KR100395275B1 - 세포또는고정화세포현탁액의보존방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효소 활성을 지닌 미생물 세포를 이의 현탁액으로서 또는 고정화 세포 입자의 현탁액으로서, 100mM 내지 무기 염의 포화 농도 범위의 몰 농도를 갖는, 무기 염의 중성 또는 약염기성 수용액인 수성 배지중에서, 상기 효소 활성을 지닌 세포 및 이의 효소 활성을 장시간 동안 안정하게 보존시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 니트릴 하이드라타제 또는 니트릴라제 효소 활성을 갖는 다량의 세포 또는 고정화 세포 입자를 실온에서조차도 세포 용해 또는 효소 열화없이 장시간(예: 300일)동안 보존시키는 산업상 유용한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 통상의 보존 방법에 필요한 노동력과 냉각 비용을 상당히 감소시킬 수 있게 한다.

Description

세포 또는 고정화 세포 현탁액의 보존방법{Method for preserving a suspension of cells or immobilized cells}
본 발명은 세포 또는 고정화 세포 현탁액의 보존방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 배양에 의해 생성된 미생물 세포 또는 이의 고정화 세포를 수성 배지 중에서 현탁액으로서 안정하게 보존시키는 방법에 관한 것이다.
미생물에 의해 생성된 효소는 많은 분야에서 화학적 전환 반응의 촉매로서 사용된다. 특히, 니트릴 하이드라타제 및 니트릴라제는 니트릴 그룹을 수화시키거나 가수분해시킬 수 있어서, 산업적 화학 분야에 중요한 아미드, 카복실산 및 α-하이드록시카복실산을 저렴한 비용으로 생성시킨다. 또한, 상기 효소들은 광학적으로 특이한 수화 또는 가수분해 반응을 수행할 수 있어서, 의약과 농업용 화학물질의 생산원료로서 중요한, 광학적으로 활성인 카복실산, 아미노산 및 α-하이드록시카복실산을 생성시킬 수 있다.
미생물 효소가 촉매로서 사용되는 화학적 전환 반응에서는, 배양시켜 수거한 미생물 세포 또는 이의 고정화 효소를 사용시까지 안정하게 보존해야 한다. 즉, 효소의 촉매적 기능이 보존되고 세포가 미생물 오염으로 인해 부패되거나 용해되지않도록 하는 조건하에서 상기 세포들을 저장시키는 것이 필요하다. 결과적으로, 효소의 불활성화, 및 세포의 용해 및 부패는 일반적으로 이들을 동결 또는 냉동시킴으로써 방지된다.
지금까지 공지된 보존 방법 중에서, 세포 또는 고정화 세포 입자의 미생물을 동결시키는 방법은 복잡한 동결 단계와 해동 단계를 필요로 하기 때문에, 효소활성이 파괴되거나 저하될 수도 있다. 냉동 보존 방법에는 미생물 오염을 방지하고 세포를 안정화시키기 위해 비교적 낮은 보존 온도가 요구되기 때문에, 결과적으로 냉각 비용이 많이 든다.
본 발명자들은 배양시켜 수거한 세포 또는 이의 고정화 세포에 대한 저렴하고도 안정한 보존 조건에 대한 집중적인 연구를 수행한 결과, 상기 세포들을 100mM 내지 무기 염의 포화농도 범위의 몰 농도를 갖는, 무기 염의 중성 내지 염기성 수용액내에 보존할 경우, 실온에서조차도 세포 용해 또는 효소 불활성화를 야기시키지 않으면서 300일 이상 동안 안정하게 보존할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 본 발명은 이러한 발견을 근거로하여 완성되었다.
따라서, 본 발명은 효소 활성을 지닌 미생물 세포와 이의 효소 활성을 장시간 동안, 100mM 내지 무기 염의 포화농도 범위의 몰 농도를 갖는 중성 또는 약 염기성 수용액인 수성 배지 중에서, 미생물 세포의 현탁액으로서 또는 고정화된 세포 입자의 현탁액으로서 안정하게 보존시키는 미생물 세포 또는 이의 고정화 세포 현탁액의 보존 방법을 제공한다.
본 발명의 기타 목적 및 잇점은 다음의 발명의 상세한 설명으로 부터 명백해질 것이다.
본 발명에 따른 무기 염의 수용액은 인산염, 붕산염, 황산염, 아황산염 및 염산염으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 염의 수용액이며; 인산염 또는 붕산염 수용액은 인산염 또는 붕산염 완충액의 형태인 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 염의 유형으로는 나트륨염, 칼륨염 및 암모늄염이 있다.
본 발명에 따른 무기 염의 수용액은 100mM 내지 무기 염의 포화농도 범위의 몰 농도를 갖는, 고도로 농축된 수용액이다. 포화 농도는 각 염과 온도에 따라서 다양하며, 바람직하게는 300 내지 500mM의 범위내이다.
또한, 무기 염의 수용액은 중성 내지 염기성이어야 하고, 일반적으로 pH 7 내지 10, 바람직하게는 pH 7.5 내지 9.5의 pH 값으로 조정된다.
효소, 및 효소 활성을 지닌 미생물은 특정하게 제한되지 않는다. 효소의 예로는 니트릴 하이드라타제, 니트릴라제 등이 있다.
수 많은 미생물이 니트릴 하이드라타제 및 니트릴라제를 생성시키는 것으로 공지되어 있긴 하지만, 로도코커스(Rhodococcus)속 및 고르도나(Gordona)속에 속하는 미생물이 그들의 높은 효소 활성으로 인해 바람직하다.
이러한 미생물의 예로는 로도코커스 종 HT40-6(FERM BP-5231), 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous)(ATCC 33278), 로도코커스 로도크로우스 J-1(FERM BP-1478) 및 고르도나 테라에(Gordona terrae) MA-1(FERM BP-4535)가 있다.
이들 균주 중에서, 로도코커스 로도크로우스(ATCC 33278)는 공지된 균주이고 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 또한, 로도코커스 종 HT40-6 및 로도코커스 로도크로우스 J-1은 국제기탁기관[National Institute of Bioscience and Human Technology (이전 명칭: Fermentation Research Institute), Agency of Industrial Science and Technology; 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan]에 상기 번호로 기탁된 공지된 균주이고, 이들의 세균학적 성질은 각각, JP-A-4-222591 및 JP-B-6-55148 (여기서, 용어 "JP-A" 및 "JP-B"는 각각, "미심사된 공개된 일본국 특허원" 및 "심사된 일본국 특허공보"를 의미한다)에 기재되어 있다.
고르도나 테라에 MA-1은 본 발명자들 중 몇몇에 의해 토양으로부터 분리된 균주이고 국제기탁기관[National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology]에 상기 번호로 기탁되어 있다. 이러한 균주의 세균학적 성질은 다음과 같다.
이들 세균학적 성질들을 문헌[참조: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986); J. Gen. appl. Micribiol., 34, 341-348 (1988) and Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 371(1989)]에 근거하여 분류하는 경우, 균주 MA-1은 고르도나 테라에 종에 속하는 세균으로서 동정되었다.
이어서, 본 발명의 일반적인 국면에 관해 기술한다.
본 발명에서 사용된 미생물은 동화성 탄소 공급원(예: 글루코즈 및 프럭토즈), 질소 공급원(예: 효모 추출물, 펩톤 및 황산암모늄) 및 무기 염(예: 염화마그네슘, 염화제이철 및 인산수소이나트륨) 뿐만 아니라, 니트릴 하이드라타제 및 니트릴라제 활성의 도입에 필요한 보결족(prosthetic group)으로서 사용될 금속 염, 및 유도제로서 사용될 니트릴(예: 벤조니트릴, 이소부티로니트릴 및 석시노니트릴) 및 아미드(예: ε-카프롤락탐, 이소부틸아미드 및 프로피온아미드)를 함유하는 배지를 사용하여 배양한다. 배양은 목적하는 효소가 그의 최대 활성에 도달할 때까지 pH 4 내지 10, 바람직하게는 pH 6 내지 9의 배지 pH 및 20 내지 40˚C, 바람직하게는 25 내지 35˚C의 배양 온도에서 1 내지 7일간 수행할 수 있다.
생선된 세포를 원성분리시켜 수집하고 붕산염 또는 인산염 완충액으로 1회 또는 2회 세척한다. 그후, 세포 현탁액을, 목적하는 최종 농도가 수득되는 양으로 전술한 무기 염의 수용액과 혼합한다.
세포가 고정화 형태로 사용되는 경우, 세척시킨 세포의 현탁액을 다음 방식으로 고정화시킨 다음 과립화시킨다. 즉, 세척시킨 세포의 현탁액에 하나 이상의 아크릴계 단량체(예: 아크릴아미드, 아크릴산, 메타크릴아미드, 메타크릴산, N,N-디메틸아크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, 디메틸아미노프로필 아크릴레이트, 디메틸아디노프로필 메타크릴레이트 디메틸아미노프로필 아크릴아미드, 디메틸아미노프로필 메타크릴아미드, 디에틸아미노프로필 아크릴아미드 또는 디에틸아미노프로필 메타크릴아미드)와 가교결합제(예: 메틸렌 비스아크릴아미드, 메틸렌 비스메타크릴아미드, 1,2-디하이드록시에틸렌 비스아크릴아미드 또는 비스아크릴아미도아세트산)의 혼합물을 가한 다음, 생성된 현탁액에 중합 개시제와 촉진제(예: 과황산 암모늄 및 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민)를 가하여 중합 및 겔화를 유발시킨다. 그후, 이렇게 생성된 겔을 일반적으로 약 0.5 내지 100mm2입방체로 절단하고, 이를 붕산염 또는 인산염 완충액으로 세척한 다음 세포의 현탁액과 관련하여 전술한 바와 같은 방법으로 무기 염의 수용액과 혼합한다.
고정화 단계에서는, 무수 중량을 기준으로 하여 일반적으로 0.1 내지 40중량%, 바람하게는 1 내지 20중량%의 세포를, 일반적으로 2 내지 30중량%, 바람직하게는 5 내지 15중량%의 단량체 혼합물과 혼합한다.
특정하게 제한되지는 않지만, 보존된 세포 또는 고정화 세포 입자의 농도는 무수 세포 중량을 기준으로 하여 0.1 내지 30중량%의 범위일 수 있다.
보존 온도는 일반적으로 0 내지 40˚C, 바람직하게는 0 내지 35˚C이다.
세포 보존시의 부패를 방지하기 위해, 보존 용액에 항균 활성 또는 항진균 활성을 지닌 약물과, 예를 들면 에틸렌디아민테트라아세트산 등의 기타 염을 가할 수도 있다.
이렇게 보존된 세포 또는 고정화 세포 입자를 전환 촉매로서 생산 반응 공정에 사용하는 경우, 세포 현탁액을 반응 용액에 직접 가하거나 필요에 따라 세척후 가할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제시된다. 그러나, 당해 실시예는 설명을 위한 것이지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주해서는 안된다. 모든 %는 달리 언급되지 않는 한 중량을 기준으로 한 것이다.
실시예 1
(1) 배양
니트릴라제 활성을 갖는 고르도나 테라에 MA-1을 효소 활성 유도제로서 1-사이클로헥세닐아세토니트릴이 보충된 다음 배지중에서 30℃하에 72시간 동안 호기적으로 배양한다:
배지조성 (pH 7.5):
(2) 보존시키고자 하는 세포 현탁액의 제조
배양한 브로쓰를 45ml 분획으로 나누어 5개의 원심분리 튜브에 분배한 다음 원심분리(10,000rpm, 15분, 10˚C)시키고, 각 튜브내에 수집된 세포를 50mM(비교 실시예), 100mM, 300mM, 500mM 또는 700mM 인산염 완충액(pH 8.0, K2HPO4-KH2PO4)45ml로 1회 세척한 다음 세척에 사용된 각각의 농도의 인산염 완충액 45ml에 재현탁시킨다. 각 세포 현탁액을 5ml 분획으로 3개의 캡핑된 유리 용기내에 나누고 암실에서 5, 20 또는 30˚C하에 보존시킨다. 0일째 또는 보존시킨지 120일 또는 300일 후에, 각 세포 현탁액의 일부를 샘플링하여 효소 활성을 측정한다.
(3) 니트릴라제 활성의 측정
보존시킨 각 세포 현탁액의 소량을 원심분리(1,500rpm, 5분, 10˚C)시키고,수집된 세포를 50mM 인산염 완충액(pH 8.0, Na2HPO4-KN2PO4) 2 용적으로 2회 세척하고, 100mM 아황산나트륨을 보충시킨 동일한 인산염 완충액에 현탁시킨다. 기질로서 만델로니트릴 20mM을 세포 현탁액에 가하여 니트릴라제 활성을 측정하고, 30℃에서 30분간 진탕시킨 후, 세포를 원심분리(1,500rpm, 5분, 10˚C)시켜 제거한다. 생성된 상등액에 함유된 R-만델산의 양을 액체 크로마토그래피[컬럼: 와코실(Wakosil) ODS 5C18, 용출제: 0.1M 인산:아세토니트릴=3:1; 검출 파장: 254nm]하여 분석한다.
1단위(1U)의 효소 활성은 무수 세포 1mg이 반응 용액 1ml중에서 분당 만델산 1μmol을 생산하는 능력으로서 정의된다. 저장된 세포 현탁액 1ml중의 효소 활성의 양은 보존된 세포 현탁액 1ml중의 무수 세포의 양(mg) x 무수 세포 1mg의 활성으로 산정한다.
(4) 결과
표 1은 0일째의 보존된 각 세포 현탁액 1nl중에서의 활성을 1.0으로서 규정하고, 이의 상대적 효소 활성치를 나타낸다.
표 1
실시예 2
실시예 1의 배양된 브로쓰를 20ml 분획으로 나누어 6개의 원심분리 튜브에 분배한 다음 원심분리(10,000rpm, 15분, 10˚C)시키고, 각 튜브내에 수집된 세포를 동일한 용적의 50mM 인산염 완충액(pH 8.0, K2HPO4-KH2PO4)으로 1회 세척한 다음, 300mM 황산나트륨, 300mM 염화나트륨, 300mM 염화칼륨 또는 100mM 아황산나트륨이 추가로 보충된 상기 50mM 인산염 완충액 20ml에 재현탁시킨다. 염이 전혀 보충되지 않은 재현탁액을 또한 비교 실시예용으로 제조한다.
세포 현탁액을 암실에서 20˚C하에 60일 동안 보존한다. 보존된 각각의 세포 현탁액 1ml 중의 효소 활성의 양을 실시예 1에서와 동일한 방식으로 측정한다. 표 2는 0일째의 보존된 각 세포 현탁액 1ml중의 활성의 양을 1.0으로서 규정하고, 이의 상대적인 값을 나타낸다.
표 2
실시예 3
실시예 1의 배양된 브로쓰를 20ml 분획으로 나누어 3개의 원심분리 튜브에분배하고 원심분리(10,000rpm, 15분, 10˚C)시키고, 각 튜브내에 수집된 세포를 pH 6.0(비교 실시예), 7.0 또는 8.0의 300mM 인산염 완충액(Na2HPO4-KH2PO4) 20ml로 1회 세척하고, 이러한 세척에 사용된 각각의 pH값을 갖는 동일한 인산염 완충액 20ml에 재현탁시킨다. 이들 세포 현탁액을 암실에서 20˚C하에 60일 동안 보존시킨다. 보존된 각 세포 현탁액 1ml중의 활성의 양은 실시예 1에서와 동일한 방식으로 측정한다. 표 3은 0일째의 보존된 각 세포 현탁액 1ml중에서의 활성의 양을 1.0으로 규정하고, 이의 상대적인 효소 활성치를 나타낸다.
표 3
실시예 4
(1) 배양
니트릴 하이드라타제 활성을 지닌 로도코커스 종 HT40-6을 효소 활성 유도제로서 ε-카프롤락탐이 보충된 다음 배지 중에서 30˚C하에 96시간 동안 호기적으로 배양한다.
배지조성 (pH 7.5):
(2) 보존시키고자 하는 세포 현탁액의 제조
배양된 브로쓰를 45ml 분획으로 나누어 5개의 원심분리 튜브내에 분배한 다음 원심분리(10,000rpm, 15분, 10℃)시키고, 각 튜브내에 수집된 세포를 50mm 인산염 완충액(pH 8.0, K2HPO4-KH2PO4)(비교 실시예) 또는 300mM 인산염 완충액(pH 8.0, Na2HPO4-KH2PO4) 45ml로 1회 세척하고, 이러한 세척에 사용된 각 농도의 인산염 완충액 20ml에 재현탁시킨다. 이렇게 제조된 세포 현탁액을 암실에서 20˚C하에 120일 동안 보존시키고, 각 세포 현탁액의 일부를 0일째 및 120일째에 샘플링하여 효소 활성을 측정한다.
(3) 니트릴 하이드라타제 활성의 측정
실시예 1에서와 동일한 조건하에 동일한 방법으로 반응을 수행하고, 형성된 생성물(만델아미드)을 실시예 1에서와 동일한 조건하에 액체 크로마토그래피하여 정량적으로 측정한다.
(4) 결과
표 4는 0일째의 보존된 각 세포 현탁액 1ml중에서의 활성의 양을 1.0으로 규정하고, 이의 상대적인 효소 활성치를 나타낸다.
표 4
실시예 5
고로도나 테라에 MA-1, 로도코커스 종 HT40-6 및 로도코커스 로도크로우스 ATCC 33278을 MA-1에 대한 실시예 1의 방법 및 HT40-6 및 ATCC 33278에 대한 실시예 4의 방법에 따라서 별도로 배양한다. 이렇게 배양된 각 브로쓰 20ml 분획을 원심분리(10,000rpm, 15분, 10˚C)시키고, 수집된 세포를 동일한 용적의 100mM 붕산염 완충액(pH 9.0, Na2B4O7·10H2O-HCl)으로 1회 세척하고 동일한 완충액 20ml에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 암실에서 20˚C하에 200일 동안 보존시키고, 0일째 및 200일째의 보존된 각 세포 현탁액 1ml중의 활성의 양을 실시예 1 및 4의 각 방법에 따라서 측정한다. 표 5는 0일째의 보존된 각 세포 현탁액 1ml중에서의 활성의 양을 1.0으로서 규정하고, 이의 상대적인 값을 나타낸다.
표 5
실시예 6
(1) 고정화 세포 입자의 제조
니트릴 하이드라타제 활성을 지닌 로도코커스 로도크로우스 J-1을, 2% 글루코즈, 1% 우레아, 0.5% 펩톤, 0.35 효모 추출물 및 0.05% 염화코발트(모두 중량%임)를 함유하는 배지(pH 7.0)중에서 호기적으로 배양한다. 생성된 세포를 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척한다. 이어서, 아크릴아미드 20중량%, 메틸렌 비스아크릴아미드 2중량% 및 2-디메틸아미노프로필 메타크릴아미드 2중량%의 단량체 혼합물 500g을 세포 현탁액 500g(무수 세포를 기준으로 하여 20중량%)에 가하고 완전히 현탁시킨다. 여기에 50중량%의 과황산암모늄 2g과 50중량%의 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 2g을 가하여 중합 및 겔화를 유발시킨다. 생성된 겔을 약 1mm2입방체로 절단하고 20mM 황산나트륨 1,000ml로 5회 세척하여 고정화 세포 입자를 수득한다.
(2) 보존시키고자 하는 고정화 세포 입자 현탁액의 제조
정치시켜 침전시킨, 고정화 세포 입자 200ml 분획을 500ml 용량의 폴리에틸렌 용기내에 넣고 40% 황산암모늄 용액(pH 7.0으로 조정됨) 및 8% 염화나트륨 용액(pH 7.0으로 조정됨) 각 200ml와 혼합한 다음, 30˚C에서 100일간 보존시킨다. 20mM의 황산나트륨을 가하는(비교 실시예) 것을 제외하고는 동일한 과정을 반복한다.
(3) 니트릴 하이드라타제 활성의 측정
이렇게 보존시킨 고정화 세포 입자 현탁액의 소량을 5용적의 50mM 인산염 완충액(pH 7.0, Na2HPO4-KH2PO4)으로 세척한다. 이어서, 샘플을 거즈로 싼 다음, 원심분리시켜 탈수시키고, 이렇게 처리시킨 입자 약 1g을 동일한 인산염 완충액 100ml에 현탁시킨다. 현탁액을 동일한 인산염 완충액 중에서 5% 아크릴로니트릴 용액과 혼합하고, 0˚C에서 20분간 진탕시킴으로써 반응을 개시한다. 반응 혼합물을 0.45μm 필터를 통해 여과시킴으로써 반응을 종결짓는다. 생성된 여액중에 형성된 아크릴아미드의 양을 가스 크로마토그래피[주입 온도: 220˚C; 컬럼 온도: 180˚C, 패킹: 포라팩(Porapack) PS 80-100 MESH(워터사 제조); 검출기: FID]하여 분석한다.
(4) 결과
표 6은 0일째의 고정화 세포 입자 1g중에서의 활성의 양을 1.0으로서 규정하고, 이의 상대적인 효소 활성치를 나타낸다.
표 6
따라서, 본 발명은 니트릴 하이드라타제 또는 니트릴라제 효소 활성을 갖는 다량의 세포 또는 고정화 세포 입자를 실온에서조차도 세포 용해 또는 효소 열화없이도 장기간(예를 들어, 300일)동안 보존하기 위한 산업상 유용한 방법을 제공해준다. 또한 본 발명은 통상의 보존 방법에 필요한 노동력과 냉각 비용을 상당히 감소시킬 수 있게 한다.
본 발명이 이의 특정 양태를 참조로 하여 보다 상세히 기술되긴 하였지만, 당해 분야의 숙련인에게는 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 각종 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 명백할 것이다.

Claims (14)

  1. 효소 활성을 지닌 미생물 세포를 이의 현탁액으로서 또는 고정화된 세포 입자의 현탁액으로서, 몰 농도 범위가 100mM 내지 무기 염의 포화 농도인 무기 염의 중성 또는 약 염기성 수용액인 수성 배지내에 보존시킴을 포함하여, 효소활성을 지닌 미생물 세포 및 이의 효소 활성을 장시간 동안 안정하게 보존시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 무기 염의 수용액이 인산염, 붕산염, 황산염, 아황산염 및 염산염으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 염의 수용액인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 무기 염이 나트륨염, 칼륨염 및 암모늄염으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 염인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 무기 염의 수용액의 pH 값이 pH 7 내지 10의 범위인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 효소 활성이 니트릴 하이드라타제 활성 또는 니트릴라제 활성인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 미생물 세포가 고르도나 테라에 MA-1(FERM BP-4535)인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 미생물 세포가 로도코커스 로도크로우스 종 HT40-6(FERM BP-5231)인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 미생물 세포가 로도코커스 로도크로우스 J-1(FERM BP-1478)인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 미생물 세포가 로도코커스 로도크로우스 ATCC 33278인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 고정화된 세포 입자의 농도 범위가, 건조 세포를 기준으로 하여, 0.1 내지 30중량%인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 보존 온도 범위가 0 내지 40˚C인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 무기 염의 수용액이, 몰 농도 범위가 300 내지 700mM인 인산염 완충액을 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 무기 염의 수용액이, 몰 농도가 50mM인 인산염 완충액과 몰 농도가 300mM인 황산나트륨 용액을 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 고정화된 세포 입자를 황산암모늄 수용액에 현탁시키는 방법.
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