KR100382982B1 - Strong Antioxidant Identification from Aloe Abadensis - Google Patents

Abstract

알로에 바아바덴시스로부터 식별되고 유리된 화합물이 특정 부여되며, 강력한 산화방지제 작용을 나타내는 것으로 판명되었다.Compounds identified and liberated from Aloe Babadensis have been given particular, and have been shown to exhibit potent antioxidant action.

Description

알로에 바아바덴시스로부터의 강력한 산화방지제 식별법Robust Antioxidant Identification from Aloe Babadensis

발명의 분야Field of invention

본 발명은 산화방지제 분야에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 강력한 산화방지 활성을 나타내는 알로에 바아바덴시스로부터 유리된 페놀계 화합물의 식별 및 정제 방법에 관한 것이다.The present invention relates to the field of antioxidants. Specifically, the present invention relates to a method for the identification and purification of phenolic compounds liberated from aloe barbadensis that exhibit potent antioxidant activity.

발명의 배경Background of the Invention

알로에 식물은 많은 생물학적 활성 물질을 함유하는 복잡한 식물이다. (코엔( Cohen) 등의상처치료/생화학 및 임상적 관점(Wound Healing/Biochemical and clinical Aspects, 1판, WB 사운더즈(Sounders), 필라델피아(1992)). 연구결과는 이들 생물학적 활성성분의 대부분이 알로에 잎의 중심에 위치한 맑은 겔 필렛(fillet)에 위치하는 것으로 판명되었다. 역사적으로 알로에 제품은 화상, 종기 및 기타 상처 치료를 위한 피부학적 적용에 사용되어 왔다. 이들 용도로 인하여, 임상적 활성, 특히 항염증 활성을 지닌, 알로에 식물로부터의 화합물을 식별하기 위한 수많은 연구가 자극을 받게 되었다(그린드레이(Grindlay) 및 레이놀즈(Reynolds) (1986)의 민족약학지(J. of Ethnopharmacology)16: 117-151 페이지; 하아트(Hart)등 (1988)의 민족 약학지23: 61-71 페이지를 참조). 이들 연구결과로써 항-종양, 항-위궤양, 항-당뇨병 및 항-티로시나제 활성을 지닌 알로에 화합물에 관한 수많은 보고서가 작성되었다(야그(Yag)등 (1977)의 Z. Naturforsch32c: 731-734 페이지 참조).Aloe plants are complex plants containing many biologically active substances. ( Wound Healing / Biochemical and clinical Aspects , Cohen et al., 1st edition, WB Sounders, Philadelphia (1992)). It has been found to be located in a clear gel fillet in the center of aloe leaves Historically, aloe products have been used in dermatological applications for the treatment of burns, boils and other wounds. Numerous studies have been stimulated to identify compounds from aloe plants, especially with anti-inflammatory activity (J. of Ethnopharmacology 16 : 117 by Grindlay and Reynolds (1986). . page -151; national pharmaceutical art and not 23 (Hart) et al. (1988): see pages 61-71), wherein as a result of these studies - cancer, anti - Aloe with a tyrosinase activity-ulcer, anti-diabetic and anti compound The number of reports have been written about (YAG (Z. Naturforsch 32c of Yag), etc. (1977): see pages 731-734).

알로에 화합물의 항염증 활성은 광범위하게 조사되었다. 데이비스(Davis)등의 연구결과는 알로에가 염증을 감소시킬 뿐만 아니라 상처 치료 효과를 개선시키는 것으로 판명정되었다(데이비스 등(1994) J. Am. Podiatric Med. Assoc,84: 77-81 페이지, 데이비스 등(1989) J. Am. Podiatric Med. Assoc.79: 395-397 페이지), 알로에의 항염증/상처 치료 능력은 상처 치료 및 염증 감소 과정을 활성화시키는 성장 인자형 물질에 기여하게 되었다(데이비스 등(1994) J. Am. Podiatric Med. Assoc.84: 77-81 페이지, 데이비스 등(1989) J. Am. Podiatric Med. Assoc.79: 395-397 페이지).The anti-inflammatory activity of aloe compounds has been extensively investigated. Davis et al. Have found that aloe not only reduces inflammation but also improves wound healing effects (Davis et al. (1994) J. Am. Podiatric Med. Assoc, 84 : pages 77-81, Davis (1989) J. Am. Podiatric Med. Assoc. 79 : pages 395-397), Aloe's ability to treat anti-inflammatory / wounds has contributed to growth factor substances that activate wound healing and inflammation reduction processes (Davis et al. 1994) J. Am. Podiatric Med.Assoc. 84 : 77-81, Davis et al. (1989) J. Am. Podiatric Med. Assoc. 79 : 395-397).

당분야에 일어난 수많은 활동에도 불구하고 오늘날까지, 알로에 식물에 산화방지제가 존재할 가능성 및 생물학적 시스템에서의 그의 생리학적 효과에 관한 보고는 없었다. 자연 발생 산화방지제는 주로 폴리페놀 화합물인데, 이들의 대부분은 식물에서 발견된다. 페놀계 산화방지제는 프리 라디칼 터미네이터 및 금속 킬레이트화제로서 작용하는 것으로 판명되었다. 그들은 주로 식품 첨가제 및 영양보충제로서 사용된다. 자연 발생 페놀계 산화방지제를 식별하기 위하여 수많은 연구가 수행되었다. 통상적인 일부 식물 페놀계 산화방지제의 예로는 플라보노이드(flavonoid) 화합물, 신남산 유도체, 쿠마린, 토코페롤 및 다기능성 유기산이 포함된다. 플라바놀(flavanol), 시산바놀(Schisanbanol) 및 시잔드린(Schizandrin) B를 포함하는 이들 화합물의 일부는 현재 상업적으로 구입 가능하다. 예를 들면, 보어스(Bors) 및 사란(Saran) (1987) Free Rad. Res. Comms.2: 289-295 페이지, 로박(Robak) 및 그리글류스키(Grylglewski) (1988) Biochem. Pharmacol37: 837-841 페이지, 다스(Das) 및 라티(Ratty) (1986)의의약에 있어서의 식물 플라보노이드: 생화학적, 약물학적 및 구조-활성 관계(Plant Flavonoids in Medicine: Biochemical, Pharmacological, and Structure-Activity Relationship) (Cody, Middelton, and Harborne(편)) Alan R. Liss, 뉴욕, 라우톤(Laughton) 등 (1989) Biochem. Pharmacol.38: 2859-2867 페이지, 슈우(Xue) 등 (1992) Free Rad. Biol. Med.12: 127-135 페이지 참조.Despite numerous activities in the art, to date, there have been no reports of the possibility of antioxidants in aloe plants and their physiological effects in biological systems. Naturally occurring antioxidants are primarily polyphenolic compounds, most of which are found in plants. Phenolic antioxidants have been found to act as free radical terminators and metal chelating agents. They are mainly used as food additives and nutritional supplements. Numerous studies have been conducted to identify naturally occurring phenolic antioxidants. Examples of some common plant phenolic antioxidants include flavonoid compounds, cinnamic acid derivatives, coumarins, tocopherols and multifunctional organic acids. Some of these compounds, including flavanol, Chisanbanol and Chizandrin B, are now commercially available. For example, Bors and Saran (1987) Free Rad. Res. Comms. 2 : 289-295 pages, Robak and Grylglewski (1988) Biochem. Pharmacol 37: 837-841, page dozen (Das) and Lahti (Ratty) (1986) Plant according to the medicament of flavonoids: Biochemical, Pharmacological, and Structure-Activity Relationships (Plant Flavonoids in Medicine: Biochemical, Pharmacological, and Structure Activity Relationship (Cody, Middelton, and Harborne) Alan R. Liss, New York, Laughton et al. (1989) Biochem. Pharmacol. 38 : 2859-2867, Xue et al. (1992) Free Rad. Biol. Med. 12 : See pages 127-135.

발명의 요약Summary of the Invention

본 발명은 강력한 산화방지 활성을 나타내는 알로에 바아바덴시스(Aloe barbadensis)로부터 유리된 페놀계 화합물의 식별 및 정제방법을 기술한다. 여기서 이 화합물의 구조는 알로에 산화방지제 $556 라고 명명되며, 제1도에 도시된다.The present invention describes a method for the identification and purification of phenolic compounds released from Aloe barbadensis that exhibits strong antioxidant activity. The structure of this compound here is named aloe antioxidant $ 556 and is shown in FIG.

이 화합물은 우선 유리된 후, 알로에 페록스(Aloe ferox)로부터 얻은 케냐 알로에로부터 스퍼렌자(Sperenza) 및 공동 연구자에 의하여 그 구조가 결정되었다(스퍼렌자 등 (1986) 식물화학 (Phytochemistry25: 2219-2222 페이지). 예비 시험 결과는 이 화합물이 비타민 E 또는 C 보다 더 효과적인 산화방지제라는 것을 나타냈다.This compound was first liberated and then its structure was determined by Sperenza and co-workers from Kenya Aloe obtained from Aloe ferox (Sperrenza et al. (1986) Phytochemistry 25 : 2219-). Preliminary test results indicate that this compound is a more effective antioxidant than vitamin E or C.

본 발명은 또한 본 화합물을 유리 및 정제하는 개선된 방법을 포함한다. 본 발명의 개선된 방법의 공정 흐름도가 제2도에 제시된다.The present invention also includes an improved method for freeing and purifying the compound. A process flow diagram of an improved method of the present invention is shown in FIG.

제 1도는 알로에 산화방지제 #556의 화학구조를 나타낸다.1 shows the chemical structure of aloe antioxidant # 556.

제 2도는 본 발명의 방법을 공정 흐름도 형식으로 도시한다.2 shows the method of the present invention in the form of a process flow diagram.

바람직한 구체예의 상세한 설명Detailed Description of the Preferred Embodiments

본 발명은 강력한 산화방지 활성을 나타내는 알로에 바아바덴시스로부터 유리된 페놀계 화합물의 식별 및 정제방법을 기술한다. 분자량이 556g/몰인 이 화합물의 구조가 제1도에 제시된다. 여기서 알로에 산화방지제 #556이라고 명명되는 이 화합물은 비타민 E나 C보다 큰 산화방지 활성을 지닌다. 이것이 알로에로부터 유리된 산화방지제에 관한 최초의 보고서이다.The present invention describes a method for the identification and purification of phenolic compounds released from Aloe Babadensis that exhibit potent antioxidant activity. The structure of this compound having a molecular weight of 556 g / mol is shown in FIG. Called aloe antioxidant # 556 here, it has greater antioxidant activity than vitamin E or C. This is the first report on antioxidants free from aloe.

본 발명은 또한 본 화합물을 정제하는 개선된 방법을 제공한다.The present invention also provides an improved method of purifying the present compounds.

실시예 1은 알로에 산화방지제 #556의 유리 및 정제방법을 기술한다. 이어지는 공정은 제2도의 공정 흐름도에 제시된다. 분리 절차는 야기 등(1986) Planta Med.3: 213-218 페이지에 기재된 방법의 변형이다. 요약하면, 알로에 추출물을 동결견조시키고, 알로에 동결 건조물을 메탄올로 추출하고, 앰버라이트(Amberlite) XAD-2 크로마토그라피 칼럼상에서 분리 작업을 수행하여 극성 슈거, 아미노산 및 기타 불순물을 제거한다. 부분적으로 정제된 동결 건조물을 이어서 아세트산 에틸중에 용해시켜, 아세트산 에틸로 실리카 겔 칼럼을 통과시켜 반복적으로 용리시켰다. 이 단계는 종래 기술의 야기 방법을 능가하여 현저히 개선된 점을 나타낸다.Example 1 describes the glass and purification of aloe antioxidant # 556. The process that follows is shown in the process flow diagram of FIG. Separation procedures are described in Yagi et al. (1986) Planta Med. 3 : A variation of the method described on pages 213-218. In summary, the aloe extract is lyophilized, the aloe lyophilized extract is extracted with methanol and a separation operation is performed on Amberlite XAD-2 chromatography column to remove polar sugars, amino acids and other impurities. The partially purified lyophilisate was then dissolved in ethyl acetate and eluted repeatedly by passing through a silica gel column with ethyl acetate. This step represents a marked improvement over the prior art method of causing.

아기의 방법은 아세트산 에틸, 아세톤 및 메탄올의 다수의 혼합된 용매 시스템을 갖는 연속 분류 공정을 이용한다. 아세트산 에틸, 아세트산 에틸: 아세톤(4:1), 아세트산 에틸: 아세톤(3:1), 아세톤 및 메탄올을 포함하는 다수의 상이한 용출액의 극성 증가를 조사하는 과정에서, 순수한 아세트산 에틸 분획이 임의의 보다 많은 극성 분획보다 보다 강력한 산화방지제를 함유한다는 것이 발견되었다.The baby's method utilizes a continuous sorting process with multiple mixed solvent systems of ethyl acetate, acetone and methanol. In the course of investigating the increased polarity of many different eluents, including ethyl acetate, ethyl acetate: acetone (4: 1), ethyl acetate: acetone (3: 1), acetone and methanol, the pure ethyl acetate fraction is It has been found to contain more powerful antioxidants than many polar fractions.

상술한 실리카 겔 크로마토그라피에 뒤이어, 2개의 별도의 박층 크로마토그라피(TLC) 시스템을 사용하여, 농축된 혼합물이 추가로 정제되었다. 제 1 TLC 시스템으로부터 분리된 여러 개의 밴드는 산화방지 활성을 보여주었다. 이들 밴드는 유리되어 제 2 TLC 시스템으로 추가로 분리되었다. 제 2 TLC 시스템으로부터 분리된 여러 개의 밴드도 산화방지 활성을 보여주었다. 상당한 산화방지 활성을 나타낸 이들 밴드중 하나를 유리하고, 제 2 TLC 시스템을 이응하여 추가로 정제하였다.Following the silica gel chromatography described above, the concentrated mixture was further purified using two separate thin layer chromatography (TLC) systems. Several bands separated from the first TLC system showed antioxidant activity. These bands were freed and further separated into a second TLC system. Several bands isolated from the second TLC system also showed antioxidant activity. One of these bands that showed significant antioxidant activity was advantageous and the second TLC system was further purified in response.

정제된 화합물은 고압 액체 크로마토그라피(HPLC)분석에서 오직 하나의 피크를 보였다(데이타는 기재되지 않음). 이 화합물은 HPLC, 가스 크로마토그라프-질량분석(GS-MS) 및 핵자기 공명(NMR)에 의하여 분석되어 쿠마르산으로 글리코실화된 C-5-메틸 크로몬으로 확인되었다(데이타는 기재되지 않음). 화합물의 분자량은 556.6인 것으로 판명되었다(따라서, 알로에 산화방지제 #556으로 임시로 명명됨). 이 화합물의 구조가 제1도에 제시된다.The purified compound showed only one peak in high pressure liquid chromatography (HPLC) analysis (data not shown). This compound was analyzed by HPLC, gas chromatography-mass spectrometry (GS-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) to identify C-5-methyl chromon glycosylated with coumaric acid (data not shown). . The molecular weight of the compound was found to be 556.6 (hence the temporary name aloe antioxidant # 556). The structure of this compound is shown in FIG.

2개의 표준방법: MDA(Malondialdehyde) 및 DCF(Dichlorofluorescein) 방법을 이용하여, 지질 과산화의 억제 정도를 측정함으로써, 산화방지제 #556의 산화방지 활성이 평가되었다. MDA 방법은 가장 폭넓게 이용되며 DCF 방법은 MDA 데이터를 보완하기 위하여 사용된다. 2개의 생물학적 정량(bioassay) 시스템 … 지질 과산화를 위하여 NADPH/ADF-Fe²⁺시스템에 의하여 유도된 랫트(rat) 뇌 호모게네이트 및 유리된 랫트 간 마이크로솜의 과산화 … 이 평가를 위하여 사용된다. 랫트 뇌 호모게이트 시스템이 선택되었는데 그것은 생체내 과산화에 대한 환경에 대한 유사성 때문이다. MDA 방법은 말론디알데히드 발생의 억압을 측정한다. 말론디알데히드는 지질 과산화반응의 주요 부산물 중의 하나로서, 지질 과산화를 측정하는 하나의 수단으로서 통상 이용된다. 존재하는 말론디알데히드의 양은 바아비투르산(TBA)을 사용하여 측정된다. DCF 방법은 프리 라디칼 발생의 억압을 측정한다. 말론디알데히드와 마찬가지로, 프리 라디칼도 지질 과산화 현상의 결과로서 발생된다. 프리 리디칼의 농도는 디클로로플루오레신-디아세테이트를 사용하여 측정된다. MDA 및 프리 라티칼 형성의 억제가 각각 커질수록, 화합물은 산화 방지제로서 더 효과적이 된다. 결과는 표 1에 제시된다.The antioxidant activity of antioxidant # 556 was evaluated by measuring the degree of inhibition of lipid peroxidation using two standard methods: MDA (Malondialdehyde) and DCF (Dichlorofluorescein) methods. The MDA method is the most widely used and the DCF method is used to complement the MDA data. Two bioassay systems. Peroxidation of Rat Brain Homogenate and Free Rat Liver Microsomes Induced by the NADPH / ADF-Fe ²⁺ System for Lipid Peroxidation. It is used for this evaluation. The rat brain homogate system was chosen because of its similarity to the environment for peroxidation in vivo. The MDA method measures the suppression of malondialdehyde development. Malondialdehyde is one of the major by-products of lipid peroxidation and is commonly used as a means of measuring lipid peroxidation. The amount of malondialdehyde present is measured using barbituric acid (TBA). The DCF method measures the suppression of free radical generation. Like malondialdehyde, free radicals are generated as a result of lipid peroxidation. The concentration of free radicals is measured using dichlorofluorescein-diacetate. The greater the inhibition of MDA and free radical formation, respectively, the more effective the compound is as an antioxidant. The results are shown in Table 1.

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 배양 10분 후, 대조 샘플에 비하여, MDA 생성은 16% 이상 억제되었으며, 프리 라디칼 생성은 57% 이상 억제되었다. 그러나, 30분 후에는 MDA 생성의 억제가 대조 샘플보다 70% 증가되었으며, 프리 라디칼 생성은 대조 샘플보다 84% 이상 억제되었다. 이 결과는 알로에 산화방지제 #556이 강력한 산화방지제라는 것을 교시한다.As can be seen from Table 1, after 10 minutes of incubation, MDA production was inhibited by at least 16% and free radical production was suppressed by at least 57% compared to the control sample. However, after 30 minutes, inhibition of MDA production was increased by 70% compared to the control sample and free radical production was inhibited by at least 84% than the control sample. These results teach that aloe antioxidant # 556 is a powerful antioxidant.

이 화합물의 산화방지 활성이, 토코페롤, 몰식자산 프로필(propyl galate) 및 BHA를 포함하는 몇 개의 시판되는 산화방지제 및 쿠마르산, 페루로일(feruloyl) 알로에신 및 바알바로인(barbaloin)과 같은 기타 페놀계 알로에 성분과 비교되었다. 이들 결과는 표 2에 제시된다. 산화 방지제 효율은 상술한 바와 같이, MDA 및 DCF 방법을 이용하여 지질 과산화의 억제 %로서 평가되었다. 0.5mM의 농도에서, 알로에 산화방지제 #556에 의한 MDA 생성의 억압은 98%였는데, 이것은 동일 농도에서의 토코페롤의 효능에 해당한다. 그러나, 좀 더 농도가 낮은 0.1mM에서는, 알로에 산화방지제 #556이 토코페롤보다 현저하게 더욱 효율적이다(92% 대 58%). 페루로일 알로에신은 0.5mM의 농도에서 MDA 억압율이 59%로서 중간정도의 산화방지활성을 나타내었으나, 0.1mM에서는 억압율이 절반 이하로 감소하였다. 이와 같은 경향은 쿠마르산의 경우에서도 유사하다. 바알발로인은 매우 약한 산화방지성 효과를 보였다. 이들 결과는 알로에 산화방지제 #556이 효율적인 산화방지제라는 것뿐만 아니라, 그 효과적인 활성범위가 기타 통상적으로 사용되는 자연 발생 산화방지제보다도 낮은 농도에서도 볼 수 있다는 것을 교시한다.The antioxidant activity of this compound is limited to several commercially available antioxidants, including tocopherol, propyl galate and BHA, and other phenols such as kumaric acid, feruloyl aloesin and barbaloin. Compared with the system aloe component. These results are shown in Table 2. Antioxidant efficiency was assessed as% inhibition of lipid peroxidation using the MDA and DCF methods, as described above. At a concentration of 0.5 mM, the suppression of MDA production by aloe antioxidant # 556 was 98%, corresponding to the efficacy of tocopherol at the same concentration. However, at a lower concentration of 0.1 mM, aloe antioxidant # 556 is significantly more efficient than tocopherol (92% vs 58%). Peruroyl aloesin showed moderate antioxidant activity with 59% MDA suppression at the concentration of 0.5mM, but the suppression rate decreased to less than half at 0.1mM. This trend is similar in the case of kumaric acid. Baalvaloin has a very weak antioxidant effect. These results teach not only that aloe antioxidant # 556 is an efficient antioxidant, but that its effective range of activity can be seen at lower concentrations than other commonly used naturally occurring antioxidants.

강력한 산화방지제로서, 화합물 #556은 다수의 강력한 용도가 있는데, 예를 들면 BHA 또는 BHT와 같은 식품 첨가제, 또는 비타민 A 또는 E와 같은 영양 보충제와 같은 용도가 있다. 알로에 산화 방지제 #556은 일부 가능한 치료적 용도도 있을 수 있다. 당분야의 숙련자들은 소정의 용도에 적합하도록 화합물 #556을 가장 효율적으로 만들기 위하여, 화합물을 적절히 배합할 수 있다. 여기에 제시된 산화방지활성 데이터도 당분야의 숙련자로 하여금 소정의 용도를 위한 적절한 투여 방법을 채택하는데 도움을 주게 된다.As a potent antioxidant, Compound # 556 has a number of potent uses, such as food additives such as BHA or BHT, or nutritional supplements such as vitamins A or E. Aloe antioxidant # 556 may also have some possible therapeutic uses. Those skilled in the art can formulate the compound as appropriate to make compound # 556 most suitable for the intended use. The antioxidant activity data presented herein will also help those skilled in the art to adopt the appropriate method of administration for a given use.

본 출원은 산화방지제로서의 화합물 #556의 용도를 포함한다. 또한 본 출원의 범위에 포함된 것은, 알로에 바아바덴시스로부터 유도되거나 또는 화합물- #556의 미소한 화학적 변형으로 얻어진 화합물 #556 유사체의 용도이다.This application includes the use of compound # 556 as an antioxidant. Also included in the scope of this application is the use of a compound # 556 analog derived from Aloe Babadenssis or obtained with a minor chemical modification of compound-# 556.

하기 실시예는 본 발명의 목적만을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를제한하려는 것은 아니다.The following examples are only intended to illustrate the purpose of the invention, and are not intended to limit the scope of the invention.

실시예 1. 알로에 산화 방지제 #556의 유리 및 정제Example 1 Glass and Tablets of Aloe Antioxidant # 556

재료material

알로에 바아바덴시스의 동결건조물을 가공된 형태 및 미가공 형태로, 알로에 코포레이션 (Aloecorp. 어벙, 텍사스)으로부터 공급받았다. 동결건조물을 제조하기 위하여, 최고도의 위생설비하에서 알로에 식물을 수확하고, 식물의 잎으로부터 겔을 필렛화하였다. 펄프는 250 메쉬 스크린을 관통시키는 것으로 겔로부터 제거시키고, 겔을 동결 건조 단계 전에, 활성탄 및 규조토로 여과하여 탈색시켰으며, 이것은 필렛화의 2시간 이내에 행하였다. 폴린-시오칼티우(Folin-Ciocalteau) 시약 방법을 통한 총 페놀계 함량에 의하여, 알로에 화합물의 몰 농도를 결정하였다. 표준 물질로서 쿠마르산(시그마사)을 이용하여, 방법에 대한 표준 곡선을 얻었다.The lyophilisate of Aloe Babadenssis was supplied from Aloe Corporation (Aloecorp. Erbung, Texas) in processed and unprocessed form. To prepare the lyophilisate, aloe plants were harvested under the highest sanitation and fillets were gelled from the leaves of the plants. The pulp was removed from the gel by penetrating a 250 mesh screen and the gel was decolorized by filtration with activated carbon and diatomaceous earth before the freeze drying step, which was done within 2 hours of filleting. The molar concentration of aloe compounds was determined by total phenolic content via the Folin-Ciocalteau reagent method. A standard curve for the method was obtained using kumaric acid (Sigma) as the standard material.

알로에 바이바덴시스의 동결건조물로부터 페놀계 화합물의 추출Extraction of Phenolic Compounds from Lyophilized Aloe Bibadensis

상술한 바와 같이, 분리 절차는 야기 등(1986)의 Planta Med.3: 213 - 218 페이지에 기술된 방법의 변형이다. 요약하면, 10g의 알로에 동결 건조물을 200ml의 메탄올로 5회 추출하였다. 다음에 수집된 추출물을 증발 및 동결건조시켜 0.35g의 황색분말을 얻었다. 이 분말을 10ml의 증류수에 용해시키고, 스티렌-디비닐벤젠 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그라피(엠버라이트 XAD-2, 2.5x28cm, Mallinckrodt)에 의하여 각각의 화학 성분으로 분리하였다. 페놀계 화합물을 용리하기 전에, 칼럼을 우선 종류수로 수회 세척하여, 알로에로부터 기원한 극성 슈거, 아미노산 및 기타 불순물을 제거하였다. 페놀계 화합물을 이어서 100ml의 메탄올로 용리하였다. 메탄올 용출액을 증발, 건조시켜 황색 분말을 얻었다. 이 분말을 아세트산 에틸중에 용해시키고, 아세트산 에틸로 실리카 겔 칼럼을 통과시켜 반복적으로 용리시켰다.As noted above, the separation procedure is described in Planta Med. 3 : A variation of the method described on pages 213-218. In summary, 10 g of aloe lyophilisate was extracted five times with 200 ml of methanol. The collected extracts were then evaporated and lyophilized to yield 0.35 g of yellow powder. This powder was dissolved in 10 ml of distilled water and separated into respective chemical components by column chromatography (Amberlite XAD-2, 2.5 × 28 cm, Mallinckrodt) using styrene-divinylbenzene resin. Prior to eluting the phenolic compound, the column was first washed several times with kind water to remove polar sugars, amino acids and other impurities originating from aloe. The phenolic compound was then eluted with 100 ml of methanol. The methanol eluate was evaporated and dried to give a yellow powder. This powder was dissolved in ethyl acetate and eluted repeatedly by passing through a silica gel column with ethyl acetate.

박층 크로마토그라피(TLC) 및 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC) 분석Thin Layer Chromatography (TLC) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Analysis

실리카 겔 60(메르크)으로 채워진 박층 크로마토그라피(TLC)를 사용하여, 농축된 아세트산 에틸 분획을 추가로 정제하였다. TLC 분리를 위하여 2개의 별도 유리 시스템을 채택하였다. 제 1 분리 시스템에 있어서, TLC는 아세트산 에틸: 메탄올: 물(100:10.3)의 이동상으로 가동되었다. 플레이트를 건조하고, 분리된 밴드를 UV 광선하에서 조사하고, 착색 반응을 위하여 0.5% 패스트 블루(Fast Blue) B시약으로 분무하였다. Rf 값이 0.40-0.55인 여러 개의 밴드는 흑갈색 및 보라색의 착색 반응을 보였다. 이들 밴드를 플레이트로부터 제거하고, 화합물을 메탄올로 용리하여, 실리카로부터 분리하였다.The concentrated ethyl acetate fraction was further purified using thin layer chromatography (TLC) filled with silica gel 60 (Merck). Two separate glass systems were employed for TLC separation. In the first separation system, TLC was operated with a mobile phase of ethyl acetate: methanol: water (100: 10.3). The plate was dried and the separated bands were irradiated under UV light and sprayed with 0.5% Fast Blue B reagent for coloring reaction. Several bands with an Rf value of 0.40-0.55 showed dark brown and violet coloring reactions. These bands were removed from the plate and the compound eluted with methanol and separated from the silica.

메탄올 용출 농축물을 이동상으로서 에탄올 및 물로 연속적으로 포화된 클로로포름을 사용하여 제 2 TLC 시스템으로 추가로 분리시켰다. 전개됨에 따라, 플레이트를 건조시기고 UV 광선하에서 조사하고, 0.5% 패스트 블루 B 시약으로 분무하였다. 검은 보라색, 청색 및 오렌지색 밴드를 포함하는 몇 개의 밴드는 각각의 밴드에 함유된 화합물을 유리 및 시험한 결과 산화방지 활성을 보였다. 스포트(spots)들 중에서, 검은 보라색 밴드는 그 상당한 양 및 산화방지 활성 때문에 가장 유망한 것으로 여겨졌다. 이 밴드를 포함하는 TLC 플레이트의 실리카를 플레이트로부터 기계적으로 제거하고, 메탄올로 용리하였다. 농축된 용출액을 다시 스포트 처리하고, 추가 정제하기 위하여 제 2 TLC 시스템에 적용하였다. 추가 정제한 결과, 패스트 블루 B로 분무한 후에, 하나의 밴드가 현저한 황색을 나타냈다. 정제된 샘플은 HPLC 분석에 의하여 하나의 피크를 나타냈으며, 물질의 분자량은 GC-MS에 의하여 556.6g/몰로 측정되었다. HPLC, GC-MS, NMR 및 UV 주사(scanning)데이터(데이타는 기재되지 않음)와 함께, 다양한 화학 시험으로 얻은 정보에 의하여, 화학구조가 결정되었다. 따라서, 2개의 상이한 연속적 TLC 분리 시스템을 적용함으로써 고도로 정제된 알로에 산화방지제 #556을 얻는 것이 가능하게 되었다.The methanol eluting concentrate was further separated into a second TLC system using chloroform continuously saturated with ethanol and water as mobile phase. As developed, the plates were dried and irradiated under UV light and sprayed with 0.5% Fast Blue B reagent. Several bands, including the black purple, blue and orange bands, showed antioxidant activity as a result of the free and tested compounds contained in each band. Among the spots, the black purple band was considered the most promising because of its significant amount and antioxidant activity. Silica of the TLC plate containing this band was mechanically removed from the plate and eluted with methanol. The concentrated eluate was again spotted and subjected to a second TLC system for further purification. Further purification revealed that after spraying with Fast Blue B, one band showed significant yellow color. The purified sample showed one peak by HPLC analysis and the molecular weight of the material was determined to be 556.6 g / mol by GC-MS. The chemical structure was determined by information obtained by various chemical tests, along with HPLC, GC-MS, NMR and UV scanning data (data not shown). Thus, by applying two different successive TLC separation systems, it became possible to obtain highly purified Aloe Antioxidant # 556.

실시예 2. 화합물 #556의 산차방지성 효과 측정Example 2. Determination of Anti-acid Effect of Compound # 556

MDA 방법MDA Method

유리관에서, 100㎕의 랫트 뇌 호모게네이트 및 약 10㎍의 알로에 산화방지제 #556을, 100㎕의 8.1% 도데실 황산 나트륨(SDS) 용액과 함께 혼합하였다. 혼합물을 5초간 원심분리한 후, 1.5ml의 20% 아세트산을 첨가하고, 혼합물을 다시 원심분리하였다. 이어서 1.0ml의 1.2% 티오바아비투르산(thiobarbituric acid; TBA) 용액을 첨가하고, 유리관을 깨끗한 대리석으로 덮고, 30분간 끓는 물에 넣었다. 2,000rpm께서 10분간 원심분리한 후에, 상청액의 색채 강도를 분광 광도계(시마드주, UV 265)에 의하여 532nm에서 판독하였다.In a glass tube, 100 μl of rat brain homogenate and about 10 μg of aloe antioxidant # 556 were mixed with 100 μl of 8.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution. After the mixture was centrifuged for 5 seconds, 1.5 ml of 20% acetic acid was added and the mixture was centrifuged again. 1.0 ml of 1.2% thiobarbituric acid (TBA) solution was then added and the glass tube was covered with clean marble and placed in boiling water for 30 minutes. After centrifugation at 2,000 rpm for 10 minutes, the color intensity of the supernatant was read at 532 nm by spectrophotometer (UV 265, Shimad).

DCF 방법DCF method

150㎕의 랫트 뇌 호모게네이트 및 약 10㎍의 알로에 산화방지제 #556을 1.6ml의 증류수에 첨가하였다. 에탄올중에 용해된 20㎕의 0.125mM 디클로로플루오레신-디아세테이트(DCFHDA) 및 10㎕의 0.1 유닛 에스터라제를 혼합물에 첨가하고, 10분간 배양하였다. 488nm에서의 여기 파장(밴드 폭 5nm) 및 525nm의 방사 파장(밴드 폭 20nm)을 이용하여 분광형광계(spectrofluorometer, 페르킨 엘머, LS 50)로 형광 강도를 측정하였다. DCF의 농도는 표준 DCF 곡선과의 비교에 의하여 측정하였는데, 이것은 농도를 알고 있는 DCF 샘플의 형광 활성을 플롯팅하여 구축하였다. 산화방지 활성은, 하기 식을 이용하여, 산화방지제 #556의 억압율을 대조 샘플에 비교함으로써 계산하였다. 결과는 표 2에 제시된다.150 μl of rat brain homogenate and about 10 μg of aloe antioxidant # 556 were added to 1.6 ml of distilled water. 20 μl of 0.125 mM dichlorofluorescein-diacetate (DCFHDA) and 10 μl of 0.1 unit esterase dissolved in ethanol were added to the mixture and incubated for 10 minutes. Fluorescence intensities were measured with a spectrofluorometer (Perkin Elmer, LS 50) using an excitation wavelength at 488 nm (band width 5 nm) and an emission wavelength of 525 nm (band width 20 nm). The concentration of DCF was determined by comparison with a standard DCF curve, which was constructed by plotting the fluorescence activity of the DCF sample of known concentration. Antioxidant activity was calculated by comparing the suppression rate of antioxidant # 556 to the control sample using the following formula. The results are shown in Table 2.

[수학식 1][Equation 1]

[표 1]TABLE 1

[표 2]TABLE 2

Claims (3)

하기 a) 내지 d) 단계를 포함하는 알로에 추출물로부터 하기 구조식을 지닌 알로에 산화방지제 화합물 #556을 유리하는 방법.A method of freeing aloe antioxidant compound # 556 having the following structural formula from an aloe extract comprising steps a) to d): [화학식 3][Formula 3] a) 알로에 추출물을 동결 건조하는 단계;a) freeze drying the aloe extract; b) 상기 알로에 동결건조물로부터 페놀계 화합물을 추출하는 단계;b) extracting a phenolic compound from the aloe lyophilisate; c) 산화방지 활성을 지닌 화합물을 유리하기 위하여, 상기 페놀계 화합물을 제 1 박층 크로마토그라피(TLC) 시스템에 적용하는 단계; 및c) applying said phenolic compound to a first thin layer chromatography (TLC) system to release a compound having antioxidant activity; And d) 알로에 산화방지제 화합물 #556을 유리하기 위하여, 산화방지 활성을 지닌 상기 화합물을 제 2 TLC 시스템에 적용하는 단계.d) applying said compound with antioxidant activity to a second TLC system in order to favor aloe antioxidant compound # 556. 알로에 바아바덴시스로부터 식별 및 유리되고, 산화방지능을 갖는 하기 화학식의 페놀계 화합물을 포함하는 산화방지제.An antioxidant comprising a phenolic compound of the formula: identified and freed from Aloe Babadensis, and having antioxidant activity. [화학식 4][Formula 4] 알로에 바아바덴시스로부터 식별 및 유리되고, 산화방지능을 갖는 하기 화학식의 페놀계 화합물의 유사체를 포함하는 산화방지제.An antioxidant comprising an analog of a phenolic compound of the formula: identified and freed from Aloe Babadensis and having an antioxidant activity. [화학식 5][Formula 5]