that GDNFR protein products may be associated with fusion proteins or polyethylene glycolated molecular preparations comprising bound GDNFR and GDNF molecules.

본 환원성 알킬화를 위한 환원제는 수성 용액에 안정해야 하며 바람직하게는 환원성 알킬화의 초기 과정에서 형성되는 쉬프염기만을 환원시킬 수 있어야 한다. 적합한 환원제는 소디움 보로하이드라이드, 소디움 시아노보로하이드라이드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 피리딘 보란 중에서 선택할 수 있다. 특히 적합한 환원제는 소디움 시아노보로하이드라이드이다. 그외 반응변수들, 이를테면 용매, 반응시간, 온도등 및 산물의 정제수단은 수용성 중합체와 단백질의 유도체화와 관련된 공개된 정보를 기초로 하여 사항에 따라 결정할 수 있다(본원에 인용된 공개문헌 참조).The reducing agent for the present reductive alkylation should be stable in the aqueous solution and preferably should be able to reduce only the Schiff bases formed in the initial process of reductive alkylation. Suitable reducing agents can be selected from sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, dimethylamine borane, trimethylamine borane and pyridine borane. Particularly suitable reducing agents are sodium cyanoborohydride. Other reaction variables, such as solvent, reaction time, temperature, and means of purification of the product, may be determined on the basis of published information relating to the derivatization of the water soluble polymer and protein (see the publications cited herein). .

C.GDNFR 단백질 산물 제약학적 조성물 C. GDNFR Protein Product Pharmaceutical Compositions

전형적으로 GDNFR 단백질 산물 제약학적 조성물은 투여 방식과의 적합성에 대해 선택한 하나 또는 그 이상의 제약학적으로, 생리적으로 용인가능한 제제형 물질을 치료학적 또는 예방적 유효량의 GDNFR 단백질 산물과 혼합한 것임을 포함한다. 적합한 제제형 물질로는 다음이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다 : 항산화제, 방부제, 착색제, 향료 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전물, 부피 조정제, 완충제, 수송 매개체, 희석제, 부형제 및/또는 제약학적 보조제. 예를들어, 적합한 매개체는 주사용 물, 생리식염수 또는 비경구 투여용 조성물에 보편적인 그외 물질을 보충하는 것이 가능한 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합한 식염수가 더 전형적인 매개체이다. 본원에 사용된 용어 '제약학적으로 용인가능한 담체' 또는 '생리적으로 용인가능한 담체' 란 제약학적 조성물로서 GDNFR 단백질 산물의 수송을 완수하거나 증가시키기에 적합한 제제형 물질(들)을 말한다.Typically GDNFR protein product pharmaceutical compositions comprise a mixture of one or more pharmaceutically, physiologically acceptable formulations selected for compatibility with the mode of administration, together with a therapeutically or prophylactically effective amount of a GDNFR protein product. Suitable formulation materials include, but are not limited to: antioxidants, preservatives, colorants, flavorings and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, volume control agents, buffers, transport media, diluents, excipients and / or Or pharmaceutical adjuvants. For example, a suitable vehicle may be artificial cerebrospinal fluid that is capable of replenishing water for injection, physiological saline or other material common to compositions for parenteral administration. Neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin are more typical mediators. As used herein, the term 'pharmaceutically acceptable carrier' or 'physiologically acceptable carrier' refers to a pharmaceutical formulation (s) suitable for completing or increasing the transport of a GDNFR protein product as a pharmaceutical composition.

매개체내 일차 용매는 사실상 수성이거나 아니면 비수성일 것이다. 또한, 매개체는 제제형의 pH, 삼투 몰농도, 점성, 정화도, 색체, 무균성, 안정성, 용해율 또는 냄새를 변화시키거나 유지시키기 위한 그외 제제형 물질을 포함할 수 있다. 유사하게, 매개체는 GDNFR 단백질 산물의 방출 속도를 변화시키거나 유지시키기 위한, 또는 혈액 - 뇌 장벽을 가로질러 GDNFR 단백질 산물이 흡수되거나 침투되는 것을 촉진시키기 위한 부가 제제형 물질을 포함할 수 있다.The primary solvent in the medium may be aqueous in nature or non-aqueous. In addition, the mediator may include other formulation materials to change or maintain the pH, osmolarity, viscosity, clarity, color, sterility, stability, dissolution rate or odor of the formulation. Similarly, the mediator may comprise additional formulation materials for altering or maintaining the rate of release of the GDNFR protein product, or for promoting the uptake or penetration of the GDNFR protein product across the blood-brain barrier.

일단 치료상 제약학적 조성물이 제형화되면, 용액, 현탁액, 겔, 유화액, 고체 또는 탈수시키거나 동결건조시킨 분말로서 무균 용기내에 저장할 수 있다. 그와 같은 제제형은 바로 사용할 수 있는 형태나 아니면 투여전 재구성할 필요가 있는 형태(예를들어, 동결건조된 형태)로 저장될 수 있다.Once the therapeutic pharmaceutical composition is formulated, it can be stored in a sterile container as a solution, suspension, gel, emulsion, solid or powder dehydrated or lyophilized. Such formulations may be stored in ready-to-use forms or in forms that need to be reconstituted prior to administration (eg, lyophilized).

본 분야의 숙련된 기술자들은 의도하는 투여경로 및 원하는 투여량에 좌우하여 최적의 제약학적 제제형을 결정할 것이다. 예를들어, 본원에서 그 명세서를 참고로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) 참조. 그와 같은 조성물은 본 단백질 및 유도체의 물리 상태, 안정성, 생체내 방출율 및 생체내 정화율에 영향을 미칠 수 있다.Those skilled in the art will determine the optimal pharmaceutical formulation form depending on the intended route of administration and the desired dosage. See, eg, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), herein incorporated by reference. Such compositions can affect the physical state, stability, in vivo release rate and in vivo purification rate of the present proteins and derivatives.

효과적인 투여형태, 이를테면 (1) 서방성(slow - release) 제제형, (2) 흡입용 합제 또는 (3) 경구적 활성 제제형도 예상한다. 또한 GDNFR 단백질 산물 제약학적 조성물은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 상기 비경구적으로 투여되는 치료학적 조성물은 전형적으로, 제약학적으로 용인가능한 매개체내의 GDNFR 단백질 산물을 포함하는 무 -발열물질의, 비경구적으로 용인가능한 수용액 형태이다. 하나의 바람직한 매개체는 생리 식염수이다. 또한 GDNFR 단백질 산물 제약학적 조성물은 폴리락트산, 폴리글리콜산등과 같은 중합체 화합물의 특정 제제, 또는 리포솜 내의 상기 특정 제제를 포함할 수 있다. 하이알루론산 또한 사용될 수 있는데, 이것은 순환시 지속기간을 촉진시키는 효과를 가질 것이다.Effective dosage forms are also envisaged, such as (1) slow-release formulations, (2) inhalation formulations, or (3) orally active formulations. GDNFR protein product pharmaceutical compositions can also be formulated for parenteral administration. The parenterally administered therapeutic composition is typically in the form of a parenterally acceptable aqueous solution of a pyrogen-free material comprising a GDNFR protein product in a pharmaceutically acceptable medium. One preferred medium is physiological saline. The GDNFR protein product pharmaceutical composition may also comprise specific formulations of polymer compounds, such as polylactic acid, polyglycolic acid, or the like, or such specific formulations in liposomes. Hyaluronic acid may also be used, which will have the effect of promoting duration in circulation.

비경구 주사용으로 특히 적합한 매개체는 GDNFR 단백질 산물을 무균의 등장액으로서 제형화시켜, 적당히 보존시키는 무균 증류수이다. 다른 제제는, 단백질을 서서히 또는 지속적으로 방출시킨 다음 저장 주사(depot injection)로서 수송할 수 있는, 주사가능한 중심체나 리포솜 같은 인자와 GDNFR 단백질 산물의 제제형을 포함할 수 있다. 그외 적합한 GDNFR 단백질 산물 도입 수단은 GDNFR 단백질 산물을 함유하는 이식가능한 약물 수송 장치를 포함한다.Particularly suitable mediators for parenteral injection are sterile distilled water in which the GDNFR protein product is formulated as a sterile isotonic solution and properly preserved. Other agents can include formulations of injectable centroids or liposomes and GDNFR protein products that can release the protein slowly or continuously and then transport it as a depot injection. Other suitable GDNFR protein product introduction means include implantable drug transport devices containing the GDNFR protein product.

본 발명의 제제는 본 기술분야에 공지되어 있는 바와 같은 다른 성분, 예를들어, 비경구적으로 용인가능한 방부제, 긴장제(tonicity agent), 혼합용매(cosolvent), 습윤제, 착화제, 완충제, 항균제, 항산화제 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를들어, 적합한 긴장 강화제로는 알칼리 금속 할로겐화물(바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨,소르비톨등이 포함된다. 적합한 방부제로는 다음이 포함되나 이것으로 국한되지는 않는다 : 벤잘코니움 클로라이드, 타이메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 등. 방부제로서 과산화수소가 사용될 수도 있다. 적합한 혼합용매의 예는 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜이다. 적합한 착화제의 예는 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타 - 사이클로 덱스트린 또는 히드록시프로필 - 베타 - 사이클로덱스트린이다. 적합한 계면활성제 또는 습윤제로는 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 80 같은 폴리소르베이트, 트로메타민, 렉틴, 콜레스테롤, 틸록사팔등이 포함된다. 완충제는 붕산염, 시트르산염, 인산염, 중탄산나트륨 또는 트리스 - HCl 같은 종래의 완충제일 수 있다.The formulations of the present invention may be formulated with other ingredients as are known in the art, for example, parenterally acceptable preservatives, tonicity agents, cosolvents, wetting agents, complexing agents, buffers, antibacterial agents, Antioxidants and surfactants. For example, suitable tension enhancers include alkali metal halides (preferably sodium chloride or potassium chloride), mannitol, sorbitol, and the like. Suitable preservatives include, but are not limited to: benzalconium chloride, tymerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidine, sorbic acid and the like. Hydrogen peroxide may also be used as preservative. Examples of suitable mixed solvents are glycerin, propylene glycol and polyethylene glycol. Examples of suitable complexing agents are caffeine, polyvinylpyrrolidone, beta-cyclodextrin or hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Suitable surfactants or wetting agents include sorbitan esters, polysorbates such as polysorbate 80, tromethamine, lectins, cholesterol, tyloxapal and the like. The buffer may be a conventional buffer such as borate, citrate, phosphate, sodium bicarbonate or tris-HCl.

제제형 성분은 투여 부위에 용인가능한 농도로 존재한다. 예를들어, 완충제는 상기 조성물을 생리학적 pH 에서나 약간 낮은 pH 에서, 전형적으로는 약 5 내지 약 8 범위의 pH 내에서 유지시키기 위해 사용한다.Formulation ingredients are present at acceptable concentrations at the site of administration. For example, buffers are used to maintain the composition at physiological pH or at slightly lower pH, typically in the range of about 5 to about 8.

제약학적 조성물은 흡입용으로 제형화될 수도 있다. 예를들어, GDNFR 단백질 산물은 흡입용 건조분말로서 제형화될 수 있다. 또한 GDNFR 단백질 산물 흡입용액은 연무 수송용 액화 추진제로 제형화될수도 있다. 또 다른 제제형에 있어, 용액이 연무될 수도 있다.The pharmaceutical composition may be formulated for inhalation. For example, the GDNFR protein product may be formulated as a dry powder for inhalation. GDNFR protein product inhalation solutions may also be formulated as liquefied propellants for haze transport. In another formulation, the solution may be fumed.

또한 GDNFR 단백질 산물을 함유하는 특정 제제형을 경구적으로 투여하고자 한다. 이런식으로 투여되는 GDNFR 단백질 산물은 정제 및 캡슐과 같은 고형의 투여형태를 조합하는 데 통상적으로 사용되는 담체와 함께, 또는 담체없이 제형화할 수 있다. 예를들어, 생체내 이용율은 최대화되고 예비 - 조직 붕괴(pre - systemic degradation)가 최소화될 때 위장관 지점에서 제제형의 활성 부분이 방출되도록 캡슐을 고안할 수 있다. GDNFR 단백질 산물의 흡수를 촉진시키기 위해 부가 제제형 물질을 포함시킬 수도 있다. 희석제, 향료, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕괴제 및 결합제 또한 사용될 수 있다.It is also intended to administer orally administer certain formulations containing GDNFR protein products. The GDNFR protein product administered in this way may be formulated with or without a carrier commonly used to combine solid dosage forms such as tablets and capsules. For example, the capsule can be designed to release the active portion of the formulation at the gastrointestinal tract when bioavailability is maximized and pre-systemic degradation is minimized. Additional formulations may also be included to facilitate the uptake of GDNFR protein products. Diluents, fragrances, low melting waxes, vegetable oils, lubricants, suspending agents, tablet disintegrating agents and binders may also be used.

다른 제제는 정제 제조에 적합한 비 - 독성 부형제와 혼합한 유효량의 GDNFR 단백질 산물과 관련될 것이다. 멸균수, 또는 다른 적합한 매개체에 정제를 용해함으로써, 용액을 단위 투여형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 다음이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다 : 탄산칼슘, 탄산 또는 중탄산 나트륨, 락토스 또는 인산칼슘과 같은 비활성 희석제 ; 녹말, 젤라틴 또는 아카시아와 같은 결합제 ; 또는 스테아르산 마그네슘, 염스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제.Other formulations will involve effective amounts of GDNFR protein products in admixture with non-toxic excipients suitable for tablet manufacture. By dissolving the tablets in sterile water, or other suitable media, the solutions can be prepared in unit dosage form. Suitable excipients include, but are not limited to: inert diluents such as calcium carbonate, carbonate or sodium bicarbonate, lactose or calcium phosphate; Binders such as starch, gelatin or acacia; Or lubricants such as magnesium stearate, salt stearic acid or talc.

GDNF 단백질 산물과 결합한 GDNFR 단백질 산물과 관련된 제제형을 포함하는, 부가 GDNFR 단백질 산물 제제형은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 분명할 것이다. 리포솜 담체, 생물 - 부식가능한 미량입자 또는 다공성 비드(bead) 및 저장주사와 같은, 다양한 그외 지속적인- 또는 조절된- 수송 수단을 제형화하는 기술 역시 본 분야의 숙련된 기술자들에게 알려져 있다. 예를들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 Supersaxo 등의 제약학적 조성물 수송을 위한 조절 방출 다공성 중합 미량입자에 관한 명세서 참조(국제 공개 번호 제 WO 93/15722 호 ; 국제 출원 번호 제 PCT/US93/00829 호).Additional GDNFR protein product formulations, including formulations associated with GDNFR protein products in combination with GDNF protein products, will be apparent to those skilled in the art. Techniques for formulating various other sustained- or controlled-transportation vehicles, such as liposome carriers, bio-corrosive microparticles or porous beads and storage injections, are also known to those skilled in the art. See, for example, the specification regarding controlled release porous polymeric microparticles for transporting pharmaceutical compositions such as Supersaxo et al., Incorporated herein by reference (International Publication No. WO 93/15722; International Application No. PCT / US93 / 00829) number).

D.GDNFR 단백질 산물 투여 D. GDNFR Protein Product Administration

GDNFR 단백질 산물은 피하, 근육내, 정맥내, 경폐적, 경피적, 초내 및 대뇌내 수송을 포함하는 다양한 경로를 통해 비경구적으로 투여할 수 있다. 또한, 혈액 - 뇌 장벽을 쉽게 통과하지 않는 단백질 인자를 직접 대뇌적으로 주입할 수 있거나, 반대로 단백질 인자를 상기 장벽을 가로질러 수송시킬 다른 요소와 공동으로 대뇌내 주입할 수 있다. 예를들어, GDNFR 단백질 산물을 대뇌실내로, 또는 뇌 또는 척수 지주막하강 내로 투여할 수 있다. 또한 GDNFR 단백질 산물을 뇌 실질내로 직접 대뇌내 투여할 수도 있다. GDNFR 단백질 산물을, 그것이혈액 - 뇌 장벽을 통과하도록 화학적으로 변형시키거나 포장한 형태로, 또는 상기 장벽을 가로질러 GDNFR 단백질 산물이 침투되는 것을 촉진시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 인자와 함께 대뇌외 투여할 수도 있다. 예를들어, NGF 와 모노클로날 항트란스페린 수용체 항체와의 결합체가 트란스페린 수용체와 결합함으로써 뇌에 수송된다고 알려져 있다.GDNFR protein products can be administered parenterally via a variety of routes including subcutaneous, intramuscular, intravenous, transpulmonary, transdermal, intra- and intra-cerebral transport. In addition, protein factors that do not readily cross the blood-brain barrier can be injected directly cerebrally, or conversely, protein factors can be injected intracranially with other elements that will transport across the barrier. For example, the GDNFR protein product may be administered intraventricularly or into the brain or spinal subarachnoid. GDNFR protein products may also be administered directly to the brain parenchyma. Administration of the GDNFR protein product in a form that has been chemically modified or packaged to cross the blood-brain barrier, or with one or more factors that may facilitate penetration of the GDNFR protein product across the barrier. You may. For example, it is known that a conjugate of NGF with a monoclonal antitransferrin receptor antibody is transported to the brain by binding to a transferrin receptor.

원하는 수준의 GDNFR 단백질 산물을 획득하기 위해, 매일 반복 주사하거나 그 보다 덜한 빈도로 주사하여 투여할 수 있거나, 일정 - 또는 프로그램화된 - 흐름 이식 펌프로 부터 연속적으로나 주기적으로 GDNFR 단백질 산물을 주입시킬 수 있다. 생물분해가능한 중합체 기질내에 끼워져 있는 신경영양성 인자를 함유하는 완용형 이식체 역시 GDNFR 단백질 산물을 수송할 수 있다. 투여 빈도는 제형화에 따른 GDNFR 단백질 산물의 약력학 및 투여 경로와 부위에 좌우할 것이다.,In order to obtain the desired level of GDNFR protein product, it can be administered by repeated daily injections or less frequently, or the GDNFR protein product can be injected continuously or periodically from a constant or programmed flow transplant pump. have. Glandular implants containing neurotrophic factors embedded in biodegradable polymeric substrates can also transport GDNFR protein products. The frequency of administration will depend on the pharmacodynamics of the GDNFR protein product according to the formulation and the route and site of administration.

투여 방식에도 불구하고, 체중, 체표면적 또는 기관의 크기에 따라 특이 투여량을 계산할 수 있다. 상기 언급한 각 제제형과 관련되는 치료를 위한 고유 투여량을 결정하는 데 필요한 더 세밀한 계산은 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에 의해 일상적으로 수행되는데, 이것은 그들이 일상적으로 수행하는 과업의 범위내이다. 고유 투여량은 고유 투여량 - 반응 데이터를 사용함으로써 확인할 수 있다.Despite the mode of administration, specific dosages can be calculated according to body weight, body surface area or organ size. More detailed calculations needed to determine the unique dosages for the treatments associated with each of the above-mentioned formulations are routinely performed by those of ordinary skill in the art, which are within the scope of the tasks they routinely perform. to be. Intrinsic doses can be ascertained by using intrinsic dose-response data.

특이 손상이나 증상을 치료하는 방법과 관련있는 최종 투여량 섭생은 주치의가 결정할 것이다. 일반적으로, 본 GDNFR 폴리펩티드의 유효량은 약의 작용을 변형시키는 여러 인자, 예를들어, 환자의 연령, 건강상태, 체중, 성별 및 규정식, 어떠한 감염의 심각성, 투여시간 및 그외 임상인자를 고려하여 결정될 것이다. 예를들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, pages 697 - 773 참조. GDNF 작용을 증강시키기 위해 GDNFR 을 사용한다면, GDNFR 투여량은 GDNF 요법에 필요한 투여량과 비슷하게 선택하며 ; GDNF 작용을 길항작용화하는 데 GDNFR 을 사용한다면, GDNFR 투여량은 GDNF 투여량의 여러 배일 것이다. 매일 1 회 또는 그 이상으로, 또는 그 보다 덜 빈번하게 투여할 수 있고, 본원에 기술한 바와 같은 다른 조성물과 함께 투여할 수도 있다. 본 발명이 본원에서 제시한 투여량으로 국한되지 않는다는 것을 주목해야 한다.The final dosage regimen that relates to the treatment of the specific injury or condition will be determined by the attending physician. In general, an effective amount of the present GDNFR polypeptide may take into account a number of factors that modify the action of the drug, such as the age, health status, weight, sex and diet of the patient, the severity of any infection, time of administration and other clinical factors. Will be decided. See, eg, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, pages 697-773, which is incorporated herein by reference. If GDNFR is used to enhance GDNF action, the GDNFR dose is chosen to be similar to the dose required for GDNF therapy; If GDNFR is used to antagonize GDNF action, the GDNFR dose will be several times the GDNF dose. It may be administered once or more daily, or less frequently, and may be administered with other compositions as described herein. It should be noted that the present invention is not limited to the dosages presented herein.

주어진 치료를 위해 GDNFR 단백질 산물을 연속적으로 투여하거나 지속적으로 수송하는 것이 이로울 것이다. 연속적인 투여는 주입 펌프와 같은 기계적 수단에 의해 수행할 수 있으나, 연속적이거나 거의 연속적인 다른 투여 방식을 실행할 수도 있을 것이다. 예를들어, 화학 유도체화나 피막형성이, 결정된 투여량 섭생에 기초하여, 예측가능한 양으로 혈류에 연속적으로 존재하는 효과를 갖는 단백질의 지속 방출 형태를 초래할 것이다. 따라서, GDNFR 단백질 산물은 그와 같은 연속적인 투여를 달성하도록 유도체화되거나 아니면 제형화된 단백질을 포함하다. GDNFR 단백질 산물의 지속적인 방출 형태는 원하는 유효 투여량이 매일 또는 매주 제공되도록 제형화될 것이다.It would be beneficial to continuously administer or continuously transport the GDNFR protein product for a given treatment. Continuous administration may be carried out by mechanical means such as an infusion pump, but other modes of administration may be carried out, continuous or near continuous. For example, chemical derivatization or encapsulation will result in a sustained release form of the protein that has the effect of being continuously present in the blood stream in predictable amounts based on the determined dosage regimen. Thus, GDNFR protein products include proteins derivatized or otherwise formulated to achieve such continuous administration. Sustained release forms of GDNFR protein products will be formulated so that the desired effective dosage is provided daily or weekly.

또한 GDNFR 단백질 산물은 GDNF 와의 결합 형태로 투여될 수 있다. 택일적으로, GDNFR 과 GDNF 단백질 산물을 개별적으로 투여할 수 있으며, 순서대로나 아니면 동시에 투여할 수도 있다.GDNFR protein products can also be administered in the form of binding to GDNF. Alternatively, GDNFR and GDNF protein products may be administered separately and may be administered sequentially or simultaneously.

신경 질환 치료시 본 발명의 GDNFR 단백질 산물은 단독으로, 또는 그외 다른 인자와 함께 사용될 수도 있다. 또한, 화학 조성물을 포함하는, 그외 인자나 그외 분자를 GDNFR 단백질 산물과 함께 사용할 수 있다. 파킨슨병 치료시, GDNFR 단백질 산물은 단독으로 또는 레보도파 투여와 함께 사용되는데, 여기서 GDNFR 은 내인성 GDNF 의 활성도를 높여 증가된 도파민 농도의 신경원 흡수를 증강시킨다.The GDNFR protein product of the invention may be used alone or in combination with other factors in the treatment of neurological diseases. In addition, other factors or other molecules, including chemical compositions, may be used with the GDNFR protein product. In the treatment of Parkinson's disease, GDNFR protein products are used alone or in combination with levodopa administration, where GDNFR enhances neuronal uptake of increased dopamine concentrations by increasing the activity of endogenous GDNF.

상기한 바와 같이, 부가 신경영양성 인자나 부가 신경원 영양 인자 역시 어떤 신경원 집단이나 어떤 유형의 손상 또는 질병 치료에 유용하거나 필수적일 것이다. GDNFR 또는 GDNFR 과 GDNF 와의 결합체와 함께 사용할 수 있는 다른 인자로는 다음이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다 : 인슐린, 인슐린 - 유사 성장인자, 표피 성장인자, 혈관작용 성장인자, 하수체 아데닐산 사이클레이스 활성 폴리펩티드, 인터페론 및 소마토스타틴 같은 마이토젠 ; 신경 성장인자, 뇌 유래의 신경영양성 인자, 뉴로트로핀 - 3, 뉴로트로핀 - 4/5, 뉴로트로핀 - 6 , 인슐린 - 유사 성장인자, 섬모 신경영양성 인자, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자 - 5, 형질전환 성장인자 - β, 코케인 - 암페타민 조절 전사(CART) 같은 신경영양성 인자 ; 및 표피 성장인자, 백혈병 억제인자, 인터루킨, 인터페론 및 군체 자극인자 같은 그외 성장인자 ; 뿐만 아니라 이들 인자와 기능상 동등한 분자 및 물질.As noted above, additional neurotrophic factors or additional neuronal nutritional factors may also be useful or necessary for treating any neuronal population or any type of injury or disease. Other factors that can be used with the GDNFR or the combination of GDNFR with GDNF include, but are not limited to: insulin, insulin-like growth factor, epidermal growth factor, vascular growth factor, pituitary adenylic acid cycle Mitogens such as active polypeptides, interferons and somatostatin; Nerve growth factor, neurotrophic factor derived from brain, neurotrophin-3, neurotropin-4 / 5, neurotropin-6, insulin-like growth factor, ciliated neurotrophic factor, acidic and basic fibroblast growth factor, Neurotrophic factors such as fibroblast growth factor-5, transforming growth factor-β, ***e-amphetamine-regulated transcription (CART); And other growth factors such as epidermal growth factor, leukemia inhibitory factor, interleukin, interferon and colony stimulating factor; As well as molecules and substances functionally equivalent to these factors.

GDNFR 단백질 산물 세포요법 및 유전자요법GDNFR Protein Product Cell Therapy and Gene Therapy

GDNFR 단백질 산물 세포요법, 예를들어 GDNFR 단백질 산물을 생산하는 세포의 대뇌내 이식 또한 의도한다. 이 실시형태는 생물학적 활성 형태의 GDNFR 단백질 산물을 합성하고 분비할 수 있는 환자의 세포내로 이식하는 것과 연관되어 있다. 그와 같은 GDNFR 단백질 산물 - 생산 세포는 GDNFR 단백질 산물의 천연 생산자인 세포일 수 있거나 원하는 GDNFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 GDNFR 단백질 산물을 생산하는 능력을 증가시킨 재조합 세포일 수 있다. 그와 같은 변형은 유전자 수송 뿐만 아니라 그것의 발현 및 분비 촉진에 적합한 벡터에 의해 수행될 수 있다. 외래종 GDNFR 단백질 산물을 투여한 환자에게서 잠재적인 면역학적 반응을 최소화하기 위해, GDNFR 단백질 산물을 생산하는 천연세포는 인체 기원이며 인체 GDNFR 단백질 산물을 생산하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, GDNFR 단백질 산물을 생산하는 재조합 세포도 인체 GDNFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 함유하는 발현벡터로 형질전환시킨 것이 바람직하다.GDNFR protein product cell therapy is also intended, for example intracellular cerebral transplantation of cells producing GDNFR protein product. This embodiment relates to implanting into a cell of a patient capable of synthesizing and secreting a biologically active form of GDNFR protein product. Such GDNFR protein products-producing cells can be cells that are natural producers of GDNFR protein products or can be recombinant cells that have increased the ability to produce GDNFR protein products by transforming with a gene encoding a desired GDNFR protein product. Such modifications can be carried out by vectors suitable for gene transport as well as for promoting their expression and secretion. In order to minimize potential immunological response in patients receiving the exotic GDNFR protein product, natural cells producing the GDNFR protein product are of human origin and preferably produce human GDNFR protein products. Similarly, recombinant cells producing GDNFR protein products are also preferably transformed with expression vectors containing genes encoding human GDNFR protein products.

주변 조직의 침윤을 피하기 위해 이식세포를 피막화시킬 수도 있다. 인체 또는 비 - 인체 동물 세포는, GDNFR 단백질 산물을 방출하지만, 환자의 면역계 또는 주변 조직으로 부터의 그외 유해인자에 의해 세포가 파괴되는 것을 방지하는 생체적합성이고 반투성인 중합성 봉입이나 막을 이루어 환자에게 이식될 수 있다. 택일적으로, 생체외 GDNFR 단백질 산물을 생산하도록 형질전환시킨 환자 자신의 세포를 상기와 같은 피막화없이 환자에게 직접 이식시킬 수 있을 것이다.Transplanted cells can also be encapsulated to avoid infiltration of surrounding tissue. Human or non-human animal cells, while releasing GDNFR protein products, form a biocompatible, semipermeable polymeric encapsulation or membrane that prevents the cell from being destroyed by other harmful factors from the patient's immune system or surrounding tissue. Can be implanted. Alternatively, the patient's own cells transformed to produce the ex vivo GDNFR protein product may be directly implanted into the patient without such encapsulation.

생존세포를 피막화시키는 기술은 본 분야에서 통상의 지식을 가진자들에게 잘 알려져 있으며, 피막화된 세포의 제조 및 환자내 이식은 과도한 실험없이 수행할 수 있다. 예를들어, Baetge 등은(본원에서 참고문헌으로 인용한 국제 공개 번호 제 WO 95/05452 호 ; 국제 출원 번호 제 PCT/US94/09299 호) 생물학적 활성분자를 효과적으로 수송하기 위한 유전자 공학에 의해 생산한 세포를 함유하는 생체적합성 캡슐에 관하여 기술하고 있다. 또한, 특별히 본원의 참고문헌으로 인용한 미국 특허 번호 제 4,892,538 호, 제 5,011,472 호 및 제 5,106,627 호 참조. 생존세포를 피막화시키는 시스템에 관하여는 특별히 본원의 참고문헌으로 인용한 Aebischer 등의 PCT 출원 번호 제 WO 91/10425 호에 기술되어 있다. 또한 특별히 본원의 참고문헌으로 인용한 Aebischer 등의 PCT 출원 번호 제 WO 91/10470 호, Winn 등의 Exper. Neurol., 113 : 322 - 329, 1991, Aebischer 등의 Exper. Neurol., 111 : 269 - 275, 1991 ; Tresco 등의 ASAIO, 38 : 17 - 23, 1992 참조.Techniques for encapsulating viable cells are well known to those of ordinary skill in the art, and the preparation and intra-patient transplantation of encapsulated cells can be performed without undue experimentation. For example, Baetge et al. (International Publication No. WO 95/05452, incorporated herein by reference; International Application No. PCT / US94 / 09299) produced by genetic engineering to effectively transport biologically active molecules. Biocompatible capsules containing cells are described. See also US Pat. Nos. 4,892,538, 5,011,472 and 5,106,627, which are specifically incorporated by reference herein. A system for encapsulating viable cells is described in PCT Application No. WO 91/10425 to Aebischer et al., Which is specifically incorporated by reference herein. See also PCT Application No. WO 91/10470 to Aebischer et al., Winn et al., Exper. Neurol., 113: 322-329, 1991, Exe. Neurol., 111: 269-275, 1991; See Tresco et al., ASAIO, 38: 17-23, 1992.

GDNFR 단백질 산물의 생체내 및 시험관내 유전자요법 수송 역시 예상된다. 시험관내 유전자요법은, 핵산 구성물이나 그외 적합한 수송 벡터를 국소 주사하여 표적세포내로 GDNFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 도입함으로써 수행할 수 있다(Hefti, J. Neurobiol., 25 : 1418 - 1435, 1994 참조). 예를들어, GDNFR 단백질 산물을 코딩하는 핵산서열을 표적세포내 수송을 위한 아데노 - 관련 바이러스 벡터에 함유시킬 수 있다(예를들어, 본원의 참고문헌으로 인용한 Johnson 의 국제 공개 번호 제 WO 95/34670 호 ; 국제 출원 번호 제 PCT/US95/07178 호 참조). 선택적인 바이러스 벡터로는 다음이 포함되나, 이것으로 국한되는 것은 아니다 : 레트로바이러스, 아데노바이러스, 단순포진 바이러스 및 파필로마바이러스 벡터. 또한 리포좀 - 매개 전이, 직접 주사(누드 DNA), 수용체 - 매개 전이(리간드 - DNA 복합체), 일렉트로포레이션, 인산칼슘 침전 또는 미량입자 충격(유전자 총)에 의해 생체내에서나 아니면 생체외에서 물리적 전이를 수행할 수 있다.In vivo and in vitro gene therapy transport of GDNFR protein products is also envisaged. In vitro gene therapy can be performed by topical injection of nucleic acid constructs or other suitable transport vectors to introduce genes encoding the GDNFR protein product into target cells (see Hefti, J. Neurobiol., 25: 1418-1435, 1994). ). For example, nucleic acid sequences encoding GDNFR protein products can be included in adeno-associated viral vectors for intracellular transport (see, eg, Johnson's International Publication No. WO 95 /, incorporated herein by reference). 34670; see International Application No. PCT / US95 / 07178). Optional viral vectors include, but are not limited to: retrovirus, adenovirus, herpes simplex virus, and papillomavirus vectors. In addition, physical transfer in vivo or ex vivo can be achieved by liposome-mediated transfer, direct injection (nude DNA), receptor-mediated transfer (ligand-DNA complex), electroporation, calcium phosphate precipitation or microparticle bombardment (gene gun). Can be done.

GDNFR 단백질 산물 유전자요법 또는 세포요법은 GDNFR 단백질 산물의 수송을 더 포함할 수 있다. 예를들어, GDNFR 단백질 산물과 GDNF 단백질 산물 둘 다를 발현하여 방출하도록 숙주세포를 변형시킬 수 있다. 택일적으로, GDNFR 및 GDNF 단백질 산물이 개별 세포에서 발현되어 그 세포로 부터 방출될 수도 있다. 그와 같은 세포는 개별적으로 환자내 도입시킬 수 있거나, 상기 캡슐화된 막과 같은 단일 이식장치에 함유시킬 수 있다.GDNFR protein product gene therapy or cell therapy may further comprise the transport of GDNFR protein products. For example, host cells can be modified to express and release both GDNFR protein products and GDNF protein products. Alternatively, GDNFR and GDNF protein products may be expressed in and released from individual cells. Such cells can be introduced into a patient individually or contained in a single implanter such as the encapsulated membrane.

본원에 기술한 GDNFR 단백질 산물 제제형은 인체에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 수의학적으로 사용될 수 있다는 것에 주목해야 하는데, 용어 '환자' 를 제한된 방식으로 파악해서는 안된다. 수의학적으로 적용할 경우, 투여량 범위는 상기한 바와 같이 결정할 수 있다.It should be noted that the GDNFR protein product formulations described herein can be applied to the human body as well as veterinary, and the term 'patient' should not be understood in a limited manner. For veterinary applications, the dosage range can be determined as described above.

실시예 1Example 1

고친화성 GDNF 결합 부위를 발현하는 세포의 확인Identification of Cells Expressing High Affinity GDNF Binding Sites

발현 클로닝은 유의 수준의 표적 전사를 포함할 것 같은 mRNA 원의 선택과 관계있다. 망막 광수용세포가 매우 낮은 농도에서 GDNF 와 반응한다는 것을 확인하였는데, 이것은 기능적인, 고친화성 수용체가 존재한다는 것을 암시한다. 랫의 광수용세포가 GDNF 에 대한 고친화성 수용체를 발현했다는 것을 확인하기 위해, [¹²⁵I]GDNF 결합 및 사진용유제 분석을 수행하였다.Expression cloning involves the selection of mRNA sources that are likely to include significant levels of target transcription. It was confirmed that retinal photoreceptors react with GDNF at very low concentrations, suggesting the presence of functional, high affinity receptors. To confirm that the photoreceptor cells in rats expressed high affinity receptors for GDNF, [ ¹²⁵ I] GDNF binding and photographic solvent assays were performed.

랫의 망막세포 배양Retinal Cell Culture in Rats

5 일 된 C57B1/6 마우스 새끼 또는 3 일 된 스프래그 - 돌레인 랫 새끼의 신경망막(미국 메사츄세츠 바 하버에 소재하는 잭슨 라보라토리스에서 구입)을 조심스럽게 제거하고 색소상피없이 절개하여, 1 mm²단편으로 잘라 얼음같이 찬 인산염 - 완충 식염수(PBS) 내에 두었다. 그런 다음 망막을 120 유닛 파파인과 2000 유닛 DNAase 를 함유하는 10 mL 의 Hank's 균형 염용액(HBSS)으로 옮겨 약 200 rpm 의 회전대 진탕기 상에서 37 ℃ 에서 20 분간 항온하였다. 불다듬질된 파스퇴르 피펫으로 상기 세포를 연마하여 분산시키고, 20 μm 니텍스 나일론 메시로 체질한 다음 200 × g 에서 5 분간 원심분리하였다. 결과적으로 생성된 세포펠릿을 1 % 오브알부민과 500 유닛 DNAase 를 함유하는 HBSS 내에 재현탁시키고 4 % 오브알부민 용액(HBSS 내) 상단에 층을 만든 다음 500 × g 에서 10 분간 원심분리하였다. 완전 배지(하기 참조)에 최종 펠릿을 재현탁하고, 약 15,000 세포/mL 로 맞춘 후, 예기한 바와 같이(Louis 등의, Journal Of Pharmacology And Experimental Therapeutics, 262, 1274 - 1283, 1992 참조) 폴리오르니틴과 라미닌으로 피복한 조직배양 평판내에 90 μl 분취량으로 접종하였다.Carefully remove the neural retina (purchased from Jackson Laboratories, Bar Harbor, Massachusetts) from a 5 day old C57B1 / 6 mouse pup or a 3 day old Sprague-Dolein rat pup and incision without pigmented epithelium, 1 mm Cut into ² fragments and placed in ice-cold phosphate-buffered saline (PBS). The retina was then transferred to 10 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) containing 120 units papain and 2000 units DNAase and incubated for 20 minutes at 37 ° C. on a swivel shaker at about 200 rpm. The cells were abraded and dispersed with a polished Pasteur pipette, sieved with 20 μm Nitex nylon mesh and centrifuged at 200 × g for 5 minutes. The resulting cell pellet was resuspended in HBSS containing 1% ovalbumin and 500 unit DNAase, layered on top of 4% ovalbumin solution (in HBSS), and centrifuged at 500 × g for 10 minutes. Resuspend the final pellet in complete medium (see below), adjust to about 15,000 cells / mL, and then, as expected (see Journal of Pharmacology And Experimental Therapeutics, 262, 1274-1283, 1992, Louis et al.). 90 μl aliquots were inoculated into tissue culture plates coated with chitin and laminin.

상기 완전 배지는 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)와 F12 배지의 1 : 1 혼합물로 이루어 진 것으로, 2.5 % 열 - 불활성화된 말 혈청(미국 유타 로간에 소재하는 하이클론에서 구입), B27 배지 보충물[미국 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 집코(GIBCO)에서 구입], D - 글루코스(최종농도 : 5 mg/mL), L - 글루타민(최종농도 : 2 mM), 20 mM HEPES, 소 인슐린 및 사람 트란스페린(최종농도 : 각각 2.5 및 0.1 mg/mL)을 보충하였다.The complete medium consists of a 1: 1 mixture of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) and F12 medium, 2.5% heat-inactivated horse serum (purchased from Hyclone, Logan, Utah), B27 Medium supplement (purchased from GIBCO, Grand Island, NY, USA), D-glucose (final concentration: 5 mg / mL), L-glutamine (final concentration: 2 mM), 20 mM HEPES, bovine insulin and Human transferrin (final concentration: 2.5 and 0.1 mg / mL, respectively) was supplemented.

광수용체의 면역세포화학적 확인Immunocytochemical Confirmation of Photoreceptors

어레스틴, 간상체 - 특이 항원에 면역염색함으로써 광수용체를 확인하였다. 광수용체 배양물을 PBS, pH 7.4 내 4 % 파라포름알데히드와 함께 실온에서 30 분간 고정시킨 다음 PBS 로 3 회 세척하였다.항체 침투를 증가시키기 위해 1 % 노니데트 P - 40 을 함유하는 수퍼블록 차단 완충액(미국 일리노이 록포드에 소재하는 피어스에서 구입)에 상기 고정 배양물을 배양하였다. 항 - 어레스틴 항체(어레스틴의 합성 펩티드 서열 : Val - Phe - Glu - Glu - Phe - Ala - Arg - Gln - Asn - Leu - Lys - Cys 에 대항하는 폴리클로날 토끼 항체)를 동일 완충액으로 1 : 2000 희석하여 가하고, 그 배양물을 회전 진탕기 상에서 37 ℃ 에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양물을 PBS 로 3 회 세척한 후 1 : 500 희석하여 염소 - 항 - 토끼 IgG(미국 캘리포니아 버링게임에 소재하는 벡터 라보라토리스로 부터 구입한 벡타스테인 키트)와 함께 37 ℃ 에서 1 시간 동안 배양하였다. PBS 로 3 회 세척한 후, 2 차 항체를 1 : 500 희석한 아비딘 - 비오틴 - 과산화효소 복합체로 표지하였다(37 ℃ 에서 45 분). PBS 로 3 회 더 세척한 후, 표지된 세포 배양물을, 0.04 % 3', 3' - 디아미노벤지딘 - (HCl)4, 0.06 % NiCl₂및 0.02 % 과산화수소를 함유하는 0.1 M 트리스 - HCl, pH 7.4 용액에 5 - 20 분간 반응시켰다. 어레스틴 - 면역반응성을 근거로, 배양물내 약 90 % 의 세포가 간상체 광수용체였다.Photoreceptors were identified by immunostaining to Arestin, rod-specific antigens. Photoreceptor cultures were fixed for 30 minutes at room temperature with 4% paraformaldehyde in PBS, pH 7.4 and then washed three times with PBS. Superblock blocking containing 1% nonidet P-40 to increase antibody penetration The fixation cultures were incubated in buffer (purchased from Pierce, Rockford, Ill.). Anti-arrestin antibody (synthetic peptide sequence of Arestin: polyclonal rabbit antibody against Val-Phe-Glu-Glu-Phe-Ala-Arg-Gln-Asn-Leu-Lys-Cys) in the same buffer : 2000 dilutions were added and the culture was incubated at 37 ° C. for 1 hour on a rotary shaker. The cultures were washed three times with PBS, diluted 1: 500, and incubated at 37 ° C. for 1 hour with goat-anti-rabbit IgG (Vectasterin kit, purchased from Vector Laboratories, Burlingame, CA). It was. After washing three times with PBS, the secondary antibody was labeled with an avidin-biotin-peroxidase complex diluted 1: 500 (45 min at 37 ° C). After three more washes with PBS, the labeled cell cultures were washed with 0.1 M Tris-HCl, containing 0.04% 3 ', 3'-diaminobenzidine- (HCl) 4, 0.06% NiCl ₂ and 0.02% hydrogen peroxide, The solution was reacted with a pH 7.4 solution for 5-20 minutes. Based on the Arrestin-immunoreactivity, about 90% of the cells in the culture were rod photoreceptors.

200 × 배율에서 밝은 - 빛 광학을 지닌 어레스틴 - 염색 배양물을 조사함으로써 광수용체 생존을 결정하였다. 어레스틴 - 양성 광수용체의 수는 6 mm - 웰의 총 표면적 중 약 20 % 를 나타내는데, 1 직경 1 × 6 mm 스트립으로 계수하였다. 생존가능한 광수용체는 보통 짧은엑손 - 유사 돌기를 갖는 규칙적인 모양의 세포체가 그 특성이다. 불규칙하고, 공포성 핵주위부세포체 또는 단편화된 축삭을 갖는 것과 같은 변성의 신호를 보이는 광수용체는 계산에서 제외시켰다(그러나, 변성 광수용체 중 대부분은 배양 기질로 부터 분리됨). 세포수는 세포/6 - mm 웰로 표시하였다.Photoreceptor survival was determined by examining the Arrestin-staining culture with bright-light optics at 200 × magnification. The number of Arestin-positive photoreceptors represents about 20% of the total surface area of 6 mm − wells, counted as 1 diameter 1 × 6 mm strips. Viable photoreceptors are usually characterized by regular shaped cell bodies with short exon-like processes. Photoreceptors that exhibit irregular, signaling signals of denaturation, such as having a plasmid nucleus or fragmented axons, were excluded from the calculation (but most of the denatured photoreceptors were isolated from the culture substrate). Cell numbers are expressed in cells / 6-mm wells.

광수용체에 대해 강화시킨 배양된 랫의 망막세포(10,000/6 - mm 웰)를 인체 재조합 GDNF(10 ng/mL 내지 1 pg/mL 범위로 10 배 계열희석)로 처리하였다. 6 일 후 배양물을 고정시키고 어레스틴, 간상체 광수용체 - 특이 항원에 대해 면역염색하였다. GDNF 로 처리하지 않은 배양물에서 광수용체의 수는 배양 6 일 후 초기 수의 약 25 % 에 도달하는 동안 꾸준히 감소하였다. 배양물을 GDNF 로 처리한 결과 배양 6 일 후 생존 가능한 어레스틴 - 양성 광수용체의 수가 약 2 배 더 많았다. GDNF 의 효과는 약 200 pg/mL 에서 최대였으며, ED₅₀은 약 30 pg/ml 이다. 광수용체의 생존을 촉진시키는 것 외에도 GDNF 부가는 그것의 축삭 - 유사 돌기가 신장되는 것을 자극함으로써 광수용체의 형태학적 발육에 대한 효과를 증명한다(GDNF 에서 광수용체의 평균 신경 돌기 길이 : 68 μm, 대조 배양물에서 27 ± 18 μm 와 비교).Cultured rat retinal cells (10,000 / 6-mm wells) enriched for photoreceptors were treated with human recombinant GDNF (10-fold series dilution in the range of 10 ng / mL to 1 pg / mL). After 6 days the cultures were fixed and immunostained for Arestine, rod photoreceptor-specific antigens. The number of photoreceptors in cultures not treated with GDNF steadily decreased while reaching about 25% of the initial number after 6 days of culture. Treatment of the cultures with GDNF resulted in about twice the number of viable Arrestin-positive photoreceptors after 6 days of culture. The effect of GDNF was maximum at about 200 pg / mL and ED ₅₀ was about 30 pg / ml. In addition to promoting photoreceptor survival, GDNF addition demonstrates the effect on morphological development of photoreceptors by stimulating their axon-like projections (average neuroid length of photoreceptors in GDNF: 68 μm, Compared to 27 ± 18 μm in control culture).

랫의 망막세포가 고친화성 GDNF 수용체를 발현한다는 것을 확인하기위해, [¹²⁵I]GDNF 결합 및 사진용유제 분석을 수행하였다. 실험 3 - 4 일 전에 생후 랫 광수용세포를 2800 세포/mm²밀도로 플라스틱 슬라이드 소형 플라스크(넝크)에 접종하였다. 이 세포를 얼음같이 찬 세척 완충액[25 mM N - 2 - 히드록시에틸피페라진 - N' - 2 - 에탄술폰산(HEPES)를 함유하는 둘베코의 변형된 이글배지(DMEM), pH 7.5]으로 1 회 세척하였다. 경쟁 결합을 위해, 500 nM 비표지 GDNF 의 존재 및 부재하 4 ℃ 에서 4 시간 동안 결합 완충액[25 mM HEPES, pH 7.5 를 함유하는 DMEM 및 2 mg/mL 의 소 혈청 알부민(BSA)] 내 다양한 농도의 [¹²⁵I]GDNF 와 함께 세포를 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고, 1 M NaOH 에 용균시켜 세포와 관련된 방사능을 감마 계수기로 측정하였다. 유의량의 [¹²⁵I]GDNF 는 낮은 리간드 농도(30 pM 만큼)에서도 광수용세포와 결합하였는데, 이 결합은 과량의 비표지 GDNF 의 존재에 의해 경쟁적으로 저해되었다.To confirm that retinal cells in rats express high affinity GDNF receptors, [ ¹²⁵ I] GDNF binding and photosolvent assays were performed. Postnatal rat photoreceptor cells were seeded in plastic slide small flasks (shanks) at a density of 2800 cells / mm ² . These cells were transferred to Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), pH 7.5 containing ice-cold wash buffer [25 mM N-2 hydroxyethylpiperazine-N'-2 ethanesulfonic acid (HEPES)]. Washed twice. For competitive binding, varying concentrations in binding buffer [DMEM containing 25 mM HEPES, pH 7.5 and 2 mg / mL bovine serum albumin (BSA)] for 4 hours at 4 ° C. with and without 500 nM unlabeled GDNF. The cells were incubated with [ ¹²⁵ I] GDNF. Cells were washed four times with ice-cold wash buffer and lysed in 1 M NaOH to determine cell-related radioactivity with a gamma counter. Significant amounts of [ ¹²⁵ I] GDNF bound photoreceptor cells even at low ligand concentrations (by 30 pM), which were competitively inhibited by the presence of excess unlabeled GDNF.

사진용유제 검출을 위해, 500 nM 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하 4 ℃ 에서 4 시간 동안 결합 완충액내 50 pM [¹²⁵I]GDNF 와 함께 세포를 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 6 회 세척하고, 2.5 % 글루타르알데히드로 이어서 50 % 및 70 % 에탄올로 고정시킨 후NTB - 2 사진용유제(미국 뉴욕 로체스터에 소재하는 이스트만 코닥에서 구입)에 잠깐 담그었다. 노출 5 일 후, 슬라이드를 현상하여 조사하였다. 사진용유제 분석은, [¹²⁵I]GDNF 가 광수용세포 중 일부와 결합한다는 것을 입증하였는데, 이것은 GDNF 에 대한 수용체가 존재한다는 것을 나타낸다. 그러나, 이 결합은 비표지 GDNF 의 부가에 의해 효과적으로 차단되었다.For photosolvent detection, cells were incubated with 50 pM [ ¹²⁵ I] GDNF in binding buffer for 4 hours at 4 ° C. with or without 500 nM unlabeled GDNF. Wash cells 6 times with ice cold wash buffer, fix with 2.5% glutaraldehyde followed by 50% and 70% ethanol, briefly in NTB-2 photosolvent (from Eastman Kodak, Rochester, NY). Dipped After 5 days of exposure, the slides were developed and examined. Photo emulsion analysis demonstrated that [ ¹²⁵ I] GDNF binds to some of the photoreceptor cells, indicating that there is a receptor for GDNF. However, this binding was effectively blocked by the addition of unlabeled GDNF.

실시예 2Example 2

광수용세포로 부터 GDNFR 의 발현 클로닝Cloning Expression of GDNFR from Photoreceptor Cells

실시예 1 에 기술한 바와 같이, 방사능표지 GDNF 와의 세포 표면 결합 및 매우 낮은 농도의 리간드에 반응하는 능력을 근거로 하여 GDNF 에 대한 고친화성 수용체의 가능한 원으로서 랫 광수용세포를 선택하였다. 수용체를 확인하기 위해, 하기 기술한 방법에 따라 포유동물 발현벡터(pSR 유도체, Takebe 등의 1998 상기문헌 참조) 및 배양된 생후 랫 광수용세포로 부터 분리한 mRNA 를 사용하여 약 50,000 독립 클론의 크기별로 선택한 cDNA 라이브러리를 구성하였다. 이 라이브러리를 약 1,500 내지 2,000 독립 클론의 풀로 나누고 확립된 발현 클로닝 접근법(Gearing 등의EMBO Journal, 8, 3667 - 3676, 1989 참조)을 이용하여 선별하였다. 라이브러리의 각 풀을 대표하는 플라스미드 DNA 를 제조하여 플라스틱 현미경 슬라이드 소형 플라스크(미국 일리노이 네이퍼빌에 소재하는 넝크에서 구입)에서 성장시킨 COS7 세포(입수처 : ATCC 제 CRL 1651 호)내로 형질감염시켰다.As described in Example 1, rat photoreceptor cells were selected as possible sources of high affinity receptors for GDNF based on their cell surface binding with radiolabeled GDNF and their ability to respond to very low concentrations of ligands. To identify the receptor, the size of about 50,000 independent clones was determined using mRNAs isolated from mammalian expression vectors (pSR derivatives, Takebe et al., 1998, supra) and cultured postnatal rat photoreceptor cells according to the methods described below. The cDNA library was selected. This library was divided into a pool of about 1,500-2,000 independent clones and selected using established expression cloning approaches (see EMBO Journal of Gearing et al., 8, 3667-3676, 1989). Plasmid DNA representing each pool of the library was prepared and transfected into COS7 cells (available from ATCC CRL 1651) grown in plastic microscope slide miniature flasks (available from Shank, Naperville, Ill.).

형질감염된 세포를 [¹²⁵I]GDNF 로 처리하고, 글루타르알데히드로 고정시켜 탈수시킨 후 자가방사기록을 위해 사진용유제에 잠깐 담그었다. 5 일 동안 노출시킨 다음 슬라이드를 현상하고, GDNF 에 대한 수용체의 세포 발현의 결과로서 세포 표면에 대한 [¹²⁵I]GDNF 의 결합을 나타내는 은가루로 덮힌 세포의 존재에 대해 조사하였다. [¹²⁵I]EGF 로 처리한 EGF 수용체 형질전환 세포를 양성 대조로서 사용하였다.Transfected cells were treated with [ ¹²⁵ I] GDNF, dehydrated by fixation with glutaraldehyde and briefly immersed in a photosolvent for autoradiography. After exposure for 5 days the slides were developed and examined for the presence of silver powdered cells showing binding of [ ¹²⁵ I] GDNF to the cell surface as a result of cell expression of the receptor for GDNF. EGF receptor transformed cells treated with [ ¹²⁵ I] EGF were used as positive controls.

이러한 방식으로 선별된 27 풀(F8 - 11) 중 하나가 형질감염에 따른 19 양성 세포를 나타냈다. 따라서, GDNFR 이 발현된 cDNA 클론을 함유하는 단일의 cDNA 라이브러리 풀이 확인되었다. 이 풀을, 상기 동일한 과정에 따라 재선별한 100 클론/풀의 더 작은 60 아풀(subpool)로 나누었다. 이들 풀 중 다섯 개가 양성으로 확인되었으며 이 다섯 풀 중 두 개를 더 세분하여 GDNF 결합 능력을 초래하는 단일 클론을 산출하였다. 단일 클론으로 부터의 플라스미드 DNA 를 COS7 세포내로 형질감염시킨 결과 세포 중 약 15 % 가 [¹²⁵I]GDNF 와 결합하였다. 이 결합은 과량의 비표지 GDNF 와 함께 경쟁시킴으로써 특이하게 저해되었다.One of the 27 pools (F8-11) selected in this way showed 19 positive cells following transfection. Thus, a single cDNA library pool containing cDN A clones expressing GDNFR was identified. This pool was divided into 60 subpools of 100 clones / pool, reselected according to the same procedure above. Five of these pools were identified as positive and two of these five pools were further subdivided to yield a single clone resulting in GDNF binding capacity. Plasmid DNA from a single clone was transfected into COS7 cells, resulting in about 15% of the cells bound to [ ¹²⁵ I] GDNF. This binding was specifically inhibited by competing with excess unlabeled GDNF.

발현 cDNA 라이브러리의 구성Construction of Expression cDNA Library

생후 3 - 7 일 된 랫으로 부터 랫 망막세포를 수확하고 라미닌 및 폴리오르니틴으로 피복된 배양 접시에 약 5700 세포/mm²밀도로 접종하였다. 배양 3 - 4 일 후 약 80 % 의 광수용세포를 함유하는 집단을 어림잡았다. 표준방법에 의해 이 배양물로 부터 총 RNA 를 제조하고, 폴리 A - 트랙트(tract) 키트(미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 프로메가에서 구입)를 사용하여 폴리 A + RNA 를 정제하였다. 집코 수퍼스크립트 초이스 시스템(미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 집코/비알엘에서 구입)을 이용하여 랫 광수용체 폴리 A + RNA 로 부터 cDNA 라이브러리를 구성하였다. 2 마이크로그람의 폴리 A + RNA 를 50 ng 의 무작위 6 량체와 혼합하고, 70 ℃ 에서 10 분간 가열한 다음 얼음으로 급히 냉각시켰다. 37 ℃ 에서 1 시간 동안 400 U 수퍼스크립트 Ⅱ RT 로 제 1 가닥 합성을 수행하였다. 동일 시험관에 dNTPs, 10 U 의E.coli DNA 리가제, 40 U 의 E.coli DNA 폴리머라제 I 및 2 U 의 E.coli RNase H 를 부가한 후 제 2 가닥 합성을 수행하였다. 16 ℃ 에서 2 시간 후, cDNA 말단을 16 ℃ 에서 5 분간 더 10 U 의 T4 폴리머라제로 처리하여 블런트화하였다. 이소프로판올 침전을 행한 다음, 10 μg 의 비인산화된 EcoRI 어댑터 올리고누클레오티드와 함께 밤새 결합시킴으로써 cDNA 에 EcoRI 클로닝 부위를 부가하였다.Rat retinal cells were harvested from 3-7 days old rats and seeded at a density of about 5700 cells / mm ² in a culture dish coated with laminin and polyornithine. After 3-4 days of culture, a population containing about 80% photoreceptor cells was estimated. Total RNA was prepared from this culture by standard methods and poly A + RNA was purified using a poly A-tract kit (purchased from Promega, Madison, Wisconsin). A cDNA library was constructed from rat photoreceptor poly A + RNA using a Zipco Superscript Choice system (purchased from Zipco / BIAL, Gaithersburg, MD). Two micrograms of poly A + RNA were mixed with 50 ng of random hexamer, heated at 70 ° C. for 10 minutes and then quenched with ice. First strand synthesis was performed with 400 U Superscript II RT at 37 ° C. for 1 hour. A second strand synthesis was performed after dNTPs, 10 U of E. coli DNA ligase, 40 U of E. coli DNA polymerase I and 2 U of E. coli RNase H were added to the same test tube. After 2 hours at 16 ° C, the cDNA ends were blunted by treatment with 10 U of T4 polymerase for 5 minutes at 16 ° C. EcoRI cloning sites were added to the cDNA by isopropanol precipitation followed by binding overnight with 10 μg of unphosphorylated EcoRI adapter oligonucleotides.

EcoRI 을 적응시킨 cDNA 를 인산화시킨 다음 세파크릴 S - 500 HR 크기 분별 칼럼에 가하였다. 부하 후, 100 μl 분취량의 TEN 완충액(10 mM 트리스 - HCl pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 25 mM NaCl)으로 칼럼을 세척하고, 30 μl 분획들을 모았다. 약 34 ng 의 고분자량 cDNA 를 함유한 분획 6 내지 8 을 풀로 만들고 침전시켰다. 회수된 EcoRI - 적응 cDNA 를 50 ng 의 EcoRI 절단 벡터 pBJ5(미국 스탠퍼드 유니버시티에서 입수)와 함께 밤새 결합시켰다. 약 15 ng 의 cDNA 를 함유하는 결합 혼합물의 분취량 각각을 일렉트로포레이션에 의해 감응세포(E.coli 균주 DH10B ; 미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 집코/비알엘에서 수득) 내로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 역가 측정한 다음 1500 콜로니/평판의 밀도로 27 Amp/LB 평판에 평판화하였다. 각 평판으로 부터 콜로니를 긁어내어 각각 1500 독립 클론으로 된 27 풀을 제조하기 위해 10 mL 의 루리아 육즙(LB)에 모았다. 각 풀로부터의 세포의 일부를 글리세롤을 첨가하여 냉동시키고 그 잔류물은 퀴아겐 팁 - 500 키트(미국 캘리포니아 채츠워스에 소재하는 퀴아겐 인코포레이티드에서 구입)를 사용하여 플라스미드 DNA 를 분리하는 데 사용하였다.EcoRI-adapted cDNA was phosphorylated and added to Sephacryl S-500 HR size fractionation column. After loading, the column was washed with 100 μl aliquots of TEN buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 25 mM NaCl) and 30 μl fractions collected. Fractions 6 to 8 containing about 34 ng of high molecular weight cDNA were pooled and precipitated. The recovered EcoRI-adapted cDNA was bound overnight with 50 ng of EcoRI cleavage vector pBJ5 (obtained from Stanford University, USA). Each aliquot of the binding mixture containing about 15 ng of cDNA was transformed by electroporation into sensitized cells (E. coli strain DH10B; obtained from Zipco / BIAL, Gaithersburg, MD, USA). Transformation mixtures were titrated and plated onto 27 Amp / LB plates at a density of 1500 colonies / plate. Colonies were scraped from each plate and collected in 10 mL of Luria gravy (LB) to produce 27 pools of 1500 independent clones each. A portion of the cells from each pool were frozen by the addition of glycerol and the residue was used to isolate plasmid DNA using the Qiagen Tip-500 kit (purchased from Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Used.

COS 세포 형질감염 및 사진용유제 분석COS cell transfection and photo emulsion analysis

형질감염 하루 전에 COS7 세포를 프로넥틴(ProNectin)[인산염 완충 식염수(PBS) 내 10 μg/mL]으로 피복된 플라스틱 슬라이드 소형 플라스크(넝크)에 접종하였다(220,000 세포/슬라이드). 형질감염시키기 위해, 2 μg 의 cDNA 를 함유하는 700 μl 의 옵티(Opti) MEMI(미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 집코/비알엘에서 구입)를 에펜도르프 시험관에서 35 μl 의 DEAE 덱스트란 용액(10 mg/mL, 미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마에서 구입)과 함께 서서히 혼합하였다. PBS 로 세포를 2 회 세척하고 5 % CO₂대기, 37 ℃ 에서 30 분간 형질감염 혼합물과 함께 배양하였다. 배양 후, 10 % 송아지 태아 혈청(FCS)과 80 nM 클로로퀸(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마에서 구입)을 함유하는 3 mL 의 DMEM 배지를 각 플라스크에 가하였다. 세포를 3.5 시간 동안 더 배양하고, 실온에서 2 분간 DMEM 내 10 % 디메틸술폭시드로 충격을 가한 다음 PBS 로 1 회 세척하고, 10 % FCS 를 함유하는 DMEM 에서 성장시켰다. 48 시간 후, 형질감염된 COS7 세포를 얼음같이 찬 세척 완충액(25 mM HEPES, pH 7.5 를 함유하는 DMEM)으로 1 회 세척하고 50 pM [¹²⁵I]GDNF 를 보충한 얼음같이 찬 결합 완충액(25 mM HEPES, pH 7.5 및 2 mg/mL BSA 를 함유하는 DMEM)에서 4 ℃ 에서 4 시간 동안 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 6 회 세척하고, 2.5 % 글루타르알데히드로 실온에서 5 분간 고정시키고, 이어서 50 % 및 70 % 에탄올로 탈수시킨 다음 NTB - 2 사진용유제(이스트만 코닥)에 잠깐 담그었다. 4 ℃ 의 어두운 곳에서 4 - 5 일 노출시킨 후 슬라이드를 현상하고 명시야 및 암시야 현미경 검사함으로써 선별하였다.One day before transfection, COS7 cells were inoculated (220,000 cells / slide) in a plastic slide small flask (shank) coated with ProNectin (10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS)). For transfection, 700 μl of Opti MEMI (Zipco / Bialel, Gaithersburg, Maryland, USA) containing 2 μg of cDNA was obtained in 35 μl of DEAE dextran solution (10 in Eppendorf). mg / mL, purchased from Sigma, St. Louis, MO.). Cells were washed twice with PBS and incubated with the transfection mixture for 30 minutes at 37 ° C. in 5% CO ₂ atmosphere. After incubation, 3 mL of DMEM medium containing 10% fetal calf serum (FCS) and 80 nM chloroquine (purchased from Sigma, St. Louis, MO) was added to each flask. The cells were further incubated for 3.5 hours, shocked with 10% dimethylsulfoxide in DMEM for 2 minutes at room temperature and then washed once with PBS and grown in DMEM containing 10% FCS. After 48 hours, transfected COS7 cells were washed once with ice cold wash buffer (DMEM containing 25 mM HEPES, pH 7.5) and ice cold binding buffer (25 mM HEPES supplemented with 50 pM [ ¹²⁵ I] GDNF). , DMEM containing pH 7.5 and 2 mg / mL BSA) at 4 ° C. for 4 hours. Wash cells 6 times with ice-cold wash buffer, fix for 2.5 minutes at 2.5% glutaraldehyde at room temperature, then dehydrate with 50% and 70% ethanol and briefly soak in NTB-2 photoemulsion (Eastman Kodak) I did. After 4-5 days of exposure in the dark at 4 ° C., slides were developed and selected by brightfield and darkfield microscopy.

양성 풀의 세분화Segmentation of Benign Pools

추정상 GDNF 수용체 클론을 함유한 단일 풀을 확인하였다. 이 풀로 부터의 클론을 100 콜로니/평판의 밀도로 60 평판에 평판화하였다. 각 평판으로부터 세포를 긁어내어 LB 에 모으고 37 ℃ 에서 4 - 5 시간 동안 성장시켰다. 상기한 바와 같이 각 풀로 부터 냉동 저장물과 DNA 제제를 만들어 각 100 독립 클론을 함유하는 60 아풀을 생성하였다. 이들 60 아풀 중 두 개가 상기 방법에 의해 양성으로서 확인되었으며, 단일 콜로니를 분리시키기 위해 이들 풀로부터의 클론을 저밀도로 평판화하였다. 두 아풀 각각에서 단일 클로니(384)를 뽑아 내어 96 - 웰평판내의 200 μl LB 에 6 시간 동안 성장시켰다. GDNFR 을 발현하는 단일 클론을 선택하기 위해, 4 개의 96 - 웰 평판을 16 열 및 24 행으로 이루어진 단일의 큰 매트릭스로 정렬시켰다. 각 열과 각 행의 웰로 부터의 세포를 결합시켜 총 40 혼합물을 산출하였다. 이 혼합물을 10 mL LB/Amp(100 μg/mL)에 밤새 성장시키고, 퀴아겐 팁 - 20 키트를 사용하여 DNA 를 제조하였다. 추정상 GDNF 수용체 클론을 분석했을 때, 3 열 혼합물과 3 행 혼합물이 양성 신호를 나타냈는데, 이 신호는 9 개의 잠재적으로 양성인 단일 클론을 암시한다. 잠재적으로 양성인 단일 클론 각각으로 부터 DNA 를 제조하여 EcoRI 과 PstI 으로 절단하였다. 9 개의 단일 클론 중 3 개 클론의 DNA 가 동일한 제한 유형을 나타낸 반면 그외 6 개 클론은 관계가 없었는데, 이것은 상기 3 개 클론이 GDNFR 을 함유하는 확실한 클론이라는 것을 시사하는 것이다.A single pool containing putative GDNF receptor clones was identified. Clones from this pool were plated on 60 plates at a density of 100 colonies / plate. Cells were scraped from each plate and collected in LB and grown at 37 ° C. for 4-5 hours. As described above, frozen stocks and DNA preparations were made from each pool to produce 60 pools containing each 100 independent clones. Two of these 60 sub pools were identified as positive by the above method, and clones from these pools were plated at low density to isolate single colonies. A single clone (384) was extracted from each of the two pools and grown for 6 hours in 200 μl LB in a 96-well plate. To select single clones expressing GDNFR, four 96-well plates were aligned in a single large matrix consisting of 16 columns and 24 rows. The cells from each column and each row of wells were combined to yield a total of 40 mixtures. This mixture was grown overnight at 10 mL LB / Amp (100 μg / mL) and DNA was prepared using the Qiagen Tip-20 kit. When putatively analyzing the GDNF receptor clones, the three-row and three-row mixtures showed a positive signal, suggesting nine potentially positive monoclones. DNA was produced from each of the potentially positive monoclonals and digested with EcoRI and PstI. While the DNA of three of the nine monoclones showed the same restriction type, the other six clones were irrelevant, suggesting that these three clones are robust clones containing GDNFR.

실시예 3Example 3

DNA 서열결정 및 서열 분석DNA sequencing and sequencing

양성의, 단일 클론으로 부터 DNA 를 제조하고 제조자의 지시에 따라 자동 ABI373A DNA 서열결정기(미국 캘리포니아 샌터 클래러에 소재하는 퍼킨/엘머 어플라이드 바이오시스템즈에서 구입)와 디데옥시 - 다이 - 종결기를사용하여 서열결정하였다. 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹 패키지(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)에 기술된 바와 같은 FASTA(Pearson and Lipman, Proceedings Of The National Academy Of Science U.S.A., 85, 2444 - 2448, 1988) 프로그램 알고리즘을 이용하여 GDNF 수용체 서열을 모든 유용한 공개 데이터베이스와 비교하였다.DNA was prepared from positive, monoclonal and sequenced using an automated ABI373A DNA sequencer (purchased from Perkin / Elmer Applied Biosystems, Santa Clara, Calif.) And dideoxy-die-terminator according to the manufacturer's instructions. Decided. Pearson and Lipman, Proceedings Of The National Academy Of Science USA, 85, as described in the University of Wisconsin Genetics Computer Group Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin. , 2444-2448, 1988) program algorithms were used to compare GDNF receptor sequences to all available public databases.

랫 GDNFR 의 서열 특성Sequence Properties of Rat GDNFR

상기 실시예 2 에 기술한 클론으로 부터의 플라스미드 DNA 를 제조하여 DNA 서열 분석하였다. 클로닝된 2138 bp 랫 cDNA 의 누클레오티드 서열 분석은 468 아미노산 잔기로 이루어진 번역 단백질을 암호하는 단일의 큰 오픈리딩 프레임을 나타냈다(도 3).Plasmid DNA from the clone described in Example 2 was prepared and DNA sequenced. Nucleotide sequence analysis of the cloned 2138 bp rat cDNA showed a single large open reading frame encoding a translational protein consisting of 468 amino acid residues (FIG. 3).

코딩(coding) 서열은, 잠재적인 폴리아데닐화 부위를 함유하고 있지 않는 301 bp 의 5'- 비번역 부위와 430 bp 의 3'- 비번역 부위에 의해 측면에 위치한다. 염기쌍 302 의 첫 번째 ATG 상류의 프레임내 정지코돈의 존재와 그 주변 누클레오티드 환경은 이 메티오닌 코돈이 아마 번역 개시 부위일 것이라는 것을 암시한다(Kozak, Nucleic AcidsResearch. 15, 8125 - 8148, 1987 참조).The coding sequence is flanked by a 301 bp 5'-untranslated site and a 430 bp 3'-untranslated site that does not contain a potential polyadenylation site. The presence of the stop codon in the frame upstream of the first ATG of base pair 302 and its surrounding nucleotide environment suggest that this methionine codon is probably the site of translation initiation (see Kozak, Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148, 1987).

랫 cDNA 클론의 3' 비번역 서열의 430 누클레오티드에서 폴리아데닐화 시그널은 발견되지 않았다. 이것은 놀라운 일이 아니다, 왜냐하면 노던 블롯 데이터가 약 3.6 kb 인 가장 짧은 mRNA 전사물을 나타냈기 때문이다.No polyadenylation signal was found at 430 nucleotides of the 3 'untranslated sequence of the rat cDNA clone. This is not surprising since the Northern blot data showed the shortest mRNA transcript of about 3.6 kb.

GDNFR 폴리펩티드 서열은 분비성 시그널 펩티드(von Heijne, Protein Sequences And Data Analysis. 1, 41 - 42, 1987 ; von Heijne, Nucleic Acids Research. 14, 4683 - 4690, 1986 참조)의 특성을 수반하는 약 19 잔기(메티오닌 - 1 내지 알라닌 - 19, 도 3)로 된 N - 말단 소수성 부위를 갖는다. 막통과 도메인으로서 역할을 할 수 있는 내부 소수성 도메인은 발견되지 않았다. 대신, 21 잔기(로이신 - 448 내지 세린 - 468, 도 3)로 된 카르복시 - 말단 소수성 부위가 존재하는 데 이것은 세포질막에 대한 수용체의 글리코실 - 포스파티딜이노시톨(GPI) 고정과 관련될 수 있다. 세 개의 잠재적 N - 결합 글리코실화 부위가 존재하는 것을 제외하고는 보존 서열이나 구조적 모티프는 발견되지 않았다. 이 단백질은 시스테인이 대단히 풍부하지만(468 아미노산 잔기 중 31 아미노산) 그 스페이싱(spacing)은 공지 수용체의 세포외 부분에서 발견되는 시스테인 - 풍부 도메인의 스페이싱과 공유되지 않는다.The GDNFR polypeptide sequence contains about 19 residues carrying the properties of a secretory signal peptide (von Heijne, Protein Sequences And Data Analysis. 1, 41-42, 1987; von Heijne, Nucleic Acids Research. 14, 4683-4690, 1986). N-terminal hydrophobic moiety consisting of (methionine-1 to alanine-19, FIG. 3). No internal hydrophobic domain was found that could act as a transmembrane domain. Instead, there is a carboxy-terminal hydrophobic site of 21 residues (leucine-448 to serine-468, Figure 3) which may be associated with glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) immobilization of the receptor for the cytoplasmic membrane. No conserved sequences or structural motifs were found except for the presence of three potential N-binding glycosylation sites. This protein is very rich in cysteine (31 amino acids in 468 amino acid residues) but its spacing is not shared with the spacing of cysteine-rich domains found in the extracellular portion of known receptors.

FASTA 를 이용하여 GDNFR 서열을 유용한 공개 데이터베이스의 서열과 비교하였다. 이 조사는 다른 공개 서열과 유의 상동성을 나타내지 않았다. 일단 랫 cDNA 클론이 수득되면, 방사능표지하여 하기 실시예 5 에 기술된 바와 같이 인체 뇌 흑질로 부터 제조한 cDNA 를 탐침시키는 데 사용한다.FASTA was used to compare the GDNFR sequences with those of useful public databases. This investigation did not show significant homology with other published sequences. Once rat cDNA clones are obtained, they are radiolabeled and used to probe cDNA prepared from human cerebral black matter as described in Example 5 below.

실시예 4Example 4

GDNFR 발현 세포에 대한 GDNF 결합GDNF binding to GDNFR expressing cells

Jing 등이 이미 기술한 검정 방법(Journal Of Cell Biology, 110, 283 - 294, 1990 참조)에 따라 결합 검정을 수행하였다. 이 검정은, GDNFR 을 발현하도록 형질감염시킨 랫 광수용세포, COS7 세포 또는 293T 세포(입수처 : ATCC 제 CRL - 1573 호)에 [¹²⁵I]GDNF 를 결합시키는 것과 관련된다. 293T 세포의 표면에 발현되는 재조합 GDNFR 은 GDNF 를 특이하게 결합시킬 수 있으며 랫 망막세포상의 GDNF 결합부위에서 발견된 친화성과 필적할 만한 친화성을 가진다.The binding assay was performed according to the assay method described by Jing et al. (See Journal Of Cell Biology, 110, 283-294, 1990). This assay involves binding [ ¹²⁵ I] GDNF to rat photoreceptor cells, COS7 cells or 293T cells (acquired by ATCC No. CRL-1573) transfected to express GDNFR. Recombinant GDNFR expressed on the surface of 293T cells can specifically bind GDNF and have comparable affinity to that found in GDNF binding sites on rat retinal cells.

상기 실시예 1 에 기술한 바와 같이 랫 광수용세포를 제조하고, 검정 2 - 3 일전, 폴리오르니틴 및 라미닌으로 예비 - 피복된 24 - 웰 코스타 조직 배양 평판에 5.7 × 10⁵세포/cm²의 밀도로 접종하였다. 검정 1 일 전에 COS7 세포를 2.5 × 10⁴세포/cm²의 밀도로 접종하고 DEAE - 덱스트란 - 클로로퀸 방법(Aruffo and Seed, Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A., 84, 8573 - 8577, 1987 참조)을 이용하여 10 - 20 μg 의 플라스미드 DNA 로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후에 각 접시로 부터 세포를 제거하고 24 - 웰 코스타 조직 배양 평판의 30 웰내로 재접종하여, 48 시간 동안 더 성장시켰다. 그런 다음 세포를 5 - 10 분간 얼음위에 둔 다음, 얼음같이 찬 세척 완충액으로 1 회 세척하고 4 ℃ 에서 4 시간 동안 비표지 GDNF 를 수반하거나 수반하지 않는 여러 농도의 [¹²⁵I]GDNF 를 함유하는 0.2 mL 의 결합 완충액과 함께 배양하였다. 0.5 mL 의 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고 0.5 mL 의 1 M NaOH 와 함께 용균시켰다. 용균물을 1470 위저드 오토메틱 감마 카운터로 계수하였다.Rat photoreceptor cells were prepared as described in Example 1 above, and 5.7 × 10 ⁵ cells / cm ² were prepared in a 24-well Costa tissue culture plate pre-coated with polyornithine and laminin 2-3 days prior to assay. Inoculated at density. COS7 cells were seeded at a density of 2.5 × 10 ⁴ cells / cm ² one day prior to assay and the DEAE-dextran-chloroquine method (see Aruffo and Seed, Proceedings Of The National Academy Of Sciences USA, 84, 8573-8577, 1987) Was transfected with 10-20 μg of plasmid DNA. Twenty four hours after transfection cells were removed from each dish and re-inoculated into 30 wells of a 24-well Costa tissue culture plate, further growing for 48 hours. The cells are then placed on ice for 5-10 minutes, then washed once with ice-cold wash buffer and 0.2 containing various concentrations of [ ¹²⁵ I] GDNF with or without unlabeled GDNF for 4 hours at 4 ° C. Incubated with mL binding buffer. The cells were washed four times with 0.5 mL of ice cold wash buffer and lysed with 0.5 mL of 1 M NaOH. The lysates were counted with a 1470 wizard automatic gamma counter.

어떤 결합 실험을 위해, 일시적으로 형질감염된 293T 세포를 사용하였다(293T 세포 형질감염에 대해서는 하기 참조). 형질감염 2 일후, 2 × 버신(versin)에 의해 접시로 부터 세포를 제거하였다. 세포를 펠릿화하고, 얼음같이 차가운 결합 완충액으로 1 회 세척한 후 3 × 10⁵세포/mL 의 밀도로 얼음같이 찬 결합 완충액에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 1.5 × 10⁵세포/시료를 함유하는 분취량으로 나누었다. 그런다음 세포를 펠릿화하고 500 nM 의 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하의 4 ℃ 에서 4 시간 동안 여러 농도의 [¹²⁵Ⅰ]GDNF 와 함께 서서히 교반하면서 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고 0.5 mL 세척 완충액에 재현탁하였다. 두 개의 0.2 mL 현탁액 분취량을 감마 계수기로 계수하여 세포와 결합한 [¹²⁵Ⅰ]GDNF 의 양을 측정하였다.For some binding experiments, transiently transfected 293T cells were used (see below for 293T cell transfection). Two days after transfection, cells were removed from the dish by 2 × versin. Cells were pelleted, washed once with ice cold binding buffer and resuspended in ice cold binding buffer at a density of 3 × 10 ⁵ cells / mL. The cell suspension was divided into aliquots containing 1.5 × 10 ⁵ cells / sample. Cells were then pelleted and incubated with gentle stirring with various concentrations of [ ¹²⁵ I] GDNF for 4 hours at 4 ° C. with or without 500 nM of unlabeled GDNF. Cells were washed four times with ice cold wash buffer and resuspended in 0.5 mL wash buffer. Two 0.2 mL suspension aliquots were counted with a gamma counter to determine the amount of [ ¹²⁵ I] GDNF bound to the cells.

모든 검정에 있어, 중복 시료 - 이 시료 중 하나는 500 nM 의 비표지 GDNF 를 함유함 - 를 사용함으로써 비특이 결합을 측정하였다. 비특이 결합 수준은 비표지 GDNF 의 부재하에서 측정한 특이 결합의 10 % 내지 20 % 까지 다양하였는데, 특이 결합에서 이것을 공제하였다. 이 검정은, 세포를 GDNFR cDNA 클론으로 형질감염시키지 않으면 GDNF 와 결합하지 않는다는 것을 입증했다.For all assays, nonspecific binding was measured by using duplicate samples, one of which contained 500 nM of unlabeled GDNF. Nonspecific binding levels varied from 10% to 20% of the specific binding measured in the absence of unlabeled GDNF, which was subtracted from the specific binding. This assay demonstrated that cells do not bind to GDNF unless they are transfected with GDNFR cDNA clones.

실시예 5Example 5

GDNFR mRNA 의 조직 분포Tissue Distribution of GDNFR mRNA

태아 마우스, 성숙한 마우스, 랫 및 인체 조직에서 GDNFR mRNA 의 발현 유형을 노던 블롯 분석으로 조사하였다. 제조자의 방법에 따라 랜덤 프라임드 디엔에이 라벨링 키트(Random Primed DNA Labeling Kit)(미국 인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임에서 구입)를 사용하여 클로닝된 랫 GDNFR cDNA 를 표지하였다. 랫, 마우스 및 인체 조직 RNA 블롯(미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크에서 구입)을 프로브와 혼성화하고 제조자의 지시에 따라 익스프레스하이브 키트(ExpressHyb Kit)(클론테크) 시약을 사용하여 세척하였다.Expression patterns of GDNFR mRNA in fetal mice, mature mice, rats, and human tissues were examined by Northern blot analysis. Cloned rat GDNFR cDNA was labeled using a Random Primed DNA Labeling Kit (purchased from Schöllinger Mannheim, Indianapolis, Indiana) according to the manufacturer's method. Rat, mouse and human tissue RNA blots (purchased from Clontech, Palo Alto, Calif.) Were hybridized with the probes and washed using ExpressHyb Kit (ClonTech) reagents according to the manufacturer's instructions.

성숙한 랫, 마우스 및 인체 조직으로 부터 제조한 조직 노던 블롯은 GDNFR mRNA 가 간, 뇌 및 신장에서 가장 높게 발현된다는 것을 나타냈다. 페에서도 높은 mRNA 발현이 검출되었고, 비장, 장, 고환 및 골격근에서는 그 보다 낮게 검출되거나 검출되지 않았다. 마우스 태아에서 분리한 mRNA 로 부터 제조한 블롯에 있어, 발현은 태아 7 일 째에 검출불가능했으나, E11 일 째에는 가시화되었고, E17 일 까지는 매우 높았다. GDNFR mRNA 는 성인 뇌의 몇몇 아부분에서 분리한 조직에서 비교적 동등한 수준으로 발현되었다. 성인 뇌에서의 GDNFR mRNA 발현은 어떤 특정 부위에 대한 특이성을 거의 나타내지 않았다.Tissue northern blots prepared from mature rats, mice and human tissues showed that GDNFR mRNA was highest expressed in liver, brain and kidney. High mRNA expression was also detected in the fetus and lower or no in the spleen, intestine, testis and skeletal muscle. In blots prepared from mRNA isolated from mouse fetuses, expression was undetectable on day 7 of fetus, but was visualized on day E11 and was very high by day E17. GDNFR mRNA was expressed at relatively equal levels in tissues isolated from several subparts of the adult brain. GDNFR mRNA expression in the adult brain showed little specificity for any particular site.

대부분 조직에서는 크기가 다른 두 개의 전사물이 존재했다. 마우스 및 인체 조직에서 8.5 및 4.4 kb 의 전사물이 발견된 반면에 랫 조직에서의 전사물은 8.5 및 3.6 kb 이었다. 더 큰 전사물과 더 작은 전사물의 상대량은 조직 유형에 따라 변하는데, 더 작은 전사물은 간 및 신장에서 우세하고 더 큰 전사물은 뇌에서 더 풍부하다. pBKRSV 벡터내 GDNFR cDNA 로 형질감염시킨 293T 세포에 대한 GDNF 의 결합은 스캐차드 분석으로 조사하였다. 두 종류의 결합부위가 검출되었는데, 하나는 낮은 피코몰 범위의 결합 친화성을 갖고 다른 하나는 약 500 pM 의 친화성을 갖는다.In most tissues, two transcripts of different sizes existed. Transcripts of 8.5 and 4.4 kb were found in mouse and human tissues, while transcripts in rat tissues were 8.5 and 3.6 kb. The relative amounts of larger transcripts and smaller transcripts vary according to tissue type, with smaller transcripts prevailing in the liver and kidneys and larger transcripts more abundant in the brain. Binding of GDNF to 293T cells transfected with GDNFR cDNA in the pBKRSV vector was examined by Scatchard analysis. Two kinds of binding sites were detected, one with a low picomolar binding affinity and the other with affinity of about 500 pM.

실시예 6Example 6

재조합 인체 GDNFRRecombinant Human Body GDNFR

프로브로서 실시예 1 의 랫 GDNFR cDNA 클론을 사용하여 박테리오파지 gt 10 내에 클로닝된 성인 흑질 cDNA 라이브러리(5' - 신장 + cDNA 라이브러리, 미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크에서 구입)를 선별하였다. 제조자의 지시에 따라 랜덤 프라임드 디엔에이 라벨링 키트(미국 인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임에서 구입)를 사용하여 [³²P] - dNTPs 로 상기 프로브를 표지하였다. 인체 흑질 cDNA 라이브러리로 부터 약 1.2 × 10⁶gt 10 파지를 15 cm 아가로스 평판에 평판화시키고 이중 니트로셀룰로스 필터에 복제하였다. 그런 다음 필터를 방사능 표지한 프로브와 혼성화함으로써 선별하였다. 필터를 55 ℃ 에서 3.5 시간 동안 200 mL 의 6 × SSC, 1 × 덴하르츠, 0.5 % SDS, 50 μg/mL 연어 정자 DNA 와 예비 혼성화하였다. 2 × 10⁸cpm 의 방사능표지 프로브를 첨가한 후에 18 시간 동안 계속 혼성화하였다. 0.5 × SSC, 0.1 % SDS 각각으로 55 ℃ 에서 30 분간 필터를 2 회 세척하고 증감 스크린(intensifying screen)과 함께 밤새 X - 선 필름에 노출시켰다.The rat GDNFR cDNA clone of Example 1 was used as a probe to screen adult adult cDNA libraries cloned into bacteriophage gt 10 (5′-renal + cDNA library, purchased from Clontech, Palo Alto, CA, USA). The probes were labeled with [ ³² P] -dNTPs using a random primed DNA labeling kit (purchased from Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, USA) according to the manufacturer's instructions. Approximately 1.2 × 10 ⁶ gt 10 phages from the human nitric cDNA library were plated onto 15 cm agarose plates and duplicated onto a double nitrocellulose filter. The filters were then selected by hybridizing with radiolabeled probes. The filter was prehybridized with 200 mL of 6 × SSC, 1 × Denharz, 0.5% SDS, 50 μg / mL salmon sperm DNA at 55 ° C. for 3.5 hours. Hybridization continued for 18 hours after the addition of 2 × 10 ⁸ cpm radiolabeled probe. The filter was washed twice for 30 minutes at 55 ° C. with 0.5 × SSC, 0.1% SDS, respectively, and exposed to X-ray film overnight with an intensifying screen.

플라크의 cDNA 삽입물이 인체 GDNFR cDNA 의 일부를 나타낸 다섯 개의 양성 플라크를 분리하였다. 도 3 에 도시한 랫의 핵산 서열과 비교하여(bp 0 내지 2140), 상기 5 개의 인체 GDNFR 클론이 다음의 서열을 함유한다는 것을 발견하였다 :Five positive plaques where the cDNA insert of the plaque showed part of the human GDNFR cDNA were isolated. Compared to the nucleic acid sequences of the rats shown in FIG. 3 (bp 0-2140), it was found that the five human GDNFR clones contained the following sequence:

도 5 에 도시한 바와 같이, 상기 서열을 정렬하고 비교하여 인체 GDNFR 에 대한 칸센서스 서열을 제공하였다. 인체 cDNA 서열에 의해 예상된 번역 산물은 465 아미노산으로 구성되며 랫 GDNFR 과 93 % 동일하다.As shown in FIG. 5, the sequences were aligned and compared to provide a Census sequence for human GDNFR. The translation product expected by the human cDNA sequence consists of 465 amino acids and is 93% identical to rat GDNFR.

전체 길이의 GDNFR 을 코딩하는 인체 cDNA 를 생성시키기 위해, 클론 21B 와 2 의 일부를 내부 BglⅡ 부위에서 서로 결합시켜 포유동물 발현 벡터 pBKRSV(미국 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 스트라타진에서 수득) 내에 서브클로닝하였다.To generate human cDNA encoding full-length GDNFR, portions of clones 21B and 2 were linked to each other at the internal BglII site and subcloned into mammalian expression vector pBKRSV (obtained from stratazine, La Jolla, Calif.). .

재조합 인체 GDNFR 발현 벡터는 포유동물 세포에서 발현되도록 제조할 수 있다. 상기한 바와 같이, 발현은 비 - 포유동물 세포, 이를테면 박테리아 세포에서도 일어날 수 있다. 본원에 기술한 핵산서열을, 상업적으로 유용한 인체 태아 신장 세포주, '293' 을 포함하는,포유동물 세포내 발현용으로 상업적으로 유용한 포유동물 벡터(예를들어, CEP4, 인비트로겐에서 수득) 내로 위치시킬 수 있다. 박테리아 세포내 발현을 위해서는 리더 서열(예를들어, 도 1 의 핵산 1 - 590)을 코딩하는 부분은 전형적으로 삭제될 것이다. 박테리아 발현을 위해 N - 말단에 부가 메티오닐을 부가시킬 수 있다. 또한, 천연 리더 서열을 다른 리더 서열로, 또는 발현을 용이하게 하기 위한 그외 절단용 서열로 치환할 수 있다.Recombinant human GDNFR expression vectors can be prepared for expression in mammalian cells. As noted above, expression can also occur in non-mammalian cells, such as bacterial cells. The nucleic acid sequences described herein are placed into a mammalian vector (eg, CEP4, obtained from Invitrogen) which is commercially useful for mammalian intracellular expression, including the commercially available human fetal kidney cell line, '293'. You can. For bacterial intracellular expression the portion encoding the leader sequence (eg, nucleic acids 1-590 of FIG. 1) will typically be deleted. Additional methionyl may be added at the N-terminus for bacterial expression. In addition, the native leader sequence may be substituted with another leader sequence or with other cleavage sequences to facilitate expression.

실시예 7Example 7

가용성 GDNFR 구성Configure Availability GDNFR

가용성 인체 GDNFR 단백질 산물을 제조하였다. 다음의 실례는 단지 카르복시 말단이 상이한 4 개의 다른 형태를 제공하는데, 도 2 에 나타낸 바와같이 번호매긴 잔기로 표시되어 있다. 두 개는, 소수성 꼬리의 바로 상류 및 마지막 시스테인 잔기의 하류로 서로 다른 지점이 절단된 가용성 형태이다. 다른 두 개는 동일한 절단형태지만 'FLAG' 서열, 즉 상업적 항체로 유용한 옥타펩티드(이스트만 코닥)가 부가되어 있다. FLAG 서열은 H2N - DYKDDDDK - COOH 이다.Soluble human GDNFR protein products were prepared. The following example merely provides four different forms with different carboxy termini, indicated by numbered residues as shown in FIG. The two are soluble forms with different points cleaved immediately upstream of the hydrophobic tail and downstream of the last cysteine residue. The other two have the same truncation but with the addition of the 'FLAG' sequence, octapeptide (Eastman Kodak), useful as a commercial antibody. The FLAG sequence is H2N-DYKDDDDK-COOH.

방법Way

인체 GDNFR 의 전체 코딩 부위를 거의 함유하는 람다 파지 클론 #21 을 EcoRI 으로 절단하여 cDNA 삽입물을 삭제하였다. 이 단편을 정제하고, 클론 21 - B - 3/pBKRSV 를 생성시키기 위해 EcoRI 절단 pBKRSV 벡터(미국 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 스트라타진에서 수득)내에 결합시켰다. 주형으로서 인체 GDNFR 클론 21 - B -3/pBKRSV 와 함께 하기에 나타낸 프라이머 1 및 2 를 PCR 반응에 사용하였다. PCR 조건은 94 ℃, 5 분, 이어서 94 ℃, 1 분으로 25 순환 ; 55 ℃, 1 분 ; 72 ℃, 2 분 및 최종 연장으로 72 ℃ 에서 5 분이었다. 이 PCR 반응으로, 프라이머 2 에 의해 제공되는 종결 코돈과 HindⅢ 제한 부위가 부가된 인체 GDNFR 클론의 누클레오티드 1265 - 1868 로 이루어진 단편이 생성되었다. 이 단편을 제한 효소 HindⅢ(프라이머 2 에 함유)와 BglⅡ(인체 GDNFR 의 위치 1304)로 절단하여, 그 결과 생성된 572 누클레오티드 단편을 겔 전기영동으로써 분리하였다. 이 단편은 이소로이신 - 255 내지 글리신 - 443 이 hGDNFR - 코딩부위를 함유했다. 프라이머 1 및 3 을 가지고 유사한 전략을 행한 결과 이소로이신 - 255 내지 프롤린 - 446 을 코딩하는 BglⅡ 및 HindⅢ 말단을 갖는 단편이 생성되었다. 프라이머 1 및 3 과 동일한 hGDNFR 부위를 코딩하지만, 플래그(Flag) 펩티드 코딩 서열(뉴 해븐에 소재하는 아이비아이/코닥에서 수득)이 부가된 단편이 생성되도록 프라이머 4 및 5 를 고안하였다. 플래그 펩티드 서열은 8 개의 아미노산(H2N - Asp - Tyr - Lys - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys - COOH)으로 구성되며 그 항체는 상업적으로 유용하다. 상기한 바와 동일한 주형과 함께 프라이머 1 및 4 또는 1 및 5 를 PCR 반응에 사용하고, 상기한 바와 같이 HindⅢ 및 BalⅡ 로 절단하였다. 이러한 과정에 의해, 이소로이신 - 255 내지 글리신 - 443 및 이소로이신 - 255 내지 프롤린 - 446 을 코딩하지만, 그 카르복시 말단에 플래그 펩티드가 부가된 단편이 생성되었다.Lambda phage clone # 21 containing almost the entire coding region of human GDNFR was digested with EcoRI to delete the cDNA insert. This fragment was purified and bound in an EcoRI cleaved pBKRSV vector (obtained from stratazine, La Jolla, Calif.) To generate clone 21 -B-3 / pBKRSV. As a template, primers 1 and 2 shown below together with human GDNFR clone 21-B-3 / pBKRSV were used for the PCR reaction. PCR conditions were 25 cycles of 94 degreeC and 5 minutes, and then 94 degreeC and 1 minute; 55 ° C., 1 minute; 5 minutes at 72 degreeC with 72 degreeC, 2 minutes, and final extension. This PCR reaction produced a fragment consisting of nucleotides 1265-1868 of the human GDNFR clone with the stop codon provided by primer 2 and a HindIII restriction site added. This fragment was digested with restriction enzymes HindIII (containing primer 2) and BglII (position 1304 of human GDNFR), and the resulting 572 nucleotide fragment was isolated by gel electrophoresis. This fragment contained an isoleucine -255 to glycine-443 hGDNFR-coding site. A similar strategy with primers 1 and 3 resulted in fragments with BglII and HindIII ends encoding isoleucine-255 to proline-446. Primers 4 and 5 were designed to generate fragments encoding the same hGDNFR sites as primers 1 and 3, but with the addition of the flag peptide coding sequence (obtained from Ivia / Kodak, New Haven). The flag peptide sequence consists of 8 amino acids (H2N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-COOH) and the antibody is commercially available. Primers 1 and 4 or 1 and 5 together with the same template as described above were used for the PCR reaction and cleaved into HindIII and BalII as described above. This procedure produced fragments encoding isoleucine-255 to glycine-443 and isoleucine-255 to proline-446 but with a flag peptide added to their carboxy terminus.

프라이머primer

상기한 바와 같이 생성된 네 단편 모두를 21B3/pBKRSV(미국 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 스트라타진에서 구입)내에 뒤로 옮겼다. 21B3/pBKRSV 클론을 BglⅡ 및 HindⅢ 로 절단하고, 송아지 장 알칼리 포스파타제(CIAP)로 처리하였다. 그 벡터와 BglⅡ 부위까지의 인체 GDNFR 코딩 부위를 함유하는 큰 단편을 겔 정제하고 겔로부터 추출하였다. 상기한 바와 같이 생성된 4 개의 BglⅡ/HindⅢ 단편 각각을 이 벡터에 결합시켜 결과적으로 다음의 pBKRSV 벡터내 구성물을 생성하였다 :All four fragments generated as described above were transferred back into 21B3 / pBKRSV (purchased from stratazine, La Jolla, Calif.). 21B3 / pBKRSV clones were digested with BglII and HindIII and treated with calf enteric alkaline phosphatase (CIAP). Large fragments containing the vector and human GDNFR coding sites up to the BglII site were gel purified and extracted from the gel. Each of the four BglII / HindIII fragments generated as described above was coupled to this vector, resulting in constructs in the following pBKRSV vectors:

모든 클론의 정확한 구성은 DNA 서열결정함으로써 확인하였다. 하기한 바와 같이 pBKRSV 폴리링커 서열에 존재하는 효소 부위를 사용하여 pBKRSV 클론의 삽입물을 다른 발현벡터로 옮겼다. 또한 가용성 GDNFRs(예를들어, sGDNFR/글리 및 sGDNFR/프로)도 일시적 발현을 위한 벡터 및 안정한 CHO 세포내 발현을 위한 pDSR - 2 내로 옮겼다.The exact configuration of all clones was confirmed by DNA sequencing. Inserts of pBKRSV clones were transferred to other expression vectors using enzyme sites present in the pBKRSV polylinker sequence as described below. Soluble GDNFRs (eg, sGDNFR / gly and sGDNFR / pro) were also transferred into vectors for transient expression and pDSR-2 for stable CHO intracellular expression.

pDSRα2 + PL 클론 :pDSRα2 + PL clone:

적당한 pBKRSV 클론을 XbaI 및 SalI 으로 절단한다. 삽입물을 상기와 동일한 효소로 절단한 pDSRα2 + PL 에 결합시키고 CIAP 로 처리한다. 이 구성물은 CHO 세포내에서 GDNFR 을 안정하게 발현시키는 데 사용될 수 있다.Suitable pBKRSV clones are cleaved with XbaI and SalI. The insert is bound to pDSRα2 + PL digested with the same enzyme as above and treated with CIAP. This construct can be used to stably express GDNFR in CHO cells.

pCEP4 클론 :pCEP4 clone:

적당한 pBKRSV 클론을 SpeI 및 XhoI 으로 절단한다. 이 삽입물을 NheI(SpeI 말단) 및 XhoI 으로 절단한 pCEP4(미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 인비트로겐에서 수득)와 결합시키고, CIAP 로 처리한다. 이 구성물은 GDNFR 의 일시적 발현을 위해 사용될 수 있다.Suitable pBKRSV clones are cleaved with SpeI and XhoI. This insert is combined with pCEP4 (obtained from Invitrogen, San Diego, Calif.) Cut with NheI (SpeI termini) and XhoI and treated with CIAP. This construct can be used for transient expression of GDNFR.

본원에서 참고문헌으로 인용한, 1990년 3 월 29 일자 제출한 공동 - 소유, 공동계류중인 미국 특허 출원 번호 제 501,904 호[또한 1990년 5월 18 일자 제출한 유럽 특허 출원 번호 제 90305433 호, 공개 번호 제 EP 398 753 호 및 제 WO 90/14363 호(1990) 참조]에 기술되어 있는 방법에서와 같이 다음의 여섯 개 DNA 단편[(a) - (f)]을 다단계 서브클로닝에 의해 최종적으로 결합시킴으로써 플라스미드 구성물 pDSR - 2 를 실질적으로 제조하되, GDNFR 유사체를 코딩하는 다양한 핵산서열이 사용될 수 있다는 것을 본 분야의 숙련된 기술자들은 이해할 것이다 :Co-owned, co-pending U.S. Patent Application No. 501,904, filed Mar. 29, 1990, also incorporated herein by reference (European Patent Application No. 90305433, published on May 18, 1990, Publication No. By finally binding the following six DNA fragments [(a)-(f)] by multistep subcloning as in the methods described in EP 398 753 and WO 90/14363 (1990). Those skilled in the art will understand that a variety of nucleic acid sequences encoding GDNFR analogs can be used to substantially prepare the plasmid construct pDSR-2:

(a) SV40 시발 프로모터/인핸서 및 복제 기원 ; PvuII(SV40 누클레오티드 개열지도 위치 # 272)와HindIII(개열지도 위치 # 5172) 부위 사이의 SV40 서열로 구성됨[DNA Tumor Viruses,J. Tooze, ed., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1981), pp. 801 - 804].(a) SV40 starting promoter / enhancer and origin of replication; Consists of the SV40 sequence between the PvuII (SV40 nucleotide cleavage map position # 272) and HindIII (cleavage map position # 5172) sites [ DNA Tumor Viruses, J. Tooze, ed., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1981 ), pp. 801-804].

(b) 인체 T - 세포 백혈병 바이러스 제 I 형(HTLV - I)의 긴 말단 반복체(LTR)의 'U5' 서열의 부분 및 'R1' 요소를 함유하는 267 bp 단편. 이 단편은 'R1' 의 정확한 5' 말단(위치 354) 내지 U5 서열내 Sau3A 부위(위치 620)에서 지도화된다[Seiki 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA80, 3618 - 3622(1983)].(b) a 267 bp fragment containing a portion of the 'U5' sequence of the long terminal repeat (LTR) of human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I) and a 'R1' element. This fragment is mapped at the exact 5 'end of R1 (position 354) to the Sau3A site (position 620) in the U5 sequence [Seiki et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 , 3618-3622 (1983).

(c) SV40 16S, 19S 접합 공여체/수용체 시그널로 구성된 단편(BamHI 링커에 의해 결합된 개열지도 위치 # 502 - 560 및 # 1410 - 1498).(c) Fragments consisting of the SV40 16S, 19S conjugated donor / receptor signals (open maps bound by BamHI linker positions # 502-560 and # 1410-1498).

(d) 2.4 kb 의 SalI 내지 BamHI 단편에 존재하는 전사 종결/폴리아데닐레이션 시그널. 이 단편은 소의 하수체 당단백질 호르몬 A - FSH(난포자극호르몬) 소단위체의 31 부분으로 부터 획득하였다. 마지막 엑손의 개시 지점에서의 BstXI 부위를 SalI 부위로 돌연변이시켰다. 이 단편의 3' 말단은 가장 가까운 하류 BamHI 부위로 연장되었다. 이 2.4 kb 단편을 pUC 벡터내로 서브클로닝한 다음 발현 벡터를 더 구성하기 위해 SalI 내지 SmaI 단편으로서 회수하였다.(d) Transcription termination / polyadenylation signal present in 2.4 kb of SalI to BamHI fragments. This fragment was obtained from 31 parts of bovine pituitary glycoprotein hormone A-FSH (follicular stimulating hormone) subunit. The BstXI site at the start of the last exon was mutated to the SalI site. The 3 'end of this fragment extended to the nearest downstream BamHI site. This 2.4 kb fragment was subcloned into the pUC vector and then recovered as SalI to SmaI fragments to further construct the expression vector.

(e) 내인성 마우스 DHFR 프로모터, cDNA 코딩서열, 및 2.5 kb 의 EcoRI 내지 HindIII 단편으로서 DHFR 전사 종결/폴리아데닐레이션 시그널 모두를 함유하는, 플라스미드 pMg1 로 부터 초기에 회수한 마우스 디하이드로 폴레이트 환원효소(DHFR) 미니유전자. 말단 제한 엔도누클레아제 부위 둘다, 즉 5' EcoRI 과 3' HindIII 는 발현벡터 구성시 파괴되었다. 상기 플라스미드 pMg1 은 Gasser 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA79, 6522 - 6526(1982) 문헌에 기술되어 있는 바와 같이, pDHFR11(1600 - 염기쌍의 마우스 DHFR cDNA 클론)의 190 - 염기쌍 TaqI 및 1.3 kb 의 TaqI - PstI 단편에 pDR34(마우스 DHFR 유전자의 5' 말단에서 수득한 인접 게놈 클론)의 1.0 - kb EcoRI - TaqI 5' 말단을 결합시킴으로써 구성하였다. 이러한 결합산물을 pBR322 의 EcoRI - PstI 긴 단편내로 삽입하고 결과적으로 생성된 테트라사이클린 - 내성 콜로니의 플라스미드 지도화로 TaqI 소단편의 방향을 결정하여, 센스 방향의 단편을 수반하는 클론을 pMg1 이라 명명하였다.(e) Mouse dehydrofolate reductase initially recovered from plasmid pMg1 containing both an endogenous mouse DHFR promoter, a cDNA coding sequence, and a DHFR transcription termination / polyadenylation signal as a 2.5 kb EcoRI to HindIII fragment ( DHFR) minigene. Both terminal restriction endonuclease sites, ie 5 'EcoRI and 3' HindIII, were destroyed when constructing the expression vector. The plasmid pMg1 was produced by Proc. Natl. Acad. Sci. As described in USA 79 , 6522-6526 (1982), pDR34 (5 ′ of the mouse DHFR gene) was added to the 190-base pair TaqI and 1.3 kb TaqI-PstI fragments of pDHFR11 (1600-base pair of mouse DHFR cDNA clones). Contiguous genomic clones obtained at the ends) were constructed by binding the 1.0-kb EcoRI-TaqI 5 'end. This binding product was inserted into the EcoRI-PstI long fragment of pBR322 and the resulting plasmid mapping of the resulting tetracycline-resistant colonies determined the orientation of the TaqI subfragment, so that the clones carrying the sense orientation fragment were named pMg1.

(f)HindII부위(개열지도 위치 # 2448)에서 EcoRI 부위(개열지도 위치 # 4362)까지 연장되며 암피실린 내성 표지유전자 및 E. coli 내 상기 플라스미드의 복제기원을 함유하는 '무독성' pBR322 서열.(f) A 'non-toxic' pBR322 sequence extending from the HindII site (cleavage map position # 2448) to the EcoRI site (cleavage map position # 4362) and containing the ampicillin resistant marker gene and the replication origin of the plasmid in E. coli.

다른 구성물은 pDSRα2 로서, 주요한 다음 세가지를 변형시킨 플라스미드 pCD(Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3 : 280 - 289, 1983 참조)의 유도체이다 : (ⅰ) SV40 폴리아데닐화 시그널을 소 난포자극호르몬의 α - 소단위체, α - bFSH(Goodwin 등의 Nucleic Acids Res. 11 : 6873 - 6882, 1983 참조)로 부터의 시그널과 대체하였다 ; (ⅱ) 마우스의 디하이드로 폴레이트 환원효소 미니유전자(Minigene)(Gasser 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. 79 : 6522 - 6526, 1982 참조)를 발현 카세트 하류에 삽입하여 형질전환체가 선택되고 증폭되도록 하였다 ; 및 (ⅲ) 인체 T - 세포 백혈병 바이러스 제 I 형(HTLV - I)의 긴 말단 반복체(LTR)의 'U5' 서열의 부분 및 'R - 요소' 를 함유하는 267 bp 단편을 클로닝하고 SV40 프로모터와 이미 기술되어 있는 바와 같은 접합 시그널(Takebe 등의 Mol. Cell Biol. 8 : 466 - 472, 1988 참조) 사이에 삽입하였다.Another construct, pDSRα2, is a derivative of the plasmid pCD (see Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3: 280-289, 1983) with three major modifications: Replaced with a signal from the α-subunit of α-bFSH (see Nucleic Acids Res. 11: 6873-6882, 1983 to Goodwin et al.); (Ii) Insert the mouse's dihydrofolate reductase Minigene (see Gasser et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6522-6526, 1982) downstream of the expression cassette to select and transform the transformant. To make it possible; And (iii) a 267 bp fragment containing a portion of the 'U5' sequence of the long terminal repeat (LTR) of human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I) and an 'R-element' and cloned into the SV40 promoter. And a conjugation signal as previously described (see Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8: 466-472, 1988).

상기 플라스미드 pCD 는 Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3 : 280 - 289, 1983 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 다음 세 단편을 T4 DNA 리가제와 함께 결합시킴으로써 제조할 수 있다 : pBR322 ori 및 Amp^R을 함유하는, pCDV1(미국 위스콘신 53205 매킨리 애비뉴 1037 에 소재하는 피 - 엘 바이오케미컬스 인코포레이티드에서 수득)으로 부터의 큰 HindII - BamHI 단편, SV40 시발 부위 프로모터 및 후기 부위 인트론을 함유하는, pL1(미국 위스콘신 53205 매킨리 애비뉴 1037 에 소재하는 피 - 엘 바이오케미컬스 인코포레이티드에서 수득)으로 부터의 HindII - PstI 단편, 및 전체 DHFR 단백질 코딩 서열(dhfr cDNA)을 함유하는 PstI - BglII 단편이나 아니면 전체 길이의 α - 글로빈 cDNA 분절을 함유하는 PstI - BamHI 단편.The plasmid pCD was Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3: 280-289, 1983 The following three fragments can be prepared by combining with T4 DNA ligase as described in the literature: pCDV1 (p. 53205 McKinley Avenue 1037, Wisconsin 53205, containing pBR322 ori and Amp ^R) PL1 (P-L Bio, 53205 McKinley Avenue 1037, Wisconsin 53205 McKinley Avenue 1037), containing a large HindII-BamHI fragment, SV40 starting site promoter and late site intron from P-L Biochemicals, Inc.). HindII-PstI fragments from Chemicals Incorporated) and PstI-BglII fragments containing full DHFR protein coding sequence (dhfr cDNA) or PstI-BamHI fragments containing full length α-globin cDNA segments snippet.

CHO 세포내 GDNFR 의 발현은 세포 표면에 대한 요오드화 GDNF 의 결합에 따라 변하였다. 상기한 바와 같이, 재조합적으로 발현된 가용성 GDNFR 단백질 산물은 GDNF 의 활성도나 세포 특이성을 강화시키는 데 사용될 수 있다. 또한 검출가능한 표지가 부착된 가용성 GDNFR 도 상기한 바와 같은 진단상 적용에 사용될 수 있다.The expression of GDNFR in CHO cells varied with the binding of iodide GDNF to the cell surface. As noted above, recombinantly expressed soluble GDNFR protein products can be used to enhance the activity or cell specificity of GDNF. Soluble GDNFRs with detectable labels can also be used for diagnostic applications as described above.

실시예 8Example 8

GDNF 와 GDNFR 의 화학 교차결합Chemical Crosslinking of GDNF and GDNFR

결합 특성 및 분자 특성을 연구하기 위해, 랫 cDNA 클론을 형질감염시킴으로써 293T 세포 표면에 GDNFR 을 일시적으로 발현시켰다. 293T 세포의 형질감염은 제조자의 지시에 따라 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 시스템(미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 집코/비알엘에서 구입)을 사용하여 수행하였다. 감염 2 일 후, 2 × 버신(versine) 처리하여 세포를 제거하고, 세척 완충액으로 1 회 세척한 다음 2 × 10⁶세포/mL 밀도로 세척 완충액에 재현탁하였다. [¹²⁵I]GDNF 결합전에 0.5 u/mL PI - PLC 와 함께 세포 2 중 세트를 37 ℃ 에서 30 분간 배양하였다. 얼음같이 찬 결합 완충액으로 이들 세포를 3 회 세척한 다음 4 ℃ 에서4 시간 동안 다른 세포와 함께 1 - 3 nM 의 [¹²⁵I]GDNF 와 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고, 1 mM 의 교차결합용 비스 수버레이트(Bis suberate)(BS3, 미국 일리노이 록포드에 소재하는 피어스에서 구입)를 보충한 세척 완충액에 재현탁하고 실온에서 30 분간 배양하였다. TBS 로 3 회 세척한 다음 이중 군 시료를 37 ℃ 에서 30 분간 0.5 u/mL 의 PI - PLC 로 처리하였다. 이들 세포를 펠릿화하고 상청액을 모았다. 그런다음 세척 완충액으로 세포를 세척하고 2 × SDS - PAGE 시료 완충액과 다른 모든 세포와 함께 용균시켰다. 세포 용균물과 수집한 상청액을 7.5 % SDS - PAGE 에서 분해시켰다.To study binding and molecular properties, GDNFR was transiently expressed on the surface of 293T cells by transfection of rat cDNA clones. Transfection of 293T cells was performed using a calcium phosphate transfection system (purchased from Zipco / BIAL, Gaithersburg, Maryland) according to the manufacturer's instructions. Two days after infection, cells were removed by 2 × versine treatment, washed once with wash buffer and then resuspended in wash buffer at a density of 2 × 10 ⁶ cells / mL. Two sets of cells were incubated at 37 ° C. for 30 minutes with 0.5 u / mL PI-PLC prior to [ ¹²⁵ I] GDNF binding. These cells were washed three times with ice-cold binding buffer and then incubated with 1-3 nM of [ ¹²⁵ I] GDNF with other cells at 4 ° C. for 4 hours. Wash cells four times with ice-cold wash buffer and resuspend in wash buffer supplemented with 1 mM cross-linked Bis suberate (BS3, purchased from Pierce, Rockford, Ill.) Incubated for 30 minutes at. After washing three times with TBS, the double group samples were treated with PI-PLC of 0.5 u / mL for 30 minutes at 37 ° C. These cells were pelleted and the supernatants collected. The cells were then washed with wash buffer and lysed with 2 × SDS-PAGE sample buffer and all other cells. Cell lysates and collected supernatants were digested in 7.5% SDS-PAGE.

세포 현탁액을 1.5 × 105 세포/시료를 함유하는 분취량으로 나누었다. 그런 다음 세포를 펠릿화하고 500 nM 의 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하 4 ℃ 에서 4 시간 동안 다양한 농도의 [¹²⁵I]GDNF 와 함께 서서히 교반하면서 배양하였다. 얼음같이 찬 세척완충액으로 세포를 4 회 세척하고 0.5 mL 세척완충액에 재현탁하였다. 현탁액의 0.2 mL 분취량 두 개를 감마 계수기로 계수하여 세포와 결합한 [¹²⁵I]GDNF 의 양을 측정하였다.The cell suspension was divided into aliquots containing 1.5 × 10 5 cells / sample. The cells were then pelleted and incubated with gentle stirring with various concentrations of [ ¹²⁵ I] GDNF for 4 hours at 4 ° C. with or without 500 nM of unlabeled GDNF. The cells were washed four times with ice cold wash buffer and resuspended in 0.5 mL wash buffer. Two 0.2 mL aliquots of the suspension were counted with a gamma counter to determine the amount of [ ¹²⁵ I] GDNF bound to the cells.

모조물로 형질감염시킨 293T 세포가 어떠한 GDNF 결합 능력도 나타내지 않았으나, GDNFR 로 형질감염시킨 세포는 피코몰 농도에서 조차 [¹²⁵I]GDNF 와 강하게 결합하였다. 이 결합은 500 nM 의 비표지 GDNF 에 의해 완전히 저해되었는데, 이것은 천연 GDNF 가 발현된 수용체에 대해 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다.293T cells transfected with the replica showed no GDNF binding capacity, but cells transfected with GDNFR bound strongly with [ ¹²⁵ I] GDNF even at picomolar concentrations. This binding was completely inhibited by 500 nM of unlabeled GDNF, meaning that native GDNF specifically binds to the expressed receptor.

293T 세포에 의해 발현된 GDNFR 을, 포스파티딜이노시톨 - 특이 포스포리파제 C(PI - PLC, 미국 인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임에서 구입)로 처리함으로써 세포로 부터 유리시킬 수 있다. 리간드 결합전 PI - PLC 로 형질감염된 세포를 처리하면 그 세포의 GDNF 결합 능력은 완전히 제거되었다. 부가적으로, 교차결합 후 형질감염 세포를 처리하면 다량의 교차결합 산물이 배지내로 유리되었다. 이 결과는 GDNFR 이 GPI 결합을 통해 세포막에 고정된다는 것을 강하게 암시한다.GDNFR expressed by 293T cells can be liberated from the cells by treatment with phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC, purchased from Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, USA). Treatment of cells transfected with PI-PLC prior to ligand binding completely eliminated their GDNF binding capacity. In addition, treatment of transfected cells after crosslinking liberated large amounts of crosslinked products into the medium. This result strongly suggests that GDNFR is anchored to the cell membrane through GPI binding.

교차결합 데이터는 GDNFR 의 분자량이 약 50 - 65 kD 이라는 것을 더 나타내는데, 이것은 저수준의 글리코실화가 존재함을 암시하는 것이다. 대부분의 교차결합종이 수용체의 단량체와 일치하는 분자량을 가질지라도, 대략 이량체에 대한 예상 분자량을 갖는 소수의 종이 발견되었다.Crosslinking data further indicates that the molecular weight of GDNFR is about 50-65 kD, suggesting the presence of low levels of glycosylation. Although most crosslinked species have a molecular weight consistent with the monomers of the receptor, few species have been found that have an expected molecular weight for approximately dimers.

실시예 9Example 9

GDNF 시그널링은 GDNFR 과 Ret 수용체 단백질 티로신 키나제의 복합체에 의해 매개됨GDNF signaling is mediated by a complex of GDNFR and the Ret receptor protein tyrosine kinase

서 론Introduction

표적화된 GDNF 유전자의 널 돌연변이(null mutation)을 지닌 마우스는 신경릉 세포로 부터 유도된 조직, 자율 신경계 및 삼차신경원과 척수 운동성 신경원에서 다양한 결손을 나타낸다. 신장 부재 및 소화관에서 소장 신경원의 완전한 결핍이 가장 심각한 결손이다. GDNF 녹아웃 마우스의 표현형은 c - ret 녹아웃 동물(Schuchardt 등의 1994)의 표현형과 놀랍도록 유사한데, 이것은 GDNF 의 시그널 트랜스덕션 경로와 c - ret 간의 가능한 결합을 암시하는 것이다.Mice with null mutations of the targeted GDNF gene exhibit various deficiencies in tissues derived from neural toll cells, autonomic nervous system and trigeminal and spinal motor neurons. The lack of kidney and complete deficiency of the small intestine neurons in the digestive tract are the most serious defects. The phenotype of GDNF knockout mice is surprisingly similar to that of c-ret knockout animals (Schuchardt et al. 1994), suggesting a possible binding between the signal transduction pathway of GDNF and c-ret.

유전자 전이 실험(Takahashi 등의 Cell. 42, 581 - 588,5 ; Takahashi and Cooper, Mol. Cell. Biol., 7, 1378 - 1385, 1987 참조)에서 분리한 종양유전자로 부터 유도된 프로브를 사용하여 원종양유전자 c - ret을 확인하였다. c - ret cDNA 를 서열분석한 결과 새로운 수용체 단백질 티로신 키나제(PTK)를 코딩하는 큰 오픈 리딩 프레임이 나타났다.수용체 PTKs 군은 세포내 키나제 도메인(van der Geer 등의 1994 참조) 내의 서열 상동성 및 세포외 도메인 구조에 따라 아군들로 분류되어 있다. Ret 의 독특한 세포외 도메인 구조는 어떠한 다른 공지된 수용체 PTK 아군 외부로 그것을 위치시키는 데, 그것은 시그널 펩티드, 캐드헤린 - 유사 모티프 및 시스테인 - 풍부 부위를 포함한다(van heyningen, Nature, 367, 319 - 320, 1994 ; Iwamoto 등의 1993 참조). 정상 소재의 혼성화 및 면역조직화학 분석은, 마우스 태아의 중추 발달 및 말초 신경계 및 배출계에 있어 ret mRNA 와 단백질이 고수준으로 발현한다는 것을 나타냈는데(Pachnis 등의 1993 ; Tsuzuki 등의 Oncogene, 10, 191 - 198, 1995 참조), 이것은 이들 조직의 발달면에서나 아니면 기능면에서 Ret 수용체의 역할을 암시하는 것이다. Ret 수용체의 기능상 리간드가 확인되지 않았으므로, Ret 시그널화의 분자기전을 더 이해하는 것은 제한된다. c - ret 유전자의 돌연변이는 가족성 수질 갑상선암(FMTC)과 다중 내분비성 종양형성 제 2A 형(MEN2A) 및 제 2B 형(MEN2B)의 암에 대한 유전소인과 관계가 있다. 이들 질병은 아마 Ret 키나제를 구조적으로 활성화시키는 돌연변이의 '기능 획득' 에 의해 유발될 것이다(Donis - Keller 등의 Hum. Molec. Genet. 2, 851 - 856, 1993 ; Hofstra 등의 nature. 367, 375 - 376, 1994 ; Mulligan 등의 Nature. 363, 458 - 460, 1993 ; Santoro 등의 Science. 267, 381 - 383, 1995 참조). 그것들은 신경릉에서 유도된 조직의 특이적 악성종양에 대한 소인을 제공하는데, 여기서ret 은 초기 발생시 정상적으로 발현된다. 다른 ret - 관련 유전자 질병인 히르쉬스프룽병(HSCR)은 하부 장관에 부교감 신경성 신경지배가 선천적으로 없다는 것이 그 특징이다(Edery 등의, Nature, 367, 378 - 438, 1994 ; Romeo 등의, 1994 참조). 가장 그럴듯한 HSCR 의 원인은 키나제 도메인이 결여되어 있는 절단된 Ret 단백질 생산을 초래하는 무의미 돌연변이 또는 Ret 키나제를 불활성화시키는 과오돌연변이이다. 상기한 바와 같이 마우스의 c - ret 원종양유전자의 표적 파괴로 인해 신장 무발육이나 심한 발육이상이 초래되며 소화관 전체에 소장 신경원이 결여된다(Schuchardt 등의 1994 참조). 이 표현형은 GDNF 녹아웃 마우스의 표현형과 아주 유사하다. 이와함께, 이들 데이터는 Ret 과 GDNF 둘 다 신장 및 소장 신경계 발생에 결정적인 시그널 트랜스덕션 경로와 관련되어 있음을 암시한다. 그러나 Ret 과 GDNF 가 어떻게 관련되어 있는지 알지 못했다.Using probes derived from oncogenes isolated from gene transfer experiments (see, Takahashi et al., Cell. 42, 581-588,5; Takahashi and Cooper, Mol. Cell. Biol., 7, 1378-1385, 1987). Proto-oncogene c-ret was identified. Sequencing of the c-ret cDNA revealed a large open reading frame encoding the new receptor protein tyrosine kinase (PTK). The receptor PTKs family is characterized by sequence homology and cellularity within the intracellular kinase domain (see van der Geer et al. 1994). It is classified into allies according to the domain structure. Ret's unique extracellular domain structure places it outside any other known receptor PTK subgroup, which includes signal peptides, Cadherin-like motifs and cysteine-rich sites (van heyningen, Nature, 367, 319-320). , 1994; Iwamoto et al. 1993). Hybridization and immunohistochemical analysis of normal material showed high levels of ret mRNA and protein expression in the central development and peripheral nervous system and excretory system of mouse embryos (Pachnis et al. 1993; Tsuzuki et al. Oncogene, 10, 191). 198, 1995), suggesting the role of Ret receptors in the development or function of these tissues. Since no functional ligands of the Ret receptor have been identified, further understanding of the molecular mechanism of Ret signaling is limited. Mutations in the c-ret gene are associated with genetic factors for familial medullary thyroid cancer (FMTC) and multiple endocrine tumorigenic type 2A (MEN2A) and type 2B (MEN2B) cancers. These diseases are probably caused by the 'gaining function' of mutations that structurally activate Ret kinases (Donis-Keller et al. Hum. Molec. Genet. 2, 851-856, 1993; nature of Hofstra et al. 367, 375 376, 1994; Mulligan et al. Nature. 363, 458-460, 1993; Santoro et al. Science 267, 381-383, 1995). They provide predisposition to specific malignancies of tissues derived from neural tombs, where ret is normally expressed at early development. Another ret-related genetic disease, Hirschsprung disease (HSCR), is characterized by the inherent lack of parasympathetic neurodominance in the lower intestine (Edery et al., Nature, 367, 378-438, 1994; Romeo et al., 1994 Reference). The most likely cause of HSCR is insignificant mutations or hypermutations that inactivate Ret kinases resulting in truncated Ret protein production lacking the kinase domain. As described above, target destruction of the c-ret proto-oncogene of mice results in no kidney development or severe dysplasia and lacks the small intestine neurons throughout the digestive tract (see Schuchardt et al. 1994). This phenotype is very similar to that of GDNF knockout mice. Together, these data suggest that both Ret and GDNF are associated with signal transduction pathways critical for renal and small intestinal nervous system development. However, I did not know how Ret and GDNF were related.

상기한 바와 같이, 발현 클로닝에 의한 GDNFR cDNA 의 분리 및 특정화는 형질전환된 인체 태아 신장 세포주 293T 에서 GDNFR 의 발현을 초래한다. 형질전환으로 인해 고(약 2 pM 의 kd) 및 저(약 200 pM 의 kd) 친화성 결합부위가 나타났다. 고친화성 결합부위는 GDNFR 단독의 동종이량체나 동종 - 올리고머, 또는 다른 분자를 수반한 GDNFR 의 이종이량체나 이종 - 올리고머로 구성될 수 있다. 상기한 바와 같이,GDNFR 은 세포질 도메인이 결여되어 있으므로 GDNF 시그널 트랜스덕션에서의 역할을 하기 위해 하나 또는 그 이상의 보조 분자를 통해 기능해야 한다. 이 연구에서, 우리는 GDNFR 의 존재하에서 GDNF 는 Ret 단백질 티로신 키나제 수용체와 결합하고, 신속히 Ret 자가인산화를 유도한다는 것을 확인하였다.As noted above, isolation and characterization of GDNFR cDNA by expression cloning results in expression of GDNFR in transformed human fetal kidney cell line 293T. The transformation resulted in high (about 2 pM kd) and low (about 200 pM kd) affinity binding sites. The high affinity binding site may consist of a homodimer or homo- oligomer of GDNFR alone, or a heterodimer or hetero- oligomer of GDNFR with other molecules. As mentioned above, GDNFR lacks the cytoplasmic domain and must function through one or more accessory molecules to play a role in GDNF signal transduction. In this study, we confirmed that in the presence of GDNFR, GDNF binds to the Ret protein tyrosine kinase receptor and rapidly induces Ret autophosphorylation.

결과result

GDNFR 을 발현하는 뉴로 - 2a 세포는 고친화성 GDNF 와 결합함Neuro-2a cells expressing GDNFR bind to high affinity GDNF

뉴로 - 2a(Neuro - 2a)는 고수준의 Ret 단백질(Ikeda 등의 Oncogene. 5, 1291 - 1296, 1990 ; Iwamoto 등의 Oncogene. 8, 1087 - 1091, 1993 ; Takahashi and Cooper, 1987 참조)을 내생적으로 발현하지만 노던 블롯에 의해 판단된 바와 같은 GDNFR mRNA 의 검출가능한 수준은 발현하지 않는 마우스 신경아세포종 세포주이다. GDNFR 의 존재하에서 Ret 이 GDNF 와 결합할 수 있는 경우를 결정하기 위해, GDNFR 을 발현하도록 유전자 조작한 뉴로 - 2a 세포에 [¹²⁵I]GDNF 가 결합하는지를 조사하는 연구를 수행하였다. 랫 GDNFR cDNA 를 함유하는 포유동물 발현벡터(이를테면 상기한 발현 플라스미드)로 뉴로 - 2a 세포를 형질감염시켰다. 이세 클론주, NGR - 16, NGR - 33 및 NGR - 38 을 [¹²⁵I]GDNF 와 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 배양이 끝나면 비결합 [¹²⁵I]GDNF 를 제거하고 상기 세포와 관련된 방사능량을 하기 실험 과정에 기술된 바와 같이 측정하였다. 세 클론주 모두 [¹²⁵I]GDNF 와 특이적으로 결합할 수 있으나 모(parantal)뉴로 - 2a 세포는 [¹²⁵I]GDNF 결합을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않았다(도 6). 500 nM 의 비표지 GDNF 를 첨가함으로써 결합은 효과적으로 경쟁될 수 있었다. 이 결과는 뉴로 - 2a 세포상에 발현되는 Ret 수용체가 GDNFR 의 부재시 GDNF 와 발현할 수 없다는 것을 입증하는데, 이것은 GDNFR 이 뉴로 - 2a 세포에서 인지가능 한 수준으로 발현되지 않는다는 이전의 관찰과 일치한다.Neuro-2a is endogenous to high levels of Ret proteins (Oncogene, Ikeda et al. 5, 1291-1296, 1990; Oncogene, Iwamoto et al. 8, 1087-1091, 1993; Takahashi and Cooper, 1987). Is a mouse neuroblastoma cell line that expresses but does not express detectable levels of GDNFR mRNA as judged by Northern blot. To determine when Ret can bind to GDNF in the presence of GDNFR, a study was conducted to investigate whether [ ¹²⁵ I] GDNF binds to neuro-2a cells genetically engineered to express GDNFR. Neuro-2a cells were transfected with a mammalian expression vector (such as the expression plasmid described above) containing rat GDNFR cDNA. Ise clones, NGR-16, NGR-33 and NGR-38, were tested for their ability to bind [ ¹²⁵ I] GDNF. At the end of the incubation, unbound [ ¹²⁵ I] GDNF was removed and the radioactivity associated with the cells was measured as described in the experimental procedure below. All three clones could specifically bind [ ¹²⁵ I] GDNF, but the parental neuron-2a cells showed little or no [ ¹²⁵ I] GDNF binding (FIG. 6). Binding could be effectively competed by adding 500 nM of unlabeled GDNF. This result demonstrates that Ret receptor expressed on neuro-2a cells cannot express with GDNF in the absence of GDNFR, which is consistent with previous observation that GDNFR is not expressed at appreciable levels in neuro-2a cells.

광범위한 범위의 리간드 농도(500 nM 의 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하에서 0.5 pM 내지 1 nM 의 [¹²⁵I]GDNF)에서 NGR - 38 세포에 대한 [¹²⁵I]GDNF 의 평형결합을 조사하였다(도 7A 참조). 배양후 비결합 [¹²⁵I]GDNF 를 제거하고 실험 과정에 기술된 바와 같이 상기 세포와 관련된 방사능을 측정하였다. 결과는 도 7 에 도시되어 있다 : (A) 비표지 GDNF 의 존재(개방원 및 개방사각형) 또는 부재(채워진 원 및 채워진사각형)시 NGR - 38 세포(원) 및 뉴로 - 2a 세포(사각형)에 대한 [¹²⁵I]GDNF 의 평형결합 ; (B) NGR - 38 세포에 대한 [¹²⁵I]GDNF 결합의 스케차드 분석. 뉴로 - 2a 세포는 1 nM [¹²⁵I]GDNF 의 농도에서 조차 거의 결합을 나타내지 않았는데, 이 결합은 과량의 비표지 GDNF 첨가에 의해 영향받지 않았다. NGR - 38 세포에 대한 결합은 도 7B 에 나타낸 바와 같이 스케차드 플롯으로 분석하였다. 두 종류의 결합부위가 검출되었는데, 하나는 k_d= 1.5 ± 0.5 pM 을 갖고 다른 하나는 k_d= 332 ± 53 pM 을 갖는다. 이들 해리 상수는 상기한 바와 같이, GDNFR 을 일시적으로 발현하는 293T 세포의 고친화성 및 저친화성 결합부위에 대해 수득한 값과 매우 유사하다.In a wide range of ligand concentration ^([125 I] GDNF of 0.5 pM to 1 nM in the presence or absence of 500 nM unlabeled GDNF) NGR - the equilibrium binding of ^[125 I] GDNF to 38 cells were examined (Fig. 7A Reference). After incubation unbound [ ¹²⁵ I] GDNF was removed and the radioactivity associated with the cells was measured as described in the course of the experiment. The results are shown in FIG. 7: (A) in NGR-38 cells (circles) and neuro-2a cells (squares) with or without unlabeled GDNF (open and open squares) or without (filled circles and filled squares). Equilibrium bond for [ ¹²⁵ I] GDNF; (B) Schachard analysis of [ ¹²⁵ I] GDNF binding to NGR-38 cells. Neuro-2a cells showed little binding even at concentrations of 1 nM [ ¹²⁵ I] GDNF, which was not affected by the addition of excess unlabeled GDNF. Binding to NGR-38 cells was analyzed by Scatchard plots as shown in FIG. 7B. Two types of binding sites were detected, one with k _d = 1.5 ± 0.5 pM and the other with k _d = 332 ± 53 pM. These dissociation constants are very similar to the values obtained for the high affinity and low affinity binding sites of 293T cells transiently expressing GDNFR, as described above.

GDNF 는 GDNFR 을 발현하는 뉴로 - 2a 세포에서 Ret 과 결합함GDNF binds to Ret in neuro-2a cells expressing GDNFR

Ret 수용체 PTK 가 GDNFR 을 발현하는 세포에서 GDNF 와 결합할 수 있는지 결정하기 위해, NGR - 38 및 모뉴로 - 2a 세포를 사용하여 교차결합실험을 행하였다. NGR - 38 세포를 [¹²⁵I]GDNF 와 배양하고, 교차결합제로 처리한 다음 SDS - PAGE 시료 완충액에 직접 용균시키거나 아니면 트리톤 X - 100 용균 완충액에 용균시켜서 실험 과정에 기술된 바와 같이항 - Ret 항체로 더 면역침전시켰다. 메르캅토에탄올의 부재(NR) 또는 존재(R)하에서 SDS - PAGE 로 면역침전물을 분석하였다. Ret 특이 항체로 용균물을 처리하고, 면역침전한 다음 환원조건하에서 SDS - PAGE 로 분석하였다(도 8 참조, 밴드는 다음과 같이 표시되어 있다 : ~ 75 kD, 채워진 삼각형 ; ~ 150 kD, 개방 삼각형 ; ~ 185 kD, 채워진 화살표 ; ~ 250 kD, 별표 ; ~ 400 kD, 개방 화살표). 가장 눈에 띄는 교차결합종이 ~ 75 kD 및 ~ 185 kD 임에도 불구하고, ~ 150 kD 과 ~ 250 kD 의 밴드는 덜 강하다. 가장 흐린 밴드인 ~ 400 kD 또한 가시화되었다(도 8, 레인 2). 면역침전물을 비환원 SDS - PAGE 로 분석했을 때, ~ 75 kD, ~ 150 및 ~ 185 kD 밴드는 환원 겔에서와 대략 동일한 세기로 존재했지만, ~ 400 kD 밴드의 양은 극적으로 증가했다(도 8, 레인 4). 또한 보다 더 뚜렷해진 것은 ~ 250 kD 밴드였다.To determine if the Ret receptor PTK can bind to GDNF in cells expressing GDNFR, cross-linking experiments were performed using NGR-38 and monuro-2a cells. NGR-38 cells were incubated with [ ¹²⁵ I] GDNF, treated with crosslinker and then directly lysed in SDS-PAGE sample buffer or lysed in Triton X-100 lysate buffer as described in the experimental procedures. Further immunoprecipitation with antibody. Immunoprecipitates were analyzed by SDS-PAGE in the absence (NR) or presence (R) of mercaptoethanol. The lysates were treated with Ret specific antibodies, immunoprecipitated and analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions (see FIG. 8, bands are indicated as follows: ~ 75 kD, filled triangles; ~ 150 kD, open triangles). ; ~ 185 kD, filled arrow; ~ 250 kD, asterisk; ~ 400 kD, open arrow). Although the most prominent crosslinked species are ˜75 kD and 185 kD, the bands of ˜150 kD and ˜250 kD are less intense. The hazy band, ˜400 kD, was also visualized (FIG. 8, lane 2). When immunoprecipitates were analyzed by non-reducing SDS-PAGE, ˜75 kD, ˜150 and 185 kD bands were present at approximately the same intensity as in reducing gels, but the amount of ˜400 kD bands increased dramatically (FIG. 8, Lane 4). Also more pronounced was the ~ 250 kD band.

환원조건과 비환원조건 둘 다에서, NGR - 38 대신에 모(parental) 뉴로 - 2a 세포를 사용했을 때 매우 환원된 세기를 갖는 밴드가 아니라 비슷한 분자량을 갖는 밴드가 관찰되었다(도 8, 레인 1 및 3). Ret 을 발현하지 않는 293T 세포에서 교차결합에 의해 동일한 분자량을 갖는 종이 생산되므로, ~ 75 kD 및 ~ 150 kD 종이 GDNF 와 GDNFR 의 교차결합 복합체를 나타낼 것 같다. 게다가, Ret 의 분자량이 170 kD 이므로, Ret 을 포함하는 어떠한 복합체도 최소한 이 크기일 것이다.In both reducing and non-reducing conditions, when using parental neuro-2a cells instead of NGR-38, bands with similar molecular weights were observed rather than bands with very reduced intensity (FIG. 8, lane 1). And 3). Since species with the same molecular weight are produced by crosslinking in 293T cells that do not express Ret, ˜75 kD and ˜150 kD species are likely to exhibit cross-linked complexes of GDNF and GDNFR. In addition, since the molecular weight of Ret is 170 kD, any complex comprising Ret will be at least this size.

이들 복합체가 항 - Ret 항체에 의해 면역침전된다는 사실은 그 복합체가 겔 분석 조건하에서 붕괴된 GDNF/GDNFR 복합체와 Ret 간의 결합산물이라는 것을 나타내는 것이다. 아마 ~ 185 kD 의 폭 넓은 밴드는, 일부 이량체 GDNF 가 포함될 수 있을지라도 단량체 재조합 GDNF 한 분자(15 kD)와 교차결합된 Ret 한 분자(170 kD)로 구성될 것이다. 비표지 GDNF 를 NGR - 38 세포와 교차결합시키고 그 산물을 항 - Ret 항체를 수반하는 웨스턴 블롯으로 조사했을 때 동일한 분자량을 갖는 밴드가 관찰된 개별 실험에 의해 상기 종에 Ret 가 존재한다는 것을 확인하였다(데이터는 나타내지 않았음).The fact that these complexes are immunoprecipitated by anti-Ret antibodies indicates that the complexes are the binding product between Ret and the GDNF / GDNFR complexes that have collapsed under gel assay conditions. A broad band, perhaps ˜185 kD, will consist of one molecule of monomeric recombinant GDNF (15 kD) and one Ret molecule (170 kD) crosslinked, although some dimeric GDNF may be included. When the unlabeled GDNF was crosslinked with NGR-38 cells and the product was examined by Western blot with anti-Ret antibody, individual experiments confirmed that Ret was present in the species by a band having the same molecular weight. (Data not shown).

~ 400 kD 밴드는 확실히 확인되지 않았는데, 어느 정도는 그 분자량을 추정하는데 어려움이 있기 때문이다. 그것이 단지 비환원 조건하에서만 두드러진다는 사실은 그것이 환원 조건하에서 관찰된 종 중 하나 또는 그 이상의 이황화물 - 결합 이량체임을 나타내는 것이다. 가장 그럴듯한 설명은, 그것이 두 개의 Ret, 하나 또는 둘의 GDNFR 및 하나 또는 둘의 GDNF 분자로 구성된 고분자량 복합체의 혼합물일 수 있으나, 그것은 185 kD 종의 이량체를 나타낸다는 것이다. ~ 250 kD 밴드의 정확한 동일성은 아직 결정되지 않았다. 한 가능성은 그것이 ~ 75 kD(GDNF + GDNFR)의 교차결합 이종이량체 및 ~ 185 kD(GDNF + Ret) 복합체를 나타낸다는 것이다.The ˜400 kD band has not been confirmed for certain because it is difficult to estimate the molecular weight to some extent. The fact that it stands out only under non-reducing conditions indicates that it is one or more disulfide-binding dimers of the species observed under reducing conditions. The most plausible explanation is that it may be a mixture of high molecular weight complexes consisting of two Ret, one or two GDNFRs, and one or two GDNF molecules, but it represents a dimer of 185 kD species. The exact identity of the ˜250 kD band has not yet been determined. One possibility is that it represents a cross-linked heterodimer of ˜75 kD (GDNF + GDNFR) and a 185 kD (GDNF + Ret) complex.

GDNF 는 GDNFR 을 발현하는 뉴로 - 2a 세포에서 Ret 의 자가인산화를GDNF inhibits Ret autophosphorylation in neuro-2a cells expressing GDNFR. 자극한다Stimulate

GDNFR 의 존재하에서 GDNF 와 결합하는 Ret 단백질 티로신 키나제 수용체의 능력은 Ret 자가인산화에 관한 GDNF 자극 연구를 이끌어 냈다. NGR - 38 세포를 GDNF 로 처리하고 용균한 다음 용균물을 항 - Ret 항체로 면역침전하였다. 실험 과정에 기술된 바와 같이 항 - 포스포티로신 항체를 사용하여 웨스턴 블롯함으로써 면역침전물을 분석하였다. 포유동물(CHO 세포 ; 도 9A, 레인 4)이나 아니면 E. coli 세포(도 9A, 레인 1, 3)에서 생산된 정제한 재조합 GDNF 로 NGR - 38 세포(도 9A, 레인 2 - 4)를 처리했을 때, 170 kD 에서 강한 밴드가 관찰되었는 데, 이것은 성숙한 형태의 Ret 상에서 티로신 잔기가 자가인산화됨을 나타내는 것이다. 훨씬 더 약한 상응 밴드가 GDNF - 처리 뉴로 - 2a 세포에서 관찰되었다(도 9A, 레인 1). 택일적으로 글리코실화된 150 kD 의 Ret 전구체 형태에서는 어떤 인산화도 관찰되지 않았다(도 9A). GDNF 에 의한 Ret 자가인산화 유도는 투여량 의존성이었다. 투여량 반응 및 NGR - 38 세포에서 GDNF 유래의 Ret 티로신 인산화의 동력학은 패널 B 및 C 에 나타나 있다. 모든 패널에 있어, 티로신 인산화된 170 kD Ret 밴드는 채워진 화살표로 표시되어 있다. 항 - Ret 항체(샌터 크루즈, C - 19, 카탈로그 번호 제 SC - 167 호)를 수반한 면역블롯을 재탐침시킴으로써측정된 바와 같은 각 레인에 부하된 Ret 단백질의 양은 패널 A 의 우측에 표시되어 있다. ~ 150 kD 에서의 밴드는 자가인산화하지 않는 택일적으로 글리코실화된 미성숙 형태의 Ret 을 나타낸다. 도 9B 에 나타낸 바와 같이, NGR - 38 세포에서 Ret 자가인산화의 자극은 50 pg/mL 의 GDNF 로 검출될 수 있었고 반응은 20 - 50 ng/mL GDNF 에서 포화되었다. 처리후 0 - 20 분의 시간 동안 NGR - 38 세포의 정제된 재조합 GDNF 에 의한 Ret 자가인산화 자극은 도 9C 에 나타나 있다. Ret 자가인산화의 증가된 수준은 GDNF 처리 1 분 이내에 관찰될 수 있었고 처리후 10 분째에 최대였다(도 9C).The ability of the Ret protein tyrosine kinase receptor to bind GDNF in the presence of GDNFR led to GDNF stimulation studies on Ret autophosphorylation. NGR-38 cells were treated with GDNF, lysed and the lysates were immunoprecipitated with anti-Ret antibody. Immunoprecipitates were analyzed by western blot using anti-phosphotyrosine antibodies as described in the experimental procedure. Treatment of NGR-38 cells (Figure 9A, lanes 2-4) with purified recombinant GDNF produced in mammalian (CHO cells; Figure 9A, lane 4) or E. coli cells (Figure 9A, lanes 1, 3). At 170 kD, a strong band was observed, indicating that the tyrosine residues autophosphorylate on mature Ret. Much weaker corresponding bands were observed in GDNF-treated neuro-2a cells (FIG. 9A, lane 1). Alternatively no phosphorylation was observed in the glycosylated 150 kD Ret precursor form (FIG. 9A). Induction of Ret autophosphorylation by GDNF was dose dependent. Dose responses and kinetics of Ret tyrosine phosphorylation from GDNF in NGR-38 cells are shown in panels B and C. For all panels, tyrosine phosphorylated 170 kD Ret bands are indicated by filled arrows. The amount of Ret protein loaded in each lane as measured by reprobing the immunoblot with anti-Ret antibody (Santer Cruz, C-19, Cat. No. SC-167) is shown on the right side of panel A. . The band at ˜150 kD represents an alternative, glycosylated immature form of Ret that does not autophosphorylate. As shown in FIG. 9B, stimulation of Ret autophosphorylation in NGR-38 cells could be detected with 50 pg / mL of GDNF and the response was saturated at 20-50 ng / mL GDNF. Ret autophosphorylation stimulation by purified recombinant GDNF of NGR-38 cells for a time period of 0-20 min after treatment is shown in Figure 9C. Increased levels of Ret autophosphorylation could be observed within 1 minute of GDNF treatment and peaked 10 minutes after treatment (FIG. 9C).

GDNF 및 가용성 GDNFR 은 뉴로 - 2A 세포의 Ret 자가인산화를 유도한다.GDNF and Soluble GDNFR Induce Ret Autophosphorylation of Neuro-2A Cells.

상기한 바와 같이, GDNFR 은 GPI 결합을 통해 세포질막에 고정되고 포스파티딜이노시톨 - 특이 포스포리파제 C(PI - PLC)로 처리함으로써 유리될 수 있다. NGR - 38 세포를 PI - PLC 와 함께 배양하면, 이들 세포에서 Ret 의 GDNF - 유래 수용체 자가인산화는 소멸되었다[도 10A ; PI - PLC 로 처리하거나(레인 1) 처리하지 않은(레인 2 및 3) NGR - 38 세포를 GDNF 와 함께(레인 1 및 3) 또는 GDNF 없이(레인 2) 배양하고 실험 과정에 기술된 바와 같이 면역블로팅함으로써 Ret 자가인산화에 대해 분석하였다].As mentioned above, GDNFR is anchored to the cytoplasmic membrane via GPI binding and can be liberated by treatment with phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC). When NGR-38 cells were incubated with PI-PLC, GDNF-derived receptor autophosphorylation of Ret disappeared in these cells [FIG. 10A; NGR-3 cells treated with PI-PLC (lane 1) or untreated (lanes 2 and 3) were incubated with GDNF (lanes 1 and 3) or without GDNF (lane 2) and immunized as described in the experimental procedure. Ret autophosphorylation was analyzed by blotting].

도 10B 는, 실험 과정에 기술된 바와 같이 면역블로팅함으로써 Ret 자가인산화에 대해 분석한 바와 같이, 뉴로 - 2a 또는 NGR - 38 세포로부터 수득한 PI - PLC/CM 의 존재(레인 5 - 8) 또는 부재(레인 1 - 4)시 GDNF 로 처리하거나(레인 2, 4, 6, 8) GDNF 없이 처리한(레인 1, 3, 5, 7) 모뉴로 - 2a 세포를 도시한 것이다. GDNF 로 처리한 NGR - 38 세포는 양성 대조로서 사용하였다. 패널 A 와 B 둘 다에 있어, 자가인산화된 170 kD Ret 밴드는 채워진 화살표로서 표시하였다. NGR - 38 세포를 PI - PLC 처리함으로써 유리된 가용성 GDNFR 을 함유하는 조정배지(PI - PLC/CM)를 GDNF 와 함께 모뉴로 - 2a 세포에 가했을 때, NGR - 38 세포의 GDNF 처리로 수득한 자가인산화에 필적할 만한 Ret 수용체의 자가인산화가 관찰되었다(도 10B, 레인 2 및 8). GDNF 를 가하지 않았을 때나, 뉴로 - 2a 세포의 PI - PLC 처리로 부터 유도된 조정배지를 시험했을 때, 단지 Ret 자가인산화의 배경 수준만이 관찰되었다(도 10B, 레인 3 - 7).10B shows the presence of PI-PLC / CM (lanes 5-8) obtained from neuro-2a or NGR-38 cells, as analyzed for Ret autophosphorylation by immunoblotting as described in the experimental procedure or FIG. Monuro-2a cells treated with GDNF in the absence (lanes 1-4) (lanes 2, 4, 6, 8) or without GDNF (lanes 1, 3, 5, 7) are shown. NGR-38 cells treated with GDNF were used as positive controls. For both panels A and B, autophosphorylated 170 kD Ret bands were indicated as filled arrows. Autologous obtained by GDNF treatment of NGR-38 cells when a control medium containing soluble GDNFR (PI-PLC / CM) liberated by PI-PLC treatment of NGR-38 cells was added to monuro-2a cells with GDNF. Autophosphorylation of Ret receptor comparable to phosphorylation was observed (FIG. 10B, lanes 2 and 8). When GDNF was not added, or when the control medium derived from PI-2 PLC treatment of neuro-2a cells was tested, only background levels of Ret autophosphorylation were observed (FIG. 10B, lanes 3-7).

Ret - Fc 융합 단백질은 GDNF 와 가용성 GDNFR 에 의해 유도된 RetRet-Fc fusion proteins are derived from GDNF and soluble GDNFR. 인산화를 차단한다.Blocks phosphorylation

GDNFR 의 존재하에서 GDNF 에 의해 유도되는 Ret 인산화가 수용체자가인산화의 결과라는 것을 확인하기 위해, Ret 세포외 도메인/면역글로불린 Fc(Ret - Fc) 융합 단백질이 Ret 활성화를 차단할 수 있는지를 측정하는 연구를 수행하였다. NGR - 38 세포상에 발현되는 다수의 GDNF 알파 수용체를 차단시키는 기술적 어려움 때문에, 표적세포로서 뉴로 - 2a 와 GDNFR 의 원으로서 PI - PLC 로 처리한 NGR - 38 세포로 부터 제거한 배지를 사용하여 Ret 인산화 검정을 수행하였다. 여러 GDNF(50 ng/mL) 조합물, 가용성 GDNFR 을 함유하는 배지(예를들어, NGR - 38 세포로 부터 유도된 PI- PLC/CM), 및 다른 농도를 갖는 Ret - Fc 융합 단백질 단독이나 아니면 도 11 에 나타낸 바와 같은 여러 조합물을 포함하는 혼합물로 세포를 처리하였다. GDNF, 가용성 GDNFR 을 함유하는 배지, Ret - Fc, 또는 예비 - 배양한 이들 혼합물로 뉴로 - 2a 세포를 처리하였다. 그런다음 세포를 용균시키고, 실험 과정에 기술된 바와 같이 항 - Ret 항체를 사용하여 면역침전시킴으로써 용균물을 c - Ret 자가인산화에 대해 분석하였다. 항 - 포스포티로신 항체를 사용하여 웨스턴 블롯함으로써 면역침전물을 분석하였다.To confirm that Ret phosphorylation induced by GDNF in the presence of GDNFR is the result of receptor autophosphorylation, studies are conducted to determine whether the Ret extracellular domain / immunoglobulin Fc (Ret-Fc) fusion protein can block Ret activation. Was performed. Due to the technical difficulty of blocking a number of GDNF alpha receptors expressed on NGR-38 cells, Ret phosphorylation using media removed from NGR-38 cells treated with PI-2 PLC as a source of neuro-2a and GDNFR as target cells The assay was performed. Several GDNF (50 ng / mL) combinations, media containing soluble GDNFR (eg, PI-PLC / CM derived from NGR-38 cells), and Ret-Fc fusion proteins with different concentrations alone or Cells were treated with a mixture comprising various combinations as shown in FIG. 11. Neuro-2a cells were treated with GDNF, medium containing soluble GDNFR, Ret-Fc, or these mixtures pre-cultured. Cells were then lysed and the lysates analyzed for c-Ret autophosphorylation by immunoprecipitation using anti-Ret antibodies as described in the experimental procedure. Immunoprecipitates were analyzed by western blot using anti-phosphotyrosine antibodies.

가용성 GDNFR 을 함유하는 배지와 GDNF 의 예비 - 배양한 혼합물은 GDNF - 처리 NGR - 38 대조세포와 필적할 만한 수준으로 뉴로 - 2a 에서 발현되는 Ret 수용체의 티로신 인산화를 유도했다(도 11, 레인 7 및 2). 자가인산화된 170 kD Ret 밴드의 위치는 채워진 화살표로 표시되어 있다.예비 - 배양한 GDNF/GDNFR 혼합물에 Ret - Fc 융합 단백질을 포함시켰을 때, Ret 인산화는 투여량 의존 방식으로 저해되었다(도 11, 레인 8 - 10). 이것은 Ret 인산화가 GDNFR 에 의해 매개된 GDNF/Ret 상호작용의 결과라는 것을 나타냈다. 비처리 뉴로 - 2a 세포에서, 또는 GDNFR 부재시 어떠한 GDNF 조합물이나 Ret - Fc 융합 단백질로 처리한 세포에서는 단지 배경 수준의 Ret 인산화가 관찰되었다(도 11, 레인 3 - 6).The pre-cultured mixture of medium containing soluble GDNFR and GDNF induced tyrosine phosphorylation of the Ret receptor expressed in neuro-2a to a level comparable to that of GDNF-treated NGR-38 control cells (FIG. 11, lane 7 and 2). The location of the autophosphorylated 170 kD Ret band is indicated by a filled arrow. Ret phosphorylation was inhibited in a dose dependent manner when the Ret-Fc fusion protein was included in the pre-cultured GDNF / GDNFR mixture (FIG. 11, Lanes 8-10). This indicated that Ret phosphorylation was the result of GDNF / Ret interaction mediated by GDNFR. Only background levels of Ret phosphorylation were observed in untreated neuro-2a cells or in cells treated with any GDNF combination or Ret-Fc fusion protein in the absence of GDNFR (FIG. 11, lanes 3-6).

GDNF 는 태아 운동 신경원에서 발현되는 c - RET 의 자가인산화를 유도한다.GDNF induces autophosphorylation of c-RET expressed in fetal motor neurons.

생체내 GDNF 작용의 주요 표적 중의 하나는 척수운동 신경원이다 (Henderson 등의, science. 266, 1062 - 1064, 1994 ; Li 등의, Proceedings Of The National Academy Of Sciences, U.S.A. 92, 9771 - 9775, 1995 ; Oppenheim 등의 Nature. 373, 344 - 346, 1995 ; Yan 등의 Nature. 373, 341 - 344, 1995 ; Zurn 등의 Neuroreport. 6, 113 - 118, 1995 참조). 이들 세포에서 Ret 자가인산화를 유도하는 GDNF 의 능력을 시험하기 위해, 태아 랫 척수 운동 신경원을 20 ng/mL GDNF 로 처리하거나(레인 2 및 4) 20 ng/mL GDNF 없이 처리한 다음(레인 1 및 3)이 세포를 용균시키고, 항 - Ret 항체로 면역침전시킨 다음 실험 과정에 기술된 바와 같이 항 - 포스포티로신 항체로 웨스턴 블로팅함으로써 분석하였다. GDNF 로 처리한 세포 용균물에서, ~ 170 kD 의 분자량을 갖는 티로신으로 인산화된 단백질 밴드가 관찰되었다(도 12, 레인 2). 결합 완충액 단독으로 처리한 세포에서는 그와 같은 시그널이 관찰되지 않았다(도 12, 레인 1). 동일한 웨스턴 블롯 필터를 제거하고 항 - Ret 항체로 재프로빙하면(즉, 항 - Ret 항체로 면역블롯을 재프로빙함으로써 각 레인에 부하된 c - Ret 단백질의 양을 측정하면), 두 시료에서 동일한 분자량과 유사한 세기를 갖는 밴드가 나타났다(도 12, 레인 3 및 4). GDNF - 처리 세포에서의 포스포티로신 밴드는 Ret 단백질 밴드와 함께 공동 - 이동하는데, 이것은 GDNF 가 Ret 의 자가인산화를 자극했다는 것을 암시하는 것이다. 자가인산화된 Ret 밴드(레인 1 및 2)와 상응하는 단백질 밴드(레인 3 및 4)는 채워진 화살표로 표시하였다.One of the major targets of GDNF action in vivo is the spinal motor neurons (Henderson et al., Science. 266, 1062-1064, 1994; Li et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences, USA 92, 9771-9775, 1995; Nature of Oppenheim et al. 373, 344-346, 1995; Yan et al. Nature 373, 341-344, 1995; Zurn et al. Neuroreport. 6, 113-118, 1995). To test the ability of GDNF to induce Ret autophosphorylation in these cells, fetal rat spinal cord motor neurons were treated with 20 ng / mL GDNF (lanes 2 and 4) or without 20 ng / mL GDNF (lanes 1 and 3) These cells were lysed, immunoprecipitated with anti-Ret antibody and analyzed by western blotting with anti-phosphotyrosine antibody as described in the experimental procedure. In cell lysates treated with GDNF, a protein band phosphorylated with tyrosine having a molecular weight of ˜170 kD was observed (FIG. 12, lane 2). No such signal was observed in cells treated with binding buffer alone (FIG. 12, lane 1). By removing the same Western blot filter and reprobing with an anti-Ret antibody (ie, measuring the amount of c-Ret protein loaded in each lane by reprobing the immunoblot with an anti-Ret antibody), the same molecular weight in both samples Bands with an intensity similar to were shown (FIG. 12, lanes 3 and 4). The phosphotyrosine band in GDNF-treated cells co-shifts with the Ret protein band, suggesting that GDNF stimulated Ret autophosphorylation. The autophosphorylated Ret bands (lanes 1 and 2) and the corresponding protein bands (lanes 3 and 4) are indicated by filled arrows.

토 론debate

폴리펩티드 성장 인자는 동계의 세포 표면 수용체와 결합함으로써 생물학적 효과를 이끌어 낸다. 수용체는 그 구조 및 작용기전을 근거로 몇 종류로 분류될 수 있다. 이러한 분류는 단백질 티로신 키나제(PTKs), 세린/트레오닌 키나제 및 사이토킨 수용체를 포함한다. 수용체 PTK 시그널화는 리간드와의 직접 상호작용에 의해 개시되며, 차례로 수용체 자가인산화를 초래하는 수용체 이합체화나 소중합체화를 유도한다. 그런 다음 활성화된 수용체는 세포내 기질을 보충하고 인산화하여 생물학적 반응을 일으키는 케스케이드(cascade) 사건을 개시한다 (Schlessinger 및 Ullrich, Neuron 9, 383 - 391, 1992 참조). 대조적으로, 세린/트레오닌 키나제나 사이토킨 수용체에 의한 시그널 트랜스덕션은 종종 리간드 결합 및 시그널 트랜스덕션 성분이 같지 않은 다성분 수용체 복합체의 형성을 포함한다. 구체적인 예는 TGF - 수용체 복합체, 즉 별개의 결합(제 2 형) 및 시그널(제 1 형) 성분과 CNTF 군으로 구성된 세린/트레오닌 키나제 수용체이다. CNTF, 인터루킨 - 6(IL - 6) 및 백혈구 저해 인자(LIF)는 그 각각의 수용체 복합체에, 공동 시그널화 성분, 즉 gp130 및/또는 ILFR 을 공유한다. 이들 복합체의 리간드 특이성은 각 개별 리간드에 특이하게 결합하는 소단위체에 의해 결정되는 반면, 시그널 트랜스덕션은 초기 리간드 복합체, 및 직접 리간드와 결합할 수 없는 그외 수용체 소단위체와의 리간드 결합 소단위체의 결합을 필요로 한다(Ip 등의 Cell. 69, 1121 - 1132, 1992 참조). CNTF 수용체 복합체에 있어, 리간드 결합 성분은 GDNFR 에 적합한 CNTF 수용체(CNTFR)로서, GPI - 고정 막 단백질이다. 본 발명은 자가인산화가 별개의 리간드 - 특이 결합 성분과의 결합에 달려있는 수용체 PTK 에 관한 첫 번째 실시예의 설명을 포함한다.Polypeptide growth factors lead to biological effects by binding to syngeneic cell surface receptors. Receptors can be classified into several types based on their structure and mechanism of action. This classification includes protein tyrosine kinases (PTKs), serine / threonine kinases and cytokine receptors. Receptor PTK signaling is initiated by direct interaction with a ligand, which in turn leads to receptor dimerization or oligomerization resulting in receptor autophosphorylation. The activated receptor then initiates a cascade event that recruits and phosphorylates the intracellular matrix to cause a biological response (see Schlessinger and Ullrich, Neuron 9, 383-391, 1992). In contrast, signal transduction by serine / threonine kinase or cytokine receptors often involves the formation of multicomponent receptor complexes that have the same ligand binding and signal transduction components. A specific example is the TGF-receptor complex, a serine / threonine kinase receptor composed of separate binding (type 2) and signal (type 1) components and the CNTF group. CNTF, interleukin-6 (IL-6) and leukocyte inhibitory factor (LIF) share a co-signaling component, gp130 and / or ILFR, in their respective receptor complexes. The ligand specificity of these complexes is determined by the subunits that specifically bind to each individual ligand, while signal transduction is the binding of the ligand binding subunits with the initial ligand complex and other receptor subunits that cannot directly bind the ligand. (See Cell, 69, 1121-1132, 1992 of Ip et al.). In the CNTF receptor complex, the ligand binding component is a CNTF receptor (CNTFR) suitable for GDNFR, which is a GPI-fixed membrane protein. The present invention includes a description of the first example of receptor PTK in which autophosphorylation depends on binding to a separate ligand-specific binding component.

본 연구는, GDNFR, GDNF 와 고친화성으로 결합하는 GPI - 결합 막 단백질이 Ret 수용체 PTK 와 GDNF 의 유효 결합을 필요로 한다는 것을 확인한다. GDNFR 의 부재시, GDNF 는 Ret 과 결합할 수 없거나 Ret 수용체 자가인산화를 자극할 수 없다. GDNFR 의 존재시, GDNF 는 Ret 과 결합하고 신속히 투여량 - 의존 방식으로 Ret 자가인산화를 유도한다. 상기한 바와 같이, GDNFR 은 막 결합이나 아니면 가용성 형태에 작용할 수 있다(도 11). 50 pg/mL 의 GDNF 농도(1.7 pM)가 GDNFR 을 발현하는 세포에서 Ret 티로신 키나제를 활성화시킬 수 있다. 이것은 NGR - 38 세포상의 고친화성 GDNF 결합부위에 대해 발견된 해리상수(1.5 pM)와 일치한다. GDNF 에 의한 Ret 인산화의 신속한 유도(처리후 1 분 째에 검출가능) 및 자가인산화를 차단시키는 Ret - Fc 의 능력은, Ret 이 어떤 다른 수용체의 인산화 결과에 따르기 보다는 직접 활성화된다는 것을 암시한다.This study confirms that GPI-binding membrane proteins that bind GDNFR and GDNF with high affinity require effective binding of the Ret receptor PTK and GDNF. In the absence of GDNFR, GDNF cannot bind Ret or stimulate Ret receptor autophosphorylation. In the presence of GDNFR, GDNF binds to Ret and induces Ret autophosphorylation in a rapid dose-dependent manner. As noted above, GDNFR may act on membrane binding or otherwise on soluble form (FIG. 11). A GDNF concentration (1.7 pM) of 50 pg / mL can activate Ret tyrosine kinase in cells expressing GDNFR. This is consistent with the dissociation constant (1.5 pM) found for the high affinity GDNF binding site on NGR-38 cells. The rapid induction of Ret phosphorylation by GDNF (detectable one minute after treatment) and the ability of Ret-Fc to block autophosphorylation suggest that Ret is directly activated rather than depending on the phosphorylation results of any other receptor.

교차결합 연구는 GDNF 와 Ret 의 유효결합이 GDNFR 에 달려있다는 가설을 지지한다. 고수준의 GDNFR 을 발현하는 NGR - 38 세포에서 Ret 에 대한 GDNF 의 교차결합은 강하지만, 모뉴로 - 2a 세포 교차결합 산물은 거의 검출불가능하다. 모든 교차결합 복합체를 결정적으로 확인하는 것은 어려우나, 상기 데이터는 GDNF 와 Ret 의 결합이 GDNF 의 존재에 달려있다는 것을 명백히 입증하며, GDNFR 이 교차결합 산물의 일부에서 유도된다는 것을 입증한다. 뉴로 - 2a 세포에 소수의 교차결합종이 존재하는 이유는 명확하지 않다. 뉴로 - 2a 세포에서의 GDNFR mRNA 발현은 노던 블롯에 의해 검출될 수 없었으나, GDNFR 이 이들 세포에서 매우 저수준으로 발현된다는 것은 가능하다.Crosslinking studies support the hypothesis that the effective binding of GDNF and Ret depends on GDNFR. The crosslinking of GDNF to Ret is strong in NGR-38 cells expressing high levels of GDNFR, but the monuro-2a cell crosslinking product is almost undetectable. Determining all crosslinking complexes critically is difficult, but the data clearly demonstrates that the binding of GDNF and Ret depends on the presence of GDNF, demonstrating that GDNFR is derived from some of the crosslinking products. The reason for the small number of cross-linked species in neuro-2a cells is not clear. GDNFR mRNA expression in neuro-2a cells could not be detected by Northern blot, but it is possible that GDNFR is expressed at very low levels in these cells.

배양된 랫 태아 척수 운동 신경원에서 Ret 이 GDNF 에 의해 활성화될 수 있다는 사실은 Ret/GDNF 상호작용의 생물학적 관련성을 더 입증해 준다. 이들 세포는 생체내 GDNF 의 일차 표적이며, 저투여량의 생체내 GDNF 와 반응한다고 밝혀졌다(Henderson 등의 1994). 운동성 신경원 세포를 PI - PLC 로 전처리하면 Ret 인산화의 자극이 소멸되었는데(데이터는 나타나 있지 않음), 이것은 GDNF 에 의한 Ret 활성화에 GDNFR 이 필요하다는 것을 시사하는 것이다.The fact that Ret can be activated by GDNF in cultured rat fetal spinal cord motor neurons further demonstrates the biological relevance of Ret / GDNF interactions. These cells have been found to be the primary target of GDNF in vivo and to react with low doses of GDNF in vivo (Henderson et al. 1994). Pretreatment of motor neuronal cells with PI-PLC eliminated stimulation of Ret phosphorylation (data not shown), suggesting that GDNFR is required for Ret activation by GDNF.

수용체 세포외 도메인에 대한 리간드의 결합이 다른 공지된 수용체 PTKs 활성화에 있어 제 1 단계 일지라도, 이것이 GDNF 와 Ret 에 대한 경우는 아니라는 것을 본 데이터는 나타냈다. 도 13 은 GDNFR 과 Ret 에 대한 GDNF 결합 모델, 및 그 결과로서 일어나는 GDNF 와 반응하는 Ret PTK 의 활성화를 도시한 것이다. 이 과정의 초기 사건은 단량체형태나 아니면 이량체형태로 이황화물 - 결합 이량체 GDNF 가 GDNFR 에 결합하는 것이다. 현재 이량체 GDNFR 존재에 대한 직접적인증거는 없으나, GDNFR cDNA 로 293T 세포를 형질감염시켰을 때 두 종류의 결합 부위가 나타났다. 이 관찰에 대한 가장 간단한 설명은 단량체 및 이량체 GDNFR 이 존재하며, 각각은 그 자체의 리간드 결합 친화성을 갖는다는 것이다. 이것은 GDNF 결합 친화성이 분명히 Ret 존재에 의해 영향 받지 않는다는 발견과 일치한다. 본 실험은 이량체 GDNFR 이 GDNF 의 존재시 그것의 단량체와 평형인지, 이량체화가 GDNF 결합에 의해 유도되는지에 관한 질문을 다루지 않으므로, 이 가능성은 선택경로로서 존재한다. 이량체 GDNFR 과 이량체 GDNF 로 구성된 복합체는 두 개의 Ret 분자와 결합할 수 있는데, 이것은 활성 시그널화 복합체를 형성한다. 그외 PTKs 에 있어서는 두 개의 Ret 분자의 세포내 촉매 도메인 간의 밀접한 접촉으로 수용체 자가인산화가 초래되는 것 같다. 이와 같은 기전에 의한 Ret 기능에 관한 개념은 안정한 상태의 Ret 이량체화를 유발하는 MEN2A 돌연변이로 인해 Ret 키나제의 본질적인 활성화가 일어난다는 사실에 의해 지지된다(Santoro 등의 1995 참조).Although the binding of the ligand to the receptor extracellular domain is the first step in the activation of other known receptor PTKs, the data indicated that this is not the case for GDNF and Ret. FIG. 13 shows the GDNF binding model for GDNFR and Ret, and the activation of Ret PTK in response to the resulting GDNF. The initial event of this process is the disulfide-binding dimer GDNF binding to GDNFR in monomeric or dimeric form. There is currently no direct evidence of the presence of dimeric GDNFR, but two binding sites appeared when 293T cells were transfected with GDNFR cDNA. The simplest explanation for this observation is that monomer and dimer GDNFRs exist, each with its own ligand binding affinity. This is consistent with the finding that GDNF binding affinity is clearly not affected by the presence of Ret. This experiment does not address the question of whether dimer GDNFR is in equilibrium with its monomers in the presence of GDNF and whether dimerization is induced by GDNF binding, so this possibility exists as a selection pathway. The complex consisting of dimer GDNFR and dimer GDNF can bind two Ret molecules, which form an active signaling complex. In other PTKs, receptor autophosphorylation seems to result from intimate contact between the intracellular catalytic domains of two Ret molecules. The concept of Ret function by this mechanism is supported by the fact that the intrinsic activation of Ret kinase occurs due to MEN2A mutations that cause steady state Ret dimerization (see Santoro et al. 1995).

운동 신경원은 5fM 만큼이나 낮은 ED50 을 갖는 GDNF 와 반응한다고 보고되어 있다(Henderson 등의 1994 참조). 생물학적 반응을 위한 ED₅₀과 결합 친화성을 비교하기는 어려우나, 이들 세포에 매우 고친화성인 GDNF 결합부위가 존재한다는 것은 가능하다. 그외 세포, 이를테면태아 병아리 교감 신경원은 1 - 5 nM 의 Kd 를 갖는 GDNF 와 반응한다고 보고되어 있다(Trupp 등의 Journal of Cell Biology, 130, 137 - 148, 1995 참조). GDNFR 을 그와 같은 낮은 친화성 부위에 대한 수용체 복합체와 관련되지 않을 것 같지만, GDNF 와 Ret 간에 약한 직접 상호작용이 존재할 수도 있다.Motor neurons have been reported to react with GDNF with ED50 as low as 5fM (see Henderson et al. 1994). Although it is difficult to compare binding affinity with ED ₅₀ for biological reactions, it is possible that there are very high affinity GDNF binding sites in these cells. Other cells, such as fetal chick sympathetic neurons, have been reported to react with GDNF with a Kd of 1-5 nM (see Journal of Cell Biology, 130, 137-148, 1995). Although GDNFR is unlikely to be associated with receptor complexes for such low affinity sites, there may be a weak direct interaction between GDNF and Ret.

소장 신경계 세포를 포함하여 많은 중추 및 말초 신경계 세포주의 배형성 중에 c - ret 발현이 관찰되었다(Pachnis, 등의 Development, 119, 1005 - 1017, 1993 ; Tsuzuki 등의 1995 참조). 신경계외에, c - ret 발현은 볼프관, 요관아 상피 및 신장의 집합관에서 검출되었다 (Pachnis, 등의 상기문헌 ; Tsuzuki 등의 1995 참조). 신경릉 유래 (Ikeda 등의 1990 참조) 및 외과수술로 절제된 신경아세포종 유래(Nagao 등의 1990 ; Takahashi 및 (Cooper, 1987 참조)의 모든 신경아세포종 세포주에서도 Ret 발현이 검출되었다. CNS 와 PNS 뿐만 아니라 배 발생중의 비 - 신경원 조직에서도 GDNF 발현은 관찰되었다. 많은 비 - 신경원 조직에서 발견된 GDNF 발현 수준은 신경계에서 보다 높았다(Choi - Lundberg 및 Bohn, Brain Res. Dev. Brain Res. 85, 80 - 88, 1995 참조). 비록 GDNFR 의 발현에 관하여 광범위하게 연구되지 않았으나, 성숙한 랫 및 마우스의 간, 뇌 및 신장에서 고수준의 GDNFR mRNA 가 존재한다는 것이 일차 노던 블롯 분석으로 검출되었다.신경계 및 신장 발생시 ret, GDNF 및 GDNFR 발현 유형의 유사성은 발생중의 그들의 조합 작용과 일치한다.C-ret expression was observed during embryogenesis of many central and peripheral nervous system cell lines, including small intestinal nervous system cells (Pachnis et al., Development, 119, 1005-1017, 1993; see Tsuzuki et al., 1995). In addition to the nervous system, c-ret expression was detected in the collection tubes of Wolf's duct, ureteric epithelium and kidney (Pachnis et al., Supra; Tsuzuki et al. 1995). Ret expression was also detected in all neuroblastoma cell lines derived from neural tombs (see Ikeda et al. 1990) and surgically resected neuroblastomas (Nagao et al. 1990; Takahashi and (see Cooper, 1987)). GDNF expression was also observed in developing non-neuronal tissues: GDNF expression levels found in many non-neuronal tissues were higher in the nervous system (Choi-Lundberg and Bohn, Brain Res. Dev. Brain Res. 85, 80-88 Although not extensively studied for the expression of GDNFR, primary Northern blot analysis revealed the presence of high levels of GDNFR mRNA in the liver, brain, and kidney of mature rats and mice. Similarity of GDNF and GDNFR expression types with their combinatorial action during development Matches.

볼프관 미측에서 발생한 분지인 발생 요관(developing ureter)과 후신 사이의 상호작용으로 인하여 포유동물 신장 발생이 일어난다고 가정되어 있다(Saxen, Organogenesis of the Kidney. Development and Cell Biology series, Cambridge University Press, Cambridge, England, 1987 참조). Ret 의 발현은 배 발생시 주변 간엽에서가 아니라 요관아에서 발견된 반면, GDNF 의 발현은 신장의 성숙한 후신모가 아니라 미분화된 후신모에서 검출되었다. 이들 관찰은, GDNF 와 Ret 간의 상호작용으로 인하여 요관 구조의 발생이 개시된다는 것을 암시한다. 이 가설은 GDNF 와 ret 유전자의 표적화된 붕괴에 의해 더 지지되는데, 그 결과 신장에 있어 매우 유사한 표현형 결손이 일어난다(Schuchardt 등의 Nature. 367, 380 - 383, 1994 ; Sanchez 출판사 참조). GDNF (-/-) 와 ret (-/-) 녹아웃 동물에서 관찰된 다른 대부분 표현형 결손은 소화관 전체에 소장 신경원이 완전히 결여된 것이다. 보다 하급 장관(lower intestinal tract)에서 부교감신경지배의 선천성 부재를 특징으로 하는 유전병인 히르쉬스프룽병 역시 Ret 의 '기능 상실(loss - of - function)' 돌연변이와 관련되어 있다(Romeo 등의 Nature. 367, 377 - 378, 1994, Edery 등의 1994 참조). 초기 관찰과는 대조적으로 이후 보고서(Angrist 등의 Hum. Mol. Genet. 4, 821 - 830, 1995 참조)에는 어떤 히르쉬스프룽병 환자는 ret 돌연변이를 지니고 있지 않음을 시사했다. 그와 같은 환자가 GDNF, GDNFR 또는 이 시그널 경로의 어떤 다른 임계 성분에서의 돌연변이를 지니고 있을지도 모른다고 현재 생각된다.It is assumed that mammalian kidney development occurs due to the interaction between the developing ureter, the basin on the back of the Wolf's tube, and the posterior body (Saxen, Organogenesis of the Kidney.Development and Cell Biology series, Cambridge University Press, Cambridge , England, 1987). Expression of Ret was found in ureters, not in the surrounding mesenchymal at embryonic development, whereas expression of GDNF was detected in undifferentiated, renal hair rather than mature renal hair. These observations suggest that the development of ureter structure is initiated due to the interaction between GDNF and Ret. This hypothesis is further supported by the targeted disruption of the GDNF and ret genes, resulting in very similar phenotypic defects in the kidneys (see Schuchardt et al. Nature 367, 380-383, 1994; Sanchez Press). Most other phenotypic defects observed in GDNF (-/-) and ret (-/-) knockout animals are the complete lack of small intestinal neurons throughout the digestive tract. Hirschsprung, a hereditary disease characterized by a congenital absence of parasympathetic nerve control in the lower intestinal tract, is also associated with Ret's 'loss-of-function' mutation (Romeo et al. Nature. 367, 377-378, 1994, Edery et al. 1994). In contrast to earlier observations, later reports (see Angrist et al., Hum. Mol. Genet. 4, 821-830, 1995) suggested that some patients with Hirsch-Sprung disease do not have a ret mutation. It is currently believed that such patients may have mutations in GDNF, GDNFR or any other critical component of this signaling pathway.

실험 과정Experiment process

GDNFR 을 발현하는 뉴로 - 2a 세포에 대한 [For neuro-2a cells expressing GDNFR [ ¹²⁵¹²⁵ I]GDNF 결합I] GDNF binding

제조자의 지시에 따라 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 시스템(집코/비알엘)을 이용하여 상기한 바와 같이 뉴로 - 2a 세포(입수처 : ATCC 제 CCL 131 호)를 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 400 μg/mL G418 항생제(시그마)에 성장시킴으로써 플라스미드의 발현에 대해 형질감염 세포를 선택하였다. G418 내성 클론을 확장시키고 [¹²⁵I]GDNF(애머샴, 인코포레이티드에서 구입, 주문 요오드화, 카탈로그 번호 제 IMQ1057 호)와 결합시킴으로써 GDNFR 발현을 검정하였다. 폴리오르니틴으로 예비 - 피복한 24 - 웰 조직배양 평판(벡톤 딕킨슨) 이중 웰에 각 클론으로 부터의 세포를 3 × 10⁴세포/cm²의 밀도로 접종하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액(25 mM HEPES, pH 7.5 를 함유하는 DMEM)으로 세포를 1 회 세척한 다음 500 mM 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하의 4 ℃ 에서 4 시간 동안 50 pM [¹²⁵I]GDNF 와 함께 결합 완충액(0.2 % BSA 를 더한 세척 완충액)에 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고, 1 M NaOH 로 용균시킨 후 방사성표지가 결합된 세포를 1470 위저드 자동 감마 카운터(월락 인코포레이티드)로 정량하였다. 개별 클론에서 발현된 GDNFR 의 양은 비표지 GDNF 의 존재 및 부재하에서 세포와 결합한 [¹²⁵I]GDNF 의 비율로써 추정하였다. 결합 실험에 사용하기 위한 높은, 중간 및 낮은 수준의 GDNFR 발현의 대표물로서 세 클론을 선택하였다. 이들 클론에 대한 비표지 GDNF 의 부재 및 존재하에서의 [¹²⁵I]GDNF 결합비는 다음과 같다 : NGR - 38) 16 : 1, NGR - 16) 12.8 : 1 및 NGR -33) 8 : 1. 표지 GDNF 의 농도 범위가 0.5 pM 내지 1 nM 인 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 NGR - 38 세포에 대한 [¹²⁵I]GDNF 의 평형결합을 수행하였다. 모든 검정에 있어, 500 nM 비표지 GDNF 의 존재하에서 세포와 결합하는 방사성표지의 양으로써 추정한 바와 같은 비특이 결합을 비표지 GDNF 의 부재하에서의 결합에서 공제하였다. 스캐차드 플롯으로써 결합 데이터를 분석하였다.Neuro-2a cells (obtained from ATCC CCL 131) were transfected with expression plasmids as described above using a calcium phosphate transfection system (Zipco / BIAL) according to the manufacturer's instructions. Transfected cells were selected for expression of the plasmids by growing in 400 μg / mL G418 antibiotic (Sigma). GDNFR expression was assayed by expanding G418 resistant clones and binding to [ ¹²⁵ I] GDNF (Amersham, purchased from Incorporated, Order Iodide, Cat. No. IMQ1057). 24-well tissue culture plates pre-coated with polyornithine (Becton Dickinson) dual wells were seeded with cells from each clone at a density of 3 × 10 ⁴ cells / cm ² . Wash cells once with ice cold wash buffer (DMEM containing 25 mM HEPES, pH 7.5) and then with 50 pM [ ¹²⁵ I] GDNF for 4 hours at 4 ° C. with or without 500 mM unlabeled GDNF. Incubation in binding buffer (wash buffer plus 0.2% BSA). The cells were washed four times with ice-cold wash buffer, lysed with 1 M NaOH, and the radiolabeled cells were quantified with a 1470 Wizard automatic gamma counter (Wallac Incorporated). The amount of GDNFR expressed in individual clones was estimated by the percentage of [ ¹²⁵ I] GDNF bound to cells in the presence and absence of unlabeled GDNF. Three clones were selected as representative of high, medium and low levels of GDNFR expression for use in binding experiments. [ ¹²⁵ I] GDNF binding ratios in the absence and presence of unlabeled GDNF for these clones are as follows: NGR-38) 16: 1, NGR-16) 12.8: 1 and NGR -33) 8: 1. Labeled GDNF Equilibrium binding of [ ¹²⁵ I] GDNF to NGR-38 cells was performed as described above except that concentration ranges from 0.5 pM to 1 nM. For all assays, nonspecific binding, as estimated by the amount of radiolabel that binds cells in the presence of 500 nM unlabeled GDNF, was subtracted from binding in the absence of unlabeled GDNF. Binding data were analyzed by Scatchard plots.

화학 교차결합Chemical crosslink

뉴로 - 2a 또는 NGR - 38 세포를 인산염 - 완충 식염수(PBS, pH 7.1)로 1 회 세척한 다음, 500 nM 비표지 GDNF 의 존재나 부재하의 4 ℃ 에서 4 시간 동안 결합 완충액내 1 또는 3 nM [¹²⁵I]GDNF 로 처리하였다. 결합 후, 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고 세척 완충액내 1 mM 비스 수버레이트(BS³, 피어스)로 실온에서 45 분간 배양하였다. 트리스 - 완충 식염수(TBS, pH 7.5)로 세포를 3 회 세척함으로써 교차 - 결합 반응을 급랭시켰다. 그런 다음 SDS - PAGE 시료 완충액(80 mM 트리스 HCl [pH 6.8], 10 % 글리세롤, 1 % SDS, 0.025 % 브로모페놀 블루)이나 아니면 트리톤 X - 100 용균 완충액[50 mM Hepes, pH 7.5, 1 % 트리톤 X- 100, 50 mM NaCl, 50 mM NaF, 10 mM 소디움 피로포스페이트, 1 % 아프로티닌(시그마, 카탈로그 번호 제 A - 6279 호), 1 mM PMSF(시그마, 카탈로그 번호 제 P - 7626 호), 0.5 mM Na₃VO₄(피셔, 카탈로그 번호 제 S454 - 50 호)]에 직접 상기 세포를 용균시켰다. 원심분리하여 용균물을 맑게 해서 5 μg/mL 의 항 - Ret 항체(샌터 크루즈 항체, C - 19, 카탈로그 번호 제 SC - 167 호)와 배양하고, 단백질 A - 세파로스 CL - 4B(파마시아)로 침전시킴으로써 결과적으로 생성된 면역복합체를 수집하였다. 면역침전물을 용균 완충액으로 3 회, 50 mM NaCl 과 20 mM 트리스 - Cl, pH 7.5 를 함유하는 0.5 % NP - 40 으로 1 회 세척한 다음 SDS - PAGE 시료 완충액에 재현탁하였다. 비스 : 아크릴아미드의 비율이 1 : 200 인 7.5 % SDS - PAGE 로 전체 세포 융균물과 면역침전물 둘 다 분획화하였다.Neuro-2a or NGR-38 cells were washed once with phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.1) and then 1 or 3 nM in binding buffer for 4 hours at 4 ° C. with or without 500 nM unlabeled GDNF [ ¹²⁵ I] GDNF. After binding, cells were washed four times with ice-cold wash buffer and incubated for 45 minutes at room temperature with 1 mM bis subversate (BS ³ , Pierce) in wash buffer. The cross-binding reaction was quenched by washing the cells three times with Tris-buffered saline (TBS, pH 7.5). Then SDS-PAGE sample buffer (80 mM Tris HCl [pH 6.8], 10% glycerol, 1% SDS, 0.025% bromophenol blue) or Triton X-100 lysis buffer [50 mM Hepes, pH 7.5, 1% Triton X-100, 50 mM NaCl, 50 mM NaF, 10 mM Sodium Pyrophosphate, 1% Aprotinin (Sigma, Cat. No. A-6279), 1 mM PMSF (Sigma, Cat. No. P-7626), 0.5 mM Na ₃ VO ₄ (Fisher, Cat. No. S454-50)] was lysed directly. The lysate was clarified by centrifugation to incubate with 5 μg / mL of anti-Ret antibody (Santa Cruz Antibody, C-19, Cat. No. SC-167), and the protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia). The resulting immunocomplexes were collected by precipitation. The immunoprecipitates were washed three times with lysis buffer, 0.5% NP-40 containing 50 mM NaCl and 20 mM Tris-Cl, pH 7.5 and then resuspended in SDS-PAGE sample buffer. Both whole cell lysates and immunoprecipitates were fractionated by 7.5% SDS-PAGE with a bis: acrylamide ratio of 1: 200.

웨스턴 블롯 분석Western blot analysis

웨스턴 블롯 분석에 의해 Ret 수용체의 자가인산화를 조사하였다. 간단히 설명하면, 검정 24 시간 전에 6 - 웰 조직배양 접시에 1.5 × 10⁶세포/웰의 밀도로 세포를 접종하였다. 결합 완충액으로 세포를 1 회 세척하고 여러 시간 동안 여러 농도의 별개 시약(GDNF, PI - PLC, PI - PLC/CM 및 Ret - Fc 융합 단백질 포함) 단독으로나, 아니면 결합 완충액과 공동으로 처리하였다. 처리 세포 및 비처리 대조를 트리톤 X - 100 용균 완충액에 용균시키고 상기한 바와 같이 항 - Ret 항체(샌터 크루즈, C 19, 카탈로그 번호 제 SC - 167 호) 및 단백질 - A 세파로스로 면역침전시켰다. SDS - PAGE 에 의해 면역침전물을 분획화하고 Harlow 및 Lane(Antibodies : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory : Cold Spring Harbor, New York, 1988 참조)이 기술한 바와 같이 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이 막을 5 % BSA(시그마)로 예비 - 차단시키고 실온에서 2 시간 동안 항 - 포스포티로신 모노클로날 항체 4G10(UBI, 카탈로그 번호 제 05 - 321 호)으로 막을 블로팅하여 상기수용체의 티로신 인산화 수준을 결정하였다. 동일한 막을 벗겨내고 항 - Ret 항체로 재탐침시킴으로써 각 레인에 포함된 단백질의 양을 측정하였다. 최종적으로, 제조자의 지시에 따라 막을 화학발광 시약(ECL, 애머샴)으로 처리하여 X - 선 필름(하이퍼필름 - ELC, 애머샴)에 노출시켰다.The autophosphorylation of Ret receptor was examined by Western blot analysis. Briefly, cells were seeded at a density of 1.5 × 10 ⁶ cells / well in 6-well tissue culture dishes 24 hours prior to assay. Cells were washed once with binding buffer and treated with various concentrations of separate reagents (including GDNF, PI-PLC, PI-PLC / CM and Ret-Fc fusion proteins) alone or in combination with binding buffer for several hours. Treated cells and untreated controls were lysed in Triton X-100 lysis buffer and immunoprecipitated with anti-Ret antibody (Santa Cruz, C 19, Cat. No. SC-167) and Protein-A Sepharose as described above. Immunoprecipitates were fractionated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membranes as described by Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1988). Tyrosine phosphorylation level of the receptor was pre-blocked with 5% BSA (Sigma) and blotted with anti-phosphotyrosine monoclonal antibody 4G10 (UBI, Cat. No. 05-321) for 2 hours at room temperature. Was determined. The amount of protein contained in each lane was determined by stripping the same membrane and reprobing with anti-Ret antibody. Finally, the membranes were treated with chemiluminescent reagents (ECL, Amersham) according to the manufacturer's instructions and exposed to X-ray films (Hyperfilm-ELC, Amersham).

PI - PLC 로 세포 처리 및 PI - PLC 처리된 조정배지 생성Cell processing with PI-PLC and creation of PI-PLC treated media

세포 표면으로 부터 GPI - 결합 GDNFR 을 유리시키기 위해, 세척 완충액으로 세포를 1 회 세척한 다음 결합 완충액내의 1 U/mL 포스파티딜이노시톨 특이 포스포리파제 C(PI - PLC, 뵈링거 만하임, 카탈로그 번호 제 1143069 호)와 함께 37 ℃ 에서 45 분간 배양하였다. 그런다음 세포를 세척 완충액으로 3 회 세척하고 Ret 자가인산화 검정용이나 교차결합용으로 더 처리하였다. PI - PLC 처리된 조정배지(PI - PLC/CM)를 생성하기 위해, 2 mM 의 EDTA 를 함유하는 PBS 로 세포를 37 ℃ 에서 5 내지 10 분간 처리함으로써 조직배양 접시에서 8 × 10⁶세포를 제거하였다. 세척 완충액으로 세포를 1 회 세척하고, 1 U/mL 의 PI - PLC 를 함유하는 1 mL 의 결합 완충액에 재현탁한 다음 37 ℃ 에서 45 분간 배양하였다. 세포는 펠릿화되었고, PI - PLC/CM 을 수집하였다.To release GPI-binding GDNFR from the cell surface, cells are washed once with wash buffer and then 1 U / mL phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC, Schöllinger Mannheim, Catalog No. 1143069) in binding buffer. Incubated at 37 ° C for 45 minutes. Cells were then washed three times with wash buffer and further treated for Ret autophosphorylation assay or crosslinking. To generate PI-PLC treated medium (PI-PLC / CM), 8 × 10 ⁶ cells were removed from tissue culture dishes by treating the cells with PBS containing 2 mM EDTA for 5-10 minutes at 37 ° C. It was. Cells were washed once with wash buffer, resuspended in 1 mL of binding buffer containing 1 U / mL of PI-PLC and incubated for 45 min at 37 ° C. Cells were pelleted and PI-PLC / CM collected.

Ret - Fc 융합 단백질 제조Manufacture of Ret-Fc Fusion Proteins

마우스 c - Ret 의 첫 번째 20 아미노산에 상응하는 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여 17 일 된 랫 태반 cDNA 라이브러리로 부터 c - Ret 의 전체 코딩 부위를 포함하는 cDNA 를 분리하였다(Iwamoto 등의 1993 ; van Heyningen, 1994 참조). Ret 수용체의 세포외 도메인을 코딩하는 부분(마지막 아미노산에서 종결, R636)을 인체 IgG 의 Fc 부분(IgG1)을 코딩하는 DNA 와 함께 프레임내 융합시키고 이미 기술된 바와 같은(Bartley 등의 Nature. 368, 558 - 560, 1994 참조) 발현 벡터 pDSR2 내에 서브클로닝하였다. 이 ret - Fc/pDSRα2 플라스미드를 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포내로 형질감염시키고 재조합체 Ret - Fc 융합단백질을 Ni++ 칼럼(퀴아겐)을 사용하여 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.An oligonucleotide probe corresponding to the first 20 amino acids of mouse c-Ret was used to isolate a cDNA comprising the entire coding region of c-Ret from a 17-day-old rat placental cDNA library (Iwamoto et al. 1993; van Heyningen, 1994). The portion encoding the extracellular domain of the Ret receptor (terminated at the last amino acid, R636) is fused in-frame with the DNA encoding the Fc portion of human IgG (IgG1) and as previously described (Bartley et al. Nature. 368, 558-560, 1994) subclones in the expression vector pDSR2. This ret-Fc / pDSRα2 plasmid was transfected into Chinese hamster ovary (CHO) cells and the recombinant Ret-Fc fusion protein was purified by affinity chromatography using a Ni ++ column (Qiagen).

태아 랫 척수 운동신경원 배양물 제조Preparation of Fetal Rat Spinal Motor Neuron Culture

실험 24 시간 전에 E15 스프래그 - 돌레이 랫 태아의 전체 척수로부터 강화된 태아 랫 척수 운동신경원 배양물을 제조하였다. 척수를 절개하고, 수막과 배근신경절(DRGs)을 제거하였다. 척수를 더 작은 단편으로 잘라서 L15 배지내 파파인(파파인 키트, 워싱톤)으로 절단하였다. 해리된 세포 현탁액내에 포함되어 있는 다른 유형의 세포보다 더 큰 운동신경원을 6.8 % 메트리자마이드 기울기(Camu and Henderson, JNeuroscience. 44, 59 - 70, 1992 참조)를 이용하여 강화시켰다. 메트리자마이드 쿠션과 세포 현탁액 사이의 접촉면에 존재하는 강화된 운동신경원을 모아서 세척하고 폴리 - L - 오르니틴 및 라미닌으로 예비 - 피복된 조직배양 접시에 ~9 × 10⁴세포/cm²의 밀도로 접종하여 37 ℃ 에서 배양하였다.Enhanced fetal rat spinal cord motor neuron cultures were prepared from the entire spinal cord of E15 Sprague-Dolei rat fetuses 24 hours before the experiment. The spinal cord was dissected and the meninges and dorsal root ganglia (DRGs) removed. The spinal cord was cut into smaller fragments and cut with papain (Papine kit, Washington) in L15 medium. Larger motor neurons than other types of cells contained in dissociated cell suspensions were enriched using a 6.8% metrizamide gradient (see Camu and Henderson, JNeuroscience. 44, 59-70, 1992). Reinforced motor neurons present at the contact surface between the methazamide cushion and the cell suspension are collected, washed and pre-coated with poly-L-ornithine and laminin at a density of ˜9 × 10 ⁴ cells / cm ² in a tissue culture dish. Inoculation was incubated at 37 ° C.

여러 참고문헌들이 본원에 인용되어 있으며, 그 명세서 전체가 참고문헌에 포함되어 있다.Several references are cited herein, the entirety of which is incorporated by reference.

본 발명은 바람직한 실시형태 및 전형적인 핵산과 아미노산 서열로 기술되어 있으나, 본 분야의 숙련된 기술자들에 의해 수정 및 변형될 것임은 물론이다. 따라서, 첨부한 청구의 범위는 본 발명에서 청구하는 바와 같은 범위 내에서의 상기 등가의 모든 변형을 포함하고자 한다.Although the present invention has been described in the preferred embodiments and typical nucleic acid and amino acid sequences, it will of course be modified and modified by those skilled in the art. Accordingly, the appended claims are intended to embrace all such modifications within the scope as claimed in the present invention.

참고 문헌references

서열목록Sequence Listing

(1) 서열들에 관한 일반정보 :(1) General information about sequences:

(ⅰ) 출원인 : 팍스 게리 엠(Ⅰ) Applicant: Pax Gary M

징 슈퀴안Jing Shuqian

웬 두안치Wen Duanqi

(ⅱ) 발명의 명칭 : GDNF 단백질의 분석방법 및 검정 기구(Ii) Name of the Invention: Method and assay apparatus for GDNF protein

(ⅲ) 서열의 갯수 : 34(Iii) Number of sequences: 34

(ⅳ) 통신 주소 :(Iii) communication address:

(A) 수신인 : 암젠 인코포레이티드(A) Recipient: Amgen Incorporated

(B) 스트리트 : 디하빌랜드 드라이브 1840(B) Street: Dehavilland Drive 1840

(C) 시 : 사우전드 오크스(C) Poetry: Thousand Oaks

(D) 주 : 캘리포니아(D) State: California

(E) 국명 : 미국(E) Country name: United States

(F) 우편번호 : 91320 - 1789(F) ZIP Code: 91320-1789

(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태 :(Iii) computer-readable form:

(A) 매체타입 : 플로피 디스크(A) Media Type: Floppy Disk

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종(B) Computer: IBM PC compatible model

(C) 운영체계 : PC - DOS/MS - DOS(C) Operating System: PC-DOS / MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30(D) Software: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30

(ⅵ) 현출원 데이터 :(Iii) Current application data:

(A) 출원번호 :(A) Application number:

(B) 출 원 일 : 1997년 4월 14일(B) Date of application: April 14, 1997

(C) 분 류 :(C) Classification:

(ⅶ) 선출원 데이터 :(Iii) First application data:

(A) 출원번호 : 제 US 60/017,221 호(A) Application No. US 60 / 017,221

(B) 출 원 일 : 1996년 5월 9일(B) Date of application: May 9, 1996

(ⅶ) 선출원 데이터 :(Iii) First application data:

(A) 출원번호 : 제 US 60/015,907 호(A) Application No. US 60 / 015,907

(B) 출 원 일 : 1996년 4월 22일(B) Date of application: April 22, 1996

(ⅷ) 대리인/관리인 정보 :(Iv) Agent / Manager Information:

(A) 성명 : 커리 다니엘 알(A) Statement: Currie Daniel R.

(B) 등록번호 : 32,727(B) Registration Number: 32,727

(C) 참조/문서번호 : A - 401A(C) Reference / Document No: A-401A

(2) 서열 번호 : 1(2) SEQ ID NO: 1

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 2568 염기쌍(A) Sequence length: 2568 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 540..1934(B) Location: 540..1934

(xi) 서열 1 :(xi) SEQ ID NO: 1:

(2) 서열 번호 : 2(2) SEQ ID NO: 2

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 465 아미노산(A) Sequence length: 465 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 2 :(xi) SEQ ID NO 2:

(2) 서열 번호 : 3(2) SEQ ID NO: 3

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 2138 염기쌍(A) Sequence length: 2138 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 302..1705(B) Location: 302..1705

(xi) 서열 3 :(xi) SEQ ID NO 3:

(2) 서열 번호 : 4(2) SEQ ID NO: 4

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 468 아미노산(A) Sequence length: 468 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 4 :(xi) SEQ ID NO: 4:

(2) 서열 번호 : 5(2) SEQ ID NO: 5

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 3209 염기쌍(A) Sequence length: 3209 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature(A) Symbol representing the feature: misc _ feature

(B) 존재위치 : 1..539(B) Location: 1..539

(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 539 는 도 5 Gdnfr 의 - 237(D) Other information: / week = '1 to 539 is-237 of Gdnfr of FIG.

내지 301 임'To 301

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 540..1937(B) Location: 540..1937

(xi) 서열 5 :(xi) SEQ ID NO 5:

(2) 서열 번호 : 6(2) SEQ ID NO: 6

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 466 아미노산(A) Sequence length: 466 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 6 :(xi) SEQ ID NO 6:

(2) 서열 번호 : 7(2) SEQ ID NO: 7

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 508 염기쌍(A) Sequence length: 508 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..508(B) Location: 1..508

(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 508 은 도 5 Hsgr - 21af 의(D) Other information: / week = '1 to 508 is shown in Figure 5 Hsgr-21af

- 237 내지 272 임'-237 to 272 '

(xi) 서열 7 :(xi) SEQ ID NO 7:

(2) 서열 번호 : 8(2) SEQ ID NO: 8

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 510 염기쌍(A) Sequence length: 510 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..510(B) Location: 1..510

(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 510 은 도 5 Hsgr - 21bf 의(D) Other information: / week = '1 to 510 is shown in Figure 5 Hsgr-21bf

- 237 내지 272 임'-237 to 272 '

(xi) 서열 8 :(xi) SEQ ID NO: 8:

(2) 서열 번호 : 9(2) SEQ ID NO: 9

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 1927 염기쌍(A) Sequence length: 1927 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 538..1926(B) Location: 538..1926

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..537(B) Location: 1..537

(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 537 은 도 5 21acon 의(D) Other information: / week = '1 to 537 is a 5

- 235 내지 301 임'-235 to 301 '

(xi) 서열 9 :(xi) SEQ ID NO: 9:

(2) 서열 번호 : 10(2) SEQ ID NO: 10

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 463 아미노산(A) Sequence length: 463 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 10 :(xi) SEQ ID NO: 10:

2) 서열 번호 : 112) SEQ ID NO: 11

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 1929 염기쌍(A) Sequence length: 1929 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 540..1928(B) Location: 540..1928

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..539(B) Location: 1..539

(D) 기타 정보 : /주 = '1 내지 539 는 도 5 21bcon 의(D) Other information: / week = '1 to 539 is in Figure 5 21bcon

- 237 내지 301 임'-237 to 301 '

(xi) 서열 11 :(xi) SEQ ID NO: 11:

(2) 서열 번호 : 12(2) SEQ ID NO: 12

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 463 아미노산(A) Sequence length: 463 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 12 :(xi) SEQ ID NO: 12:

(2) 서열 번호 : 13(2) SEQ ID NO: 13

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 699 염기쌍(A) Sequence length: 699 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..699(B) Location: 1..699

(D) 기타 정보 : /주 = '1 내지 699 는 도 5 Hsgr - 29a 의(D) Other information: / week = '1 to 699 is shown in Figure 5 Hsgr-29a

814 내지 1512 임'814 to 1512 '

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 2..697(B) Location: 2..697

(xi) 서열 13 :(xi) SEQ ID NO: 13:

(2) 서열 번호 : 14(2) SEQ ID NO: 14

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 232 아미노산(A) Sequence length: 232 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 14 :(xi) SEQ ID NO: 14

(2) 서열 번호 : 15(2) SEQ ID NO: 15

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 2157 염기쌍(A) Sequence length: 2157 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 2..886(B) Location: 2..886

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..2157(B) Location: 1..2157

(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 2157 은 도 5 29brc 의 814(D) Other information: / Note = '1 to 2157 is 814 of Fig. 5 29brc

내지 2971 임'To 2971 '

(xi) 서열 15 :(xi) SEQ ID NO: 15:

(2) 서열 번호 : 16(2) SEQ ID NO: 16

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 295 아미노산(A) Sequence length: 295 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 16 :(xi) SEQ ID NO: 16:

(2) 서열 번호 : 17(2) SEQ ID NO: 17

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 659 염기쌍(A) Sequence length: 659 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 2..658(B) Location: 2..658

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..659(B) Location: 1..659

(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 659 는 도 5 Hsgr - 21ar 의(D) Other information: / week = '1 to 659 is shown in Figure 5 Hsgr-21ar

1033 내지 1691 임'1033 to 1691 '

(xi) 서열 17 :(xi) SEQ ID NO: 17:

(2) 서열 번호 : 18(2) SEQ ID NO: 18

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 219 아미노산(A) Sequence length: 219 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 18 :(xi) SEQ ID NO: 18:

(2) 서열 번호 : 19(2) SEQ ID NO: 19

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 630 염기쌍(A) Sequence length: 630 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 3..629(B) Presence location: 3..629

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..630(B) Location: 1..630

(D) 기타 정보 : /주 = '1 내지 630 은 도 5 Hsgr - 21br(D) Other information: / week = '1 to 630 is Figure 5 Hsgr-21br

의 1062 내지 1691 임'Of 1062 to 1691 '

(xi) 서열 19 :(xi) SEQ ID NO: 19:

(2) 서열 번호 : 20(2) SEQ ID NO: 20

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 209 아미노산(A) Sequence length: 209 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 20 :(xi) SEQ ID NO: 20:

(2) 서열 번호 : 21(2) SEQ ID NO: 21

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 1075 염기쌍(A) Sequence length: 1075 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 2..445(B) Location: 2..445

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..1075(B) Location: 1..1075

(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 1075 는 도 5 Hsgr - 2 의(D) Other information: / week = '1 to 1075 is shown in Figure 5 Hsgr-2

1255 내지 2330 임'1255 to 2330 '

(xi) 서열 21 :(xi) SEQ ID NO: 21:

(2) 서열 번호 : 22(2) SEQ ID NO: 22

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 148 아미노산(A) Sequence length: 148 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 22 :(xi) SEQ ID NO: 22:

(2) 서열 번호 : 23(2) SEQ ID NO: 23

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 1059 염기쌍(A) Sequence length: 1059 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS(A) Characteristic symbols: CDS

(B) 존재위치 : 3..428(B) Location: 3..428

(ⅸ) 서열의 특징 :(Iii) Characteristic of the sequence:

(B) 존재위치 : 1..1059(B) Location: 1..1059

(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 1059 는 도 5 Hsgr - 9 의(D) Other information: / week = '1 to 1059 are shown in Figure 5 Hsgr-9

1272 내지 2330 임'1272 to 2330 '

(xi) 서열 23 :(xi) SEQ ID NO: 23

(2) 서열 번호 : 24(2) SEQ ID NO: 24

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 142 아미노산(A) Sequence length: 142 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질(Ii) Type of molecule: protein

(xi) 서열 24 :(xi) SEQ ID NO: 24:

(2) 서열 번호 : 25(2) SEQ ID NO: 25

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 10 아미노산(A) Sequence length: 10 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드(Ii) Type of molecule: peptide

(xi) 서열 25 :(xi) SEQ ID NO: 25:

(2) 서열 번호 : 26(2) SEQ ID NO: 26

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 10 아미노산(A) Sequence length: 10 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드(Ii) Type of molecule: peptide

(xi) 서열 26 :(xi) SEQ ID NO: 26:

(2) 서열 번호 : 27(2) SEQ ID NO: 27

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 10 아미노산(A) Sequence length: 10 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드(Ii) Type of molecule: peptide

(xi) 서열 27 :(xi) SEQ ID NO: 27:

(2) 서열 번호 : 28(2) SEQ ID NO: 28

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 10 아미노산(A) Sequence length: 10 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드(Ii) Type of molecule: peptide

(xi) 서열 28 :(xi) SEQ ID NO: 28:

(2) 서열 번호 : 29(2) SEQ ID NO: 29

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 14 아미노산(A) Sequence length: 14 amino acids

(B) 서열의 타입 : 아미노산(B) Type of sequence: amino acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드(Ii) Type of molecule: peptide

(xi) 서열 29 :(xi) SEQ ID NO: 29

(2) 서열 번호 : 30(2) SEQ ID NO: 30

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 21 염기쌍(A) Sequence length: 21 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(xi) 서열 30 :(xi) SEQ ID NO: 30:

(2) 서열 번호 : 31(2) SEQ ID NO: 31

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 36 염기쌍(A) Sequence length: 36 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(xi) 서열 31 :(xi) SEQ ID NO: 31

(2) 서열 번호 : 32(2) SEQ ID NO: 32

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 37 염기쌍(A) Sequence length: 37 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(xi) 서열 32 :(xi) SEQ ID NO: 32

(2) 서열 번호 : 33(2) SEQ ID NO: 33

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 60 염기쌍(A) Sequence length: 60 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(xi) 서열 33 :(xi) SEQ ID NO: 33:

(2) 서열 번호 : 34(2) SEQ ID NO: 34

(ⅰ) 서열의 특성 :(Iii) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 60 염기쌍(A) Sequence length: 60 base pairs

(B) 서열의 타입 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 토폴로지 : 선형(D) topology: linear

(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA(Ii) Type of molecule: cDNA

(xi) 서열 34 :(xi) SEQ ID NO: 34

Claims

도 2 또는 도 4(SEQ ID NO : 2 또는 4)에 나타나 있는 아미노산 서열을 가지며, 실험 시료에 존재하는 GDNF 와 반응하여 검출가능한 반응 산물을 생산함으로써 GDNF 가 존재함을 알 수 있게 하는 GDNFR 단백질을 함유하거나 그것으로 코팅한 고정상을 포함하는, 실험 시료내 GDNF 의 존재 여부를 분석하기 위한 검정 기구.A GDNFR protein having an amino acid sequence as shown in FIG. An assay instrument for analyzing the presence of GDNF in a test sample, the stationary phase containing or coated with it.

도 2 또는 도 4(SEQ ID NO : 2 또는 4)에 나타나 있는 아미노산 서열을 가지며, 실험 시료에 존재하는 GDNF 와 반응하여 검출가능한 반응 산물을 생산함으로써 GDNF 가 존재함을 알 수 있게 하는 GDNFR 단백질을 포함하는 검정 시약과 시료를 접촉시킴을 포함하는, 인체를 제외한 포유동물의 실험 시료내 GDNF 의 존재 여부를 분석하는 방법.A GDNFR protein having an amino acid sequence as shown in FIG. A method for analyzing the presence of GDNF in an experimental sample of a mammal, except human, comprising contacting a sample with an assay reagent comprising.