KR100396986B1 - 누에분말로부터 α-글루코시다제 억제물질을 제조하는 방법 - Google Patents

누에분말로부터 α-글루코시다제 억제물질을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 누에분말로부터 식후 혈당상승에 대한 억제효과가 탁월한 혈당강하 물질의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 누에분말로부터 혈당강하 물질의 제조방법에 의하면 누에분말을 에탄올로 추출한 후 여과하고, 계속하여 일련의 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 혈당강하 작용이 탁월한 물질인 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin)을 분리한다. 본 발명의 제조방법에 의해 분리된 혈당강하 물질은 종래의 당뇨 치료제인 아카보즈(acarbose)와 거의 동일한 혈당강하 활성을 갖고 잇는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명에 의해 제조된 물질을 당뇨병 치료제로 개발하는 경우 농가의 소득증대 및 국민건강의 증진에 기여할 것으로 기대된다.

Description

누에분말로부터 α-글루코시다제 억제물질을 제조하는 방법{A process for preparing α-glycosidase inhibitor derived from powdery silkworm}
본 발명은 누에분말로부터 α-글리코시다제(glycosidase) 억제물질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 5령 3일 누에분말을 동결건조하고 50% 에탄올 추출과 일련의 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 실시하여, α-글리코시다제(glycosidase) 억제작용이 탁월한 물질인 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
건강인들의 인슐린 분비 양상은 포도당 부하시 처음에 빠른 속도로 인슐린이 혈액중으로 유리된 후, 서서히 한시간에 걸쳐서 인슐린이 유리되는 양상을 띠는 반면, 당뇨 환자의 치료 목적으로 투여되는 인슐린이나 인슐린 분비 촉진 약물들은 이러한 정상적인 인슐린 분비 반응을 흉내내는데 한계가 있어, 약물 부작용으로 저혈당과 고인슐린증 등이 종종 나타나는 문제를 안고 있다.
이와 같은 식후 상승된 혈당과 혈액 중 인슐린 함량간에 불일치 문제를 해결할 수 있는 방법으로 이제까지는 약물투여 시간의 조절, 새로운 약물 투여경로의 개발 및 약물 흡수를 촉진시키는 새로운 제형의 개발 등 수많은 방법들이 시도되어 왔으나 아직까지 만족할 만한 결과를 얻지 못하고 있다.
또한, 식후 상승되는 고혈당 문제를 해결할 수 있는 여러 방법들이 개발되는 과정 중, 소장에서 포도당의 흡수를 지연시키는 활성을 나타내는 α-글리코시다제 억제물질을 이용하는 방법이 강구되었고, 수많은 동물 및 임상시험을 통해 그 약효가 입증되기에 이르렀다. 이와같이 소장내 α-글리코시다제 억제물질을 투여하게 되면, 식후 급격히 상승하는 혈당을 조절할 수 있고, 당뇨환자에서 흔히 보여지는 큰 폭의 혈당상승 및 저하 현상을 해결할 수 있음을 물론, 불필요한 인슐린의 유리도 억제되어 고인슐린증으로 인한 다른 순환계 합병증의 발병을 예방하는데 일조 할 수 있다.
한편, 본 발명자들은 누에분말이 식후 혈당상승과 커다란 억제효과가 있으며, 이는 기존의 당뇨치료제인 아카보즈(acarbose)와 마찬가지로 소장에서 탄수화물 소화에 관여하는 효소인 α-글루코시다제 억제작용에 기인한다는 사실을 밝힌 바 있다(특허등록번호 특허 제151731호)
그러나, 누에분말 자체의 어떤 성분이 α-글리코시다제의 억제물질로서 작용하는 지는 알려져 있지 않다.
이에 본 발명자들은 누에분말로부터 α-글리코시다제 억제물질을 제조하고자 예의 노력한 결과 α-글리코시다제 억제작용이 탁월한 1-디옥시노지리마이신을 단독으로 분리할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 누에분말로부터 α-글리코시다제 억제물질인 1-디옥시노지리마이신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 방법에 의해 제조된 1-디옥시노지리마신의 사진이다.
도 2는 스트렙토조토신(STZ)에 의해 유발된 고혈당 흰쥐에서의 혈당강하효과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 우리나라 당뇨병 환자의 84%가 인슐린 비의존형 당뇨병이라는 사실로부터 인슐린 요법보다는 생리활성이 높은 천연물부터 혈당강하 물질을 분리하고자 하는 것에서 출발하였다. 종래 이러한 천연물로부터 혈당강하물질을 분리하는 방법으로, 예를 들면, 대한민국공개 제 1999-54967호(1999. 7. 15)에 누에오줌으로부터 α-글리코시다제 억제물질인 1-디옥시노지리마이신, 파고민 및 1,4-다이디옥시-1,4-이미노-D-아라비노톨을 동시에 분리하는 방법이 개시되어 있는데, 이 방법은 누에오줌이 누에로부터 대사되어 나온 물질이기 때문에 누에분말보다 그 안에 함유되어 있는 화합물이 단순함에도 불구하고, 각각의 α-글리코시다제 억제물질이 개별적으로 분리되지 않고 혼합물의 형태로 분리되기 때문에, 본 발명자들은 누에오줌보다 많은 화합물을 함유하고 있는 누에분말로부터 α-글리코시다제 억제물질을 단독으로 분리하고자 하였고, 따라서, α-글리코시다제 억제물질 중 1-디옥시노지리마이신을 단독으로 분리하는 성공하였다.
본 발명에 따라 1-디옥시노지리마이신을 누에분말로부터 분리하는 방법은
(1) 5령 3일 냉동건조 누에를 동결건조하여 분말상태로 만든 후, 여기에 50% 에탄올을 가하여 추출액을 얻는 단계;
(2) 상기 추출액을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 0.5N NH4OH로 용출한 다음, 이 용출액을 농축시켜 농축물을 얻는 단계;
(3) 상기 농축물을 물에 녹인 다음, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 음이온 수지의 약 10배 부피의 물로 용출시킨 다음, 이 용출액을 농축시켜 농축물을 얻는 단계;
(4) 상기 농축물을 물에 녹인 다음, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 양이온 수지의 약 5배 부피의 물로 용출시켜 5개의 분획을 얻고, 0.5N NH4OH로 용출시켜 1개의 분획을 얻는 단계;
(5) 상기 6개의 분획중 2번째 분획물을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 순수한 1-디옥시노지리마이신 분획을 얻는 단계; 및
(6) 상기 1-디옥시노지리마이신 분획을 메탄올 침전시켜 1-디옥시노지리마이신 결정을 얻는 단계
로 이루어짐을 특징으로 한다.
상기 각 단계를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(1) 5령 3일 냉동건조 누에를 동결건조하여 분말상태로 만든 후, 여기에 50% 에탄올을 가하여 추출액을 얻는 단계.
50% 에탄올을 사용하여 추출하는 것은, 50% 에탄올이 1-디옥시노지리마이신을 포함한 알카로이드(alkaloids)와 아미노산만을 추출할 수 있기 때문이다. 추출방법은 초음파로 약 2시간 동안 5회에 걸쳐 추출한 다음, 셀라이트(celite)로 여과한다.
(2) 상기 추출액을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 0.5N NH 4 OH로 용출한 다음, 이 용출액을 농축시켜 농축물을 얻는 단계.
양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 Amberlyst 15 수지(NH4 +형, 1.2ℓ)를 사용하여, 이온교환을 통하여 추출물내에 함유된 화합물이 수지상에 접착되도록 한 다음, 0.5N NH4OH(12ℓ)로 용출하여 농축시킨 다음 무게를 측정한다. 이러한 공정에 의해 음이온 화합물이 수지에 부착이 된다.
(3) 상기 농축물을 물에 녹인 다음, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 음이온 수지의 약 10배 부피의 물로 용출시킨 다음, 이 용출액을 농축시켜 농축물을 얻는 단계.
음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 Dowex 1×2 수지(OH-형)를 사용한다. 이 단계에 의해 알카로이드 이외에 다른 아미노산 성분들이 제거된다.
(4) 상기 농축물을 물에 녹인 다음, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 양이온 수지의 약 5배 부피의 물로 용출시켜 5개의 분획을 얻고, 0.5N NH 4 OH로 용출시켜 1개의 분획을 얻는 단계.
양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 Amberlyst 15 수지(NH4 +형, 2.7×85㎝)을 사용한다.
(5) 상기 6개의 분획중 2번째 분획물을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 순수한 1-디옥시노지리마이신 분획을 얻는 단계.
음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 Dowex 1×2 수지(OH-형)를 사용한다.
(6) 상기 1-디옥시노지리마이신 분획은 메탄올 침전시켜 1-디옥시노지리마이신 결정을 얻는 단계.
상기한 방법에 의해 얻어진 1-디옥시노지리마이신은 기능성 식품 등의 건강보조식품으로서 뿐만 아니라 당뇨병 환자들이 손쉽게 복용하여 혈당을 조절할 수 있는 의약품으로 사용될 수 있어 양잠산물의 소비층을 확대할 수 있고, 양잠산물의 새로운 용도 개발, 농가소득 향상 및 국민 건강 증진에 기여할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들예로만 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 누에분말로부터 1-디옥시노지미마이신의 분리
5령 3일 누에를 동결건조하여 1㎏ 분말상태로 만든 후, 여기에 50% 에탄올을 가하였다. 이어 Amberlyst 15(NH4 +)에 추출물을 통과시키고, 0.5N NH4OH로 유출시켜농축시키고, Dowex 1X2(OH-)에 농축물을 통과시키고 50% 에탄올로 유출시켜 농축시키고 Amberlite CG-50(NH4 +)를 H2O와 0.5N NH4OH로 유출시켜 농축시키고, Dowex 1X2(OH-)를 H2O로 용출 이 분획을 감압농축하고 메탄올을 가하여 백색결정인 화합물3.0g(수율 0.3%)을 얻었다.
화합물의 특성은 다음과 같다.
Rf: 0.42
m.p.: 200℃
분자량: 163
1H-NMR(500MHz, D2O): δ 2.52(dd, 1H,J 1ax,1eq =12.1,J 1ax,2 =10.9Hz H1ax), 2.61(ddd, 1H,J 1ax, 1eq =12.1,J 1eq,2 =5.1Hz, H1eq), 3.3(t, 1H,J 3,4 =J 4,5 =9.1Hz, H4), 3.38(t, 1H,J 2,3 =J 3,4 =9.1Hz, H3), 3.56(ddd, 1H,J 1ax,2 =10.9,J 1eq,2 =5.1,J 2,3 =9.1Hz, H2), 3.7(dd, 1H,J 5,6ax =6.2,J 6ax,6eq =11.3Hz, H6ax), 3.84(dd,J 5,6eq =2.9,J 6ax,6eq =11.3Hz, H6eq)
13C-NMR(125MHz, D2O): δ51.3(C1), 63.1(C5), 64.7(C6), 73.5(C2), 74.1(C4), 81.3(C3)
FABMS(NBA matrix) m/z 164(M+1) : Anal(C6H13NO4) C,H,N
상기한 화합물의 특성과, 문헌에 기재된 1-디옥시노지리마이신의 특성이 일치하였고, Asano교수(일본 Hokuriku 대학)로부터 얻은 1-디옥시노지리마이신의 표준물과 TLC 상에서 Rf값을 비교한 결과, 이들이 일치하였으므로, 상기한 방법에 의해 얻어진 백색결정의 화합물은 하기 일반식의 1-디옥시노지리마이신으로 동정되었다.
<시험예 1>
(1)실험동물 및 동물실험
삼성서울병원 실험동물센터에서 사육중인 SD계 랫트(male, 160±10 g)를 사사하여 동물사육실에서 2주 동안 예비사육한 다음, 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ) 65mg/kg을 iv하여 당뇨를 유발시킨 후 3일간 혈당을 측정하여 350mg/㎗ 이상인 랫트만 실험에 사용하였다. 동물실험에서 실험그룹은 6마리씩 4개의 군으로 나누에 실험용 대조그룹(Control group)과 유발군(STZ)은 증류수로 섭식시키고, 항당뇨 효과를 구명하기 위하여 실시예 1의 1-디옥시노지리마이신(DNJ) 20mg을, 혈당강하제로서 현재 시판 중인 인슐린 비의존형(type II) 당뇨병 치료제인 아카보즈을 40mg이 되도록 물에 녹여 복강 투여하여 12일간 혈당강하 효과를 분석하여 항당뇨 효과를 평가하였다. 본 실험에서 사용된 시약은 모두 미국 시그마사 제품이다.
(2) 조제사료의 조성
본 실험에 사용한 사료조성은 탄수화물 59.0%(α-corn starch : 44.0% + sucrose 15.0%), 단백질 18.0%(sodium-free casein), 지질 15.0% (lard : 10.0% + corn oil : 5.0%), 비타민과 무기질(AIN-76 mixture) 각각 1.0%, 3.5%, 그리고 섬유질 3.0%, DL-메티오닌 0.3%, 염화콜린(choline chloride) 0.2%를 첨가하였다.
(3) 실험방법
① 실험적 당뇨의 유발
당뇨 유발제로서 널리 사용되고 있는 STZ를 사용하여 SD계 랫트에 65mg/kg BW가 되도록 0.1M 시트르산나트륨 완충용액(pH 4.3)에 녹여서 꼬리정맥을 통하여 주사하였다. 당뇨 유발된 랫트의 꼬리정맥에서 3일 후 혈액을 채취하여 혈당량을 분석하였다. 4일째 혈당량이 350mg/dl 이상인 랫트만을 사용하여 실시예 1의 DNJ 20mg/kg를 섭식시켜 11일 동안 혈당량을 분석하여 비교??평가하였고, 다시 DNJ를 투여하지 않고 3일간 혈당변화를 관찰하여 약물에 의한 혈당강하효과를 관찰하였다. 대조약물로 시판 당뇨병 치료제인 아카보즈 40mg/kg을 섭식시켜 혈당량(glucose content)을 분석하여 비교??평가하였다.
② 혈당(blood glucose)의 측정
꼬리 정맥에서 채혈한 혈액에서 분리한 혈청중의 글루코오스 함량은 효소법에 의한 키트시약(Sigma, Co., USA)으로 측정하였다. 먼저 혈청 및 표준용액으로서 글루코오스 표준액(400㎎/dl)을 각각 5㎕씩 넣고, 여기에 발색시약을 1.0㎖씩 넣은 다음, 잘 혼합하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 증류수에 발색시약을 넣은 blank를 대조그룹으로 하여 505nm에서 흡광도를 측정하여 하기식에 따라 글루코오스 함량을 산출하였다.
Glucose함량(mg/dl serum)=(OD검체/OD표준용액)×400*
(식중, *는 글루코오스 표준용액의 농도를 의미한다.)
그 결과는 하기 표 1 및 도 2와 같다.
아카보즈와 DNJ 투여일수에 따른 혈당강하효과 비교(%)
투여일수 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
아카보즈 11.6 11.1 26.2 27.8 35.2 41.5 57.6 60.4 61.6 59.4 54.8
DNJ 22.7 12.4 16.1 47.1 49.9 60.0 66.3 64.0 60.9 69.6 51.6
표 1로부터, 대조약물인 아카보즈는 투여 7일째부터 57.6%의 탁월한 혈당강하 효과를 보이지만, DNJ는 투여 4일부터 47.1%의 효과를 보이고, 투여기간 동안 계속하여 탁월한 혈당강하효과를 보인다는 것을 알 수 있다.
또한, 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, STZ로 유발시킨 고혈당 흰쥐군의 혈당은 실험기간 내내 450mg/dl이상을 유지하지만, 누에분말로부터 분리된 DNJ 투여군의 혈당함량은 대조그룹 대비 4일부터 47.1%의 유의적인 효과를 나타내기 시작하여 투여 11일째의 혈당강하효과는 51.6%가 나타났고, 투여하지 않은 3일간은 혈당은 서서히 STZ유발군의 혈당으로 증가되었다. 대조약물로 투여된 아카보즈 투여군은 투여 7일부터 50%이상의 혈당강하효과를 보이고 이후 투여기간 내내 좋은 혈당강하 효과를 보였다. DNJ와 아카보즈 약물기전에 대하여 알아보고자 투여를 중지한 3일간의 경우 혈당이 상승하는 것으로 보아 이 약물들은 인슐린 비의존형에 대한 치료제로서 이용가능하다고 하겠다.
본 실험 결과 누에로부터 분리된 DNJ는 당뇨병 치료제인 아카보즈의 항당뇨에 손색이 없을 정도로 효과적인 점을 감안하면 DNJ 20mg로서 항당뇨 효과가 인정되어 당뇨병의 예방 및 치료효과를 감안하여 생리활성을 갖는 항당뇨 치료제의 개발이 바람직할 것이다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 누에분말로부터 α-글루코시다제 억제물질인 1-디옥시노지리마이신을 분리 제조하는 방법으로서, 본 발명으로부터 분리된 1-디옥시노지리마이신은 기존의 당뇨병 치료제인 아카보즈와 거의 동일한 혈당강하 활성을 갖는 것으로 확인되었으므로,이를 당뇨병 치료제로 개발하는 경우 농가의 소득증대 및 국민 건강 증진에 기여할 것으로 기대된다.

Claims (3)

  1. (1) 5령 3일 냉동건조 누에를 동결건조하여 분말상태로 만든 후, 여기에 50% 에탄올을 가하여 추출액을 얻는 단계;
    (2) 상기 추출액을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 0.5N NH4OH로 용출한 다음, 이 용출액을 농축시켜 농축물을 얻는 단계;
    (3) 상기 농축물을 물에 녹인 다음, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 음이온 수지의 약 10배 부피의 물로 용출시킨 다음, 이 용출액을 농축시켜 농축물을 얻는 단계;
    (4) 상기 농축물을 물에 녹인 다음, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 양이온 수지의 약 5배 부피의 물로 용출시켜 5개의 분획을 얻고, 0.5N NH4OH로 용출시켜 1개의 분획을 얻는 단계;
    (5) 상기 6개의 분획중 2번째 분획물을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 순수한 1-디옥시노지리마이신 분획을 얻는 단계; 및
    (6) 상기 1-디옥시노지리마이신 분획을 메탄올 침전시켜 1-디옥시노지리마이신 결정을 얻는 단계
    로 이루어짐을 특징으로 하는 누에분말로부터 α-글루코시다제 억제물질인 1-디옥시노지리마이신을 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 Amberlyst 15 수지(NH4 +형) 또는 Amberlite CG-50 수지(NH4 +형)를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 Dowex 1×2 수지(OH-형)를 사용함을 특징으로 하는 방법.
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