KR100363122B1

KR100363122B1 - 유전자 조작을 통한 마늘 식물체의 형질전환 방법 및 형질전환 마늘

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Publication number: KR100363122B1
Application number: KR1020000050536A
Authority: KR
Inventors: 남상일; 최양도; 박미연; 이나리; 이한용; 임재윤; 장효상; 김성태; 정종주; 이종섭; 김주곤
Original assignee: 동양물산기업 주식회사
Priority date: 2000-08-29
Filing date: 2000-08-29
Publication date: 2002-12-05
Also published as: KR20010044086A

Abstract

이 발명은 미세입자 투사법 (입자총)에 의한 형질전환 기술을 이용하여 유전공학적으로 조작된 마늘 식물체 (Allium sativum)를 제공하는 방법에 관한 것이다. 마늘의 생장점을 채취하여 적절한 조건에서 배양하면 캘러스 (callus)의 발생 유도가 가능하며, 이들 캘러스는 미분화 분열조직으로서 완전한 식물체로 재분화 (regeneration)가 가능하다. 효율적인 형질전환을 위해서는, 특정한 배지에서 배양한 비교적 세포분열이 활발하고 재분화가 가능한 특정한 형태의 캘러스를 얻고 이 캘러스에에 재조합 DNA로 코팅한 미세입자를 투사하여야 한다. 또한, 효율적인 형질전환을 위해서는 미세입자 투사 후 선별제를 이용한 형질전환체 선별 과정이 효과적으로 진행되어야 하고, 이 과정에서 하이그로마이신 같은 효과적인 선별제의 사용이 필수적이다. 형질전환에 사용되는 유전자의 재조합 과정에서는 마늘 조직에 효과적인 프로모터의 선정도 필요하다. 따라서 본 발명에 기재된 기술을 이용하면 형질전환 효율이 높은 마늘 캘러스의 선발, 재조합 DNA로 코팅한 미세입자의 투사, 형질전환체의 선별, 형질전환체의 재분화와 증식, 형질전환체의 확인 및 순화 과정을 거쳐 유용한 형질을 가진 마늘 형질전환체를 효과적으로 얻게된다.

Description

유전자 조작을 통한 마늘 식물체의 형질전환 방법 및 형질전환 마늘{A method for the development of transgenic garlic plants by gene manipulation and its transgenic garlic}

이 발명은 식물의 유전자 조작 기술에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세입자 투사법에 의한 형질전환 기술(particle bombardment-mediated transformation technique)을 이용하여 마늘을 형질전환 시키는 방법에 관한 것이다.

마늘은 백합과, 파속에 속하는 대표적인 양념 채소 작물로 파속 작물 중 양파 다음으로 생산량이 많고 전세계에 걸쳐 재배되고 있으며 특히 한국인에게 많이 애용되고 있으며, 건강식품 또는 의약품의 원료로도 이용되고 있다. 마늘은 생리적인 특성상 결실이 되지 않는 불염성으로 인편(clove)을 통해 영양번식하기 때문에 육종이 여의치 않아 품종 수가 극히 제한적이다. 우리 나라의 경우 겨울의 기온이 비교적 높고 짧은 남해안 지역과 제주도에서 재배하는 난지형과 겨울의 기온이 낮고 긴 지역에서 재배하는 한지형으로 크게 구분하는 정도이며, 예천 마늘, 의성 마늘, 단양 마늘 등과 같이 재배 지역의 풍토에 적응된 품종을 산지별 지역종으로 편의상 구분하고 있다.

이와 같이 꽃가루받이에 의한 전통적인 교배 육종 방법을 쓸 수 없는 경우 그 대안으로 최근 발달한 유전공학적 분자육종 방법의 적용이 가능하다. 유전공학적 분자 육종은 새로운 기능성 유전자를 선발된 개체의 유전체에 이식 발현시켜 원하는 형질을 얻는 방법이다. 전통적인 교배 육종과는 달리, 우수한 품종의 유전자형을 그대로 유지하면서 새로운 기능성 유전자를 이식하기 때문에 단시간 내 효율적인 육종이 가능하다.

유전공학적 방법을 성공적으로 수행하기 위해서는 목표하는 세포 내로 외래 유전자를 효과적으로 이식시키는 방법, 이에 적합한 목표 시료를 얻는 방법, 그리고 형질전환된 세포에서 완전한 식물체를 얻는 재분화 기술이 반드시 필요하다. 효과적인 식물 세포의 형질전환 (유전자 이식) 방법은 크게 두 가지가 있는데 첫번째는 생물학적 벡터를 이용하여 식물 세포로 외래 유전자 DNA를 전달하는 방법으로 주로 토양 식물 병원균인 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 이용하는 방법이고, 두번째는 식물 세포 내로 외래 유전자 DNA를 직접 전달하는 방법으로 DNA로 코팅한 금속 미세입자를 투사하는 방법을 들 수 있다 (Hansen and Wright,Trends Plant Sci. 4; 226-231, 1999).

오늘날 가장 보편적으로 이용되고 있는 식물 형질전환 기술은 식물 병원균 아그로박테리움을 이용하는 것으로, 이들 세균은 그들의 Ti (종양 유도성, tumor-inducing) 또는 Ri (뿌리 유도성, root-inducing) 플라스미드 DNA 중 일부 (T-DNA)를 감염된 식물 세포 내로 전이 이식시키는 능력을 지니고 있다. 따라서 목적 유전자를 T-DNA 내에 재조합 한 후 이를 보유한 균가 식물체를 공동 배양하면 식물 세포의 형질전환이 가능해진다. 그러나, 이 기술의 결정적인 한계는 아그로박테리움과 형질전환 목표 세포와의 숙주 범위(host range)를 포함한 화합성에 있으며 궁극적으로는 형질전환 세포의 성공적인 재분화에까지 영향을 미치게 된다. 따라서 경제적으로 유용한 많은 작물들이 아직 이 방법에 의해 형질전환이 되지않고 있다 (Hansen and Wright,Trends Plant Sci. 4; 226-231, 1999).

식물종이나 유전형에 관계없이 유전자 이식이 가능한 방법을 개발하기 위한 노력의 일환으로, DNA를 식물 세포로 직접 전달하는 몇 가지 기술이 연구되었으며, 이들에는 전기충격에 의한 DNA 주입법(electroporation), 미세주사법 (microinjection), PEG- 또는 리포좀-매개를 이용한 DNA 흡입, 탄화실리콘 휘스커스(silicon carbide whiskers), 그리고 미세입자 투사법 등이 있다. 이들 가운데 바이오리스틱스 (biolistics) 또는 마이크로 프로젝타일스 (microprojectiles)로 알려져 있는 미세입자 투사 기술은 작은 캐리어 금속 입자들에 목적재조합 유전자 DNA를 코팅하고, 이 입자들을 물리적으로 식물 세포 내로 투사시키는 것이다 (Kleinet al.,Nature327; 70-73, 1987: Sanford,Plant Physiol. 79; 206-209, 1990). 이러한 방법은 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, DNA를 도입하는 데에 세포벽의 제거가 필요하지 않다. 둘째, DNA를 분열조직 및 분화된 조직의 세포 내로 쉽게 도입할 수 있다. 셋째, 특별한 생물학적 운반체의 조작이 필요하지 않다. 마지막으로, 세포 내로 DNA를 전이하는 데에 형질전환 목표 세포와 생물학적 벡터의 결합 내지 상호 인식에 의존하지 않는다. 이들 입자투사 방법으로 형질전환 된사례를 보면 옥수수 (Frommet al.,1990Biotechnology8; 833-839, 1990), 쌀 (Christouet al.,Biotechnology9; 957-962, 1991), 보리 (Wan and Lemaux,Plant Physiol. 104; 37-48, 1994), 밀 (Vasilet al., 1992Biotechnology10; 667-674, 1992), 대두 (McCabeet al., Biotechnology 6; 923-926, 1988), 사탕수수 (Bower and Birch, Plant J. 2; 409-416, 1992) 등 중요 작물에서 증명되어진 바 있다. 이 방법의 장점은 형질전환 세포에서 재분화되는 신초를 일차 및 이차 분열조직으로부터 직접적으로 발생시킬 수 있어 식물 호르몬의 처리를 줄이고 체세포변이를 최소화 시킬 수 있다는 것이다.

유전공학적 조작에 의한 병해충 저항성 마늘, 냄새 없는 마늘, 무주아 마늘, 약리 성분이 강화된 마늘 등 새로운 품종의 육종은 상업적인 중요성을 지닌다. 영양번식을 하는 마늘의 생리적 특성상 교배와 같은 재래적인 식물 육종 방법에 의한 품종의 개량은 거의 불가능하므로, 유전공학적 기술을 이용한 마늘의 개량이 관심의 대상이 되고 있다. 또한 마늘과 같은 불염성 메카니즘 연구를 위해서도 학문적으로 중요성을 지닌다.

마늘은 실제로 형질전환에 있어서 다른 식물들에 비해 몇 가지 다른 특징이 있다. 첫째, 마늘은 10¹²염기쌍 정도로 매우 큰 게놈을 지니고 있다. 둘째, 마늘 세포들은 protoplast 배양 등 조직배양 및 형질전환 과정에서 다양한 조작에 잘 반응하지 않는다. 셋째, 배양한 분화 세포로부터 식물체의 재분화가 잘 이루어지지 않는다. 넷째, 마늘 세포들은 가나마이신과 같은 항생물질을 이용한 유전자 이식세포의 선발이 용이하지 않다. 이번 실험 결과에서 나타난 바와 같이, 마늘은 500mg/L 이상의 가나마이신에서도 내성을 나타낸다. 마지막으로, 마늘 형질전환에 쓰이는 분열조직 (캘러스)의 다중세포 구조 때문에, 얻어진 형질전환 식물이 때로 형질전환과 비형질전환 부분을 지닌 키메라(chimera)가 될 수 있다.

그러므로, 현재까지 보고된 어떠한 실험 방법도 마늘의 유전공학 기술의 실제 적용에 유용하지 못하고, 따라서 전 세계적으로 형질전환 마늘의 성공 사례가 보고된 바 없다. Barandiaran 등 (Barandiaranet al.,Plant Cell Rep. 17; 737-741, 1998) 이 미세입자 투사법으로 마늘의 여러 조직을 대상으로 형질전환을 시도하였으나 일부 조직에서 표지 유전자의 일시적인 발현만 보고하였을 뿐 세계적으로 재조합 DNA 유전자를 이식한 마늘 형질전환체가 얻어진 사례가 없다. 같은 속에 속하는 양파의 경우 올해 Eady 등이 아그로박테리움을 이용하여 형질전환체를 얻은 바 있다 (Eady et al. 2000. Annual Meeting of the International Society for Plant Molecular Biology, Quebec). 그들은 해파리의 녹색 형광 단백질 (green fluorescence protein) 유전자를 표지 유전자로 사용하였다 (Eadyet al.,Plant Cell Rep. 19; 376-381, 2000).

본 발명의 목적은 미세입자 투사법으로 마늘을 형질전환시키는 유효한 방법을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 생성된 캘러스를 형질 전환시키기 적합한 상태로 만들기 위하여 적절한 배지 조성과 배양 조건을 제공하며, 입자 투사 전 내지 입자 투사 후 연속된 분열조직의 발생을 유도하여 외래 유전자 이식 효율을 높이고, 이어서 태발생(morphogenesis), 재분화능이 있는 캘러스를 효과적으로 선별하여 재분화 식물체를 얻는 방법을 제공함으로서 마늘의 특성 개량을 가속화시킬 수 있는 유전공학적 기술의 광범위한 적용 가능성을 지니는 방법을 제공하는 것이다. 실 예로써 목적 유전자로 제초제 저항성 유전자를 이용하여 제초제 저항성 형질전환 마늘 식물체를 생산하였다.

도 1은 미세 입자 투사에 효과적인 특정한 캘러스의 선정과 형질전환효율 검정 사진이고,

도 2는 선별제 하이그로마이신에 대한 비형질전환 마늘 캘러스의 감수성을 조사한 사진이며,

도 3은 마늘 캘러스에서 여러 가지 프로모터의 발현조절 효율을 조사한 사진이며,

도 4는 이 실험에서 사용된 재조합 유전자 pC1301-ALSGUS 와 pCambia1201의 개략도이며,

도 5는 형질전환 캘러스를 선별하기 위한 함몰 배지 배양 사진이며,

도 6은 형질전환체로 확인된 캘러스로부터 재분화되는 신초 사진이고,

도 7은 형질 전환된 마늘 신초에서 표지 유전자(GUS)의 장기간 안정된 발현을 검정한 사진이고,

도 8은 형질 전환된 마늘을 확인하기 위하여 이식시킨 선별 유전자 (HPT)와 제초제 저항성 목적 유전자(ALS)를 PCR (polymerase chain reaction)로 증폭시킨 후 해당 DNA 단편을 서던 블롯으로 나타낸 그림이고,

도 9는 형질 전환된 마늘에 이식 발현된 선별 유전자 (HPT)와 제초제 저항성 유전자 (ALS)의 RNA 전사체 단편을 노던 블롯으로 확인한 그림이고,

도 10은 토양에서 자라는 형질전환 마늘 식물체의 사진이고,

도 11은 형질전환 마늘 식물체의 제초제 저항성을 검정하기 위하여 4ppm의 제초제 GLEAN^?(chlorsulforan, DuPont)이 함유된 배지에서 배양한 그림이다.

본 발명은 식물체에서 발현 가능한 재조합 유전자를 이용하여 유전공학적으로 조작한 마늘을 생산함에 있어서,

1) 형질 전환이 용이하고, 분열이 활발한 캘러스를 특정한 조건에서 배양하고;

2) 미세입자 투사를 위한 표적의 표면에 재분화 가능한 캘러스 세포를 집중 배양하고 ;

3) 최소한 목적하는 외부 유전자와 형질 전환체 선별 유전자를 포함하는 재조합 외래 유전자를 코팅한 미세 금속 입자들을 물리적으로 가속 투사하여, 외래 유전자를 이식하며 ;

4) 효과적인 선별 배지에서 형질전환 세포를 선택적으로 증식시킨 후;

5) 재분화 배지에서 형질전환 마늘 식물체를 얻고;

6) 다신초 증식 방법을 이용하여 형질 전환 마늘을 대량 증식하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 유전공학적 마늘 품종 제조 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

이 발명은 형질 전환된 마늘 세포를 포함하는 형질전환 마늘 식물체를 생산하기 위해 이용되어질 수 있고, 이 형질 전환된 마늘 세포는 외래 유전자를 함유하게 된다. 이러한 마늘 유전공학 기술은 미세 입자로 전달된 외래 유전자 DNA를 캘러스에 이식시킨 다음 형질 전환 세포들을 선발하고 재분화를 통해 형질전환 식물체를 얻는 입자투사법에 의한 식물 형질전환 기술의 이용을 통해 달성할 수 있다. 여기에 기재된 배양기술은 입자투사가 가해진 비교적 많은 수의 분열조직 세포들의 증식을 유도하고, 형질전환된 분열조직의 효과적인 선별을 통해, 투사된 분열조직을 증식시키고 도입된 유전자가 발현되고 있는 캘러스들을 효과적으로 선발할 수 있도록 한다. 그 후 분열조직으로부터 신초 발생을 유도하여 형질 전환된 식물체를 생산한다. 본 발명을 수행하는 데에 사용한 마늘 시료는 단양 및 의성 지역종 마늘이다.

이 발명의 목적, 장점 및 특성은 이하 명세서와 도면을 통해 더욱 명백할 것이다. 이 발명에서는 미세입자 투사법을 이용한 식물 형질전환법이 마늘 형질전환에 성공적으로 적용할 수 있는 것으로 밝혀졌고, 이 방법을 이용하여 제초제 저항성 형질 전환 마늘을 개발할 수 있었다. 이 발명에 이용된 기술은 앞으로 다양한 목적 유전자를 마늘에 형질 전환시키는데 동일하게 적용될 수 있기 때문에 이를 이용하여 유전공학적으로 병충해 저항성 마늘, 냄새없는 마늘, 무주아 마늘, 약리성분이 강화된 마늘 등 상업적으로 가치가 있는 형질전환된 마늘의 품종 개발이 가능해진다.

여기에 기재된 방법은 마늘 식물체의 게놈 내로 외래 목적 유전자들을 인위적인 조작을 통해 이식하는 것에 관한 것이다. 그러한 외래 유전자들은 동,식물 및 미생물 등 다른 종으로부터 유래된 유전자 DNA 모두가 바람직하고, 외래 유전자들은 일반적으로 특정한 RNA 전사체 또는 목적 단백질을 합성할 수 있는 염기서열을 포함한다.

DNA 운반체 (vector)는 전형적으로 단백질의 발현을 야기시키는 데에 효과적인 발현조절부위 (regulatory sequence)을 포함한다. 발현조절부위의 예로는 식물세포에서 전사(transcription)를 조절하기에 충분한 프로모터 (promoter), 그리고 전사 또는 번역(translation)을 정상적으로 종결 시켜 온전한 유전자 생성물을 얻기에 충분한 폴리아데닐레이션 (polyadenylation) 서열 및/또는 터미네이터 (terminator)가 있다. 또한 유전자의 효과적 발현, 특히 단백질 생성물의 발현 효율을 증진시키기 위해서 프로모터 주위에 전사 및 번역 효율 증진 부위(enhancer)를 포함시키는 것도 가능하다. 특히 프로모터를 적절히 선택하면 형질전환된 세포 내에서 유전자를 상시 (constitutive) 발현시키거나, 조직특이적 혹은 특정 인자에 의해 유도 (inducible) 발현시키는 조작이 가능하다.

마늘 형질전환에는 다양한 목적 유전자들이 이용될 수 있다. 병충해 및 제초제 등에 대한 저항성을 제공할 수 있는 효소 단백질 유전자, 대사를 조절하여 약리 성분을 강화하거나 냄새를 약화시키는 반응에 관여하는 효소 단백질 유전자, 무주아 마늘 등 식물의 생장 및 형태변이에 관여하는 유전자 등 매우 다양할 수 있다. 유전자는 원핵생물 또는 진핵생물, 즉 박테리아, 곰팡이, 효모, 바이러스 등 미생물, 식물 및 동물에서 유래한 어떠한 유전자라도 활용이 가능하다.

미세 입자 투사법으로 식물체 형질전환에 사용되는 재조합 플라스미드 (recombinant plasmid)는 1 종류 이상의 유전자 카세트(cassette)가 포함되어 있는데, 그 유전자 산물은 독립적으로 혹은 상호 작용할 수 있다. 다양한 카세트가 이용될 때에는, 동일한 플라스미드 또는 아그로박테리움 방법과 달리 다른 플라스미드에 각각 따로 위치할 수도 있다. 다른 플라스미드에 카세트가 따로 따로 존재할 때, 이들 플라스미드는 동일한 미세입자 (microprojectile)에 코팅하여 사용하거나, 각각 다른 미세입자에 코팅하여 사용할 수도 있고 또는 따로 코팅한 이들 미세입자들을 서로 혼합하여 표적 조직에 투사할 수도 있다.

발현 카세트는 전사를 조절하는 프로모터, 전사 개시 부분, 번역 개시 코돈 (codon), 단백질의 아미노산 암호화 부위, 번역 정지 코돈에 뒤따라 전사를 종결짓는 전사 터미네이터 (transcriptional terminator) 등이 전사 방향인 5'-3' 쪽으로 배열되어 있다. 발현 카세트는 또한 적어도 1 개 이상의 복제 원점 (origin of replication)을 지니는 플라스미드 벡터 (vector)와 같이 재조합된다. 편의상, 대장균에서 작용하는 복제 원점을 지니는 것이 일반적이다.

형질전환에 사용되는 재조합 유전자는 복제 원점 외에도 선별 유전자 (selectable gene), 표지 유전자 (marker gene), 목적 유전자 (target gene) 등 다양한 유전자 발현카세트로 구성된다. 선별 유전자들은 항생물질, 독소, 중금속 또는 그와 같은 바이오사이드(biocide)에 대해 내성을 부여하는데, 예를 들면 NPTⅡ (neomycinphosphotransferase), HPT (hygromycin phosphotransferase), CAT (chloramphenicol acetyltransferase), 니트릴레이즈 (nitrilase) 및겐타마이신(gentamicin) 저항성 유전자 등이 있다. 한 프라스미드에는 적어도 1개 이상의 선별 유전자가 존재하는데 이는 개개의 숙주에 서로 다른 선별 유전자들이 이용되기 때문이다. 즉, 한 개의 선별 유전자는 대장균 등 원핵 세포 숙주에서의 선발에 이용되며, 다른 선발 유전자는 진핵 세포 숙주에서의 선발에 이용되어진다.

형질전환 식물에서 새로운 화합물의 생성을 통한 가시적 표현형(visual phenotype)을 제공하는 적절한 표지 유전자의 예로는 인디고(indigo)를 생성하는 GUS (β-glucuronidase), 아세틸클로람페니콜을 생성하는 CAT, 가시적으로 빛을 내개하는 루시퍼레이즈 (luciferase), 녹색 형광을 내는 GFP (green fluorscent protein) 등이 사용되고 있다.

목표 유전자 카세트는 형질전환된 식물체에서 목표하는 형질을 부여할 수 있는 유용 유전자 재조합체이다. 형질전환에 의한 분자 육종의 목적은 바로 이 목표 유전자의 이식 발현에 있다. 따라서 형질전환 식물체의 고유성은 이 목표 유전자에 의해 결정될 수 있다.

다양한 유전자 및 벡터의 재조합 및 클로닝 기술들은 문헌에 상세히 예시되어 있다. (Sambrook 등, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1987)

DNA를 코팅한 미세 입자들을 식물 세포 내로 효과적으로 이식하기 위해서는 다양한 입자 가속 장치가 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 이 장치의 예가 바이오리스틱스 입자 가속 장치 (모델 Biolistic PDS-1000/He)로 바이오-라드 (Bio-Rad Laboratories, USA)에서 구입 사용 가능하다. 미세입자는 금속, 유리, 실리카, 얼음, 폴리에틸렌, 폴리프로필린, 폴리카보네이트및 카본 화합물(예를 들면, 흑연, 다이아몬드) 등이 가능하나 현재로는 금속 입자가 바람직하다. 적절한 금속 입자의 크기와 종류에는 제한이 없으나 이번 실험에서는 직경 0.5 - 3 ㎛ 크기의 텅스텐, 금 및 이리디움 (iridium) 입자를 포함한다. DNA가 코팅된미세입자는 가압된 헬륨에 의해 신속히 추진된다. 미세입자가 표적판에 있는 세포의 세포벽을 관통할 때 입자에 코팅된 DNA 들을 표적 조직의 세포 안으로 이식 시킨다. 이 때 헬륨 공기의 유입으로 마이크로프로젝타일의 추진력이 과도하게 저하되는 것을 방지하기 위해 투사 실시 전에 입자투사 챔버를 부분적으로 진공으로 만든다. 챔버는 표적 조직이 그들의 입자투사 동안 분리되지 않도록 부분적인 진공을 가한다.

표적 조직의 예로는 배아, 줄기, 정단 및 뿌리의 분열조직 그리고 캘러스와 같은 유도된 분열조직을 포함한다. 특정 조직의 선택은 이용 가능한 클론적 증식 방법과 조직의 재분화 능력에 따라 다양해질 수 있다.

이 발명의 실시를 위해 바람직한 클론적 증식 방법을 다음에 기재한다. 이 방법은 다음의 몇 가지 단계로 구성되어 있는데; 1) 마늘 인편의 생장점에서 형질전환에 적합한 캘러스를 얻기 위해 충분한 기간 동안 특정한 배지에서 캘러스를 유기 시키고; 2) 분열조직의 왕성한 발생을 자극하기 위해 미세입자 투사 전 적절한 시기에 새 증식 배지로 옮기며; 3) 재조합 유전자 DNA를 투사한 후 형질전환 세포를 선별 증식시키고; 4) 재분화에 의한 신초의 형성을 유도하기에 충분한 시간 동안 재분화 배지에 처리하고; 5) 재분화된 신초들은 뿌리가 자라 유식물체로 성장할 때까지 영양배지에서 배양하고; 6) 형질 전환된 마늘 식물체를 순화시킨 후 토양에 이식하여 완전한 식물체로 자라게 한다.

마늘의 캘러스는 배양 중 표면에 점성 물질을 형성하여 외래 유전자를 이식시키는 형질전환 과정에서 장애가 된다. 따라서 이러한 점성 물질의 형성을 최소화하여 형질전환 효율을 높이기 위하여 이번 실험에서는 캘러스 증식 배지 조성과 투사 전 계대 배양 시기를 조절하여 외래 유전자가 마늘 캘러스 내의 게놈에 효과적으로 삽입되도록 하였다. 위에 기재된 방법대로 미세 입자 투사 전에 새로운 배지로 목표 캘러스를 옮겨주는 이유는 입자투사될 조직에서 더 많은 수의 세포들을 형질전환이 잘되는 세포분열의 특정 주기 내에 존재하게 하여 형질전환 빈도를 높이는 효과를 낳게 된다. 즉 조직 내에서 특정 주기 에 있는 더 많은 세포들을 대상으로 투사할수록 형질전환 가능성도 높아지게 된다. 따라서 표적조직의 첫 번째와 두 번째 층 정도의 표면 분열조직을 형성하기에 필요한 시간만큼 새로운 캘러스 증식 배지에서 기른 후 입자투사를 실시하도록 한다.

세포로 전달된 미세 입자들에 코팅된 외래 재조합 유전자 DNA는 투사된 세포의 게놈에 삽입된다. 적절한 조건에서 형질전환 세포를 선별한 후, 식물체를 재분화 발생시킨다. 형질 전환된 식물체를 얻기 위해 식물 조직에 입자투사법으로 형질전환을 실시할 때, 형질 전환된 세포와 비형질전환된 세포를 모두 함유하는 키메라(chimera) 형질전환 식물체의 발생을 피하는 것이 중요하다. 즉 캘러스와 같은 미분화 분열 조직 내로 유전자 DNA를 투사함으로써 키메라가 아닌 (non-chimeric) 형질전환 식물체를 얻는 것이 중요하다. 캘러스 단계에서 확실한 선별을 거쳐 일단 형질전환 신초가 나오면 이는 다신초 증식 방법 (대한민국 특허 특0134140)으로신초의 대량 증식이 가능한 바, 본 발명은 입자 투사 전에 형질 전환 가능한 캘러스를 특정한 배지 조건에서 증식시킴으로써 형질전환의 효율을 증가시키고, 재분화 단계를 거쳐 안정하게 형질전환된 마늘 식물체를 대량 얻을 수 있게 한다.

우수한 선별유전자의 선택은 형질전환 방법에서 필수적 부분이다. 형질전환 세포의 효과적인 선별에 중요한 요인들은 선별 유전자의 구조, 발현 수준 및 선별제의 선택이다 (Wilmink and Don,Plant Mol. Biol. Rep.11; 165-185, 1993). 선별 유전자들은 항생물질, 대사길항물질 및 제초제 등에 대해 저항성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는데, 아미노산 또는 동족체의 독성에 대한 저항성을 부여하기도 한다. NPTⅡ는 식물의 형질전환을 위한 선별유전자로 가장 널리 이용되고 있다. 선별 유전자에 대한 식물 세포의 민감도는 생리학적 상태, 식물의 크기 및 기원 조직과 조직 배양 상태에 따라 다르다. 그러므로, 비형질전환된 세포의 생장을 완전히 저해할 수 있는 선별제의 최소 수준을 형질전환체 선별 및 재분화 효율을 고려해 결정한다. 비형질전환된 세포의 생장을 효율적으로 억제하는 한편 인접한 형질전환 세포에 대해 사멸한 세포의 독성을 최소화 할 수 있도록 계대 배양 기간을 결정한다.

표지 유전자는 형질전환된 조직 및 식물체에서 표식이 쉬운 생성물을 형성하는 효소를 암호화하는 유전자이다. 유용한 표지 유전자는 GUS를 예로 들수 있는데 이는 입자 투사에 뒤따르는 유전자의 일시적 발현과 선별 후 재분화된 식물체의 다양한 조직에서 유전자가 안정적으로 발현되는 모습 모두를 효과적으로 관찰할 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만 다음 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 기술되어진 것으로 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

[실시예 1] 형질전환에 적합한 캘러스의 유도

마늘 인편의 생장점에서 유도된 초기의 캘러스는 배지에서 증식되는 속도가 느린 편이며, 세포 주변에 당질류의 대사산물이 분비되고 점질의 막이 생겨 형질 전환 대상 조직으로 사용하기 어렵다. 따라서 본 발명에서는 캘러스 증식과 재분화에 영향을 미치는 것으로 나타난 배지 조성과 계대 배양 시기를 조절하여 입자투사에 의한 재조합 외래 유전자가 마늘 캘러스의 게놈에 효과적으로 삽입되고 재분화되도록 하였다.

단양과 의성 지역종 마늘을 수집하여 표면 껍질을 제거하고 인편의 표면을 70% 에탄올에 2 분, 표백제 (0.5% 차아염소산 나트륨용액; NaOCl)로 10분간 소독하였다. 멸균수로 3회 정도 세척한 후 시료의 근경 최상부에 존재하는 생장점을 (0.3 mm 이하)를 현미경하에서 적출하고 식물 생장 조절 물질인 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 0.1 ppm (mg/l)이 들어있는 MS 고체 배지 (Murashige and Skoog; Murashige and Skoog,Plant Physiol. 15; 473-497, 1962) 에서 3-4 개월 배양하여 캘러스를 유도하였다.

식물 조직 배양에 사용되고 있는 배지에 들어 있는 여러 가지 무기 영양소 중 세포의 생장과 재분화에 일반적으로 가장 많은 영향을 미치는 원소는 질소이다. 따라서 이 실험에서는 배지 조성 중 질소원의 함량을 집중적으로 검토하였다. 식물조직 배양에서 일반적으로 사용하는 MS 배지에는 질소원으로 질산암모늄 (NH₄NO₃) 1650 ppm과 질산칼륨 (KNO₃) 1900 ppm이 들어 있다. MS 배지의 다른 성분과 함량은 그대로 유지하면서 이들 질소원 각각의 농도를 변화시켰을 때, 형질전환에 사용할 캘러스 증식은 질산암모늄의 농도가 MS 배지의 절반 수준 (825 ppm)으로 낮추었을 때 가장 좋은 생장을 보였고 질산칼륨의 경우는 MS 배지의 2 배 수준 (3800 ppm)으로 높였을 때 캘러스의 생장이 가장 좋았다 (표 1). 한편 캘러스의 생장 속도가 빠를수록 표면의 점질 물질 분비는 현저히 감소하였다.

형질전환을 위한 마늘 캘러스 배양 배지 조성

질소원	질산 암모늄	질산 칼륨
질소원 농도(MS 대비)	1/4	1/2	1	2	4	1/4	1/2	1	2	4
질소원 농도(PPM)	412.5	825	1650	3300	6600	475	950	1900	3800	7600
캘러스 증식율(%)	266	332	301	233	221	257	263	298	340	301

따라서 질산암모늄의 농도를 반으로 줄이고 질산칼륨은 MS 배지의 2 배 농도 (변형 MS 배지)에서 6 개월 내지 1 년간 계대 배양을 반복하여 캘러스를 증식시켜 점성이 없고 형질전환 효율과 재분화율이 높은 캘러스를 확보하였다.

이렇게 얻은 캘러스의 성능을 확인하기 위하여 GUS 유전자를 재조합한 플라스미드 pCambia1201 (MRC, UK)을 사용하여 입자 투사를 실시하고 3 일 후 GUS 유전자의 발현을 검정한 결과는 도 1 에서와 같이 현저한 차이를 보였다. 그림의 왼쪽은 MS 배지에서 4 개월 배양한 캘러스이고 오른쪽은 이 발명을 통해서 최적화한 조건에서 배양한 캘러스를 비교하였는데 투사한 외래 유전자 GUS의 일시적 발현 효율은 50 - 100 배의 차이를 보였다.

[실시예 2] 효과적인 선별제 선정

형질전환체를 선별하는 단계에서 여러 가지 항생제나 제초제를 선별제로 이용하였다. 마늘의 경우 아직까지 여러 가지 선별제에 대한 내성 조사가 보고된 바 없다. 따라서 담배, 벼 등의 형질전환식물 선별에 유용하게 사용되는 항생제 가나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin) 그리고 제초제 PPT (phosphinothricin)을 사용하여 마늘 캘러스의 내성을 조사한 결과 도 2 에서와 같이 캘러스 증식 배지의 경우 하이그로마이신 50 ppm이 포함된 경우 (왼쪽), 재분화 배지의 경우 하이그로마이신 25 ppm이 포함된 경우 (오른쪽) 비형질전환 캘러스가 모두 죽었다. 가나마이신과 PPT의 경우 각각 500 과 50 ppm 에서도 살아서 자라는 캘러스가 관찰되는 등 확실한 선별 효과를 관찰할 수 없었다. 형질전환체를 선별하기 위한 목적으로 마늘이 아닌 다른 식물의 경우 가나마이신은 일반적으로 500 ppm 그리고 PPT는 50 ppm 까지의 농도로 사용된다. 따라서 마늘 형질전환체 선별을 위하여 하이그로마이신을 선별제로 선정하고 하이그로마이신 저항성 유전자를 선별 유전자로 재조합하여 금 혹은 텅스텐 입자에 코팅하고 입자 투사을 실시하였다.

[실시예 3] 입자총의 입자 투사 조건

생장점에서 유기 후 6 개월 이상 안정화 단계를 거친 표적 캘러스를 새 고체 배지로 옮겨 7-15일간 활발한 세포 분열을 유도하고 입자 투사를 실시하였다. 이는 입자투사 될 조직에서 더 많은 수의 세포들을 형질전환이 잘되는 세포분열의 특정 주기 내에 존재하게 하여 형질전환 빈도를 높이는 효과를 낳게 된다. 즉 조직 내에서 특정 주기에 있는 더 많은 세포들을 대상으로 투사할수록 형질전환 가능성도 높아지게 된다. 따라서 표적조직의 첫 번째와 두 번째 층 정도의 표면 분열조직형성하기에 필요한 시간 만큼 새로운 캘러스 증식 배지에서 기른 후 입자투사를 실시하도록 한다.

형질전환에 사용된 재조합 플라스미드 DNA를 Klein 등의 방법 (Kleinet al.,Nature327; 70-73, 1987)에 따라 250 mM 염화칼슘과 100 mM 스퍼미딘을 첨가하여 미세립자와 잘 섞운 후 침전시킨다. 미세입자는 지름이 약 0.6 ㎛인 금(gold) 입자 또는 0.7 ㎛인 텅스텐 입자을 사용하였으며 이들은 입자총 (Biolistic PDS-1000/He)과 함께 바이오-라드 (Bio-Rad Laboratories, U.S.A.)에서 구입하였다. 실제 입자 투사 조건은 여러 번 반복 실험으로 형질 전환 효율이 최대가 되도록 조정하여 실시하였다. 한 번 투사에는 10 ㎍의 플라스미드 DNA를 코팅한 약 750 ㎍의 입자들을 7 ㎕ 부피 정도로 분출시켰다. 투사 실시 후 일시적인 GUS 표지유전자 발현 분석 결과 입자총 챔버 내부의 진공상태는 25-30 inch Hg , 헬륨압력은 1000-1500 psi, 입자 이동 거리는 3-5 인치, 배플은 63-212 ㎛ 크기를사용하여 실시하는 것이 가장 효과적인 것으로 결정되었다. (표 2)

미세 입자 투사 조건

챔버 내부 진공도 (inch Hg)	25 - 30
헬륨 압력 (psi)	1000 - 1500
입자 이동 거리 (inch)	3 - 5

[실시예 4] 재조합 프로모터 선정

식물에 이식된 외래 유전자가 효과적으로 발현되도록 조절하는 유전자 발현 조절 부위 즉 프로모터는 여러 가지가 보고되어 있다. 일반적으로 단자엽 식물의 경우에는 단자엽 식물에서 분리한 프로모터가 효과적이고 인트론 (intron)이 첨가될 경우 효율이 수 배 내지 수십 배 증가하는 것으로 알려져 있다 (McEloryet al., Plant Cell,2; 163-171, 1990). 마늘의 경우 이러한 프로모터 활성이 보고 된 바 없어 표지 유전자 GUS를 다양한 프로모터와 재조합 한 후 입자 투사를 실시하여 표지 유전자의 발현을 조사하였다 (도 3). 이 때 사용한 프로모터는 35S (꽃양배추 모자익바이러스의 35S 유전자 프로모터), 여기에 옥수수 알코홀 탈수소효소 유전자 (Adh1)의 인트론이 첨가된 35S-INT, 인트론을 포함하는 옥수수 알코홀 탈수소효소 유전자의 프로모터 Adh, 쌀에서 분리한 액틴 유전자 (Act-1)의 프로모터 ACT, 옥수수 유비퀴틴 유전자 (ubi-1) 프로모터 Ubi 등을 들 수 있다. 도 3에서 보는 바와 같이 지금까지 보고된 다른 단자엽 형질전환 식물체에서와 달리 마늘의 경우 벼 등의 단자엽 식물에서 분리된 프로모터보다는 35S 프로모터가 약 8 배 정도 더 효과적인 것으로 나타났고 특히 인트론이 없는 35S 경우가 인트론이 있는 35S-INT 보다 약 3 배 높게 나타났다. 따라서 이 후 실험에서는 35S 프로모터를 목적 유전자와 재조합하여 사용하였다.

[실시예 5] 형질전환용 재조합 유전자

이번 실시 예에서 사용된 마늘 형질전환용 재조합 유전자는 pC1301-ALSGUS 와 pCambia1201 (MRC, UK)를 사용하였으며 도 4에 나타나 있다. 각각의 벡터는 식물세포 내 발현 가능한 선별유전자 hpt (hygromycin phosphotransferase)와 표지유전자 GUS (β-glucuronidase) 카세트를 공통적으로 포함하고 pC1301-ALSGUS의 경우는 추가로 목표 유전자 ALS (acetolactate synthase) 카세트를 재조합하였다. 식물 유전자 발현 카세트 중의 하나인 hpt는 항생물질 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는데 hpt 발현 카세트는 35S 프로모터(P35S)와 35S 폴리아데닐레이션/터미네이터 (T35S)로 구성되어 있다. 두 번째 발현 카세트 GUS는 β-글루쿠로니데이즈 효소를 암호화하고, 그 발현 여부는 조직화학적 분석방법으로 검색할 수 있는데 35S 프로모터 (P35S) 혹은 유비퀴틴 프로모터 (PUbi)와 노파린 신테이즈 폴리아데닐레이션/터미네이터 (Tnos)로 구성되어 있다. 제초제 저항성 목적 유전자 ALS 카세트는 GLEAN^?(DuPont, USA)과 같은 설포닐유리아계 제초제에 대해 내성이 있는 애기장대의 돌연변이 아세토락테이트 신세이즈 효소 (Haughn et al., Mol. GenGenet. 211; 266-271, 1988)를 암호화하며 35S 프로모터(P35S)와 노파린 신테이즈 폴리아데닐레이션/터미네이터로 구성되어 있다.

[실시예 6] 입자투사 후 형질전환체 선별

형질전환을 위해 미세입자를 투사한 캘러스는 하이그로마이신이 포함되어 있지 않은 고체배지에서 7-14일간 배양한 후 6 주 간격으로 50 ppm 하이그로마이신이 포함되어 있는 고체 배지에 옮겨 배양하면서 새 배지로 옮기면서 4-6 개월간 선별하였다. 형질전환이 되지 않은 캘러스는 진한 황색으로 갈변하면서 죽어 가는데 비해 형질전환된 세포는 계속 분열하여 반투명한 흰색의 새로운 캘러스로 자라 나왔다.

또는 50 ppm 하이그로마이신 배지에서 일주일 경과 후 50 ppm 하이그로마이신이 포함되어 있는 새고체 배지를 만들어 굳기 전에 반고체 상태에서 캘러스 위에 부어 캘러스 표면을 덮도록 굳혀서 캘러스를 함몰시킨 상태에서 3-4 개월간 선별하는 방법이 더 효과적이었다 (도 5). 이 방법은 고체 배지 표면상에서 선발하는 경우 보다 단시간에 5 배 더 효과적으로 형질 전환 세포를 선별 배양할 수 있었다.

선별 배양 방법에 따른 형질전환체 선별 효율.

배양 방법	투사 캘러스 수	하이그로마이신 저항성캘러스 수 (%)	재분화형질전환체 수 (%)
표면 배양	1000	40 (4)	8 (0.8)
함몰 배양	900	4 (0.4)	4 (0.4)

[실시예 7] 형질전환체 재분화

하이그로마이신으로 선별한 형질전환 캘러스는 2.5 ppm 벤질아미노퓨린이 포함되어 있는 변형 MS 배지 (재분화 배지)에서 2 단계 과정을 거쳐 재분화 하였다. 즉, 하이그로마이신이 첨가되지 않은 재분화 배지에서 2 달간 배양 후, 하이그로마이신 20 ppm이 포함된 재분화 배지로 옮겨 배양하였다. 이때 신초 돌기가 형성되면 캘러스를 2-5 신초 덩어리로 나누어 새 배지로 옮겨주면서 4 달간 배양하였다. 2 cm 이상의 신초는 식물 생장 조절 물질을 제거하고 설탕 농도를 40 g/L 로 증가시킨 변형 MS 배지로 옮겨 배양하였다. 도 6에서와 같이 선별제가 있는 배지에서 왕성한 신초의 재분화를 확인할 수 있었다.

[실시예 8] GUS 염색법에 의한 형질전환체 분석

형질전환 여부를 확인하기 위하여 선별 재분화 시킨 시료를 2.0 mM X-Glu (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid) 용액에서 24-48 시간동안 염색 후 청색으로 나타나는 GUS 활성을 분석하였다 (도 7). 식물체 전체에 걸쳐 GUS 특유의 진한 청색 염색 반응을 보이는 것으로 보아 이 형질전환체는 키메라가 아닌 전신 형질전환체임을 확인할 수 있었다.

[실시예 9]PCR 증폭에 의한 형질전환체 분석

나아가서 선별 재분화 시킨 시료에서 게놈 DNA를 분리하고 PCR 증폭 및 서던 블롯으로 재조합 유전자의 이식 여부를 확인하였다. 형질전환체에서 HPT와 ALS 특이 시발체 (primer)를 사용하여 PCR 증폭시킨 후 HPT 와 ALS 특이 탐침을 서던 블롯을 실시한 결과 비형질전환체 (wild)에서는 어떤 신호도 나타나지 않았으나 pCambia1201을 이식한 식물체에서는 HPT 유전자가, pC1301-ALSGUS 유전자를 이식한 식물체에서는 HPT와 ALS 유전자가 예상대로 모두 이식된 것을 확인 할 수 있었다 (도 8).

[실시예 10] 노던 블롯에 의한 형질전환체 분석

또 선별된 시료에서 전체 RNA를 분리후 노던 블롯 분석을 통하여 도입된 외부 유전자가 형질 전환체에서 안정적으로 발현이 이루어짐을 확인하였다. HPT 와 ALS 특이 탐침을 노던 블롯을 실시한 결과 비형질전환체 (wild)에서는 어떤 신호도 나타나지 않았으나 pCambia1201을 이식한 식물체에서는 HPT 유전자가, pC1301-ALSGUS 유전자를 이식한 식물체에서는 HPT와 ALS 유전자가 예상대로 모두 안정적으로 발현되는 것을 확인 할 수 있었다 (도 9).

[실시예 11] 형질전환체 대량 증식 및 토양 이식

형질전환체 분석 과정을 통해 형질전환체로 확인된 신초는 씨마늘 증식 방법 (대한민국 특허 특0134140)에 따라 다신초를 유도하여 증식시켰다. 이후 4 ℃에서 4-8 주간 저장 후 설탕 농도를 90 g/L로 조정한 변형 MS 배지 (구형성 배지)로 옮겨 2-4 개월간 배양하여 소구를 형성시켰다. 이후 소구는 토양에서 발아시켜 형질전환 마늘 식물체를 얻었다 (도 10).

[실시예 12] 제초제 저항성 검정

제초제 저항성 유전자가 형질 전환된 마늘의 제초제 저항성을 검정하기 위하여 제초제 GLEAN^?이 4 ppm이 포함되어 있는 배지에서 2 개월간 배양하였다. 대조군으로 사용한 비형질전환 마늘의 경우 살아 남지 못하고 죽은 반면 형질 전환체의 경우 4 ppm 농도에서도 건강히 자라는 것을 관찰하였다 (도 11).

이 발명의 효과는 재조합 유전자를 미세입자 투사법으로 이식하여 마늘 식물체를 형질전환시키는 유효한 방법을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 생성된 캘러스를 형질전환시키기 위한 입자 투사 전 내지 투사 후 분열조직의 배양 및 선별 조건을 제공하며, 이어서 효과적인 재분화 및 증식 과정을 거쳐 형질전환 마늘 식물체를 얻게되는 조건을 제공하는데, 이는 궁극적으로 재조합 유전자를 마늘에 이식 발현시키는 유전공학적 기술의 광범위한 적용 가능성을 지니는 방법 (methodology)을 제공한다.

Claims

유전공학적으로 조작한 형질전환 마늘 식물체 제조방법에 있어서,

형질 전환에 적절한 캘러스를 생산하기 위하여 특정 배지에서 6 개월 이상 계대 배양하여 형질전환과 재분화 효율이 높은 표적 세포를 생산하고,

표적 세포인 캘러스에 미세립자를 물리적으로 가속을 가하고, 상기 미세립자는 최소한 관심있는 외래 목적 유전자와 선별에 활용될 수 있는 선별 유전자 하나를 포함하는 재조합 유전자들을 전달하며,

물리적으로 외래 재조합 유전자를 세포 내로 이식 시키는 효과적인 조건으로 금속 입자의 종류와 크기, 사출 압력 및 시료와의 거리 등 투사 후 외래 유전자가 발현되는 캘러스를 효과적으로 선발, 증식하기 위하여 특정한 선별 물질 하이그로마이신을 사용하며,

선별제를 함유하는 고체 배지를 반고체 상태에서 첨가하여 캘러스를 함몰 상태에서 배양 선별하며,

선발된 캘러스에서 형질 전환된 신초를 유도하며,

그후 생성된 신초를 다신초 증식 방법에 의해 형질 전환된 마늘로 재발생시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 마늘 식물체 (Aliium sativumL.)의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 마늘 세포는 백합과 파속에 속하는 것을 특징으로 하는 형질 전환 마늘 식물체 (transgenic garlic)의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 캘러스 조직은 분열조직을 포함하고, 분열조직으로의 유도 및 식물 또는 유식물로서의 재분화가 가능한 조직임을 특징으로 하는 형질전환 마늘 식물체 제조방법.
제 1항에 있어서, 일차 캘러스는 마늘 인편의 생장점으로부터 유도된 분열조직을 포함하고, 캘러스는 식물로 재분화가 가능한 조직이고, 증식적 캘러스로의 유도 및 식물 재분화가 가능한 조직임을 특징으로 하는 형질전환 마늘 식물체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 형질전환 효율이 높은 분열성 캘러스를 얻기 위한 배지 조성 중 질산암모늄의 농도를 MS 배지의 절반 수준으로 그리고 질산 칼륨을 MS 배지의 2 배로 하는 것을 특징으로 하는 형질전환 마늘 식물체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 외부 유전자 구조체는 선별 가능한 표지 유전자로 GUS 유전자를 포함하여 그의 발현이 캘러스 및 재분화 신초에서 검색 가능하며, 선별에서 생존한 형질전환체의 특성을 확인 가능함을 특징으로하는 형질전환 마늘 식물체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 선별 유전자로 하이그로마이신 저항성 유전자를 포함하여 선별에서 생존한 형질전환 세포의 특성으로 확인 가능함을 특징으로 하는 형질전환 마늘 식물체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 미세입자는 지름이 약 0.5∼3 ㎛인 금속 입자를 포함함을 특징으로 하는 형질전환 마늘류의 제조방법.
제 1항에 있어서, 다수의 상기 미세입자를 제공하고, 상기 외부 유전자 구조체를 지닌 미세입자를 상기 식물 표적 조직에 투사시킴을 특징으로 하는 형질전환 마늘류의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 투사 후 외래 유전자가 발현되는 캘러스를 효과적으로 선발, 증식하기 위하여 고체 배지에서 일부 배양 후 선별 물질을 함유하는 고체 배지를 반고체 상태에서 첨가하여 캘러스를 함몰 상태에서 배양하여 형질전환체를 선별함을 특징으로 하는 형질전환 마늘 식물체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 더 나아가 상기 형질전환된 식물 조직으로부터 뿌리의 발생의 과정을 포함함을 특징으로 하는 형질전환 마늘류의 제조방법.
제 1항의 유전자 재조합 방법에 따라 제조된 형질전환 마늘.