KR100363587B1 - Dendritic cell-cancer fusion hybrid for anti-cancer cellular vaccine - Google Patents
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Abstract
본 발명은 강력한 세포성 백신인 인체의 수상돌기세포를 이용한 종양 치료에 관한 것이다. 본 발명은 수상돌기세포가 보유하는 고유한 항원제공 능력을 임상과 치료에 이용 가능한 충분한 수의 수상돌기세포의 제조를 용이하게 하는 방법을 제공하는 바, 본 발명에 따른 수상돌기세포는 종양, 자가면역질환, 알레르기성 질환, 감염성 질환의 치료와 예방 백신의 전달 등에 유용하게 이용할 수 있다.The present invention relates to tumor treatment using dendritic cells of the human body, which are powerful cellular vaccines. The present invention provides a method for facilitating the production of a sufficient number of dendritic cells available for clinical and therapeutic use of the unique antigen-providing ability possessed by dendritic cells. It can be usefully used for the treatment of immune diseases, allergic diseases, infectious diseases and delivery of preventive vaccines.
Description
본 발명은 강력한 세포성 백신인 인체의 수상돌기세포를 이용한 종양 치료에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체의 면역기전을 활성화 시켜 질병으로부터 인체를 방어할 수 있는 수상돌기세포에 의한 종양의 면역치료방식에 관한 것이다.The present invention relates to a tumor treatment using dendritic cells of the human body, which is a powerful cellular vaccine, and more particularly, to immunotherapy of tumors by dendritic cells capable of activating the human immune mechanism to protect the human body from disease. It is about.
수상돌기 세포(dendritic cell; DC)는 골수에서 유래하며 현재 알려진 중에서도 가장 강력한 항원제공세포(APC)이며, 대식세포나 B 림프구와는 달리 T 림프구를 활성화시키는 필수적인 세포로, 혈액, 골수, 림프절, 피부, 중추 신경계 등 외부물질과 접촉이 빈번한 조직과 기관에 극소량으로 산재한 다양한 발달단계에 있는 세포군의 통칭이다(Steinman, R. M., Ann. Rev. Immunol. 9:271(1991); Schuler, G., and R. M. Steinman., J. Exp. Med. 186:1183(1997); Banchereau, J., and R. M. Steinman., Nature 392:245(1998)). 이 세포는 접촉과민 반응, 조직 이식 거부반응, 병원성 미생물에 대한 면역 반응에서 T 림프구를 활성화 시키는 등 일차 면역반응을 유도하는 면역반응의 시작세포로 여겨지고 있다(Banchereau, J., and R. M. Steinman., Nature 392:245(1998); Steinman, R. M., M. Pack, and K. Inaba., Immunol. Rev .156:25(1997); Bieber, T., Immunol. Today 18:311(1997); Sallusto, F., and A. Lanzavecchia., J. Exp. Med. 189:611(1999)). 종양부위에서 수상돌기 세포들이 발견되기도 하며(Chaux, P., A. Hammann, F. Martin, and M. Martin., Eur. J. Immunol. 23:2517(1993)), 종양에 침투한 수상돌기 세포가 발견되는 경우 예후(prognosis)가 좋다는 보고(Celluzzi, C. M., and J. L. D. Falo., J. Immunol .160:3081(1998))에서와 같이 종양억제나 퇴치에 있어서 수상돌기 세포의 중요성을 알 수 있다. 비록 완전하게 정의되지 않았으나 이들은 항원만을 제공하는 것이 아니라 T 림프구의 활성에 필요한 모든 보조 활성인자를 제공하고 있다. 이와 같이 수상돌기 세포가 면역반응을 조절하는데 중추적인 역할을 한다는사실을 고려한다면, 종양 치료 뿐만 아니라 T 세포 반응이 문제가 되는 알레르기성 질환, 자가면역질환, 감염성 질환 등의 여러 질환 및 백신개발 등에서 수상돌기 세포를 이용할 수 있다.현재 세계적으로 여러 연구소에서 수상돌기 세포를 이용한 cell-based 백신의 개발이 진행 중에 있으며, 대표적인 방법으로는 (a)종양세포의 종양 특이 단백질을 수상돌기 세포 배양액(culture media)에 투여하거나(Porgador, A., D. Snyder, and E. Gilboa., J. Immunol .156:2918(1996); Young, J. W., and K. Inaba., J. Exp. Med. 183:7(1996)), (b)종양 특이 펩타이드 항원을 수상돌기 세포 배양액에 투여하거나, (c)종양세포를 파괴한 후 이를 수상돌기 세포 배양액에 투여하거나, (d)종양특이항원의 유전자를 수상돌기 세포에 도입하는 등 종양특이 항원이 수상돌기 세포의 MHC 클래스 I 혹은 클래스II에 적재(loading)될 수 있는 여건을 조성하여 수상돌기 세포를 활용하는 방안과, (e)종양세포를 수상돌기 세포와 함께 배양하여 항원의 공유와 교환을 이룬 후 수상돌기 세포를 활용하는 방식 등이 있다(Celluzzi, C. M., and J. L. D. Falo., J. Immunol. 160:3081(1998)). 또한, (f)일부 혈액종양의 경우, 종양세포를 수상돌기 세포로 분화하도록 유도하여 종양세포 자체를 백신으로 이용하려는 시도가 있다(Santiago-Schwarz, F., D. L. Coppock, A. A. Hindenburg, and J. Kern., Blood 84:3054(1994); Cao, X., Y. Zhao, Y. Yu, Y. Wang, M. Zhang, W. Zhang, and J. Wang., Immunol. 95:141(1998); Grouard, G., M.-C. Rissoan, L. Filgueira, I. Durand, J. Banchereau, and Y.-J. Liu., J. Exp. Med. 185:1101(1997); Oehler, L., O. Majdic, W. F. Pickl, J. Stockl, E. Riedl, J. Drach, K. Rappersberger, K.Geissler, and W. Knapp., J. Exp. Med. 187:1019(1998); Choudhury, B. A., et al., Blood 93:780(1999)). 이러한 방식의 성공을 위해서 극복해야 할 과제는 첫째, 충분한 양의 수상돌기 세포를 확보하여야 하며, 둘째 앞서 언급한 (c)항을 제외하고는 종양특이 항원의 분리, 동정 그리고 유전자 합성 등의 까다롭고, 간혹 불가능한 전제 조건들을 충족 시켜야 한다는 것이다. 또한, 외부에서 주입되는 항원들의 대부분은 세포내 소화과정(endocytic pathway)을 거쳐 MHC 클래스 II에 의해 CD4+T 세포에게 제공되므로, 세포 내에서 생성되는 종양특이항원과 같은 세포 내부생성 항원이 CTL에게 제공되기 위해 이용하는 MHC 클래스 I 과정을 작동하기란 위에서 언급한 (a-c)항의 경우 이 문제점을 항상 내포하게 된다. 그리고 마지막으로 수상돌기 세포가 항원 제공 세포로서의 기능을 수행하기 위해서는 상당히 복잡한 분화과정을 겪어야 한다. 수상돌기 세포가 분화(또는 성숙)의 어느 단계에 있느냐에 따라 T 림프구를 만날 수 있는 장소인 림프절로의 이동 능력이 달라지고, 면역반응의 방향성도 결정되어 지기 때문이다. 경우에 따라서는 항원의 흡수 (endocytosis)와 처리(processing)의 기능과 보조활성인자의 발현 유무에 따라 면역체계의 활성화 대신 면역관용(tolerance)을 유도할 가능성이 있기 때문에 분화의 적절한 조절이 필요하다.Dendritic cells (DC) are derived from the bone marrow and are the most potent antigen-providing cells (APCs) known today, and unlike macrophages and B lymphocytes, are essential cells that activate T lymphocytes, including blood, bone marrow, lymph nodes, It is a collective name for cell groups in various stages of development, scattered in very small amounts in tissues and organs that are frequently in contact with external substances such as the skin and the central nervous system (Steinman, RM, Ann. Rev. Immunol. 9: 271(1991); Schuler, G., and R. M. Steinman., J. Exp. Med. 186: 1183(1997); Banchereau, J., and R. M. Steinman., Nature 392: 245(1998). These cells are thought to be the starting cells of immune responses that induce primary immune responses, such as contact hypersensitivity, tissue graft rejection, and activation of T lymphocytes in the immune response to pathogenic microorganisms (Banchereau, J., and R. M. Steinman., Nature 392: 245 (1998); Steinman, R. M., M. Pack, and K. Inaba., Immunol. Rev .156: 25 (1997); Bieber, T., Immunol. Today 18: 311 (1997); Sallusto, F., and A. Lanzavecchia., J. Exp. Med. 189: 611 (1999). Dendritic cells are sometimes found in tumor sites (Chaux, P., A. Hammann, F. Martin, and M. Martin., Eur. J. Immunol. 23: 2517 (1993)), prognosis is reported when dendritic cells infiltrate tumors (Celluzzi, C. M., and J. L. D. Falo., J. Immunol .160: 3081 (1998), the importance of dendritic cells in tumor suppression or eradication. Although not fully defined, they provide not only the antigen but also all the cofactors necessary for the activity of T lymphocytes. Considering the fact that dendritic cells play a pivotal role in regulating immune response, not only tumor treatment but also various diseases such as allergic disease, autoimmune disease, infectious disease and vaccine development, etc., where T cell response is a problem, etc. A dendritic cell is available. Currently, a number of research institutes are developing cell-based vaccines using dendritic cells worldwide. Representative methods include (a) dendritic cell culture for tumor-specific proteins of tumor cells. media) (Porgador, A., D. Snyder, and E. Gilboa., J. Immunol .156: 2918 (1996); Young, J. W., and K. Inaba., J. Exp. Med. 183: 7 (1996)), (b) administering tumor specific peptide antigens to dendritic cell cultures, (c) destroying tumor cells and then administering them to dendritic cell cultures, or (d) genes of tumor specific antigens. To utilize dendritic cells by creating conditions in which tumor-specific antigens can be loaded into MHC class I or class II of dendritic cells, such as by introducing into dendritic cells, and (e) receiving tumor cells. Cultured with dendritic cells to share and exchange antigens, and then utilize dendritic cells (Celluzzi, CM, and JLD Falo., J. Immunol. 160: 3081 (1998). In addition, (f) in the case of some blood tumors, there is an attempt to use tumor cells themselves as vaccines by inducing tumor cells to differentiate into dendritic cells (Santiago-Schwarz, F., DL Coppock, AA Hindenburg, and J.). Kern., Blood 84: 3054 (1994); Cao, X., Y. Zhao, Y. Yu, Y. Wang, M. Zhang, W. Zhang, and J. Wang., Immunol. 95: 141 (1998); Grouard, G., M.-C. Rissoan, L. Filgueira, I. Durand, J. Banchereau, and Y.-J. Liu., J. Exp. Med. 185: 1101 (1997); Oehler, L., O. Majdic, W. F. Pickl, J. Stockl, E. Riedl, J. Drach, K. Rappersberger, K. Geissler, and W. Knapp., J. Exp. Med. 187: 1019 (1998); Choudhury, B. A., et al., Blood 93: 780 (1999). The challenges to be successful for this approach are firstly to ensure that sufficient dendritic cells are secured, and secondly, with the exception of paragraph (c) above, it is difficult to separate and identify tumor-specific antigens and to synthesize genes. In some cases, it is necessary to meet the prerequisites that are sometimes impossible. In addition, most of the antigens injected externally through CD4 by MHC class II via the intracellular digestive process (endocytic pathway).+Since it is provided to T cells, the MHC class I process used to provide intracellular antigens, such as tumor-specific antigens produced in cells, to CTLs will always present this problem in the case of paragraph (ac) mentioned above. . And finally, dendritic cells must undergo quite complex differentiation in order to function as antigen-providing cells. This is because, depending on the stage of differentiation (or maturation) of the dendritic cells, the ability to move to the lymph node, a place where T lymphocytes can be met, and the direction of the immune response are determined. In some cases, proper regulation of differentiation is necessary because it may induce immunotolerance instead of activating the immune system depending on the function of endocytosis and processing of antigens and the presence of coactivators. .
수상돌기 세포의 수적인 제한이라는 문제를 해결할 수 있는 방법은 이미 여러 연구자들에 의해 밝혀져 있으며(Santiago-Schwarz, F., E. Belilos, B. Diamond, and S. E. Carsons., J. Leuk. Biol. 52:274(1992); Caux, C., C.Dezutter-Dambuyant, D. Schimitt, and J. Banchereau., Nature 360:258(1992); Peters, J. H., R. Gieseler, B. Thiele, and F. Steinbach., Immunol. Today 17:273(1996); Thurner, B., C. Roder, D. Dieckmann, M. Heuer, M. Kruse, A. Glaser, P. Keikavoussi, E. Kampgen, A. Bender, and G. Schuler., J. Immunol. Methods 223:1(1999)), 골수(Porgador, A., D. Snyder, and E. Gilboa., J. Immunol. 156:2918(1996); Reid, C. D. L., P. R. Fryer, C. Clifford, A. Kirk, J. Tikerpae, and S. C. Knight., Blood 76:1139(1990); Szabolcs, P., M. A. S. Moore, and J. W. Young., J. Immunol .154:5851(1995); Siena, S., M. Di Nicola, M. Bregni, R. Mortarini, A. Anichini, L. Lombardi, F. Ravagnani, G. Parmiani, and A. M. Gianni., Exp. Heamatol. 23:1463(1995); Galy, A., F. Morel, B. Hill, and B. P. Chen., J. Immunother. 21:132(1998)) 또는 제대혈(cord blood)(Min, Y. H., S. T. Lee, K. M. Choi, S. Y. Chong, H. O. Kim, J. S. Hahn, and Y. W. Ko., Yonsei Med. J. 39:328(1998); Bykovskaja, S. N., et al., J. Leuk. Biol. 63:620(1998))에서 분리한 CD34 양성 조혈세포, 말초 혈액의 대식 세포(Romani, N., D. Reider, M. Heuer, S. Ebner, E. Kampgen, B. Eibl, D. Niederwieser, and G. chuler., J. Immunol. Methods 196:137(1996); Chapuis, F., M. Rosenzwajg, M. Yagello, M. Ekman, P. Biberfeld, and J. C. Gluckman., Eur. J. Immunol. 27:431(1997); Goxe, B., N. Latour, J. Bartholeyns, J. L. Romet-Lemonne, and M. Chokri., Res. Immunol. 149:643(1998)), 구동화된(mobilized) CD34음성세포 (Choi, D., M. Perrin, S. Hoffmann, A. E. Chang, V. Ratanatharathorn, J.Uberti, K. T. McDonagh, and J. J. Mule., Clin. Cancer Res. 4:2709.29(1998)) 나 호중구(neutrophil)(Oehler, L., O. Majdic, W. F. Pickl, J. Stockl, E. Riedl, J. Drach, K. Rappersberger, K. Geissler, and W. Knapp., J. Exp. Med. 187:1019(1998)) 등으로부터 수상돌기 세포로의 분화를 유도하고 있다. 본 발명자들은 가장 손쉽게 구할 수 있는 말초 혈액(peripheral blood)의 대식세포(Romani, N., D. Reider, M. Heuer, S. Ebner, E. Kampgen, B. Eibl, D. Niederwieser, and G. chuler., J. Immunol. Methods 196:137(1996))를 이용하였다. 이들 배양된 수상돌기 세포들은 체내에 존재하는 수상돌기 세포와 동일한 혹은 유사한 특성(조직으로의 이동, 항원 제공 능력, 보조활성인자 발현 등)을 보유함으로써, 이들 세포의 임상 적용에 용이할 것으로 본다.Solutions to the number limitation of dendritic cells have already been identified by several researchers (Santiago-Schwarz, F., E. Belilos, B. Diamond, and S. E. Carsons., J. Leuk. Biol. 52: 274 (1992); Caux, C., C. Dezutter-Dambuyant, D. Schimitt, and J. Banchereau., Nature 360: 258 (1992); Peters, J. H., R. Gieseler, B. Thiele, and F. Steinbach., Immunol. Today 17: 273 (1996); Thurner, B., C. Roder, D. Dieckmann, M. Heuer, M. Kruse, A. Glaser, P. Keikavoussi, E. Kampgen, A. Bender, and G. Schuler., J. Immunol. Methods 223: 1 (1999)), bone marrow (Porgador, A., D. Snyder, and E. Gilboa., J. Immunol. 156: 2918 (1996); Reid, C. D. L., P. R. Fryer, C. Clifford, A. Kirk, J. Tikerpae, and S. C. Knight., Blood 76: 1139 (1990); Szabolcs, P., M. A. S. Moore, and J. W. Young., J. Immunol .154: 5851 (1995); Siena, S., M. Di Nicola, M. Bregni, R. Mortarini, A. Anichini, L. Lombardi, F. Ravagnani, G. Parmiani, and A. M. Gianni., Exp. Heamatol. 23: 1463 (1995); Galy, A., F. Morel, B. Hill, and B. P. Chen., J. Immunother. 21: 132 (1998)) or cord blood (Min, Y. H., S. T. Lee, K. M. Choi, S. Y. Chong, H. O. Kim, J. S. Hahn, and Y. W. Ko., Yonsei Med. J. 39: 328 (1998); Bykovskaja, S. N., et al., J. Leuk. Biol. 63: 620 (1998)), CD34 positive hematopoietic cells, macrophages of peripheral blood (Romani, N., D. Reider, M. Heuer, S. Ebner, E. Kampgen, B. Eibl, D. Niederwieser, and G. chuler., J. Immunol. Methods 196: 137 (1996); Chapuis, F., M. Rosenzwajg, M. Yagello, M. Ekman, P. Biberfeld, and J. C. Gluckman., Eur. J. Immunol. 27: 431 (1997); Goxe, B., N. Latour, J. Bartholeyns, J. L. Romet-Lemonne, and M. Chokri., Res. Immunol. 149: 643 (1998)), mobilized CD34 negative cells (Choi, D., M. Perrin, S. Hoffmann, A. E. Chang, V. Ratanatharathorn, J. Uberti, K. T. McDonagh, and J. J. Mule., Clin. Cancer Res. 4: 2709.29 (1998)) or neutrophils (Oehler, L., O. Majdic, W. F. Pickl, J. Stockl, E. Riedl, J. Drach, K. Rappersberger, K. Geissler, and W. Knapp., J. Exp. Med. 187: 1019 (1998)) and the like to induce differentiation into dendritic cells. The inventors have found that the most readily available peripheral blood macrophages (Romani, N., D. Reider, M. Heuer, S. Ebner, E. Kampgen, B. Eibl, D. Niederwieser, and G. chuler., J. Immunol. Methods 196: 137 (1996). These cultured dendritic cells have the same or similar characteristics as the dendritic cells present in the body (migration to tissues, antigen presenting ability, coactivator expression, etc.) and thus are expected to facilitate the clinical application of these cells.
본 발명자들은 종양에 대한 T 림프구 활성을 유도하기 위해 수상돌기 세포를 이용하는 방법을 시험 연구한 결과, 인체로부터 획득한 수상돌기세포의 전구체를 수상돌기세포로 분화 시키고 이들을 종양세포와 융합하여 종양환자에 투여하여 생체 내에서 종양 면역을 유도할 수 있었으며, 또한 수상돌기 세포를 종양세포와 공동 배양하거나, 종양 추출물을 수상돌기 세포 배지에 첨가하여 이들을 환자에게 투여하는 방법을 통하여 종양 면역을 유도할 수 있었고, 수상돌기 세포와 종양 세포 추출물(또는 종양 세포)을 공동 배양한 후, 시험관에서 종양환자의 T 림프구를 활성화한 다음 활성화된 상기 T 림프구를 환자에게 투여하는 어돕티브 트랜스퍼(Adoptive transfer) 방법을 통하여 종양면역을 유도할 수 있어 본 발명을 완성하게 되었다. 상기 방법들은 공통적으로 수상돌기 세포로 하여금 종양에 선택적인 면역 T 림프구를 활성화시킴으로써 종양의 면역치료를 할 수 있는 장점을 보유한다. 또한 수상돌기세포와 종양세포의 융합체(DCCH) 및 수상돌기세포/종양세포 근접 배양에 의한 백신 개발은 종양의 종류에 관계 없이 적용할 수 있다는 장점을 갖는다. 특히 세포 배양이 어렵거나 불가능 한 경우에도 종양 면역을 증강 시키는 효과를 보유하며, 수상돌기세포가 종양 환자로부터 유래하기 때문에 이들에 대한 GvHD와 같은 부작용이 나타나지 않는 효과가 있으며, 종양 항원의 검색과 치료 약제 구입과 같은 고도의 기술과 비용 부담이라는 단점을 동시에 극복할 수 있기 때문에 가장 안전하고 완벽한 치료 모델로 자리 잡을 수도 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 수상돌기세포를 이용하여 인체 면역체계를 자극하여 일차 종양 및 전이성 종양의 치료를 할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.The present inventors conducted a study on a method of using dendritic cells to induce T lymphocyte activity against a tumor. As a result, the precursors of dendritic cells obtained from the human body are differentiated into dendritic cells and fused with tumor cells to tumor patients. Tumor immunity could be induced in vivo by administration, and tumor immunity could be induced by co-culturing dendritic cells with tumor cells or by adding tumor extracts to dendritic cell media and administering them to patients. After co-culturing the dendritic cells and tumor cell extracts (or tumor cells), the patient activates the T lymphocytes of the tumor patient in vitro, and then administers the activated T lymphocytes to the patient through an adaptive transfer method. Tumor immunity can be induced to complete the present invention. These methods commonly have the advantage of allowing dendritic cells to immunoimmunize tumors by activating immune T lymphocytes selective for the tumor. In addition, vaccine development by fusion of dendritic cells and tumor cells (DCCH) and dendritic cells / tumor cells has the advantage that it can be applied regardless of the type of tumor. In particular, it has the effect of enhancing tumor immunity even if cell culture is difficult or impossible, and since dendritic cells are derived from tumor patients, there are no effects such as GvHD on them. Overcoming the disadvantages of high technology and cost, such as the purchase of drugs, can be a safe and complete treatment model. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for treating primary tumors and metastatic tumors by stimulating the human immune system using dendritic cells.
상기 수상돌기세포를 이용하기 위하여 본 발명은 (a)종양세포와 수상돌기세포의 융합, (b)종양세포와 수상돌기세포의 공동배양 또는 (c)종양세포 추출물과 수상돌기세포와의 혼합배양에 의하여 종양 항원이 수상돌기세포에 의해 면역체계에 제시될 수 있도록 하는 3가지 방식을 개시한다.본 발명의 다른 목적은 환자에게서 분리한 T 림프구를 체외에서 종양 항원을 제시하는 수상돌기세포로 활성화 시킨 다음, 상기 활성화된 T 림프구를 다시 환자의 체내로 투여하는 종양 치료 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 의한 항종양 세포성 백신은 종양의 형태, 크기, 종류에 관계 없이 적용할 수 있는 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 방법은 간암, 폐암,피부암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 전립선암, 백혈병 및 뇌암 환자 등에 적용가능한 종양특이적 항종양 세포성 백신을 제공할 수 있다.In order to use the dendritic cells, the present invention provides a method for (a) fusion of tumor cells and dendritic cells, (b) co-culture of tumor cells and dendritic cells, or (c) mixed culture of tumor cell extracts and dendritic cells. Three methods for allowing tumor antigens to be presented to the immune system by dendritic cells are disclosed. Another object of the present invention is to activate T lymphocytes isolated from a patient as dendritic cells that present tumor antigens in vitro. Then, the present invention provides a method for treating tumors, wherein the activated T lymphocytes are administered back to the patient's body. Antitumor cellular vaccines according to the present invention have the advantage of being applicable regardless of the type, size, or type of tumor. Thus, the method of the present invention can provide a tumor specific anti-tumor cellular vaccine applicable to liver cancer, lung cancer, skin cancer, bladder cancer, cervical cancer, ovarian cancer, breast cancer, prostate cancer, leukemia and brain cancer patients.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
도1은 말초 혈액의 대식세포로부터 유도한 수상돌기 세포를 단일클론 항체로 염색한 후 유세포 분석기로 측정한 대표적인 결과이고,1 is a representative result measured by flow cytometry after staining dendritic cells derived from macrophages of peripheral blood with a monoclonal antibody,
도 2는 세포융합의 상대인 림프종 종양 세포주 CA46 (Burkitt s lymphoma)의 표현 형질을 단일클론항체로 염색한 후 유세포 분석기로 분석한 결과이고,Figure 2 is a result of staining the expression trait of lymphoma tumor cell line CA46 (Burkitt s lymphoma) relative to cell fusion with a monoclonal antibody and analyzed by flow cytometry,
도3는 종양 세포주와 수상돌기 세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜 1450를 이용하여 융합한 후 융합이 완료된 세포를 단일클론항체로 염색하고 이를 유세포 분석기로 표현형질의 유지를 확인한 결과이고,3 is a result of fusion of tumor cell lines and dendritic cells with 50% polyethylene glycol 1450, and then staining the fusion-completed cells with monoclonal antibodies and confirming the maintenance of the phenotype by flow cytometry.
도 4는 수상돌기세포에 의한 T 림프구 증식을 측정한 대표적인 결과이다.4 is a representative result of measuring T lymphocyte proliferation by dendritic cells.
본 발명은 종양면역유도 방법에 있어서 종래의 것보다는 개선된 하기와 같은 특징이 있다.The present invention has the following characteristics improved in the tumor immunoduction method than the conventional one.
(1) 수상돌기세포와 종양세포의 체외 융합 :(1) In vitro fusion of dendritic cells with tumor cells:
수상돌기세포와 종양세포의 융합은 종양세포에 의한 항원의 제공과 수상돌기 세포에 의한 강력한 면역체계 활성화라는 두 가지 필수조건을 하나의 세포에 의해 해결하였다.Fusion of dendritic cells with tumor cells solved two essential conditions by one cell: the provision of antigen by tumor cells and the activation of a strong immune system by dendritic cells.
(2) 수상돌기세포에 의한 종양항원의 제공 :(2) Providing tumor antigen by dendritic cells:
수상돌기세포에 종양 세포 추출물을 투여하는 방식을 보다 수월하게 하여, 종양 항원의 순수 분리라는 기술적으로 어렵고 경비가 많이 드는 방법을 해결하였다.By simplifying the method of administering tumor cell extracts to dendritic cells, the technically difficult and expensive method of pure separation of tumor antigens has been solved.
(3) 효율성 :(3) Efficiency:
기존의 종양치료방식(외과적 수술, 화학요법, 방사선 요법)에 비해 부작용이 낮고, 재발의 위험성을 제거하였다. 또한 종양의 종류에 관계 없이 적용할 수 있다.Compared with conventional tumor treatment methods (surgical surgery, chemotherapy, radiation therapy), side effects are lower and the risk of recurrence is eliminated. It can also be applied regardless of the type of tumor.
(4) 안전성 :(4) safety:
본 발명은 환자 자신의 면역세포와 종양세포를 이용하는 등 항원의 제공원으로 환자 자신의 면역체계를 동원하기 때문에 안전하게 적용할 수 있다. 또한 현재 개발 중인 유전자 요법에 비해 외부의 핵산(DNA), 바이러스 등을 이용하지 않으므로 이를 사용할 때 나타날 수 있는 부작용의 위험성도 해결하였다.The present invention can be safely applied because it uses the patient's own immune system as a source of antigen, such as using the patient's own immune cells and tumor cells. In addition, it does not use external nucleic acids (DNA), viruses, etc., compared to the gene therapy currently being developed, thereby solving the risk of side effects that may occur when using the same.
본 발명자들은 기존의 방식에서 벗어나 보다 저렴하고 효과적인 방식으로 수상돌기세포에 의한 종양항원의 제공 방법을 발명하였다.The inventors have invented a method for providing tumor antigens by dendritic cells in a cheaper and more effective manner, away from the conventional method.
본 발명에서 사용하는 대식세포는 말초혈액에서 추출하였고, 이를 피콜-하이패크(Ficoll-Hypaque, Pharmacia, Uppsala, Sweden) 및 퍼콜(Percoll, Pharmacia)로 연속 분리한 후 부착성 형질을 이용하여 분리하였다. 그러나, 본원에서 이용하는 방식은 골수, 림프절 등의 다른 조직에서 획득한 대식세포 또는 골수, 제대혈, 말초혈액과 같은 다른 조직에서 획득한 조혈 모세포에도 적용할 수 있다.사용한 배양용기는 조직 배양용 플레이트(culture dish, TPP, Switzerland)를 이용하였으나, 페트리디시, 플라스크, 또는 roller bottles 등의 다른 세포 배양 용기를 이용할 수도 있다. 배양용기에 분주한 세포의 수는 ml 당 5 x 10exp5개로 하였다. 각 배양단계에 이용하는 배양액은 수상돌기세포의 생존과 증식을 유지할 수 있어야 하며, 이를 위해 성장인자의 첨가가 필수적인 과정이다. 일반적으로 사용하는 배양액은 10% 우혈청(Life Technologies, Grand Island, NY)을 첨가한 RPMI-1640(Ivrine Scientific, Santa Ana, CA) 이나 사람을 포함하는 다른 종의 혈청을 이용할 수 있으며, 필수 아미노산, 비타민을 함유하는 다른 합성 배양액을 사용할 수도 있다. 배양 중 세균에 의한 오염을 최소화 하기 위해 페니실린, 스트렙토마이신 또는 젠타마이신 사용이 바람직하다. 배양액에 의해 제공되는 양분의 지속적인 공급을 위해 주기적으로 성장인자를 첨가한 배양액의 교환이 바람직하다.Macrophages used in the present invention were extracted from peripheral blood, and then separated using Ficoll-Hypaque (Ficoll-Hypaque, Pharmacia, Uppsala, Sweden) and Percol (Percoll, Pharmacia) and then using adherent traits . However, the method used herein can also be applied to macrophages obtained from other tissues such as bone marrow, lymph nodes, or hematopoietic stem cells obtained from other tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, and peripheral blood. culture dish, TPP, Switzerland), but other cell culture vessels such as Petri dishes, flasks, or roller bottles may be used. The number of cells dispensed into the culture vessel was 5 x 10 exp 5 per ml. The culture medium used in each culture step should be able to maintain the survival and proliferation of dendritic cells, and for this, the addition of growth factors is an essential process. Commonly used culture medium may use RPMI-1640 (Ivrine Scientific, Santa Ana, Calif.) With 10% bovine serum (Life Technologies, Grand Island, NY) or serum from other species, including humans. Other synthetic cultures containing vitamins may also be used. The use of penicillin, streptomycin or gentamicin is preferred to minimize contamination by bacteria during culture. Exchange of the culture with the growth factor periodically added is preferred for continued supply of the nutrients provided by the culture.
본 발명은 또한 치료대상이 되는 환자로부터 직접 대식세포 또는 수상돌기 세포를 분리하는 방법을 사용하는데 특징이 있다. 이들 세포를 이용하여 체내 또는 체외에서 환자의 T 림프구를 활성화시켜 종양의 면역치료에 이용한다. 또한, 정상인으로 부터 수집하거나 획득한 수상돌기세포세포의 HLA 항원(클래스 I 과 II; HLA-A, B, C 와 DP, DQ, DR)이 환자의 그것과 동일한 경우 이들을 이용할 수도 있다. 특히, 방사선 및 화학요법으로 치료를 받는 말기 종양환자로부터 수상돌기세포의 수집이나 말초혈액의 수집이 용이하지 않는 경우 또는 HLA 항원이 일치하는 친족이 존재하는 경우 이를 활용할 수도 있다.이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐 본 발명은 이에 제한적인 것은 아니다. 또한, 본 발명의 기술적 요지 및 권리범위내에서 얼마든지 당업자간에 변형실시 또는 균등적 실시가 가능하다는 것은 당업자간에 명백히 이해될 것이고, 그 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.The present invention is also characterized by the use of a method for separating macrophages or dendritic cells directly from the patient being treated. These cells are used to activate T lymphocytes of patients in or outside the body and use them for immunotherapy of tumors. In addition, the HLA antigens (class I and II; HLA-A, B, C and DP, DQ, DR) of dendritic cell cells collected or obtained from normal individuals may be used if they are the same as that of the patient. In particular, it may be utilized when the collection of dendritic cells or peripheral blood from a terminal tumor patient treated with radiation and chemotherapy is not easy, or when a relative with a matching HLA antigen is present. Through the present invention will be described in more detail. However, the following examples are only for illustrating the present invention is not limited thereto. In addition, it will be clearly understood by those skilled in the art that modifications or equivalents may be made by those skilled in the art within the technical spirit and scope of the present invention, and also belong to the scope of the present invention.
실시예 1 : 종양조직의 수집Example 1 Collection of Tumor Tissue
조직학으로 확인된 종양 조직과 말초혈액 50 ml을 환자의 동의하에 수집하였으며, 임상적인 소견, 혈액의 상태 및 다른 구체적인 치료 방식들을 구체적으로 기록하였다. 전립선 암, 위암, 간암, 난소암, 흑색종, 백혈병 등과 같은 다양한 종양에서 유래한 세포주를 구축하고, 이들의 표현 형질을 유세포 분석기(BectonDickinson, San Diego, CA)를 통해 분석하였다.Histologically confirmed tumor tissue and 50 ml of peripheral blood were collected with the patient's consent and the clinical findings, blood condition and other specific treatment modalities were specifically recorded. Cell lines derived from various tumors such as prostate cancer, gastric cancer, liver cancer, ovarian cancer, melanoma, leukemia, etc. were constructed and their expression traits were analyzed by flow cytometry (BectonDickinson, San Diego, Calif.).
실시예 2 : 대식세포의 분리 및 배양Example 2 Isolation and Culture of Macrophages
(1) 대식세포의 분리(1) Isolation of Macrophages
본 발명에서 사용하는 대식세포는 말초혈액에서 추출하였고, 이를 파이콜-하이패크(Ficoll-Hypaque) 및 퍼콜(Percoll)로 연속 분리한 후 부착성 형질을 이용하여 분리하였다. 말초혈액에서 단핵구를 파이콜-하이패크 농도 그래디언트에 의해 원심분리하고, 상기 원심분리에 의해 분리된 단핵구를 다시 퍼콜을 사용해 농축하였다. 구체적으로는, 1.061 g/ml 및 1.050 g/ml의 밀도를 갖는 퍼콜 그래디언트를 제작한 후 이들을 15 ml 원심분리 튜브(conical tube)에 10.061, 1.015의 순서로 아래에서부터 비연속적인 그래디언트를 형성하도록 주입하였다. 배지에 부유되어 있는 단핵구(1X10exp8)를 상층에 주입한 후 10분간 2000 x g, 20℃에서 원심분리한 다음 1.050과 1.061의 중간층에서 대식세포를 수집하였다. 이 때, 항 CD14 항체 (Becton Dickinson)로 염색한 후 유세포 분석기로 분석한 결과 전체의 70% 이상이 대식세포임을 알 수 있었다.Macrophages used in the present invention were extracted from the peripheral blood, it was separated by Ficoll-Hypaque (Percoll) and Percoll (Percoll) and then separated using adherent traits. In peripheral blood monocytes were centrifuged by a picol-highpack concentration gradient, and the monocytes separated by the centrifugation were again concentrated using percol. Specifically, percol gradients with densities of 1.061 g / ml and 1.050 g / ml were prepared and then injected into 15 ml conical tubes to form discontinuous gradients from below in the order of 10.061, 1.015. It was. Monocytes (1X10exp8) suspended in the medium were injected into the upper layer, followed by centrifugation at 2000 x g and 20 ° C for 10 minutes, and macrophages were collected from the interlayers of 1.050 and 1.061. At this time, after staining with anti-CD14 antibody (Becton Dickinson) and analyzed by flow cytometry, it can be seen that more than 70% of the total macrophages.
대식세포의 순도를 높이기 위해 별도로 대식세포가 플라스틱표면에 부착하는 성질을 이용하여 순도 90-95%로 대식세포를 분리하였다. 필요에 따라서는 대식세포를 CD14-MACS(Miltenyi Biotec, Germany)를 이용하여 분리하였다. 이 경우 말초혈액 단핵구를 사람의 항체로 항체수용체를 블록킹(blocking)한 다음 초미세금속파편이 접속된 항사람 CD14 항체(CD14-microbeads)와 30 분간 4℃에서 염색한다. 염색 후 세포를 원심 분리하여 세척하고 이를 자기장이 적용되는 컬럼(column)에 적용하여 항 CD14 항체가 부착된 세포들이 자기장에 의해 컬럼에 부착시키고 여타세포는 방출하도록 한다. 부착된 세포는 자기장으로부터 격리하여 모아 1회 세척한 후 세포 수를 결정한다.In order to increase the purity of macrophages, macrophages were isolated with a purity of 90-95% using the properties of macrophages attached to plastic surfaces. If necessary, macrophages were isolated using CD14-MACS (Miltenyi Biotec, Germany). In this case, peripheral blood mononuclear cells are blocked with a human antibody and then stained with anti-human CD14 antibody (CD14-microbeads) to which ultrafine metal fragments are connected at 4 ° C. for 30 minutes. After staining, the cells are centrifuged and washed and applied to a column to which a magnetic field is applied so that the cells to which the anti-CD14 antibody is attached are attached to the column by the magnetic field and other cells are released. The attached cells are isolated from the magnetic field, collected and washed once to determine the number of cells.
대식세포는 10% 우혈청, 10 mM 글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies, Grand Island, NY)을 함유하는 RPMI 1640 배지에 부유 시킨 다음 6 웰 또는 100 mm 조직배양 플레이트에 5 x 10exp5 cells/ml의 농도로 배양을 시작하였다.Macrophages are suspended in RPMI 1640 medium containing 10% bovine serum, 10 mM glutamine, and penicillin / streptomycin (Life Technologies, Grand Island, NY) and then 5 x 10exp5 cells / in 6-well or 100 mm tissue culture plates. Incubation was started at a concentration of ml.
(2) 대식세포에서 수상돌기세포로 분화 유도(2) Induce differentiation from macrophages to dendritic cells
상기 과정에 의해 분리된 대식세포를 6일간 GM-CSF (600 U/ml, Pharmingen, San Diego, CA) 및 IL-4(100 U/ml, Pharmingen) 을 함유하는 배지에서 배양하였다. 배양 3일째 50%의 배지를 이들 성장인자를 함유하는 신선한 배지로 교체하여 주었다. 6일째에 비부착성 세포를 수집하여 원심 분리한 후 이들을 GM-CSF(600 U/ml), IL-4(100 U/ml) 및 CD40리간드(CD154,CD40 ligand, 연세대학교 이태호 교수) 또는 GM-CSF(600 U/ml), IL-4(100 U/ml) 및 20% 대식세포 배양상층액(monocyte-conditioned medium, MCM)으로 3일간 추가 배양하여 성숙(maturation)을 완료하였다.Macrophages isolated by the above procedure were cultured in a medium containing GM-CSF (600 U / ml, Pharmingen, San Diego, Calif.) And IL-4 (100 U / ml, Pharmingen) for 6 days. On day 3 of culture, 50% of the medium was replaced with fresh medium containing these growth factors. On day 6, non-adherent cells were collected and centrifuged and then GM-CSF (600 U / ml), IL-4 (100 U / ml) and CD40 ligand (CD154, CD40 ligand, Prof. Taeho Lee, Yonsei University) or GM -Maturation was completed by further incubation with CSF (600 U / ml), IL-4 (100 U / ml) and 20% macrophage culture supernatant (monocyte-conditioned medium, MCM) for 3 days.
상기 성숙시킨 세포들이 체내의 수상돌기 세포와 유사한 형질과 능력을 가졌는지를 유세포 분석기(flow cytometry, Becton Dickinson)와 다양한 시험관내검사(in vitro assay)를 통해 확인하였다. 형질확인을 위해서 형광색소가 부착된 백서에서 제작된 항사람 단일클론항체들, CD1a (Pharmingen), CD11c (Pharmingen), CD14(Becton Dickinson), CD15(Becton Dickinson), CD40 (Pharmingen), CD54, CD80(Serotec, Oxford, England), CD83(Pharmingen), CD86 (serotec) 및 HLA-DR(Becton Dickinson)로 염색한 후 유세포 분석기를 통해서 표현형질을 확인하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.It was confirmed by the flow cytometry (Becton Dickinson) and various in vitro assays that the mature cells had similar traits and abilities similar to dendritic cells in the body. Antihuman monoclonal antibodies, CD1a (Pharmingen), CD11c (Pharmingen), CD14 (Becton Dickinson), CD15 (Becton Dickinson), CD40 (Pharmingen), CD54, CD80 After staining with (Serotec, Oxford, England), CD83 (Pharmingen), CD86 (serotec) and HLA-DR (Becton Dickinson), the phenotype was confirmed by flow cytometry and the results are shown in FIG.
기능성 확인을 위해서 첫째, 배양된 수상돌기 세포를 자극원(stimulator)으로 하고 동종(allogeneic)의 말초 혈액 단핵구(mononuclear cells; MNC)를 반응체 (responder)로 하여 반응체의 분열능을 방사선 동위원소로 표지한 티미딘 (thymidine, NEN, Boston, MA)의 염색체 통합(integration) 정도로 확인 하였고, 둘째, 수상돌기 세포를 테타누스 독소(tetanus toxoid) 등과 같은 항원과 배양을 한 후 동일인으로부터 추출한 단핵구(autologous MNC) 또는 순수분리한 T 림프구에 항원 제공 능력을 분석하였다. 상기 과정에서 다양한 방법과 성장인자 배합에 의해 배양된 수상돌기 세포들의 기능 차이를 분석하여 최적의 항원 제공능력을 가진 수상 돌기 세포를 선발하였다.For functional verification, first, cultured dendritic cells were used as a stimulator, and allogeneic peripheral blood mononuclear cells (MNC) were used as the reactants, and the cleavage ability of the reactants was determined by radioisotopes. Thymidine (thymidine, NEN, Boston, MA) labeled with the degree of chromosome integration (integration) was confirmed, second, dendritic cells were cultured with antigens such as tetanus toxoid and then monocytes extracted from the same person ( autologous MNC) or purely isolated T lymphocytes were analyzed for antigen presentation ability. In the process, by analyzing the functional differences of the dendritic cells cultured by various methods and growth factor combinations were selected dendritic cells having the optimal antigen providing ability.
상기 제조되는 수상돌기세포의 수적 증가를 위해 GM-CSF, IL-4과 MCM 또는 CD40 리간드를 이용하였으며, 이외에도 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), M-CSF(monocyte-macrophage colony-stimulating factor), 인터루킨 1, 인터루킨 3, 인터루킨 6, TNF(tumor necrosis factor)와 같은 다른 성장인자를 사용할 수 있었는데, 이들 인자는 세포 성장과 분화에 최적 농도를 결정한 후 첨가되었다. 혈액으로부터 수상돌기세포의 제조을 시작할 때 생존률을 증가 시키기 위해 다음의 방식을 적용하였다; 혈액을 헤파린(100 U/ml) 또는 다른 항 응고제를 함유하는 용액(주로 RPMI-1640)에 1:1로 희석한 후 파이콜-하이패크(Ficoll-Hypaque) 위에 얹은 다음 이들을 2000 RPM(약 900g force)으로 상온에서 20분간 원심분리하였다. 상기 방식에 의해 단핵구는 파이콜-하이패크와 혈액희석액의 중간층에서 획득되었으며 적혈구, 다핵구 및 혈소판의 오염을 최소화할 수 있었다. 사용되는 성장인자의 양은 공급자의 활성 정의에 따라 다르지만 GM-CSF(100-100 U/ml), IL-4 (10-500 U/ml)을 사용하는 것이 바람직하였다. 세포 수를 검사한 후 필요에 따라 일부는 동결배지로 처리한 후 바이얼(cryovial)에 넣어 인식 표시한 후 질소탱크에서 장기보존하였다.GM-CSF, IL-4 and MCM or CD40 ligand was used to increase the number of dendritic cells prepared above. In addition, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and monocyte-macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) were used. ), Interleukin 1, interleukin 3, interleukin 6, and tumor necrosis factor (TNF) could be used, and these factors were added after determining the optimal concentration for cell growth and differentiation. In order to increase the survival rate when starting the production of dendritic cells from blood, the following method was applied; Dilute the blood 1: 1 in a solution containing heparin (100 U / ml) or other anticoagulant (primarily RPMI-1640), then place it on Ficoll-Hypaque and add 2000 RPM (approximately 900 g). centrifugation at room temperature for 20 minutes. By this method monocytes were obtained in the middle layer of the picol-highpack and hemodiluent and could minimize contamination of red blood cells, multinucleated cells and platelets. The amount of growth factor used depends on the activity definition of the supplier but it is preferred to use GM-CSF (100-100 U / ml), IL-4 (10-500 U / ml). After checking the cell number, if necessary, some of them were treated with a freeze medium and placed in a cryovial to be identified and stored for a long time in a nitrogen tank.
실시예 3 : 수상돌기세포와 종양세포의 융합Example 3 Fusion of Dendrites and Tumor Cells
수상돌기세포(5 x 10exp6)와 종양세포(2.5 x 10exp6)을 15 ml 원심분리튜브에 혼합한 후 이들을 잔류단백질을 제거하기 위해 PBS를 첨가하고 원심분리를 2회 실시하였다. 상기 원심 분리 후, 부유액을 완벽하게 제거하고 침전 세포에 PEG 1500 (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 세포 융합을 수행하였다. 세포융합은 60초간 1 ml의 50% PEG을 함유하는 RPMI-1640을 침전된 세포에 한 방울씩 주입하면서 침전을 용해시킬 정도로 흔들어 주면서 시작 하였고, 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지 1ml을 1 분간 첨가한 다음 9ml을 1 분간 첨가 함으로서 종결하였다. 융합 직후 세포를 한차례 배지로 희석한 다음 원심 분리하여 잔류 PEG을 제거하였다. 융합의 정도는 수상돌기 세포에 대한 단일클론항체와 종양세포에 대한 단일클론항체로 염색하고 이를 유세포 분석기로 분석함으로써 결정하였다. 본 발명에서는 실험상의 편리를 위해 예비단계로 종양세포의 세포질을 5 M CSFE(5-(and-6)-carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester, molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 15분간 염색하여 융합의 효율을 측정하였다. 상기 염색 형광물질은 녹색 발광으로 세포를 표지하므로 전체세포 중 녹색 형광을 발하는 세포 중에서 수상돌기 세포의 표지 인자인 CD1a, CD11c 또는 CD83을 발현하는 세포는 성공적으로 융합 되었음을 의미하는데, 측정 결과 대부분의 경우 3-6%의 수상돌기세포가 융합되는 것을 확인할 수 있었다. 이 경우 단일클론 항체 생성을 위해 myeloma(종양의 일종) 세포를 비장의 정상세포(B 림프구)와 융합한 결과(hybridoma)가 종양세포의 특성인 영구성(비사멸성)과 B 림프구의 특성인 항체의 합성/분비라는 양면성을 모두 만족하는 예에서 본 바와 같이(Olsson, L., and H. S. Kaplan. Methods Enzymol. 92:3(1983)), 종양세포(종양특이항원의 제공자: signal 1과 APC(보조활성인자의 제공자: signal 2의 양쪽 특성을 모두 충족 시킬 수 있는 융합세포(hybrid cell)가 형성된다.After dendritic cells (5 x 10exp6) and tumor cells (2.5 x 10exp6) were mixed in a 15 ml centrifuge tube, they were added with PBS to remove residual protein and centrifuged twice. After the centrifugation, the suspension was completely removed and cell fusion was performed by adding PEG 1500 (Sigma, St. Louis, MO, USA) to the precipitated cells. The cell fusion was started by shaking the solution so as to dissolve the precipitate while injecting RPMI-1640 containing 1 ml of 50% PEG into the precipitated cells for 60 seconds, and adding 1 ml of RPMI-1640 medium containing serum for 1 minute. Then it was terminated by adding 9 ml for 1 minute. Immediately after fusion, cells were diluted once with medium and centrifuged to remove residual PEG. The degree of fusion was determined by staining with monoclonal antibodies against dendritic cells and monoclonal antibodies against tumor cells and analyzing them with flow cytometry. In the present invention, the cytoplasm of the tumor cells as a preliminary step for the convenience of experiment, stained with 5 M CSFE (5- (and-6) -carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester, molecular Probes, Eugene, OR, USA) for 15 minutes The efficiency of the fusion was measured. Since the stained fluorescent material labels cells with green luminescence, cells expressing dendritic cell markers CD1a, CD11c or CD83 among green fluorescing cells of the whole cells are successfully fused. 3-6% of dendritic cells were confirmed to be fused. In this case, the result of fusion of myeloma cells with the spleen's normal cells (B lymphocytes) for the production of monoclonal antibodies (hybridoma) is an antibody that is characteristic of tumor cells (perishable) and B lymphocytes. As seen in the example that satisfies both sides of the synthesis / secretion of (Olsson, L., and HS Kaplan.Methods Enzymol. 92: 3 (1983)), tumor cells (providers of tumor specific antigens: signal 1 and APC ( Provider of coactivators: Hybrid cells are formed that can meet both characteristics of signal 2.
실시예 4 : 수상돌기 세포에 의한 T 림프구 증식 분석Example 4 Analysis of T Lymphocyte Proliferation by Dendritic Cells
종양 환자로부터 수집한 말초혈액의 단핵구(1 x 106cell)를 HEPES, 2-머캡토에탄올, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 10% 사람 AB 혈청을 함유하는RPMI 1640에 부유 시킨 다음 1 U/ml의 재조합 IL-2를 첨가 한 후 96-웰 마이크로타이터 플레이트(well microtiter plate)에 분주하였다. 수상돌기 세포(세포 융합 후 또는 종양 항원의 전이 후1 x 10exp5 cells)를 30g/ml의 마이토마이신-C(Mitomycin-C)으로 처리 한 다음 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 대조군으로 테타누스 독소(500 ng/ml)와 무처리군을 이용하였다. 마이크로타이터는 플레이트는 5% CO2, 37℃의 조건에서 5일간 배양한 다음 웰당 1 mCi의 방사선 표지 티미딘(3H-Thymidine)을 첨가한다. 24시간 추가 배양 후, 반자동 세포 수집기(semi-automatic cell harvester)와 방사선 검사기를 이용하여 방사선 잔류량을 측정하고 이를 통해 항원의 제공능력을 검증하였다.Peripheral blood monocytes (1 × 10 6 cells) collected from tumor patients were suspended in RPMI 1640 containing HEPES, 2-mercaptoethanol, L-glutamine, penicillin / streptomycin and 10% human AB serum and then 1 U. / ml of recombinant IL-2 was added and then dispensed into a 96-well microtiter plate. Dendritic cells (1 × 10exp5 cells after cell fusion or after metastasis of tumor antigens) were treated with 30 g / ml mitomycin-C and added to microtiter plates. Tetanus toxin (500 ng / ml) and untreated group were used as a control. The microtiter plate is incubated for 5 days at 37 ° C. with 5% CO 2 and then added 1 mCi of radiolabeled thymidine (3H-Thymidine) per well. After further incubation for 24 hours, the residual amount of radiation was measured using a semi-automatic cell harvester and a radiograph, and the antigen provision ability was verified.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 수상돌기세포가 보유하는 고유한 항원제공 능력을 임상과 치료에 이용 가능한 충분한 수의 수상돌기세포의 제조를 용이하게 하는 방법을 제공하는 바, 본 발명에 따른 수상돌기세포는 종양, 자가면역질환, 알레르기성 질환, 감염성 질환의 치료와 예방 백신의 전달 등에 유용하게 이용할 수 있어 본 발명은 의학 및 생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the present invention provides a method for facilitating the preparation of a sufficient number of dendritic cells available for clinical and therapeutic use of the unique antigen-providing ability possessed by dendritic cells. Cells can be usefully used for the treatment of tumors, autoimmune diseases, allergic diseases, infectious diseases, and for the delivery of preventive vaccines.
Claims (6)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| KR20020060643A (en) * | 2002-06-04 | 2002-07-18 | 김진경 | A method of cancer treatment with other person's immune system |
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| WO2007001200A1 (en) * | 2005-06-23 | 2007-01-04 | Obschestvo S Ogranichennoi Otvetsvennostyu 'rusgen' | Mature dendritic cells loaded with tumor polylysates and antitumoral vaccine base thereon |
| ES2401706T3 (en) * | 2005-07-27 | 2013-04-23 | Eli Lilly And Company | A method of treating cancer cells to create a modified cancer cell that elicits an immunogenic response |
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996030030A1 (en) * | 1995-03-31 | 1996-10-03 | Universite Libre De Bruxelles | Dendritic-like cell/tumor cell hybrids and hybridomas for inducing an anti-tumor response |
| WO1998001538A1 (en) * | 1996-07-10 | 1998-01-15 | Immunex Corporation | Method of activating dendritic cells |
| US5788963A (en) * | 1995-07-31 | 1998-08-04 | Pacific Northwest Cancer Foundation | Isolation and/or preservation of dendritic cells for prostate cancer immunotherapy |
| WO1998046785A1 (en) * | 1997-04-15 | 1998-10-22 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Dendritic cell hybrids |
| JPH11290068A (en) * | 1998-03-03 | 1999-10-26 | Inst Gustave Roussy | Activation of natural killer (nk) cell and its procedure |
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996030030A1 (en) * | 1995-03-31 | 1996-10-03 | Universite Libre De Bruxelles | Dendritic-like cell/tumor cell hybrids and hybridomas for inducing an anti-tumor response |
| US5788963A (en) * | 1995-07-31 | 1998-08-04 | Pacific Northwest Cancer Foundation | Isolation and/or preservation of dendritic cells for prostate cancer immunotherapy |
| WO1998001538A1 (en) * | 1996-07-10 | 1998-01-15 | Immunex Corporation | Method of activating dendritic cells |
| KR20000022445A (en) * | 1996-07-10 | 2000-04-25 | 크리스토퍼 엘. 와이트, 스코트 지. 홀퀴스트, 스티븐 엘. 말라스카 | Method of activating dendritic cells |
| WO1998046785A1 (en) * | 1997-04-15 | 1998-10-22 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Dendritic cell hybrids |
| JPH11290068A (en) * | 1998-03-03 | 1999-10-26 | Inst Gustave Roussy | Activation of natural killer (nk) cell and its procedure |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180085251A (en) | 2017-01-18 | 2018-07-26 | 서강대학교산학협력단 | Method for manufacturing multicellular spheroid using hydrogel microwell |
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