KR100362940B1

KR100362940B1 - 헤마테인을 함유하는 고지혈증 및 동맥경화증 예방 및치료용 조성물

Info

Publication number: KR100362940B1
Application number: KR1020020027396A
Authority: KR
Inventors: 정태숙; 이새봄; 이은숙; 복성해; 오구택; 이병재; 최재훈; 이형규; 오세량
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2002-11-30
Also published as: KR20020060115A

Abstract

본 발명은 유효량의 헤마테인을 함유하는 고지혈증 및 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 의약용 및 식품용 조성물을 포함한다. 헤마테인은 LDL-항산화제 활성을 나타내며, 혈중 콜레스테롤을 현저하게 감소시키고, 간 마이크로좀 ACAT 활성을 강력하게 저해하므로, 헤마테인을 함유하는 본 발명의 조성물은 고지혈증 및 동맥경화증의 치료 및 예방을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

헤마테인을 함유하는 고지혈증 및 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING HYPERLIPIDEMIA AND ATHEROSCLEROSIS COMPRISING HEMATEIN}

본 발명은 헤마테인을 함유하는 고지혈증 및 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 의약용 및 식품용 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 LDL(저밀도 지단백질)-항산화제 활성, 혈중 콜레스테롤 강하 활성 및 아실-코에이: 콜레스테롤 아실트랜스퍼레이즈(ACAT) 저해 활성을 나타낸다.

혈중 콜레스테롤 증가로 인한 동맥경화는 노화와 더불어 주요 질환중의 하나로서, 임상 및 기초분야에서 가장 활발히 연구되고 있다. 지금까지 동맥경화증의 발병 메카니즘에 대해서는 여러 가지 가설이 있는데, 그 중에서도 대표적인 것으로는 "변형된 저밀도 지단백질(modified low density lipoprotein; M-LDL)"에 대한 가설을 들 수 있다(Steinberg, D.et al.,N. Engl. J. Med., 320, 915-924 (1989)).

LDL은 콜레스테롤 에스테르의 형태로 콜레스테롤을 운반하는 중요한 운반체이다. LDL은 중간밀도 지단백질(IDL)을 지나 초저밀도 지단백질(VLDL)로부터 생성된다. LDL은 모세관 내피 세포들 사이의 접합점을 통과해 아포(apo) B-100 단백질을 인식하는 세포막의 LDL 수용체에 결합한다. LDL 수용체와 접합한 후 세포내로 들어오게되고 리소좀 분해(lysosomal degradation)를 통해 유리 콜레스테롤이 된다. 콜레스테롤은 HMG-CoA 환원효소에 의해서 합성되기도 하고 음식물로부터 유입된 콜레스테롤에 의해 합성이 억제되어 항상성을 유지한다. 유리 콜레스테롤은 아실-코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼레이즈(acyl-CoA:cholesterol acyltransferase; ACAT)의 자극을 받아 콜레스테릴 에스테르로 에스테르화된다. LDL 수용체는 세포내 콜레스테롤이 증가하면 감소하는 방향으로 조절이 일어난다. 이처럼 정상적인 천연 LDL은 세포내에서 콜레스테롤 합성을 조절하는 역할을 하는데 이것이 산화 변형되어 Ox-LDL로 되면 동맥경화 발병의 원인이 되기도 하고 동맥경화를 더욱 악화시키기도 한다. 처음 LDL이 산화되는 동안 최소한으로 변형된 LDL(MM-LDL)은 내피하강(subendothelial space)을 형성한다. MM-LDL은 내피에 점착해 단구 화학주성 단백질(monocyte chemotactic protein-1; MCP-1)과 마크로파지-콜로니 자극 인자(macrophage-colony stimulation factor; M-CSF)의 분비를 유도한다. 이것은 M-CSF가 조직 마크로파지의 증식을 촉진시키고 마크로파지는 MM-LDL을 더욱 산화시켜 Ox-LDL은 더 이상 LDL 수용체에 인식되지 않고 그 대신 단구-마크로파지의 스캐빈져(scavenger) 수용체에 포착되어 세포내의 콜레스테롤 함량을 조절하지 못하게 된다. 따라서, 마크로파지내에 콜레스테롤이 축적되어 포말 세포를 형성하게 된다. Ox-LDL은 단구에 대한 효과적인 화학 친화물질이며 마크로파지 이동을 강하게 억제시켜 동맥벽에 마크로파지가 오래 머물도록 한다. Ox-LDL은 세포독성을 나타내며 내피의 기능이상을 촉진하고 지방 선조(fatty streak)를 형성하여 그 영역을 더 넓혀가고 동맥벽의 다른 유전자의 발현에 변화를 가져와 동맥경화를 촉진시킬 수도 있다.

일반적으로 LDL 산화는 항산화제로부터 격리된 마이크로도메인(microdomain)과 동맥의 맥관내막(intima)에서 일어나는 것으로 믿어져 왔으며, 동맥경화에서 Ox-LDL에 대한 역할에 대한 연구는 계속 이루어지고 있다. LDL은 단구-마크로파지와 평활근 세포(smooth muscle cell), 내피 세포(endothelial cell)와 같은 동맥벽의 주요 세포에서 철과 구리와 같은 전이금속에 의해 산화적으로 변형될 수 있다. LDL의 내부를 살펴보면 콜레스테롤 에스테르 핵을 인지질(phospholipid)과 α-토코페롤, β-카로틴과 같은 지방친화성(lipophilic) 항산화제가 둘러싸고 있다. LDL은 구리 이온과 함께 반응시킴으로서 시험관내(in vitro)에서나 세포에서 모두 산화를 유도할 수 있고, 따라서 산화결과 LDL 입자의 물리화학적 성질이 변하게 된다. 처음에는 지방친화성 항산화제가 LDL 입자의 변형을 막게된다. 그러나 항산화제 소모 후에는 인지질의 고도 불포화지방산(polyunsaturated fatty acid)이 산화된다. 초기산화에서는 상대적으로 아포 B-100 단백질은 고유의 성질을 유지하게 되며 LDL 입자는 최소한으로 변형된다. 그러나 반응이 진전되고 계속되면 산화된 지질 산물은 입자내에서 증가하고 축적된다. 그리고 아포 B-100 단백질에서 아미노산 잔기를 변형시켜 LDL 입자의 음전하를 증가시키고 LDL의 단백질 구성성분을단편화시킨다. 이러한 아포 B-100 단백질의 산화적 변형은 LDL 수용체와의 결합을 막고 스캐빈져(scavenger) 아세틸-LDL 수용체와 상호 작용하는 새로운 결합 에피토프(binding epitope)를 생성하고, 입자의 지질 코어에서 콜레스테롤 에스테르로부터 옥시스테롤(oxysterols)을 생성하게 할 뿐 아니라 포스파티틸콜린을 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine; lyso PC)으로 전환시켜서 세포 독성을 나타낸다 (Zhang, H.,et al.,J. Lipid Res. 31, 1361-1369(1990)).

LDL내의 항산화제 함량은 LDL의 산화억제에 중요하다. LDL내에 지방친화성 항산화제가 충분히 존재한다면 LDL은 산화공격으로부터 보호될 수 있다. 프로옥시단트(Prooxidant)의 공격과 항산화제 함량 사이의 균형은 동맥벽내에 존재하는 변형된 LDL의 함량에 의해 결정된다. 프로부콜(Probucol)이나 N,N'-디페닐렌디아민, BHT와 같은 항산화제는 산화정도를 약화시키고 죽종형성 영역을 감소시켰으나 부작용이 따른다. 따라서 α-토코페롤과 β-카로틴, 아스코르브산과 같은 천연 항산화제가 관심을 끌게 되었다. 특히 유기합성 항산화제와 비교하여 "GRAS(generally recognized as safe)"로 평가되는 천연 항산화제의 장점 때문에 최근 들어 유럽 및 미주 지역에서 천연물 유래 약용 및 기능성 식품의 중요성이 크게 부각되고 있다.

관상동맥성 심혈관 질환은 현재 모든 사망원인의 30% 이상을 차지하고 있으며 미국, 유럽 등 선진국에서는 심각한 문제가 되고 있다. 한편 개발도상국에서도 식생활의 서구화, 운동부족 등의 영향을 받아 심장병이 증가하고 있는 추세에 있다. 한국에서 문제가 되고 있는 뇌혈관 질환도 모세혈관의 경화현상에서 기인되는 경우가 흔하다. 혈중 콜레스테롤의 양이 높을 경우 혈관벽에 지방과 더불어 마크로파지, 포말세포(foam cells) 등이 생성, 침착되고 플라크(plaque)를 형성하여 혈액순환을 저해하는 동맥경화증세가 오기 쉬운 것으로 알려져 있다(Ross, R.Nature 362: 801-809(1993)). 혈중 콜레스테롤의 양을 줄이는 방법으로는 식이요법을 통해 콜레스테롤 및 지방성분의 섭취를 줄이는 방법이 있을 수 있다. 한편 간에서 활발하게 진행되는 콜레스테롤 생합성 속도를 늦추면 혈중 콜레스테롤을 줄일 수 있을 것이다.

혈중 콜레스테롤의 양을 줄이는 방법으로 콜레스테롤의 흡수를 억제하는 방법이 있다. ACAT 는 인체조직 속에서 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스테르로 전환시켜주는 효소이다. 대식세포(marcrophage)나 평활근(smooth muscle) 세포 유래 포말세포들의 형성은 실험적으로 유발시키거나, 임상학적인 동맥경화 현상에서 아주 중요한 병인이다. 포말세포들은 ACAT 작용에 의해 형성되고 혈액 속의 LDL에 의해 운반되는 콜레스테릴 에스테르를 많이 함유하고 있다. 동맥 혈관 벽에 있는 포말세포들은 ACAT 활성의 증가와 더불어 발견되는 경우가 많기 때문에, ACAT 저해제는 동맥경화 예방제가 될 가능성이 높다. 또한 간 속의 ACAT 활성을 저해할 경우 혈액속에 유통되는 LDL-콜레스테롤 수준을 낮출 수 있을 것이다(Witiak, D. T. and D. R. Feller(eds),Antilipidemic Drugs: Medicinal, Chemical, and Biochemical Aspects, Elsevier, pp. 159-195(1991)).

본 발명자들은 비교적 안전할 것으로 생각되는 생약재에 함유된 물질들의 약리 활성물질 탐색 연구를 수행하였다. 그 결과, 한약재로 사용하는 소목에 존재하는 헤마테인이 LDL-항산화제 활성이 있음을 본 연구에서 처음으로 발견하고, 이것이 고지혈증 및 동맥경화증의 치료 및 예방과 관련이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

헤마테인은 지금까지는 지시약 및 조직 염색용 염료로서 사용되어 왔다.

본 발명의 목적은 헤마테인을 함유하는 고지혈증 및 동맥경화증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 헤마테인을 함유하는 고지혈증 및 동맥경화증의 예방 및 치료용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 활성성분으로서 유효량의 헤마테인을 함유하는 고지혈증 및 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다. 또한, 헤마테인을 함유하는 고지혈증 및 동맥경화증 예방 및 치료용 식품 조성물 및 음료 조성물이 제공된다.

헤마테인은 소목(Heartwood ofCaesalpinia sappan)으로부터 추출하거나 상업적으로 입수할 수 있다.

헤마테인은 LDL-항산화제 활성을 나타내며, 고지혈증 및 동맥경화증 질환 모델동물인 ApoE 유전자 적중 마우스에 투여할 때, 혈중 콜레스테롤을 현저하게 감소시키고, 간 마이크로좀 ACAT 활성을 강력하게 저해함으로써 고지혈증 및 동맥경화증의 치료 및 예방 효과를 나타낸다.

현재까지 연구된 독성시험 결과, 헤마테인은 1,000 ㎎/㎏의 용량으로 쥐에게 경구투여하였을 때 독성이 거의 없는 것으로 밝혀졌다. 또한, 헤마테인은 간을 비롯한 장기의 기능에 어떠한 부작용도 나타내지 않는다.

고지혈증 및 동맥경화증을 예방 및 치료하기 위하여, 헤마테인을 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 고지혈증 및 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물을 제조할 수 있다. 이 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

헤마테인을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 3 mg 내지 10 mg의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 헤마테인은 또한 고지혈증 및 동맥경화증을 예방 및 치료할 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 경우에, 식품 또는 음료중 헤마테인의 함량은 0.1 내지 5 중량%일 수 있다. 건강보조식품용 개발을 위하여 본 발명의 헤마테인을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 육류, 음료수, 초코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알콜음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

이하 본 발명을 다음과 같이 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 소목(Heartwood ofCaesalpinia sappan)으로부터 헤마테인의 분리

국내 한약재상에서 구입한 소목 1 ㎏에 4ℓ의 아세톤을 첨가하고 상온에서 24 시간 방치한 후 여과지를 이용하여 액상 추출액을 분리하였다. 액상 추출액을 감압하에서 농축하고 수화 상태 500 ㎖로 만든 후, 동량의 에틸 아세테이트를 3 번 첨가하여 추출하였다. 추출된 에틸 아세테이트층을 모으고 감압 건조하여 얻은 홍갈색 물질(약 26 g)을 소량의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여서 100 % 클로로포름으로 충진된 실리카겔 컬럼(Merck, Art No. 9385, 7.5 x 24 cm)에 흡착시킨 후 클로로포름과 메탄올의 비율을 10:1, 5:1, 1:1, 100 % 메탄올로 변화시키면서 100 ㎖/분의 유속으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 행하였다. 용출물을 각 분획 당 500 ml씩 21 개의 분획으로 나눈 후, TBA(thiobarbituric acid)법으로 항산화제 활성을 측정하여 분획 4-6, 분획 15, 분획 21의 3개 활성 분획을 얻었다. 다음 단계로 활성 분획 15를 농축하여 세파덱스(Sephadex) LH-20 컬럼 크로마토그래피(3.5 x 90 cm)를 행하여 클로로포름/메탄올(1:9(v/v)) 용액으로 용출하면서 크기 배제(size exclusion) 방법에 의해 분리하여 8 개의 분획으로 나누었다. 이 중 활성이 강한 15-4 분획(40 ㎎)을 preparative-TLC(전개용매 CHCl₃/MeOH=5:1(v/v))를이용하여 다시 분리하였고, 분리된 분획 중 15-4-3(13 ㎎)의 분획이 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 이 순수물질의¹H-NMR 스펙트럼으로부터 방향족 화합물임을 알 수 있었고, 7.62 ppm (1H,d,H-1), 7.22 ppm (1H,s,H-11), 7.01 ppm (1H, d, H-2), 6.67 ppm (1H, s, H-8), 4.10 ppm (1H,d,H-6), 4.88 ppm (1H,d,H-6), 2.88 ppm (1H,d,H-7), 3.22 ppm (1H,d,H-7)의 피크와 8.7 ppm에 싱글렛 피크(singlet peak)가 존재하는 것으로부터 방향족 하이드록실기가 있음을 알 수 있었다. 분자량 측정 데이타(Mass data)의 301(M+H)에 나타나는 피크로부터 이 물질의 분자량이 300임을 확인할 수 있고, 따라서 분자식이 C₁₆H₁₂O₆로 추정되었다. 종합적으로 실험 데이타와 문헌상에 보고된 수치를 비교한 결과 이 물질이 하기 화학식 1의 구조를 갖는 헤마테인임을 알 수 있었다(Masuda, H.et al.,Chem. Pharm. Bull., 39, 1382-1384(1991): Oh, S. R.et al.,Panta Med., 64, 456-458(1999)).

실시예 2: 시판중인 헤마테인의 정제

소목으로부터 다량의 헤마테인을 분리하는 것이 용이하지 않으므로 시그마사(Sigma)로부터 시판되는 헤마테인을 구입하여 다음과 같은 방법으로 정제하였다.

시판되는 헤마테인 30 g을 곱게 갈아서 80 % 아세톤 1 ℓ에 밤새 교반(swirling)하였다. 여과지를 사용하여 용해되지 않은 물질은 제거하고, 감압하에 농축하여 용매를 제거한 후 물 1 ℓ를 넣었다. 이것을 에틸아세테이트 1 ℓ로 3번 반복하여 추출하고 감압하에서 농축하였다. 농축한 헤마테인을 소량의 DMSO에 녹여 실리카겔 컬럼(Merck, Art No. 9385, 10 x 25.5 cm)에 흡착시키고, 클로로포름과 메탄올의 비율을 10:1로부터 5:1, 3:1, 2:1 순으로 줄여가고 마지막으로 100 % 메탄올을 이용하여 용출시켰다. 뽑아낸 분획들은 약 10 % 정도로 농축해서 모아놓고 TLC 방법으로 헤마테인으로 추정되는 물질들만 따로 모으고, TLC상에서 보이는 불순물인 극성물질의 제거를 위해 부탄올로 추출한 후, 농축 건조하여 7.1 g의 순수 헤마테인을 얻어 동물실험에 사용하였다.

실시예 3: LDL-항산화제의 활성 측정

LDL-항산화제로서 헤마테인의 활성을 측정하기 위해, Cu²⁺-매개된 LDL-산화를 유발시키고 이때 생성된 불포화지방산의 산화 산물인 디알데하이드(dialdehyde)를 TBA(thiobarbituric acid)법으로 측정하였다(Packer, L. Ed. (1994)Methods inEnzymologyVol. 234, Oxygen radicals in biological systems Part D. Academic press, San Diego).

헤마테인을 DMSO를 이용하여 각각 200, 100, 75, 70, 65, 60 및 50 ㎍/ml로 용해시켜 제조된 헤마테인 용액 10 ㎕, 사람의 혈액으로부터 초원심분리기를 이용해 분리한 LDL 50 ㎕(50-100 ㎍ 단백질), 10 mM 인산염 완충 식염수(PBS) 180 ㎕를 혼합한 후에 0.25 mM CuSO₄10 ㎕를 첨가하므로써 반응을 시작하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후, 20% 트리클로로아세트산(TCA) 용액 1 ㎖을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 0.05 N NaOH 용액에 녹인 0.67% TBA 1 ㎖을 첨가하고 교반한 후, 발색반응이 일어나도록 95 ℃에서 5 분 동안 가열하고, 얼음물에 냉각하였다. 3,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고 상등액의 흡광도를 540 nm에서 측정하여 생성된 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 양을 계산하였다. 테트라메톡시프로판(malonaldehyde bis(dimethylacetal))의 저장용액을 이용하여 250 ㎕ PBS 용액에 0 내지 5 nmol MDA를 포함하는 표준용액을 만들어서 위와 같은 방법으로 가열하여 MDA의 생성 표준곡선을 구하였다.

그 결과, 헤마테인은 3 μM의 농도에서 LDL-산화를 50% 억제하였다(IC₅₀).

실시예 4: 헤마테인의 동물투여 실험

(단계 1) 유전자 적중 모델 동물

모델 동물로는 현재 세계적으로 개발된 모델 동물 중 인체의 질환과 가장 유사한 아포지단백질 E(ApoE) 유전자 적중 마우스를 사용하였다(Breslow, J. L.,Science,272, 685-688(1996)).

아포지단백질 E는 동맥 경화증의 원인이 되는 지단백질들을 저밀도 지단백질 수용체(LDLr)나 LDL 수용체 관련 단백질과 결합시키는 역할을 한다. 따라서 ApoE 유전자를 녹아웃(knock-out)시킨 마우스는 인체와 유사한 정도의 콜레스테롤 식이에서도 죽상 경화반을 형성하여 동맥 경화증을 유발한다. 본 실시예에서는 한국과학기술연구원 생명공학연구소에서 계대중인 ApoE 유전자 적중 마우스 대조군인 야생형 C57BL/6(wild type litter mater)(+/+)와 동형접합체(homozygote)(-/-)를 분양받아 사용하였다. 실험동물의 유전자형은 연쇄 중합효소 반응법(PCR) 또는 게놈의 서던 블랏팅 방법으로 확인하였다. 아포지단백질 E(ApoE) 적중 마우스는 SPF(Specific Pathogen Free) 동물 사육 시설에서 온도 21±2℃, 습도 55±5%를 유지하고, 명암을 12시간 주기로 조절하면서 사육하였다.

(단계 2) 실험동물의 식이 조성과 헤마테인의 동물투여 실험

13 주령된 ApoE 적중 마우스들을 인체의 식이와 비슷한 정도의 콜레스테롤을 포함하는 하기 표 1과 같은 조성의 정상식이(PicoLab^RRodent Diet 20, Product Code 5053, PMI Feeds회사(St. Louis, Missouri, 미국))로 사육하면서 대조군(control group)으로서 헤마테인을 투여하지 않는 군과, 실험군으로서 2일에한번씩 10 ㎎/㎏ 헤마테인을 복강내에 투여 한 군 및 2일에 한번씩 50 ㎎/㎏ 헤마테인을 복강내에 투여한 군을 설정하여 총 3개의 군으로 나누었다. 헤마테인 투여 실험은 3주 동안 실시하였다. 동물사육이 종료된 후 사육일지의 자료를 분석한 결과, 식이 섭취량과 체중증가에 있어서는 3 개군간 유의적인 차이가 없었으며 정상적인 성장율을 보였다.

(단계 3) 마우스의 혈중 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성 지질 함량 측정

실험에 사용한 모든 마우스에서 안와-후 천자(retro-orbital puncture)를 실시하여 혈장을 분리한 뒤 혈액내의 총 콜레스테롤(TC), 트리글리세라이드(TG), 고밀도 지단백질(HDL)의 양을 측정하였다. 혈장 HDL 분획은 덱스트란-설페이트를 포함한 HDL-콜레스테롤 시약(Sigma Chemical Co., Cat. No. 352-3)에 의해 분리하였다. HDL-콜레스테롤 농도의 측정을 위해서는 HDL-콜레스테롤 캘리브레이터(Sigma Chemical Co., Cat. No. C9908)를 사용하였다. 총 콜레스테롤 농도는 총 콜레스테롤 키트(Sigma Chemical Co., Cat. No. 352-100)를 사용한 효소발색법(Allainet al.,Clin. Chem.,20, 470-475(1974))에 의해 측정하였다. 트리글리세라이드(중성지질) 농도는 시그마 케미칼사 제품인 진단 키트(Cat. No. 339-50)를 사용하여 측정하였다(McGowanet al.,Clin. Chem.,29, 538-543(1983)). 그 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.

표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 2일에 한 번씩 10 mg/kg의 헤마테인을 투여한 군과 50 ㎎/㎏의 헤마테인을 투여한 군에서 대조군과 비교하여 총콜레스테롤이 각각 약 31%, 51% 씩 현저하게 감소하였으며, 특히 HDL의 양은 대조군보다 각각 약 85%, 120% 씩 현저하게 증가하였다.

실시예 5: 헤마테인의 ACAT 저해 활성

(단계 1) 간 마이크로좀 ACAT의 분리

ACAT 효소원으로서 수컷 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 래트(체중 150∼200 g)의 간조직을 문헌(Ericksonet al., J. Lipid Res., 21: 3569-3570(1980))의 방법으로 분리하여 생리식염수로 세척하고 4배 용량의 완충액A(0.25 M 슈크로즈, 1 mM EDTA, 0.01 M Tris, pH 7.4)를 가한 다음 빙욕에서 테플론 균질화기(Teflon homogenizer)로 균질화하였다. 균질액을 14,000 x g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 얻은 후 100,000 x g 에서 1시간 동안 초원심분리하였다. 이 침전물을 완충액 B(0.25 M 슈크로즈, 0.01 M Tris, pH 7.4)로 수세하고 분쇄시킨 후 1시간 동안 100,000 x g 에서 다시 초원심분리를 행하였다. 2차로 얻은 침전물을 4 ㎖의 완충액 B에 현탁시킨 후 우 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 표준단백질로 사용하여 로우리(Lowry)의 방법에 따라 단백질을 정량하고 단백질 농도가 8∼10 ㎎/㎖ 가 되도록 희석하여 200 ㎕씩 분취한 후 -80℃ 냉동고에 보관하였다.

(단계 2) ACAT의 활성 측정

ACAT의 활성은 [1-¹⁴C] 올레오일-CoA를 기질로 하고 문헌(Brecher Chan,Biochim. Biophys. Acta., 617: 458-471(1980))의 방법을 일부 수정하여 측정하였다. 각 실험개체의 간 마이크로좀 효소 4.0 ㎕, 분석 완충액(0.5 M KH₂PO4, 10 mM DTT, pH 7.4) 20.0 ㎕, 40 ㎎/㎖ BSA(지방산이 제거된 것, Sigma A6003) 15.0 ㎕, 20 ㎎/㎖ 콜레스테롤 2.0 ㎕, H₂O 41.0 ㎕를 혼합하여 37 ℃에서 15분간 예비 반응시켰다. 이 반응액에 [1-¹⁴C] 올레오일-CoA(0.02 μCi, 최종농도 10 μM) 8 ㎕를 첨가하여 다시 37℃ 에서 15 분간 반응시킨 후 이소프로판올-헵탄(4:1(v/v)) 1 ㎖을 가하여 반응을 정지시키고, 헵탄 0.6 ㎖과 5배로 희석한 분석 완충액 0.4 ㎖를 첨가한 후 원심분리를 행하였다. 효소활성의 측정은 원심분리하여 얻은 상층액 100 ㎕에 칵테일(Lipoluma, Lumac Co.) 4 ㎖를 첨가한 후 액체 신틸레이션 카운터를 이용하여 방사선량을 측정하였다. 활성도의 계산은 1 ㎎의 마이크로좀 단백질이 1 분간 생성해 내는 콜레스테릴 올레오에이트의 pmole 수(형성된 콜레스테릴 올레오에이트의 pmole/분/㎎ 마이크로좀 단백질)로 나타낸다.

(단계 3) 헤마테인 투여가 실험동물의 간조직 ACAT의 활성에 미치는 영향 분석

죽상경화반 형성에 중요한 역할을 수행하는 아실-코에이: 콜레스테롤 아실트랜스퍼레이즈(ACAT)의 활성도를 분석한 결과, 투여량-의존적으로 활성도를 억제하였다(표 3). ACAT는 장에서 콜레스테롤의 흡수, 간에서 지단백질의 합성 및 병변에서 콜레스테롤 침착에 관여하여 동맥경화증 유발에 중요한 역할을 수행하는 효소이다. 따라서 헤마테인은 ACAT의 활성도를 낮춤으로써 혈중 콜레스테롤 수치를 효과적으로 낮추었다고 볼 수 있다. 또한 시험관내(in vitro)에서 강력한 항산화효과가 관찰되었으므로 지질과산화 억제 및 염증반응의 중요한 매개체인 혈소판 활성인자(PAF)의 억제를 유도하여 생체내(in vivo)에서 죽상경화반 형성을 효과적으로 저해할 것으로 생각된다. 본 실험은 급성투여 실험이었으므로 병변은 관찰하지 못하였다.

위의 결과를 종합하면, 본 실험에 사용된 아포지단백질 E 유전자 적중 마우스는 고콜레스테롤 식이를 실시하지 않고도 고지혈증을 유발하여 동맥경화반을 형성하여 동맥경화 발병 기전연구나 새로운 동맥경화 억제제를 탐색하는데 매우 효과적인 모델동물이다. 이 모델동물에 동맥경화 억제 후보물질인 헤마테인을 이용하여 실험한 결과, 매우 유의성있게 혈청 HDL을 증가시킴과 동시에 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추었으며, ACAT의 간 마이크로좀 활성도도 투여량-의존적으로 억제되어 매우 효과적인 동맥경화 치료제로서의 효능을 보여주었다.

실시예 6: 헤마테인의 경구독성 실험

한국과학기술연구원 생명공학연구소에서 유지 관리되고 있는 7-8 주령의 특정 병원체 부재(specific pathogens free) ICR 마우스로서 체중 23-27 g의 암컷 5마리와 체중 30-35 g의 수컷 5마리를 온도 22±1 ℃, 습도 55±5 %, 조명 12L/12D의 동물실내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1 주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료(PicoLab^RRodent Diet 20-5053, Product Code 5053) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유 섭취시켰다.

헤마테인을 0.5% 트윈 80을 용매로 하여 100 mg/ml 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20 g 당 0.2 ml씩 경구투여하였다(최종 투여량 1,000 mg/kg). 시료는 1회 경구투여하였으며 투여 후 10 일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여당일은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 뒤에, 그리고 투여 익일부터 10일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 10일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 헤마테인에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.

본 실험은 헤마테인에 대하여 경구경로에서의 급성독성의 정도를 파악함으로써 일반약리 및 약효시험에서의 가용 약용량에 대한 정보를 제공하고 독성에 대한 기초 자료를 도출함을 목적으로 실시하여 아래와 같은 결과를 얻었다.

급성 경구독성의 경우는 헤마테인 1,000 mg/kg의 약용량에서 10일동안 치사동물이 관찰되지 않았다. 10일 후 생존동물에 대한 부검을 실시한 바, 특별한 병변 육안 소견이 없었으며, 투여 익일부터 10일간 어떠한 체중의 감소 없이 정상적인 체중의 증가가 관찰되었다.

결론적으로, 헤마테인은 상기의 농도로 경구투여시 독성이 관찰되지 않았다.

실시예 7: 헤마테인 함유 약학 제제의 제조

하기 제제예는 본 발명의 제제를 예시하는 것일 뿐 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

다음의 성분들을 이용하여 경질 젤라틴 캅셀을 제조하였다.

상기 성분들을 완전히 혼합하여 총 500 mg의 양으로 경질 캅셀에 채웠다.

상기 조성물은 또한 비타민 C외에 건강에 유익한 다른 성분들을 추가로 포함할 수 있으며, 이 조성물을 이용하여 일반적으로 널리 알려진 방법에 따라 정제, 과립제, 분제, 마이크로캅셀제, 드링크제 등의 각종 경구용 제제를 제조할 수 있다.

실시예 8: 헤마테인 함유 식품 및 음료의 제조

밀가루에 헤마테인을 0.1 내지 5중량%의 양으로 첨가한 후, 이를 원료로하여 빵, 케이크, 국수, 과자 등의 밀가루 식품을 제조함으로써 헤마테인 함유 식품을 제조하였다.

또한, 쥬스의 원료에 헤마테인을 0.1 내지 5중량%의 양으로 첨가한 후 쥬스를 제조하거나, 통상의 방법으로 제조된 쥬스에 헤마테인을 상기 양으로 첨가하여 헤마테인 함유 쥬스를 제조하였다.

유사하게, 각종 식품 또는 음료의 원료에 헤마테인을 첨가하거나 제조된 식품 또는 음료에 헤마테인을 첨가하여 헤마테인 함유 식품 및 음료를 제조할 수 있다.

헤마테인은 LDL-항산화제 활성을 나타내며, 혈중 콜레스테롤을 현저하게 감소시키고, 간 마이크로좀 ACAT 활성을 강력하게 저해하므로, 헤마테인을 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 고지혈증 및 동맥경화증의 치료 및 예방을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

활성성분으로서 유효량의 헤마테인을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 포유동물의 고지혈증 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 고지혈증의 예방 및 치료 효과가 헤마테인이 아실-코에이: 콜레스테롤 아실트랜스퍼레이즈(acyl-CoA:cholesterol acyltransferase)의 활성을 저해함으로써 나타남을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 고지혈증의 예방 및 치료 효과가 헤마테인이 LDL-항산화제로서 작용함으로써 나타남을 특징으로 하는 조성물.