KR100391221B1 - 염색체 통합 벡터 - Google Patents

Abstract

[목적] 균류 형질 변이체에 대한 약제 내성의 신규한 선택적 마커를 부여할 수 있는 신규한 염색체 통합 벡터를 제공하기 위한, 상기 벡터로 형질 변이된 형질변이체 및 상기를 제조하는 방법.

아우레오바시딘에 대한 내성을 부여할 수 있고 선택적인 마커로 작용할 수 있는 단백질 및 상기에 대해 코딩하는 DNA.

[구성] 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 숙주 균류를 위한 염색체 통합 벡터. 복제 벡터를 절단하여 벡터를 얻는 단계, 벡터를 숙주 균류의 염색체내로 통합시키는 단계 및 그리하여 얻은 숙주를 선별하는 단계로 구성되는 아우레오바시딘 내성 형질 변이체 생산 방법, 및 상기 방법에 의해 얻은 형질 변이체, 상기 벡터는 외래 유전자를 함유할 수 있다.

아우레오바시딘에 대한 민감성을 부여할 수 있는 서열 목록에서 SEQ ID NO.1 로 표시되는 단백질의 적어도 240 번째 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질 또는 상기 언급된 단백질을 아미노산 잔기(들)의 치환, 삽입 및 삭제로 부터 선택된 변형 중 적어도 하나에 적용시켜 얻은 아미노산 서열을 갖는 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 다른 단백질. 단백질에 대해 코딩하는 DNA.

[효과] 특히 예를들면, 실제 사용가능한 효모를 품종개량하는 유전 공학 및 상기에 대한 유전학적 정보의 분석에 사용가능하다.

Description

염색체 통합 벡터

본 발명은 숙주에 신규 우세한 유전 마커를 부여할 수 있고, 균류 세포의 염색체내로 통합될 수 있으며 그로써 특정 배지 내로 접종된 상기 세포로 부터 형질변이체를 쉽게 감지할 수 있는 벡터, 상기 언급한 벡터를 사용하여 그에 부가된 마커를 갖는 형질변이체를 생산하는 방법, 및 상기 백터에 의해 형질변이된 형질변이체에 관한 것이다.

본 발명은 부가로 항진균성 아우레오바시딘에 대한 민감성을 부여할 수 있는 단백질의 돌연변이체, 아우레오바시딘 내성 단백질로 변이된 돌연 변이체, 및 상기 단백질에 대해 코딩하는 DNA에 관한 것이다.

실험실에서 사용되는 일배체 균류 세포, 예를들면,사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae, 이후 간단히S.세레비시에로 부름),스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe, 이후 간단히Schizo.폼브로 부름) 및아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans, 이후 간단히A.니둘란스로 부름) 내로 유용한 유전자를 혼입하는 기술이 알려져 왔다. 플라스미드 DNA 를 균류 세포내로 병합시키고 고정시키는 것이 비교적 성공하기 힘들기 때문에, 형질변이체를 확인할 때 선택적인 마커를 사용하는 것이 요구된다. 대부분의 경우, 선택은 생장인자를 필요로하는 돌연변이를 숙주 세포내 혼입하여 수행할 수 있다. 예를들어,S.세레비시에에 일반적으로 사용되는 돌연변이의 예는 Ura3, leu2 trp1 및 his3 을 포함한다. 플라스미드는 상기 유전자 중 하나의 아생형 전사를 운반한다. 플라스미드 상의 야생형 전사는 숙주의 염색체 대립형질에 대해 우세하기 때문에, 그에 혼입된 플라스미드를 갖는 세포는 생장인자를 필요로하는 숙주 세포에 의해 요구되는 영양소를 함유하지 않은 최소 배지내에서 선별될 수 있다. 또한 작은 수이지만, 형질변이체를 선별할 때 약제 내성을 사용하는 것에 관한 몇몇 보고서가 공개되었다. 즉, 네오마이신 동족체 G418, 하이그로마이신 및 세룰레닌과 같은 항생물질에 대한 내성을 갖는 유전자를 함유한 복제 벡터 및 염색체 통합 벡터가 보고되었다. 복제 벡터는 세포내에서 작용하는 DNA 복제 기원을 갖는다. 상기 플라스미드는 고리형 유전자부체로서 염색체 외부에 유지되고 세포의 증식에 따라 수％의 비율로 연속적으로 감소된다. 통합 벡터는 숙주 세포의 염색체내로 삽입되어 안정한 상태로 유지된다. 그러므로, 상기 경우에, 벡터의 서열을 유지하는 선택적인 기능을 부여하기 위해 배지에 부가로 약제를 첨가하는 것이 불필요하다.

산업용 균류의 경우에, 부여된 유용한 특성을 안정한 상태로 유지하는 것이 요구된다. 염색체 통합 벡터가 상기 용도를 위해 유용하다.

균류는 청주, 맥주 및 와인과 같은 알콜 음료 및 미소(발효된 대두콩 페이스트) 및 간장과 같은 발효 식품에 널리 이용되어 왔다. 또한 산업적 용도에 사용되는 상기 균류를 품종개량하기 위해, 유전 공학 기술이 그에 유용한 특징을 부여하는데 매우 효과적이다. 그리하여 효과적으로 형질변이체를 선별하는데 사용할 수 있는 선택적인 마커가 요구되어 왔다. 산업용 효모는 보통 이배체 또는 배수체 세포이다. 그러므로, 예를들어, 실험실에서 사용되는 효모의 일배체 세포에 효과적인 생장인자를 필요로하는 마커를 상기 산업용 효모에 혼입하는 것이 어렵다. 더욱이, 돌연변이화가 다른 유전자의 돌연변이를 유도할 가능성이 높기 때문에, 따라서 그에 단독으로 혼입된 원하는 생장인자를 필요로하는 돌연변이를 갖는 돌연 변이체를 발생시키는 것이 매우 어렵다. 약제 내성을 사용하면 염색체의 수 또는 특정 돌연변이 발생에 상관없이 인위적 효모의 안정한 형질변이체를 선별할 수 있다. 그러나 많은 이들 산업용 균류는 G418 및 하이그로마이신과 같은 항생물질에 둔감하며, 따라서 상기는 상기 항생물질에 대해 내성을 갖는 유전자를 사용 불가능하게 한다. 더욱이 상기 내성 유전자는 원핵 생물인 박테리아로 부터 유도된 유전자 또는 단백질이고 상기 유전자에 상응하는 어떠한 것도 효모와 같은 균류내에 존재하지 않는다. 그에 통합된 이러한 외래 유전자를 갖는 균류 세포의 사용은 엄격하게 제한되어 있다.S.세레비시에에서 기원한 세룰레닌 내성 유전자 (PDR4)는 양조 효모를 포함한S.세레비시에의 형질변이에 사용가능하다. 그러나, 상기는 또한 실제 사용에서 몇몇 문제를 야기할 수 있는 셀룰레닌 외의 약제에 대한 내성이 부여된다. 그러므로 PDR4는 이후 개선된 특성을 갖는S.세레비시에를 포함하는 산업용 균류를 품질개량하기 위한 조건을 완전히 만족시킬 수 없다. 그리하여 본질적으로 균류에 의해 운반되는 유전자를 사용한 약제 내성 마커를 개발하는 것이 요구되었다.

이러한 여건하에서, 본 발명은 약제 내성의 신규한 선택적 마커를 균류 형질변이체에 부여할 수 있는 신규한 염색체 통합 벡터, 및 상기 벡터에 의해 형질변이된 형질변이체를 제공하는데 목적이 있다.

본 발명은 부가로 아우레오바시딘 내성을 부여하고 균류의 유전자 공학예서 사용가능한 선택적인 마커로서 작용할 수 있는 단백질, 및 상기 단백질에 대해 코딩하는 DNA 를 제공하는데 목적이 있다.

본 발명은 하기와 같이 요약될 수 있다. 즉, 본 발명의 제 1 발명은 아우레로바시딘 내성 유전자를 함유한 것을 특징으로 하는 숙주 균류를 위한 염색체 통합 벡터에 관한 것이다. 상기 염색체 통합 벡터는 종종 외래 유전자를 함유한다. 제 2 발명은 하기로 구성되는 것을 특징으로하는 아우레오바시딘 내성 형질변이체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

(1) 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 복제 벡터를 얻는 단계,

(2) 상기 단계에서 얻은 복제 백터내 한 부위예서 아우레오바시딘 내성 유전자를 절단하여 숙주 균류를 위한 염색체 통합 벡터를 얻는 단계,

(3) 상기 단계에서 얻은 숙주 균류를 위한 염색채 통합 벡터를 숙주 균류의 염색체내로 통합하는 단계; 및

(4) 아우레오바시딘 존재하에 아우레오바시딘 내성체로 형질변이된 숙주를 선택하는 단계.

아우레오바시딘 내성 변이체를 생산하는 상기 방법에서, 복제 벡터는 종종 외래 유전자를 함유한다. 제 3 발명은 제 2 발명의 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 변이체에 관한 것이다.

제 4 발명은 서열 목록에서 SEQ ID No. 8 로 표시되는 아우레오바시딘 민감성을 부여할 수 있는 단백질 내 적어도 240 번째 아미조산 잔기 Ala 가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질, 또는 상기 -언급된 단백질을 아미노산 잔기(들)의 치환, 삽입 및 삭제로 부터 선택된 변형중 적어도 하나에 적용시켜 얻은 아미노산 서열을 갖고 상기-언급된 단백질과 필적할만한 생물학적 활성을 보이는 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 다른 단백질에 관한 것이다. 제 5 발명은 제 4 발명의 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질에 대해 코딩하는 DNA 에 관한 것이다.

아우레오바시딘 [일본 특허 공개 제 138296/1990호, 제 22995/1991호, 제 220199/1991호 및 제 279384/1993호, 일본 특허 출원 제 303177/1992, J.Antibiotics,44(9), 919-924,ibid,44(9), 925-933,ibid.,44(11), 1187-1198 (1991)]은 균주아우레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) No. R106 (FERMBP-1938)의 발효 생산물로서 얻어지는 고리형 뎁시펩티드이다. 상기는 다른 항진균체와 구조가 완전히 다르다. 표 1 및 2가 제시하는 바와 같이, 대표적인 아우레오바시딘 화합물인 아우레오바시딘 A 는칸디다 알비칸스(Candida albicans, 이후 간단히C.알비칸스로 부름)를 포함하는칸디다속의 여러가지 효모.크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcusneoformans),히스토플라스마 캅슐라툼(Histoplasma capsulatum),블라스토마이세스 덜마티티디스(Blastomyces dermatitidis) 및아스페르길루스속 균류 (일본 특허 공개 제 138296/1990호)에 잠재적인 항진균 활성을 나타내지만 포유류내에서 극도로 낮은 독성을 보인다. 그리하여 상기 화합물은 선택적인 독성면에서 우수한 항진균체이다.

이후,칸디다,크립토코쿠스및아스페르기루스는C.Cr및A. 로 간단히 표기할 것이다.

[ 표 1 ]

[ 표 2 ]

일본 특허 출원 제 106158/1994호에 서술된 바와 같이, 본 발명가들은 이전에Schizo.폼브및S.세레비시에와 같은 균류가 아루레오바시딘에 대해 민감성을 보이는 것을 발견했다.

[ 표 3 ]

본 발명가들은 아우레오바시딘에 민감한Schizo.폼브또는S.세르비시에의해 야생형 균주를 돌연변이화하여 내성 돌연변이체를 얻었다. 본 발명가들은 부가로 상기 내성 돌연변이체로 부터 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 유전자 (내성 유전자) 및 상응하는 민감성 세포로 부터 아우레오바시딘 민감성을 부여할 수 있는 다른 유전자 (민감성 유전자)를 성공적으로 단리했다. 또한, 본 발명가들은 상기 유전자 각각에 의해 코딩되는 단백질의 존재를 밝혔다. 본 발명가들은 또한 상기 유전자를 함유한 복제 벡터를 제조하고 상기 벡터를 사용하여 형질변이시킨 세포를 인큐베이션시킴으로써 상기 유전자를 발현시키는데도 성공했다. 프로브로서 상기 유전자의 DNA 단편을 사용하여, 본 발명가들은 부가로 아우레오바시딘에 민감한 다른 균류들로 부터 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 신규한 유전자를 발견하는데 성공했다.

표 1 및 2에 나열된 아우레오바시딘 민감성을 갖는 균류 및 표 3에 나열된 균류는 각각 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 단백질 및 상기 단백질에 대해 코딩하는 유전자를 운반한다. 본원에 사용된 용어 "아우레오바시딘 민감성을 제어하는 단백질"은 아우레오바시딘에 대한 민감성을 가진 균류내 함유된 단백질을 의미한다. 상기 단백질은 아우레오바시딘에 대한 민감성 또는 내성의 발현을 위해 요구된다. 물론, 상기-언급한 단백질과 같은 동족체를 35％ 이상 갖고 유사한 기능을 갖는 단백질이 또한 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 단백질에 포함된다. 더욱이, 유전자 공학 절차에 의해 상기 단백질을 변형시켜 얻은 단백질은 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 단백질에 포함된다. 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 유전자는 상기 서술된 것과 같이 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하고 민감성 유전자 및 내성 유전자를 모두 포함한다.

아우레오바시딘 민감성을 제어하는 유전자를 단리하기 위해, 아우레오바시딘 민감성 세포 (야생형 균주)를 먼저 유전자 돌연변이화에 적용하여 그로부터 내성 균주를 유도한다. 다음, DNA 라이브러리를 상기 내성 균주의 염색체 DNA 또는 cDNA로 부터 제조하고 내성을 부여할 수 있는 유전자 (내성 유전자)를 상기 라이브러리로 부터 클로닝시킨다. 또한, 민감성 유전자는 야생형 균주의 DNA 라이브러리를 제조하고 상기 라이브러리로부터 내성 유전자와 혼성가능한 DNA 분자를 단리하고 상기를 클로닝시켜 단리할 수 있다.

유전자 돌연변이화는, 예를들면, 에틸메탄 설포네이트 (EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG)과 같은 화학약품으로 처리하거나 또는 자외선 또는 다른 복사에 의해 수행한다. 내성을 획득한 세포는 적합한 조건하에 적합한 농도로 아우레오바시딘을 함유한 영양 배지내에서 유전자돌연변이된 세포를 배양하여 선별할 수 있다. 그리하여 얻어진 내성 균주는 유전자 돌연변이를 위해 선택된 방법 및 조건에 따라 변할 수 있다.

본 발명에 따른 이우레오바시딘 민감성을 제어하는 유전자 ( aur 로 명명)의 대표적인 예로서, aurl 유전자를 들 수 있다. aurl 유전자의 대표적인 예는Schizo. 폼브로 부터 단리된 spaurl 유전자 및S.세레비시에로 부터 단리된 scaur1 유전자를 포함한다. 이제, 본 발명가들에 의해 내성 돌연변이체로 부터 단리된 내성 유전자 (spaurl^R및 scarurl^R) 및 민감성 야생형 균주로 부터 단리된 민감성 유전자 (spaurl^S및 scaurl^S)를 서술할 것이다.

제 3도는 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 유전자 spaurl^R및 spaurl^S의 제한 효소 지도를 제시하고 제 4도는 scaurl^R및 scaurl^S의 제한 효소 지도를 제시한다.

아우레오바시딘에 민감한Schizo.폼브를 EMs 로 운전자돌연변이화하고 그리하여 얻어진 내성 균주의 게놈 라이브러리를 제조한다. 상기 라이브러리로 부터, 내성 유전자 (spaurl^R)를 함유하고 제 3도의 제한 효소 지도를 갖는 DNA 단편을 단리한다. 상기 유전자는 서열 목록에서 SEQ ID No. 1로 표시된 누클레오티드 서열을 갖는다. 상기 누클레오티드 서열을 기초로하여 결정된, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록에서 SEQ ID No. 2 로 표시된 것이다. 프로브로서 상기 내성 유전자를 사용하며 혼성함으로써, 민감성 유전자 (spaurl^S)를 함유하고 제 3도의 제한 효소 지도를 갖는 DNA 단편을 민감성 균주로부터 단리한다. 상기 유전자는 서열목록에서 SEQ ID No.3 으로 표시되는 누클레오티드 서열을 갖는다. 상기 누클레오티드 서열을 기초로하여 결정된, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록에서 SEQ ID No. 4 로 표시되는 것이다. SEQ ID No. 3 과 SEQ ID No. 1 의 서열간의 비교는 G 에서 T 로의 돌연변이가 1053 위치에서 발생한 것을 나타내여, SEQ ID No. 4 와 SEQ ID No. 2 의 서열간의 비교는 잔기 240 에서 글리신이 아미노산 수준에서 시스테인으로 전환되어, 내성을 초래하는 것을 나타낸다.

또한, 아우레오바시딘에 민감한S.세르비시에를 EMS 로 유전자돌연변이화하고 그리하여 얻어진 내성 균주의 게놈 라이브러리를 제조한다. 우세한 돌연변이체로서 내성 유전자 (scaurl^R)를 함유하고 제 4도의 제한효소 지도를 갖는 DNA 단편을 단리한다.

Scaurl^R유전자의 단백질에 대한 코딩 영역의 누클레오티드 서열은 서열 목록에서 SEQ ID No. 5 로 표시되는 것이다. 상기 누클레오티드 서열을 기초로하여 결정된, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록에서 SEQ ID No. 6 으로 표시되는 것이다. 프로브로서 상기 내성 유전자 scaurl^R을 사용하며 혼성함으로써, 민감성 유전자(scaurl^S)를 함유하고 제 4도의 제한 효소 지도를 갖는DNA 단편을 민감성 균주로 부터 단리한다. 상기 유전자는 서열 목록에서 SEQ ID No. 7 로 표시되는 누클레오티드 서열을 갖는다. 상기 누클레오티드 서열을 기초로하여 결정한 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록에서 SEQ ID No. 8 로 표시되는 것이다. SEQ ID No. 7 과 SEQ ID No. 5 의 서열간의 비교는 T 에서 A 로의 돌연 변이가 852 위치의 염기에서 발생한 것을 나타내며, SEQ ID No. 8 과 SEQ ID No. 6 의 서열간의 비교는 잔기 158에서 페닐알라닌이 아미노산 수준예서 티로신으로 전환됨으로써 내성을 초래하는 것을 나타낸다. spaur1 유전자는 아미노산 수준으로 scaur1 유전자와 58％ 가 같은 동족체이다. 그리하여 그들이 서로 유사한 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 유전자라는 것이 명백하다. spaur1 및 scaur1 유전자와 그리고 상기에 의해 코딩되는 단백질과 동족체인 유전자 및 단백질을 데이타 베이스로 부터 조사할 때, 35％ 이상이 같은 동족체는 감지되지 않는다. 따라서, 이들 유전자 및 그들에 의해 코딩되는 단백질은 이제껏 공지되지 않았던 신규한 분자임이 분명하다.

다음으로, 서열 목록에서 SEQ ID No. 9 및 No. 10 으로 표시되는 프라이머 한쌍을 SEQ ID No. 1 로 표시되는 spaurl^R유전자의 DNA 염기 서열을 기초로하여 합성한다. 상기 프라이머를 사용하고, 템플레이트로서 발병 균류C.알비칸스의 cDNA 를 사용하며 PCR 을 수행한다. 그리하여 얻은 PCR 생산물을 아가로스 겔상 전기 영동하고 에티디움 브로마이드로 착색하여 DNA 단편의 특이적 증폭을 확인한다.

그리하여 얻어진 DNA 단편을 프로브로서 사용하여,C.알비칸스의 게놈 DNA 라이브러리를 선별한다. 그리하여 spaurl 및 scaurl 유전자와 유사한 기능을 갖는유전자 (caaurl)를 함유하고 제 5도의 제한 효소 지도를 갖는 DNA 분자를 얻는다. 상기 caaurl 유전자의 염기 서열은 서열 목록에서 SEQ ID No. 11 로 표시된 것이다. 상기 염기 서열을 기초로하여 결정된 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록에서 SEQ ID No. 12로 표시된 것이다. 그리하여 상기 단백질은 spaurl 및 scaurl 유전자에 의해 코딩되는 단백질과 많이 같다.

상기-언급된 실시예가 명백히 제시한 바와 같이, 각각의 유기체 또는 각각의 방법에 상응하는 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 유전자는 아우레오바시딘에 민감한 유기체인 출발 물질을 사용하여 상기 서술된 것과 같은 방식으로 다양한 유전자 돌연변이화 및/또는 신별 처리를 수행하여 클로닝을 수행함으로써 단리할 수 있다. 또한, 상기 유전자와 혼성된 유전자를 단리할 수 있다. 물론, 화학적, 물리학적 또는 유전 공학적 기술에 의해 상기 얻어진 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 유전자를 부분적으로 변환시켜 변형된 유전자를 제조하는 것이 가능하다.

본 발명에서, 아우레오바시딘 내성 유전자는 숙주 균류내에 통합될 때 항진균성 아우레오바시딘에 대한 내성을 부여할 수 있는 유전자를 말한다. 상기 유전자는 아우레오바시딘 내성을 부여하는 단백질에 대해 코딩한다.

아우레오바시딘 내성 유전자는 상기 언급된 spaurl^R및 scaurl^R이 대표적인 예이다. 상기 유전자가 우세하게 작용하고 상기 유전자에 의해 부여되는 내성은 아우레오바시딘에 대해 선택적이다. 다시말해, 다른 약제에 대한 민감성에 있어서 임의의 실질적인 변화를 초래하지 않는다.

아우레오바시딘 내성 유전자는 또한 spaurl^R및 scaurl^R과 혼성가능하고 숙주 균류에 아우레오바시딘 내성을 부여하는 유전자(예를 들면, 화학적, 효소적, 물리적 또는 유전 공학적 기술에 의해 spaurl^R또는 scaurl^R유전자를 부분적으로 변환시켜 제조한 유전자)를 포함한다.

또한, 아우레오바시딘 내성 유전자는 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질(Aurl^Rp)을 아미노산 잔기(들)의 치환, 삽입 및 삭제로부터 선택된 변형중 하나 이상에 적용하여 얻은 아미노산 서열을 갖고 아우레오바시딘 내성을 부여하는 활성을 보이는 단백질에 대해 코딩하는 유전자를 포함한다.

Aurl^Rp로부터 아미노산 잔기(들)을 치환하고, 삽입하고 그리고 삭제하는 것은 부위-특이적 유전자돌연변이화에 의해 수행할 수 있다. 단리된 Aurl^Rp에 대해 코딩하는 DNA 또는 아우레오바시딘 민감성을 부여할 수 있는 단백질(Aurl^Sp)에 대해 코딩하는 DNA는 누클레오티드(들)의 치환, 삽입 및 삭제중 적어도 하나를 수행하여 쉽게 변형시킬 수 있고 그리하여 Aurl^RP의 돌연변이체에 대해 코딩하는 신규한 DNA를 얻을 수 있다. 아미노산 잔기(들)의 치환, 삽입 및 삭제에 대해 고려할 때, 아미노산(들)의 전환은 특정 부위에서 잔기에 대한 돌연변이를 적절히 수행하기 위해 생물학적 활성을 손상시키지 않고 유전 공학 기술에 의해 수행할 수 있는 것을 기초로하고 타겟 코돈은 랜덤 유전자 돌연변이화에 적용시키고 원하는 활성을갖는 유전자를 그리하여 표현된 것들로부터 선별한다. 삽입에 으이해 얻어지는 돌연변이체는 Aurl^Rp 또는 그의 단편이 펩티드 결합에 의해 Aurl^Rp 또는 그의 단편의 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단에서 다른 단백질 또는 폴리펩티드에 결합된 유합 단백질을 포함한다. 아미노산 잔기(들)을 삭제하기 위해, 아미노산 서열내 인위적 아미노산 코돈을 간격을 띄운 복식 방법에 의해 말단 코돈으로 치환하여 치환된 아미노산 잔기의 카르복실 말단쪽 영역을 아미노산 서열로부터 삭제하는 것이 가능하다. 대안으로, 임의의 길이로 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단 영역이 삭제된 단백질에 대해 코딩하는 DNA를 아미노산 서열의 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단에 상응하는 영역(들)로부터 코딩 DNA를 감성시키는 것으로 구성되는 삭제방법[Gene,33, 103-119 (1985)]에 의해 또는 개시 코돈 및/또는 종결 코돈을 함유한 프라이머를 사용하는 PCR 방법에 의해 얻을 수 있다. 공지된 부위 특이적 유전자 돌연변이화 방법의 예는 올리고누클레오티드(들)을 사용하는 간격 복식 방법 [Methods in Enzymology,154, 350-367 (1987)], 올리고누클레오티드(들)을 사용하는 우라실 DNA 방법[Methods in Enzymology,154, 367-382 (1987)], 질소산 돌연변이 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79, 7258-7262 (1982)] 및 카셋트 돌연변이 방법[Gene,34, 315-323 (1985)]을 포함하다.

본 발명가들은 서열 목록에서 SEQ IN No. 8로 표시되는 Aurl^Rp 를 다른 아미산 잔기로 240번째 잔기 Ala를 치환하여, 제 4 및 제 5 발명을 완결함으로써 Aurl^Rp 로 전환시킬 수 있음을 발견했다.

제 4 발명의 Aurl^Rp 는 서열 목록에서 SEQ IN No. 8로 표시되는 Aurl^Sp 의 240번째 잔기 Ala가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 다른 아미노산 잔기는 그로 인해 생물학적 활성이 손상되지 않는 한, 화학적, 물리적 또는 유전 공학적 기술을 사용하여 치환되거나, 삽입되거나 또는 삭제될 수 있다. 제 4 발명의 Aurl^Rp 는 서열 목록에서 SEQ ID No. 23 으로 표시되는 Aurl^Sp 에 대해 코딩하는 유전자를 사용함으로써 유전 공학 기술에 의해 적절히 제조할 수 있다. 그의 생물학적 활성은 아우레오바시딘 민감성 세포를 내성 세포로 전환시키는 활성을 측정하여 평가할 수 있다. 제 4 발명의 Aurl^Rp 는 서열 목록에서 SEQ IN No. 6으로 표시되는 Aurl^Rp 에 비해 아우레오바시딘 민감성 세포를 내성 세포로 전환시키는 활성이 향상된 것이다.

바람직한 Aurl^Rp 는 서열목록에서 SEQ ID No. 6으로 표시되는 Aurl^Rp 에 비해 아우레오바시딘 민감성 세포를 내성 세포로 전환시키는 활성이 향상된 것이다. 상기 Aurl^Rp 에 대해 로딩하는 DNA는 본 발명에서 적합하게 사용될 수 있다.

특히 바람직한 실시양태의 Aurl^Rp의 예에서, 돌연변이체는 240번째 잔기 Ala를 Cys로 치환하여 얻을 수 있다. 상기 돌연변이체의 예의 아미노산 서열은 서열 목록에 SEQ ID No. 18로 제시된다. 상기 돌연변이체를 Aurl^Rp (A240C)로 부른다. Aurl^Sp 의 158번째 잔기 Phe 및 240번째 잔기 Ala가 각각 Tyr 및 Cys로 치환된 돌연변이체를 또한 얻을 수 있다. 상기 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열 목록에 SEQ ID No. 19로 제시된다. 상기 돌연변이체를 Aurl^R(F158Y, A240C)로 부른다. 상기 돌연변이체 각각은 Aurl^Sp 의 158번째 잔기 phe가 Tyr로 치환된 서열 목록에서 SEQ IN No. 16으로 표시되는 단백질 [Aurl^Rp (F158Y) 보다 강한 아우레오바시딘 내성을 부여하는 능력을 가졌다.

본 발명에 사용되는 아우레오바시딘 내성 유전자는 서열 목록에서 SEQ IN No. 20-22로 표시되는 DNA로 예시된다. 서열 목록에서 SEQ IN No. 22로 표시되는 DNA는 Aurl^Rp (F158Y)에 대해 코딩하는 DNA이고, 서열 목록에서 SEQ ID No. 20으로 표시되는 DNA는 Aurl^Rp (A240C)에 대해 코딩하는 DNA이고, 서열 목록에서 SEQ ID No. 21로 표시되는 DNA는 Aurl^Rp (F158Y, A240c)에 대해 코딩하는 DNA이다.

복제 플라스미드는 아우레오바시딘 민감성을 제어하는 단백질에 대해 코딩하는, 유전자를 적절한 벡테내로 통합시켜 제조할 수 있다. 예를 들면, 아우레오바시딘 내성 유전자를 적합한 효모 벡터내로 통합시켜 제조한 플라스미드는 선택적인 마커 유전자로서 매우 유용한데, 이는 형질변이체가 아우레오바시딘을 사용하는 약제 내성에 따라 쉽게 선택될 수 있기 때문이다. 효모를 위한 벡터로서, YRp, YCp, YEp 및 YIp 유형의 것을 사용할 수 있다.

또한, 복제 플라스미드는 예를 들면,에쉬리키아 콜리(Escherichia coli)에 의해 안정하게 운반될 수 있다. 상기 경우에 사용할 수 있는 벡터의 예는 pUC118, pWH5, pAU-PS, Traplex 119 및 pTV118을 포함한다. 그에 통합된 Scaurl^S유전자를 갖는 pAU-PS을 pSPAR1로 명명한다. 그에 통합된 Spaurl^S유전자를 갖는 pWH5를 pSCAR1으로 명명한다. 그에 통합된 caaurl 유전자를 갖는 Traplex 119 벡터를 pCAAR1로 명명한다. 상기 재조합 플라스미드 각각은E. 콜리로 형질변이된다. 상기 플라스미드를 적합한 숙주내에 발현시키는 것이 또한 가능하다. 상기 유전자는 개방 해석 프레임(ORF)으롤 전적으로 환원되어 필요하다면, 적합한 제한 효소로 절단하여 단백질내로 해독되고나서 적합한 벡터에 결합된다. 그리하여 발현 재조합 플라스미드를 얻을 수 있다.E. 콜리를 숙주로 사용할 때, pTV118과 같은 플라스미드를 발현 플라스미드를 위한 벡터로 사용할 수 있다. 효모를 숙주로 사용할 때, pYES2와 같은 플라스미드를 벡터로 사용할 수 있다. 그에 통합된 Spaurl^S유전자를 갖는 pSPAR1에 의해 변이된E. 콜리JM109는에쉬리키아 콜리JM109/pSPAR1으로 명명되고 지정되고 부다페스트 조약에 따라, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, 히가시 1 조메 추쿠바-시 이바라키-켄 305, 일본)에 수탁 번호 FERM BP-4485로 기탁되어 있다. 그에 통합된 Scaurl^S유전자를 갖는 pSCAR1 에 의해 형질 변이된E. 콜리HB101은에쉬리키아 콜리HB101/pSCAR1으로 명명되고 지정되었고 부다페스트 조약에 따라 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology에 수탁 번호 FERM BP-4483으로 기탁되어 있다. 그에 통합된 Caaurl^S유전자를 갖는 pCCAR1에 의해 형질 변이된E. 콜리HB101은에쉬리키아 콜리HB101/pCAAR1으로 명명되고 지정되었고 부다페스트 조약에 따라 National Insitute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology에 수탁 번호 FERM BP-4482로 기탁되어 있다.

본 발명의 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 통합 벡터는 선형 벡터로 통상 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 복제 플라스미드를 선형 형태로 절단하여 제조할 수 있다. 복제 플라스미드에서 절단 지점은 이후 서술될 것이다.

제 1 도는 염색체 통합 벡터내 아우레오바시딘 내성 유전자가 그와 동족체인 숙주 염색체(즉 아우레오바시딘 민감성 유전자)와 동족 재조합하여 아우레오바시딘 민감성 세포를 아우레오바시딘 내성 세포로 전환시키는 방법을 제시한다. 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 복제 플라스미드는 아우레오바시딘 내성 유전자 서열내 한 위치에서 적합한 제한효소에 의해 선형 형태로 절단된다. 그리하여 선형화된 벡터는 그와 동족체인 숙주 염색체내 아우레오바시딘 민감성 유전자와 동족 재조합한다. 그리하여 아우레오바시딘 내성이 숙주 세포에 부여된다. 복제 플라스미드가 외래 유전자를 함유하면 아우레오바시딘 내성 및 외래 유전자가 숙주 세포에 부여된다. 예를 들면,일본 특허 공개 제 254680/1991에 서술된 인간 아실아미노산 방출 효소(AARE) 및 Scaurl^R을 함유한 선형 벡터를 제조하기 위한 복제 벡터pAURlaare을 제조한다. 그에 혼입된 상기 벡터를 갖는에쉬리키아 콜리JM109 균주는에쉬리키아 콜리JM109/pAURlaare로 명명했고 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology에 수탁 번호 FERM P-14366으로 기탁되었다. 복제 벡터를 선형화하는데는, 타겟 외래 유전자 부분이 아니라 아우레오바시딘 내성 유전자에 존재하는 제한 효소 절단 부위를 효과적으로 사용할 수 있다. 예를 들면,S. 세레비시에내 기원한 Scaura^R및S. 폼브에 기원한 Spaura^R의 경우에,StuI 등 및BalI, 등의 제한 효소 부위를 각각 사용할 수 있다.

바람직한 형태로, 본 발명의 벡터는 아우레오바시딘 내성 유전자 및 외래 유전자를 함유할 수 있고 다른 복제 벡터에 지원한 유전자를 그로부터 제거할 수 있다. 아우레오바시딘 내성 유전자 및 외래 유전자를 발현시키기 위한 프로모터, 종결제 등은 숙주의 특성에 따라 선택할 수 있다. 물론, 서열 목록에서 SEQ ID No. 1 및 No. 5로 표시되는 DNA의 프로모터 부분을 아우레오바시딘 내성 유전자의 기능을 발현시키기 위한 프로모터로서 사용할 수 있다.S. 세레비시에의 경우에, 예를 들면, 알콜 탈수소효소 유전자 (ADH1) 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 유전자 (GPD)의 프로모터 및 시토크롬 Cl 유전자(CYCl)의 종결제를 사용할 수 있다. 상기 프로모터 및 종결제를 아우레오바시딘 내성 유전자를 발현시키는 것과 다를 수 있다.

본 발명에서, 용어 "외래 유전자는 숙주 균류 세포에 대해 외래인 즉 외계유전자를 말한다. 상기의 예는 비 균류 유잔자, 변형 유전자, 숙주와 다른 균류 종의 유전자 및 자가 클로킹 유전자를 포함한다. 보다 구체적으로, 발효, 알콜 내성, 당화 및 감미 성분 또는 방향 성분의 형에 참여하는 유전자가 상기 범주내 속한다.

제 2 발명은 아우레오바시딘 내성 형질변이체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 아우레오바시딘 내성 형질 변이체는 예를 들면, 상기- 언급된 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 복제 벡터를 제조하고, 상기를 복제 벡터내 아우레오바시딘 내성 유전자내 한 위치에서 절단하여 숙주 균류를 위한 선형 염색체 통합 벡터를 얻고, 상기 벡터를 균류 세포의 형질 변이를 허용하는 조건하에 아우레오바시딘 민감성 숙주 균류 세포에 첨가하여, 벡터를 숙주 염색체내로 통합하고, 형질변이체를 항생물질 아우레오바시딘을 함유한 숙주 세포의 증식에 적합한 배지내에서 인큐베이션시키고, 그리하여 증식된 아우레오바시딘 내성 형질 변이체를 선별함으로써 생산한다. 형질 변이는 원형질 발생 절차, 리튬 아세테이트 절차 또는 일렉트로포레이션 절차와 같은 대중적으로 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 본원에 사용되는 배지는 균류의 증식에 사용가능한 배지는 균류의 증식에 사용가능한 한 특별히 제한되지 않는다. 흔히 사용되는 상기 배지의 예는 사부로드의 덱스트로스 배지, YPD 배지, czapek 배지 및 YNBG 배지를 포함한다. 첨가된 아우레오바시딘의 농도는 민감성을 갖는 숙주 균류 세포에 따라 변하고 통상 0.05 - 80㎍/㎖ 범위이다.

제 3 발명의 형질 변이체는 제 2 발명의 방법에 의해 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 형질 변이체의 예로서, 염색체내로 통합된 scaurl^R및 AARE 유전자를 갖는 청주 효모 kyokai K-701은 National Institute of Bioscience andHuman-Technology, Agency of Industrial Science and Technology에 수탁 번호 FERM P-14379으로 기탁되었다. 그리하여 본 발명의 염색체 통합 벡터를 사용하여 얻은 형질 변이체는 그에 부여된 아우레오바시딘 내성을 갖고 그에 통합된 안정한 상태로 염색체 상 보유된 외래 유전자를 갖는다. 이러한 특성이 상기를 산업적 사용등에 매우 유용하게 한다.

제 4 발명의 Aurl^Rp는 일배체 효모 및 이배체 효모, 구체적으로, 실제 사용가능한 것들에 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있다. 즉, 청주, 소주, 맥주 및 와인과 같은 알콜 음료 및 빵과 같은 발효 식품에 널리 이용되온S. 세레비시에를 품종개량하는데 매우 유용하다. 또한, 제 4 발명의 Aurl^Rp는S. 세레비시에이외의 균류에 이용가능하고 예를 들면, 다른 균류의 품종개량 및 유전 공학적 응용에 유용하다.

예를 들면, 제 4 발명의 Aurl^Rp 는C. 알비칸스에 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있다. 상기 Aurl^Rp 에 대해 코딩하는 DNA를 갖는 벡터는C. 알비칸스에 제공된 유전공학적 사용을 위한 제 1 벡터이다.

C. 알비칸스는 사상균병을 초래하는 균류로 알려져 있다. 최근 감염기회가 증가됨에 따라, 발병 원인을 분명히 하려는 연구를 수행할 필요가 있어 왔다. 제 4 발명의 Aurl^Rp 및 상기- 언급된 벡터는C. 알비칸스에 대한 유전학적 연구에 매우 유용하다.

[실시예]

본 발명은 부가로 보다 더 상세히 설명하기 위해서, 하기 실시예가 주어질 것이다. 그러나 본 발명은 하기에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.

실시예 1 : 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 염색체 통합 벡터의 구성

(1) scaurl^R을 함유하는 내성 벡터의 구성

플라스미드 pSCAR1를 scaurl^S를 함유한 플라스미드 pSCAR1을 운반하는에쉬리키아 콜리HB101/pSCAR1 (FERM BP-4483)으로부터 제조했다.

그리고나서, 얻은 플라스미드를HindIII로 부분적으로 절단하고, 그리하여 scaurl^S를 함유한 3.5 kb의 DNA를 상기로부터 분리시켰다. 상기 DNA(3.5 kb)를HindIII 로 절단된 벡터 pUC118에 결찰시킴으로써 플라스미드 pUscaurl^S를 제조했다. 상기 플라스미드 pUscaurl^S를에쉬리키아 콜리CJ236으로 형질변이시킴으로써 ssDNA를 제조했다.

다음으로, 부위-특이성 DNA 돌연 변이체를, 합성되고 정제된, 서열 블록에서 SEQ ID No. 13으로 표시되는 돌연 변이를 유발시키기위한 합성 올리고누클레오티드 및 상기 언급된 ssDNA를 사용하고 Mutan-K 기구(Takara Shuzo Co., Ltd 에 의해 제작됨)를 사용하여 유발시켰다. 다시말해, 서열 목록에서 SEQ ID No. 13으로 나타낸 올리고누클레오티드를 사용하여 유전자 scaurl^S와 ORF 내 158번째 아미노산 잔기Phe의 코돈 TTT이 Tyr의 코돈 TAT로 치환된 scaurl^R을 얻을 수 있었다. Aurl^Rp (F158Y)에 대해 코딩하는 DNA를 갖는 상기 플라스미드를 pUscaurlR로 지명 하였다.

(2) PCR 방법에 의한 scaurl^R의 증폭

scaurl^R을 함유하는 3.5 kb의Hind III 단편을 운반하는 플라스미드 pUscaurlR을 사용하여, scaurl^R(약 1.9 kb)를 PCR 방법에 의해 증폭했다. 본원에 사용된 프라이머를 고려할 때, 플라스미드 벡터 pYES2 (Invitrogen corporation 에 의해 제조됨)로 증폭된 scaurl^R무성 생식시키기위해 XhoI 및 KpnI 부위를 프라이머 내 지정함으로써, 서열 목록에서 SEQ ID Nos. 14 및 15로 표시되는 프라이머를 합성했다.

반응을 하기 방식으로 실시했다. PCR 완충액 [최종 농도 10 mM의 Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM의 KCl, 1.5 mM의 MgCl₂, 0.1 mM의 dATP, 0.1 mM의 dCTP, 0.1 mM의 dTTP 및 0.1 mM의 dGTP를 얻을 수 있음] 28㎕ 2.5U의 Ampli Taq DNA 폴리머라제 1㎕ (Perkin-Elmer에 의해 제조됨), 서열 목록에서 SEQ ID No. 14 및 No. 15로 표시된 20 pmol 프라이머 0.5㎕ 분액, 플라스미드 1㎕ 및 H₂O 69㎕를 함유한 PCR 용액 100㎕를 개시 온도 94℃에 1분동안 유지하고나서, 뒤이어 94℃에서 1분동안, 50℃에서 2분동안, 72℃에서 3분동안 가열했다. 상기 가열 주기를 35회 반복했다. 다음으로, 반응 혼합물을 72℃에서 10분동안 유지하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 그리고나서 PCR 증폭 생산물을KpnI 및XhoI로 절단하고 아가로스 겔상에서 전기 영동시키고, 약 1.9 kb의 타겟 DNA 단편을 겔로부터 회수하고 Suprec™-01 (Takara Shuzo Co., Ltd 에 의해 제조됨)를 사용하여 정제했다.

(3) DNA 결찰 및 형질 변이

상기 단계에서 정제된 DNA 단편(약 1.9 kb) 약 0.3㎍을 움 결찰 기구 (Takara Shuzo Co., Ltd 에 의해 제작됨)를 사용하여,XhoI 및KpnI로 소화된 pYES2 약 0.1㎍으로 결찰시켰다.

다음으로, 상기-언급된 결찰 혼합물 7㎕을에쉬리키아 콜리HB101의 경쟁 세포 200㎕에 첨가했다. 상기 세포를 얼음상 30분동안, 42℃에서 1분 동안, 그리고나서 얼음상 1분동안 방치했다. 그리고나서 SOC 배지 [Sambrook 일동, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 800㎕를 상기에 첨가했다. 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시킨 후, 상기에쉬리키아 콜리세포를 암피실린 50㎍/ml을 함유한 L-육즙 한천 배지상 바르고 37℃ 밤새 인큐베이션시켰다. 이로써 형질 변이체를 얻었다.

상기 변이체를 37℃에서 암피실린 50㎍/ml을 함유한 L-육즙 배기 5 ml 내에서 밤새 인큐베이션시켰다. 상기 배양물로부터, 알칼릴 방법 (상기 인용된 "Molecular Cloning")에 따라, 플라스미드 DNA를 제조했다. 그리하여, 얻은 플라스미드를 pYES2aurl 라고 명명했다.

(4) 염색체 통합 벡터의 구성

상기 언급된 플라스미드 pYES2aurl 약 0.4㎍을Xba1 및Kpn1로 소화시키고,아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다. 그리고나서 scaurl^R을 함유한 약 1.9kb의 DNA 단편을 겔로부터 회수하고 Suprec-01을 사용하여 정제했다.

유사하게, 플라스미드 벡터 pUC19 약 0.4㎍을 Ssp I 및 Pvu II로 소화시키고, 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다. 그리고나서 암피실린 내성 유전자 및 ColE1 기원을 함유한 DNA 단편 (약 1.8 kb)을 겔로부터 회수하고 정제했다. 이렇게 정제된 상기 DNA 단편의 약 0.1㎍ 분액을 DNA 블런팅 기구 (Takara Shuzo Co., Ltd에 의해 제작됨)를 사용하여 말단을 블런팅시켰다. 부가로, 상기 블런팅된 DNA 단편의 약 0.1㎍ 분액을 결찰 반응에 적용했다. DNA 결찰 기구 (Takara Shuzo Co., Ltd에 의해 제작됨)를 사용하여 결찰 반응을 실시했다.

이어서, 플라스미드를에쉬리키아 콜리JM 109로 통합시켰다. 인큐베이션시킨 후, 형질 변이체 및 플라스미드 DNA를 제조했다. 그리하여 얻은 플라스미드를 플라스미드 pAUR1으로 명명했다. 다음으로, 상기 플라스미드를StuI 로 절단하여 염색체 통합 벡터를 제조했다.

실시예 2 : 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 염색체 통합 벡터의 구조

(1) PCR에 의해 유발된 돌연 변이를 가지는 scaurl^R의 DNA 단편의 증폭

Aurl^Rp (F158Y)의 240번째 아미노산 잔기 Ala를 Cys로 치환시키기 위해, 서열 목록에서 SEQ ID No. 24로 표시되는, Ala의 코돈 GCT가 Cys의 코돈 TGT로 바뀐 프라이머를 합성하고 정제했다. 템플레이트로서, pUC119의Hind III 부위에 scaurl^R을 함유하는Hind III 단편 (3.5 kb)을 운반하는 실시예 1-(1)에서 서술된 플라스미드 pUscaur1R을 사용하고, 서열목록에서 SEQ ID No. 24로 표시되는 프라이머 및 프라이머 M13M4를 사용하여 PCR 방법에 의해, GCT가 TGT로 바뀐 Aurl^Rp (F158Y, A240C)의 C-말단측상 아미노산 서열에 대하여 코팅하는 약 500 bp의 서열을 함유하는 DNA 단편 (약 1.4 kb)을 증폭시켰다. PCR을 하기 방식으로 실시했다. PCR 완충액 [최종 농도 10 mM와 Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM의 KCl, 1.5 mm의 MgCl₂, 0.1 mM의 dATP, 0.1 mM의 dCTP, 0.1 mM의 dTTP 및 0.1 mM와 dGTP를 얻을 수 있음] 28㎕에 2.5U의 Ampli Taq DNA 폴리머라제 서열 목록에서 SEQ ID NO. 24로 표시되는 프라이머 및 프라이머 M13M4의 100 pmol 분액, PUscaur1R 1 ng 및 증류수를 첨가하여 PCR 용액 100㎕를 얻었다. 그리고나서, 뒤이어 상기 반응 혼합물을 94℃에서 1분동안, 55℃에서 1.5분동안 72℃에서 1.5분동안 가열했다. 상기 주기를 30회 반복했다. 다음으로, PCR 생산물을SalI 및SnaI로 절단하고, 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 약 1.3 kb의 타겟 DNA 단편을 겔로부터 회수하고 정제했다.

(2) Aurl^Rp (F158Y, A240C)에 대해 코딩하는 DNA을 함유한 플라스미드의 구성.

pUscaurlR을SalI 및SnaI로 절단하고, 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다. 5.3 kb의 타겟 DNA 단편을 회수하고, 정제했다. 실시예 2-(1)에서 얻은 1.3 kb의 DNA 단편을 상기 DNA 단편에 결찰시켰다. Aurl^Rp (F158Y, A240C)에 대해 코딩하는DNA (scaurl^RC) 얻어진 플라스미드를 pUscaurl^R-C로 명명했다. 상기를 청주 효모의 염색체내로 통합시켜 형질변이시키기위해 pUscaurl^R-C를 사용 전에StuI로 절단하여 결찰했다. 대조군으로서, pUscaurlR을 또한StuI로 결찰시켰다.

(3) Aurl^Rp (A240C)에 대해 코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드의 구성

pUscaurl^S를SalI 및SnaI로 절단하고 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다. 5.3 kb의 타겟 DNA 단편을 회수하고 정제했다. 실시예 2-(1)에서 얻은 1.3 kb의 DNA 단편을 상기 DNA 단편에 결찰시켰다. Aurl^Sp의 240번째 진기 Ala가 Cys로 치환된 Aurl^Rp (A240C)에 대해 코팅하는 DNA를 갖는 얻어진 플라스미드는 pUscaurlA 240C로 명명했다. 상기를 청주효모의 염색체로 통합시켜 형질변이시키기위해, pUscaurA 240C를 사용전에StaI로 절단하여 결찰시켰다.

실시예 3 : 숙주로서 청주 효모를 사용한 형질 변이.

(1) 실시예 1에 서술된 플라스미드 pAUR1의 선형 벡터 약 10㎍을 리튬 아세테이트 방법 [Journal of Bacteriology,153, 163 (1983)]에 의해 청주 효모 Kyokai K-701에 혼입했다.

즉, 0.1M 리튬 아세테이트 용액 1.3 ×10⁸세포/0.1M 리튬 아세테이트의 약 100㎕)내에 현탁된 청주 효모 Kyokai K-701에, 한 위치에서StuI로 절단함으로써 scaurl^R를 선형화하여 제조한 벡터 10㎍을 첨가했다. 30℃에서 30분동안, 그리고나서 42℃에서 15분동안 처리한 후에, 세포를 원심분리에 의해 회수하고, YPD 액체 배지 5 ml에서 예비-인큐베이션했다. 0.4㎍/ml 의 아우레오바시딘 A를 함유하는 YPD 액체 배지내에서 예비-인큐베이션 한후에, 0.8 ㎍/ml의 아우레오바시딘 A를 함유하는 YPD 한천 배지상에 변어체들을 얻었다. 이 형질 변이체를 청주 효모 Kyokai K-701/pAUR1으로 명명했다.

이 형질 변이체를 아우레오바시딘 A의 부재하에 3세대에 걸쳐 준배양시키고나서, 아우레오바시딘에 대한 민감성을 평가했다. 결과로서, 상기는 어버이 균주 (즉, 청주 효모 Kyokai K-701)의 아우레오바시딘 내성의 8배의 아우레오바시딘 내성 (MIC 1.56㎍/ml)을 보였고, 이는 아우레오바시딘 내성이 유지되었다는것을 가리킨다. 그리하여, 숙주 염색체상에 혼입된 아우레오바시딘 내성이 선택성 마아커로서 사용가능하다는것이 확인되었다.

(2) 실시예 2-(2)에서 제조된 pUscarul^R-C, 실시예 2-(3)에서 제조된 pUscaurl A240C, 및 실시예 1-(1)에서 제조된 pUscaurlR의 활성을 비교하기위해,StuI로 선형화 플라스미드 5㎍을 리튬 아세테이트 방법에 의해 청주 효모 Kyokai K-701 내로 혼입했다. 즉, 0.1 M 리튬 아세테이트 용액(pH 7.5) 내에 현탁되고 적응된 청주 효모에, 한 위치에서StuI로 절단함으로써 선형화된 플라스미드 5㎍ 및 40％ 폴리에틸렌 글리콜/0.1 M 리튬 아세테이트 850㎕를 첨가했다. 30℃에서 30분동안 처리하고나서 42℃에서 15분동안 유지시킨후에, 세포를 회수하고, 1시간동안 또는 밤새 YPD 액체 배지 5ml 내에서 예비 인큐베이션하고나서, 여러가지 농도로 아우레오바시딘 A를 함유하는 YPD 한천 배지상에 도말(塗抹)시켰다. 3-4일동안 30℃에서 인큐베이션시킨후에, 아우레오바시딘 A에 대한 내성을 가지는 형질 변이체를 얻는다. 표 4가 제시하는, 바와 같이StuI-선형화된 pUscarul^R-C를 사용하여 제조한 형질 변이체는 5㎍/ml의 아우레오바시딘 A를 함유하는 배지에서 조차 성장할 수 있었다. 이들 형질 변이체들은 여러 세대에 걸쳐 준배양된후에도 어버이 균주의 내성보다 10배 이상 높은 아우레오바시딘A 내성을 유지했다. 선형화된 pUscaurl^R-C를 사용함으로써 얻은 형질 변이체는 20㎍/ml 이상의 아우레오바시딘 A에 대한 MIC를 보였다. 그리하여, Aurl^Rp (F158Y, A240C)가 청주 효모에 대한 효과적인 선택적 마아커로서 사용가능하다는것이 확인되었다. 표 4가 제시하는 바와 같이,StuI-선형화 pUscaurl A240C는 내성을 부여하는 활성에 있어서StuI-선형화 pUscaurlR를 능가했다. 즉, 240 번째 잔기 Ala 에서의 돌연변이가 보다 강한 내성을 부여하는 활성의 발현을 초래했다.

[표 4]

실시예 4 : 아우레오바시딘 내성 유전자 및 AARE 유전자를 가지는 염색체 통합 벡터에 의한 형질변이

(1) AARE 유전자를 함유하는 플라스미드 구성

플라스미드 pAUR1 0.5㎍을SphI로 절단하고 아가로스 겔상 전기영동시켰다. 그리고나서, 선형 플라스미드 pAUR1를 겔로 부터 회수하고 정제했다.

다음으로, 일본 특허 공개 제 254680/1991호에서 서술된 AARE 유전자를 함유하는 플라스미드 pYHA201 (즉,사카로마이세스 세르비시에BJ2168/pYHA201; FERM P-11570)를 운반하는 효모 BJ2168로 부터 플라스미드 pYHA201를 제조했다. 상기 플라스미드 pYHA201 0.5㎍를SphI로 소화시키고, DNA 단편 (약 3.2 kb)을 단리하고 정제했다.

AARE 유전자를 함유한 약 3.2 kb의 상기 DNA 단편을 ADHI 프로모터의 다운스트림에 결합시켰다.

정제된SphI-절단된 DNA 단편 모두의 각각 0.2㎍ 분액을 사용하고, (Takare Shuzo Co., Ltd. 에 의해 제조된) DNA 결찰 키트를 사용함으로써 결찰반응을 실시했다. 이어서, 플라스미드를에쉬리키아 콜리JM109 내로 통합시키고, 인큐베이션하여 형질 변이체 및 플라스미드 DNA를 얻었다. 그리하여 얻은 플라스미드를 플라스미드 pAURlaare로 명명하는 한편, 그리하여 얻은 형질 변이체를에쉬리키아 콜리JM 109/pAUR1aare 로서 명명했고, 수탁 변호 FERM P-14366으로 Natronal Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial science and Technology 에 기탁했다.

(2) 청주효묘에서 AARE의 발현

약 10㎍의 상기-언급된 플라스미드 pAUR1aare를 사용하므로써, 선형 플라스미드 pAUR1aare 를 실시예 3에서 서술한 것과 같은 방식으로 청주 효모 Kyokai K-701로 형질변이시켰다. 그리고나서, 아우레오바시딘 내성 형질변이체를 0.4㎍/ml의 아우레오바시딘 A를 함유하는 YPE 한천 배지상에 얻었다.

이렇게 얻은 형질변이체를사카로마이세스 세르비시에K701/pAUR1aare로 칭하고 지시하고, 수탁 번호 FERM P-14379 하에 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial science and Technology 에 기탁했다.

다음으로, 상기 형질변이체를 최소 배지 5ml [0.67％의 아미노산이 없는Bacto 효모 질소 염기 (Difco에 의해 제조됨), 2％의 글루코스] 내로 접종시키고, 2일 동안 30℃에서 인큐베이션시키고나서, 세포를 원심분리로써 얻었다.

상등액을 버린후에, 세포를 물 2ml로 세척하고, 원심분리에 의해 다시 회수했다.

뒤이서, 세포를 0.2M 인산나트륨 완충액 (pH 7.2) 700 ㎍ 내에 현탁시켰다.

상기 현탁액에 유리 구슬 (직경으로 0.40-0.60 mm) 400㎕를 첨가하고, 세포를 얼음-냉각하에 격렬하게 교반시킴으로써 분열시켰다.

원심분리후에, 상등액을 회수하고, 추출물로서 간주했다.

또한, 실시예 3에서 얻은 청주효모 Kyokai K-701/pAUR1 및 청주효모 Kyokai 701의 추출물을 같은 방식으로 제조했다.

그리하여 얻은 추출물 각각의 아실아미노산 방출 효소 활성을 하기 방법에 의해 측정했다. N-아세틸-L-메티오닌 및 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)로 부터 제조된 0.020 mM의 아미드를 함유하는 0.5％ 디메틸포름아미드-0.2M 인산나트륨 완충액 (pH 7.2) 0.89 ml를 약 5분동안 37℃에서 예비가열시켰다. 그리고나서, 상기-언급한 추출물 100㎕를 그에 첨가하고, 결과얻어진 혼합물을 15분동안 37℃ 에서 인큐베이션시켰다. 반응을 완결시킨후에 10％ SDS 10㎕를 첨가함으로써 반응을 중단시키고, 형광 광도를 형광 광도계로 측정했다. 즉, 여기 파장 및 측정 파장을 각각 380mm 및 440 mm에 세팅했다. 유리된 AMC의 양을 공지된 농도의 AMC 샘플을 사용하여 표준 곡선을 제조하고 그로 얻은 자료를 비교함으로써 결정했다.

S. 세레비시에K701/pAUR1aare의 추출물 100㎕은 상기 반응 시스템에서 15분후에 AMC 약 25 p몰을 유리시키는 활성을 가졌다.

반면, 플라스미드가 없는 청주효모 Kyokai K-701의 추출물 및 실시예 3에서 얻은 청주효모 Kyokai K-701/pAUR1의 추출물은 각각 AARE 활성이 없음을 보였다.

또한, 프로브로서 아우레오바시딘 내성 유전자를 사용하며 서던 혼성화에 의해 분석을 실행했다. 혼성화에서 프로브로서, 서열 목록에서 SEQ ID 제 16 및 17로 표시되는 프라이머 및 템플레이트로서 플라스미드 pAUR1을 사용하는 PCR 방법에 의해 증폭된 scaurl^R단편 (약 1.6 kb)로 사용했다. 그리하여 얻은 단편 100 ng을 BcaBEST™라벨링 기구를 사용함으로써 [³²P]dCTP로 라벨링했다. 청주효모 Kyokai K-701 및사카로마이세스 세레비시에K701/pAUR1aare의 게놈 DNA를 여러가지 제한효소(pAUR1aare 상 절단 부위를 갖지 않는HPaI, pAUR1aare 상 두 절단 부위를 갖는BamHI)로 절단하고, 아가로스 겔상 전기영동시키며, 혼성화 필터상으로 전이시켰다.

제 2 도에서, 레인 1 및 2는 청주 효모 Kyokai의 게놈 DNA를HpaI (레인 1) 또는BamHI (레인 3)로 절단하고 서던 혼성화에 적용시켜 얻은 결과를 제시하며, 레인 2 및 4는사카로마이세스 세레비시에K701/pAUR1aare K701/pAURlaare의 게놈 DNA를 HpaI (레인 2) 또는BamHI (레인 4)로 절단하고 서던 혼성화에 적용시켜 얻은 결과를 제시한다. HpaI가 플라스미드 pAUR1aare 상에 절단 부위를 갖지 않았지만 전적으로 게놈 DNA를 절단하기 때문에, 아우레오바시딘 내성 유전자가 한 쌍의 염색체 중 하나에 통합되었음이 레인 1 및 2로 부터 입증되었다.

아우레오바시딘 내성 유전자가 청주 효모의 염색체 상 아우레오바시딘 민감성 유전자내로 일치하게 통합되었음이 레인 3 및 4로부터 확인되었다.

상기 결과는 청주 효모의 유전자가 아우레오바시딘 내성 유전자의 랜덤 통합에 의해 분열되지 않았음을 나타낸다.

상기 서술된 바와 같이, 본 발명의 염색체 통합 벡터를 사용함으로써, 내성이 아우레오바시딘 민감성 균류에 부여될 수 있고 또한, 외래 유전자가 발현될 수 있었다.

실시예 5: 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 재조합 플라스미드의 구성 (1) Aurl^Rp (F158Y, A240C)에 대해 코딩하는 DNA를 운반하는 pYC 벡터의 구성.

템플레이트로서 pUscaurl^R-C를 사용하고, 서열 목록에서 SEQ ID NO. 25 및 No. 26 으로 표시되는 프라이머를 사용하며 PCR을 수행했다. 증폭된 Aurl^Rp (F158Y, A240C)에 대해 코딩하는 DNA를 함유한 PCR 생산물 (약 2.2 kb)를XhoI 및KpnI으로 절단하고 블런팅 기구 (Takara Shuzo Co., Ltd. 제작)를 사용하여 말단 블런팅시켰다.

pYC 벡터 pYEUra³(Clontech Laboratories., Inc. 제조)을EcoRI 및BamHI로 절단하고 블런팅 기구를 사용하여 말단 블런시켰다. 그리고나서 상기를 상기 서술된 말단 블런팅된 PCR 생산물 (약 2.2 kb)로 결찰시켰다. 그리하여 얻은 플라스미드를 pYC scaurl^R-C로 명명했다. 템플레이트로서 pUscarulR을 사용하고, 서열 목록에서 SEQ ID NO. 25 및 26으로 표시되는 프라이머를 사용하며 같은 방식으로 PCR을 수행했다. 증폭된 Aurl^RP (F158Y)에 대해 코딩하는 DNA를 함유한 PCR 생산물 (약 2.2 kb)을XhoI 및KpnI로 절단하고 블런팅 기구 (Takara shuzo Co. Ltd 제작)를 사용하여 말단 블런팅시켰다. pYEUra³를EcoRI 및BamHI으로 절단하고 블런팅 기구를 사용하여 말단을 블런팅시켰다. 그리고나서 상기를 상기 서술된 말단 블런팅된 PCR 생산물 (약 2.2 kb)로 결찰시켰다. 그리하여 얻은 플라스미드를 pYCscaurlR로 명명했다.

(2) Aurl^Rp (F158Y, A240C)에 대해 코딩하는 DNA를 운반하는 pYE 벡터의 구성

Aurl^Rp (F158Y, A240C)에 대해 코딩하는 DNA를 함유한 DNA 단편 (약 2.2 kb)을 템플레이트로서 pUscaurl^R-c를 사용하고, 서열 목록에서 SEQ ID No. 25로 표시되는 프라이머 및 프라이머 M13M4를 사용하며 PCR 방법에 의해 중폭했다. PCR 생산물을BamHI로 절단했고 아가로스 겔 상 전기영동했다. 그리고나서 타겟 DNA 단편 (약 1.8 kb)을 겔로 부터 회수하고 정제했다. 플라스미드 pSCAR1을 BamHI로 절단했고 그리하여 scaurl^S를 함유한 2.8 kb의 DNA 단편이 제거된, 11.7 kb의 DNA 단편을 얻었다. 상기 11.7kb DNA 단편을 Aurl^Rp (F158Y, A240C)에 대해 코팅하는 DNA 단편을 함유한 1.8 kb의 상기 언급된 DNA 단편으로 결찰시켰다. 그리고나서 원하는 방향으로 그에 삽입된 1.8 kb의 단편을 갖는 플라스미드를 선택했다. Aurl^Rp (F158Y, A240C)에 대해 코딩하는 DNA를 함유한 상기 플라스미드를 pWscaurl^R-C로 명명하고 실험실 사용을 위한 효모의 형질 변이체에 사용했다.

실시예 6 : 숙주로서 효모를 사용하는 형질변이

(1) pYCsaurl^R-c 에 의한 청주 효모의 형질 변이

pYC 플라스미드 pYcscaurl^R-C 5㎍ 을 사용하며, 실시예 1-(1)에 서술된 리튬아세테이트 방법에 의해 청주 효모/ kyokai K-701 을 형질 변이시켰다. 표 5가 제시하는 바와같이, 얻어진 결과는 선형 플라스키드의 경우에 얻은 결과와 유사하다. 상기 형질 변형체들은 각각 여러 세대에 걸친 준 배양 후에도 어버이 균주 보다 10배 이상 높은 아우레오바시딘 A 내성을 유지했다. 그리하여 Aurl^Rp (F1584, A240C)가 복제 벡터에 의한 형질 변이에서 청주 효모를 위한 효과적이고 선택적인 마커로서 유용함을 확인 했다.

[표5]

표 5

(2) pWscaurl^R-c에 의한 실험실 효모의 형질변이

숙주로서 실험실 사용을 위한 일배체 효모 DKD-5D (a, his 3, trp 1, leu2-3, 112)를 사용하며, 실시예 3-(1)에 서술된 리튬 아세테이트 방법에 의해 pwscaurl^R-c 5㎍ 를 형질변이 시켰다.

비교를 위해, 플라스미드내 함유된 생장 인자를 필요로하는 마커를 사용하여 최소배지에서 형질 변이체를 선별했다. 표 6 이 제시하는 바와같이, Aurl^Rp (F158 Y, A240C)가 일배체 효모에서 종래의 생장 인자를 필요로하는 마커에 필적할만한 선택성 마커로서 유용함을 확인했다.

[표6]

표 6

실시예 7 : 숙주로서C.알비칸스를 사용한 형질 변이

pUC 119 영역내 한 지점에서 절단할 수 있는SalI 로 PUscaurl^R-C 를 절단하여 제조한, 선형 플라스미드 5㎍ 를 리튬 아세테이트 방법에 의해C. 알비칸스TIMMO 0136 으로 형질 변이시켰다. 형질 변이를 완결한 후, 세포를 YPD 배지내에서 1 시간 동안 또는 밤새 인큐베이션시키고나서 아우레오바시딘A 를 함유한 YPD 한천 배지상에 발랐다. 표 7이 제시한 바와같이, 아우레오바시딘에 대한 내성을 갖는 형질 변이체를 밤새 예비-인큐베이션을 수행하여 얻었다. 상기 형질변이체들은 각각 10㎍/ ml 이상의 MIC 를 보였다.

[표7]

표 7

본 발명은 균류 (특히 산업용 균류)의 유전적 재조합에 유용한, 선택적인 마커로서 아우레오바시딘에 대한 내성을 사용하는 염색체 통합 벡터, 그에 혼입된 상기 벡터를 갖는 형질 변이체를 생산하는 방법, 및 상기 방법에 의해 얻어진 형질 변이체를 제공한다. 상기는 예를들어, 유용한 단백질을 생산하고 품종 개량하기 위한 형질변이체의 발생에 효과적으로 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 아우레오바시딘에 대한 강한 내성을 부여할 수 있는 단백질 및 상기 단백질에 대해 코딩하는 DNA를 제공한다. 상기는 아우레오바시딘 민감성을 갖는 유기체에 내성을 부여했고 그리하여 내성을 획득한 유기체를 선별하는 선택적인 마커로서 유용하다. 상기는 특히, 예를들면, 실제 사용가능한 효모의 유전공학적 품질개량 및C. 알비칸스의 유전적 정보의 분석에 매우 유용하다. 구제적으로,S. 세르비시에기원한 아우레오바시딘 내성 유전자가S. 세르비시에의 품질개량 및 유용한 단백질을 생성하기 위한 형질 변이체의 제조에 매우 유용한데, 이는S. 세르비시에가 산업용 효모로서 널리 사용될 뿐만아니라 유전적 재조합 면에서 매우 안정하기 때문이다.

제 1도는 본 발명의 예인 벡터의 구조, 및 벡터를 염색체 내로 통합시킨 것을 제시한다.

제 2도는 제한 효소에 의해 소화된 게놈 DNA의 전기 영동 후 서던 혼성화의 패턴을 제시한다.

제 3도는 유전자 spaurl^R및 spaurl^S의 제한 효소 지도를 제시한다.

제 4도는 유전자 Scaurl^R및 Scaurl^S의 제한 효소 지도를 제시한다.

제 5도는 유전자 caaurl 의 제한효소 지도를 제시한다.

서열 목록

Claims (11)

1. (1) 서열 목록에서 SEQ ID No. 8로 표시되는 서열에서 240번째 아미노산 잔기 Ala가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열, 및

   (2) 상기 (1)의 아미노산 서열에 240번째 아미노산 잔기를 제외한 다른 아미노산 잔기(들)에 치환, 삽입 및 삭제로부터 선택된 하나이상의 변형을 가함으로써 얻어진 아미노산 서열으로서, 상기 SEQ ID No. 8로 표시되는 아미노산 서열과 58％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질.
2. 제 1 항에 있어서, 240번째 아미노산 잔기 Ala가 Cys로 치환된 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질.
3. 제 2 항에 있어서, 서열목록에서 SEQ ID No. 18 또는 19로 표시되는 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에서 청구된 아우레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질에 대해 코딩하는 DNA.
5. 제 4 항에 있어서, 서열 목록에서 SEQ ID No. 20 또는 21로 표시되는 DNA.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 청구된 단백질을 코딩하는 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 것을 특징으로 하는, 숙주인 균류(fungus)를 위한 염색체 통합 벡터.
7. 제 6 항에 있어서, 외래 유전자를 함유한 벡터.
8. 하기로 구성되는 것을 특징으로 하며, 균류에 속하는, 아우레오바시딘 내성 형질변이체를 생산하는 방법.

   (1) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 청구된 단백질을 코딩하는 아우레오바시딘 내성 유전자를 함유한 복제 벡터를 얻는 단계.

   (2) 상기 단계에서 얻은 복제 벡터 내 아우레오바시딘 내성 유전자를 한 부위에서 절단하여 숙주 균류를 위한 염색체 통합 벡터를 얻는 단계;

   (3) 상기 단계에서 얻은 숙주 균류를 위한 염색체 통합 벡터를 숙주 균류의 염색체내로 통합하는 단계; 및

   (4) 아우레오바시딘 존재하에 아우레오바시딘 내성체로 형질변이된 숙주를 선택하는 단계.
9. 제 8 항에 있어서, 제 8 항에 서술된 복제 벡터가 외래 유전자를 함유한 것임을 특징으로 하는 형질변이체를 생산하는 방법.
10. 제 8 항에 청구된 방법에 의해 얻은 균류에 속하는 형질변이체.
11. 제 9 항에 청구된 방법에 의해 얻은 균류에 속하는 형질변이체.