KR100398075B1 - Novel Pediococcus acidilactici and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 발효 식품에서 추출한 신규한 유산균 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici) 및 이를 포함하는 음식물 쓰레기 발효제에 관한 것이다.The present invention relates to a novel lactic acid bacterium pediococcus aciddiactici extracted from fermented foods and a food waste fermenting agent comprising the same.

본 발명의 유산균은 내염성 및 내열성이 우수하고, 특히 한국 음식 쓰레기 에서의 성장율이 우수하며, 본 발명의 유산균을 사용하여 음식물 쓰레기를 발효시킬 경우 초산과 같이 사료의 미감을 떨어뜨리는 물질을 생성하지 않으므로 가축에게 다량으로 섭취시킬 수 있어 매우 효과적이다.The lactic acid bacteria of the present invention is excellent in flame resistance and heat resistance, especially in the growth rate in Korean food waste, and when the food waste is fermented using the lactic acid bacteria of the present invention, it does not produce substances that degrade the taste of feed, such as acetic acid. It is very effective because it can be consumed in large quantities in livestock.

Description

신규한 유산균 페디오코커스 에시디락티시 및 이의 용도{Novel Pediococcus acidilactici and use thereof}Novel Pediococcus acidilactici and use thereof

본 발명은 신규한 유산균 및 이의 용도에 관한 것으로서, 좀 더 자세하게는 발효 식품에서 추출한 신규한 유산균 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 및 이를 음식물 쓰레기의 발효시 사용하는 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a novel lactic acid bacteria and its use, and more particularly, to a novel lactic acid bacteria Pediococcus acidilactici extracted from fermented foods and the use thereof in the fermentation of food waste.

도시화 및 외식 문화의 증대에 따라 생활 폐기물 중 음식물 쓰레기의 발생량은 1995년도 기준 15,075톤/일이며, 이는 전체 생활 쓰레기의 31.6%를 차지한다. 음식물 쓰레기는 일반적으로 매립, 소각, 퇴비화, 사료화의 방법에 의해 처리되는데 젖은 음식물 쓰레기의 소각 및 매립시에는 다이옥신 등이 방출될 뿐 아니라 침출수에 의한 지하수의 오염, 악취 등의 문제가 발생된다.As urbanization and the food culture increase, the amount of food waste generated from household waste is 15,075 tons / day as of 1995, accounting for 31.6% of the total household waste. Food wastes are generally treated by landfilling, incineration, composting, feed, etc. During incineration and landfilling of wet food wastes, not only dioxin is released but also problems such as groundwater contamination and odor by leachate.

상기의 문제점을 극복하고 보다 환경 친화적인 음식물 쓰레기의 처리 방법의 일환으로 최근에는 음식물 쓰레기를 퇴비화 또는 사료화하여 재활용하기 위한 다양한 연구 및 노력들이 진행되고 있다. 음식물 쓰레기를 원료로한 사료 제조시 주로 사용되는 방법은 발효이다. 발효는 크게 습식 및 건식으로 나눌 수 있는데 이는 살균 및 발효 온도에 따라 다시 고온 및 저온 발효로 나눌 수 있다. 고온 발효의 경우 멸균 등의 안전성은 확보되나 고온 유지에 따른 운전 비용이 높으며, 건식 발효의 경우 먼저 음식물 쓰레기의 물기를 제거하기 위한 과정이 선행됨에 따라 부가 비용이 소요되므로 경제적으로 효율적이지 못하며, 염분 농축에 따라 급수가 용이하지 못할 경우 가축들에게 염중독을 일으킬 수 있다. 반면, 습식 저온 발효는 특별한 장치가 필요하지 않아 안전할 뿐 아니라 발효 과정 이외의 별도 공정 및 부가 비용이 필요하지 않으므로 적정 발효가 이루어질 경우 가장 간편하고 경제적인 방법이라고 할 수 있다.In order to overcome the above problems and to treat food wastes that are more environmentally friendly, various researches and efforts have recently been conducted to compost or feed and recycle food wastes. Fermentation is the main method used in the manufacture of feed from food waste. Fermentation can be largely divided into wet and dry, which can be further divided into high temperature and low temperature fermentation depending on the sterilization and fermentation temperature. In the case of high temperature fermentation, the safety of sterilization is secured, but the operating cost is high due to the maintenance of high temperature.In the case of dry fermentation, it is not economically efficient because additional costs are required as the process for removing food waste is preceded first. Poor water supply due to concentration can cause salt poisoning in livestock. On the other hand, wet low temperature fermentation is safe because no special device is required, and since it does not require a separate process and additional costs other than the fermentation process, it can be said to be the simplest and most economical method when proper fermentation is made.

일반적으로 습식 발효사료 제조시 사용되는 발효 균주로는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 아스퍼질러스(Aspergillus spp.)와 같은 곰팡이, 및 바실러스(Bacillus spp.), 유산균 및 광합성 세균과 같은 세균 등이 있으며, 이들은 단독 또는 여러 종류가 혼합되어 사용된다. 바실러스의 경우 각종 분해효소를 많이 생산하기 때문에 음식물 쓰레기의 발효 균주로 많이 사용되고 있다. 국내에서 발생하는 음식물 쓰레기는 대부분 된장 등의 발효식품에서 유래하는 유익한 바실러스를 다량 함유하고 있으며, 이들은 내생포자 형성으로 내열성이 높아 가열처리에서 상당량 생존하나, 바실러스는 균주에 따라 설사유발 독소 등을 생산하기 때문에 균주 선발에 철저한 검토가 요구된다. 효소생산이 우수하고 안정성이 확보된 바실러스 균주의 첨가도 고려될 수 있으나 경제적으로 적합하지 않다. 사료의 미감 개선을 목적으로 가장 많이 이용되고 있는 효모의 경우 발효시간이 장기화되면 생성된 알콜이 아세토박터(Acetobacter spp.)와 같은 초산균에 의해 초산으로 전환되며, 곰팡이의 경우에도 초산 및 특유의 곰팡이 냄새 등으로 맛이 떨어짐으로써 가축의 사료 섭취량을 감소시키는 원인이 된다.Fermentation strains generally used in the manufacture of wet fermented feeds include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae , molds such as Aspergillus spp. , And Bacillus spp. , Lactic acid bacteria and photosynthesis. Bacteria, such as a bacterium, etc., These are used individually or in mixture of many types. Bacillus is used as a fermentation strain of food waste because it produces a lot of various enzymes. Most of the food waste generated in Korea contains beneficial Bacillus derived from fermented foods such as doenjang.They are highly resistant to heat due to the formation of endospores. Therefore, a thorough examination is required for the selection of strains. Addition of Bacillus strains with good enzyme production and stability can be considered, but it is not economically suitable. In yeast, which is most commonly used to improve the taste of feed, alcohol produced is converted to acetic acid by acetic acid bacteria such as Acetobacter spp. Decreased taste due to smell, etc., reduces the feed intake of livestock.

발효산물이 주로 유산인 호모형의 유산균은 제조된 사료의 가축 체내 이용률을 높일 뿐 아니라, 초산이나 이산화탄소 등의 가축의 섭취량을 저하시키는 물질을 생산하지 않는 장점을 갖는데, 발효 균주로 이용되기 위해서는 다양한 종류의 음식물 쓰레기에서 성장이 우수해야 하고, 가열처리 후 미생물 접종까지의 공정시간을 줄이기 위해 고온(50℃)에서도 내열성이 있는 등의 조건을 만족시켜야 한다. 그러나 종래에 사용되던 대한민국특허공보 제10-0191259호 및 제10-0268680호의 락토바실러스(Lactobacillus spp.) 유산균의 경우 내열성이 낮아 낮은 온도에서만 발효시켜야 하는 문제점이 있었다.Homo lactic acid bacteria, whose fermentation products are mainly lactic acid, have the advantage of not only increasing the utilization rate of livestock in the manufactured feed, but also producing a substance that reduces the intake of livestock such as acetic acid and carbon dioxide. The growth of food wastes should be excellent, and the conditions such as heat resistance at high temperature (50 ° C.) should be satisfied to reduce the process time from heat treatment to microbial inoculation. However, in the case of Lactobacillus spp . Lactic acid bacteria of Korean Patent Publication Nos. 10-0191259 and 10-0268680, which were used in the past, had low heat resistance and had to be fermented only at low temperatures.

따라서, 가축이 싫어하는 초산 등의 악취물질을 생성하지 않아 다량 섭취를 가능하게 하고, 음식물 쓰레기에서 성장이 우수할 뿐만 아니라 내열성이 높아 공정시간을 단축시킬 수 있는 발효 균주의 필요성이 대두되고 있다.Therefore, there is a need for a fermentation strain that can produce a large amount of odorous substances, such as acetic acid, which is disliked by livestock, and can not only grow in food waste, but also increase heat resistance and shorten processing time.

이에 본 연구자들은 섬유소 함량이 높고 젖갈 등이 많이 함유된 음식물 쓰레기 등에서도 성장이 우수할 뿐만 아니라 초산과 같은 악취물질을 생성하지 않고 공지 유산균에 비해 내열성이 우수한 신규 유산균 페디오코커스 에시디락티시를 발효 식품으로부터 분리하였으며 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.In this regard, the researchers found a novel lactic acid bacterium pediococcus edidilacci that is not only excellent in growth in food waste containing high fibrin content and lactate, but also does not produce odorous substances such as acetic acid and has better heat resistance than known lactic acid bacteria. It was isolated from fermented food and the present invention was completed based on this.

따라서, 본 발명의 목적은 발효를 통한 사료 제조시 가축이 싫어하는 초산 등의 악취물질을 생성하지 않아 다량 섭취를 가능하게 하고, 음식물 쓰레기에서 성장이 우수할 뿐만 아니라 내열성이 높아 공정시간을 단축시킬 수 있는 발효 균주를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to produce a large amount of odorous substances, such as acetic acid, which livestock do not like when producing a feed through fermentation, to enable a large amount of ingestion, not only excellent growth in food waste, but also high heat resistance can shorten the process time To provide a fermentation strain.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 유산균은 유산균 페디오코커스 에시디락티시(기탁번호 KFCC-11097) 이다.The lactic acid bacteria of the present invention for achieving the above object is a lactic acid bacterium pediococcus esididilacti (Accession No. KFCC-11097).

이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 페디오코커스 에시디락티시 유산균의 균주를 얻기 위하여 먼저, 염농도가 비교적 높은 여러 종류의 김치, 장아찌, 가축사료용 사일리지(silage)를 채취하여 이를 생리식염수에 희석시킨 후 유산균수 측정용 배지인 BCP 배지(Bromo-Cresol Purple agar ; 하기 표 1 조성 참조)를 이용하여 산생성이 우수한 균주들을 1차로 분리하였다. 1차로 분리된 균주들을 다시 염화나트륨을 함유한 MRS 액상배지(deMan, Rogosa Sharpe broth ; 하기 표 1 조성 참조)에 배양시킨 다음 성장율을 측정하여 성장율이 우수한 5균주 2-3, 3-7, 5-2, 11-9, 14-2 를 2차적으로 선발하였다.In order to obtain a strain of pediococcus ecidi lacticci lactic acid bacterium of the present invention, first, various kinds of kimchi, pickles, and silage (silage) having a relatively high salt concentration are collected and diluted in physiological saline, followed by a medium for measuring the number of lactic acid bacteria. Bacterial BCP medium (Bromo-Cresol Purple agar; see Table 1 composition below) using the acid-producing strain was isolated first. The first isolates were further cultured in MRS liquid medium containing sodium chloride (deMan, Rogosa Sharpe broth; see Table 1, below), and the growth rate was measured. 2, 11-9 and 14-2 were selected secondarily.

BCP 및 MRS 배지 조성BCP and MRS Medium Composition 배지badge 조성(1 ℓ기준)Composition (based on 1 L) BCPBCP 효모엑기스(yeast extract) 2.5g, 펩톤(peptone) 5g, 포도당(glucose) 1g, 트윈 80(Tween 80) 1g, 엘-시스틴(L-cysteine) 0.1g, 브로모크레졸퍼플(bromo-cresolpurple) 0.04gYeast extract 2.5g, peptone 5g, glucose 1g, Tween 80 1g, L-cysteine 0.1g, bromo-cresolpurple 0.04 g MRSMRS 펩톤(peptone) 10g, 육엑기스(beef extract) 10g, 효모엑기스(yeast extract) 5g, 포도당(glucose) 20g, 아세트산나트륨(sodium acetate) 5g, 트리암모늄 시트릭산(tri-ammonium citrate) 2g, 황화마그네슘(magnesium sulfate) 0.1g,황화망간(manganese sulfate) 0.05g, 인산 제2칼륨(dipotassium phosphate) 2g, 폴리소빅산 80 (polysorbate 80)1g,10 g of peptone, 10 g of bee extract, 5 g of yeast extract, 5 g of yeast extract, 20 g of glucose, 5 g of sodium acetate, 2 g of tri-ammonium citrate, magnesium sulfide 0.1 g of magnesium sulfate, 0.05 g of manganese sulfate, 2 g of dipotassium phosphate, 1 g of polysorbate 80,

다음으로 음식물 쓰레기 30중량%, 당밀 2중량%를 함유한 배지를 121℃, 1.5기압 조건에서 15분간 멸균시키고, 상기에서 2차 선발된 5균주들을 각각 접종하여 37℃, 150 rpm으로 각각 10, 20시간 동안 진탕배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 BCP 배지에 도말한 다음 균수를 측정하여 가장 성장이 우수한 최종 균주 5-2를 분리하여 본 발명의 페디오코커스 에시디락티시 유산균의 균주를 얻었다.Next, sterilize the medium containing 30% by weight of food waste and 2% by weight of molasses at 121 ° C. and 1.5 atm for 15 minutes, and inoculate the 5 strains selected secondly at 37 ° C. and 150 rpm. Shake culture for 20 hours. After the incubation was completed, the culture medium was plated in BCP medium, and the number of bacteria was measured to isolate the final strain 5-2 having the highest growth, thereby obtaining a strain of Pediococcus esididilaccytic lactic acid bacteria of the present invention.

본 발명의 페디오코커스 에시디락티시 유산균은 형태적으로 간균의 특성을 가지며, 생리학적으로는 내열성이 높고 통성 혐기성이며, 생화학적으로는 포도당을 발효하여 대부분 유산 만을 생성하는 호모 발효(homo fermentation)특성을 갖는다. 당이용성에 있어서, 본 발명의 균주는 엘-아라비노스, 리보스, 디-자일로스, 갈락토스, 디-글루코스, 디-프락토스, 디-만노스, 엔-아세틸 글루코스아민, 베타-젠티오비오스, 및 디-타가토스에는 양성반응을 보였고, 아미그달린, 알부틴, 락토스 및 글루코네이트에는 약양성반응을 보였는데, 특히, 람노스의 경우, 한국종균협회로 부터 분양받은 공지의 페디오코커스 에시디락티시(KCCM 11746)는 양성 반응을 보이는 반면 본 발명의 균주는 음성 반응을 보임을 확인함으로써, 본 발명의 균주가 신균주임을 확인하였고, 이를 1999년 6월 16일자로 한국종균협회 부설 한국 미생물 보존 센터(KCCM)에 기탁번호 KFCC-11097로 기탁하였다.Pediococcus ecidi lactic lactic acid bacterium of the present invention has the characteristics of bacillus in morphology, physiologically high heat resistance and permeability anaerobic, biochemical fermentation of glucose homogeneous (homo fermentation) to produce mostly lactic acid only Has characteristics. For sugar availability, the strains of the present invention are el-arabinose, ribose, di-xylose, galactose, di-glucose, di-fractose, di-mannose, en-acetyl glucoseamine, beta-gentiobis, and It was positive for di-tagatose and weakly positive for amigdaline, arbutin, lactose, and gluconate. Especially, in the case of rhamnose, the known pediococcus edidilacthyse, obtained from the Korean spawn association, KCCM 11746) confirmed that the strain of the present invention is a positive strain while showing a positive reaction, the strain of the present invention, which was confirmed on June 16, 1999 Korea microbial conservation center (KPA) KCCM) was deposited with the accession number KFCC-11097.

본 발명에 따른 균주의 내염성은 음식물 쓰레기 내의 염도가 매우 높기 때문에 중요한데 비교적 높은 내염성을 가진 것으로 알려진 공지의 페디오코커스 에시디락티시(KCCM 11746)와 비교 실험한 결과 유사한 내염성을 나타내었으며, 특히 5 중량%의 염화나트륨을 첨가한 경우에는 장시간 배양시에도 공지의 KCCM 11746보다높은 성장율을 나타냄을 확인함으로써 본 발명의 균주가 더욱 우수한 내염성을 가짐을 알 수 있었다.Flame resistance of the strain according to the present invention is important because the salinity in food waste is very high, compared with the known Pediococcus ecidi lactici (KCCM 11746) known to have a relatively high flame resistance showed similar flame resistance, especially 5 When the sodium chloride by weight was added, it was confirmed that the strain of the present invention had more excellent flame resistance by confirming that the growth rate was higher than that of the known KCCM 11746 even when cultured for a long time.

본 발명의 균주를 사용하여 음식 쓰레기를 발효시켜 사료를 제조하기 위하여 먼저 발효제를 제조하였다. 발효제는 본 발명의 균주를 멸균된 MRS 배양액에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 얻은 배양액을 종균으로 5 ℓ 자-퍼멘터(jar-fermentor) 상에서 3 ℓMRS 배양액에 접종하고 37℃에서 24시간 배양시켰다. 배양이 끝난 후 얻은 배양액을 밀기울, 미강, 질석이 1:1:1의 비율로 함유된 부형제와 1:1로 혼합하여 건조시킨 다음 분쇄하여 얻었다. 가스크로마토그래피를 이용하여 상기의 방법으로 얻은 발효제의 초산 함량을 분석한 결과 초산이 전혀 검출되지 않음을 확인할 수 있었다. 다음으로 열처리된 음식 쓰레기에 상기의 방법으로 제조된 발효제 0.1중량%를 첨가하고 발효시켜 사료를 얻었으며, 상기와 동일한 방법으로 초산 함량을 분석한 결과 초산이 전혀 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.Fermentation agent was first prepared to ferment food waste using the strain of the present invention to produce feed. The fermentation agent was inoculated into a sterile MRS culture medium and incubated for 24 hours at 37 ° C., and then the obtained culture solution was seeded with 3 L MRS culture medium on a 5 L jar-fermentor and subjected to 24 ° C. at 37 ° C. Time was incubated. After the incubation, the obtained culture solution was mixed with an excipient containing bran, rice bran, vermiculite in a ratio of 1: 1: 1, 1: 1, dried and ground. As a result of analyzing the acetic acid content of the fermentation agent obtained by the above method using gas chromatography, it was confirmed that acetic acid was not detected at all. Next, 0.1 wt% of fermentation agent prepared by the above method was added to the heat-treated food waste and fermented to obtain a feed. As a result of analyzing the acetic acid content in the same manner as above, it was confirmed that acetic acid was not detected at all.

결과적으로 본 발명의 균주는 음식 쓰레기의 발효를 통한 사료 제조시 가축이 싫어하는 초산 등의 악취 물질을 생성하지 않아 사료의 다량 섭취가 가능하고, 음식물 쓰레기에서 성장이 우수할 뿐만 아니라 내열성이 높아 공정 시간을 단축시킬 수 있는 장점을 가진다.As a result, the strain of the present invention does not produce odorous substances, such as acetic acid, which livestock dislike when producing feed through fermentation of food waste, and thus can consume a large amount of feed, and has excellent growth in food waste and high heat resistance. It has the advantage of shortening.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1Example 1

균주의 분리Isolation of Strains

본 균주는 김치, 장아찌, 및 가축먹이용 사일리지 등 여러 유산균 발효식품에서 얻은 시료를 멸균된 생리식염수(0.85중량% NaCl)로 적당히 희석한 후, 유산 등의 산 생성에 의해 배지색깔이 자주색에서 노란색으로 변하는 유산균수 측정용 배지인 BCP 배지를 이용하여 산 생성이 우수한 균주들을 1차적으로 분리하였다. 분리된 유산균을 3중량% 염화나트륨을 함유한 멸균 MRS 액상배지에 접종하여 37℃, 150 rpm으로 20시간 진탕배양 후 성장이 우수한 5 균주를 선별하였고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 미생물의 성장 정도는 분광계측기(Spectrophotometer; Kontron사, 모델번호 922)를 이용하여 600 nm에서 흡광도(O.D)를 측정하여 파악하였다.In this strain, samples from various fermented lactic acid bacteria fermented foods, such as kimchi, pickles, and livestock feeding silage, are diluted appropriately with sterile saline solution (0.85% by weight NaCl), and the medium color is changed from purple to yellow by production of acid such as lactic acid. Strains excellent in acid production were primarily isolated using BCP medium, which is a medium for measuring the number of lactic acid bacteria. The isolated lactic acid bacteria were inoculated into a sterile MRS liquid medium containing 3 wt% sodium chloride, and 5 strains having excellent growth after shaking for 20 hours at 37 ° C. and 150 rpm were selected, and the results are shown in Table 2 below. The growth of microorganisms was determined by measuring the absorbance (O.D) at 600 nm using a spectrophotometer (Kontron, Model No. 922).

선별된 5 균주들의 MRS 액상배지에서의 pH 변화 및 성장도 비교(평균±표준편차)Comparison of pH Change and Growth in MRS Liquid Medium of Selected 5 Strains (Mean ± Standard Deviation) 균주Strain pHpH 흡광도(성장도)Absorbance (Growth) 2-32-3 4.78±0.024.78 ± 0.02 1.75±0.081.75 ± 0.08 3-73-7 4.22±0.104.22 ± 0.10 2.12±0.122.12 ± 0.12 5-25-2 4.02±0.014.02 ± 0.01 3.01±0.023.01 ± 0.02 11-911-9 4.89±0.034.89 ± 0.03 2.71±0.022.71 ± 0.02 14-214-2 4.02±0.034.02 ± 0.03 2.77±0.022.77 ± 0.02

다음으로, 121℃, 1.5기압 조건에서 15분간 멸균시킨 MRS 액상배지에 상기에서 선발된 5균주를 접종한 다음 37℃, 150 rpm으로 20시간 동안 선배양하여 접종액을 제조하였다. 수거해 온 음식물 쓰레기 30중량%, 당밀 2중량%를 함유한 혼합물에 상기에서 제조된 접종액을 1.0%(v/v)로 접종하였고, 37℃, 150 rpm으로 10 시간 및 20시간 진탕배양 후 각 균주의 성장율을 측정하였다. 균주의 성장율은 배양시료를십진 희석법에 따라 희석 후 유산균 수 측정배지인 BCP 아가에 도말한 다음 37℃에서 24 시간 배양하고, 주변이 노란색으로 변하는 콜로니의 수를 측정하여 결정하였다.Next, the inoculation solution was prepared by inoculating the 5 strains selected above to the MRS liquid medium sterilized for 15 minutes at 121 ℃, 1.5 atm conditions and pre-cultured at 37 ℃, 150 rpm for 20 hours. The inoculation solution prepared above was inoculated at 1.0% (v / v) in a mixture containing 30% by weight of collected food waste and 2% by weight of molasses, and then shaken at 37 ° C. and 150 rpm for 10 hours and 20 hours. The growth rate of each strain was measured. The growth rate of the strain was determined by diluting the culture sample according to the decimal dilution method, smeared on BCP agar, a lactic acid bacteria counting medium, and incubated at 37 ° C for 24 hours, and measuring the number of colonies that turned yellow around.

균주들의 성장율 비교 (단위: CFU/㎖)Comparison of Growth Rates of Strains (Unit: CFU / mL) 균주Strain 10시간 배양10 hours incubation 20시간 배양20 hours incubation 2-32-3 2.7×103 2.7 × 10 3 2.7×103 2.7 × 10 3 3-73-7 1.0×103 1.0 × 10 3 1.2×103 1.2 × 10 3 5-25-2 5.7×105 5.7 × 10 5 3.0×107 3.0 × 10 7 11-911-9 2.5×104 2.5 × 10 4 2.7×105 2.7 × 10 5 14-214-2 2.1×103 2.1 × 10 3 2.7×104 2.7 × 10 4

상기 표 3에 나타난 바와 같이 가장 성장율이 우수한 5-2 균주를 최종 선발하였다.As shown in Table 3, the 5-2 strain having the best growth rate was finally selected.

실시예 2Example 2

균주의 균학적 성질 및 동정Mycological Properties and Identification of Strains

(1) 형태적 특징(1) Morphological features

상기 실시예 1에서 최종적으로 선발된 5-2 균주는 BCP 배지에서 37℃ 24시간 동안 배양한 후에 버기스 매뉴얼(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology; Kandler와 Weiss, 1986)에 따라 현미경 관찰, BCP 배지 상에서의 유산 생성여부, 그람염색 시험 등을 수행하였고 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.The 5-2 strain finally selected in Example 1 was incubated in BCP medium at 37 ° C. for 24 hours, followed by microscopy according to Burgy's Mannual of Systematic Bacteriology (Kandler and Weiss, 1986), on BCP medium. Whether lactic acid production, Gram stain test, etc. were performed and the results are shown in Table 4 below.

균주의 형태적 특징Morphological features of the strain 항목Item 5-25-2 KCCM 11746KCCM 11746 세포의 형상Cell shape 간균Bacillus 간균Bacillus 그람 염색Gram dyeing 양성positivity 양성positivity 산 생성Acid generation 양성positivity 양성positivity 운동성motility 없음none 없음none 포자형성능Spore forming ability 없음none 없음none 집락의 형상Colony 구형rectangle 구형rectangle 집락의 크기(직경)Colony size (diameter) 0.5-1.2 ㎜0.5-1.2 mm 0.5-1.2 ㎜0.5-1.2 mm 집락의 색조Hue of colony 흰색White 흰색White 집락의 표면Colony surface 매끈함Smoothness 매끈함Smoothness 집락의 융기Colony uplift 난형Ovoid 난형Ovoid

(2) 생리학적 성질 확인(2) Confirmation of Physiological Properties

온도가 5-2 균주 성장에 미치는 영향을 파악하기 위해 5-2 균주를 일반적인 유산균 배양온도인 37℃ 및 유산균 성장속도가 저하되는 45℃ 고온에서 6시간 및 12시간 동안 배양한 후 분광계측기로 600 nm에서 흡광도(O.D.)를 측정하여 균주별 성장도를 비교하였다. 결과는 하기 표 5에 나타내었다.In order to determine the effect of temperature on the growth of 5-2 strains, 5-2 strains were incubated for 6 hours and 12 hours at 37 ℃, which is a common lactic acid culture temperature, and 45 ℃ high temperature, where the growth rate of lactic acid bacteria was reduced, followed by 600 with a spectrometer. Absorbance (OD) was measured at nm to compare the growth of each strain. The results are shown in Table 5 below.

또한, 5-2 균주의 산소 요구성에 대한 특성을 파악하기 위해 호기적 조건 또는 5% 이산화탄소(CO2)가 공급되는 CO2배양기에서 6시간 및 12시간 동안 배양한 다음 그 성장도를 상기와 동일한 분광계측기를 이용한 방법으로 측정하였고 그 결과를 하기 하기 표 5에 나타내었다.In addition, in order to determine the characteristics of the oxygen requirements of the 5-2 strain incubated for 6 hours and 12 hours in aerobic conditions or CO 2 incubator supplied with 5% carbon dioxide (CO 2 ) and the growth rate is the same as above. It was measured by a method using a spectrometer and the results are shown in Table 5 below.

균주의 생리적 특징(O.D.평균값±표준편차)Physiological characteristics of the strain (O.D. mean ± standard deviation) 항목Item 5-25-2 KCCM 11746KCCM 11746 ATCC 0393ATCC 0393 6시간배양6 hours culture 12시간배양12 hours culture 6시간배양6 hours culture 12시간배양12 hours culture 6시간배양6 hours culture 12시간배양12 hours culture 온도*Temperature* 37℃37 ℃ 2.65±0.012.65 ± 0.01 2.79±0.022.79 ± 0.02 2.55±0.072.55 ± 0.07 2.74±0.102.74 ± 0.10 1.66±0.081.66 ± 0.08 2.35±0.012.35 ± 0.01 45℃45 ℃ 1.85±0.011.85 ± 0.01 2.55±0.032.55 ± 0.03 0.89±0.090.89 ± 0.09 2.01±0.132.01 ± 0.13 0.55±0.030.55 ± 0.03 1.75±0.051.75 ± 0.05 산소Oxygen 호기Exhalation 2.65±0.012.65 ± 0.01 2.79±0.022.79 ± 0.02 2.55±0.072.55 ± 0.07 2.74±0.102.74 ± 0.10 1.66±0.081.66 ± 0.08 2.35±0.012.35 ± 0.01 5% CO2 5% CO 2 2.15±0.012.15 ± 0.01 2.35±0.012.35 ± 0.01 2.10±0.012.10 ± 0.01 2.22±0.012.22 ± 0.01 1.78±0.011.78 ± 0.01 2.31±0.012.31 ± 0.01

*초기 0시간 배양시 O.D.값은 0.13±0.01로 배양시켰다.* O.D. value was incubated at 0.13 ± 0.01 during the initial 0 hour culture.

그 결과 본 발명의 균주인 5-2 균주가 페디오코커스 에시디락티시(KCCM 11746) 및 일반적인 유산균인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei; ATCC 0393)에 비하여 45℃ 조건에서 성장율이 우수하였으므로, 다른 균주에 비해서 내열성이 우수한 것을 확인하였다. 산소 요구성에 대한 실험 결과, 혐기 상태에서도 호기 조건에서와 거의 유사한 성장율을 나타내는 것으로 보아 5-2 균주는 통성혐기성 균임을 확인할 수 있었고, 따라서 혐기 상태인 음식 쓰레기 내에서도 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.As a result, the 5-2 strain of the present invention had a superior growth rate at 45 ° C compared to Pediococcus esidilactici (KCCM 11746) and Lactobacillus casei (ATCC 0393), which is a common lactic acid bacterium. It was confirmed that heat resistance was superior to the strain. As a result of the oxygen demand, it was confirmed that the growth rate was similar to that of the aerobic condition in the anaerobic condition, so that the 5-2 strain was aerobic bacteria, and thus, it could be effectively used in the anaerobic food waste.

(3) 생화학적 특징(3) biochemical characteristics

API 50 CHL 균 동정 키트(Bio Merieux Vitek, Inc.)를 이용하여 본 발명의 5-2 균주의 생화학적 특성을 파악하였고, 그 결과는 하기 표 6a 및 6b에 나타내었다.Biochemical properties of 5-2 strains of the present invention were determined using API 50 CHL bacterial identification kit (Bio Merieux Vitek, Inc.), and the results are shown in Tables 6a and 6b.

선발된 균주의 생화학적 특성Biochemical Properties of Selected Strains 시험항목Test Items 5-25-2 KCCM 11746KCCM 11746 글리세롤(Glycerol) Glycerol -- -- 에리쓰리톨(Erythritol) Erythritol -- -- 디-아라비노스(D-Arabinose) D-Arabinose -- -- 엘-아라비노스(L-Arabinose) L-Arabinose ++ ++ 리보스(Ribose) Ribose ++ ++ 디-자일로스(D-Xylose)D-Xylose ++ ++ 엘-자일로스(L-Xylose)L-Xylose -- -- 아도니톨(Adonitol)Adonitol -- -- 베타-메일-자일로사이드 (Methyl-xyloside)Beta-Mail-Xiloside (Methyl-xyloside) -- -- 갈락토스(Galactose)Galactose ++ ++ 디-글루코스(D-Glucose)D-Glucose ++ ++ 디-프락토스(D-Fructose)D-Fructose ++ ++ 디-만노스(D-Mannose)D-Mannose ++ ++ 엘-솔보스(L-Sorbose)L-Sorbose -- --

람노스(Rhamnose)Rhamnose -- ++ 둘시톨(Dulcitol)Dulcitol -- -- 이노시톨(Inositol)Inositol -- -- 만니톨(Mannitol)Mannitol -- -- 솔비톨(Sorbitol)Sorbitol -- -- 알파-메틸-디-만노사이드(Methyl-D-mannoside)Methyl-D-mannoside -- -- 알파-메틸-디-글루코사이드(Methyl-D-glucoside)Methyl-D-glucoside -- -- 엔-아세틸 글루코스아민(N Acetyl glucosamine)N Acetyl glucosamine ++ ++ 아미그달린(Amygdaline)Amygdaline +w+ w +w+ w 알부틴(Arbutine)Arbutine +w+ w ++ 에스컬린(Esculine)Esculline ++ ++ 살리신(Salicine)Salicine ++ ++ 셀로비오스(Cellobiose)Cellobiose ++ ++ 말토스(Maltose)Maltose -- -- 락토스(Lactose)Lactose +w+ w +w+ w 멜리비오스(Melibiose)Melibiose -- -- 사카로스(Saccharose)Saccharose -- --- 트레할로스(Trehalose)Trehalose -- -- 이눌린(Inuline)Inuline -- -- 멜레지토스(Melezitose)Melezitose -- -- 디-라피노스(D-Raffinose)D-Raffinose -- -- 아미돈(Amidon)Amidon -- -- 글라이코겐(Glycogen)Glycogen -- -- 자일리톨(Xylitol)Xylitol -- -- 베타-젠티오비오스(β-Gentiobiose)Beta-Gentiobiose ++ ++ 디-튜라노스(D-Turanose)D-Turanose -- -- 디-라이조스(D-Lyxose)D-Lyxose -- -- 디-타가토스(D-Tagatose)D-Tagatose ++ ++ 디-퓨코스(D-Fucose)D-Fucose -- -- 엘-퓨코스(L-Fucose)L-Fucose -- -- 디-아라비톨(D-Arabitol)D-Arabitol -- -- 엘-아라비톨(L-Arabitol)L-Arabitol -- -- 글루코네이트(Gluconate)Gluconate +w+ w +w+ w 2-아세토-글루코네이트(2 aceto-gluconate)2-aceto-gluconate -- --

+: 양성반응, -: 음성반응, +w: 약양성반응+: Positive,-: negative, + w: weak positive

상기 표 4, 5, 6a 및 6b에 나타난 내용에 따라 상기 유산균 5-2는 99.4%의 신뢰도로 페디오코커스 에시디락티시로 동정되었다. 이때 동정의 정확성과 기존의 균주와의 차이를 확인하기 위해 한국종균협회로부터 분양받은 페디오코커스 에시디락티시(KCCM 11746)를 대조구로 하여 비교한 결과 대부분의 당 이용 및 발효는 동일하였으나 대조구인 KCCM 11746 균주와는 달리 람노스(rhamnose)를 발효시키지 않음을 확인함으로써 신규한 균주인 것으로 확인되었다.According to the contents shown in Tables 4, 5, 6a, and 6b, the lactic acid bacterium 5-2 was identified as pediococcus esididilacti with a reliability of 99.4%. At this time, in order to confirm the accuracy of the identification and the difference between the existing strains, Pediococcus esididilactisi (KCCM 11746), which was distributed from the Korean spawn association, was compared. Unlike the KCCM 11746 strain, it was confirmed that it is a novel strain by confirming that it does not ferment rhamnose.

실시예 3Example 3

내염성 확인Flameproof confirmation

본 발명의 페디오코커스 에시디락티시를 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 염화 나트륨을 각각 0, 5, 7, 8, 또는 9중량%로 접종한 MRS 배지 100 ㎖에 1.0 ×103CFU/㎖ 농도로 새로 접종하고 6시간, 12시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 배지 1 ㎖을 채취한 다음 분광계측기(Kontron사 제품, 모델번호 922)를 사용하여 600 nm에서 흡광도(O.D)를 측정하였으며 이를 기준으로 각기 다른 염 농도에서의 세포 성장율을 비교하였다.After inoculating Pediococcus esididilacci of the present invention into MRS medium and incubating overnight at 37 ° C., 1.0 to 100 ml of MRS medium inoculated with sodium chloride at 0, 5, 7, 8, or 9% by weight, respectively. Freshly inoculated at a concentration of 10 3 CFU / mL and incubated for 6 hours and 12 hours. After incubation, 1 ml of the medium was collected, and then the absorbance (OD) was measured at 600 nm using a spectrometer (Kontron, Model No. 922). Based on this, cell growth rates at different salt concentrations were compared.

비교 균주로는 내염성을 갖는 것으로 알려진 페디오코커스 에시디락티시 (KCCM 11746; 한국종균협회)를 사용하였고, 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.As a comparative strain, Pediococcus esididilacti (KCCM 11746; Korean spawn association) known to have flame resistance was used, and the results are shown in Table 7 below.

내염성 비교 (단위: O.D.)Flameproof Comparison (Unit: O.D.) 균주Strain 본 발명의 균주(5-2)Strain of the Invention (5-2) 비교균주(KCCM 11746)Comparative strain (KCCM 11746) NaCl첨가량(w/v)NaCl addition amount (w / v) 0시간 배양0 hours incubation 6시간 배양6 hours incubation 12시간 배양12 hours incubation 0시간 배양0 hours incubation 6시간 배양6 hours incubation 12시간 배양12 hours incubation 00 0.14±0.010.14 ± 0.01 2.65±0.012.65 ± 0.01 2.79±0.002.79 ± 0.00 0.13±0.000.13 ± 0.00 2.55±0.112.55 ± 0.11 2.74±0.022.74 ± 0.02 55 0.15±0.030.15 ± 0.03 1.82±0.051.82 ± 0.05 2.39±0.012.39 ± 0.01 0.14±0.020.14 ± 0.02 0.79±0.030.79 ± 0.03 2.07±0.072.07 ± 0.07 77 0.15±0.030.15 ± 0.03 0.18±0.000.18 ± 0.00 0.25±0.010.25 ± 0.01 0.15±0.030.15 ± 0.03 0.20±0.000.20 ± 0.00 0.24±0.010.24 ± 0.01 88 0.13±0.050.13 ± 0.05 0.14±0.000.14 ± 0.00 0.15±0.010.15 ± 0.01 0.17±0.050.17 ± 0.05 0.17±0.010.17 ± 0.01 0.17±0.010.17 ± 0.01 99 0.12±0.040.12 ± 0.04 0.13±0.000.13 ± 0.00 0.13±0.000.13 ± 0.00 0.12±0.010.12 ± 0.01 0.16±0.000.16 ± 0.00 0.16±0.010.16 ± 0.01

상기 표 7에 나타난 바와 같이 비교 대조군과 비교하여 본 발명 균주는 유사한 성장율를 나타내었으며, 특히 5중량%의 염화나트륨을 첨가한 경우에는 장시간의 배양에도 보다 높은 성장율을 나타냄을 확인하였다. 결과적으로 본 발명의 페디오코커스 에시디락티시가 우수한 내염성을 가짐을 확인하였다.As shown in Table 7, the strain of the present invention showed a similar growth rate compared to the comparative control, and especially when 5% by weight of sodium chloride was added, it was confirmed that the growth rate was higher even for a long time of culture. As a result, it was confirmed that the pediococcus esididilacti of the present invention has excellent flame resistance.

실시예 4Example 4

음식 쓰레기의 발효를 통한 사료의 제조Preparation of feed through fermentation of food waste

먼저 신규 유산균 함유 발효제를 만들기 위해 MRS 아가에 보존된 5-2 균주를 MRS 배양액 200 ㎖에 접종하여 24시간 동안 37℃에서 교반 배양하였다. 배양 후 얻어진 배양액을 3 ℓ의 MRS 배양액에 접종하고 5 ℓ자-퍼멘터(jar-fermentor)를 이용하여 24시간 동안 37℃에서 교반 배양한 후 얻어진 배양액을 밀기울, 미강, 질석을 1:1:1의 비율로 함유하는 부형제와 1:1로 혼합하여 건조시키고 분쇄하여 3 ㎏의 발효제를 얻었다.First, 5-2 strains preserved in MRS agar were inoculated into 200 ml of MRS culture to make a novel lactic acid-containing fermentation agent, followed by incubation at 37 ° C. for 24 hours. After incubation, the obtained culture solution was inoculated into 3 L MRS culture solution and stirred culture at 37 ° C. for 24 hours using a 5 L jar-fermentor. The obtained culture solution was bran, rice bran and vermiculite 1: 1: The excipients contained in the ratio of 1 were mixed 1: 1, dried, and ground to obtain 3 kg of fermentation agent.

다음으로 아파트 및 상가에서 수거한 음식 쓰레기의 이물질을 선별하고 분쇄한 다음, 1차 탱크에서 밀기울, 당밀 등을 혼합하여 고열증기관을 통과시켜 살균시켰다. 고열증기관 통과 후 2차 탱크에서 밀기울, 옥분 등을 첨가하여 영양 요구량을 맞춘 다음 45∼50℃로 냉각시켜 최종적으로 사용될 음식 쓰레기를 준비하였다. 준비된 음식 쓰레기에 상기의 방법으로 얻은 발효제를 0.1중량% 첨가하고 30분 간격으로 3분간 교반시키면서 24시간 동안 발효시켜 사료를 얻었다. 발효시킨 사료는 돼지에게 액상사료로 자동급여시켰다.Next, foreign matters of food waste collected from apartments and shopping malls were sorted and pulverized, and then mixed with bran and molasses in a primary tank and sterilized by passing through a hyperthermia engine. After passing through the hot steam engine, the secondary tank was added with bran and jade to meet the nutritional requirements, and then cooled to 45-50 ° C. to finally prepare food waste for use. 0.1 wt% of the fermentation agent obtained by the above method was added to the prepared food waste and fermented for 24 hours while stirring for 3 minutes at 30 minutes intervals to obtain a feed. Fermented feed was automatically fed to the pig as a liquid feed.

실시예 5Example 5

음식쓰레기 발효 사료의 안전성 및 돼지의 사료 섭취량 비교Comparison of Food Waste Fermentation Safety and Feed Intake of Pigs

상기 실시예 4에서 제조한 발효 사료의 안전성을 확인하기 위하여 유해 균수 및 중금속 함량을 검사하였고, 또한 초산 함량을 가스크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.In order to confirm the safety of the fermented feed prepared in Example 4, harmful bacteria and heavy metal content were examined, and acetic acid content was analyzed using gas chromatography.

사료 섭취량 비교를 위해 본 발명의 유산균을 이용하여 제조한 발효사료와 다른 유산균, 효모, 또는 곰팡이가 함유되어 있는 다른 발효제로 발효시킨 사료를 각각 평균체중이 44.8 kg인 육성돈 40마리에게 77일간 비육하여 사료 섭취량을 파악하였다.For comparison of feed intake, fermented feed prepared using lactic acid bacteria of the present invention and other fermented feeds containing other lactic acid bacteria, yeast, or mold were fermented to 40 pigs with an average weight of 44.8 kg each for 77 days. Feed intake was identified.

평판배지법과 증균배양법을 사용하여 대장균, 황색포도상구균, 살모넬라, 및 리스테리아 등의 존재 유무를 측정한 결과 유해미생물이 검출되지 않음을 확인하였으며, 중금속 중 카드뮴과 납 함량을 측정한 결과 전혀 검출되지 않음을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 사료에서 초산이 검출되지 않음을 확인하였다.As a result of measuring the presence of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, and Listeria by using the plate culture method and the enrichment method, it was confirmed that no harmful microorganisms were detected, and the contents of cadmium and lead in the heavy metals were not detected at all. It was confirmed. In addition, it was confirmed that acetic acid was not detected in the feed according to the present invention.

사료 섭취량은 본 발명의 유산균으로 발효시킨 사료구의 경우 일당사료섭취량이 6.85 ㎏인 반면 다른 발효제로 발효시킨 사료구는 일당 사료섭취량이 6.32kg으로 나타남으로써, 본 발명의 유산균을 사용하여 제조한 발효사료가 돼지에게 기호도가 우수한 것을 확인하였다.The feed intake of the feed fermented with the lactic acid bacteria of the present invention is 6.85 ㎏ daily feed intake of the other fermented feed, the daily feed intake of 6.32 kg, the fermented feed prepared using the lactic acid bacteria of the present invention Pigs were confirmed to have excellent palatability.

상기 실시예에서 본 바와 같이, 본 발명의 신규한 유산균은 다른 유산균에 비해 내염성 및 내열성이 우수하고 한국에서 발생되는 음식물 쓰레기에서 성장율이 우수하여 음식물 쓰레기를 사료화하기 위한 발효균주로 적합하다. 또한, 음식물 쓰레기의 발효시 사료의 미감을 떨어뜨리는 초산과 같은 물질을 생산하지 않는 호모형 유산균이므로, 가축의 다량 섭취가 가능하여 매우 효과적이다. 뿐만 아니라, 여름철 고온다습한 기후시 사료의 보관 중에 첨가하면 발효사료내 유해균의 증식 및 이상발효를 억제함으로써 보존성을 높일 수 있는 효과가 있다.As seen in the above embodiment, the novel lactic acid bacteria of the present invention is excellent in flame resistance and heat resistance compared to other lactic acid bacteria and has a high growth rate in food waste generated in Korea is suitable as a fermentation strain for feed food waste. In addition, it is a homo lactic acid bacteria that do not produce substances such as acetic acid, which lowers the taste of feed when fermentation of food waste, it is possible to eat a large amount of livestock is very effective. In addition, when added during the storage of the feed during the summer hot and humid climate has the effect of increasing the preservation by inhibiting the growth and abnormal fermentation of harmful bacteria in fermented feed.

Claims (4)

유산균 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici; 기탁번호 KFCC-11097).Lactobacillus pediococcus acididiactic ( Pediococcus acidilactici ; accession number KFCC-11097). 제1항의 유산균을 포함하는 음식물 쓰레기 발효제.Food waste fermentation agent containing the lactic acid bacteria of claim 1. 제2항의 음식물 쓰레기 발효제를 포함하는 사료.Feed comprising the food waste fermentation agent of claim 2. 제3항에 있어서, 상기 사료는 양돈 사료로 사용되는 것을 특징으로 하는 사료.4. The feed of claim 3, wherein the feed is used as a pig feed.
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