KR100368686B1

KR100368686B1 - 수크로즈를이용한세포와바이러스의분리방법

Info

Publication number: KR100368686B1
Application number: KR1019940038598A
Authority: KR
Inventors: 김순하; 박복련; 김정민
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1994-12-29
Publication date: 2003-12-01
Also published as: KR960023047A

Abstract

본 발명은 수크로즈를 이용한 원형 세포의 제거 방법에 관한 것으로, 감염세포 파쇄후 파쇄액의 원심분리시 파쇄액중의 수크로즈 농도보다 2 내지 5 배 높은 농도의 수크로즈 쿠션을 사용함으로써 바이러스 활성은 감소하지 않고 원형 세포를 완전히 제거하여 순수한 세포외 바이러스를 효과적으로 분리할 수 있다.

Description

수크로즈를 이용한 세포외 바이러스의 분리 방법{METHOD FOR ISOLATING CELL-FREE VIRUS USING SUCROSE}

본 발명은 수크로즈를 이용한 세포외 바이러스의 분리 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 파쇄후 원심 분리시 수크로즈를 이용하여 원형 세포를 완전히 제거함으로써 바이러스, 특히 수두 바이러스 감염 세포로부터 세포외 수두 바이러스를 순수하게 분리하는 방법에 관한 것이다.

흔히 '물마마'로 불리우는 수두(chicken pox)는 헤르페스 바이러스와 일종으로 200 nm의 크기를 갖는 DNA 바이러스인 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus, 이하 "VZV"로 칭함)에 의해서 어린이나 면역성이 약화된 노약자 또는 환자에게 발병하는, 매우 전염성이 강하고 계절적 요인의 영향을 받는 바이러스성 질환이다. 상기 VZV에 감염된 후 14 일 정도가 지나면 감기 증상과 매우 유사하게 열이 발생하고 전신에 반점 형태의 발진이 나타나서 결국 여드름 형태로 발전하여 '낭'을 형성하게 되는데 심한 경우 치명적인 흉터를 남기게 된다.

VZV는 1차 감염 부위인 호흡계에서 주로 증식이 시작되어 혈액으로 흘러나와 림프선으로 이동, 확산되어 1차 비레미아(viremia) 현상을 나타낸다. 비레미아 현상이란 혈액중에 바이러스가 존재하는 바이러스혈중을 말하는 것으로 보통 병감(病感), 발열, 배부통(背部痛) 및 사지통(四脂痛)을 특징으로 한다. VZV는 세포성 면역반응이 약화되거나 결핍되면 다음 단계인 세망내피계(reticulo endothelial system)로 이동하여 피부에서 본격적인 다증식이 이루어지고 폐와 간으로까지 확대되어 2차 비레미아 현상을 나타낸다. 일반적으로 정상인의 경우, 이와 같은 2차 비레미아 현상은 세포성 또는 체액성 면역 방어 기작에 의해 3일내에 사라진다. 특히, 세포성 면역 반응이 수두 바이러스의 억제에 보다 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 2차 비레미아 현상은 사라지더라도 감염후 2 주일이 지나면 바이러스는 면역 방어망을 피해 뇌의 신경절 세포속으로 침투하여 신경세포 주위를 감싸고 있는 위성 세포(satellite cell)에 잠복하는데, 숙주의 세포성 면역반응에 의해 오랫동안 바이러스 증식이 억제되어 숙주 세포에 손상을 주지 않고 본격적인 잠복기에 들어가게 된다. 이와 같은 잠복 상태에 있는 바이러스의 재활성화는 체액성 면역 반응에 의해서는 막을 수 없으며 세포성 면역 반응에 의해서만 가능하다. 즉, 세포성 면역 기작에 의해 여러 사이토카인이 유도되어 바이러스에 감염된 신경 세포에 결합함으로써 바이러스 증식을 억제하게 된다. 한편, 바이러스 증식을 억제할 수 없을 정도로 세포성 면역성이 현저히 저하된 노년층 또는 환자의 경우, VZV에 대한 특이 항체가 존재하더라도 VZV는 재활성화되어 신경절 세포에서 다증식이이루어지므로 상기와 같이 잠복되는 과정의 역순에 의해 피부로 다시 이동, 확산되어 대상포진(herpes zoster)을 야기한다[H. John et al., Virol. 5, 241(1991);and D.G. Lawrence et al., Virology, 2, 2011-2054(1990)].

이와 같이 신경절 세포에서 재활성화된 VZV는 1차 수두성 폐렴과 같은 수두성 질병에 걸려 있는 환자의 경우, 보다 심각한 증상을 야기한다. 1차적으로 떨림, 근육저긴장증(마비), 급성 소뇌퇴행과 같은 중앙신경계 이상이 나타나며 극히 일부이기는 하지만 뇌출혈, 말초 혈관 원형세포 침윤 등으로 더욱 심화되어 신경염이나 뇌척수염으로 발전, 결국 사망에 까지 이르게 하는 치명적인 질환이 되기도 한다. 미국의 경우 1 년에 400 만명 정도의 수두 환자와 120 만명 정도의 대상포진 환자가 발생하여 매년 100 명 이상이 수두성 복합 질환에 의해 사망하며, 특히 백혈병 환자와 같이 면역억제제를 투여해야 하는 경우 더욱 치명적인 것으로 보고되고 있다[G. Fleisher et al., Am. J. Dis. Child., 135, 896(1981); R.P. Stephen et al., Pediatrics, 68, 14(1981); and P.A. Patel et al., Pediatrics, 94, 223(1979)].

현재 이러한 VZV를 억제할 수 있는 치료제로서 비다라빈(Vidarabine, Adenosine arabinoside), 아사이클로비르(Acyclovir) 등이 개발되어 있으나 강한 독성으로 인해 신장이나 뇌의 중앙신경계에 심한 부작용을 일으키기 때문에 이들을 이용한 치료는 매우 제한적이다[T.H. Weller et al., New England J. Med., 309, 1434(1983)]. 따라서, 예방차원의 수두 백신 개발은 필수적이라 할 수 있으며, 지금까지 수두성 질환을 예방하기 위한 많은 연구가 이루어져 왔다. 그러나, 이러한종래의 연구작업은 고전적인 생 수두 백신(live attenuated vaccine)을 이용한 것일 뿐 고도의 유전 공학 기술을 이용한 재조합 백신을 사용하는 것은 아니다. 생 수두 백신은 1975년 일본 오사카 대학의 다카하시(Takahashi) 그룹에 의해 처음 개발되어[M. Takahashi et al., Biken J., 18, 25(1975)] 바이켄(Biken)사에서 제품 생산(Oka strain)을 하고 있다. 미국의 경우 머크(Merck)사가 개발한 수두 백신(KMcC strain)을 면역 억제 환자에 제한적으로 사용하여 왔으며, 1994년 초에 일본 바이켄사로부터 특허권을 양도받아 FDA 승인(Oka/Merck strain)을 받음으로써 그의 안전성 및 유효성이 입증되어 수두 질환 예방에 많은 기여를 할 것으로 예상된다.

또한, 최근의 몇몇 흥미로운 보고에 의하면, 일반적으로 노년층에 많이 발병하는 것으로 알려진 대상포진은 세포성 면역반응의 약화에 의한 바이러스의 재활성화에 기인하기 때문에 생 수두 백신을 접종함으로써 면역성을 재자극하여 노년층의 대상포진 발병을 예방할 수 있다고 한다[S.A. Plotkin et al., Science, 265, 1383(1994)]. 상기 수두 백신은 접종후 5일이내에 세포성 면역반응이 일어나고 7일 이내에 중화항체가 만들어진다. 수두 바이러스에 자연 감염된 경우, 바이러스는 1차 감염 부위에서 7일 정도 증식된 후 몸 전체로 퍼져 나가기 때문에, 감염 후라도 5일 이내에만 백신 접종을 하면 수두를 치료할 수 있는 치료제로서의 가능성도 있는 것으로 보고되어 있어[M. Takahashi et al., Postpraduate Med. J., 61, 37(1985); and Y. Asano et al., Biken, J., 25, 43(1982)], 향후 수두 백신 시장은 더욱 커질 것으로 전망된다.

한편, VZV는 1986년 데이비슨(A.J. Davison)에 의해 그의 DNA 서열이 완전히 밝혀진[A.J. Davison et al., J. Gen. Virol., 67, 1759(1986)] 이후 이에 대한 연구가 본격적으로 진행되고 있다. VZV는 gA, gB 및 gC의 3개 유전자에 의해 만들어지는 6개의 주요 당단백질(gPI-gPV, IE-62)을 바이러스 막 표면에 지니고 있으며, 특히 gpI 및 gPIV가 VZV에 대한 특이 중화 항체를 만들 수 있어 재조합 백신으로서의 가능성이 있기 때문에[A. Vafai et al., Vaccine, 11, 937(1993)] 많은 연구가 진행 중이다. 세포 배양 시스템을 이용한 VZV의 증식 방법은 예를 들어 인간 양막(amnion) 세포, 인간 갑상선(thyroid) 세포, 인간 태아 폐(embryo lung) 세포, 인간 자궁암(cervix, hela) 세포 및 원숭이 신장(kidney) 세포와 같은 여러 세포들에서 가능한 것으로 보고된 바 있으며[E.V. Meurisse et al., J. Microbiol., 2, 317(1969)], 백신 개발시에는 인간 이배체 세포가 적합하기 때문에 각 회사들은 고유 세포주를 개발하여 백신 개발에 응용하고 있는 것이 현재의 추세이다.

상기와 같은 VZV는 세포-의존성 성질을 가지고 있어[M.C. Cook et al., J. Virol., 2, 1458(1968)] 세포 밖에서는 바이러스 활성이 극히 미미하기 때문에 활성을 제대로 지니는 안정화된 세포외 바이러스를 대량으로 얻을 수 있는 방법의 확립, 및 세포배양 시스템을 이용하여 VZV를 대량으로 증식시킬 수 있는 고도의 세포배양 기술의 개발이 수두 백신 개발에 있어 가장 중요한 요인이라 할 수 있다.

특히, 백신 개발을 위해서는 안정화된 세포외 수두 바이러스의 생산이 필수적이므로 지금까지 수두 바이러스를 안정화시키기 위한 많은 연구가 활발히 진행되어 왔다. 세포외 수두 바이러스를 얻기 위한 방법으로, 예를 들면 초음파 파쇄[C.Grose et al., Infection and Immunity, 19, 199(1978);N.J. Schmidt et al., Infection and Immunity, 14, 709(1976); and C. Grose et al., J. Gen. Virol., 43, 15(1979)], 유리구슬 파쇄, 세포 균질 파쇄 등의 방법이 보고되어 있으나 이들 중 초음파 파쇄가 가장 효과적인 것으로 알려져 있다. 수두 바이러스를 안정화시키기 위한 안정제로서는 감염 세포 파쇄시 5 내지 7.5 %의 수크로즈[M.R. Hilleman et al., 미국 특허 제 4,000,256 호(1975); K. Takahashi et al., 미국 특허 제 3,985,615 호(1975); 및 Nathan Zygraich et al., 미국 특허 제 3,915,794 호(1973)] 또는 5 % 솔비톨[D'Hondt Erik et al., 유럽 특허 제 0,252,059 A2 호(1987); C. Grose et al., J. Gen. Virol., 43, 15(1979)]을 주로 사용하였다.

수두 백신 개발에 있어 또 다른 중요한 요인중의 하나는 감염 세포 파쇄후 파쇄되지 않은 원형 세포가 바이러스 부유 원액 중에 남아 있지 않도록 하는 것이다(WHO 자료, 생수두 바이러스 요건, pp 102-133; 대한민국 기시법, 수두 생바이러스 백신 pp 219-223). 지금까지 바이러스 부유액을 얻기 위한 방법으로는 원심분리[K. Takahashi et al., 미국 특허 제 3,985,615 호(1975); C. Grose et al., J. Gen. Virol., 43, 15(1979)] 및 여과[M.R Hilleman et al., 미국 특허 제 4,000,256 호(1975); Nathan Zygraich et al., 미국 특허 제 3,915,794 호(1973)]와 같은 방법이 주로 알려져 있다.

그러나, 본 발명자들이 상기 여과 및 원심분리 방법을 이용하여 바이러스 부유액을 분리하는 실험을 수행한 결과, 여과에 의해서는 양호한 결과를 얻을 수 없었고 원심분리를 이용한 경우에는 바이러스 부유액과 침전물의 경계가 명확하지 않아 부유액 만을 회수하는 과정에서 침전물의 일부가 섞여 침전물 속에 존재하는 파쇄되지 않은 원형세포가 부유액속에 함유되는 문제가 발생하였다.

이에, 본 발명자들은 감염 세포 파쇄시 파쇄되지 않은 원형세포의 효과적인 제거 방법을 찾기 위해 연구를 거듭하던 중, 감염 세포 파쇄시 적당한 농도의 수크로즈를 사용하면 세포외 수두 바이러스를 효과적으로 안정화시킬 수 있음을 확인하고, 세포 파쇄액을 원심분리시 파쇄액중의 수크로즈 농도보다 높은 농도의 수크로즈 쿠션(cushion)을 이용함으로써 파쇄되지 않았거나 덜 파쇄된 원형세포를 효과적으로 제거하여 세포외 바이러스를 순수하게 분리할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 바이러스 감염 세포로부터 원형세포를 효과적으로 제거하여 세포외 바이러스를 순수하게 분리하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 바이러스 감염 세포를 파쇄한 후 파쇄액을 원심분리하여 바이러스 감염 세포로부터 세포외 바이러스를 분리하는 방법에 있어서, 상기 원심분리를 파쇄액중의 수크로즈 농도보다 높은 농도의 수크로즈 쿠션을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 세포외 바이러스 분리 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 바이러스에 대한 숙주세포로서 본 출원인이 인간 태아의 폐조직으로부터 1차 배양하여 자체 개발한 인간 태아 폐섬유 세포(human embryonic lung fibroblast, 이하 'LBHEL'로 칭함; 1994년 11월 9일 한국 과학 기술 연구원부설 유전 공학 연구소 유전자 은행에 기탁 번호 제 KCTC 0127BP 호로 기탁됨)를 사용하고, 바이러스 세포주로서는 Varicella Oka 균주(ACTC VR-795, Lot No. 6w)를 사용한다.

본 발명에 따라 수두 바이러스에 감염된 세포로부터 수크로즈 쿠션을 이용하여 세포외 수두 바이러스를 순수하게 분리하는 과정은 다음과 같다.

먼저, 상기 LBHEL 세포를 5% FBS(GIBCO BRL 16000-028) 및 ABAM(antibiotic-antimycotic, GIBCO BRL 15240-013)을 함유하는 DMEM (GIBCO BRL 12800-082) 배지를 사용하여 배양 플라스크(T 80, Nunc 178905, 80 cm²) 또는 다층 배양판(CF-10, Nunc 164327, 6000 cm²)에 배양한다. 37 ℃의 배양 온도 및 5%의 CO₂농도를 유지하면서 배양기(Nuaire TM)에서 일정시간 동안 배양하여 세포 단층을 형성시킨 후, 인산염 완충용액(D-PBS, GIBCO BRL 450-1600 EA)으로 3회 세척하고 적당량의 바이러스 감염 세포를 접종시킨다. 상기 배양조건에서 약 48 시간 동안 배양하여 세포 병변 효과(cytopathic effect)가 50 내지 75 %에 이르렀을 때 상기 인산염 완충용액으로 다시 3회 세척하고 0.02% EDTA(GIBCO BRL 890-12661M) 용액으로 처리하여 배양기에서 10분간 정치시킨 후 감염 세포를 수확한다.

이어서, 수확한 감염 세포를 세포 파쇄 용액으로서 SPGA(pH 7.2, 7.5-37.5 %(w/v) 수크로즈, 0.0038 M 인산칼륨(1 염기), 0.0072 M 인산칼륨(2 염기), 0.0049 M 나트륨 글루타메이트, 0.2 % EDTA, 및 1%(w/v) 인간 혈청 알부민 함유)에 T 80 플라스크당 1 ㎖ 씩 가하여 세포 현탁액을 만든 다음, 초음파 세포 파쇄기(Bransonsonifier 450)를 사용하여 원형 세포가 거의 보이지 않을 때까지 파쇄한다. 그런 다음, 상기 파쇄액을 파쇄 용액중의 수크로즈 농도보다 높은 농도의 수크로즈 용액과 혼합하여 4 ℃의 온도에서 1000 rpm의 속도로 10 분간 원심분리하여 수크로즈 쿠션층과 침전물은 버리고 바이러스 부유액만을 회수한다. 이때, 상기 수크로즈 쿠션액과 파쇄액의 부피비는 1:1 이상이 되도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 수크로즈 쿠션액은 단지 수크로즈의 농도만 높을 뿐 파쇄액과 동일한 구성성분으로 되는 것이 바람직하다.

다음으로, 감염 세포 활성(plaque forming cell, PFC)과 세포외 바이러스 활성(plaque forming unit, PFU)을 알아보기 위해, 직경 6.0 cm의 패트리 디쉬에 상기와 동일한 절차로 DMEM 배지를 사용하여 배양시킨 LBHEL 세포 단층을 PBS로 3회 세척한 후 적당량의 연속 희석된 감염 세포 및 바이러스 부유액을 접종한다. 상기에서와 같은 배양 조건하에 1 내지 2 시간 동안 배양한 후 3 % FBS 함유 DMEM 배지를 첨가하고 배양기에서 다시 7 내지 9일 동안 배양하여 100 배율 현미경(Nicon, TMS)으로 플라크 수를 세어 감염세포와 바이러스 부유액의 바이러스 활성을 계산한다. 이때 실험의 오차를 줄이기 위해 각 샘플 당 3회 반복하여 수행한다.

상기 실험 결과, 감염 세포를 초음파 파쇄한 후 파쇄액을 파쇄 용액중의 수크로즈 농도보다 2 내지 5 배 높은 농도의 수크로즈 용액(15 내지 37.5 % 용액)과 혼합하여 수크로즈 쿠션을 이용하여 원심분리할 경우 세포외 바이러스 활성은 감소되지 않고 파쇄되지 않거나 덜 파쇄된 원형세포를 효과적으로 제거할 수 있는 것으로 나타났다.

본 발명에 따른 감염세포 파쇄액으로부터 수크로즈 쿠션을 이용한 원형세포의 제거방법은 수두 바이러스 뿐 아니라 다른 바이러스의 분리에도 적용될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하겠지만, 이들 실시예는 단지 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위가 이로 한정되는 것은 아니다.

실 시 예 1 : 숙주 세포의 배양 및 수확

5% FBS 및 ABAM을 함유하는 DMEM(GIBCO BRL 12800-082) 배지를 사용하여 T 80 플라스크(Nunc 178905, 80 cm²) 또는 다층 배양판(CF-10, Nunc 164327, 6000 cm²)에 숙주 세포로서 인간 태아 폐섬유 세포(LBHEL, 기탁 번호 제 KCTC 0127BP 호)를 37 ℃에서 5 % CO₂의 존재하에 3 내지 5 일동안 배양하였다. 세포가 단층을 형성하면 PBS로 3회 세척하여 0.25 %의 트립신 용액(GIBCO BRL 15090-012)으로 처리하고 약 2 내지 3 분후에 세포를 수확하였다. 수확된 세포를 1000 rpm으로 3분간 원심분리하여 침전된 세포를 20 % FBS 함유 10 % 글리세롤 용액중에서 -180 ℃로 보관하고 필요시 사용하였다.

실 시 예 2 : 접종용 바이러스(seed 바이러스)의 배양

수두 바이러스로서 Varicella Oka 균주(ATCC VR-795, Lot No. 6w)를 사용하여 실시예 1 의 방법으로 미리 제조한 LBHEL 세포 단층에 상기 바이러스를 접종하고 2 내지 3 일 동안 배양한 후 PBS 로 3 회 세척한 다음 0.02 % EDTA 로 처리하여배양기에서 정치시키고 5 내지 10 분후에 감염 세포를 수확하였다. 동일한 방법으로 3회 바이러스 계대배양을 수행하여 바이러스를 증식시킨 후 실시예 1 에서와 같이 20 % FBS 함유 10 % 글리세롤 용액중에서 -180 ℃로 보관하고 필요시 접종용 바이러스로 사용하였다.

실 시 예 3 : 바이러스 배양 및 바이러스 부유액 분리

단계 1. 바이러스 접종 및 감염 세포의 수확

실시예 1 과 동일한 방법으로 준비한 LBHEL 세포 단층을 PBS로 3회 세척한 후 실시예 2 에서 준비한 바이러스 감염 세포의 접종액 2 ㎖ 씩을 분주하여 접종액의 바이러스 활성이 T 80 플라스크 당 100,000 내지 200,000 PFC가 되도록 접종시켰다. 접종한 지 1 내지 2시간 후에 3 % FBS를 함유하는 DMEM 배지를 첨가하고 배양기에서 48 시간동안 배양하여 50 내지 75 % 의 세포 병변 효과를 나타낼 때 PBS로 다시 3회 세척하고 0.02 % EDTA로 처리하였다. 5 내지 10분간 정치시킨 후에 1000 rpm으로 3분간 원심분리하여 감염세포를 수확하였다.

단계 2. 초음파 파쇄

상기 단계 1 에서 얻은 감염 세포로부터 세포외 바이러스를 분리하기 위해 초음파 파쇄를 실시하였다. 먼저, 상기 감염 세포를 파쇄용액인 SPGA(pH 7.2, 7.5-37.5 %(w/v) 수크로즈, 0.0038 M 인산칼륨(1 염기), 0.0072 M 인산칼륨(2 염기), 0.0049 M 나트륨 글루타메이트, 0.2 % EDTA, 및 1 %(w/v) 인간 혈청 알부민 함유)에 5 - 10 x 10⁶cells/㎖의 농도가 되도록 가하여 세포 현탁액을 만든 다음, 마이크로팁(T 80 플라스크의 경우) 또는 호른(다층배양판의 경우)을 사용하여 초음파 세포 파쇄기(Branson sonifier 450)로 원형 세포가 거의 보이지 않을 때까지 파쇄하였다. 이때 파쇄용액은 얼음 용기에 넣어서 차게 유지하였다.

단계 3. 원심분리

상기 단계 2 의 초음파 파쇄후 수득된 파쇄액 속에 남아 있는 원형 세포를 효과적으로 제거하는데 있어 원심분리시의 수크로즈 쿠션의 영향을 알아보기 위해 파쇄 용액중의 수크로즈 농도보다 각각 2배(15 %), 3배(22.5 %), 4배(30 %), 5배(37.5 %) 고농도의 수크로즈 용액과 세포 파쇄액을 혼합하여 4 ℃의 온도에서 1000 rpm의 속도로 10 분간 원심분리하여 각각의 수크로즈 쿠션층과 침전물은 버리고 바이러스 부유액만을 회수하였다. 또한, 파쇄 용액의 여러 수크로즈 농도에서도 수크로즈 쿠션에 의한 원형 세포 제거 효과가 있는지 알아보기 위해 다양한 수크로즈 농도의 파쇄 용액 및 상기 파쇄 용액중의 수크로즈 농도보다 7.5 % 더 높은 농도의 수크로즈 쿠션액을 사용하여 동일한 절차를 반복하였다.

실 시 예 4 : 바이러스 활성(감염성) 조사

직경 6.0 cm의 패트리 디쉬에 상기 실시예 1 과 동일한 방법으로 LBHEL 세포 단층을 형성시킨 후 PBS로 3회 세척하고, 실시예 3의 단계 3 에서 준비한 각 바이러스 부유액을 5회 연속 희석하여 감염 세포의 활성을 측정시에는 0.3 ㎖/디쉬, 세포외 바이러스의 활성을 측정시에는 0.1 ㎖/디쉬의 양으로 접종하였다. 30 분 내지 1 시간 동안 배양후 3 % FBS 함유 DMEM 배지를 첨가하고 7 내지 9 일후에 100 배율의 현미경으로 플라크 수를 세어 감염세포 활성(plaque forming cell, PFC)과 세포외 바이러스 활성(plaque forming unit, PFU)을 측정하여 결과를 하기 표 1 에 나타내었다. 이때, T 80 플라스크의 경우 감염 세포 활성은 3,132,000 PFC/T 80 이었고, 다층 배양판의 경우는 285,600,000 PFC/CF-10 으로 나타났다. 또한, 파쇄 용액중의 수크로즈 농도에 따라 수크로즈 쿠션의 영향을 알아보기 위해 파쇄 용액중의 수크로즈 농도를 변화시키면서 파쇄액중의 수크로즈 농도보다 7.5 % 높은 농도의 수크로즈 쿠션을 사용하여 동일한 절차를 반복하여 측정된 활성을 하기 표 2 에 나타내었다.

표 1

상기 표 1 에서 볼 수 있듯이, 원심 분리시 2 내지 5 배 농도의 수크로즈 쿠션을 사용함으로써 바이러스 활성의 감소없이 효과적으로 세포외 바이러스를 분리할 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 대량생산시에도 거의 동등한 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

표 2

상기 표 2 에서 보듯이, 파쇄 용액의 수크로즈 농도에 관계없이 파쇄 용액중의 수크로즈 농도보다 7.5 % 더 높은 농도의 수크로즈 쿠션을 사용함으로써 바이러스 활성에는 영향없이 세포외 바이러스를 효과적으로 분리할 수 있다.

실 시 예 5 : 원형세포의 존재 여부 확인

상기 실시예 3 의 단계 3 에서 수득된 바이러스 부유액중의 원형 세포의 존재 여부를 알아보기 위해서 100 배율의 현미경으로 관찰한 결과를 제 1 도에 나타내고, 바이러스 부유액을 3000 rpm으로 30 분간 원심분리한 후 얻어진 침전물에 부유액 부피의 1/50의 배지를 첨가하고 현미경으로 관찰하였다. 제 1 도에서 알 수 있듯이, 파쇄 용액의 수크로즈 농도보다 2 내지 5배 높은 농도의 수크로즈 쿠션을 사용하여 원심분리한 경우 바이러스 부유액 중에는 원형 세포가 전혀 존재하지 않고 침전물중으로 완전히 분리되었다. 또한, 상기 50 배 농축하여 관찰한 결과 수크로즈 쿠션을 사용하지 않은 경우에는 바이러스 부유액중 수백개 이상의 원형 세포가 존재한 반면, 2 내지 5 배의 수크로즈 쿠션을 사용한 경우에는 바이러스 부유액중 원형 세포가 전혀 관찰되지 않았다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 감염세포 파쇄후 파쇄액의 원심분리시 파쇄액중의 수크로즈 농도보다 2 내지 5 배 높은 농도의 수크로즈 쿠션을 사용함으로써 바이러스 활성은 감소하지 않고 원형 세포를 완전히 제거하여 순수한 세포외 바이러스를 효과적으로 분리할 수 있다.

제 1 도는 감염 세포 파쇄후 원심분리하여 얻어진 바이러스 부유액중의 원형 세포의 존재 유무를 100 배율 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

Claims

바이러스 감염 세포를 파쇄한 후 파쇄액을 원심분리하여 바이러스 감염 세포로부터 세포외 바이러스를 분리하는 방법에 있어서, 상기 원심분리를 파쇄 용액중의 수크로즈 농도보다 2 내지 5배 높은 농도의 수크로즈 쿠션을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 세포외 바이러스 분리 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 수크로즈 쿠션액의 구성성분이 세포 파쇄 용액과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 바이러스가 수두 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.