KR100396983B1 - Highly reactive branched polymer and proteins or peptides conjugated with the polymer - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새로운 생체적합성 고분자 유도체 및 그 생체적합성 고분자 유도체가 생물학적으로 활성을 갖는 단백질(protein) 또는 펩타이드(peptide)와 결합하여 얻어지는 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생체적합성 고분자를 활성화하여 얻어지는 고반응성의 가지달린(branched) 고분자 유도체를 얻고 그 유도체에서 단백질에 연결되는 연결쇄를 길게함으로써, 얻어지는 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체는 고분자 유도체가 단백질의 생리활성 부위에 결합하는 수가 적게되어 단백질의 생리활성 감소를 최소화하면서 생체내 용해도를 증가시키고, 생체내 효소에 의한 분해로부터 분자구조의 보호를 최대화시켜서 단백질의 체내활성이 장시간 유지되므로 활성 단백질 또는 펩타이드의 생체 이용율을 극대화시킨다.The present invention relates to a novel biocompatible polymer derivative and a protein-polymer or peptide-polymer conjugate obtained by binding a biocompatible polymer derivative to a biologically active protein or peptide. By obtaining a highly reactive branched polymer derivative obtained by activating a compatible polymer and lengthening the linking chain from the derivative to the protein, the resulting protein-polymer or peptide-polymer conjugate is obtained by the polymer derivative at the bioactive site of the protein. The small number of binding increases the solubility in vivo while minimizing the decrease of physiological activity of the protein, and maximizes the protection of the molecular structure from degradation by enzymes in vivo, thereby maintaining the protein activity in the body for a long time, so the bioavailability of the active protein or peptide It maximizes.
Description
본 발명은 새로운 생체적합성 고분자 유도체 및 그 생체적합성 고분자 유도체가 생물학적으로 활성을 갖는 단백질(protein) 또는 펩타이드(peptide)와 결합하여 얻어지는 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생체적합성 고분자를 활성화하여 얻어지는 고반응성의 가지달린(branched) 고분자 유도체를 얻고 그 유도체에서 단백질에 연결되는 연결쇄를 길게함으로써, 얻어지는 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체는 고분자 유도체가 단백질의 생리활성 부위에 결합하는 수가 적게되어 단백질의 생리활성 감소를 최소화하면서 생체내 용해도를 증가시키고, 생체내 효소에 의한 분해로부터 분자구조의 보호를 최대화시켜서 단백질의 체내활성이 장시간 유지되므로 활성 단백질 또는 펩타이드의 생체 이용율을 극대화시키는 고분자 유도체에 관한 것이다.The present invention relates to a novel biocompatible polymer derivative and a protein-polymer or peptide-polymer conjugate obtained by binding a biocompatible polymer derivative to a biologically active protein or peptide. By obtaining a highly reactive branched polymer derivative obtained by activating a compatible polymer and lengthening the linking chain from the derivative to the protein, the resulting protein-polymer or peptide-polymer conjugate is obtained by the polymer derivative at the bioactive site of the protein. The small number of binding increases the solubility in vivo while minimizing the decrease of physiological activity of the protein, and maximizes the protection of the molecular structure from degradation by enzymes in vivo, thereby maintaining the protein activity in the body for a long time, so the bioavailability of the active protein or peptide It relates to a polymer derivative that maximizes.
일반적으로 호르몬(hormone), 사이토카인(cytokine)과 같은 다양한 펩타이드 또는 단백질이 체내에서 중요한 역할을 하고 있다는 것은 잘 알려진 사실이다. 또한 최근에는 대량 합성법이나 유전 공학에 의해 대량 생산이 가능해짐으로써, 다양한 단백질이나 펩타이드들이 의약품으로 사용되고 있다.In general, it is well known that various peptides or proteins such as hormones and cytokines play an important role in the body. In recent years, mass production is possible by mass synthesis or genetic engineering, and various proteins and peptides have been used as medicines.
그러나, 이러한 펩타이드 또는 단백질을 의약품으로 사용하는 데는 많은 문제점이 있다. 이러한 문제점으로서, 첫째는 체내 투여 후 쉽게 가수분해되거나 효소에 의해 단시간에 파괴되어 흡수율이 극히 낮게 된다는 것이고, 둘째는 반복적으로 투여되면 면역 반응이 자주 유도되어 생성된 항체의 생리활성 중화작용으로 인해 생명을 위협할 정도의 과민 반응(hypersensitivity)이 유발될 뿐만 아니라 망상세포의 내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의한 소실(clearance)이 증가하게 된다는 것이다.However, there are many problems in using such peptides or proteins as medicines. As a problem, the first is that it is easily hydrolyzed after the administration in the body or destroyed by enzymes in a short time, and the absorption rate is extremely low, and the second is life due to the physiological neutralization of the antibody produced by frequently inducing an immune response. Not only does it cause hypersensitivity, but it also increases the clearance of the reticuloendothelial system (RES) of reticular cells.
이러한 이유로 대부분의 단백질 또는 펩타이드 약물은 현재까지 주로 주사제로서 투여되었으며, 투여횟수는 1일 1회 또는 그 이상의 빈도로 투여되어왔다. 그러나, 이러한 약물의 빈번한 투여는 환자에게 고통을 줄 뿐 아니라 위험을 수반하며, 특히 장기간 치료가 필요한 환자에게 있어서는 양질의 생활을 유지하기가 어려웠다. 따라서, 상기와 같은 문제점이 개선된 보다 안정성 있는 약물의 개발이 요구되고 있다.For this reason, most protein or peptide drugs have been mainly administered as injections to date, and the frequency of administration has been administered once or more frequently per day. However, frequent administration of such drugs not only suffers from patients but also carries risks, and it is difficult to maintain a good quality of life, especially for patients in need of long-term treatment. Therefore, there is a need for the development of more stable drugs in which the above problems are improved.
단백질 또는 약리 활성을 가진 분자를 합성 고분자와 결합시키는 것은 생체 내(in vivo)및 생체 외(in vitro) 적용 시에 많은 이점을 제공할 수 있다. 생리활성 분자에 대한 고분자의 공유결합은 분자의 표면특성 및 용해성을 변화시켜서, 물 또는 유기용매에 대한 용해성을 증가시킬 수 있다. 또한, 생체적합성(biocompatibility)을 증가시켜서 면역 반응성을 감소시키며, 생체 내에서의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 장관 시스템, 신장(kidney), 비장(spleen) 또는 간(liver)에 의한 소실(clearance)을 연장시킬 수 있다. 따라서, 펩타이드에 고분자를 수식하는 것은 용액 내에서의 안정성을 증가시킬 수 있으며, 펩타이드의 내인성(intrinsic) 표면 특성을 효과적으로 보호할 수 있어 비특이적 단백질 흡착을 방지할 수 있다.Coupling proteins or molecules with pharmacological activity with synthetic polymers can provide a number of advantages in in vivo and in vitro applications. Covalent bonding of polymers to bioactive molecules can alter the surface properties and solubility of the molecules, thereby increasing their solubility in water or organic solvents. It also increases biocompatibility, thereby reducing immune responsiveness, increasing stability in vivo, as well as clearing clearance by the intestinal system, kidney, spleen or liver. Can be extended. Therefore, modifying the polymer in the peptide can increase the stability in solution, and can effectively protect the intrinsic surface properties of the peptide to prevent non-specific protein adsorption.
이에 생물학적으로 활성이 있는 펩타이드나 단백질 물질에 PEG를 결합시켜 체내 반감기를 연장하고 용해도를 증가시키며 체내에서의 면역 반응을 감소시키는 효과에 대한 연구가 진행되었다.Thus, studies have been conducted on the effects of PEG binding to biologically active peptides or protein substances to prolong half-life in the body, increase solubility, and reduce immune responses in the body.
미국특허 제4179337호는 단백질과 폴리펩타이드(polypeptide)를 분자량이 500 ~ 20,000정도의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, 이하 PEG라 한다) 또는 수용성 폴리머(polymer)에 결합시켜 생물학적 활성을 유지하면서 항원성과 항면역성이 감소된 단백질-고분자 결합체에 대해 언급하였다. 또한 미국특허 제4301144호는 헤모글로빈(hemoglobin)을 PEG나 수용성 폴리머와 결합하였을 때 산소 운반능이 증가됨을 기재하고 있다.U.S. Pat.No. 4,937,337 binds proteins and polypeptides to polyethylene glycol (PEG) or water-soluble polymers having a molecular weight of about 500 to 20,000 or so to maintain biological activity while maintaining antigenicity and anti-immunity. Reference was made to this reduced protein-polymer conjugate. U.S. Pat.No.4301144 also describes increased oxygen transport capacity when hemoglobin is combined with PEG or a water soluble polymer.
아부초스키 등(Abuchowskiet al.,Cancer Biochem. Biophys., 7, 175-186, 1984)은 PEG와 결합된 여러 가지 단백질들이 혈장에서 체내 반감기가 증가되고 면역원성이 감소됨을 증명하였으며, 또한 데이비스 등(Daviset al.,Lancet, 2, 281-283, 1981)은 유리카제(uricase)가 PEG와 결합하면 체내 반감기가 증가되고 요산의 대사시 부작용이 감소됨을 증명하였다.Abuchowski et al ., Cancer Biochem. Biophys ., 7, 175-186, 1984 demonstrated that PEG-binding proteins increase the body half-life and decrease immunogenicity in plasma. (Davis et al ., Lancet , 2, 281-283, 1981) demonstrated that the combination of uricase with PEG increases the half-life in the body and reduces the side effects of uric acid metabolism.
단백질 또는 폴리펩타이드에 PEG를 결합시키기 위하여 여러 가지 방법이 있는데, 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노(amino) 잔기, 올리고당 또는 히드록시기에 활성화된 PEG를 반응시키는 방법이 있다.There are various methods for binding PEG to a protein or polypeptide, and there is a method for reacting PEG activated on amino residues, oligosaccharides or hydroxy groups of a protein or polypeptide.
활성화된 PEG와 결합하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노 잔기로는 라이신(lysine)기와 N-말단을 들 수 있으며, PEG를 활성화시키는 방법은 다음과 같다. PEG의 한쪽 하이드록시기(hydroxy group)를 메칠에테르기(methyl ether group)로 치환시키고, 나머지 한쪽 하이드록시기에 친전자성 물질(electrophile)을 함유한 작용기를 결합시킨다. 활성화된 고분자의 예로는 아마이드 결합(amide bond)을 가진 PEG-N-하이드록시석신이미드-활성화된 에스테르(PEG-N-Hydroxysuccinimide-activated esters), 알킬 결합(alkyl bond)을 가진 PEG-에폭사이드(PEG-epoxide)와 PEG-트레실레이트(PEG-tresylate), 우레탄 결합(urethane bond)을 가진 PEG-카보닐 이미다졸(PEG-carbonyl imidazole)과 PEG-니트로페닐 카보네이트(PEG-nitrophenyl carbonates), N-말단에 쉬프 베이스(Schiff's base)를 가진 PEG-알데하이드(PEG-aldehyde) 등이 있다.Amino residues of the protein or polypeptide that binds to the activated PEG include a lysine group and the N-terminus, and a method of activating PEG is as follows. One hydroxyl group of the PEG is replaced with a methyl ether group, and the other hydroxyl group is bonded to a functional group containing an electrophile. Examples of activated polymers include PEG-N-Hydroxysuccinimide-activated esters with amide bonds and PEG-epoxides with alkyl bonds. (PEG-epoxide) and PEG-tresylate, PEG-carbonyl imidazole with urethane bonds and PEG-nitrophenyl carbonates, PEG-aldehyde with a Schiff's base at the N-terminus.
그러나, 단백질 및 폴리펩타이드에는 라이신 잔기가 무작위적으로 존재하므로 아미노기에 반응하는 PEG를 사용하게 되면 PEG가 비특이적으로 결합하게 되어 불균일한 혼합물이 된다. 따라서, 최근에는 균일한 PEG 결합체를 만들기 위해 단백질 또는 폴리펩타이드의 시스테인(cysteine)기, 올리고당(oligo sugar), 하이드록시기, 아르기닌(arginine)기 등 목적하는 특정부위에 PEG를 결합시키는 방법들이 시도되고 있다.However, since lysine residues are present in proteins and polypeptides randomly, using PEG reacting with amino groups causes PEG to bind nonspecifically, resulting in a heterogeneous mixture. Therefore, recent attempts have been made to bind PEG to specific sites of interest, such as cysteine groups, oligosaccharides, hydroxyl groups, and arginine groups of proteins or polypeptides to produce uniform PEG conjugates. It is becoming.
단백질 또는 폴리펩타이드의 시스테인기에 특이적으로 반응하는 PEG 유도체로는 PEG-비닐 설폰(vinyl sulphone), PEG-아이오도아세트아마이드(iodoacetamide), PEG-말레이미드(maleimide), PEG-오르소피리딜 디설파이드(orthopyridyl disulfide) 등이 있으며, 주로 말레이미드(maleimide)를 함유한 PEG를 이용하는 방법이 많이 쓰이고 있다. PEG-비닐 설폰은 수용액 상에서 안정성이 가장 좋으며, PEG-오르소피리딜 디설파이드는 디설파이드 결합을 가지고 있어 가역적으로 체내에서 분해될 수 있다. 이러한 유도체들을 이용한 펩타이드의 예로는 인터루킨-3(interleukin-3) 및 인터루킨-2(interleukin-2) 등이 있다.PEG derivatives that specifically react with cysteine groups of proteins or polypeptides include PEG-vinyl sulphone, PEG-iodoacetamide, PEG-maleimide, PEG-orthopyridyl disulfide (orthopyridyl disulfide) and the like, and a method using a PEG containing maleimide (maleimide) is mainly used. PEG-vinyl sulfone is the most stable in aqueous solution, PEG- orthopyridyl disulfide has a disulfide bond can be reversibly degraded in the body. Examples of peptides using these derivatives include interleukin-3 and interleukin-2.
단백질 또는 폴리펩타이드의 올리고당에 특이적으로 반응하는 PEG 유도체로는 알데하이드(aldehyde)를 함유한 물질과 반응하여 비교적 안정한 히드라존(hydrazone) 결합을 형성할 수 있는 PEG-히드라자이드(hydrazide)를 들 수 있다. PEG-히드라자이드는 특히 당단백질(glycoprotein)의 당부위에 특이적으로 결합하는 특징을 가지고 있어 특정부위 결합을 위한 목적으로 많이 쓰인다.PEG derivatives that specifically react with oligosaccharides of proteins or polypeptides include PEG-hydrazides, which can react with aldehyde-containing materials to form relatively stable hydrazone bonds. have. PEG-hydrazide is specifically used for glycoprotein (glycoprotein) specific site binding properties because it has a characteristic of binding specifically.
단백질 또는 폴리펩타이드의 하이드록시기에 특이적으로 반응하는 PEG 유도체로는 PEG-이소시아네이트(PEG-isocyanate)를 들 수 있으며, 단백질 또는 폴리펩타이드의 아르기닌기에 PEG를 결합시킬 때는 구아니디노(guanidino)기에 잘 반응하는 페닐글리옥살(phenylglyoxal)을 함유한 PEG 유도체가 사용된다.PEG derivatives that specifically react with the hydroxyl group of a protein or polypeptide include PEG-isocyanate, and when the PEG is bound to an arginine group of a protein or polypeptide, a guanidino group is used. PEG derivatives containing phenylglyoxal, which reacts well, are used.
일반적으로 단백질을 수식하는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(monomethoxy- polyethylene glycol, 이하 "mPEG"이라 함)은 선형 고분자로서 분자량은 1,000 내지 25,000 정도의 것이 사용되고 있다. 그런데, 단백질 또는 펩타이드의 생리활성 부위는 한정되어 있으므로, 활성을 유지하면서 다수의 선형 고분자를 상기 단백질 등에 접합시키는 데에는 한계가 있다. 특히 저분자량의 단백질 등의 경우 상대적으로 생리활성부위가 적어 고분자의 접합에 의해 급격히 활성이 저하되는 등의 문제가 있다. 이에 단백질의 활성을 유지하면서 다수의 고분자 물질을 결합시키는 방법에 대한 연구가 진행되었다. 우선, 분자량 20,000 이상의 선형 고분자를 접합시키는 방법이 시도되었는데, 분자량 20,000 이상의 선형 고분자를 접합시킴으로써 종래의 분자량 1,000 내지 25,000의 선형 고분자를 결합시키는 것보다 체내 반감기는 연장시킬 수 있으나, 이와 같이 생성된 접합체는 그 수율이 극히 낮은 것이 확인되었으며 그로인해 경제적이지 못하다는 단점이 있다.In general, monomethoxy polyethylene glycol (hereinafter referred to as "mPEG") that modifies a protein is a linear polymer, and molecular weight of about 1,000 to 25,000 is used. However, since the physiologically active site of the protein or peptide is limited, there is a limit in conjugating a large number of linear polymers to the protein or the like while maintaining the activity. In particular, low-molecular-weight proteins and the like have a relatively small amount of physiologically active sites, such that there is a problem in that activity is rapidly reduced due to the conjugation of a polymer. Thus, research into a method of binding a plurality of polymer materials while maintaining the activity of the protein has been in progress. First, a method of conjugating a linear polymer having a molecular weight of 20,000 or more has been attempted.By conjugating the linear polymer having a molecular weight of 20,000 or more, the half-life of the body can be extended, rather than the conjugation of a linear polymer having a molecular weight of 1,000 to 25,000. The yield was found to be extremely low, which is disadvantageous because it is not economical.
상기와 같은 선형의 고분자를 접합시키는 방법의 이용에는 한계가 있으므로, 이를 극복하기 위하여 가지달린 mPEG를 접합시키는 방법이 모색되었는데, 이러한 방법은 와나 (Wana, H et al., 'Antitumor enzymes: polyethylene glycol-modified asparaginase',Ann. N.Y. Acad.Sci. 613, 95-108, 1990) 등의 보고에 따른 것으로서, 트리 클로로 트리아진(trichlorotriazine)을 이용하여 가지 달린 mPEG 유도체를 단백질에 접합하는 것이 기재되어 있다.Since there is a limit to the use of such a method of conjugating linear polymers, in order to overcome this problem, a method of conjugating mPEG having been sought has been sought. Such a method is wana (Hana et al., 'Antitumor enzymes: polyethylene glycol) -modified asparaginase ', Ann. NY Acad. Sci. 613, 95-108, 1990), and the like described the conjugation of branched mPEG derivatives to proteins using trichlorotriazine. .
또한, 야마사키 (yamasaki, N. et al.,Agric. Biol. Chem.,52, 2125-2127, 1988) 등은 노르루신(norleucine)을 가지 달린 mPEG 합성에 이용함으로써 분석을 용이하게 한 바 있다. 상기 야마시키 방법은 아미노산 분석방법으로 노르루신을 측정함으로써 고분자 물질과 단백질의 결합정도를 용이하게 측정할 수 있다는 장점이 있다.In addition, Yamasaki (yamasaki, N. et al., Agric. Biol. Chem. , 52 , 2125-2127, 1988) and the like have facilitated the analysis by using norleucine for mPEG synthesis. The Yamashik method has an advantage in that the degree of binding of the polymer and the protein can be easily measured by measuring norleucine using an amino acid analysis method.
그러나 상기한 바와 같은 활성화된 가지 달린 고분자들은 그 크기가 거대하여 수식된 단백질의 표면에 입체적 장애(steric hindrance)를 유발함으로써 단백질의 반응성을 저하시키고 수율을 떨어뜨리는 문제가 있다.However, the activated branched polymers as described above have a large size, causing steric hindrance on the surface of the modified protein, thereby lowering the reactivity of the protein and lowering the yield.
이에 본 발명자는 가지 달린 고분자와 단백질을 연결하는 연결쇄(linker)를 길게 함으로써, 생리활성부위에 결합하는 수를 최소화하고 가지달린 고분자에 의한 입체적 장애를 감소시키면서도 단백질의 구조 보호를 극대화하여 생리활성의 감소를 최소화할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors by lengthening the linker (linker) connecting the branched polymer and the protein, by minimizing the number of binding to the physiologically active site and reducing the steric hindrance caused by the branched polymer while maximizing the structure protection of the protein physiological activity It has been found that the reduction of can be minimized to complete the present invention.
본 발명은 단백질과 결합하는 연결쇄를 길게한 가지달린 생체적합성 고분자 유도체를 제공함으로써, 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 고분자의 수를 최소화하고, 또한 단백질 활성부위에 가해지는 입체적 장애를 감소시켜 단백질 또는 펩타이드의 활성을 최적으로 유지하면서도 단백질 또는 펩타이드의 용해도 및 체내 안정성이 극대화된 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention provides a branched biocompatible polymer derivative having an extended linking chain that binds to a protein, thereby minimizing the number of polymers that bind to the protein or peptide, and also reducing the steric hindrance to the protein active site, thereby reducing the protein or peptide. An object of the present invention is to provide a protein-polymer or a peptide-polymer conjugate in which the solubility and stability of the protein or peptide are maximized while maintaining optimal activity.
도 1은 고분자 유도체에 의해 수식되지 아니한 인터페론의 HPLC를 수행한 결과에 대한 그래프이며, 1 is a graph showing the results of HPLC of interferon not modified by a polymer derivative,
도 2는 Di-PEG 5000와 반응한 인터페론(IFN)의 HPLC 결과에 대한 그래프이며, Figure 2 is a graph of the HPLC results of interferon (IFN) reacted with Di-PEG 5000,
1: Di-PEG-IFN, 2: Mono-PEG-IFN, 3: 고분자 수식이 되지 아니한1: Di-PEG-IFN, 2: Mono-PEG-IFN, 3: unmodified polymer
IFN(unreacted IFN)Unreacted IFN
도 3은 Di-PEG 20000과 반응한 IFN의 HPLC 결과에 대한 그래프이며, 3 is a graph showing the HPLC results of IFN reacted with Di-PEG 20000,
1: Mono-PEG-IFN, 2: 고분자 수식이 되지 아니한 IFN1: Mono-PEG-IFN, 2: IFN without polymer modification
도 4는 Tri-PEG 5000과 반응한 IFN의 HPLC 결과에 대한 그래프이며, 4 is a graph showing the HPLC results of IFN reacted with Tri-PEG 5000.
1: Di-PEG-IFN, 2: Mono-PEG-IFN, 3: 고분자 수식이 되지 아니한 IFN1: Di-PEG-IFN, 2: Mono-PEG-IFN, 3: IFN without polymer modification
도 5는 Tri-PEG 20000과 반응한 IFN의 HPLC 결과에 대한 그래프이다. 5 is a graph of the HPLC results of IFN reacted with Tri-PEG 20000.
1: Di-PEG-IFN, 2: Mono-PEG-IFN, 3: 고분자 수식이 되지 아니한 IFN1: Di-PEG-IFN, 2: Mono-PEG-IFN, 3: IFN without polymer modification
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 연결쇄를 길게 한 가지달린 생체적합성 고분자 유도체를 제공하고, 이러한 고분자 유도체를 생물학적 활성 단백질 또는 펩타이드와 결합시킨 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a biocompatible polymer derivative having a long linking chain, and provides a protein-polymer or peptide-polymer conjugate in which the polymer derivative is combined with a biologically active protein or peptide.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 연결쇄를 길게 한 가지달린 생체적합성 고분자 유도체를 제공한다.The present invention provides a biocompatible polymer derivative having one long chain.
본 발명의 생체적합성 고분자 유도체는 하나 또는 그 이상의 생체적합성 고분자가 결합된 가지달린 구조를 갖는 활성화된 고분자이다. 우선 생체적합성 고분자를 활성화하고, 활성화된 고분자로부터 하나의 활성화된 고분자 가지를 갖는 고분자 유도체(Di-고분자 유도체)를 합성하고, 상기 고분자 가지가 결합하는 가지점(branched point)에 단백질 또는 펩타이드에 접합하는 연결쇄로 긴 사슬의 생체적합성 고분자를 포함하는 구조의 고분자 유도체(Tri-고분자 유도체)를 본 발명의 바람직한 가지달린 고분자 유도체의 예로서 제공한다.Biocompatible polymer derivatives of the present invention are activated polymers having a branched structure in which one or more biocompatible polymers are bound. First, the biocompatible polymer is activated, and a polymer derivative (Di-polymer derivative) having one activated polymer branch is synthesized from the activated polymer, and then conjugated to a protein or peptide at a branch point to which the polymer branch is bound. A polymer derivative (Tri-polymer derivative) having a structure containing a long chain biocompatible polymer as a linking chain is provided as an example of the preferred branched polymer derivative of the present invention.
본 발명의 생체적합성 고분자는 자연적이거나 합성에 의한 물질로 기본적으로는 물에 용해되는 성질을 갖는 것으로서, 이러한 고분자로는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, 이하 "PEG"라 한다), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol, PPG), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene, POE), 폴리트리메틸렌 글리콜(polytrimethylene glycol), 폴리락트산(polylactic acid) 및 그 유도체, 폴리아크릴산 및 그 유도체, 폴리(아미노산), 폴리(비닐 알코올), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리포스파진(polyphosphazenes), 폴리(L-라이신)[poly (L- lysine)], 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide, PAO), 폴리사카라이드(polysaccharide) 등의 수용성 고분자 및 덱스트란(dextran), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리아크릴 아마이드(polyacryl amide) 등의 비면역성 고분자로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 또는 그 이상을 사용할 수 있다.The biocompatible polymer of the present invention is a natural or synthetic substance and basically has a property of dissolving in water. Such polymers include polyethylene glycol (hereinafter referred to as "PEG") and polypropylene glycol. , PPG), polyoxyethylene (POE), polytrimethylene glycol, polylactic acid and its derivatives, polyacrylic acid and its derivatives, poly (amino acids), poly (vinyl alcohol), poly Water-soluble polymers and dexes such as urethane, polyphosphazenes, poly (L-lysine), polyalkylene oxide (PAO), polysaccharide Composed of non-immune polymers such as dextran, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol (PVA), polyacryl amide You can use one or more selected from the group.
또한, 본 발명의 가지달린 고분자 유도체의 합성에 사용되는 생체적합성 고분자의 분자량은 약 200 내지 100,000인 것이 바람직하며, 1,000 내지 40,000인 것이 보다 바람직하다.In addition, the molecular weight of the biocompatible polymer used in the synthesis of the branched polymer derivative of the present invention is preferably about 200 to 100,000, more preferably 1,000 to 40,000.
본 발명의 고분자 유도체의 연결쇄는 긴 사슬의 활성화된 생체적합성 고분자이며, 바람직하게는 분자량 200 내지 20,000인 것을 사용할 수 있다.The linking chain of the polymer derivative of the present invention is a long chain activated biocompatible polymer, and preferably a molecular weight of 200 to 20,000 can be used.
본 발명의 가지달린 고분자 유도체를 제조하기 위해서는 우선적으로 상기 생체적합성 고분자가 활성화되도록 반응을 진행시키는데 이때 본 발명에서는 글라이신을 사용하여 반응성이 큰 말단 작용기가 결합될 말단부가 형성되도록 한다. 본 발명의 고분자 유도체의 말단 작용기는 N-하이드록시석신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester, 이하 "NHS"로 약칭함), 히드라진 하이드레이트(hydrazine hydrate, NH2NH2), 카르보닐 이미다졸(carbonyl imidazole), 니트로페닐(nitrophenyl), 이소시아네이트(isocyanate), 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride), 알데히드(aldehyde), 글리옥살(glyoxal), 에폭시드(epoxide), 탄산염(carbonate), 할로겐화 시안눌기(cyanuric halide), 디티오카보네이트(dithiocarbonate), 토실레이트(tosylate), 말레이미드(maleimide)등이 사용가능하며, 가장 바람직하게는 NHS 또는 NH2NH2를 사용할 수 있다.In order to prepare the branched polymer derivative of the present invention, the reaction proceeds first to activate the biocompatible polymer. In the present invention, glycine is used to form a terminal portion to which a highly reactive terminal functional group is bound. The terminal functional group of the polymer derivative of the present invention is N-hydroxysuccinimide ester (hereinafter abbreviated as "NHS"), hydrazine hydrate (NH 2 NH 2 ), carbonyl imidazole (carbonyl imidazole, nitrophenyl, isocyanate, sulfonyl chloride, aldehyde, glyoxal, epoxide, carbonate, cyanuric halide ), Dithiocarbonate, tosylate, maleimide and the like can be used, most preferably NHS or NH 2 NH 2 can be used.
본 발명의 생체적합성 고분자의 활성화 방법에 대해서는, 본 발명의 바람직한 하나의 구체적인 예로서 제공되는 PEG를 상기 생체적합성 고분자로 하여 상세히 설명하면 다음과 같다.Regarding the activation method of the biocompatible polymer of the present invention, PEG, which is provided as one specific example of the present invention, will be described in detail as the biocompatible polymer.
먼저 고분자가 모노메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)[monomethoxy-poly(ethylene glycol), mPEG]과 같은 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide, 이하 PAO라 한다)가 되도록 하고, 이 PAO의 다른 말단부분을 반응성이 큰 작용기로 전환하여 이루어진다. 특히 바람직한 예로서 생체적합성 고분자를 N-하이드록시석신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester, NHS) 형으로 활성화시키는 반응식을 하기 반응식 1 및 반응식 2에 나타내었다.First, the polymer is made of polyalkylene oxide (hereinafter referred to as PAO) such as monomethoxy-poly (ethylene glycol, mPEG), and the other end of the PAO is reactive. This is done by switching to a large functional group. As a particularly preferred example, a reaction scheme for activating a biocompatible polymer in the form of N-hydroxysuccinimide ester (NHS) is shown in Scheme 1 below. And in Scheme 2.
상기 반응식 1은 하나의 활성화된 생체적합성 고분자 가지를 포함하는 활성화된 Di-고분자 유도체 합성 과정을 단계적으로 나타낸 것이다.Scheme 1 illustrates step by step the synthesis of activated Di-polymer derivatives comprising one activated biocompatible polymer branch.
상기 반응식 2는 활성화된 Di-고분자 유도체의 가지점에 긴 사슬의 활성화된 생체적합성 고분자를 단백질 또는 펩타이드에 대한 연결쇄로서 결합하여 활성화된 Tri-고분자 유도체 합성 과정을 나타낸 것이다.Scheme 2 shows a process of synthesizing an activated Tri-polymer derivative by binding a long-chain activated biocompatible polymer to a branch of the activated Di-polymer derivative as a linking chain to a protein or a peptide.
상기와 같은 활성화된 가지달린 고분자 유도체에 있어 단백질 또는 펩타이드와 결합하는 말단에 작용기로서 상기 반응식 1 및 2의 NHS외에 NH2NH2, 카르보닐 이미다졸(carbonyl imidazole), 니트로페닐(nitrophenyl), 이소시아네이트(isocyanate), 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride),알데히드(aldehyde), 글리옥살(glyoxal), 에폭시드(epoxide), 탄산염(carbonate), 할로겐화 시안눌기(cyanuric halide), 디티오카보네이트(dithiocarbonate), 토실레이트(tosylate), 말레이미드(maleimide)등이 사용가능하며, NH2NH2를 사용한 경우의 반응식을 하기 반응식 3에 나타내었다.In the activated branched polymer derivative as described above, NH 2 NH 2 , carbonyl imidazole, nitrophenyl, and isocyanate, in addition to NHS of Schemes 1 and 2, are functional groups at the ends that bind to proteins or peptides. isocyanate, sulfonyl chloride, aldehyde, glyoxal, epoxide, carbonate, cyanuric halide, dithiocarbonate, tosyl Tosylate, maleimide, and the like can be used, and the reaction scheme when NH 2 NH 2 is used is shown in Scheme 3 below.
본 발명은 상기 활성화된 가지달린 고분자 유도체가 수식된 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 제공한다.The present invention provides a protein-polymer or peptide-polymer conjugate in which the activated branched polymer derivative is modified.
본 발명은 상기와 같이 합성된 활성화된 가지달린 고분자 유도체와 생물학적 활성을 가진 단백질 또는 펩타이드을 반응시켜 단백질 또는 펩타이드에 상기 고반응성의 활성화된 가지달린 고분자가 결합된 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 제공한다. 이 때, 단백질과 고분자 유도체의 결합에 있어 결합의 종류는 공유결합은 물론 친유성(lipophilic) 또는 소수성(hydrophilic) 작용에 의한 비공유결합을 포함한다.The present invention provides a protein-polymer or peptide-polymer conjugate in which the highly reactive activated branched polymer is bound to a protein or peptide by reacting the activated branched polymer derivative synthesized as described above with a protein or peptide having biological activity. do. At this time, the type of bond in the binding of the protein and the polymer derivative includes not only covalent bonds but also non-covalent bonds by lipophilic or hydrophilic action.
상기 활성화된 가지달린 고분자는 단백질 또는 펩타이드 내 라이신의 ε-아민기와 반응함으로써 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 형성하게 되며, 이 경우 라이신의 아민기외에도 단백질 또는 펩타이드 내의 카르복실기, 활성화된 카르보닐기 또는 산화된 당이 상기 활성화된 가지달린 고분자와의 접합 부분이 될 수 있다.The activated branched polymer reacts with the ε-amine group of lysine in the protein or peptide to form a protein-polymer or peptide-polymer conjugate. In this case, in addition to the amine group of lysine, the carboxyl group, activated carbonyl group or oxidation in the protein or peptide. The sugar may be a conjugate to the activated branched polymer.
상기 하나 또는 그 이상의 가지달린 고분자 유도체는 일반적인 화학 방법에 의해 생물학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드에 접합될 수 있으며, 이러한 접합 반응의 조건으로서 반응온도는 0 내지 40 ℃인 것이 바람직하며 4 내지 30 ℃인 것이 보다 바람직하고, 반응 pH는 4 내지 9, 반응시간은 5 분 내지 10 시간으로 하는 것이 바람직하다.The one or more branched polymer derivatives may be conjugated to biologically active proteins or peptides by general chemical methods, and the reaction temperature is preferably 0 to 40 ° C. and 4 to 30 ° C. as conditions for the conjugation reaction. More preferably, the reaction pH is 4 to 9, and the reaction time is preferably 5 minutes to 10 hours.
또한, 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 제조하는 반응에 사용되는, 단백질 또는 펩타이드와 활성화된 생체적합성 고분자 유도체의 몰비는 약 1:1 내지 1:100이며, 1:1 내지 1:20인 것이 보다 바람직하다.In addition, the molar ratio of the protein or peptide to the activated biocompatible polymer derivative used in the reaction for preparing the protein-polymer or peptide-polymer conjugate is about 1: 1 to 1: 100, and 1: 1 to 1:20. More preferred.
본 발명에 사용되는 단백질 또는 펩타이드는 특정 치료용 약물에 한정되지 않고 생물학적으로 활성이 있는 모든 물질이 사용될 수 있다. 구체적으로는 알파, 베타, 감마 인터페론(α-, β-, γ-interferon), 아스파라기나아제(asparaginase), 아르기나아제(arginase), 아르기닌 디이미나아제(arginine deiminase), 아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxidedismutase), 엔도톡시나아제(endotoxinase), 카탈라아제(catalase), 키모트립신(chymotrypsin), 리파아제(lipase), 유리카제(uricase), 아데노신 디포스파타아제(adenosine diphosphatase), 티로시나아제(tyrosinase), 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase), 글루코시다아제(glucosidase), 갈락토시다아제(galactosidase), 글루코유로니다아제(glucouronidase), 헤모글로빈(hemoglobin), 혈액 인자 VII, VIII 및 IX(blood factor VII, VIII and IX), 면역글로불린(immunoglobulins), 사이토카인(cytokines) 즉, 인터루킨(interleukins), G-CSF, GM-CSF, PDGF, 렉틴(lectins), 리신(ricins), TNF, TGFs, EGF, PTH, 칼시토닌(calcitonin), 부갑상선 호르몬(Parathyroid hormone, PTH), 인슐린(insulin), 합성 엔케팔린(enkephalin), 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide, GHRP), 황체호르몬 분비 호르몬(luteinizing hormone releasing hormone, LHRH) 및 그 유도체, 시상하부의 분비물질, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(calcitonin gene related peptide, CGRP), 갑상선 자극 호르몬, 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor, THF) 등을 사용하는 것이 바람직하다.The protein or peptide used in the present invention is not limited to a specific therapeutic drug, any biologically active substance can be used. Specifically, alpha, beta, gamma interferon (α-, β-, γ-interferon), asparaginase, arginase, arginse, arginine deiminase, adenosine deaminase ( adenosine deaminase, superoxide dismutase, endotoxinase, catalase, chymotrypsin, lipase, uricase, adenosine diphosphatase diphosphatase, tyrosinase, glucose oxidase, glucosidase, galactosidase, glucouronidase, hemoglobin, blood factor VII, VIII And IX (blood factor VII, VIII and IX), immunoglobulins, cytokines, ie interleukins, G-CSF, GM-CSF, PDGF, lectins, lysines, TNF, TGFs, EGF, PTH, calcitonin (cal citonin, Parathyroid hormone (PTH), insulin, synthetic enkephalin, growth hormone releasing peptide (GHRP), luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) and its It is preferable to use derivatives, hypothalamic secretions, calcitonin gene related peptide (CGRP), thyroid stimulating hormone, thymic humoral factor (THF), and the like.
본 발명의 활성화된 가지달린 고분자 유도체는 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 형성하는 반응성이 매우 우수하다. 특히 Di-고분자 유도체의 경우에 비해 Tri-고분자 유도체의 경우 단백질에 활성화된 생체적합성 고분자를 결합시키는 반응성이 상당히 우수함을 확인하였다(도 2내지도 5및 표 1 참조). 이로서 Tri-고분자 유도체의 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 연결쇄 고분자의 긴 사슬 구조가 상기와 같이 반응성을 증가시킴을 알 수 있다.The activated branched polymer derivatives of the present invention have very good reactivity to form protein-polymer or peptide-polymer conjugates. In particular, it was confirmed that the reactivity of binding the activated biocompatible polymer to the protein of the Tri-polymer derivative was significantly superior to that of the Di-polymer derivative (see FIGS. 2 to 5 and Table 1). As a result, it can be seen that the long chain structure of the linking chain polymer that binds to the protein or peptide of the Tri-polymer derivative increases the reactivity as described above.
상기와 같이 제조된 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 분리 정제하는데 있어서 사용 용액의 pH는 7 내지 9, 바람직하게는 7.5 내지 8.5이다. 이 때 분리정제에 사용할 수 있는 완충용액으로는 KCl, NaCl, Tris-HCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, (NH4)2CO3, 글리신(glycine) NaOH이며, 바람직하게는 Tris-HCl과 인산완충용액을 사용할 수 있다. 또한, 사용할 수 있는 이온교환수지로는 Q-HD(BioSepra, USA), QA-TRISACRYL과 QMA-SPHEROSIL (sepracore, USA), TMAE650M(EM separation, USA), Mono-Q과 Q-Sepharose (Pharmacia, Sweden) 등이 있다.The pH of the solution used in separating and purifying the protein-polymer or peptide-polymer conjugate prepared as described above is 7 to 9, preferably 7.5 to 8.5. At this time, the buffer solution that can be used for separation and purification is KCl, NaCl, Tris-HCl, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , NaBO 4 , (NH 4 ) 2 CO 3 , glycine NaOH, preferably Tris-HCl and phosphate buffer solution can be used. Also available ion exchange resins include Q-HD (BioSepra, USA), QA-TRISACRYL and QMA-SPHEROSIL (sepracore, USA), TMAE650M (EM separation, USA), Mono-Q and Q-Sepharose (Pharmacia, Sweden).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
1. 활성화된 생체적합성 고분자 PEG의 합성1. Synthesis of Activated Biocompatible Polymer PEG
<실시예 1> 활성화된 고분자 mPEG-OCHExample 1 Activated Polymer mPEG-OCH 22 CONHCHCONHCH 22 COONHS(5000)의 합성Synthesis of COONHS (5000)
(단계 1) mPEG-OCH(Step 1) mPEG-OCH 22 COOH(5000)의 합성Synthesis of COOH (5000)
분자량이 5000인 PEG를 이용하여 mPEG를 제조하고, mPEG-OH(5000)(10g, 2mmole)를 질소 기체(nitrogen gas)하에서 THF에 녹인후 실온에서 교반(stirring) 하면서 나트륨, 나프탈렌(naphthalene) 용액을 가하고 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 브로모에틸렌아세테이트(bromoethylacetate)(1.0g, 6.0mmole)를 실온에서 교반하면서 적하시키는 방법으로(dropwise) 넣어 주었다. 실온에서 15시간 이상 반응시킨 후 냉각조(ice bath) 하에서 아이스 에테르(ice ether)를 가해 응고시켰다. 생성된 고형분을 여과(solid filter)하여 회수한 후 이를 에테르로 세척하고, 진공 건조하였다.MPEG was prepared using PEG with a molecular weight of 5000, and mPEG-OH (5000) (10 g, 2 mmoles) was dissolved in THF under nitrogen gas (nitrogen gas), and then sodium and naphthalene solution was stirred at room temperature. Was added and stirred at room temperature for 3 hours. Bromoethylacetate (bromoethylacetate) (1.0 g, 6.0 mmoles) was added dropwise with stirring at room temperature. After reaction at room temperature for 15 hours or more, ice ether was added and coagulated in an ice bath. The resulting solid was collected by filtration (solid filter), which was then washed with ether and dried in vacuo.
그 결과 고형분(crude solid)는 15.5 g이 얻어졌다.As a result, 15.5 g of crude solid was obtained.
그 후 상기 고형분을 물에 녹인 후 1N NaOH를 가해 pH를 11로 맞추고 55 ℃에서 24 시간 동안 교반한 후 실온으로 식히고 HCl을 가해 pH를 3으로 조정한 다음 증발시켰다. 염화메틸렌(methylene chloride, 이하 "MC"라 약칭함)에 녹이고 실온에 1 시간 방치한 후 셀라이트 여과(celite filter)하여 증발시켰다. 그 다음 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol, 이하 "ipa"라 약칭함)을 넣고 녹인 후 냉각조하에서 결정화시켰다. 그 결과 얻어진 연갈색 고형분을(pale brown solid) 여과하고 에테르로 세척한 후 진공 건조하였다.Then, the solid was dissolved in water, 1N NaOH was added thereto to adjust the pH to 11, stirred at 55 ° C. for 24 hours, cooled to room temperature, HCl was added to adjust the pH to 3, and then evaporated. It was dissolved in methylene chloride (hereinafter abbreviated as "MC"), left at room temperature for 1 hour, and evaporated by celite filtration. Then, isopropyl alcohol (hereinafter, abbreviated as "ipa") was added thereto, dissolved, and crystallized under a cooling bath. The resulting pale brown solid was filtered, washed with ether and dried in vacuo.
그 결과 얻어진 상기 연갈색 고형분은 10.3 g (수율 : 100 %)이었다.As a result, the light brown solid was 10.3 g (yield: 100%).
(단계 2) mPEG-OCH(Step 2) mPEG-OCH 22 COONHS(5000)의 합성Synthesis of COONHS (5000)
단계 1에서 얻어진 mPEG-OCH2COOH(5000)(3g, 0.6mmole)을 MC에 녹인 후 교반하면서 NHS(0.2g, 1.8mmole)와 N,N'-디시클로헥실 카보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide, 이하 "DCC"라 약칭함)(0.37g, 1.8mmole)를 넣어 주었다. 30 ℃로 가열하면서 교반하여 18 시간 동안 반응시킨 후 실온으로 식혀, 셀라이트 여과한 다음 석탄(charcoal; 활성탄소)로 여과하고 증발시켰다.MPEG-OCH 2 COOH (5000) (3g, 0.6mmole) obtained in step 1 was dissolved in MC and then stirred with NHS (0.2g, 1.8mmole) and N, N'-dicyclohexyl carbodiimide (N, N ') -dicyclohexyl carbodiimide (hereinafter abbreviated as "DCC") (0.37g, 1.8mmole) was added. The mixture was stirred with heating to 30 ° C., reacted for 18 hours, cooled to room temperature, filtered through Celite, filtered through charcoal, and evaporated.
ipa를 넣어 녹인 후 냉각조하에서 결정화하였으며, 그 결과 얻은 백색의 고형분을 여과하고 에테르로 세척한 다음 진공 건조하였다. 결과적으로 얻어진 mPEG-OCH2COONHS(5000)를 포함하고 있는 상기 백색 고형분은 2.81 g (수율 : 91 %)이었다.Ipa was added to dissolve and crystallized under a cooling bath. The resulting white solid was filtered, washed with ether and dried in vacuo. The white solid, which contained the resulting mPEG-OCH 2 COONHS (5000), was 2.81 g (yield: 91%).
(단계 3) mPEG-OCH(Step 3) mPEG-OCH 22 CONHCHCONHCH 22 COOH(5000)의 합성Synthesis of COOH (5000)
글리신(glycine)(0.06 g, 0.8 mmole)을 붕산염 완충용액(0.1 M, pH 8.5)에 녹인 후 교반하면서 mPEG-OCH2COONHS(5000)(0.5, 0.1mmole)을 적하하여 넣어 주었다. 1.5 일 동안 실온에서 반응시킨 후 물을 넣고 옥살산(oxalic acid)을 가하여 pH를 3으로 조정하였다. MC로 3 회 추출한 후 MC 분획층을 Na2SO4로 건조시켜 여과하고 증발시켰다.Glycine (0.06 g, 0.8 mmole) was dissolved in borate buffer solution (0.1 M, pH 8.5), and mPEG-OCH 2 COONHS (5000) (0.5, 0.1 mmol) was added dropwise while stirring. After reacting at room temperature for 1.5 days, water was added and the pH was adjusted to 3 by adding oxalic acid. After extraction three times with MC, MC fractions were dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated.
ipa를 넣고 녹인 후 냉각조하에서 결정화시키고 얻어진 백색 고형분을 여과하고 에테르로 세척, 진공 건조하였다. 그 결과 mPEG-OCH2CONHCH2COOH(5000)를 포함하는 백색 고형분이 0.50 g (수율 : 98 %) 얻어졌다.Ipa was added and dissolved, and crystallized under a cooling bath. The white solid obtained was filtered, washed with ether and dried in vacuo. As a result, mPEG-OCH 2 CONHCH 2 COOH a white solid 0.50 g (yield: 98%) containing 5000 was obtained.
(단계 4) mPEG-OCH(Step 4) mPEG-OCH 22 CONHCHCONHCH 22 COONHS(5000)의 합성Synthesis of COONHS (5000)
단계 3에서 얻은 mPEG-OCH2CONHCH2COOH(5000)(0.5g, 0.1mmole)을 MC에 녹인 후 교반하면서 NHS(0.034g, 0.3mmole)와 DCC(0.062g, 0.3mmole)를 넣어 주었다. 30 ℃로 가열하면서 교반하여 24 시간 동안 반응시킨 후 실온으로 식히고 셀라이트 여과한 후 석탄로 여과하고 증발시켰다.MPEG-OCH 2 CONHCH 2 COOH (5000) (0.5g, 0.1mmole) obtained in step 3 was dissolved in MC and NHS (0.034g, 0.3mmole) and DCC (0.062g, 0.3mmole) were added while stirring. The mixture was stirred with heating to 30 ° C. for 24 hours, cooled to room temperature, filtered through Celite, filtered through coal and evaporated.
ipa를 넣고 녹인후 냉각조하에서 결정화하고 그 결과 얻은 백색 고형분을 여과하고 에테르로 세척하여 진공 건조 시켰다. 그 결과 mPEG-OCH2CONHCH2COONHS(5000)에 대한 백색 고형분이 0.43 g (수율 : 83%) 얻어졌다.Ipa was added and melted and crystallized under a cooling bath. The resulting white solid was filtered, washed with ether and dried in vacuo. As a result, 0.43 g (yield: 83%) of white solids were obtained for mPEG-OCH 2 CONHCH 2 COONHS (5000).
<실시예 2> 활성화된 고분자Example 2 Activated Polymer mPEG-OCHmPEG-OCH 22 CONHCHCONHCH 22 COONHS(20000)의 합성Synthesis of COONHS (20000)
(단계 1) mPEG-OCH(Step 1) mPEG-OCH 22 COOH(20000)의 합성Synthesis of COOH (20000)
분자량 20000의 mPEG-OH(20000)(5g, 0.25mmole)를 실시예 1의 단계 1과 동일하게 반응시켜 mPEG-OCH2COOH(20000)에 대한 연갈색 고형분을 5.0 g (수율 : 100 %) 얻었다.MPEG-OH (20000) (5 g, 0.25 mmol) having a molecular weight of 20000 was reacted in the same manner as in Step 1 of Example 1 to obtain 5.0 g (yield: 100%) of a light brown solid for mPEG-OCH 2 COOH (20000).
(단계 2) mPEG-OCH2COONHS(20000)의 합성(Step 2) Synthesis of mPEG-OCH2COONHS (20000)
mPEG-OCH2COOH(20000)(3g, 0.15mmole)을 실시예 1의 단계 2와 동일하게 반응시켜 mPEG-OCH2COONHS(20000)에 대한 백색 고형분 2.2 g (수율 : 73%)을 얻었다.mPEG-OCH 2 COOH (20000) (3 g, 0.15 mmol) was reacted in the same manner as in Step 2 of Example 1 to obtain 2.2 g of a white solid (yield: 73%) for mPEG-OCH 2 COONHS (20000).
(단계 3) mPEG-OCH(Step 3) mPEG-OCH 22 CONHCHCONHCH 22 COOH(20000)의 합성Synthesis of COOH (20000)
mPEG-OCH2COONHS(20000)(0.5g, 0.025mmole)을 실시예 1의 단계 3과 동일하게 반응시켜 mPEG-OCH2CONHCH2COOH(20000)에 대한 백색 고형분 0.50 g (수율 : 100 %)을 얻었다.mPEG-OCH 2 COONHS (20000) (0.5 g, 0.025 mmol) was reacted in the same manner as in step 3 of Example 1 to obtain 0.50 g (yield: 100%) of white solids for mPEG-OCH 2 CONHCH 2 COOH (20000). Got it.
(단계 4) mPEG-OCH(Step 4) mPEG-OCH 22 CONHCHCONHCH 22 COONHS(20000)의 합성Synthesis of COONHS (20000)
mPEG-OCH2CONHCH2COOH(20000)(0.5g, 0.025mmole)을 실시예 1의 단계 4와 동일하게 반응시켜 mPEG-OCH2CONHCH2COONHS(20000)에 대한 백색 고형분 0.45 g (수율 : 90 %)을 얻었다.mPEG-OCH 2 CONHCH 2 COOH (20000) (0.5 g, 0.025 mmol) was reacted in the same manner as in Step 4 of Example 1 to 0.45 g of a white solid for mPEG-OCH 2 CONHCH 2 COONHS (20000) (yield: 90% )
2. 활성화된 가지달린 고분자 유도체 Di-PEG 및 Tri-PEG의 합성2. Synthesis of Activated Branched Polymer Derivatives Di-PEG and Tri-PEG
<실시예 3> 활성화된 가지달린 고분자 유도체 Di-PEG-NHS (5000)의 합성Example 3 Synthesis of Activated Branched Polymer Derivative Di-PEG-NHS (5000)
(단계 1) Di-PEG-COOH (5000)의 합성(Step 1) Synthesis of Di-PEG-COOH (5000)
라이신-HCl(lysine-HCl)(0.08 g, 0.042 mmole)을 붕산염 완충용액(0.1 M pH 8.5)에 녹인 후 교반하면서 mPEG-OCH2CONHCH2COONHS(5000)(0.4, 0.076mmole)을 적하하여 넣어 주었다. 2 일동안 실온에서 반응시킨 후 물을 넣고 옥살산을 가하여 pH 3으로 조정하였다. MC로 3 회 추출한 뒤 MC 분획층에 Na2SO4를 가하여 건조시킨 후여과하고, 증발시켰다.Lysine-HCl (lysine-HCl) (0.08 g, 0.042 mmole) was dissolved in borate buffer solution (0.1 M pH 8.5), and stirred and added dropwise with mPEG-OCH 2 CONHCH 2 COONHS (5000) (0.4, 0.076 mmol). gave. After reacting at room temperature for 2 days, water was added thereto and adjusted to pH 3 by adding oxalic acid. After extraction three times with MC, Na 2 SO 4 was added to the MC fraction layer, dried, filtered and evaporated.
ipa를 넣고 녹인 후 냉각조하에서 결정화하여 백색의 고형분을 얻어 여과하고 에테르로 세척한 다음 진공 건조하였다.Ipa was added to dissolve and crystallized in a cooling bath to obtain a white solid, filtered, washed with ether and dried in vacuo.
그 결과 얻어진 백색 고형분(Di-PEG-COOH)이 0.33 g (수율 : 84%)을 얻어졌다. 상기 백색 고형분은 하기 화학식 1과 같은 구조식을 갖는다.As a result, 0.33 g (yield: 84%) of white solid content (Di-PEG-COOH) obtained. The white solid has a structure represented by the following Chemical Formula 1.
(단계 2) Di-PEG-NHS (5000)의 합성(Step 2) Synthesis of Di-PEG-NHS (5000)
상기 단계 1에서 얻은 Di-PEG-COOH(5000)(0.3g, 0.029mmole)를 NHS(0.01 g, 0.087 mmole) 및 DCC(0.018 g, 0.087 mmole)과 혼합하여 실시예 1의 단계 4와 동일한 방법으로 반응시켜 백색 고형분 0.25 g (수율 : 82 %)을 얻었다. 상기 백색 고형분(Di-PEG-NHS)은 하기 화학식 2와 같은 구조식을 갖는 화합물이다.Di-PEG-COOH (5000) (0.3 g, 0.029 mmol) obtained in step 1 was mixed with NHS (0.01 g, 0.087 mmole) and DCC (0.018 g, 0.087 mmole) in the same manner as in step 4 of Example 1 Reaction was carried out to give 0.25 g of a white solid (yield: 82%). The white solid (Di-PEG-NHS) is a compound having a structural formula as shown in the following formula (2).
<실시예 4> 활성화된 가지달린 고분자 유도체 Di-PEG-NHS (20000)의 합성Example 4 Synthesis of Activated Branched Polymer Derivative Di-PEG-NHS (20000)
(단계 1) Di-PEG-COOH (20000)의 합성(Step 1) Synthesis of Di-PEG-COOH (20000)
mPEG-OCH2CONHCH2COONHS(20000)(0.4g, 0.02mmole)을 실시예 3의 단계 1과 동일하게 반응시켜 백색 고형분 0.35 g (수율 : 87 %)을 얻었다. 결과 백색 고형분은 Di-PEG-COOH로서 상기 화학식 1의 구조식을 갖는 화합물이다(상기 화학식 1에서 PEG 의 분자량은 20000이다).mPEG-OCH 2 CONHCH 2 COONHS (20000) (0.4 g, 0.02 mmol) was reacted in the same manner as in Step 1 of Example 3 to obtain 0.35 g of a white solid (yield: 87%). The resulting white solid is Di-PEG-COOH, a compound having the structural formula of Formula 1 above (the molecular weight of PEG in Formula 1 is 20000).
(단계 2) Di-PEG-NHS (20000)의 합성(Step 2) Synthesis of Di-PEG-NHS (20000)
Di-PEG-COOH(20000)(0.3 g, 0.025 mmole)을 실시예 3의 단계 2와 동일하게 반응시켜 백색의 고형분 0.25 g (수율 : 83 %)를 얻었다. 이렇게 얻어진 백색 고형분(Di-PEG-NHS)은 상기 화학식 2와 같은 구조식의 화합물이다(상기 화학식 2에서 PEG의 분자량은 20000이다).Di-PEG-COOH (20000) (0.3 g, 0.025 mmole) was reacted in the same manner as in Step 2 of Example 3, to obtain 0.25 g of a white solid (yield: 83%). The white solid (Di-PEG-NHS) thus obtained is a compound having the same structural formula as in Chemical Formula 2 (the molecular weight of PEG in Chemical Formula 2 is 20000).
<실시예 5> 긴사슬의 연결쇄를 포함하는 활성화된 가지달린 고분자 유도체 Tri-PEG-NHS (5000)의 합성Example 5 Synthesis of Activated Branched Polymer Derivative Tri-PEG-NHS (5000) Containing Long Chain Linkage
(단계 1) Tri-PEG-COOH (5000)의 합성(Step 1) Synthesis of Tri-PEG-COOH (5000)
실시예 3에서 얻은 Di-PEG-COONHS(5000)(0.1 g, 0.0096 mmole)을 MC에 녹이고 실온에서 교반하면서 NH2PEG-COOH(2000)(0.038 g, 0.0192 mmole)를 가하였다. 40 ℃에서 2 일 동안 반응시킨 후 셀라이트로 여과하고, 증발시켰다.Di-PEG-COONHS (5000) (0.1 g, 0.0096 mmole) obtained in Example 3 was dissolved in MC and NH 2 PEG-COOH (2000) (0.038 g, 0.0192 mmole) was added with stirring at room temperature. After reacting at 40 ° C. for 2 days, the mixture was filtered through celite and evaporated.
ipa를 넣고 녹인 후 냉각조하에서 결정화시켜 백색의 고형분을 얻었으며 이를 여과하고 에테르로 세척한 후 진공건조하였다.Ipa was added to dissolve and crystallized in a cooling bath to obtain a white solid, which was filtered, washed with ether and dried in vacuo.
그 결과 얻어진 백색 고형분은 0.12 g (수율 : 92 %)이었다. 이렇게 얻어진 백색 고형분(Tri-PEG-COOH)은 하기 화학식 3과 같은 구조의 화합물이다.The resulting white solid was 0.12 g (yield: 92%). The white solid (Tri-PEG-COOH) thus obtained is a compound having the same structure as in Chemical Formula 3 below.
(단계 2) Tri-PEG-NHS (5000)의 합성(Step 2) Synthesis of Tri-PEG-NHS (5000)
실시예 4에서 얻은 Tri-PEG-COOH(0.1 g, 0.007 mmole)를 NHS(0.0024 g, 0.021 mmole) 및 DCC(0.0043 g, 0.021 mmole)과 혼합하여 실시예 3의 단계 2와 동일한 방법으로 반응시켜 백색 고형분 0.1 g (수율 : 99 %)을 얻었다. 이 백색의 고형분(Tri-PEG-NHS)은 하기 화학식 4와 같은 구조의 화합물이다.Tri-PEG-COOH (0.1 g, 0.007 mmole) obtained in Example 4 was mixed with NHS (0.0024 g, 0.021 mmole) and DCC (0.0043 g, 0.021 mmole) in the same manner as in Step 2 of Example 3 0.1 g (yield: 99%) of white solids were obtained. This white solid (Tri-PEG-NHS) is a compound having the structure shown in the following formula (4).
<실시예 6> 긴사슬의 연결쇄를 포함하는 활성화된 가지달린 고분자 유도체 Tri-PEG-NHS (20000)의 합성Example 6 Synthesis of Activated Branched Polymer Derivative Tri-PEG-NHS (20000) Containing Long Chain Linkage
(단계 1) Tri-PEG-COOH (20000)의 합성(Step 1) Synthesis of Tri-PEG-COOH (20000)
실시예 4에서 얻은 Di-PEG-COONHS(20000)(0.1 g, 0.00247 mmole)을 실시예 4의 단계 2와 동일한 방법으로 반응시켜 백색의 고형분 0.107 g (수율 : 98 %)을 얻었다. 상기 백색 고형분(Tri-PEG-COOH)은 상기 화학식 3과 같은 구조의 화합물이며, PEG는 분자량 20000이다.Di-PEG-COONHS (20000) (0.1 g, 0.00247 mmole) obtained in Example 4 was reacted in the same manner as in Step 2 of Example 4, to obtain 0.107 g of a white solid (yield: 98%). The white solid (Tri-PEG-COOH) is a compound having the same structure as in Chemical Formula 3, and PEG has a molecular weight of 20000.
(단계 2) Tri-PEG-NHS (20000)의 합성(Step 2) Synthesis of Tri-PEG-NHS (20000)
실시예 4에서 얻은 Tri-PEG-COOH(20000)(0.08 g, 0.0018 mmole)를 실시예 4의 단계 2와 동일한 방법으로 반응시켜 백색의 고형분 0.080 g (수율 : 99 %)을 얻었다. 이렇게 얻은 백색 고형분(Tri-PEG-NHS)은 상기 화학식 4의 구조를 갖는 화합물이며, 이에서 PEG의 분자량은 20000이다.Tri-PEG-COOH (20000) (0.08 g, 0.0018 mmole) obtained in Example 4 was reacted in the same manner as in Step 2 of Example 4, to obtain 0.080 g of a white solid (yield: 99%). The white solid thus obtained (Tri-PEG-NHS) is a compound having the structure of Chemical Formula 4, wherein the molecular weight of PEG is 20000.
<실시예7>Example 7 Tri-PEG-NHNHTri-PEG-NHNH 22 (5000)의 합성Synthesis of 5000
하기 화학식 5의 화합물을 다음의 단계 1 및 단계 2의 반응을 수행하여 얻었다.The compound of formula 5 was obtained by performing the reaction of Step 1 and Step 2 below.
(단계 1) 화학식 6의 고분자 유도체의 합성(Step 1) Synthesis of Polymer Derivative of Chemical Formula 6
실시예 5의 단계 1의 Tri-PEG-COOH(5000) (1 g, 0.083 mmole)를 MC에 녹인 후 SOCl2(0.05 g, 0.4 mmole)을 적하하여 넣고 가열하여 3시간 동안 환류(reflux) 반응시킨 후 실온까지 식히고 증발시켰다. 그 결과 갈색의 오일 1 g (수율 : 98 %)이 얻어졌다. 이 때 주의할 것은 결과적으로 얻어진 상기 갈색의 오일은 매우 불안정하여 회수 후 곧바로 다음반응에 사용하도록 하여야 한다는 것이다.Tri-PEG-COOH (5000) (1 g, 0.083 mmole) of Step 1 of Example 5 was dissolved in MC, followed by dropwise addition of SOCl 2 (0.05 g, 0.4 mmole), followed by heating to reflux for 3 hours. After cooling down to room temperature and evaporation. As a result, 1 g (yield: 98%) of brown oil was obtained. Note that the resulting brown oil is very unstable and should be used for the next reaction immediately after recovery.
(단계 2) 화학식 7의 고분자 유도체의 합성(Step 2) Synthesis of Polymer Derivative of Chemical Formula 7
상기 단계 1에서 얻어진 Tri-PEG-COCl (5000) (1.1 mmole)을 MC에 녹인 후NH2NH2, H2O 10 ml을 적하하여 넣고 실온에서 교반하여 3시간 반응시킨 후 증발시키고, 실리카 칼럼에서 분리하고 이를 증발시키고 진공 건조시켰다.After dissolving Tri-PEG-COCl (5000) (1.1 mmole) obtained in step 1 in MC, 10 ml of NH 2 NH 2 and H 2 O were added dropwise thereto, stirred at room temperature, reacted for 3 hours, and evaporated. Separated in and evaporated and dried in vacuo.
그 결과 황색 오일이 약 1 mmole (수율 : 92 %) 얻어졌다. 상기 황색 오일은 상기 화학식 7의 구조를 갖는 고분자 유도체이다.As a result, about 1 mmole (yield: 92%) of yellow oil was obtained. The yellow oil is a polymer derivative having the structure of Formula 7.
<실시예 8><Example 8> Tri-PEG-NHNHTri-PEG-NHNH 22 (20000)의 합성Synthesis of (20000)
(단계 1) 화학식 6의 고분자 유도체의 합성(Step 1) Synthesis of Polymer Derivative of Chemical Formula 6
실시예 6의 단계 1의 Tri-PEG-COOH(20000) 역시 위와 같은 방법으로 반응시켜 Tri-PEG-COCl(20000)을 합성한다. 그 결과 갈색의 오일 1g (수율 : 98 %)이 얻어졌다. 합성된 갈색 오일은 상기 화학식 6의 구조를 갖는 것으로 PEG의 분자량은 20000이다.Tri-PEG-COOH (20000) of Step 1 of Example 6 was also reacted in the same manner to synthesize Tri-PEG-COCl (20000). As a result, 1 g of a brown oil (yield: 98%) was obtained. The synthesized brown oil has the structure of Chemical Formula 6, and the molecular weight of PEG is 20000.
(단계 2) 화학식 7의 고분자 유도체의 합성(Step 2) Synthesis of Polymer Derivative of Chemical Formula 7
상기 단계 1에서 얻어진 Tri-PEG-COCl (20000) (1.1 mmole)을 실시예 7의 단계 2와 동일한 방법으로 Tri-PEG-NHNH2(20000)을 합성하였다. 그 결과 황색 오일이 약 1 mmole (수율 : 92 %) 얻어졌다. 상기 황색 오일은 상기 화학식 7의 구조를 갖는 고분자 유도체로서 PEG의 분자량은 20000이다.Tri-PEG-COCl (20000) (1.1 mmole) obtained in Step 1 was synthesized in the same manner as in Step 2 of Example 7 to Tri-PEG-NHNH 2 (20000). As a result, about 1 mmole (yield: 92%) of yellow oil was obtained. The yellow oil is a polymer derivative having the structure of Formula 7 and has a molecular weight of 20000.
3. 활성화된 고분자 유도체와 단백질(인터페론)의 접합체의 제조3. Preparation of conjugates of activated polymer derivatives and proteins (interferon)
<실시예 9> Di-PEG(5000)-인터페론의 제조Example 9 Preparation of Di-PEG (5000) -Interferon
3 mg의 인터페론(Interferon, INF)을 pH 7.0의 0.1 M 인산 완충용액으로 투석한 후, 실시예 3에서 제조된 석시닐-N-하이드록시석신이미드 에스테르(succinyl-N-hydroxysuccinimide ester)형으로 활성화된 Di-PEG(5000) 3 mg을 넣어 실온에서 30분 동안 교반하였다. 0.1 M의 글리신(glycine)을 첨가하여 반응을 중단시키고, 반응하지 않은 과량의 PEG과 INF를 센트리콘-30(Centricon-30; Amicon, USA)을 사용하여 다량 제거하여 Di-PEG(5000)-INF를 제조하였다.3 mg of Interferon (INF) was dialyzed with 0.1 M phosphate buffer at pH 7.0, and then to the succinyl-N-hydroxysuccinimide ester form prepared in Example 3. 3 mg of activated Di-PEG (5000) was added thereto and stirred at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by addition of 0.1 M glycine, and large amounts of unreacted PEG and INF were removed using Centricon-30 (Amicon, USA) to remove Di-PEG (5000)-. INF was prepared.
<실시예 10> Di-PEG(20000)-인터페론의 제조Example 10 Preparation of Di-PEG (20000) -Interferon
3 mg의 INF를 pH 7.0인 0.1 M 인산 완충용액으로 투석한 후, 실시예 4에서 제조된 석시닐-N-하이드록시석신이미드 에스테르(succinyl-N-hydroxysuccinimide ester)형으로 활성화된 Di-PEG(20000) 12 mg을 넣어 실온에서 30분 동안 교반하였다. 0.1 M의 글리신을 첨가하여 반응을 중단시키고, 반응하지 않은 과량의 PEG과 INF을 센트리콘-30을 사용하여 다량 제거함으로써 제조하였다.3 mg of INF was dialyzed with 0.1 M phosphate buffer solution at pH 7.0 and then activated with Di-PEG in the form of succinyl-N-hydroxysuccinimide ester prepared in Example 4. 12 mg (20000) was added and stirred at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by addition of 0.1 M glycine and prepared by removing large amounts of unreacted excess PEG and INF with Centricon-30.
<실시예 11> Tri-PEG(5000)-인터페론의 제조Example 11 Preparation of Tri-PEG (5000) -Interferon
실시예 9와 같은 방법으로 Tri-PEG(5000)-INF를 제조하였다. 이 때 사용되는 PEG은 실시예 5에서 만들어진 Tri-PEG(5000)-NHS를 사용하였다.Tri-PEG (5000) -INF was prepared in the same manner as in Example 9. The PEG used at this time used Tri-PEG (5000) -NHS made in Example 5.
<실시예 12> Tri-PEG(20000)-인터페론의 제조Example 12 Preparation of Tri-PEG (20000) -Interferon
실시예 9와 같은 방법으로 Tri-PEG(20000)-INF를 제조하였다. 이 때 사용되는 PEG은 실시예 6에서 만들어진 Tri-PEG(20000)-NHS를 사용하였다.Tri-PEG (20000) -INF was prepared in the same manner as in Example 9. The PEG used at this time used Tri-PEG (20000) -NHS made in Example 6.
<실시예 13> Tri-PEG(5000)NHNHExample 13 Tri-PEG (5000) NHNH 22 -인터페론의 제조Preparation of Interferon
3 mg의 인터페론을 pH 6.0인 0.1 M 인산 완충용액으로 투석한 후, 10 mg의 1-에틸-3- (3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드[1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, 이하 "EDC"라 약칭함]를 첨가하여 단백질의 카르복실기에 중간체를 만든 후, 실시예 7에서 제조된 Tri-PEG(5000)-NHNH23 mg을 넣어 저온에서 2시간 내지 24시간 동안 교반하였다. 반응하지 않은 과량의 PEG과 INF를 센트리콘-30을 사용하여 다량 제거하여 Tri-PEG(5000)NHNH2-INF를 제조하였다.After 3 mg of interferon was dialyzed with 0.1 M phosphate buffer at pH 6.0, 10 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride [1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (hereinafter abbreviated as "EDC") was added to form an intermediate in the carboxyl group of the protein, and then added 3 mg of Tri-PEG (5000) -NHNH 2 prepared in Example 7 to 2 hours at low temperature. Stir for 24 hours. Excess PEG and INF unreacted was removed in a large amount using Centricon-30 to prepare Tri-PEG (5000) NHNH 2 -INF.
<실시예 14> Tri-PEG(20000)NHNHExample 14 Tri-PEG (20000) NHNH 22 -인터페론 의 제조Preparation of Interferon
3 mg의 인터페론을 pH 6.0인 0.1M 인산 완충용액으로 투석한 후, 10 mg의 EDC를 첨가하여 단백질의 카르복실기에 중간체를 만든 후, 실시예 8에서 제조된 Tri-PEG(20000)NHNH2 12 mg을 넣어 저온에서 2시간 내지 24시간 동안 교반하였다. 반응하지 않은 과량의 PEG과 INF를 센트리콘-30을 사용하여 다량 제거하여 Tri-PEG(20000)NHNH2-INF를 제조하였다.After dialysis of 3 mg of interferon with 0.1 M phosphate buffer solution at pH 6.0, 10 mg of EDC was added to form an intermediate in the carboxyl group of the protein, and then 12 mg of Tri-PEG (20000) NHNH 2 prepared in Example 8 was prepared. The mixture was stirred at low temperature for 2 to 24 hours. Excess unreacted PEG and INF were removed in a large amount using Centricon-30 to prepare Tri-PEG (20000) NHNH 2 -INF.
<실시예 15> Tri-PEG(5000)-EGF의 제조Example 15 Preparation of Tri-PEG (5000) -EGF
5 mg의 EGF(epithermal growth factor)를 pH 7.0인 0.1M 인산 완충용액으로 투석한 후, 실시예 5에서 제조된 석시닐-N-하이드록시석신이미드 에스테르(succinyl-N-hydroxysuccinimide ester)형으로 활성화된 Tri-PEG(5000) 5 mg을 넣어 실온에서 30분 동안 교반하였다. 0.1 M의 글리신을 첨가하여 반응을 중단시키고, 반응하지 않은 과량의 PEG과 EGF를 센트리콘-30을 사용하여 다량 제거하여 Tri-PEG(5000)-EGF를 제조하였다. 이의 분리 정제는 상기 실시예 19과 같은 방법으로 수행하였다.5 mg of epithermal growth factor (EGF) was dialyzed with 0.1 M phosphate buffer solution at pH 7.0, and then to the succinyl-N-hydroxysuccinimide ester type prepared in Example 5. 5 mg of activated Tri-PEG (5000) was added thereto, followed by stirring at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 0.1 M glycine, and a large amount of unreacted PEG and EGF was removed using Centricon-30 to prepare Tri-PEG (5000) -EGF. Its separation and purification was carried out in the same manner as in Example 19.
<실시예 16> Tri-PEG(20000)-EGF의 제조Example 16 Preparation of Tri-PEG (20000) -EGF
상기 실시예 15의 방법과 동일한 방법에 따라 제조하였는데, 이 때 PEG은 실시예 6에서 제조된 Tri-PEG(20000) 20 mg를 사용하였다. 이의 분리 정제는 하기 실시예 19와 같은 방법으로 수행하였다.Prepared according to the same method as in Example 15, wherein PEG was used 20 mg of Tri-PEG (20000) prepared in Example 6. Its separation and purification was carried out in the same manner as in Example 19 below.
<실시예 17> Tri-PEG(5000)-HGH의 제조Example 17 Preparation of Tri-PEG (5000) -HGH
5 mg의 HGH(human growth hormone)를 pH 7.0인 0.1 M 인산 완충용액으로 투석한 후, 실시예 5에서 제조된 석시닐-N-하이드록시석신이미드 에스테르(succinyl-N-hydroxysuccinimide ester)형으로 활성화된 Tri-PEG(5000) 8 mg을 넣어 실온에서 30분 동안 교반하였다. 0.1 M의 글리신을 첨가하여 반응을 중단시키고, 반응하지 않은 과량의 PEG과 EGF를 센트리콘-30을 사용하여 다량 제거하여 상기 Tri-PEG(5000)-HGH를 제조하였으며, 이의 분리 정제는 하기 실시예 19와 같은 방법으로 수행하였다.5 mg of human growth hormone (HGH) was dialyzed with 0.1 M phosphate buffer solution at pH 7.0, and then to the succinyl-N-hydroxysuccinimide ester type prepared in Example 5. 8 mg of activated Tri-PEG (5000) was added thereto and stirred at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by the addition of 0.1 M glycine, and a large amount of unreacted PEG and EGF were removed using Centricon-30 to prepare Tri-PEG (5000) -HGH. Example 19 was carried out in the same manner.
<실시예 18> Tri-PEG(20000)-HGH의 제조Example 18 Preparation of Tri-PEG (20000) -HGH
상기 실시예 17의 방법에 따라 Tri-PEG(20000)-HGH를 제조하였다. 이 때 PEG은 실시예 6에서 제조된 Tri-PEG(20000) 25 mg을 사용하였다. 이의 분리 정제는 하기 실시예 19와 같은 방법으로 수행하였다.Tri-PEG (20000) -HGH was prepared according to the method of Example 17, above. At this time, PEG used 25 mg of Tri-PEG (20000) prepared in Example 6. Its separation and purification was carried out in the same manner as in Example 19 below.
<실시예 19> Mono-PEG(5000, 20000)-인터페론의 분리 정제Example 19 Separation and Purification of Mono-PEG (5000, 20000) -Interferon
실시예 9 내지 12에서 제조된 PEG-INF를 센트리콘-30을 사용하여 10 mM Tris 완충용액으로 투석한 후 음이온교환수지(mono-Q; Pharmacia, Sweden)로 Mono-PEG-INF를 분리하였다. 분리 과정에 사용된 나트륨 염은 0 으로부터 300 mM까지의 농도구배로 사용하였다. 분리된 Mono-PEG-INF의 양은 크기-배제 HPLC(size-exclusion HPLC) 또는 MALDI-TOF 질량 분석기 (MALDI-TOF mass spectometer)로 확인되었다.PEG-INF prepared in Examples 9 to 12 was dialyzed with 10 mM Tris buffer using Centricon-30, and Mono-PEG-INF was separated by an anion exchange resin (mono-Q; Pharmacia, Sweden). The sodium salt used in the separation process was used in a concentration gradient from 0 to 300 mM. The amount of isolated Mono-PEG-INF was confirmed by size-exclusion HPLC or MALDI-TOF mass spectrometer.
<실험예 1> 활성화된 가지달린 고분자 유도체의 반응성 시험Experimental Example 1 Reactivity Test of Activated Branched Polymer Derivative
상기 실시예 1 내지 8에서 합성된 활성화된 고분자 유도체의 단백질 또는 펩타이드와의 반응성을 조사하기 위해, 이들 각각을 INF와 실시예 9 내지 14에서와 같은 방법으로 반응시킨 후 생성되는 Mono-PEG-IFN을 실시예 19에서와 같은 방법으로 정제 분리하여 생성된 Mono-PEG-IFN의 양을 HPLC의 피크면적(도 2, 도 3, 도 4및도 5)으로부터 결정하였으며, 그 결과 상기 활성화된 PEG 유도체의 단백질에 대한 반응성을 알 수 있었다(표 1).In order to investigate the reactivity of the activated polymer derivatives synthesized in Examples 1 to 8 with proteins or peptides, Mono-PEG-IFN produced after reacting each of them with the same method as in Examples 9 to 14 The amount of Mono-PEG-IFN produced by purification and separation in the same manner as in Example 19 was determined from the peak areas of HPLC ( FIGS. 2, 3, 4 and 5 ), and as a result, the activated PEG derivative. The reactivity with respect to the protein was found (Table 1).
이때, 비교예로서 시판되고 있는 노르루신이 삽입되지 않은 분자량 10000, 20000 또는 40000의 가지달린 PEG 고분자 유도체인 브렌치드 PEG2-NHS 에스터(branched PEG2-NHS ester, Sheawater polymers)의 반응성을 상기와 같은 조건에서 조사하여 상기 본 발명의 고분자 유도체의 반응성과 비교하였다.At this time, as a comparative example, the reactivity of the branched PEG 2-NHS ester (Shawater polymers), which is a branched PEG polymer derivative having a molecular weight of 10000, 20000 or 40000, to which no-leucine is inserted, was compared. Was investigated to compare the reactivity of the polymer derivative of the present invention.
상기 표 1의 결과에서 보듯이, Di-PEG 유도체 및 Tri-PEG 유도체는 모두 인터페론과의 반응성이 있으나, 특히 본 발명의 Tri-PEG 유도체의 경우 활성화된 PEG와 인터페론의 결합을 유도하는 성질이 월등히 우수함을 확인할 수 있다.As shown in the results of Table 1, both the Di-PEG derivatives and Tri-PEG derivatives are reactive with interferon, but particularly in the case of the Tri-PEG derivative of the present invention, the property of inducing binding of activated PEG and interferon is excellent. It can be confirmed that excellent.
본 발명은 단백질 또는 펩타이드, 특히 분자량이 작아 활성부위가 결합되는 고분자 구조에 의한 입체적 장애에 영향을 많이 받는 단백질 또는 펩타이드를 수식하는데 효과적인 긴사슬구조의 연결쇄를 포함하는 고반응성 가지달린 고분자 유도체를 합성하여 단백질-고분자 또는 펩타이드-고분자 접합체를 제조함으로써, 단백질 또는 펩타이드의 활성을 최대한 유지하면서도 고 수율과 약물의 활성감소를 최소화하며 체내효소로부터의 분해를 방지하여 안정성을 증가시키는 결과, 투여되는약물의 횟수를 줄여 과다 약물 사용으로 인한 부작용을 감소시키는데 효과적으로 이용될 수 있다.The present invention provides a highly reactive branched polymer derivative comprising a long chain linkage chain which is effective for modifying a protein or peptide, particularly a protein or peptide that is affected by steric hindrance due to a low molecular weight and a polymer structure to which an active site is bound. By synthesizing a protein-polymer or peptide-polymer conjugate, the drug to be administered is increased while maintaining the maximum activity of the protein or peptide while minimizing the high yield and deactivation of the drug and increasing the stability by preventing degradation from enzymes in the body. It can be effectively used to reduce the number of times of side effects due to overdose.
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Payment date: 20130823 Year of fee payment: 11 |
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| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140821 Year of fee payment: 12 |
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| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |