KR100381494B1 - Generation of human insulin - Google Patents

Abstract

프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 폴딩함으로서 재조합 인간 인슐린을 생산하는 향상되고 효과적인 방법을 제공한다.Folding proinsulin hybrid polypeptides provides an improved and effective method of producing recombinant human insulin.

Description

인간 인슐린의 제조방법{GENERATION OF HUMAN INSULIN}Production method of human insulin {GENERATION OF HUMAN INSULIN}

본 발명은 1993년 12월 29일 출원된 미국 출원번호 08/175/298의 부분연속출원이다.The present invention is a partial serial application of US Application No. 08/175/298, filed December 29, 1993.

본 명세서를 통해 다양한 간행물이 괄호 안의 아라비아 숫자에 의해 참조된다. 이러한 참조문헌에 대한 완전한 인용은 명세서의 끝부분 청구항 직전에 있다.Throughout this specification, various publications are referred to by Arabic numerals in parentheses. Full citation of this reference is at the end of the specification immediately before the claim.

이러한 간행물의 전체 개시 내용은 본 발명이 속하는 기술분야를 더욱 상세히 설명하기 위해 본 명세서에 참고로 삽입된다.The entire disclosure of these publications is incorporated herein by reference in order to explain in more detail the technical field to which this invention pertains.

인슐린은 글루코스 대사의 조절에 필수적인 폴리펩티드 호르몬으로, 인슐린의 불충분한 공급으로 일어나는 대사장애(metabolic disorder)인 당뇨병으로 고생하는 환자에게 매일 투여된다.Insulin is a polypeptide hormone essential for the regulation of glucose metabolism and is administered daily to patients suffering from diabetes, a metabolic disorder caused by insufficient supply of insulin.

생체내에서(in vivo)호르몬은 먼저 길다란 전구물질 분자로서 합성되고, 이어서 A사슬과 B사슬로 구성된 생물학적 활성형태로 가공된다. 더욱 상세히 설명하면, 프리프로인슐린 (preproinsulin) 유전자는 내분비선의 췌장(endocrine pancreas)의 베타 세포에서 mRNA 전구물질로 전사되고, 상기 mRNA 전구물질은 성숙한 mRNA를 생산하기 위해 스플라이싱(splicing)된다. 상기 mRNA는 프리프로인슐린(NH₂-프리리전(preregion)-B 사슬-C 펩티드-A 사슬-COOH)으로 번역되고, 이어서 프리프로인슐린은 프로인슐린으로 가공되고, 결국은 인슐린으로 가공된다. 상기 가공의 첫단계는, 조면소포체(rough endoplasmatic reticulum)의 마이크로좀 멤브레인을 통해 미성숙 사슬이 트랜스퍼(transfer)하도록 소수성 신호 서열로 사용되는 상기 프리리전을 단백질분해에 의해 제거하는 것이다. 인간 프리프로인슐린에서 프리리전의 길이는 24개의 아미노산이다. In vivo, hormones are first synthesized as long precursor molecules and then processed into biologically active forms consisting of A and B chains. In more detail, the preproinsulin gene is transcribed into mRNA precursors in beta cells of the endocrine pancreas, and the mRNA precursors are spliced to produce mature mRNA. The mRNA is translated into preproinsulin (NH ₂ -preregion-B chain-C peptide-A chain-COOH), which is then processed into proinsulin and eventually into insulin. The first step in the process is proteolytic removal of the precipitates used as hydrophobic signal sequences to transfer immature chains through the microsomal membrane of the rough endoplasmatic reticulum. In human preproinsulin, the length of the region is 24 amino acids.

프로인슐린에서, 성숙한 인슐린이 될 폴리펩티드 사슬의 2개 지역, 즉 B- 및 A 사슬은 N 및 C 말단에 2쌍의 염기성 아미노산을 포함하는 C 펩티드(또는 C-사슬)에 의해 서로 연결된다. 대부분의 C-펩티드에서의, 상기 염기성 아미노산 쌍들은 Arg-Arg와 Lys-Arg이다. 상기한 측면으로 늘어선 2쌍의 염기성 아미노산을 포함하는, 인간 C 펩티드는 35개의 이미노산을 함유한다. 상기 C 펩티드는 폴리펩티드의 2개 부분을 연결하여 상기 B 및 A 단편(segments) 간에 적절한 디설파이드 다리(disulfide bridge)의 형성을 돕는다. 따라서, 상기 C 펩티드의 역할은 그 구조에 크게 의존하지 않는다. 사실, 더 짧은 합성 다리로 대체해도 프로인슐린 분자가 적절하게 폴딩(folding)된다 (1,2).In proinsulin, the two regions of the polypeptide chain to be mature insulin, ie the B- and A chains, are linked to each other by a C peptide (or C-chain) comprising two pairs of basic amino acids at the N and C termini. In most C-peptides, the basic amino acid pairs are Arg-Arg and Lys-Arg. Human C peptides, comprising two pairs of basic amino acids lined in the above aspect, contain 35 imino acids. The C peptide joins two portions of the polypeptide to assist in the formation of a suitable disulfide bridge between the B and A segments. Thus, the role of the C peptide does not depend greatly on its structure. In fact, the replacement of shorter synthetic bridges allows the proinsulin molecules to fold properly (1,2).

상기 프로인슐린은 폴딩되면서 동시에 A사슬 안에서 2개의 사슬간의 디설파이드 결합과 하나의 디설파이드 결합의 산화를 일으킨다. 성숙화의 최종 단계에서, 단백질 분해 효소는 염기성 아미노산에서 절단하여 C 펩티드를 방출하고 성숙한 인슐린(3)을 형성한다. 인간 인슐린에서 상기 A 사슬은 아미노산 21개의 길이이고 B사슬은 아미노산 30개의 길이이다.The proinsulin folds and simultaneously oxidizes two disulfide bonds and one disulfide bond in the A chain. In the final stage of maturation, proteolytic enzymes cleave at the basic amino acids to release the C peptide and form mature insulin (3). In human insulin, the A chain is 21 amino acids long and the B chain is 30 amino acids long.

인슐린에 대한 세계적인 수요는 매년 수톤을 넘고 있지만, 공급은 심각하게부족한 실정이다. 종래에는, 인슐린은 한정된 동물 원료, 주로 소와 돼지의 췌장으로부터 생산되었다. 상기 소와 돼지의 췌장에 의해 생산된 인슐린은 인간 인슐린과 다르고 역면역반응(adverse immune reaction)을 초래할 수도 있다.Global demand for insulin is more than a ton every year, but supply is severely short. In the past, insulin was produced from a limited animal source, primarily the pancreas of cattle and pigs. Insulin produced by the pancreas of cattle and pigs is different from human insulin and may result in an reverse immune reaction.

1960년대에 행해진 연구결과는 시험관 내(in vitro)에서의 인슐린 제조가 가능하게 되었다. 인슐린 합성은 S-술폰화된 형태(4)에서 A 및 B 사슬을 조합하거나 또는 환원된 프로인슐린(5)의 자발적 재산화에 의해 얻어졌다. 상기 후자의 재산화하는 방법은 산화 혼합물에서의 단백질 농도가 매우 낮기 때문에 대규모의 인슐린 생산에는 부적합했다. 이어서 트립신과 카르복시펩티다제 B (carboxypeptidase B)(6)로 처리한 후 인슐린이 회수될 수 있었다.Research done in the 1960s made it possible to produce insulin in vitro. Insulin synthesis was obtained by combining A and B chains in S-sulfonated form (4) or by spontaneous reoxidation of reduced proinsulin (5). This latter reoxidation method is unsuitable for large scale insulin production because of the very low protein concentration in the oxidative mixture. Insulin could then be recovered after treatment with trypsin and carboxypeptidase B (6).

반합성(semi-synthetic) 및 생합성(biosynthetic) (재조합) 인간 인슐린이 최근 사용가능하게 되었다. 반합성 인간 인슐린은 B 사슬의 위치 30(돼지 인슐린과 인간 인슐린의 유일한 차이점)에서 트립신을 촉매로 알라닌을 트레오닌으로 교환함에 의해 돼지 인슐린으로부터 생산된다.이.콜라이(E.coli)또는 효모(yeast)에서 생산된 재조합 인간 인슐린(recombinant human insulin)은 모든 다른 제조 루트들(routes)을 결국 대체하게 될 것이다.Semi-synthetic and biosynthetic (recombinant) human insulin has recently become available. Semisynthetic human insulin is produced from porcine insulin by exchanging alanine for threonine with trypsin as catalyst at position 30 of the B chain (the only difference between pig insulin and human insulin). E. coli (E.coli) or yeast (yeast) with recombinant human insulin (recombinant human insulin) produced will eventually replace all other routes producing (routes).

생합성 재조합 인간 인슐린은 현재 2가지 루트에 의해 제조된다. 그중 한 루트는이.콜라이에서 A 및 B 사슬을 분리하여 생산하여서 상기 사슬들을 조합하는 것이고(7,8), 다른 루트는이.콜라이(1,8) 또는 효모(2,9)에서 발현된 프로인슐린 유사 폴리펩티드를 효소 변환하는 것(enzymatic conversion)이다.Biosynthetic recombinant human insulin is currently produced by two routes. One of them is to separate and produce the A and B chains in E. coli to combine them (7,8), and the other route is expressed in E. coli (1,8) or yeast (2,9). Enzymatic conversion of proinsulin-like polypeptides.

대부분의 경우, 프로인슐린은 세포내 침전 단백질로서 축적되는 혼성단백질(hybrid protein)로 생산된다. 상기 혼성물은 CNBr에 의해 정제되고 절단되어 프로 인슐린 폴리펩티드를 방출한다. 또한, 상기 프로인슐린 폴리펩티드는 산화 술피톨리시스(oxidative sulfitolysis)에 의해 프로인슐린 S-술폰산염(S-sulfonate)으로 변형된다. 이어서, 상기 프로인슐린 S-술폰산염은 정제되고 환원 조건(reducing condition)하에서 프로인슐린(8)으로 폴딩된다. 프로인슐린이 인슐린으로 변환하는 것은 트립신과 카르복시펩티다제 B(6)와 연합 작용에 의해 이루어진다.In most cases, proinsulin is produced as a hybrid protein that accumulates as intracellular precipitated protein. The hybrid is purified and cleaved by CNBr to release the pro insulin polypeptide. In addition, the proinsulin polypeptide is transformed into proinsulin S-sulfonate by oxidative sulfitolysis. The proinsulin S-sulfonate is then purified and folded into proinsulin 8 under reducing conditions. The conversion of proinsulin to insulin is done in association with trypsin and carboxypeptidase B (6).

Novo Nordisk A/S에 부여된 특허 공개번호 EP 195691 B1은 식 B-Lys-Arg-A의 프로인슐린과, 효모에서 인슐린 제조을 위한 상기 프로인슐린의 사용법을 기술하고 있다.Patent publication number EP 195691 B1, assigned to Novo Nordisk A / S, describes the proinsulin of the formula B-Lys-Arg-A and the use of said proinsulin for the production of insulin in yeast.

Chiron Corp.에 부여된 특허 공개번호 EP 196056 B1은 효모에 의해 생산되는 hSOD-프로인슐린 단백질을 기술하고 있다. 폴딩하기 전에 상기 hSOD-프로인슐린 단백질에 시아노겐 브로마이드 절단 및 술피톨리시스를 실행한다.Patent publication number EP 196056 B1 granted to Chiron Corp. describes hSOD-proinsulin proteins produced by yeast. The hSOD-proinsulin protein is subjected to cyanogen bromide cleavage and sulfitolissis prior to folding.

획스트(Hoechst)는 EPO 공개번호 379162에서 '인슐린 전구물질의 가짜 재조합체'(즉 부정확하거나 부분적으로 부정확한 분자간 디설파이드 다리(intermolecular disulfied bridges)를 가지는 재조합 인슐린 제품)는 유기 산화.환원계(organic redox system)의 존재에서 수성 배지에서 과량의 머캅탄과 가짜 재조합체를 반응시킴으로써 술피톨리시스 없이 '정확한' 인슐린 제품으로 변환될 수 있다는 것을 개시하고 있다. 아미노산 또는 펩티드 라디칼(peptide radical)이 융합 폴리펩티드로부터 (화학적으로 또는 효소적으로) 절단된 후 본래의 술피톨리시스 단계가 일어나고(상기 절단은 숙주 세포의 용해(lysis) 후에 발생한다), 그 다음 상기 인슐린 전구물질의 시스테인 6개는 S-술폰산염으로 변환된다. 이어서, 복원 단계(renaturing step)에서, 3개의 정확한 디설파이드 다리를 형성하여 상기 프로인슐린 S-술폰산염으로부터 자연 프로인슐린(natural proinsulin)을 생산한다. 상기 복원 단계에서 소위 '가짜 재조합체'라는 것이 생산된다.Hoechst, in EPO Publication No. 379162, states that 'false recombinants of insulin precursors' (i.e. recombinant insulin products with inaccurate or partially inaccurate intermolecular disulfied bridges) are organic. In the presence of a redox system, it is disclosed that by reacting an excess mercaptan with a fake recombinant in an aqueous medium, it can be converted into a 'correct' insulin product without sulfitolisis. After the amino acid or peptide radical is cleaved (chemically or enzymatically) from the fusion polypeptide, the original sulfitolisis step occurs (the cleavage occurs after lysis of the host cell), and then Six cysteines of the insulin precursor are converted to S-sulfonates. Then, in the renaturing step, three correct disulfide bridges are formed to produce natural proinsulin from the proinsulin S-sulfonate. In this restoration step a so-called 'fake recombinant' is produced.

획스트는 PCT 국제 공개번호 WO 91/03550에 원하는 단백질(예를 들어, 프로인슐린)과 "발라스트 성분"을 함유하는 융합 단백질을 제조하는 공정을 개시한다. 술피톨리시스는 폴딩하기 전에 실행되는 반면, "발라스트 성분"은 폴딩 후에 프로인슐린의 C-사슬과 함께 부수적으로(concomitantly) 절단된다.Chust discloses in PCT International Publication No. WO 91/03550 a process for preparing fusion proteins containing the desired protein (eg proinsulin) and the "ballast component". Sulfitolisis is performed before folding, while the "ballast component" is concomitantly cleaved with the C-chain of proinsulin after folding.

더욱이, 획스트는 EP 347781 B1에 "미니프로인슐린"(B-Arg-A) 및 모노-Arg 인슐린과 인슐린의 제조를 위한 미니프로인슐린의 사용법을 설명한다. 또한, 이들은 B-Arg-A 및 "발라스트 성분"을 포함하는 융합 단백질을 설명한다. 상기 "발라스트 성분"은 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide)에 의해 절단되고, 술피톨리시스는 폴리펩티드의 폴딩 전에 실행된다.Furthermore, the hulst describes the use of "miniproinsulin" (B-Arg-A) and mono-Arg insulin and miniproinsulin for the production of insulin in EP 347781 B1. In addition, they describe fusion proteins comprising B-Arg-A and the "ballast component". The "ballast component" is cleaved by cyanogen bromide and sulfitolissis is performed prior to folding of the polypeptide.

본 발명은 개선되고 효율적인 공정에 의해 재조합 인간 인슐린을 제조하는 공정을 개시한다. 리더 서열(leader sequence)을 포함하는 재조합 프로인슐린 혼성 폴리펩티드가이.콜라이에서 합성된다. 부분 정제를 한 후 상기 재조합 프로인슐린 혼성 폴리펩티드는 리더 펩티드를 부착한 상태로 정확한 폴딩을 허용하는 조건 하에서 폴딩된다. 그 다음 카르복시펩티다제 B와 트립신으로 연합처리하여 생물학적으로 활성인 인간 인슐린을 생산하며, 이와 동시에 이 효소들에 의해 리더 펩타이드와 C-사슬이 절단된다. 이렇게 생산되고 정제된 인간 인슐린은 자연적으로 발생하는 인간 인슐린과 동일하다.The present invention discloses a process for producing recombinant human insulin by an improved and efficient process. Recombinant proinsulin hybrid polypeptides comprising a leader sequence are synthesized in E. coli . After partial purification, the recombinant proinsulin hybrid polypeptide is folded under conditions that allow accurate folding with the leader peptide attached. It then associates with carboxypeptidase B and trypsin to produce biologically active human insulin, which simultaneously cleaves the leader peptide and the C-chain. Human insulin thus produced and purified is identical to naturally occurring human insulin.

본 발명에 따르면 프로인슐린 혼성 폴리펩티드 전부는 리더 펩티드와 비보호된 시스테인 잔기의 존재하에서도 자연 구조(native structure)로 효율적으로 폴딩할 수 있기 때문에 풍부한 SH기(SH group)를 보호하기 위해 사용된 술피톨리시스와 혼성 폴리펩티드의 CNBr 절단에 관련된 위험하고 까다로운 절차는 본 발명의 신규방법에서 제외된다. 활성 재조합 인간 인슐린은 효소 분해에 의해 방출되고 이어서 정제된다.According to the present invention, all of the proinsulin hybrid polypeptides can be efficiently folded into the native structure even in the presence of the leader peptide and unprotected cysteine residues, so sulfitol used to protect the rich SH group. Dangerous and tricky procedures involving CNBr cleavage of lysis and hybrid polypeptides are excluded from the novel method of the present invention. Active recombinant human insulin is released by enzymatic digestion and then purified.

[발명의 상세한 설명]Detailed description of the invention

도 3 내지 5에 나타난 3개의 플라스미드(plasmid)에 대한 제한효소 지도(restriction map)는 플라스미드 상에 있는 제한 부위 모두를 나타내지는 않는다. 그러나, 본 발명을 완전하게 이해하기 위해 필요한 제한 부위들은 나타나 있다.Restriction maps for the three plasmids shown in FIGS. 3 to 5 do not represent all of the restriction sites on the plasmid. However, the restriction sites necessary to fully understand the present invention are shown.

도 1은 플라스미드 pBAST-R의 발현(expression)에 의해 생산된 폴딩되고 디설파이드 결합된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 효소 분해함으로써 제조한 인간 인슐린을 나타낸다. 여기서는 SOD 리더 서열(leader sequence)의 일부만이 표시되어 있다.Figure 1 shows human insulin prepared by enzymatic digestion of folded and disulfide bound proinsulin hybrid polypeptides produced by expression of plasmid pBAST-R. Only part of the SOD leader sequence is shown here.

도 2는 플라스미드 pDBAST-LAT 또는 플라스미드 pλ BAST-LAT의 발현에 의해 생산되는 폴딩되고 디설파이드 결합된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 효소 분해함으로써 제조한 인간 인슐린을 나타낸다. 여기서는 SOD 리더 서열의 일부만이 표시되어 있다.2 shows human insulin prepared by enzymatic digestion of folded and disulfide bound proinsulin hybrid polypeptides produced by expression of plasmid pDBAST-LAT or plasmid pλ BAST-LAT. Only a portion of the SOD leader sequence is shown here.

도 3은 ATCC 수탁번호 69362로 ATCC에 기탁된 SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 발현 플라스미드인 플라스미드 pBAST-R의 구조를 나타낸다.3 shows the structure of plasmid pBAST-R, an expression plasmid encoding the SOD-proinsulin hybrid polypeptide deposited with ATCC under ATCC accession number 69362.

도 4는 ATCC 수탁번호 69361로 ATCC에 기탁된 SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 발현 플라스미드인 pDBAST-LAT의 구조를 나타낸다.4 shows the structure of pDBAST-LAT, an expression plasmid encoding the SOD-proinsulin hybrid polypeptide deposited with ATCC under ATCC accession number 69361.

도 5는 ATCC 수탁번호 69363로 ATCC에 기탁된 SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 발현 플라스미드인 pλ BAST-LAT의 구조를 나타낸다.Figure 5 shows the structure of pλ BAST-LAT, an expression plasmid encoding the SOD-proinsulin hybrid polypeptide deposited with ATCC under ATCC accession number 69363.

도 6은 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 아미노산과 해당하는 DNA 누클레오티드 서열을 나타낸다.Figure 6 shows the amino acid and corresponding DNA nucleotide sequences of the SOD-proinsulin hybrid polypeptide expressed by plasmid pBAST-R.

도 7은 플라스미드 pDBAST-LAT와 pλ BAST-LAT에 의해 발현된 SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 아미노산과 해당하는 누클레오티드 서열을 나타낸다.Figure 7 shows the amino acid and corresponding nucleotide sequences of SOD-proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmids pDBAST-LAT and pλ BAST-LAT.

도 8은 폴딩 혼합물(folding mixture)의 pH에 따라 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현되는 상기 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터 인간 인슐린 생산을 보여준다.Figure 8 shows human insulin production from the proinsulin hybrid polypeptide expressed by plasmid pBAST-R depending on the pH of the folding mixture.

(구체예 2에 기술한 바와 같이 생산되는) 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 폴딩을 100mM 글리신 버퍼에서, 4℃의 온도로, 약 16시간동안, 혼성 폴리펩티드 1mg/ml 또는 0.5mg/ml를 이용하여 지시한 바와 같이 다양한 pH에서 실행했다. 상기 폴딩된 물질을 트립핀(1:500w/w)(시그마)과 카르복시펩티다제 B(CPB, 시그마, 1:200w/w)로 30분 동안 37℃로 pH 9에서 처리하고, 표준으로¹²⁵I-인슐린(아메르삼(Amersham))과 인간 재조합 인슐린(칼비오켐(Calbiochem))을 사용하여 라디오이뮤노어세이(radioimmunoassay)에 의해 면역활성(IR) 인슐린을 분석했다.Folding of the proinsulin hybrid polypeptide (produced as described in Example 2) was indicated using 1 mg / ml or 0.5 mg / ml of the hybrid polypeptide in a 100 mM glycine buffer at a temperature of 4 ° C. for about 16 hours. Run at various pHs as described. The folded material was treated with trypin (1: 500 w / w) (sigma) and carboxypeptidase B (CPB, sigma, 1: 200 w / w) at pH 9 at 37 ° C. for 30 minutes, ^{125 as} standard. Immune activity (IR) insulin was analyzed by radioimmunoassay using I-insulin (Amersham) and human recombinant insulin (Calbiochem).

도 9는 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현되는 상기 프로인슐린 혼성 폴리 펩티드로부터 인간 인슐린 생산을 나타낸다.9 shows human insulin production from these proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pDBAST-LAT.

(실시예 2에서 기술한 바와 같이 생산되는) 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 8M 요소, 5mM HCl에서 약 30mg/ml의 농도로 용해하고, pH 11인 100mM 글리신-NaOH에서 1mg/ml로 희석했다. 22℃의 실온에서 20시간동안 폴딩했다. 이어서 상기 용액을 HCl에 의해 pH 8.8로 조절했다. 카르복시펩티다제 B(1:1000 w/w, 시그마)와 트립신(1:2000 w/w, 시그마)을 더하고, 반응 혼합물을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션했다. 소화 혼합물(digestion mixtures)을 희석하기 전에 10mM HCl에 의해 pH 3으로 산성화했다. 150μl 부분표본(aliquots)을 31.5%(v/v) 아세토니트릴을 함유하는 50mM 테트라에틸암모늄 인산염(tetraethylammonium phosphate), pH 3인 162mM NaClO₄로 평형화시킨 250× 4mm, 5μ 리크로스페르 100 RP-8 칼럼(머크)(5μ Lichrosphere 100 RP-8 colum (Merck)) 상에서 역상-고압 액체 크로마토그래피에 의해 분석했다. 상기 칼럼을 75분 동안 1ml/분의 유속(flow rate)에서 31.5-40.5% 아세토니트릴(acetonitrile)의 선상 그레디언트(linear gradient)로 전개했다. 220nm에서 흡광도를 모니터링했다.The proinsulin hybrid polypeptide (produced as described in Example 2) was dissolved in 8M urea, 5 mM HCl at a concentration of about 30 mg / ml and diluted to 1 mg / ml in 100 mM glycine-NaOH, pH 11. Folding for 20 hours at room temperature of 22 ℃. The solution was then adjusted to pH 8.8 with HCl. Carboxypeptidase B (1: 1000 w / w, Sigma) and trypsin (1: 2000 w / w, Sigma) were added and the reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Digestion mixtures were acidified to pH 3 with 10 mM HCl before dilution. 150 × aliquots were equilibrated with 50 mM tetraethylammonium phosphate containing 31.5% (v / v) acetonitrile, 250 × 4 mm, 5 μ Lycrosssper 100 RP-8, pH 3, 162 mM NaClO ₄ Analysis by reverse phase-high pressure liquid chromatography on a column (Merck) (5μ Lichrosphere 100 RP-8 colum (Merck)). The column was developed with a linear gradient of 31.5-40.5% acetonitrile at a flow rate of 1 ml / min for 75 minutes. Absorbance was monitored at 220 nm.

A: 5μg의 표준 인슐린 (Boehringer-Mannheim);A: 5 μg of standard insulin (Boehringer-Mannheim);

B: 효소처리 후에 생산되는 재조합 인간 인슐린;B: recombinant human insulin produced after enzymatic treatment;

C: 폴딩된 SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드.C: folded SOD-proinsulin hybrid polypeptide.

도 10은 폴딩 혼합물에서 pH에 따라 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현되는 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터의 인간 인슐린 생산을 나타낸다.Figure 10 shows human insulin production from proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pDBAST-LAT with pH in the folding mixture.

(실시예 2에 기술한 바와 같이 생산되는) 상기 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 지시된 pH 값을 가지는 100mM 글리신-NaOH 완충액에서 1mg/ml로 희석하고 22℃에서 16시간동안 폴딩했다. 효소처리와 RP-HPLC 분석을 도 9에 도시한 바와 같이 실행했다. 상기 혼성 폴리펩티드로부터 생산되는 재조합 인간 인슐린의 양은 표준 인슐린과 동일한 체류시간을 가지는 피크 영역에 따라 계산되었다.The proinsulin hybrid polypeptide (produced as described in Example 2) was diluted to 1 mg / ml in 100 mM glycine-NaOH buffer with the indicated pH value and folded at 22 ° C. for 16 hours. Enzyme treatment and RP-HPLC analysis were performed as shown in FIG. The amount of recombinant human insulin produced from the hybrid polypeptide was calculated according to the peak region with the same residence time as the standard insulin.

도 11은 상기 폴딩 혼합물에서 아스코르브산(ascorbic acid)의 농도에 따라 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현되는 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터의 인간 인슐린 생산을 나타낸다.FIG. 11 shows human insulin production from proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pDBAST-LAT depending on the concentration of ascorbic acid in the folding mixture.

(실시예 2에 기술한 바와 같이 생산되는) SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 폴딩을, 22℃의 온도로 지시된 농도의 아스코르브산의 존재에서 pH 11.2인 100mM 글리신-NaOH에서 1mg/ml로 실행했다. 시료를 5시간과 25시간동안의 폴딩이 끝난 후(도 9에 도시한 바와 같이) 트립신과 카르복시펩티다제 B로 처리했다. 재조합 인간 인슐린의 생산을 (도 9에 도시한 바와 같이) RP-HPLC상에서 분석했다.Folding of the SOD-proinsulin hybrid polypeptide (produced as described in Example 2) was performed at 1 mg / ml in 100 mM glycine-NaOH, pH 11.2, in the presence of ascorbic acid at the concentration indicated at a temperature of 22 ° C. . Samples were treated with trypsin and carboxypeptidase B after 5 and 25 hours of folding (as shown in FIG. 9). Production of recombinant human insulin was analyzed on RP-HPLC (as shown in FIG. 9).

도 12는 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현되는 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터 생산되는 인간 인슐린의 신뢰성을 나타낸다.Figure 12 shows the reliability of human insulin produced from proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pDBAST-LAT.

(실시예 2에 기술한 바와 같이 생산되는) SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드의폴딩을 22℃에서 16시간동안 pH 11.2인 100mM 글리신-NaOH 및 1.2mM 아스코르브산에서 1mg/ml로 실행했다. (도 9에 도시한 바와 같이) 다음 효소 처리를 한 후에 혼합물은 pH 8인 20mM Tris-HCl에서 평형화된 DEAE-세파로스 칼럼(DEAE-Shepharose column) 상에서 크로마토그래피되었다. 재조합 인간 인슐린을 pH 8인 20mM Tris-HCl에서 0 내지 0.4M NaCl의 선상 그래디언트로 용출했다. 피크 분획(peak fraction)을 모아서 HCl에 의해 pH 3로 산성화했다. 또한, 상기 재조합 인간 인슐린을 도 9에 도시한 바와 같이 RP-HPLC에 의해 인슐린 유사 분자로부터 정제했다. 주요 피크를 모아, 0.25M 아세트산에서 세파덱스(Sephadex) G-25 칼럼 상에서 탈염했으며 동결건조했다. 시료(5μg의 재조합 인간 인슐린)는 10mM HCl에서 제조됐고 동일한 조건 하에서 RP-HPLC에 의해 분석되었다.Folding of the SOD-proinsulin hybrid polypeptide (produced as described in Example 2) was performed at 1 mg / ml in 100 mM glycine-NaOH and 1.2 mM ascorbic acid at pH 11.2 for 16 hours at 22 ° C. After the following enzymatic treatment (as shown in FIG. 9), the mixture was chromatographed on a DEAE-Shepharose column equilibrated in 20 mM Tris-HCl at pH 8. Recombinant human insulin was eluted with a linear gradient of 0-0.4 M NaCl in 20 mM Tris-HCl at pH 8. Peak fractions were combined and acidified to pH 3 with HCl. The recombinant human insulin was also purified from insulin like molecules by RP-HPLC as shown in FIG. 9. Main peaks were collected, desalted and lyophilized on Sephadex G-25 column in 0.25M acetic acid. Samples (5 μg of recombinant human insulin) were prepared in 10 mM HCl and analyzed by RP-HPLC under the same conditions.

A: 표준 인슐린(standard insulin);A: standard insulin;

B: HPLC 정제된 재조합 인간 인슐린;B: HPLC purified recombinant human insulin;

C: HPLC 정제된 재조합 인간 인슐린과 표준 인슐린을 조합한 시료.C: Sample combining HPLC purified recombinant human insulin and standard insulin.

도 13은 상기 폴딩 혼합물에서 단백질 농도에 따라서 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현되는 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터의 인간 인슐린 생산을 나타내다.FIG. 13 shows human insulin production from proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pDBAST-LAT depending on protein concentration in the folding mixture.

(실시예 2에 기술한 바와 같이 생산되는) SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 지시한 바와 같이 pH 11.2인 100mM 글리신-NaOH으로 0.5mg/ml 내지 10mg/ml의 최종 단백질 농도가 되도록 폴딩하였다. 각각의 폴딩 혼합물에 SH기 1몰 당 2.5몰의 아스코르브산이 보충되었다. 폴딩은 24℃의 실온에서 16시간동안 실행됐다. 효소처리와 RP-HPLC 분석은 도 9에 도시한 바와 같이 실행되었다.SOD-proinsulin hybrid polypeptides (produced as described in Example 2) were folded with 100 mM glycine-NaOH at pH 11.2 to a final protein concentration of 0.5 mg / ml to 10 mg / ml as indicated. Each folding mixture was supplemented with 2.5 moles of ascorbic acid per mole of SH group. Folding was performed for 16 hours at room temperature of 24 ° C. Enzyme treatment and RP-HPLC analysis were performed as shown in FIG.

도 14는 폴딩 시간에 따라서 세포내 조침전물(crude intracellular precipitate)로부터 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현되는 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터의 인간 인슐린 생산을 나타낸다.14 shows human insulin production from proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pDBAST-LAT from crude intracellular precipitate, depending on folding time.

세포내 침전물을 20mM 글리신-NaOH, pH 11.2인 33μM EDTA에서 1ml 당 약 2.6A₂₈₀의 농도에서 용해했다. 상기 pH는 10N 수산화나트륨(sodium hydroxide)에 의해 12로 조절됐다. 상기 용액은 10분 동안 교반시켰다. 상기 pH는 농축된 염산(hydrochloric acid)에 의해 11.2로 적정됐다. (시그마, 산세척된)활성탄(activated charcoal)을 0.1% w/v 최종농도에 더하고, 상기 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 현탁액은 20℃에서 (20분, 12000rpm) 원심분리되었다.Intracellular precipitate was dissolved in 20 mM glycine-NaOH, pH 11.2 at 33 μM EDTA at a concentration of about 2.6 A ₂₈₀ per ml. The pH was adjusted to 12 by 10N sodium hydroxide. The solution was stirred for 10 minutes. The pH was titrated to 11.2 with concentrated hydrochloric acid. Activated charcoal (sigma, pickled) was added to a final concentration of 0.1% w / v and the mixture was stirred for 30 minutes. The suspension was centrifuged at 20 ° C. (20 min, 12000 rpm).

상기 분리된 상청액은 약 2.15의 A₂₈₀을 갖게되었다. 아스코르브산은 3mM의 최종 농도로 보충됐다. 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 폴딩을 실온(22 내지 23℃)에서 강하게 저음(stirring)으로 실행했다. 실험에 따른 다양한 시점에서 (용해에서 시작하여) 10ml의 부분표본을 뽑아내고, pH 8.8로 적정하며, 50μM ZnCl₂존재하에 37℃에서 1시간동안 카르복시펩티다제 B(1:1000 w/w)와 트립신(1:2000 w/w)로 소화했다. 소화는 산성화에 의해 종결됐다. 소화된 시료 각각에 들어 있는 인슐린 함량은 도 9에 도시한 바와 같이 RP-HPLC 분석에 의해 판정됐다. 폴딩 반응의 진행은 (소화가 종결된 후)인슐린의 증가, 자유티올기(free thiol group)의 레벨 강도의 감소에 의해 분명해지고 자유티올기의 레벨 강도는 엘만 반응(Ellmanreaction)(16)에 의해 분석된다.The separated supernatant had an A ₂₈₀ of about 2.15. Ascorbic acid was supplemented to a final concentration of 3 mM. Folding of the proinsulin hybrid polypeptide was performed at room temperature (22-23 ° C.) with strong stirring. At various time points in the experiment, 10 ml aliquots (starting from dissolution) were extracted, titrated to pH 8.8, and carboxypeptidase B (1: 1000 w / w) for 1 hour at 37 ° C. in the presence of 50 μM ZnCl ₂ . And trypsin (1: 2000 w / w). Digestion was terminated by acidification. Insulin content in each digested sample was determined by RP-HPLC analysis as shown in FIG. 9. The progress of the folding reaction is evident by the increase in insulin (after the digestion is terminated) and the decrease in the level strength of the free thiol group, and the level strength of the free thiol group is determined by the Elman reaction (16). Is analyzed.

--발명의 요약----Summary of invention--

본 발명은 정확한 디설파이드 결합 형성을 허용하는 조건 하에서 프로인슐린을 포함하는 혼성 폴리펩티드를 폴딩하는 단계, 상기 폴딩된 디설파이드 결합한 혼성 폴리펩티드를 효소 분해하여 활성 인간 인슐린을 생산하는 단계, 그리고 상기 활성 인간 인슐린을 정제하는 단계를 포함하는 인간 인슐린 생산방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing an active human insulin, the method comprising: folding a hybrid polypeptide comprising proinsulin under conditions that allow for accurate disulfide bond formation, enzymatically digesting the folded disulfide bound hybrid polypeptide, and purifying the active human insulin It provides a method for producing human insulin comprising the step of.

본 발명은 또한 프로인슐린과, 프로인슐린의 N-말단에 부착된 리더 펩티드를 포함하며 폴딩되고 정확한 디설파이드 결합을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.The invention also provides a polypeptide comprising a proinsulin and a leader peptide attached to the N-terminus of the proinsulin and containing folded and accurate disulfide bonds.

이.콜라이에서 플라스미드 pBAST-R, pDBAST-LAT, 및 pλ BAST-LAT는 각각 1993, 7.26일짜 ATCC 수탁번호 69362, 69361, 및 69363으로 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852에 위치한 ATCC(American Ttype Culture Collection)에 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인(International Recognition of the Deposit of Microorganisms)에 관한 부다페스트 조약의 요구사항에 따라서, 부다페스트 조약의 요청에 부합하도록 기탁됐다. The plasmids pBAST-R, pDBAST-LAT, and pλ BAST-LAT in E. coli were ATCC (American Ttype Culture Collection) located at 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 at ATCC Accession Nos. 69362, 69361, and 69363, dated 1993, 7.26, respectively. In accordance with the requirements of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms under the Patent Procedures, it was deposited in conformity with the request of the Budapest Treaty.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 혼성 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드에 공유결합적으로 붙은 리더 펩티드를 포함한다, 본 발명의 혼성 폴리펩티드는 프로인슐린을 포함하고, 바람직하게는 리더 펩티드로서 SOD를 포함한다.As used herein, a hybrid polypeptide includes a leader peptide that is covalently attached to a desired polypeptide. The hybrid polypeptide of the present invention comprises a proinsulin and preferably comprises SOD as the leader peptide.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 폴딩은 SH기를 보호하기 위한 폴딩 전의 술피톨리시스가 없고 폴딩 전에 CNBr 절단 없이 프로인슐린을 포함하는 혼성 폴리펩티드의 폴딩을 포함한다. 여기서 상기 폴딩은 혼성 폴리펩티드에서 정확한 디설파이드 결합 형성을 허용한다.As used herein, folding includes the folding of a hybrid polypeptide that includes proinsulin without sulpitolisis before folding to protect the SH group and without CNBr cleavage before folding. Wherein said folding allows for accurate disulfide bond formation in the hybrid polypeptide.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 혼성 폴리펩티드의 정확한 디설파이드 결합 형성은 인슐린의 Cys^B7-Cys^A7, Cys^B19-Cys^A20, 및 Cys^A6-Cys^A11사이의 3개의 디설파이드 결합의 형성을 포함한다 (Cys 잔기는 성숙한 인슐린에서의 계수(numbering)에 따라 계수된다).As used herein, accurate disulfide bond formation of a hybrid polypeptide includes the formation of three disulfide bonds between Cys ^B7 -Cys ^A7 , Cys ^B19 -Cys ^A20 , and Cys ^A6 -Cys ^A11 of insulin (Cys residues). Is counted according to the numbering in mature insulin).

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 프로인슐린은 N-말단에서 C-말단 순으로 인슐린의 B, C 및, A 사슬을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.As used herein, proinsulin includes polypeptides comprising the B, C, and A chains of insulin from N-terminus to C-terminus.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 인슐린의 C-사슬 펩티드는 트립신과 카르복시펩티다제 B에 의해 절단될 수 있는 자연발생적 C-펩티드 및 여하한 다른 올리고펩티드(oligopeptide), 디펩티드(dipeptide) 또는 단일 아미노산을 포함한다.As used herein, C-chain peptides of insulin are naturally occurring C-peptides and any other oligopeptides, dipeptides or singles that can be cleaved by trypsin and carboxypeptidase B. Contains amino acids.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 리더 펩티드는 폴딩과 디설파이드 결합 형성을 허용하고 트립신에 의해 절단될 수 있는 인슐린의 B 사슬에 공유결합적으로 붙은 여하한 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함한다. 상기 리더 펩티드는 SOD인 것이 바람직한다.As used herein, a leader peptide includes any polypeptide or peptide that is covalently attached to the B chain of insulin that allows folding and disulfide bond formation and can be cleaved by trypsin. The leader peptide is preferably SOD.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, SOD는 CuZnSOD 또는 MnSOD의 아미노산 서열의 여하한 실질적인 부분을 포함하나, 상기 부분은 SOD의 생물학적 활성을 필수적으로 가지는 것은 아니며, 자연발생되는 SOD의 아미노산 서열의 비유되는 부분과 동일한 아미노산 서열을 필수적으로 가지지도 않는다. 상기 SOD를 암호화하는 DNA는 당업자들에게 알려진 방법, 예를 들어 Bauer외 다수(1985)의 Gene37: 73-81에 의해 돌연변이화될 수도 있다.As used herein, an SOD includes any substantial portion of the amino acid sequence of CuZnSOD or MnSOD, but the portion does not necessarily have the biological activity of the SOD and is a likened portion of the amino acid sequence of a naturally occurring SOD. It does not necessarily have the same amino acid sequence as. The DNA encoding the SOD may be mutated by methods known to those skilled in the art, for example, by Gene 37 : 73-81 of Bauer et al. (1985).

상기 리더 펩티드는 SOD 대신 여하한 다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이거나 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열의 여하한 실질적인 부분을 포함할 수도 있다. 여기서 상기 부분은 상기 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 생물학적 활성을 반드시 가질 필요는 없고, 또한 자연발생적 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 동일한 아미노산 서열을 반드시 가질 필요도 없다. 그러나 상기 리더 펩티드는 상기 혼성 폴리펩티드의 정확한 디설파이드 결합 형성과 폴딩을 허용해야만 한다.The leader peptide may be any other peptide, polypeptide or protein in place of SOD or may comprise any substantial portion of the amino acid sequence of the peptide, polypeptide or protein. Wherein the moiety does not necessarily have the biological activity of the peptide, polypeptide, or protein, nor does it necessarily have the same amino acid sequence as compared to the amino acid sequence of a naturally occurring peptide, polypeptide or protein. However, the leader peptide must allow for accurate disulfide bond formation and folding of the hybrid polypeptide.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 인슐린은 자연발생적인 인슐린의 동족체(homolog)를 포함할 수도 있다.As used herein, insulin may comprise homologs of naturally occurring insulin.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 프로인슐린은 자연 발생적인 프로인슐린의 동족체를 포함할 수 있다.Proinsulin, as used herein, may include homologs of naturally occurring proinsulin.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 생산되는 인슐린 폴리펩티드에 관련된 상기 "동족체"라는 용어는 실질적으로 인슐린과 동일한 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드이다. 따라서 동족체는 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기를 부가하거나 결실시키거나 치환함으로 본 발명의 방법에 의해 생산되는 인슐린 폴리펩티드와는 다를 수도 있지만, 얻어지는 폴리펩티드는 인슐린의 생물학적 활성을 유지한다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람들은 예를 들어 상기 폴리펩티드의 폴리펩티드 동족체의 세균발현을 코딩하는 DNA 서열의 제조와 디자인, 부위-특이적 돌연변이 유발 기술(site-directed mutagenesis techniques)에 의한 게놈 서열(genomic sequences)과 cDNA의 변형, 재조합 단백질과 발현 벡터의 구성, 폴리펩티드의 세균 발현에 사용되는 종래의 방법, 및 종래 생화학적 분석을 사용는 폴리펩티드의 생화학적 활성의 측량을 포함하는 기존의 주지 방법을 사용함으로, 어떤 아미노산 잔기가 부가될지, 결실될지, 또는 치환될지 (또는 어떤 아미노산으로 치환될지)를 쉽게 판단할 수 있다.As used herein, the term "homolog" relating to an insulin polypeptide produced by the method of the present invention is a polypeptide having a biological activity substantially the same amino acid sequence as insulin. Thus, while homologues may differ from insulin polypeptides produced by the methods of the present invention by adding, deleting or replacing one or more non-essential amino acid residues, the polypeptide obtained retains the biological activity of insulin. One of ordinary skill in the art, for example, the preparation and design of DNA sequences encoding bacterial expression of polypeptide homologs of such polypeptides, genomic sequences by site-directed mutagenesis techniques modifications of genomic sequences and cDNAs, the construction of recombinant proteins and expression vectors, conventional methods used for bacterial expression of polypeptides, and the use of conventional biochemical assays are known methods that include the measurement of the biochemical activity of polypeptides. By using it, one can easily determine which amino acid residue is to be added, deleted, or substituted (or which amino acid is substituted).

인슐린의 동족체의 상기 정의는 프로인슐린의 동족체에도 동일하게 적용된다.The above definition of homologues of insulin equally applies to homologs of proinsulin.

본 발명의 방법에 의해 생산되는 인슐린의 동족체의 예로, 자연발생적 인슐린의 모든 잔기보다 작게 함유하는 결실 동족체(deletion homolog)와, 상기 하나 이상의 특이적 잔기가 다른 잔기에 의해 대체되는 치환 동족체(substitution homolog)와, 하나 이상의 아미노산 잔기가 인슐린 폴리펩티드의 말단 또는 중간 부위에 더해지는 부가 동족체(addition homolog)가 있다. 이들은 모두 인슐린의 생물학적 활성동을 보유한다.Examples of homologues of insulin produced by the methods of the present invention include deletion homologs containing less than all residues of naturally occurring insulin and substitution homologs in which the one or more specific residues are replaced by other residues. ) And addition homologs in which one or more amino acid residues are added to the terminal or intermediate portion of the insulin polypeptide. They all possess the biologically active activity of insulin.

동족체의 예로는 EPO 특허 출원 EP 384472에 개시된 인슐린 아날로그와 "Eli Lilly and Company Report to Shareholders 1992"에 개시된 바와 같이 Eli Lilly의 인슐린 아날로그 "휴말로그(Humalog)"가 있다.Examples of homologues are the insulin analogue disclosed in EPO patent application EP 384472 and Eli Lilly's insulin analogue "Humalog" as disclosed in "Eli Lilly and Company Report to Shareholders 1992".

본 명세서에서 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 아미노산 서열에서 아미노산의 치환 및/또는 결실 및/또는 부가를 포함하는 것으로 정의되며, 예를 들어문헌(Albert L. Lehninger, Biochemistry, second edition, Worth Pulishers Inc. (1975), Chapter 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England(1989), 및 Margaret O. Dayhoff, Atlas of protein Sequence and Structure, Volumn 5, The National Biomedical Research Foundation(1972), Chapter 9)에 의해 설명한 바와 같이 동족 또는 등가군(homologus and equivalence groups)에 따라 10개(10)까지의 잔기를 포함할 수도 있다. 상기 치환은 당업자들에게 익히 공지되어있다.Substantially identical amino acid sequences herein are defined to include substitutions and / or deletions and / or additions of amino acids in the amino acid sequence, see for example Albert L. Lehninger, Biochemistry, second edition, Worth Pulishers Inc. 1975), Chapter 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (1989), and Margaret O. Dayhoff, Atlas of protein Sequence and Structure, Volumn 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), Chapter 9) may contain up to 10 (10) residues, depending on homologous and equivalence groups. Such substitutions are well known to those skilled in the art.

인슐린 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 예를 들어 문헌(Bauer외 다수(1985), Gene37: 73-81)에 기재된 바와 같이 당업자들에게 알려진 방법에 의해 돌연변이화 될 수도 있다. 돌연변이가 일어난 서열은 본 명세서에서 설명한 바와 같이 적합한 발현 벡터로 삽입될 수도 있다. 상기 발현 벡터들은 세포에 도입되며, 이어서 세포들이 처리되므로, 상기 돌연변이가 일어난 DNA는 폴리펩티드 동족체의 발현을 지시하게된다.DNA encoding an insulin polypeptide may be mutated by methods known to those of skill in the art, for example, as described in Bauer et al. (1985), Gene 37 : 73-81. The mutated sequence may be inserted into a suitable expression vector as described herein. The expression vectors are introduced into the cell and then the cells are processed so that the mutated DNA will direct expression of the polypeptide homologue.

본 발명의 플라스미드는 프로인슐린을 포함한 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하며, CHO, 치킨 엠브리오(chicken embryo), 피브로블라스트(fibroblast), 또는 알려진 다른 세포주(cell line)와 같은 포유류 세포, 균류, 효모, 또는 세균에서의 발현을 위해 변형될 수도 있다. 여기서 상기 플라스미드는 추가로 세균, 효모, 균류, 또는 포유류 세포에서 클로닝된 유전자의 발현에 필요한 조절요소(regulatory element)를 추가로 포함하며, 이 조절요소는 상기 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 대해 핵산의 발현을 허용하도록 위치된다. 발현에 요구되는 조절 요소는 RNA 폴리머라제(polymerase)를 결합하기 위한 프로모터 서열(promotor sequence)과 리보솜 결합을 위한 리보솜 결합 부위를 포함한다.Plasmids of the invention comprise sequences encoding hybrid polypeptides, including proinsulin, and include mammalian cells, fungi, such as CHO, chicken embryos, fibroblasts, or other known cell lines. It may also be modified for expression in yeast, or bacteria. Wherein the plasmid further comprises a regulatory element necessary for the expression of the cloned gene in a bacterial, yeast, fungus, or mammalian cell, wherein the regulatory element is directed to the nucleic acid encoding the hybrid polypeptide. It is positioned to allow expression. Regulatory elements required for expression include a promoter sequence for binding RNA polymerase and a ribosomal binding site for ribosomal binding.

본 발명의 플라스미드는 프로인슐린을 포함하는 혼성 폴리펩티드를 발현한다.Plasmids of the invention express hybrid polypeptides comprising proinsulin.

당업자들은 본 명세서와 관련하여 기탁된 플라스미드가 동종 폴리펩티드(homologous polypeptides)의 발현을 암호화하기 위한 (링커들(linkers)의 삽입 또는 부위-특위적 돌연변이 유발에 의한) 기존의 기술에 의해 쉽게 변경될 수도 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 기술들은 예를 들어 Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 설명되어 있다.Those skilled in the art may readily modify the plasmids deposited in connection with the present specification by existing techniques (by insertion of linkers or site-specific mutagenesis) to encode the expression of homologous polypeptides. I will understand. Such techniques are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F. And Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

적합한 조절 요소는 프로인슐린을 포함하는 상기 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 대해 프라스미드 안에 위치되어 적합한 숙주 세포(host cell)에서 혼성 폴리펩티드를 발현시키도록 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 조절 요소는 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 가깝게 그리고 상향에 위치한다.Suitable regulatory elements are located within the plasmid with respect to the DNA encoding the hybrid polypeptide, including proinsulin, to allow expression of the hybrid polypeptide in a suitable host cell. In a preferred embodiment of the invention, said regulatory element is located close to and upward from the DNA encoding the hybrid polypeptide.

프로인슐린을 포함하는 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 DNA로부터 전사된 mRNA가 숙주 세포안의 리보솜에 결합할 수 있도록 하는deoRBS와 같은 다양한 리보솜 결합 부위(RBSs: ribosomal binding sites)도 또한 본 발명에 포함된다.Also included in the present invention are various ribosomal binding sites (RBSs), such as deo RBS, that allow mRNA transcribed from DNA encoding a hybrid polypeptide comprising proinsulin to bind to ribosomes in host cells.

또한, 본 발명의 플라스미드는 ATG 개시 코돈(ATG initiation codon)을 포함한다. 프로인슐린을 포함하는 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 상기 ATG 개시코돈과 같은 위상에 있다.In addition, the plasmids of the invention comprise ATG initiation codons. DNA encoding a hybrid polypeptide comprising a proinsulin is in phase with the ATG start codon.

본 발명의 플라스미드는 숙주 세포에서 자율적 증식(autonomous replication)을 할 수 있는 세균 플라스미드로부터 유래한 복제기점(origin of replication)을 포함하는 DNA 서열을 포함한다. 적합한 복제기점은 플라스미드 pBR322(ATCC 수탁번호 37017)와 같은 수많은 소오스로부터 얻을 수도 있다.Plasmids of the invention comprise DNA sequences comprising an origin of replication derived from bacterial plasmids capable of autonomous replication in host cells. Suitable origins of replication can also be obtained from numerous sources such as plasmid pBR322 (ATCC Accession No. 37017).

또한, 본 발명의 플라스미드는 예를 들어 암피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 또는 테트라시클린(tetracycline)에 대한 내성인 약물내성 유전자와 같은, 플라스미드가 숙주 세포에 있을 때 나타나는 선택가능하거나 식별 가능한 표현형질(phenotypic trait)과 관련된 유전자를 포함하는 DNA 서열을 포함한다.In addition, the plasmids of the present invention are selectable or identifiable when the plasmid is present in a host cell, such as, for example, drug-resistant genes that are resistant to ampicillin, chloramphenicol, or tetracycline. DNA sequences containing genes associated with phenotypic traits.

(프로인슐린을 포함하는)혼성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 발현하기 위해 사용될 수도 있는 벡터의 예는 예를들면, (파지 람브다(phage lambda)와 같은) 박테리오파지(bacteriephages), 코스미드(cosmides), 플라스미드, 그리고 다른 벡터들인 세균 바이러스(bacterial virus)와 같은 바이러스들이 있다. 프로인슐린을 포함하는 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 방법을 통해 적합한 벡터에 삽입된다. 예를 들어, 종래의 제한 엔도누크레아제 효소 부위(endonuclease enzyme sites)를 사용하여, 삽입물(inserts)과 벡터 DNA는 서로 염기쌍을 이루고 이어서 DNA 리가제(ligase)로 함께 연결되는 상보적 말단을 만들어내기 위해 절단될 수 있다. 다른 대안으로는, 벡터 DNA에서 제한 부위에 상보적인 염기 서열(base sequences)을 가지는 합성 링커들(synthetic linkers)이 삽입 DNA에 연결될 수 있고, 이어서 삽입 DNA는 그 부위에서 절단하는 제한 요소에 의해 소화된다. 또한, 다른 방법들도 사용될 수 있다.Examples of vectors that may be used to express nucleic acids encoding hybrid polypeptides (including proinsulin) include, for example, bacteriophages (such as phage lambda), cosmides, There are viruses such as plasmids and other vectors, the bacterial virus. Genes encoding hybrid polypeptides, including proinsulin, are inserted into suitable vectors by methods well known in the art. For example, using conventional restriction endonuclease enzyme sites, the inserts and the vector DNA make complementary ends that base pair with each other and are then linked together by DNA ligase. Can be cut to make. Alternatively, synthetic linkers having base sequences complementary to restriction sites in the vector DNA can be linked to the insert DNA, which is then digested by restriction elements that cut at that site. do. In addition, other methods may be used.

바람직한 세균 숙주 세포는이.콜라이세포들이다. 적합한이.콜라이의 세포의 예는 스트레인(strain) Sφ 733(cytRstrA) 또는 4300이지만 다른이.콜라이스트레인과 다른 세균도 플라스미드를 위한 숙주로서 사용될 수 있다.Preferred bacterial host cells are E. coli cells. Examples of suitable E. coli cells are strain Sφ 733 (cytRstrA) or 4300, but other E. coli strains and other bacteria can also be used as hosts for the plasmids.

숙주로 사용되는 상기 세균은 (A1645와 같은)옥소트로픽(auxotrophic), (A4255와 같은)프로토트로픽(prototrophic), 및 리틱(lytic) 스트레인; F⁺및 F^-스트레인: (A1645와 A4255와 같은) λ 프로파지(prophage)의 cI857 리프레서 서열(repressor sequence)을 가지는 스트레인과데오리프레서(deorepressor) 및/또는데오유전자(deogene)가 없는 스트레인을 포함하는 여하한 스트레인일 수도 있다(1989년 2월 22일에 공개된 유럽 특허 출원 공개 번호 0303972를 참조)이.콜라이스트레인 Sφ 733과이.콜라이스트레인 4300은 각각 ATCC 수탁 번호 69361과 69363으로 수탁되어있다.The bacterium used as a host can include auxotropic (such as A1645), prototrophic (such as A4255), and lytic strains; F ⁺ and F ^- strains (such as A1645 and A4255) λ Pro grip (prophage) the cI857 repressor sequence (repressor sequence) to have a strain and Deo repressor (deo repressor) and / or the Deo gene (deo gene) It may be any strain that includes a strain that is absent (see European Patent Application Publication No. 0303972, published February 22, 1989) . E. coli strain Sφ 733 and E. coli strain 4300 are ATCC accession numbers 69361 and 69363, respectively . Has been entrusted.

상기한 모든이.콜라이숙주 스트레인에서 예를 들어Bacteriol. Review 33,210(1969)에서 R.P. Novick에 의해 설명된 에티디움 브로마이드 방법(ethidium bromide method)과 같은 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법에 의해 상기 스트레인이 가지는 플라스미드를 제거할 수 있다.For all of the above E. coli host strains, for example Bacteriol. Review 33, 210 (1969) can remove the plasmid of the strain by methods well known in the art, such as the ethidium bromide method described by RP Novick.

본 발명은 정확한 디설파이드 결합 형성을 허락하는 조건 하에서 프로인슐을 포함하는 혼성 폴리펩티드를 폴딩하는 단계, 인슐린을 생산하기 위해 폴딩된 디설파이프 결합한 혼성 폴리펩티드를 효소분해하는 단계, 그리고 상기 인슐린을 정제하는 단계를 포함하는 인슐린 생산방법을 제공한다. 상기 인슐린은 상업적으로 이용가능한 인간 인슐린의 활성과 특성을 가진다.The present invention relates to the steps of folding a hybrid polypeptide comprising a proinsulin under conditions that allow for accurate disulfide bond formation, enzymatically digesting the folded disulfide bound hybrid polypeptide to produce insulin, and purifying the insulin. It provides a method for producing insulin comprising a. The insulin has the activity and properties of commercially available human insulin.

바람직한 구체예에서, 폴딩하는 단계는 약 4 내지 37℃의 온도로 약 1 내지 30시간동안 악 8.5 내지 12.0의 pH로 상기 혼성 폴리펩티드를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.In a preferred embodiment, the folding step comprises incubating the hybrid polypeptide to a pH of evil 8.5 to 12.0 for about 1 to 30 hours at a temperature of about 4 to 37 ° C.

다른 바람직한 구체예에서, 폴딩하는 단계는 아스코르브산의 존재 하에 약 4 내지 37℃의 온도로 약 1 내지 30시간동안 약 8.5 내지 12.0의 pH로 상기 혼성 폴리펩티드를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.In another preferred embodiment, folding comprises incubating the hybrid polypeptide to a pH of about 8.5 to 12.0 for about 1 to 30 hours at a temperature of about 4 to 37 ° C. in the presence of ascorbic acid.

특히 바람직한 구체예에서, 폴딩하는 동안 pH는 11.0 내지 11.25이다.In a particularly preferred embodiment, the pH is 11.0 to 11.25 during folding.

다른 바람직한 구체예에서, 아스코르브산의 농도는 폴딩 혼합물에 존재하는 SH기 1몰 당 약 2몰이다.In another preferred embodiment, the concentration of ascorbic acid is about 2 moles per mole of SH groups present in the folding mixture.

또다른 구체예에서, 상기 인큐베이션하는 시간은 약 5시간이다.In another embodiment, the time of incubation is about 5 hours.

다른 구체예에서, 상기 효소분해하는 단계는 pH를 약 8.8 내지 9.0으로 조절하는 단계와, 상기 혼성 폴리펩티드를 트립신파 카핀복시펩티다제 B로 약 16 내지 37℃의 온도로 약 30분에서 16시간동안 분해하는 단계를 포함한다.In another embodiment, the enzymatic step comprises adjusting the pH to about 8.8 to 9.0, and combining the hybrid polypeptide with trypsinic cappinepeptidase B at a temperature of about 16 to 37 ° C. for about 30 minutes to 16 hours. During the decomposition.

다른 구체예에서, 상기 정제하는 단계는 DEAE-세파로스 크로마토그래피와 RP-HPLC를 포함한다.In another embodiment, the purifying comprises DEAE-Sepharose chromatography and RP-HPLC.

역시 다른 구체예에서, 상기 정제하는 단계는 한외여과와 CM-세파로스 크로마토그래피를 더 포함한다.In yet another embodiment, the purifying further comprises ultrafiltration and CM-Sepharose chromatography.

특히 바람직한 구체예에서, 상기 정제하는 단계는 DEAE-세파로스 크로마토그래피와 페닐-세파로스 크로마토그래피(phenyl-Sepharose chromatography)를 더 포함한다.In a particularly preferred embodiment, the purifying step further comprises DEAE-Sepharose chromatography and phenyl-Sepharose chromatography.

특히 다른 바람직한 구체예에서, 상기 혼성 폴리펩티드는 ATCC 수탁번호 69361로 기탁된 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현된다.In another particularly preferred embodiment said hybrid polypeptide is expressed by plasmid pDBAST-LAT deposited with ATCC Accession No. 69361.

다른 바람직한 구체예에서, 혼성 폴리펩티드는 ATCC 수탁번호 69363로 기탁된 플가스미드 pλ BAST-LAT에 의해 발현된다.In another preferred embodiment, the hybrid polypeptide is expressed by the flugasmide pλ BAST-LAT deposited under ATCC Accession No. 69363.

다른 구체예에서, 상기 혼성 폴리펩티드는 ATCC 수탁 번호 69362로 기탁된 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된다.In another embodiment, the hybrid polypeptide is expressed by plasmid pBAST-R deposited with ATCC Accession No. 69362.

바람직한 구체예에서, 상기 혼성 폴리펩티드는 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 함유하는 세균 세포를 상기 DNA가 혼성 폴리펩티드의 발현을 지시하도록 처리하고, 상기 세포로부터 혼성 폴리펩티드를 회수함으로써 얻어진다.In a preferred embodiment, the hybrid polypeptide is obtained by treating a bacterial cell containing DNA encoding the hybrid polypeptide such that the DNA directs expression of the hybrid polypeptide and recovering the hybrid polypeptide from the cell.

상기 세균 세포를 처리하는 단계는 글루코스, 글리세롤, 또는 갈락토스에서 발효하는 단계를 포함하는 것으로 생각된다.Treating the bacterial cells is thought to include fermenting in glucose, glycerol, or galactose.

상기 세포로부터 혼성 폴리펩티드의 회수는 용해물(lysate)을 생산하기 위해 세균 세포의 세포벽 또는 그의 절편을 파괴하는 단계, 원심분리를 통해 상기 용해물로부터 세포내 침전물을 분리하는 단계, 침전물을 가용화하는 단계, 크로마토그래피 또는 한외여과에 의해 혼성 폴리펩티드를 선택적으로 정제하는 단계를 포함한다는 것을 또한 짐작할 수 있다.Recovery of the hybrid polypeptide from the cells involves disrupting the cell walls or fragments of the bacterial cells to produce lysates, separating intracellular precipitates from the lysates by centrifugation, solubilizing the precipitates. It can also be envisaged that it comprises the step of selectively purifying the hybrid polypeptide by chromatography, ultrafiltration or ultrafiltration.

또한, 본 발명은 프로인슐린과 프로인슐린의 N-말단에 부착된 리더 펩티드를포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 여기서 상기 폴리펩티드는 폴딩되고, 정확한 디설파이드 결합을 갖는다.The present invention also provides a polypeptide comprising a proinsulin and a leader peptide attached to the N-terminus of the proinsulin. Wherein the polypeptide is folded and has the correct disulfide bond.

바람직한 구체예에서, 상기 리더 펩티드는 CuZnSOD의 N-말단으로부터 유래된다.In a preferred embodiment, the leader peptide is derived from the N-terminus of CuZnSOD.

특히 바람직한 구체예에서, 상기 리더 펩티드는 62개의 아미노산을 포함하며, 아미노산 Met(amino acid Met)의 뒤에와 Arg 잔기 앞에 위치한다.In a particularly preferred embodiment, the leader peptide comprises 62 amino acids and is located after the amino acid Met and before the Arg residue.

바람직한 구체예에서, 상기 프로인슐린은 단일 Arg 잔기에 의해 인슐린 A 사슬에 연결된 인슐린 B-사슬을 포함한다.In a preferred embodiment, the proinsulin comprises an insulin B-chain linked to the insulin A chain by a single Arg residue.

다른 구체예에서, 상기 프로인슐린은 디펩티드 Lys-Arg에 의해 인슐린 A 사슬에 연결되는 인슐린 B-사슬을 포함한다.In another embodiment, the proinsulin comprises an insulin B-chain that is linked to the insulin A chain by dipeptide Lys-Arg.

상기 2개의 프로인슐린 분자는 혼성 단백질로서 생산되어야 한다. 그렇지 않으면, 발현 레벨이 매우 낮게 되며 상업적 중요성이 없게된다.The two proinsulin molecules must be produced as hybrid proteins. Otherwise, the expression level will be very low and no commercial significance.

모든 바람직한 구체예에서, 상기 리더 펩티드의 시스테인 잔기는 세린 잔기(serine residues)에 의해 대체되었다.In all preferred embodiments, the cysteine residues of the leader peptide have been replaced by serine residues.

하기 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되지만, 결코 발명의 범위를 한정하려는 것도 아니고, 그렇게 해석되어서도 안된다. 실시예들은 벡터를 제작하거나, 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 벡터내로 삽입하거나 또는 그 결과 얻어지는 플라스미드를 숙주내로 도입시키는 종래 방법에 대한 자세한 설명을 포함하고 있지 않다. 또한 하기 실시예들은 그러한 숙주 벡터 시스템에 의해 생산된 폴리펩티드를 분석하기 위해 사용되는 종래의 방법에 대해 자세한 설명을 포함하고 있지 않다. 그 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 하기 문헌 Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 포함한 많은 간행물에 개시되어 있다.The following examples are provided to aid the understanding of the present invention, but are not intended to limit the scope of the invention and should not be so interpreted. The examples do not include detailed descriptions of conventional methods for constructing a vector, inserting a gene encoding a polypeptide into a vector, or introducing the resulting plasmid into a host. In addition, the examples below do not include detailed descriptions of conventional methods used to analyze polypeptides produced by such host vector systems. The methods are well known to those skilled in the art and include, for example, many publications including Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Is disclosed.

실시예 1Example 1

SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 발현하는 생산 플라스미드 pBAST-R, pDBAST-LAT 및 pλ BAST-LAT의 제작Construction of Production Plasmids pBAST-R, pDBAST-LAT, and pλ BAST-LAT Expressing SOD-Proinsulin Hybrid Polypeptides

deoP₁P₂또는 λ P_L프로모터의 조절하에서이.콜라이(E. coli)에서 혼성 단백질을 과잉생산하는 세균 발현 벡터(bacterial exprssion vectors)를 제작하였다. 프로인슐린은 인슐린 B-사슬-Lys-Arg-인슐린 A-사슬을 암호화하는 발현 벡터를 가지는 세균이, 검출가능한 폴리펩티드를 생산할 수 없다는 것을 알기 때문에 혼성 단백질로서 생산되었다. 상기 혼성 단백질은 62개의 아미노산이고, CuZnSOD(11)의 N-말단으로부터 유래하고, N-말단에서 Met 잔기의 다음에 오고, C-말단에서 리더 펩티드를 인슐린 B-사슬에 연결하는 Arg 잔기의 앞에 오는 리더 펩티드를 포함한다. 상기 인슐린 B-사슬은 Lys-Arg 또는 Arg로 이루어진 짧은 C-사슬 펩티드에 의해 인슐린 A-사슬에 연결된다. SOD부에 원래 존재하는 두 개의 시스테인은 세린 잔기로 대체되었다.Bacterial exprssion vectors were constructed that overproduce hybrid proteins in E. coli under the control of the deo P ₁ P ₂ or λ P _L promoter. Proinsulin was produced as a hybrid protein because it knew that bacteria with expression vectors encoding insulin B-chain-Lys-Arg-insulin A-chain could not produce detectable polypeptides. The hybrid protein is 62 amino acids, derived from the N-terminus of CuZnSOD (11), following the Met residue at the N-terminus, and in front of the Arg residue which connects the leader peptide to the insulin B-chain at the C-terminus. Coming leader peptides. The insulin B-chain is linked to the insulin A-chain by a short C-chain peptide consisting of Lys-Arg or Arg. The two cysteines originally present in the SOD moiety were replaced with serine residues.

A. 플라스미드 pBAST-RA. Plasmid pBAST-R

일련의 플라스미드를 최종적으로 pBAST-R이 되게 제작했다. pBAST-R은 적절한이.콜라이숙주 세포의 형질전환시 인간 인슐린 생산에 유용한 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 효과적인 발현을 지시할 수 있었다.A series of plasmids was finally made to be pBAST-R. pBAST-R could direct effective expression of proinsulin hybrid polypeptides useful for human insulin production upon transformation of appropriate E. coli host cells.

SOD-인슐린 B 사슬-Lys-Arg-인슐린 A사슬 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 pBAST-R의 구조는 도 3에 나타나 있고; 혼성 폴리펩티드의 DNA 서열 및 해당 아미노산 서열은 도 6에 나타나 있다.The structure of plasmid pBAST-R encoding SOD-insulin B chain-Lys-Arg-insulin A chain hybrid polypeptide is shown in FIG. 3; The DNA sequence and corresponding amino acid sequence of the hybrid polypeptide are shown in FIG. 6.

플라스미드 pBAST-R은 약 4380 bp 길이이고 다음 요소들을 (시계 반대 방향으로) 포함한다:Plasmid pBAST-R is about 4380 bp in length and includes the following elements (counterclockwise):

1. 1521 bp 길이이고, 테트라시클린 내성유전자(the tetracycline resistance gene)를 포함하는 pBR322상의AatII-MscI 부위까지 뻗치는 DNA 절편.1. A DNA fragment 1521 bp long and extending to the Aat II- Msc I site on pBR322 containing the tetracycline resistance gene.

2. 1497 bp 길이이고, 끝을 자른(trunctated) 암피실린 내성유전자와 상기 DNA 복제의 기점을 포함하는 pBR322상의ScaI-HaeII 부위까지 뻗치는 DNA 절편.2. A DNA fragment 1497 bp long and extending to the Sca I- Hae II site on pBR322 containing the truncated ampicillin resistance gene and the origin of the DNA replication.

3. 930 bp 길이이고,deoP₁P₂프로모터와 리보솜 결합 부위RBS(13)를 포함하는이.콜라이DNA상의AvaII-NdeI 부위까지 뻗치는 DNA 절편.3. A DNA fragment 930 bp long and extending to the Ava II- Nde I site on E. coli DNA comprising the deo P ₁ P ₂ promoter and ribosomal binding site RBS (13).

4. 188 bp 길이이고, 인간 CuZnSOD cDNA의NdeI-PpuMI 부위까지 뻗치는 DNA 절편. 성숙한 SOD의 위치 6과 57에서의 상기 시스테인을 올리고누클레오티드부위-특이적 돌연변이 유발법(oligonucleotide site-directed mutagenesis)에 의해 세린 잔기로 치환시켰다(12).4. A DNA fragment 188 bp long and extending to the Nde I- PpuM I site of human CuZnSOD cDNA. The cysteines at positions 6 and 57 of the mature SOD were replaced with serine residues by oligonucleotide site-directed mutagenesis (12).

5. 172 bp 길이이고,PpuMIBamHI 말단을 가지는 합성 DNA 절편. 상기 영역은 Arg-인슐린 B 사슬-Lys-Arg-인슐린 A 사슬을 암호화한다.5. Synthetic DNA fragment 172 bp long and with the PpuM I BamH I termini. This region encodes an Arg-insulin B chain-Lys-Arg-insulin A chain.

6.BamHI 와HindIII말단을 가지는 합성 36 bp 다중 클로닝 부위 폴리링커.6. Synthetic 36 bp multiple cloning site polylinker with BamH I and Hind III ends.

7.HindIII와AatII 말단(10)을 가지는 TrpA 전사 터미네이터를 포함하는 합성 44 bp 올리고누클레오티드.7. Synthetic 44 bp oligonucleotide comprising TrpA transcription terminator with Hind III and Aat II termini (10).

테트라시클린 내성을 주고 SOD-인슐린 B 사슬-Lys-Arg-인슐린 A 사슬 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 pBAST-R를이.콜라이스트레인 Sφ 733(cytRstrA)내로 도입하고 1993년 7월 26일에 ATCC 수탁 번호 69362로 ATCC에 기탁했다.The plasmid pBAST-R, which is tetracycline resistant and encodes the SOD-insulin B chain-Lys-Arg-insulin A chain hybrid polypeptide, was introduced into E. coli strain Sφ 733 (cytRstrA) and was assigned ATCC on July 26, 1993. Deposited to the ATCC at number 69362.

B. 플라스미드 pDBAST-LATB. Plasmid pDBAST-LAT

또 다른 일련의 플라스미드를 최종적으로 플라스미드 pDBAST-LAT가 되게 제작했다. 상기 pDBAST-LAT는 적절한이.콜라이숙주 세포의 형질전환시, 인간 인슐린 생산에 유용한 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 효과적인 고도 발현을 지시할 수 있었다.Another series of plasmids was finally made to be plasmid pDBAST-LAT. The pDBAST-LAT could direct effective high expression of proinsulin hybrid polypeptides useful for human insulin production upon transformation of appropriate E. coli host cells.

SOD-인슐린 B 사슬-Arg-인슐린 A 사슬 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 pDBAST-LAT의 구조는 도 4에 나타나 있고; 상기 혼성 폴리펩티드의 DNA 서열과 대응 아미노산 서열은 도 7에 나타나 있다. 플라스미드 pDBAST-LAT는 약 4377 bp 길이이고 다음 요소들을 (시계반대 방향으로)포함한다:The structure of the plasmid pDBAST-LAT encoding the SOD-insulin B chain-Arg-insulin A chain hybrid polypeptide is shown in FIG. 4; The DNA sequence and corresponding amino acid sequence of the hybrid polypeptide are shown in FIG. 7. Plasmid pDBAST-LAT is about 4377 bp in length and includes (counterclockwise) the following elements:

1. 1521 bp 길이이고, 테트라시클린 내성유전자를 포함하는 pBR322상의AatII-MscI 부위까지 뻗치는 DNA 절편.1. DNA fragment 1521 bp long and extending to the Aat II- Msc I site on pBR322 containing a tetracycline resistant gene.

2. 1497 bp 길이이고, 끝을 자른 암피실린 내성유전자와 상기 DNA 복제의 기점을 포함하는 pBR322상의ScaI -HaeII 부위까지 뻗치는 DNA 절편.2. A DNA fragment 1497 bp long and extending to the Sca I- Hae II site on pBR322 containing the truncated ampicillin resistance gene and the origin of the DNA replication.

3. 930 bp 길이이고,deoP₁P₂프로모터와 RBS(13)를 포함하는이.콜라이DNA상의AvaII-NdeI 부위까지 뻗치는 DNA 절편.3. A DNA fragment 930 bp long and extending to the Ava II- Nde I site on E. coli DNA containing the deo P ₁ P ₂ promoter and RBS (13).

4. 188 bp 길이이고, 인간 CuZnSOD cDNA의NdeI-PpuMI 부위까지 뻗치는 DNA 절편, 성숙한 SOD의 위치 6과 57에서의 상기 시스테인을 세린 잔기로 치환하고 이 절편의 GC 함량을 올리고누클레오티드 부위-특이적 돌연변이 유발법(12)에 의해 38%까지 감소시켰다.4. A 188 bp long, DNA segment extending to the Nde I- PpuM I site of human CuZnSOD cDNA, replacing the cysteine at positions 6 and 57 of mature SOD with a serine residue and altering the GC content of this fragment to an oligonucleotide site-specific Red mutagenesis (12) reduced by 38%.

5. 169 bp 길이이고,PpuMI 와BamHI 말단을 가지는 합성 DNA 절편. 이 영역은 Arg-인슐린 B 사슬-Arg-인슐린 A 사슬을 암호화한다.5. Synthetic DNA fragment 169 bp long, with PpuM I and BamH I termini. This region encodes an Arg-insulin B chain-Arg-insulin A chain.

6.BamHI와HindIII말단을 가지는 합성 36bp 다중 클로닝 부위 폴리링커.6. Synthetic 36 bp multiple cloning site polylinker with BamH I and Hind III ends.

7.HindIII와AatII말단(10)을 가지는 TrpA 전사 터미네이터를 포함하는 합성 44 bp 올리고누클레오티드.7. Synthetic 44 bp oligonucleotide comprising TrpA transcription terminator with Hind III and Aat II termini (10).

테트라시클린 내성을 주고 SOD-인슐린 B 사슬-Arg-인슐린 A 사슬 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 pDBAST-LAT를,이.콜라이스트레인 Sφ 733(cytRstrA)내로 도입하고 1993년 7월 26일에 ATCC 수탁 번호 69361로 ATCC에 기탁했다.The plasmid pDBAST-LAT, which is tetracycline resistant and encodes a SOD-insulin B chain-Arg-insulin A chain hybrid polypeptide, was introduced into E. coli strain Sφ 733 (cytRstrA) and the ATCC accession number on July 26, 1993 Deposited to the ATCC at 69361.

C. 플라스미드 pλ BAST-LATC. Plasmid pλ BAST-LAT

또 다른 일련의 플라스미드를 최종적으로 플라스미드 pA BAST-LAT가 되게 제작했다. 그것은 (cI857 리프레서를 가지는)유전자 공학에 의해 생성된이.콜라이숙주 세포의 형질전환시 인간 인슐린 생산에 유용한 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 효과적인 발현을 지시할 수 있었다.Another series of plasmids was finally made to be plasmid pA BAST-LAT. It could direct the effective expression of proinsulin hybrid polypeptides useful for human insulin production in the transformation of E. coli host cells produced by genetic engineering (with cI857 repressor).

SOD-인슐린 B 사슬-Arg-인슐린 A 사슬 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 pλ BAST-LAT의 구조는 도 5에 나타나 있다. 상기 혼성 폴리펩티드의 DNA 서열과 대응 아미노산 서열은 도 7에 나타나 있다.The structure of the plasmid pλ BAST-LAT encoding the SOD-insulin B chain-Arg-insulin A chain hybrid polypeptide is shown in FIG. 5. The DNA sequence and corresponding amino acid sequence of the hybrid polypeptide are shown in FIG. 7.

플라스미드 pλ BAST-LAT는 약 3777 bp 길이이고 다음 요소들을 (시계반대 방향으로)포함한다:Plasmid pλ BAST-LAT is about 3777 bp in length and includes (counterclockwise) the following elements:

1. 1521 bp 길이이고, 테트라시클린 내성유전자를 포함하는 pBR322상의AatII-MscI 부위까지 뻗치는 DNA 절편.1. DNA fragment 1521 bp long and extending to the Aat II- Msc I site on pBR322 containing a tetracycline resistant gene.

2. 1497 bp 길이이고, 끝을 자른 암피실린 내성유전자와 상기 DNA 복제의 기점을 포함하는 pBR322상의ScaI-HaeII 부위까지 뻗치는 DNA 절편.2. A DNA fragment 1497 bp long and extending to the Sca I- Hae II site on pBR322 containing the truncated ampicillin resistance gene and the origin of the DNA replication.

3. 330 bp 길이이고, λ P_L프로모터와AvaII-NdeI 30 염기쌍 길이deo리보솜 결합 부위를 가지는 플라스미드 pSODα 13(14)상의BamHI -EcoRI 부위까지 뻗치는 DNA 절편.3. DNA fragment 330 bp long and extending to the BamH I- EcoR I site on plasmid pSODα 13 (14) with a λ P _L promoter and an Ava II- Nde I 30 base pair length deo ribosomal binding site.

4. 188 bp 길이이고, 인간 CuZnSOD cDNA의NdeI-PpuMI 부위까지 뻗치는 DNA 절편. 성숙한 SOD의 위치 6과 57에서의 상기 시스테인을 세린 잔기로 치환하고 이 절편의 GC 함량을 올리고누클레오티드 부위-특이적 돌연변이 유발법(12)에 의해 38%까지 감소시켰다.4. A DNA fragment 188 bp long and extending to the Nde I- PpuM I site of human CuZnSOD cDNA. The cysteine at positions 6 and 57 of mature SOD was replaced with a serine residue and the GC content of this fragment was reduced by 38% by oligonucleotide site-specific mutagenesis (12).

5. 169 bp 길이이고,PpuMI 와BamHI 말단을 가지는 합성 DNA 절편. 이 영역은 Arg-인슐린 B 사슬-Arg-인슐린 A 사슬을 암호화한다.5. Synthetic DNA fragment 169 bp long, with PpuM I and BamH I termini. This region encodes an Arg-insulin B chain-Arg-insulin A chain.

6.BamHI 와HindIII말단을 가지는 합성 36 bp 다중 클로닝 부위 폴리링커.6. Synthetic 36 bp multiple cloning site polylinker with BamH I and Hind III ends.

7.HindIII와AatII 말단(10)을 가지는 TrpA 전사 터미네이터를 포함하는 합성 44 bp 올리고누클레오티드.7. Synthetic 44 bp oligonucleotide comprising TrpA transcription terminator with Hind III and Aat II termini (10).

테트라시클린 내성을 주고 λ P_L프로모터의 조절하에서 SOD-인슐린 B 사슬-Arg-인슐린 A 사슬 혼성 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 pλ BAST-LAT를이.콜라이스트레인 4300(F-,bio, cI⁸⁵⁷)내로 도입하고 1993년 7월 26일에 ATCC 수탁 번호 69363로 ATCC에 기탁했다.Plasmid pλ BAST-LAT encoding tetracycline resistance and encoding SOD-insulin B chain-Arg-insulin A chain hybrid polypeptide under the control of the λ P _L promoter was transferred into E. coli strain 4300 (F-, bio, c ⁸⁵⁷ ). And was deposited with the ATCC under the ATCC accession number 69363 on 26 July 1993.

세균 세포를 30℃에서 증식시켰다. 혼성 폴리펩티드의 생산은 42℃로의 온도 전이때 유도되었다.Bacterial cells were grown at 30 ° C. Production of the hybrid polypeptide was induced at temperature transition to 42 ° C.

실시예 2Example 2

SOD-프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 발효, 성장 조건 및 정제Fermentation, Growth Conditions, and Purification of SOD-Proinsulin Hybrid Polypeptides

I . 스톡 배양(Stock Cultures)I. Stock Cultures

플라스미드 pDBAST-LAT(또는 pBAST-R)을 가지는이.콜라이스트레인 Sφ 733의 스특 배양물을 테트라시클린(10mg/L)가 보충된 카제인 배지(casein medium)(20gr/L 카제인 가수분해 생성물, 10gr/1 이스트 추출물 및 5gr/L NaCl)상에서 성장시켰다. 이어서 상기 배양물을 동결 배지로 두 배 희석시키고 80℃에 저장했다.A special culture of E. coli strain Sφ 733 with plasmid pDBAST-LAT (or pBAST-R) was subjected to a casein medium (20 gr / L casein hydrolysis product, 10 gr supplemented with tetracycline (10 mg / L). / 1 yeast extract and 5 gr / L NaCl). The culture was then diluted twice with freezing medium and stored at 80 ° C.

상기 접종물(inoculum)을 생산 배지(하기 참조)에서 증식시켰다. 진탕 플라스크(a shake flask)내에 들어있는 멸균 배지에 스톡 배양물을 접종시키고, 37℃에서 대략 200 r.p.m으로 진탕기(a shaker)에서 15시간 인큐베이션시켰다. 필요한 경우에, 접종물 증식에서의 차후 단계들은 교반 통기 발효조(stirred aerated fermenters)에서 실행되었다. 멸균 배지를 플라스크 배양물 2 내지 10%로 접종시키고, 20% 공기 포화 이상으로 용존산소 수준을 유지하기 위해 교반(agitation)과 통기(aeration)시키면서 37℃에서 15시간 동안 pH 7± 0.5로 인큐베이션시켰다.The inoculum was grown in production medium (see below). Stock cultures were inoculated in sterile medium contained in a shake flask and incubated for 15 h on a shaker at 37 ° C. at approximately 200 r.p.m. If necessary, subsequent steps in inoculum propagation were carried out in stirred aerated fermenters. Sterile media were inoculated with flask culture 2-10% and incubated at pH 7 ± 0.5 for 15 hours at 37 ° C. with agitation and aeration to maintain dissolved oxygen levels above 20% air saturation. .

III. 생산III. production

상기 생산 배지를 접종 배양물 0.5 내지 10%로 접종시키고 37℃에서 인큐베이션시켰다. 교반-통기 비율은 약 20% 공기 포화 이상의 용존 산소 수준을 유지하도록 설정했다. pH는 NH₃로 7± 0.2에서 유지되도록 했다.The production medium was inoculated with 0.5-10% of the inoculation culture and incubated at 37 ° C. The stir-vent ratio was set to maintain dissolved oxygen levels above about 20% air saturation. The pH was kept at 7 ± 0.2 with NH ₃ .

글루코스 50%와 글리세롤 30%의 살균 용액을 주입하여 에너지와 탄소원을 공급했다. 세포 농도가 25의 OD₆₆₀에 도달하자마자, 10% 글루코스와 30% 글리세롤의 멸균 용액을 주입시키고 세포 농도가 대략 60의 OD₆₆₀에 도달할 때까지 약 5시간 동안 계속 성장시켰다. 이어 상기 배양물을 냉각시키고 세포를 원심분리에 의해 회수하였다. 탄소원으로써 글루코스, 글리세롤, 갈락토스 또는 그들의 조합중 어느 1종의 존재하에서의이.콜라이의 발효는 SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 발현을 촉진시켰다.Bactericidal solution of 50% glucose and 30% glycerol was injected to supply energy and carbon source. As soon as the cell concentration reached an OD ₆₆₀ of 25, a sterile solution of 10% glucose and 30% glycerol was injected and continued to grow for about 5 hours until the cell concentration reached an OD ₆₆₀ of approximately 60. The culture was then cooled and cells were recovered by centrifugation. Fermentation of E. coli in the presence of any one of glucose, glycerol, galactose or combinations thereof as a carbon source promoted the expression of SOD proinsulin hybrid polypeptides.

IV. 정제IV. refine

플라스미드 pBAST-R 과 pDBAST-LAT에 의해서 발현된 SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드는 세포내 침전물에 축적되었고 이 세포내 침전물은 하기 공정에 따라 분리되었다: 세균 케이크의 1gr(습식 무게)를 pH 8인 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA를 포함하는 10ml 완충액에 현탁시키고 리소자임(머크(Merck), 2500μ/ml)으로 37℃에서 2시간동안 처리했다. 그 혼합물을 이어서 초음파처리하고 노니데트(Nonidet)-P-40(시그마) 또는 트리톤(Triton) X 100을 최종 농축가 2%가 되도록 가하고 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 상기 침전물을 원심분리에 의해 펠릿으로 만들고 물로 세척했다.SOD proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmids pBAST-R and pDBAST-LAT accumulated in intracellular precipitates and the intracellular precipitates were separated according to the following procedure: 50 mM Tris with 1gr (wet weight) of bacterial cake at pH 8 -HCl, suspended in 10 ml buffer containing 10 mM EDTA and treated with lysozyme (Merck, 2500 μ / ml) at 37 ° C. for 2 hours. The mixture was then sonicated and Nonidet-P-40 (Sigma) or Triton X 100 was added to a final concentration of 2% and stirred at room temperature for 2 hours. The precipitate was pelleted by centrifugation and washed with water.

상기 혼성 폴리펩티드를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 다음과 같이 정제하여 거의 동질이 되도록 했다. 상기 침전물을 8M 우레아, 20mM Tris-HCl, pH 8.2인 200mM β -머캅토에탄올(β -mercaptoethanol)에서 용해시켰다. 상기 용액을 원심분리에 의해 맑게하고 8M 우레아, 20mM Tris-HCl, pH 8.2인 20mM β -머캅토에탄올에서 미리 평형화된 DEAE 세파로스 페스트-플로우 칼럼(DEAE-Sepharose Fast-Flow column)(파마시아 LKB)상에서 크로마토그래피를 하였다. 플로우-스루 물질(flow-through material)을 수집하고 그 혼성 단백질은 40% 포화에서 (NH₄)₂SO₄로 침전되거나 10K 멤브레인상에서 한외여과된 다음 pH 3.1인 100mM 글리신-HCl에 대해 디아필트레이션(diafiltration)에 의해 농축되었다.The hybrid polypeptide was purified by anion exchange chromatography as follows to make it nearly homogeneous. The precipitate was dissolved in 8 mM urea, 20 mM Tris-HCl, 200 mM β-mercaptoethanol, pH 8.2. The solution was cleared by centrifugation and DEAE-Sepharose Fast-Flow column (Pharmacia LKB) pre-equilibrated in 20 mM β-mercaptoethanol at 8M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8.2. Chromatography was performed. The flow-through material was collected and the hybrid protein precipitated with (NH ₄ ) ₂ SO ₄ at 40% saturation or ultrafiltered on a 10K membrane and then diafiltered for 100 mM glycine-HCl, pH 3.1. concentrated by diafiltration.

다르게는, 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 8M 우레아, 20mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol), pH 5인 50mM Na 아세테이트에서 용해시키고 그리고 일련의 100kD와 50kD 멤브레인(필트론(Filtron))을 통해 한외여과하여 거의 동질이 되도록 정제시켰다. 상기 혼성 폴리펩티드를 10kD 멤브레인상에서 농축시키고 40% 포화에서 (NH₄)₂SO₄로 침전시켰다.Alternatively, SOD proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pBAST-R were dissolved in 8M urea, 20 mM Dithiothreitol, 50 mM Na acetate, pH 5, and a series of 100kD and 50kD membranes (Filtron Ultrafiltration through)) was purified to be almost homogeneous. The hybrid polypeptide was concentrated on a 10 kD membrane and precipitated with (NH ₄ ) ₂ SO ₄ at 40% saturation.

실시예 3Example 3

SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 폴딩 및 효소분해Folding and Enzymatic Degradation of SOD Proinsulin Hybrid Polypeptides

(NH₄)₂SO₄침전물에 의해 또는 한외여과에 의해(실시예 2) 얻어진 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 8M 우레아, 5mM HCl에 용해시키고 pH 8.5 내지 12.0인 100mM 글리신 완충액으로 최종 농도가 약 1mg/ml가 되도록 희석시켰다.The proinsulin hybrid polypeptide obtained by (NH ₄ ) ₂ SO ₄ precipitate or by ultrafiltration (Example 2) was dissolved in 8M urea, 5 mM HCl and the final concentration was about 1 mg / ml with 100 mM glycine buffer, pH 8.5-12.0. Dilute to

A. 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 폴딩은 올바른 디설파이드 결합 형성을 허용하기 위해 약 1 내지 24 시간 동안 약 4내지 37℃에서 일어났다.A. Folding of the SOD proinsulin hybrid polypeptide expressed by plasmid pBAST-R took place at about 4 to 37 ° C. for about 1 to 24 hours to allow for correct disulfide bond formation.

폴딩되고 디설파이드 결합된 혼성 폴리펩티드를 포함하는 용액의 pH를 HCl로 약 8.8 내지 9.0으로 조절하고 상기 단백질을 트립신과 카르복시펩티다제 B로 16 내지 37℃에서 30 내지 120분 동안 처리했다.The pH of the solution containing the folded and disulfide bound hybrid polypeptide was adjusted to about 8.8-9.0 with HCl and the protein was treated with trypsin and carboxypeptidase B at 16-37 ° C. for 30-120 minutes.

많은 시험을 한 후에, 다음과 같은 최적의 조건을 발견했다: 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 상기 혼성 폴리펩티드를 8M 우레아, 5mM HCl내에서 용해시키고 pH 11.0인 100 mM 글리신 완충액에서 최종 농도가 약 1mg/ml가 되도록 희석시켰다(도 8). 그 다음 혼성 폴리펩티드의 폴딩이 25℃에서 6 내지 16시간 동안 일어났다. 그 후에 상기 폴딩되고 디설파이드 결합된 혼성 폴리펩티드를 트립신(1:500 w/w)과 카르복시펩티다제 B(1:200 w/w)로 37℃에서 30 내지 60분 동안 절단하였다.After many tests, the following optimum conditions were found: The hybrid polypeptide expressed by plasmid pBAST-R was dissolved in 8M urea, 5 mM HCl and the final concentration was about 1 mg in 100 mM glycine buffer at pH 11.0. Diluted to / ml (FIG. 8). Folding of the hybrid polypeptide then took place at 25 ° C. for 6-16 hours. The folded and disulfide coupled hybrid polypeptide was then cleaved with trypsin (1: 500 w / w) and carboxypeptidase B (1: 200 w / w) at 37 ° C. for 30 to 60 minutes.

플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 상기 폴딩되고 디설파이드 결합된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 효소 분해에 의한 인슐린 생성이 도 1에 도식적으로 나타나 있다.Insulin production by enzymatic digestion of the folded and disulfide bound proinsulin hybrid polypeptide expressed by plasmid pBAST-R is shown schematically in FIG. 1.

B. 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현된 SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 폴딩은 올바른 디설파이드 결합 형성을 허용하기 위해 약 5 내지 30 시간 동안 약 7 내지 31℃에서 일어났다.B. Folding of the SOD proinsulin hybrid polypeptide expressed by plasmid pDBAST-LAT took place at about 7 to 31 ° C. for about 5 to 30 hours to allow for correct disulfide bond formation.

폴딩되고 디설파이드 결합된 혼성 폴리펩티드를 포함하는 용액의 pH를 HCl로 약 8.8 내지 9.0으로 조절하고 상기 단백질을 트립신과 카르복시펩티다제 B로 22 내지 37℃에서 30분 내지 16시간동안 처리했다.The pH of the solution containing the folded and disulfide bound hybrid polypeptide was adjusted to about 8.8-9.0 with HCl and the protein was treated with trypsin and carboxypeptidase B at 22-37 ° C. for 30 minutes to 16 hours.

많은 시험을 한 후에, 다음과 같은 최적의 조건을 발견했다: 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 상기 혼성 폴리펩티드를 8M 우레아, 5mM HCl내에서 용해시키고 pH 11.0 내지 11.25인 100mM 글리신 완충액으로 최종 농도가 약 1mg/ml 되도록 희식시켰다(도 8). 그런 다음, 혼성 폴리펩티드의 폴딩은 25℃에서 5시간 동안 일어났다. 그 후에 상기 폴딩되고 디설파이드 결합된 혼성 폴리펩티드를 트립신(1:15.000 W/W)과 카르복시펩티다제 B(1:10.000 W/W)로 25℃에서 16시간 동안 절단하였다.After many tests, the following optimal conditions were found: The hybrid polypeptide expressed by plasmid pBAST-R was dissolved in 8M urea, 5 mM HCl and the final concentration was approximately 100 mM glycine buffer at pH 11.0 to 11.25. It was distilled to 1 mg / ml (FIG. 8). The folding of the hybrid polypeptide then took place at 25 ° C. for 5 hours. The folded and disulfide coupled hybrid polypeptide was then cleaved with trypsin (1: 15.000 W / W) and carboxypeptidase B (1: 10.000 W / W) at 25 ° C. for 16 hours.

플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현된 상기 폴딩되고 디설파이드 결합된 프로인슐린 혼성 플리펩티드의 효소 분해에 의한 인슐린 생성이 도 2에 도식적으로나타나 있다.Insulin production by enzymatic digestion of the folded and disulfide bonded proinsulin hybridized polypeptides expressed by plasmid pDBAST-LAT is shown schematically in FIG. 2.

상기 A와 B 모두에 대한 구체적 조건의 예들은 도 8 내지 도 14에 대한 범례에 상세하게 되어 있다.Examples of specific conditions for both A and B are detailed in the legend for FIGS. 8-14.

실시예 4Example 4

플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로 부터 인간 인슐린의 단백질 분석 및 정제Protein Analysis and Purification of Human Insulin from SOD Proinsulin Hybrid Polypeptides Expressed by Plasmid pBAST-R

플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로 부터의 인간 인슐린 생성을 시판용 인간 인슐린을 표준(Calbiochem)으로 활용하여 라디오이뮤노어세이(radioimmunoassay)와 RP-HPLC에 의해 측정했다. 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 아미노산 서열에 따라 계산된 재조합 인간 인슐린의 이론적 수율은 45.6%이다. 최적의 폴딩은 pH 11에서 일어난다는 것이 도 8로부터 자명하다. 이 pH 값에서, 인슐한 생산량은 이론적 수율의 약 80%에 달한다(이것은 투입된 혼성 폴리펩티드의 약 40%에 해당한다). 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터 생산된 인간 인슐린을 RP-HPLC에 의해 측정하였다. Vydac 218TP54, 250 × 4.6 mm I.D.(분리 그룹), 5μm, 300Å 공극 크기 칼럼을 실온에서 분당 1ml의 유량으로 사용했다. H₂O 내의 트리플루오로아세트산(TFA) 0.1%를 용출액(eluant) A로 사용하고 아세토니트릴중의 TFA 0.08%를 용출액 B로 사용하였다. 상기 칼럼을 5분 동안 평형 완충액(용출액 B 25%)에서 세척한 다음, 37.5분 동안 용출액 B 25 내지 50%의 선상 그레디언트에 의해 용출하였다. 흡광도를 220nm또는 280nm에서 측정했다. 폴딩되고 디설파이드 결합된 혼성 폴리펩티드의 효소 소화(the enzymatic digestion)후에 역상-고압 액체 크로마토그래피에 의한 인간 인슐린의 분석 결과는 표준 인간 인슐린과 동일한 체류시간을 갖는 주요 피크가 나타났다.Human insulin production from SOD proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pBAST-R was measured by radioimmunoassay and RP-HPLC using commercial human insulin as the standard (Calbiochem). The theoretical yield of recombinant human insulin calculated according to the amino acid sequence of the proinsulin hybrid polypeptide is 45.6%. It is apparent from FIG. 8 that optimal folding occurs at pH 11. At this pH value, the insulated production amounts to about 80% of the theoretical yield (this corresponds to about 40% of the injected hybrid polypeptide). Human insulin produced from proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pBAST-R was measured by RP-HPLC. A Vydac 218TP54, 250 × 4.6 mm ID (separation group), 5 μm, 300 mm pore size column was used at room temperature at a flow rate of 1 ml per minute. 0.1% of trifluoroacetic acid (TFA) in H ₂ O was used as eluant A and 0.08% of TFA in acetonitrile was used as eluent B. The column was washed for 5 minutes in equilibration buffer (eluent B 25%) and then eluted with a linear gradient of eluent B 25-50% for 37.5 minutes. Absorbance was measured at 220 nm or 280 nm. Analysis of human insulin by reverse phase-high pressure liquid chromatography after the enzymatic digestion of the folded and disulfide coupled hybrid polypeptide showed a major peak with the same retention time as standard human insulin.

두 개의 소규모 배치(batches)를 준비하여 각각 인간 인슐린의 26mg과 13mg을 얻었다. 인간 인슐린을 상기 효소-처리 용액(pH 9)으로부터 3K 또는 5K 멤브레인(필트론)중 하나에서 한외여과에 의해 정제한 다음 CM-세파로스 크로마토그래피(시트레이트 완충액, pH 3)에 의해 정제했다. 피크 분획을 탈염시키고, 동결건조시키고, N-말단 시퀀싱과 아미노산 분석을 했다. 재조합 인간 인슐린의 두 배치의 상기 아미노산 조성은 자연적으로 발생하는 인간 인슐린과 실질적으로 동일했다(표 1 참조, 제조물 1). 상기 인슐린 제조물의 아미노 말단에서 5개 아미노산의 서열을 에드만 디그라데이션(Edman degradation)에 의해 결정했다. 인간 인슐린의 A 사슬과 B사슬 모두의 NH₂-말단과 동일하다는 것을 알아냈으며, 이는 상기인 비트로생성물의 신뢰성(authenticity)을 증명한다.Two small batches were prepared to obtain 26 mg and 13 mg of human insulin, respectively. Human insulin was purified from the enzyme-treated solution (pH 9) by ultrafiltration on either 3K or 5K membranes (filtrons) and then by CM-Sepharose chromatography (citrate buffer, pH 3). Peak fractions were desalted, lyophilized, subjected to N-terminal sequencing and amino acid analysis. The amino acid composition of the two batches of recombinant human insulin was substantially the same as naturally occurring human insulin (see Table 1, preparation 1). The sequence of five amino acids at the amino terminus of the insulin preparation was determined by Edman degradation. It was found that it is identical to the NH ₂ -terminus of both the A chain and B chain of human insulin, which proves the authenticity of the product in vitro .

하지만, 상기 시퀀싱 결과는 약 25%의 분자내에서 여분의 Arg 잔기가 첫번째 위치에 존재함을 나타낸다 이 결과는 상기 링커 서열 Lys-Arg내에 Lys과 Arg사이의 트립신 분해에 해당한다. 따라서, 부가의 Arg 잔기가 상기 A 사슬의 아미노 말단상에 남아있게 된다.However, the sequencing results indicate that excess Arg residues are present in the first position in about 25% of the molecule. This result corresponds to trypsin digestion between Lys and Arg in the linker sequence Lys-Arg. Thus, additional Arg residues remain on the amino terminus of the A chain.

트립신에 의한 상기 Arg의 C-말단에서 특이적 가수분해는 pH 11에서 반응을시킴으로서 이를 수 있다는 것을 알았다. 이 상승된 pH에서, Lys의 ε -아미노기의 대부분은 하전되지 않아서(pK=10.3) 선택적 분해가 가능하다. 1mg의 정제 인슐린과 6.5mg의 정제 인슐린을 얻은 두 배치는 상기 트립신 단계를 pH 11(표 11참조, 제조물 2)에서 수행한 다음 카르복시펩티다제 B 소화를 pH 8.5에서 수행함으로서 얻었다. N-말단 시퀀싱은 여분의 Arg를 포함하는 인슐린의 양이 약 5%까지 감소했다는 것을 밝혔다.It was found that specific hydrolysis at the C-terminus of the Arg by trypsin can be achieved by reacting at pH 11. At this elevated pH, most of the ε-amino group of Lys is not charged (pK = 10.3), allowing for selective degradation. Two batches of 1 mg purified insulin and 6.5 mg purified insulin were obtained by performing the trypsin step at pH 11 (see Table 11, preparation 2) followed by carboxypeptidase B digestion at pH 8.5. N-terminal sequencing revealed that the amount of insulin containing extra Arg was reduced by about 5%.

[표 1]TABLE 1

재조합 인간 인슐린의 아미노산 조성Amino Acid Composition of Recombinant Human Insulin

제조물 1과 제조물 2는 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터 생산된 재조합 인간 인슐린의 아미노산 조성을 나타낸다. 트립신 분해를 pH 9(제조물 1) 또는 pH 11(제조물 2)중 어느 한 쪽에서 실행했다.Preparation 1 and Preparation 2 show the amino acid composition of recombinant human insulin produced from proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pBAST-R. Trypsin digestion was carried out at either pH 9 (Product 1) or pH 11 (Product 2).

아미노산 분석은 정제 인슐린 제조물의 기체상 가수분해와퍼포름산(performic acid) 산화 후에 행해졌다.Amino acid analysis was performed after gas phase hydrolysis and performic acid oxidation of the purified insulin preparation.

실시예 5Example 5

플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터 생산된 정제 인간 인슐린의 펩티드 분석Peptide Assay of Purified Human Insulin Produced from SOD Proinsulin Hybrid Polypeptides Expressed by Plasmid pBAST-R

상기 실시예에서 설명된 바와 같이 생산된 정제 인간 인슐린을 엔도프로테인아제(endoproteinase) Glu-C(시그마)를 활용하여 펩티드 분석했고, 이는 글루타미잔기(glutamy residues)의 카르복시측에서 펩티드 결합을 가수분해한다.Purified human insulin produced as described in the above example was peptide analyzed using endoproteinase Glu-C (Sigma), which hydrolyzed peptide bonds on the carboxy side of glutami residues. do.

좀더 상세하게는 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 상기 폴딩되고 디설파이드 결합된 프로인슐린 폴리펩티드의 분해에 의해 생산된 인슐린 시료(100 μg)를 5 u g Glu-C로 6시간동안 37℃에서 1000μl의 pH 7 8인 0.1M Tris-HCl내에서 소화시켰다. HPLC 분석을 다음과 같이 했다: 시중에서 구입가능한(대조군) 인슐린의 시료와, 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 상기 폴딩되고 디설파이드 결합된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 분해에 의해 생산된 인슐린의 시료를 약 3정도의 pH까지 산성화시키고 RP-HPLC에 의해 분리시켰다. Vydac 218TP54, 250 × 4.6mm I.D, 5μm, 300 Å 공극 크기의 칼럼을 사용하였다. 상기 칼럼을 아세토니트릴 31.5%(부피/부피)를 포함하는 50mM 테트라에틸암모늄 포스페이트, pH 3인 162mM NaClO₄으로 평형화시키고 분당 1ml의 유량으로 75분 동안 아세토니트릴 35 내지 45%의 선상 그래디언트로 전개시켰다. 흡광도는 220nm에서 측정되었다.More specifically, an insulin sample (100 μg) produced by digestion of the folded and disulfide bound proinsulin polypeptide expressed by plasmid pBAST-R with 5 ug Glu-C for 6 hours at 37 ° C. at 1000 μl of pH 7 Digestion was performed in 0.1 M Tris-HCl, which is 8. HPLC analysis was performed as follows: a sample of commercially available (control) insulin and a sample of insulin produced by digestion of the folded and disulfide bound proinsulin hybrid polypeptide expressed by plasmid pBAST-R were approximately 3 samples. Acidified to pH and separated by RP-HPLC. A column of Vydac 218TP54, 250 × 4.6 mm ID, 5 μm, 300 mm pore size was used. The column was equilibrated with 50 mM tetraethylammonium phosphate containing 31.5% (volume / volume) of acetonitrile, 162 mM NaClO ₄ , pH 3 and developed with a linear gradient of acetonitrile 35-45% for 75 minutes at a flow rate of 1 ml per minute. . Absorbance was measured at 220 nm.

비록 상기 분획들 중 하나에 대응하는 피크의 뒤에 생기는 작은 숄더가데스-Thr(B₃₀) 인슐린 유사 분자(15)에 관련된 것일지라도 모든 예상 펩티드는 대조 반응과 일치하여 생성되었다.All expected peptides were generated in line with the control response, although related to the small Shouldergades-Thr (B ₃₀ ) insulin-like molecule 15 which occurs behind the peak corresponding to one of the fractions.

실시예 4와 실시에 5는 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 재조합 폴리펩티드가 자연적으로 발생하는 인간 인슐린의 서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 생산된 재조합 단백질의 적은 부분이 Arg(Ao), 데스아미도- 또는 데스-Thr(B₃₀) 인슐린 유사 분자와 같은 형태를 포함했다.Examples 4 and 5 show that the recombinant polypeptide expressed by plasmid pBAST-R comprises a sequence of naturally occurring human insulin. A small fraction of the recombinant proteins produced included forms such as Arg (Ao), Desamido- or Des-Thr (B ₃₀ ) insulin like molecules.

이 원하지 않았던 부산물들을 위에서 설명한 바와 같은 RP-HPLC 등의 크로마토그래피 방법에 의해 제거할 수 있다.These unwanted byproducts can be removed by chromatographic methods such as RP-HPLC as described above.

실시예 6Example 6

플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현된 상기 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로 부터 생산된 인간 인슐린의 단백질 분석과 정제Protein Analysis and Purification of Human Insulin Produced from the Proinsulin Hybrid Polypeptides Expressed by Plasmid pDBAST-LAT

Arg(Ao) 인슐린 부산물이 생성되는 것을 피하기 위해(실시예 4와 실시예 5), 발현 플라스미드 pBAST-R을 변형시켜 플라스미드 pBAST-R에 의해 발현된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 A 사슬과 B 사슬사이에 Lys-Arg를 코딩하는 DNA와 대조적으로 상기 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 A 사슬과 B 사슬사이의 Arg 잔기를 코딩하는 DNA만을 포함하게 했다. 이것은 발현 플라스미드 pDBAST-LAT(실시예 B)와 pλ BAST-LAT(실시예 1C)가 되었다.To avoid the production of Arg (Ao) insulin by-products (Examples 4 and 5), the expression plasmid pBAST-R was modified to between the A and B chains of the proinsulin hybrid polypeptide expressed by plasmid pBAST-R. In contrast to the DNA encoding Lys-Arg, only the DNA encoding the Arg residue between the A and B chains of the proinsulin hybrid polypeptide was included. This became the expression plasmids pDBAST-LAT (Example B) and pλ BAST-LAT (Example 1C).

트립신과 새로운 발현 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현된 상기 폴딩되고 디설파이드 결합된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 트립신과 CPB로 효소 처리한 뒤에 인슐린이 효율적으로 생산되었다. 인슐린 유사 오염물의 존재는 낮았다(도 9). 폴딩은 pH 11.25에서 최적이고(도 10), 그 반응 혼합물내에서 SH 기 1몰당 약 2몰의 아스코르브산이 존재할 때 현저하게 향상되었다(도 11).Insulin was efficiently produced after enzyme treatment of trypsin and CPB with the folded and disulfide coupled proinsulin hybrid polypeptide expressed by trypsin and the novel expression plasmid pDBAST-LAT. The presence of insulin-like contaminants was low (FIG. 9). Folding was optimal at pH 11.25 (FIG. 10) and markedly improved when there were about 2 moles of ascorbic acid per mole of SH group in the reaction mixture (FIG. 11).

프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터 생성된 인슐린의 수율에서 단백질 농도의 효과를 다른 최적의 폴딩 조건들하의 일련의 반응으로 결정하였다. 단백질 농도가 1.5 mg/ml를 초과하지 않았을 때 최적의 수율을 얻었다(도 13).The effect of protein concentration on the yield of insulin produced from proinsulin hybrid polypeptides was determined by a series of reactions under different optimal folding conditions. Optimum yields were obtained when the protein concentration did not exceed 1.5 mg / ml (FIG. 13).

상기 인슐린을 DEAE-세파로스 크로마토그래피를 한 다음 RP-HPLC(도 9에서 설명된 바와 같이)를 함으로서 정제하였다. 도 12로 확실히 알 수 있듯이, 생산된 상기 재조합 인간 인슐린은 표준(시중에서 구입가능한) 인간 인슐린과 동일한 체류 시간을 가졌다. 상기 정제 재조합 인간 인슐린 제조의 아미노산 조성은 표준 인슐 린과 동일하다(표 2 참조, 재조합 인슐린).The insulin was purified by DEAE-Sepharose chromatography followed by RP-HPLC (as described in FIG. 9). As can be seen clearly in FIG. 12, the recombinant human insulin produced had the same retention time as standard (commercially available) human insulin. The amino acid composition of the purified recombinant human insulin preparation is identical to that of standard insulin (see Table 2, recombinant insulin).

표 2는 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현된 상기 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로 부터 생산된 인슐린이 실시예 4에서 설명된 바와 같이 인슐린 A 사슬(Aeg(Ao) 인슐린)에 부착된 여분의 Arg 잔기를 가지지 않았다는 것을 나타낸다. 따라서, 인슐린 생산을 위한 바람직한 플라스미드는 플라스미드 pDBAST-LAT이고 상기 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 위한 바람직한 서열은 도 7에 나타나 있는 것이다.Table 2 shows that insulin produced from the proinsulin hybrid polypeptide expressed by plasmid pDBAST-LAT did not have extra Arg residues attached to the insulin A chain (Aeg (Ao) insulin) as described in Example 4. Indicates. Thus, the preferred plasmid for insulin production is plasmid pDBAST-LAT and the preferred sequence for the proinsulin hybrid polypeptide is shown in FIG. 7.

[표 2]TABLE 2

재조합 인간 인슐린의 아미노산 조성Amino Acid Composition of Recombinant Human Insulin

표준 인간 인슐린과 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현된 프로인슐린 혼성플리펩티드로부터 생상된 재조합 인간 인슐린의 아미노산 조성을 나타낸다.The amino acid composition of recombinant human insulin produced from proinsulin hybrid polypeptides expressed by standard human insulin and plasmid pDBAST-LAT.

아미노산 분석은 정제 인슐린 제조물의 퍼포름산 산화와 기체상 가수분해 후에 행해졌다.Amino acid analysis was performed after performic acid oxidation and gas phase hydrolysis of the purified insulin preparation.

실시예 7Example 7

세포내 조침전물로 부터의 플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로 부터 인간 인슐린 생산Human insulin production from proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pDBAST-LAT from intracellular precipitates

상기 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 인슐린으로의 효소적 전환과 폴딩을 하기 위한 향상된 방법을 세포내 조침전물(crude intracellular precipitate)을 사용함으로서 실행하여 실시예 2의 IV부분에서 설명된 바와 같은 초기 정제 단계의 필요성을 제거했다. 폴딩되고 디설파이드 결합된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 트립신과 카르복시펩티다제 B로 효소 분해를 한 다음에 인슐린이 효율적으로 생산되었다(도 14와 표 3). 인슐린의 수율을 상기 침전물 용해 단계에서 결정한 것과 같이 pH 12에서 초기 단백질 농도(A₂₈₀)의 백분율로 계산하였다(도 14). 세포내 조침전물로부터 SOD 프로인슐린 혼성 폴리펩티드의 폴딩은 상기 시험의 시작에서부터 약 4.5시간에서가 최적이라는 것이 나타났다.An improved method for enzymatic conversion and folding of the proinsulin hybrid polypeptide to insulin is carried out by using a crude intracellular precipitate, thus requiring the need for an initial purification step as described in section IV of Example 2 Removed. Insulin was efficiently produced after enzymatic digestion of the folded and disulfide coupled proinsulin hybrid polypeptides with trypsin and carboxypeptidase B (Figure 14 and Table 3). Yield of insulin was calculated as a percentage of initial protein concentration (A ₂₈₀ ) at pH 12 as determined in the precipitate dissolution step (FIG. 14). The folding of SOD proinsulin hybrid polypeptides from intracellular precipitates has been shown to be optimal at about 4.5 hours from the start of the test.

표 3에서는 45의 0.D.₆₆₀에서 1리터 발효 배양물로부터 제조된 세포내 조침전물로부터 플라스미드 pBAST-LAT에 의해 발현된 상기 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터의 인슐린의 부분 정제를 요약하고 있다. 용해와 폴딩은 도 14에 설명된 바와 같이 실행되었다. 용해된 다음부터 4.5시간 뒤에, 폴딩되고 디설파이드 결합된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드를 포함하는 상기 폴딩된 벌크 용액을 pH 8.8까지 진한황산으로 적정했다. ZnCl₂(최종 농도 50μM까지), 카르복시펩티다제 B(1:4000 w/w)와 트립신(1:6000 w/w)을 첨가했다. 3시간 동안 37℃에서 소화시키고 페닐메틸술포닐플루오리드(PMSF)를 최종 농도 0.5mM까지 첨가함로서 종결시켰다. HPLC에 의한 분석(도 9에서 설명된 바와 같이)은 169mg의 인슐린 수율을 나타내었다. 인슐린을 일련의 음이온 교환 단계와 소수성 크로마토그래피 단계에 의해 정제시켰다. 소화된 폴딩 혼합물을 수지 1ml당 약 50 A₂₈₀단위(units)에서 20mM Tris-HCl, 10mM NaCl pH 8 완충액에서 미리 평형화시킨 DEAE 세파로스 페스트 플로우(파마시아)컬럼상에 적하시켰다. 결합된 물질(bound material)을 20mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH 8 완충액으로 세척하고 인슐린을 동일한 완충액에서 250mM NaCl로 용출시켰다. 인슐린을 포함하는 풀 분획(pool fractions)은 적하된 단백질 20%를 나타내고 순도 37.1%를 가진다. 암모니움 설페이트를 DEAE 용출 풀에 410mM 농도까지 첨가하고 수지 1ml당 약 12 A₂₈₀단위로 20mM Tris-HCl, 540mM 암모니움 설페이트에서 미리 평형화시킨 페닐 세파로스 페스트 플로우 칼럼상에 적하시켰다. 결합된 물질을 평형 완충액으로 세척하고 인슐린을 20mM Tris-HCl, 220mM 암모니움 설페이트, pH 8인 완충액으로 용출시켰다. 인슐린을 포함하는 분획은 적하된 단백질 42.3%를 나타내고 순도 74.1%를 가진다. 상기 부분 정제법의 결과로, 표준 인슐린과 동일한 인슐린 120mg을 생산했다. 이는 인슐린의 수율 5.16%에 해당한다. 인슐린의 추가 정제를 겔 여과, RP-HPLC 그리고 결정화(17) 등의 종래 방법을 사용하여 실행할 수도 있다.In Table 3, 0.D. Partial purification of insulin from the proinsulin hybrid polypeptides expressed by plasmid pBAST-LAT from intracellular crude precipitate prepared from 1 liter fermentation culture at ₆₆₀ is summarized. Dissolution and folding were performed as described in FIG. 14. 4.5 hours after dissolution, the folded bulk solution comprising the folded and disulfide bonded proinsulin hybrid polypeptide was titrated with concentrated sulfuric acid to pH 8.8. ZnCl ₂ (to a final concentration of 50 μM), carboxypeptidase B (1: 4000 w / w) and trypsin (1: 6000 w / w) were added. Digestion at 37 ° C. for 3 hours was terminated by addition of phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) to a final concentration of 0.5 mM. Analysis by HPLC (as described in FIG. 9) showed an insulin yield of 169 mg. Insulin was purified by a series of anion exchange steps and hydrophobic chromatography steps. The digested folding mixture was loaded onto a DEAE Sepharose Fest Flow (Pharmacia) column previously equilibrated in 20 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl pH 8 buffer at about 50 A ₂₈₀ units per ml of resin. Bound material was washed with 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8 buffer and insulin eluted with 250 mM NaCl in the same buffer. Pool fractions containing insulin represent 20% loaded protein and have a purity of 37.1%. Ammonium sulfate was added to the DEAE elution pool to a concentration of 410 mM and loaded onto a phenyl sepharose fest flow column previously equilibrated in 20 mM Tris-HCl, 540 mM Ammonium sulfate at about 12 A ₂₈₀ units per ml of resin. The bound material was washed with equilibration buffer and insulin eluted with 20 mM Tris-HCl, 220 mM ammonium sulfate, pH 8 buffer. The fraction containing insulin represents 42.3% of the loaded protein and has a purity of 74.1%. As a result of this partial purification, 120 mg of insulin, which is equivalent to standard insulin, was produced. This corresponds to a 5.16% yield of insulin. Further purification of insulin may be carried out using conventional methods such as gel filtration, RP-HPLC and crystallization 17.

[표 3]TABLE 3

플라스미드 pDBAST-LAT에 의해 발현된 프로인슐린 혼성 폴리펩티드로부터의세포내 조침전물의 용해, 폴딩 및 트립신과 카르복시펩티다제 B 효소처리에 의한 재조합 인간 인슐린의 정제Purification of Recombinant Human Insulin by Lysis, Folding, and Treatment of Trypsin and Carboxypeptidase B Enzymes of Intracellular Precipitates from Proinsulin Hybrid Polypeptides Expressed by Plasmid pDBAST-LAT

A₂₈₀은 각 정제단계에서 280 nm에서의 총 흡광도를 나타낸다. 인슐린 존재는 도 9에 나타난 것과 같이 표준 인슐린과 비교하는 HPLC 분석에 의해 측정되었으며 표준 인슐린의 주요 인슐린 피크에 해당한다.A ₂₈₀ represents the total absorbance at 280 nm in each purification step. Insulin presence was determined by HPLC analysis comparing to standard insulin as shown in FIG. 9 and corresponds to the major insulin peak of standard insulin.

참조 문헌Reference

인슐린은 글루코스 대사의 조절에 필수적인 폴리펩티드 호르몬으로, 본 발명은 재조합 인간 인슐린을 제조하는 개선되고 효율적인 공정을 제공한다.Insulin is a polypeptide hormone essential for the regulation of glucose metabolism, and the present invention provides an improved and efficient process for producing recombinant human insulin.

Claims (12)

(a) 혼성 폴리펠티드를 암호화하는 DNA를 함유하는 박테리아 세포를 처리하여 DNA가 혼성 폴리펩디드의 발현을 지시하게 하고 박테리아 세포로부터 혼성 폴리펩티드를 회수함으로써 프로인슐린을 포함하는 혼성 폴리펩티드를 수득하는 단계;(a) treating a bacterial cell containing DNA encoding the hybrid polyfelt to direct the expression of the hybrid polypeptide and recovering the hybrid polypeptide from the bacterial cell to obtain a hybrid polypeptide comprising proinsulin ; (b) 수득된 혼성 폴리펩티드에 술피톨리시스(sulfitolysis)공정 또는 CNBr 절단을 우선 실행하지 않고 정확한 디설파이드 결합 형성을 얻기 위해 상기 혼성 폴리펩티드를 4-37℃에서 1-30 시간동안 8.5-12.0 범위의 pH로 인큐베이션하는 것을 포함하는 폴딩 조건으로 폴딩하는 단계;(b) in order to obtain accurate disulfide bond formation without first performing a sulfitolysis process or CNBr cleavage on the obtained hybrid polypeptide, the hybrid polypeptide was in the range of 8.5-12.0 for 1-30 hours at 4-37 ° C. folding to a folding condition comprising incubating to pH; (c) 결과 생성된 폴딩되고 디설파이드 결합된 혼성 폴리펩티드를 효소분해하여 인슐린을 제조하는 단계; 및(c) enzymatically digesting the resulting folded and disulfide coupled hybrid polypeptide to produce insulin; And (d) 제조된 인슐린을 정제하는 단계를 포함하는 인슐린 제조방법.(d) purifying the prepared insulin. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 인큐베이션을 아스코르브산의 존재하에서 수행하는 인슐린 제조방법.A method of making insulin, wherein incubation is carried out in the presence of ascorbic acid. 제1항 또는 제2항에 있어서,The method according to claim 1 or 2, 상기 pH는 11.0-11.25인 인슐린 제조방법.The pH is 11.0-11.25 insulin production method. 제2항에 있어서,The method of claim 2, 상기 아스코르브산의 농도는 폴딩 혼합물에 존재하는 SH기 1몰 당 약 2몰인 인슐린 제조방법.Wherein the concentration of ascorbic acid is about 2 moles per mole of SH groups present in the folding mixture. 제1항 또는 제2항에 있어서,The method according to claim 1 or 2, 상기 인큐베이션 시간이 5시간인 인슐린 제조방법.Insulin production method is the incubation time is 5 hours. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 (c) 단계의 효소분해가 i) pH를 8.8-9.0로 조절하고 ii) 혼성 폴리펩티드를 트립신과 카르복시펩티다아제 B로 16-37℃에서 30분 내지 16시간동안 분해하는 것을 더 포함하는 인슐린 제조방법.The enzymatic digestion of step (c) further comprises i) adjusting the pH to 8.8-9.0 and ii) degrading the hybrid polypeptide with trypsin and carboxypeptidase B at 16-37 ° C. for 30 minutes to 16 hours. . 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 단계 (d)의 정제가 i) DEAE-세파로스 크로마토그래피와 RP-HPLC; ii) 한외여과와 CM-세파로스 크로마토그래피 및 iii) DEAE-세파로스 크로마토그래피와 페닐-세파로그 크로마토그래피로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 수단에 의해서 행해지는 인슐린 제조방법.Purification of step (d) comprises i) DEAE-Sepharose chromatography and RP-HPLC; ii) ultrafiltration and CM-sepharose chromatography, and iii) a method selected from the group consisting of DEAE-sepharose chromatography and phenyl-sephalog chromatography. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 프로인슐린 혼성 폴리펩티드가 i) ATCC 수탁 번호 69361로 기탁된 플라스미드 pDBAST-LAT; ii) ATCC 수탁 번호 69363으로 기탁된 플라스미드 pλ BAST-LAT 및 iii) ATCC 수탁 번호 69362로 기탁된 플라스미드 pBAST-R로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 플라스미드에 의해 발현되는 인슐린 제조방법.I) the plasmid pDBAST-LAT wherein the proinsulin hybrid polypeptide is deposited with ATCC accession number 69361; ii) a method for preparing insulin expressed by a plasmid selected from the group consisting of plasmid pλ BAST-LAT deposited with ATCC accession number 69363 and iii) plasmid pBAST-R deposited with ATCC accession number 69362. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 단계 (a)에서의 처리가 글루코오스, 글리세롤 또는 갈락토오스 존재하에서의 발효를 포함하는 인슐린 제조방법.A process for producing insulin, wherein the treatment in step (a) comprises fermentation in the presence of glucose, glycerol or galactose. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 회수가 i ) 박테리아 세포의 세포벽 또는 그의 절편을 파괴하여 용해물(lysate)을 제조하고;The method of claim 1, wherein the recovery in step (a) comprises: i) disrupting the cell wall or fragment thereof of the bacterial cell to prepare a lysate; ii) 원심분리에 의해 상기 용해물로부터 세포내 침전물을 분리하며;ii) separating intracellular precipitate from the lysate by centrifugation; iii) 상기 침전물을 가용화하는 것을 포함하는 인슐린 제조방법.iii) a method of making insulin comprising solubilizing the precipitate. 프로인슐린 및 프로인슐린의 N-말단에 부착된 리더 펩티드를 포함하는 혼성 폴리펩티드로써, 상기 폴리펩티드는 폴딩되어 정확한 디설파이드 결합을 함유하고 상기 프로인슐린은 인슐린 A-사슬에 i) 단일 아르기닌 잔기 또는 ii) 리신-아르기닌 디펩티드에 의해 공유결합적으로 부착된 인슐린 B-사슬을 포함하는 혼성 폴리펩티드.A hybrid polypeptide comprising a proinsulin and a leader peptide attached to the N-terminus of the proinsulin, wherein the polypeptide is folded to contain the correct disulfide bond and the proinsulin is in the insulin A-chain i) a single arginine residue or ii) lysine A hybrid polypeptide comprising an insulin B-chain covalently attached by an arginine dipeptide. 프로인슐린 및 프로인슐린의 N-말단에 부착된 리더 펩티드를 포함하는 혼성폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 폴딩되어 정확한 디설파이드 결합을 함유하고리더 펩티드의 시스테인 잔기는 세련 잔기에 의해 대체되어진 혼성 폴리펩티드.A hybrid polypeptide comprising a proinsulin and a leader peptide attached to the N-terminus of the proinsulin, wherein the polypeptide is folded to contain the correct disulfide bond and the cysteine residue of the leader peptide is replaced by a refinement residue.

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