KR100390332B1

KR100390332B1 - 항말라리아제와 항암제의 병용투여에 의한 항암제 복합 조성물

Info

Publication number: KR100390332B1
Application number: KR10-2000-0044851A
Authority: KR
Inventors: 유내춘; 금기창; 유원민
Original assignee: 유원민; 금기창; 유내춘
Priority date: 2000-08-02
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2003-07-07
Also published as: KR20020011528A; WO2002013826A1; WO2002013826A9; AU2001275821A1; EP1313475A4; EP1313475A1

Abstract

본 발명은 항말라리아제와 항암제의 병용투여에 의해 항암제의 최소 유효농도를 낮추고 항암제에 의한 암세포의 약제 내성을 억제하여 항암제의 항암효과를 상승시킨 항암제 복합 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 항말라리아제로 흔히 사용되는 하이드록시클로로퀸, 클로로퀸, 프리마퀸 등과 대표적인 항암제인 독소루비신, 시스플라틴 등을 병용투여하면 항암제의 최소 유효농도(IC₅₀)을 낮추고 항암제에 의한 암세포의 약제 내성을 억제하여 유방암의 경우 약 3배, 위암의 경우 약 10배, 대장암의 경우 약 10배, 육종암의 경우 약 10배까지 항암 효과를 상승시킬 수 있는 항암제 복합 조성물에 관한 것이다.

Description

항말라리아제와 항암제의 병용투여에 의한 항암제 복합 조성물{anti-cancer composition composed of anti-cancer and anti-malarial drugs}

최근 급성 백혈병, 악성 임파종 및 고환암 등의 일부 고형암에서 항암화학요법에 의한 치료성적이 괄목할만하게 향상되었다. 그러나, 아직도 많은 종류의 암에서는 초기 치료에서부터 항암제에 내성을 보이거나, 치료후 재발하여 사망에 이르게 된다. 따라서, 항암제에 대한 암세포의 내성은 암치료에 있어 중요한 장애요인중의 하나이다. 암세포가 항암제에 대해 내성을 가지게 되는 기전에는 약동학적인 요인, 병리세포형과 생물학적 특성, 개체의 면역반응, 약제투여경로 및 세포단위에서의 약제내성이 제시되고 있다. 이중에서 세포단위에서의 약제내성이 가장 중요한 기전으로 생각되며, 한가지 약제에 내성이 생긴 암세포가 화학적 구조가 전혀 다른 항암제에 대해서도 동시에 내성을 가지는 경우를 다중약제내성(multidrug resistance, MDR)이라고 한다.

1960년대말 Kessel등은 vinblastine을 저용량으로 지속적으로 노출시켜 vinblastin에 내성을 갖게 만든 P388 백혈병 세포주가 dactinomycin, vincristine 및 daunorubicin에 교차내성을 나타내는 것을 관찰하였고, Biedler등은 이러한 현상을 다중약제내성이라고 명명하였다. Ling 및 Thomson은 다중약제내성을 가진 Chinese hamster 난소암 세포의 막에서 170kD 크기의 표면 당단백질이 증가되어 있음을 발견하여 P-당단백질이라고 명명하였으며, 세포내 약물의 농도를 감소시키는 작용을 하여 항암제의 다중약제내성과 관련이 있음을 보고하였다. P-당단백질의 기능은 칼슘과 ATP를 이용하여 세포내로 들어온 항암제를 세포밖으로 능동적으로 내보내는 펌프 역할을 하여 세포내 항암제의 유입을 억제하여 농도를 낮추고, 이로인해 항암제의 항암효과를 감소시키게 된다. 다중약제내성에 관련되는 항암제로는 adriamycin과 daunorubicin등의 anthracycline계 약물, vincristine과 vinblastin등의 vinka alkaloid계 약물, etoposide등의 epipodophllotoxin계 약물 및 그외 actinomycin-D, taxol등의 항암제가 있으며, 이들 항암제간에는 교차내성을 일으킨다. 이들 항암제들의 특징으로는 300-900D의 분자량의 약물들로 소수성이며, 복잡한 환구조로 이루어져 있고, 양전하의 질소 그룹을 가지고 있으며, 수동적으로 세포내로 확산되는 공통점이 있다. 1986년 Gros 등은 P-당단백질 유전자에 대한 cDNA의 염기배열순서를 규명하여 다중약제내성과 관련된 mdrl(multidrug resistance) 유전자의 존재가 밝혀지게 되었다. P-당백질은 1280개의 아미노산으로 구성되어 있으며, hemolycin B, leukotoxin, histidine등의 수송을 담당하는 수송단백질과 구조가 유사하며, 박테리아나 효모에서도 유사한 수송단백질이 존재함이 알려져 있다. 즉, P-당단백질은 암세포에만 특이하게 발견되는 것이 아니라, 대장 및 소장, 부신, 신장, 간 등의 정상세포에서도 발견되며, 세포내로 들어온 세포독성물질을 세포밖으로 내보내는 일반적인 역할을 하는 수송단백질의 일종이라는 것이 알려졌다. 특히 P-당단백질은 간세포의 담도쪽, 신장 근위세관의 내강표면, 대장 및 소장 내강점막의 원주세포, 부신피질과 수질에 주로 분포하며, 대장암, 신장암, 간암, 만성 백혈병, 부신암 및 비소세포성암 등의 암에서는 진단 당시부터 mdrl 유전자의 mRNA 양이 증가되어 있어 내인성 다중약제내성 나타낸다(Fojo AT, Ueda K, Slamon DJ, Poplack DG, Gottesman MM, Pastan I : Expression of a multidrug resistance gene in human tumors and tissues. Proc Natl Acad Sci USA 84:265, 1987; Goldstein LJ, Galski H, Fojo A, Willingham M, Lai SL, Gazdar A, Pirker R : Expression of a multidrug resistance gene in human cancers. J Natl Cancer Inst 81:116, 1989).

각종 암에서 mdrl mRNA과 P-당단백질의 과발현(over expression)은 치료실패의 중요한 요인으로 생각하게 되었고, 일부 암에서는 이들의 과발현이 치료성적 및 예후를 예측하는 인자로 제시되었다. 이러한 사실에 근거하여 다중약제내성을 극복하기 위하여 다중약제내성유전자의 발현을 억제하거나 P-당단백질의 기능을 조절하는 것을 목표로 한 치료법이 시도되었다. Tsuro등은 다중약제내성을 보이는 암세포들이 감수성 암세포에 비해 세포막과 세포질에 더 많은 양의 칼슘이 함유되어 있다는 사실에 근거하여 verapamil등의 칼슘통로차단제를 사용하였고, 이 약제들이 세포내 약물배출과정을 억제하여 항암제의 세포내 축적을 증가시켜 다중약제내성을 극복할 수 있다고 보고하였다(Tsuruo T. Fidler IJ.Differences in drug sensitivity among tumor cells from parental tumors, selected variants, and spontaneous metastases.Cancer Research. 41(8):3058-64, 1981 Aug. 1981). Verapamil 이외에도 cyclosporin-A, calmodulin, phenothiazine, quinine, tamoxifen등이 시도되고 있으나, 제 1상 및 제 2상 임상시험에서 대부분의 약제들이 체내에서 다중약제내성을 극복할만한 농도에 이르기 어렵거나, 혹은 그러한 농도에 이른다 하더라도 심독성, 신독성 등의 심각한 부작용이 발생하여 임상에 사용되는데는 아직 제한점이 있다. 또한 백혈병, 악성 임파종 및 다발성 골수종 등의 혈액암에서는 높은 항암효과가 관찰되어 일부 완치의 가능성을 보이기도 했으나, 대부분의 고형암에서는 그 효과가 아직은 미미한 실정이다.

Hydroxychloroquine은 대표적인 항말라리아제로 최근에는 각종 류마치스 질환에서 항염증약물로도 사용된다. 이들 약물은 세포내에서 산성을 유지하는 기관인 lysosome, endosome 및 trans-Golgi network 등 세포내 기관들의 pH를 상승시켜 약리작용을 나타낸다고 알려져 있다(Fox RI.Mechanism of action of hydroxychloroquine as an antirheumatic drug.Seminars in Arthritis Rheumatism. 23(2 Suppl 1):82-91, 1993 Oct.; Fox R.Anti-malarial drugs: possible mechanisms of action in autoimmune disease and prospects for drug development. Lupus. 5 Suppl 1:S4-10, 1996 Jun.). 세포내 기관들의 알칼리화는 합성된 단백질의 분비에 영향을 미치게 되고, 또한 DNA와 RNA 합성을 저해한다는 보고도 있다.

본 발명자는 다중약제내성을 나타내는 위암 및 대장암 세포주에 항말라리아 제제인 하이드록시클로로퀸, 클로로퀸, 프리마퀸 등과 항암제인 독소루비신, 시스플라틴 등을 일정약물 농도로 병용투약한 후 각각의 조합에 의한 항암효과를 나타내는 최소 유효농도 조사하여 하이드록시클로로퀸등 항말라리아제제가 항암제에 의한 암세포의 약제 내성을 억제하여 항암제의 항암효과를 상승시키는지를 연구하였다.

도 1a 내지 도 1c는 대장암과 위암 세포주에서 하이드록시클로로퀸 15㎍/㎖과 30㎍/㎖ 사용에 따른 Doxorubicin(ADR)과 DDP의 세포독성도의 변화를 나타낸 것이다(X축은 항암제의 투여농도, Y축은 세포 생존율).

도 2a 내지 도 2b는 유방암, 위암, 섬유육종암 세포주에서 클로로퀸 20μM(10.318㎍/㎖)과 40μM(20.636㎍/㎖) 또는 프리마퀸 1.5μM(0.683㎍/㎖)과 3μM(1.366㎍/㎖) 사용에 따른 Doxorubicin(ADR)과 DDP의 세포독성도의 변화를 나타낸 것이다(X축은 항암제의 투여 농도, Y축은 세포 생존율).

도 1a 내지 도 1c는 대장암과 위암 세포주에서 하이드록시클로로퀸 15㎍/㎖과 30㎍/㎖ 사용에 따른 Doxorubicin(ADR)과 DDP의 세포독성도의 변화를 나타낸 것이다. 도 2a 내지 도 2b는 유방암, 위암, 섬유육종암 세포주에서 클로로퀸 20μM(10.318㎍/㎖)과 40μM(20.636 ㎍/㎖) 또는 프리마퀸 1.5μM(0.683㎍/㎖)과 3μM(1.366㎍/㎖) 사용에 따른 Doxorubi cin(ADR)과 DDP의 세포독성도의 변화를 나타낸 것이다.

세포주 및 암세포의 배양

HT-29 (ATCC HTB38, Adenocarcinoma, colon, moderately well differentiated grade II, human), HCT-15 (ATCC CCL225, colon adenocarcinoma, human)의 대장암 세포주와, KHH (YCC-2, Human gastric adenocarcinoma),PHB (YCC-3, Human gastric adenocarcinoma), KMB (YCC-7, Human gastric adenocarcinoma),AGS (ATCC CRL 1739, Human gastric adenocarcinoma)의 위암 세포주,HT 1080 (ATCC CCL 121, Fibrosarcoma, Human)섬유육종 세포주, SK-BR-3 (ATCC HTB 30, Adenocarcinoma, breast, malignant pleural effusion human) 유방암세포주를 가열 비활성화(56℃ 30분) 되어진 10% 우태아혈청 (Commonwealth Serum Laboratories, Australia; 이하 FCS로 약함)이 함유된 RPMI 1640 배지(GIBCO, U.S.A.)에 penicillin(100U/ml; GIBCO, U.S.A)과 streptomycin(100㎍/㎖; GIBCO, U.S.A)을 첨가하여 5% CO₂의 존재하에 37℃ 항온배양기에서 배양하였다.

실험에 사용된 약제

실험에 사용된 항암제는 adriamycin(일반명: 독소루비신(Doxorubicin), Farmitalia Carlo Erba Ltd, Italy; 이하 ADR로 약함), cisplatin(diaminodichloro platinum: Pharmachemie B.V., Holland; 이하 DDP로 약함). 항암제에 의한 세포 살상능의 검사는 MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-1-butene; Sigma, U.S.A}를 사용하였다. MTT 검사에 이용한 항암제의 농도는 ADR의 경우 10, 1, 0.1, 0.01㎍/㎖로, DDP는 50, 5, 0.5, 0.05㎍/㎖의 농도로 하여 microplate의 각각의 column에서 단계적으로 희석하여 사용하였다. Hydroxychloroquine의 농도는 15, 30㎍/㎖, Chloroquine의 농도는 10.3, 20.6 ㎍/㎖, Primaquine의 농도는 0.68, 1.36㎍/㎖를 사용하여 실험하였다.

MTT 방법에 의한 세포독성도(항암효과)의 검사

MTT검사는 살아있는 세포의 경우 cytochrome b 및 c 부위에 있는 미토콘드리아의 효소인 succinate dehydrogenase가 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT)의 tetrazolium환을 분절시켜 황색조의 MTT salt를 자주색의 formazan으로 환원시키는데, 그 원리를 두고 있으며, 죽은 세포나 조직 배양액에서는 이러한 변화가 일어나지 않고, 산 세포에서만 선택적으로 일어나는 이 색조 반응을 분광흡도계로 측정하여 살아있는 세포의 수를 알 수 있는 검사법으로, 여러번의 반복 실험에서 재현성이 높아, 현재 미국 국립암연구소에서 인체 종양세포주 에 대한 체외 항암제감수성 검사방법으로 추천되고 있다.

본 연구에서는 Carmichael등의 방법에 따라 MTT 검사를 시행 하였으며, 약술하면 다음과 같다. 각각의 배양된 암세포주에서 성장곡선을 그려, 지수성장을 보이는 세포수를 결정 한 후 세포성장곡선상 지수성장기에 해당하는 세포수를 0.25% trypsin-EDTA를 처리하여 단일 부유 암세포로 만든후, 10% FCS가 함유된 RPMI 1640 배지로 3회 세척하고, trypan blue (GIBCO, U.S.A) 염색으로 세포수를 세어 180μl의 배양액에 지속성장기에 해당하는 세포수를 부유하여 96 well plate (Costar, U.S.A)에 분주하였다. 각각의 세포주는 96 well plate에 분주하여 37⁰C, 5% CO₂배양기에서 24시간 배양한 후, 여러 농도의 항암제를 단독 또는 조합하여 20μl의 생리식염수에 용해시켜 96 well plate에 투여하였다. 이후 microplate를 4일 추가 배양한 후 MTT 50μl (2mg/ml)를 각well에 첨가하고 이를 4시간 더 추가 배양하였다. 이때 대조군의 well에는 항암제 대신 동량의 생리식염수를 사용하였다. 배양이 끝난 microplate는 450g에서 10분간 원심분리한 후, 바닥에 있는 formazan 결정이 제거되지 않도록 주의하면서, 30μl 정도의 배양액이 남도록 digital multichannel pipette (Flow Titertck, Finland)을 사용하여 상층액을 제거하였다. 여기에 다시 150 μl의 dimethyl sulfoxide (Sigma, U.S.A)를 각 well에 첨가하고 진탕기(plate shaker)에서 formazan결정이 용해될 때까지 36⁰C에서 10분간 진탕한 후 multi-well ELISA automatic spectrometer recorder (Behring ELISA Processor II, Germany)를 이용하여 540nm의 파장에서 판독한 실험군의색소흡수율(absorbance, optical density)을 대조군의 색소흡수율과 비교하여 아래의 공식으로 생존율을 구하였다.

본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

실시예 1.

위에 기술한 방법에 따라 아래 암세포주에 하이드록시클로로퀸을 15㎍/㎕, 30㎍/㎕을 각각 독소루비신, 시스플라틴(DDP: cisplatin)과 병용투여하여 각각의 최소유효농도 (IC₅₀)을 측정하여 표 1에 기재하였다.

hydroxychloroquine 15 ㎍/ml과 30 ㎍/ml병용투여시 대장암 세포주 및 위암 세포주에서 doxorubicin과 DDP의 최소유효농도(IC₅₀)

	Doxorubicin	DDP
	control(㎍/ml)	하이드록시클로로퀸15㎍/ml	하이드록시클로로퀸30㎍/ml	control(㎍/ml)	하이드록시클로로퀸15㎍/ml	하이드록시클로로퀸30㎍/ml
HT-29	0.55	0.4	0.09	3.03	2.36	0.64
HCT-15	3.16	0.06	0.007	3.35	0.91	0.1
YCC-2	0.30	0.13	0.008	2.24	1.50	0.13
YCC-3	0.68	0.04	0.01	6.11	0.36	0.04
YCC-7	9.77	0.74	0.05	24.8	6.42	0.27

표 1에서 보는 바와 같이, Hydroxychloroquine(HCQ)의 경우 50%세포사망률을 측정한 결과 대장암의 경우 HCQ실험농도에서 항암제 Doxorubicin는 약 10배의 약효증대를 보여주고있으며, DDP의 경우 평균 2-5배의 약효증대 효과를 보였다. 위암세포주의 경우에는 HCQ실험농도에서 항암제 Doxorubicin은 약3-10배의 약효증대를 보여주고있으며, DDP의 경우 평균 4-15배의 약효증대 효과를 보여주었다.

실시예 2.

상기 실시예 1과 같은 방법으로 아래 암세포주에 클로로퀸 20μM, 40μM를 각각 독소루비신, 시스플라틴(DDP: cisplatin)과 병용투여한 후 각각의 최소유효농도를 측정하여 하기 표 2에 기재하였다.

chloroquine 20μM(10.318㎍/㎖)과 40μM(20.636㎍/㎖) 병용투여시 유방암 세포주 및 위암세포주에서 doxorubicin 과 DDP의 최소유효농도(IC₅₀)

	Doxorubicin	DDP
	control(㎍/ml)	클로로퀸20μM	클로로퀸40μM	control(㎍/ml)	클로로퀸20μM	클로로퀸40μM
SK-Br-3	0.345	0.275	0.115	18.25	9.0	8.75
AGS	0.975	0.175	0.0985	4.77	7.5714	4.717
HT1080	0.887	0.236	0.0788	19.143	7.5714	0.757
YCC-7	6.15	0.80	0.605	11.25	2.675	2.1

표 2에서 보는 바와 같이, Chloroquine(CQ)의 경우 50% 세포사망률을 측정한 결과 유방암의 경우 CQ 실험농도에서 항암제 Doxorubicin는 약 1.4-3배, 위암의 경우는 약 6-10배, 육종암의 경우는 약 4-10배의 약효증대를 보여주고 있으며, DDP의 경우 유방암의 경우에서는 약 2-2.3배, 위암의 경우는 약 1-5배, 육종암의 경우는 약 2.3-12배의 약효증대를 보여주고 있다.

실시예 3.

실시예 1과 같은 방법으로 아래 암세포주에 프리마퀸 1.5μM, 3μM을 각각 독소루비신, 시스플라틴(DDP: cisplatin)과 병용투여한 후 각각의 최소 유효농도를측정하여 하기 표 3에 기재하였다.

primaquine 1.5μM(0.683㎍/㎖)과 3μM(1.366㎍/㎖) 병용투여시 유방암 세포주 및 위암 세포주에서 doxorubicin과 DDP의 최소유효농도(IC₅₀)

	Doxorubicin	DDP
	Control(㎍/ml)	프리마퀸1.5μM	프리마퀸3μM	Control(㎍/ml)	프리마퀸1.5μM	프리마퀸3μM
SK-Br-3	0.345	0.1	0.23	18.25	16.25	16.25
AGS	0.975	0.0945	0.088	4.77	4.5	7.829
HT1080	0.887	0.2286	0.275	19.143	16.571	12.714
YCC-7	6.15	0.60	0.50	11.25	2.0652	1.975

표 3에서 보는 바와 같이, Primaquine(PQ)의 경우 50%세포사망률을 측정한 결과 유방암의 경우 PQ실험농도에서 항암제 Doxorubicin는 약 3배, 위암의 경우는 약 10배, 육종암의 경우는 약 3-4배의 약효증대를 보여주고 있으며, DDP의 경우 유방암에서는 약 1.2배, 위암의 경우는 약 1-6배, 육종암의 경우는 약 1.3배의 약효증대를 보여주고 있다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명에서 항말라리아제와 항암제의 병용투여시 암종류에 관계없이 항암제의 항암효과가 증대하는 것을 알 수 있으며, 이 경우 기존 항암제의 투여방법에 따라 항말라리아제는 경구, 비경구 어느 경우라도 좋으며, 하이드로클로로퀸 0.1~500mg/kg, 클로로퀸 0.1~700mg/kg, 프리마퀸 0.1~800mg/kg을 기존 항암제의 투여용량과 병용투여하는 것이 바람직하며, 하이드로클로로퀸 10~100mg/kg, 클로로퀸 10~300mg/kg, 프리마퀸 50~500mg/kg을 기존 항암제 투여용량과 병용투여하는 것이 보다 바람직하다.

이상 설명하고 실시예를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 항말라리아제로 흔히 사용되는 하이드록시클로로퀸, 클로로퀸, 프리마퀸 등과 대표적인 항암제인 독소루비신, 시스플라틴 등을 병용투여하면 항암제의 최소 유효농도(IC₅₀)을 낮추고 항암제에 의한 암세포의 약제 내성을 억제하여 유방암의 경우 약 3배, 위암의 경우 약 10배, 대장암의 경우 약 10배, 육종암의 경우 약 10배까지 항암 효과를 상승시킬 수 있는 효과가 있다.

Claims

활성 성분으로 항말라리아제 및 시스플라틴을 포함하여 항암 효과를 상승시키는 것을 특징으로 하는 복합 항암 조성물.
제1항에 있어서, 항말라리아제가 시스플라틴의 암세포 내성을 억제하여 항암 효과를 상승시키는 것을 특징으로 하는 복합 항암제 조성물.
제1항에 있어서, 항말라리아제는 하이드록시클로로퀸, 클로로퀸 또는 프리마퀸인 것을 특징으로 하는 복합 항암 조성물.
제3항에 있어서, 항말라리아제는 하이드록시클로로퀸인 것을 특징으로 하는 복합 항암 조성물.