KR100327597B1 - A Process for insulin microcrystalization - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인슐린 용액의 용해도 조절에 의해 결정의 핵으로 작용할 수 있는 미세한 인슐린 입자를 용액내에 자체적으로 형성시킨 후 이 용액중의 인슐린 용해도를 감소시켜 인슐린을 결정화시킴으로써 10 ㎛ 이하의 미세한 인슐린 결정을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention forms fine insulin particles that can act as nuclei of crystals by controlling the solubility of the insulin solution in itself, and then decreases the insulin solubility in the solution to crystallize the insulin to increase the fine insulin crystals of 10 μm or less. It relates to a process for producing in yield.
Description
본 발명은 인슐린의 균일한 미세 결정(crystal)의 새로운 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a new process for the production of uniform fine crystals of insulin.
인슐린은 J.J. Abel에 의해 정방형(rhombohedral) 형태의 결정이 최초로 만들어진 이후(Abel et al., 1927) 지금까지 인슐린과 인슐린 유도체에 대한 연구가 계속되어 왔다.Insulin is J.J. Since the first rhombohedral crystals were made by Abel (Abel et al., 1927), research on insulin and insulin derivatives has continued to date.
Abel에 의한 인슐린 결정의 제조에 이어서 D. A. Scott (1934)에 의해 정방형 인슐린이 아연을 포함한다는 사실이 밝혀졌으며 그는 이어서 아연이 다른 중금속 이온 (코발트, 니켈, 카드뮴)으로 대체될 수 있음을 알아내었다 (Scott and Fisher, 1935). 분자적 수준에서의 인슐린 분자에 대한 연구는 Sanger에 의해 인슐린의 아미노산 서열이 밝혀지면서 더욱 활기를 띄었다.Following the manufacture of insulin crystals by Abel, DA Scott (1934) revealed that square insulins contain zinc and he subsequently found that zinc could be replaced by other heavy metal ions (cobalt, nickel, cadmium) ( Scott and Fisher, 1935. The study of insulin molecules at the molecular level was more energetic as Sanger revealed the amino acid sequence of insulin.
1956년 Schlichtkrull는 정상적인 인슐린 결정이 2개의 아연 이온과 6개의 인슐린 분자로 구성된다는 사실을 밝혀내었고 최초로 당뇨병 치료용 작은 인슐린 결정 생성을 시도하였다 (Schlichtkrull, 1956). 이는 인슐린 결정은 천천히 인슐린을 용해시키기 때문에 우리몸 안의 췌장에서 인슐린이 생성되고 분비되는 것과 같이 혈액내에서 인슐린의 활성을 보다 오랜 기간동안 기대할 수 있었기 때문이다.In 1956 Schlichtkrull discovered that normal insulin crystals consist of two zinc ions and six insulin molecules, and for the first time attempted to produce small insulin crystals for the treatment of diabetes (Schlichtkrull, 1956). This is because insulin crystals slowly dissolve insulin, so the insulin activity in the blood can be expected for a longer period of time as insulin is produced and secreted from the pancreas in our body.
그 이후부터 지금까지 인슐린 결정화는 주로 구조분석 (structuralanalysis) (Adams et al., 1969) 분야와 제약응용 (pharmaceutical application) (Schlichtkrull, InsulinKristalle (Insulin Crystals) (1961))에서 많은 연구가 진행되었으며, 구조분석 분야에서는 X-선 회절을 이용한 구조분석이 용이하도록 보다 큰 인슐린 결정을 얻어내는 방법에 대한 연구가 주를 이룬 반면, 제약응용 분야에서는 몸 안에서 천천히 녹도록 인슐린 또는 인슐린 유도체의 결정을 작게 (< 30 ㎛) 만드는 결정화 방법의 개발에 목적을 두었다.Since then, many studies have been conducted on insulin crystallization mainly in the field of structural analysis (Adams et al., 1969) and in pharmaceutical applications (Schlichtkrull, InsulinKristalle (Insulin Crystals) (1961)). In the field of analysis, research on obtaining larger insulin crystals mainly focused on structural analysis using X-ray diffraction, while in the pharmaceutical field, the crystals of insulin or insulin derivatives were made smaller (< 30 micrometers) aimed at the development of a crystallization method.
현재까지 알려진 단백질 결정화 방법은 회분법 (Batch method), 투석법 (Dialysis), 증기분산법(Vapor Diffusion), 온도변화법 (Temperature shift), 그리고 자유경계면분산법 (Free Interface Diffusion) 등으로 주로 구조분석용 결정을 얻기 위한 방법들이다 (Weber, P. C. 1991).Protein crystallization methods known to date are mainly composed of batch method, dialysis method, vapor dispersion method, temperature shift method, and free interface diffusion method. Methods for obtaining analytical decisions (Weber, PC 1991).
회분법은 단백질 용액에 염 (salts) 또는 침전제 (precipitants)를 넣어서 용액의 용해도를 변화시켜서 결정이 생성될 수 있는 과포화 상태를 유도하는 방법으로 가장 간단한 방법이며 투석법은 용매와 작은 이온분자들은 통과시키고 단백질은 통과시키지 않는 반투막을 경계로 막 안쪽의 단백질 용액과 밖의 단백질이 없는 용액의 산도나 이온힘을 평형을 시킴으로써 과포화 상태에 도달하게 하는 방법이다. 증기분산법은 단백질이 포화되기에 필요한 농도보다 낮은 침전제를 포함한 단백질 용액을 방울의 형태로 용기의 뚜껑에 만들고 아래에 더 높은 농도의 결정화 용액 (crystallizing agent solution)을 놓아서 증기분산에 의해 평형을 이루어 과포화 상태에 도달하게 하는 방법이며 온도변화법은 단백질의 용해도가 온도에 따라 달라지는 특성을 이용한 방법으로 상온보다는 높은 온도에서 잘 녹는 단백질에 주로 이용된다. 마지막으로, 자유경계면 분산법은 침전용액과 단백질 용액을 경계를 이루도록 한뒤 그 경계를 제거하면 단백질과 침전제가 서로 분산되면서 다양한 수준의 과포화 상태의 유발을 통해 결정을 얻는 방법이다.Batch is the simplest method of adding salts or precipitants to a protein solution to change the solubility of the solution to induce a supersaturated state in which crystals can form. It is a method of reaching the supersaturated state by balancing the acidity or ionic force of the protein solution inside the membrane and the protein-free solution outside the semipermeable membrane which does not pass the protein. The vapor dispersion method equilibrates by vapor dispersion by placing a protein solution containing a precipitant below the concentration required for the protein to saturate in the form of droplets on the lid of the container and placing a higher concentration of crystallizing agent solution below. It is a method of reaching the super saturation state, and the temperature change method is a method using a property in which the solubility of the protein varies with temperature. Finally, free boundary surface dispersion is a method of obtaining a crystallization by inducing various levels of supersaturation by dispersing the protein and the precipitant by making the boundary between the precipitation solution and the protein solution.
이러한 다양한 방법에도 불구하고 결정이 생성되는 적절한 조건을 알아내는 일은 매우 힘들고 시간을 많이 요구하는 과정으로 알려져 있다. 왜냐하면, 결정화는 결정생성용액의 산도, 이온힘, 온도변화, 침전제의 농도, 단백질의 농도 등 많은 요인에 의해서 영향을 받기 때문이다. 다시말해서 결정이 생성되려면 우선 과포화 상태가 유발되어야하며 이어서 용액내에서는 결정으로 성장이 가능한 핵 (nuclei)이 생성되어야 한다.Despite these various methods, finding the proper conditions under which crystals are produced is known to be a very difficult and time-consuming process. This is because crystallization is affected by many factors such as acidity, ion force, temperature change, concentration of precipitant, and protein concentration. In other words, before crystals can be produced, a supersaturated state must be triggered, followed by the formation of nuclei that can grow into crystals in solution.
이러한 핵화 (nucleation)에는 과포화 용액 속의 균질 단백질 분자에 의해서 만들어지는 균질 핵화 (homogeneous nucleation)와, 과포화 용액 속의 외부 물질들 (먼지입자, 용기의 벽면 등)이 핵으로 작용하는 비균질 핵화 (heterogeneous nucleation)가 있는데 (Weber, P. C. 1991) 이들은 모두 용액의 조건에 따라 매우 민감하게 변화한다. 따라서, 결정을 얻기위해서는 핵화과정을 유발시키는 적절한 조건을 알아야하며 이 과정이 매우 어려운 부분으로 남아있다. 그래서, 보다 쉽게 결정을 얻기위해 핵 (nuclei)으로 작용할 수 있는 씨 (seed)를 외부에서 넣어 주기도 한다.Such nucleation includes homogeneous nucleation made by homogeneous protein molecules in supersaturated solution and heterogeneous nucleation in which foreign substances (dust particles, wall of container, etc.) in supersaturated solution act as nucleus. (Weber, PC 1991) They all change very sensitively depending on the conditions of the solution. Thus, in order to obtain a decision, it is necessary to know the appropriate conditions that trigger the nucleation process, which remains a very difficult part. So, in order to make the decision easier, the seeds can be put in from outside that can act as nuclei.
씨투여(seeding)는 외부에서 씨로 작용 할 만한 것을 넣어 주어서 보다 확실하게 결정의 생장을 유도하는 방법이다 (Stura and Wilson, 1990; Thaller et al., 1981). 일반적으로 씨는 같은 단백질의 결정을 저장용액 (보통 낮은 과포화 상태로만들어서 결정 생성, 성장을 억제한)에서 잘게 부수어서 준비한다. 만약 사용 가능한 결정이 없다면 이종 단백질(다른 종(species)에서 얻어진 동일한 단백질)로부터 얻은 결정을 이용하여 만든 씨용액을 이용한다.Seeding is a method of inducing the growth of crystals by incorporating externally-seedable seeds (Stura and Wilson, 1990; Thaller et al., 1981). In general, seeds are prepared by crushing the same protein crystals in a stock solution (usually made into a low supersaturated state, which inhibits crystal formation and growth). If no crystal is available, use a seed solution made from crystals from heterologous proteins (the same protein from different species).
씨투여의 방법에는 크게 Microanalytical seeding, Macroproduction seeding, 그리고 Macroseeding이 있다. Microanalytical seeding은 결정화의 조건이 적합한지를 알아보기 위해 사용되는 방법이다. 준비된 고농도의 씨용액을 각 결정생성 조건에 넣어서 생겨나는 결정의 모양으로 결과를 판단한다. 방법은 보통 1-2 ㎕를 직접 포화 단백질 용액에 넣거나 씨용액에 hair를 담그었다가 꺼내어 결정 생성 용액에 스트리킹(streaking) 하는 스트리킹 씨투여(Stura and Wilson, 1990; Leung et al., 1989) 방법을 사용한다. Microproduction seeding은 Microanalytical seeding과 거의 유사하며 단지 씨용액을 보다 희석하여 넣어주기때문에 생성되는 결정의 수가 적다는 차이점이 있다. 따라서, 보다 큰 소수의 결정을 얻고자할때 사용된다. Macroseeding은 작은 결정을 연구목적에 알맞는 보다 큰 결정으로 만들고자 씨로 사용하는 것을 말한다. 다시말해서, 생성된 작은 결정을 세척용액(침전제의 농도가 약간 낮은 용액)에 넣어서 결정의 표면에 있을 수 있는 핵을 제거한 다음에 이 결정을 다시 포화 단백질 용액에 넣어서 계속해서 결정을 성장시키는 것이다.Seeding methods include microanalytical seeding, macroproduction seeding, and macroseeding. Microanalytical seeding is a method used to determine if the conditions for crystallization are appropriate. The result is judged by the shape of the crystal which is prepared by putting the prepared high concentration seed solution under each crystal formation condition. The method is usually stir and seed (Stura and Wilson, 1990; Leung et al., 1989), in which 1-2 μl is added directly to saturated protein solution or the hair is soaked in seed solution and then streaked in crystal forming solution. Use Microproduction seeding is very similar to microanalytical seeding, with the difference that fewer crystals are produced because the solution is diluted more. Thus, it is used to obtain a larger number of decisions. Macroseeding is the use of seeds as seeds to make small crystals larger crystals suitable for research purposes. In other words, the resulting small crystals are placed in a washing solution (a solution with a slightly lower concentration of precipitant) to remove nuclei that may be on the surface of the crystals, and then the crystals are added to a saturated protein solution to continue growing the crystals.
구조 분석에 이용되는 인슐린 결정의 경우 이상과 같은 씨투여 방법에 의해 주로 만들어진 반면, 작은 크기의 제약 응용용 인슐린 결정은 주로 인슐린 용액의pH 변화를 이용하는 방법에 의해 만들어졌다.Insulin crystals used for structural analysis were mainly made by the above-described seed administration method, whereas small-sized insulin crystals for pharmaceutical application were made mainly by using the pH change of the insulin solution.
그러한 방법의 예로는, R.S.Jackson의 미국 특허 제3,719,655호에 개시된 방법으로서 돼지 또는 소 인슐린과 알카리 금속 양이온과 암모늄 양이온으로 구성된 군에서 선택된 양이온 0.2 몰 내지 1.0몰 농도를 포함한 용액의 염기성을 알카리 금속 또는 암모늄 염기를 이용하여 pH7.2 내지 pH 10.0까지 조절하는 방법과, 0.25N 아세트산, 약 2g/l 인슐린 및 2% 아연을 포함한 인슐린 용액의 pH를 염기를 이용하여 5.9 내지 6.0으로 조절하는 방법 등이 있다. 하지만, 이들 방법에 의해서는 10㎛ 이하의 미세 결정을 얻을 수 없다.An example of such a method is a method disclosed in US Pat. No. 3,719,655 to RSJackson, wherein the basicity of a solution containing 0.2 to 1.0 molar concentrations of cations selected from the group consisting of porcine or bovine insulin, an alkali metal cation and an ammonium cation is used for alkali metal or Adjusting pH 7.2 to pH 10.0 using an ammonium base and adjusting the pH of an insulin solution containing 0.25N acetic acid, about 2 g / l insulin and 2% zinc to 5.9 to 6.0 using a base have. However, by these methods, fine crystals of 10 mu m or less cannot be obtained.
또한 미국 특허 제4,959,351호에는 등전점 pH 부근에서의 결정화에 의해 인슐린 유도체 결정을 제조하는 방법이 개시되어 있지만, 인슐린 유도체는 인슐린과는 다른 결정화 성질을 가지며, 이 경우에도 약 10㎛ 정도의 결정을 주로 얻을 수 있었을 뿐 10㎛ 이하의 더 미세한 결정을 고수율로 만들수는 없었다.In addition, U.S. Patent No. 4,959,351 discloses a method for preparing insulin derivative crystals by crystallization near isoelectric point pH, but insulin derivatives have different crystallization properties from insulin, and in this case, crystals of about 10 mu m are mainly used. It was only possible to obtain finer crystals of 10 μm or less in high yield.
한편, 당뇨병 치료를 위한 인슐린의 투여는 주로 피하주사, 근육내 주사를 통해 이루어지고 있으나, 이들 방법들은 신체적, 정신적 불편과 고통을 수반하는 문제점이 있어 이러한 문제점을 갖지 않는 경구 투여 제제에 대한 연구가 계속되고 있다. 하지만, 이러한 경구 투여의 경우 역시 단백질 분해 효소의 작용에 의해 인슐린이 효과를 제대로 발휘할 수 없다는 점과 인슐린이 장내 점막을 거쳐 혈액으로 이동하기가 용이하지 않다는 문제점이 있다.On the other hand, the administration of insulin for the treatment of diabetes is mainly through subcutaneous injection and intramuscular injection, but these methods are accompanied by problems involving physical and mental discomfort and pain, and there are studies about oral dosage forms that do not have such problems. It is going on. However, such oral administration also has the problem that insulin can not properly exert the effect by the action of proteolytic enzymes and that insulin is not easy to move through the intestinal mucosa to the blood.
이와 같은 기존의 인슐린 투여 방법과는 달리 폐를 통한 인슐린 투여는 경구 투여 등에서와 같은 문제점들을 갖지 않으므로, 폐를 통한 인슐린 투여를 위한 연구가 계속되고 있다. 인슐린 결정을 이용하여 폐를 통해 투여할 경우 체내에서 인슐린 분말에 비해 오랜 시간동안 머무를 수 있어 장시간 그 효과가 지속된다는 장점이 있으며, 폐를 통한 인슐린 결정의 투여에 있어 가장 중요한 요소는 인슐린 결정의 크기로서 가능한 인슐린 결정의 크기가 작아서 10㎛이하인 것이 바람직하다. 하지만, 현재 주로 이용되고 있는 전술한 인슐린 결정화 방법들에 의해서는 이와 같은 작은 크기의 결정을 고수율로 얻기가 힘들다.Unlike the conventional insulin administration method, since insulin administration through the lung does not have the same problems as in oral administration, research for the administration of insulin through the lung continues. When administered through the lungs using insulin crystals, the body can stay for a long time compared to insulin powder, so the effect lasts for a long time. The most important factor in the administration of insulin crystals through the lungs is the size of the insulin crystals. It is preferable that the size of the insulin crystals as small as possible be 10 µm or less. However, it is difficult to obtain such a small size crystal in high yield by the above-described insulin crystallization methods which are mainly used.
한편, 씨투여를 이용하여 결정을 만들 경우, 넣어주는 씨의 양에 따라 생성되는 결정의 크기가 좌우된다는 것은 이미 알려진 사실이다. 따라서, 10㎛ 이하의 크기의 결정을 만들기 위해 앞에서 언급하였던 씨투여 방법을 사용할 수 있다는 생각을 할 수 있다. 하지만, 여기에는 몇가지 문제가 있다.On the other hand, it is known that the size of the crystals produced depends on the amount of seeds to be added when the crystals are prepared using seed administration. Therefore, it can be thought that the seed administration method mentioned above can be used to make a crystal having a size of 10 mu m or less. However, there are some problems here.
첫째, 결정 성장 용액의 희석(dilution)이다. 적절한 씨를 준비하기 위해서는 씨용액 자체내에서는 결정이 생성되거나 성장이 일어나서는 안된다. 때문에 일반적으로 씨용액은 결정 생성 용액보다 단백질 농도를 낮게 만든다. 따라서, 이러한 씨용액을 결정 생성 용액에 섞음으로 인해서 발생하는 결정 생성 용액의 희석은 전체적인 결정 생성조건(과포화 농도, 이온 힘(ionic strength) 등)을 변화시키는 문제를 안고있다.First is dilution of the crystal growth solution. To prepare the proper seed, crystals should not be formed or grown in the seed solution itself. Seed solutions generally result in lower protein concentrations than crystal forming solutions. Therefore, the dilution of the crystal formation solution generated by mixing the seed solution with the crystal formation solution has a problem of changing the overall crystal formation conditions (supersaturation concentration, ionic strength, etc.).
둘째, 씨 자체의 크기의 다양성이다. 즉, 결정을 파쇄해서 씨를 만들기 때문에 생성되는 씨마다 크기의 차이가 있고 이를 해결하기 위해서는 또 다른 공정을 거쳐야하는 어려움이 있다.Second is the variety of the size of the seed itself. That is, because the seeds are made by crushing the crystals, there is a difference in size for each seed produced, and there is a difficulty in going through another process to solve this problem.
이와 같은 문제점 때문에 지금까지 씨투여에 의한 미세 인슐린 결정화는 지금까지 많은 어려움이 있었다.Due to such a problem, the micro-insulin crystallization by seed administration has been difficult until now.
이에 본 발명자들은 미세한 인슐린 결정을 고수율로 형성할 수 있는 인슐린 결정화 방법에 대해 연구한 결과, 인슐린 용액의 용해도 조절에 의해 결정의 핵으로 작용할 수 있는 미세한 인슐린 입자를 용액내에 자체적으로 형성시킨 후 이 용액중의 인슐린 용해도를 감소시켜 인슐린을 결정화시킴으로써 10㎛ 이하의 미세한 인슐린 결정을 고수율로 제조하는 본 발명 방법을 완성하게 되었다. 본 발명을 이용하면 보다 미세하고 균일한 인슐린 결정을 높은 수율로 만들 수 있다.Therefore, the present inventors have studied a method for insulin crystallization that can form fine insulin crystals in high yield. As a result, after forming self-forming fine insulin particles in the solution, which can act as nuclei of crystals by controlling the solubility of the insulin solution, By reducing the insulin solubility in the solution to crystallize insulin, the method of the present invention for producing fine insulin crystals of 10 μm or less in high yield was completed. Using the present invention, finer and more uniform insulin crystals can be made in high yield.
도 1. 0.1N 초산에서의 인슐린의 pH에 따른 용해도 변화Figure 1. Solubility change with pH of insulin in 0.1N acetic acid
도 2. pH에 따른 인슐린 집합체의 변화Figure 2. Changes in insulin aggregates with pH
(A) 인슐린 집합체 (aggregates) (pH 4.5)(A) insulin aggregates (pH 4.5)
(B) 인슐린 집합체와 몇 개의 결정들 (pH 5.2)(B) Insulin aggregates and some crystals (pH 5.2)
(C) 인슐린 집합체와 몇 개의 결정들 (pH 5.4)(C) Insulin aggregates and some crystals (pH 5.4)
(D) 초미세 인슐린 결정 (pH 6.0)(D) Ultrafine insulin crystals (pH 6.0)
(E) None (pH 10.0)(E) None (pH 10.0)
(F) None (pH 11.0)(F) None (pH 11.0)
도 3. 각 pH 인슐린 용액에 시버 용액(Sieber's solution)(2X)을 섞어 주었을 때의 변화Figure 3. Changes when Sieber's solution (2X) is mixed with each pH insulin solution
(A) 별모양과 정방형의 중간적 인슐린 결정 (pH 4.2)(A) Star and square intermediate insulin crystals (pH 4.2)
(B) 정방형 인슐린 결정 (40-70 ㎛) (pH 5.2)(B) square insulin crystals (40-70 μm) (pH 5.2)
(C) 15-20 ㎛ 이하 초미세 결정 (pH 5.4)(C) 15-20 μm or less ultrafine crystals (pH 5.4)
(D) 초미세 인슐린 결정 (pH 6.0)(D) Ultrafine insulin crystals (pH 6.0)
(E) 초미세 인슐린 결정 (pH 10.0)(E) Ultrafine insulin crystals (pH 10.0)
(F) 정방형 인슐린 결정 (50-80 ㎛) (pH 11.0)(F) Square insulin crystals (50-80 μm) (pH 11.0)
도 4. pH에 따라 생성된 인슐린 결정의 입자 분석기를 이용한 크기 분석4. Size analysis using particle analyzer of insulin crystals produced according to pH
도 5. 초미세 인슐린 결정의 주사전자현미경 사진5. Scanning electron micrograph of ultrafine insulin crystals
도 6. pH 6.4에서 얻어진 초미세 인슐린 결정의 입자 분석기를 이용한 크기 분석Figure 6. Size analysis using a particle analyzer of ultrafine insulin crystals obtained at pH 6.4
도 7. pH 10.14, 9.4에서 얻어진 초미세 인슐린 결정의 입자 분석기를 이용한 크기 분석Figure 7. Size analysis using a particle analyzer of ultrafine insulin crystals obtained at pH 10.14, 9.4
(A) pH 10.14의 결정의 크기(A) the size of the crystal at pH 10.14
(B) pH 9.4의 결정의 크기(B) the size of the crystals at pH 9.4
도 8. 0.22㎛ filtering 이후 pH 9.8에서 얻어진 초미세 인슐린 결정의 입자 분석기를 이용한 크기 분석8. Size analysis using a particle analyzer of ultrafine insulin crystals obtained at pH 9.8 after 0.22 μm filtering
도 9. NaOH로 pH 9.8까지 올린 후 HCl에 의해 pH 낮춘 경우 얻어진 인슐린 결정의 입자 분석기를 이용한 크기 분석.9. Size analysis using a particle analyzer of the insulin crystals obtained when raised to pH 9.8 with NaOH and lowered by HCl.
(A) pH6.1까지 낮춘 경우(A) lowered to pH6.1
(B) pH5.0까지 낮춘 경우(B) lowered to pH5.0
도 10. 염기에 녹인 인슐린 용액의 pH를 산으로 낮춰 얻어진 인슐린 결정의 입자 분석기를 이용한 크기 분석.10. Size analysis using a particle analyzer of insulin crystals obtained by lowering the pH of an insulin solution dissolved in a base with an acid.
도 11. pH 10.0의 씨용액을 이용한 인슐린 결정의 크기 조절Figure 11.Control of size of insulin crystals using seed solution of pH 10.0
(A) 1/100 희석한 씨용액을 이용한 경우(A) 1/100 diluted seed solution
(B) 원액 씨용액을 이용한 경우(B) In case of using undiluted seed solution
본 발명에 따른 인슐린 결정 제조 방법은 다음과 같다.Insulin crystal production method according to the invention is as follows.
인슐린 분말을 pH 2.0 초산에 녹인 뒤 1 N과 10 N NaOH를 이용하여 산도를 변화시키면 pH 4.5를 지나면서 집합체 (aggregates)가 생성된다. 그러나, pH를 더 증가시키면 pH 6.0을 지나면서는 5 ㎛ 이하의 미세 인슐린 결정이 62% 이상 생성되며, pH 9.0 내지 10.5에서의 인슐린 용액을 결정생성 용액인 시버 용액(Sieber's solution) (2×)과 1:1로 섞어주면 수 초 내지 2분 안에 5 ㎛ 이하의 미세 인슐린 결정이 90% 이상 생성된다. 즉, pH 2.0에서 pH10.5까지의 산도 변화에 의해 생성된 pH9.0 내지 10.5의 인슐린 용액에는 씨로 작용할 수 있는 미세한 인슐린 입자들이 존재하며 이들로부터 인슐린을 결정화시킴으로써 기존의 인슐린 결정화 방법에 의해 생성된 결정들에 비해 훨씬 작은 크기인 5㎛ 이하의 미세 인슐린 결정을 높은 수율로 얻을 수 있다.After dissolving the insulin powder in acetic acid at pH 2.0 and changing the acidity using 1 N and 10 N NaOH, aggregates are formed over pH 4.5. However, further increase of pH produces more than 62% of fine insulin crystals of 5 μm or less after pH 6.0, and the insulin solution at pH 9.0 to 10.5 is combined with Siber's solution (2 ×), the crystallization solution. When mixed 1: 1, more than 90% of fine insulin crystals of 5 μm or less are produced within a few seconds to 2 minutes. That is, in the insulin solution of pH 9.0 to 10.5 produced by the pH change from pH 2.0 to pH10.5, there are fine insulin particles that can act as seeds, and crystallized from them to produce insulin produced by conventional insulin crystallization methods. Fine insulin crystals of 5 μm or less, much smaller in size, can be obtained in high yield.
이때 인슐린을 녹이기 위한 산과 인슐린 용액의 pH변화에 이용되는 염기는 그 종류에 구애되지 않는다.상기에서 사용되는 시버 용액 (2×)은 구연산 단수화물(citric acid monohydrate) 39.9g, 염화나트륨 3.48g, 염화아연(Ⅱ) 3.28g 을 증류수 1ℓ에 녹인 뒤 pH를 6.0으로 맞추어 만든 것을 사용한다. (Obermeier et al., 1976).At this time, the acid used to dissolve insulin and the base used to change the pH of the insulin solution are not limited to the type. The Siber solution (2 ×) used above includes 39.9 g of citric acid monohydrate, 3.48 g of sodium chloride, and chloride. 3.28g of zinc (II) is dissolved in 1L of distilled water, and the pH is adjusted to 6.0. (Obermeier et al., 1976).
또한, 같은 방법으로 산성 인슐린 용액을 염기성으로 만든 뒤 생성된 pH 9.0 내지 10.5의 인슐린 용액에 2N HCl을 첨가하여 pH를 변화시키면 pH 6.0(±0.5)를 지나면서 5㎛ 이하 크기의 결정 비율이 90% 이상인 미세한 결정이 생성된다. 이때 인슐린 용액의 pH를 낮추기 위해 이용되는 산 역시 그 종류에 구애되지 않는다.In addition, the acidic insulin solution was made basic in the same manner, and then the pH was changed by adding 2N HCl to the resulting insulin solution of pH 9.0 to 10.5, and the crystal ratio of 5 μm or less was passed through pH 6.0 (± 0.5). Fine crystals of more than% are produced. At this time, the acid used to lower the pH of the insulin solution is not limited to the type.
pH 2.0 초산 용액내의 인슐린은 pH 변화에 따라 도.1과 같은 용해도의 변화를 나타내는데 pH 4.5를 지나면서 용해도는 급격히 감소하기 시작한다. pH 5.0-5.5 사이에서 용해도는 어느정도 비슷하게 유지되다가 pH 5.5를 지나면서 다시 떨어져서 pH 6.0 근처에서 최저의 용해도를 나타낸다. 이후 pH를 높여줄수록 용해도는 다시 증가하여 pH 10.5를 지나면서는 완전히 녹는다.Insulin in pH 2.0 acetic acid solution shows a change in solubility as shown in Fig. 1 according to the pH change. The solubility remained somewhat similar between pH 5.0-5.5 and then dropped again after pH 5.5, showing the lowest solubility near pH 6.0. After increasing the pH, the solubility increases again and completely dissolves after pH 10.5.
위에서 관찰된 각 pH에 따른 인슐린 미세 결정의 생성변화는 pH 변화에 따른 초산 용액내에서의 인슐린 용해도의 변화와 밀접한 관련이 있는 것으로 생각된다. 앞에서도 언급하였듯이 결정이 생성되려면 과포화가 유발되어야 하고 더불어 핵이 생성되어야 한다. pH 4.5 인슐린 용액에는 과포화가 도입되기 시작하지만 핵의 생성은 없기에 인슐린 분자들은 집합체 (aggregates)를 이룬다. 하지만, pH 5.5 (인슐린 등전점)를 지나면서는 등전점 침전에 의해 핵이 생성되기 시작하여 결정이 생성되기 시작하며, 이때 용액내에는 많은 수의 핵이 동시에 생겨나게 되고 그로 인해 많은 수의 인슐린 결정들이 동시에 성장하기 시작한다. 따라서, 최종 생성되는 인슐린 결정의 크기는 매우 작아져서 5 ㎛ 이하의 미세 인슐린 결정이 62% 이상 생성된다. 용액의 pH를 더 높여주면 용해도의 증가로 인해 생성된 미세 인슐린 결정들은 점점 녹기 시작한다. 그래서 pH 10.5 이상이 되면 완전히 용해된다.The production change of insulin microcrystals with each pH observed above is thought to be closely related to the change of insulin solubility in acetic acid solution with pH change. As mentioned earlier, crystals need to be supersaturated and nuclei generated. Insulin molecules begin to supersaturate in the pH 4.5 insulin solution, but there is no nucleation, resulting in the aggregation of insulin molecules. However, after pH 5.5 (insulin isoelectric point), the isoelectric point precipitation starts to generate nuclei and crystals begin to form, whereby a large number of nuclei are simultaneously formed in the solution, resulting in a large number of insulin crystals growing simultaneously. To start. Thus, the size of the resulting insulin crystals is so small that more than 62% of fine insulin crystals of 5 μm or less are produced. As the pH of the solution is further increased, the fine insulin crystals produced by the increased solubility begin to melt. Thus, when pH is above 10.5, it dissolves completely.
이때 pH 9.0 내지 10.5의 인슐린 용액에 시버 용액(Sieber solution) (2×)를 섞어주면 미세한 결정들이 생성되는데, 이들의 경우 5 ㎛ 이하의 미세 인슐린 결정이 90% 이상의 높은 비율을 보인다.At this time, when the Siber solution (2 ×) is mixed with an insulin solution of pH 9.0 to 10.5, fine crystals are produced. In these cases, fine insulin crystals of 5 μm or less show a high ratio of 90% or more.
이는 등전점 근처 pH의 인슐린 용액의 결정화에 의해 생성된 인슐린 결정의 경우(62%)보다 5㎛ 이하의 미세 인슐린 결정의 수율이 훨씬 높은 것이다.This is a much higher yield of fine insulin crystals of 5 μm or less than that of insulin crystals produced by crystallization of the insulin solution at pH near the isoelectric point (62%).
또한, 상기한 pH 9.0 내지 10.5 인슐린 용액을 시버 용액 첨가없이 2N HCl을 이용하여 산도를 낮출 경우에도 pH 6.0(±0.5)를 지나면서 5㎛ 이하 결정이 90% 이상 생성된다.In addition, even when pH is lowered by using 2N HCl in the above pH 9.0 to 10.5 insulin solution without adding a siber solution, crystals of 5 μm or less are generated by 90% or more while passing pH 6.0 (± 0.5).
상기와 같은 인슐린 결정화는, pH 9.0 내지 10.5 상태의 인슐린 용액내에 결정의 핵으로 작용할 만한 씨가 존재하며, pH 9.0 내지 10.5로부터 pH 6.0으로 변화되는 과정을 통해서 인슐린의 용해도가 떨어지게 되고 그로 인해 과포화가 도입되어, 이미 존재하는 많은 수의 인슐린 씨를 통해 결정화가 일어나기 때문에 아주 미세한 결정들이 생성되는 것으로 생각된다.In the insulin crystallization as described above, there is a seed capable of acting as a nucleus of crystals in the insulin solution in the pH 9.0 to 10.5 state, the solubility of the insulin is reduced through the process of changing from pH 9.0 to 10.5 to pH 6.0, thereby causing supersaturation Introduced, it is believed that very fine crystals are produced because crystallization occurs through a large number of already existing insulin seeds.
실제 pH 10.0(±0.5) 상태의 인슐린 용액내에 70 nm 이하 크기의 입자가 존재함을 입자분석기를 통해 확인하였다.It was confirmed by particle analyzer that particles of less than 70 nm in the insulin solution at the actual pH of 10.0 (± 0.5).
한편, pH 12.0의 초산에 인슐린을 녹여 만든 pH 11 이상의 인슐린 용액에 2N HCl을 첨가하여 산도를 변화시키면 약 pH 7.0을 지나면서 보다 큰 결정이 생성되기 시작하는 데 이 경우 생성되는 결정의 평균 크기는 6.75㎛이다.On the other hand, when the acidity is changed by adding 2N HCl to an insulin solution of pH 11 or higher prepared by dissolving insulin in pH 12.0 acetic acid, larger crystals start to form after about pH 7.0. In this case, the average crystal size is 6.75 mu m.
이 경우 역시 산도 변화에 의한 용해도 변화에 의해 인슐린 결정이 생성되는것으로 생각된다. 하지만, 이 경우 pH 11이상의 인슐린 용액은 이미 씨로 작용할 수 있는 입자들이 완전히 녹은 후여서 씨로 작용할 수 있는 미세 입자가 존재하지 않아 이를 다시 pH를 변화시켜서 산도를 낮춰도 씨로부터의 결정화가 일어날 수 없으며, 이때에는 인슐린 분자들의 균질핵화를 통해서 결정이 생성되어 보다 큰 인슐린 결정이 생성되는 것으로 생각된다.In this case, too, it is thought that insulin crystals are formed by the change in solubility caused by the change in acidity. However, in this case, the insulin solution having a pH of 11 or more is completely dissolved after the particles capable of acting as seeds, so there is no microparticles capable of acting as seeds. At this time, it is thought that crystals are produced through homogenization of insulin molecules, thereby producing larger insulin crystals.
또한, 같은 인슐린 농도를 지닌 웰(well)에 서로 다른 양의 씨를 넣어줄 경우 생성되는 결정의 크기가 넣어준 씨의 양과 반비례하므로 씨의 양을 조절함으로써 생성되는 결정의 크기 또한 조절할 수 있다.In addition, since the size of the crystals produced when different amounts of seeds are added to wells having the same insulin concentration is inversely proportional to the amount of seeds, the size of the crystals may be controlled by controlling the amount of seeds.
상기와 같은 본 발명 방법에 의해 생성된 인슐린 결정은 10㎛ 이하, 특히 1-5㎛의 미세하고 균일한 크기에 의해 폐를 통한 인슐린 투여에 효과적으로 이용될 수 있다.The insulin crystals produced by the method of the present invention as described above can be effectively used for insulin administration through the lungs by a fine and uniform size of 10 μm or less, especially 1-5 μm.
[실시예]EXAMPLE
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
실시예. 1Example. One
용액의 pH에 따른 인슐린 침전의 변화Changes in Insulin Precipitation with pH of Solution
여과한 0.1 N 초산 (acetic acid)을 pH 2.0 으로 조정한 뒤 소 인슐린 분말(Sigma, MO, U.S.A.)을 10 mg/ml이 되도록 녹여 상온에 보관했다. 결정 생성 용액으로 사용한 시버 용액 (2×)은 구연산 단수화물(citric acid monohydrate) 39.9g, 염화나트륨 3.48g, 염화아연(Ⅱ) 3.28g 를 증류수 1ℓ에 녹인 뒤 pH를 6.0으로 맞추어 준비하였다 (Obermeier et al., 1976).The filtered 0.1 N acetic acid (acetic acid) was adjusted to pH 2.0 and the bovine insulin powder (Sigma, MO, U.S.A.) was dissolved to 10 mg / ml and stored at room temperature. The Siber solution (2 ×) used as a crystal forming solution was prepared by dissolving 39.9 g of citric acid monohydrate, 3.48 g of sodium chloride, and 3.28 g of zinc chloride (II) in 1 L of distilled water and adjusting the pH to 6.0 (Obermeier et. al., 1976).
인슐린 분말을 0.1 N 초산 (pH 2.0)에 녹여 3.0 mg/ml 을 만들었다. 이어서 10 N과 1 N 수산화나트륨을 이용하여 인슐린 용액의 pH를 변화시켜가면서 각 pH 4.5, 5.2, 5.4, 6.0, 10.0, 11.0에서 시료를 취해서 인슐린 침전물의 변화를 광학현미경 (Leica, Germany)으로 관찰하였다Insulin powder was dissolved in 0.1 N acetic acid (pH 2.0) to make 3.0 mg / ml. Subsequently, 10 N and 1 N sodium hydroxide were used to change the pH of the insulin solution, taking samples at each of pH 4.5, 5.2, 5.4, 6.0, 10.0, and 11.0 to observe the change in insulin deposits under an optical microscope (Leica, Germany). Was
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, pH 4.5의 경우 인슐린 집합체만이 생성된 반면 pH 5.2, pH 5.4로 갈수록 생성되는 결정의 수가 증가하였다. pH 6.0에서는 이와는 대조적으로 인슐린 집합체는 보이지 않고 미세한 인슐린 결정이 생성되었다. pH 10.0, 11.0의 경우 인슐린 결정은 관찰되지 않았다. 이것은 pH 6.0에서 pH를 올려준 경우 인슐린의 용해도가 증가하게 되고(도.1) 이로 인해서 초미세 결정들이 다 녹았기때문으로 보인다.As can be seen in Figure 2, in the case of pH 4.5, only insulin aggregates were produced, whereas the number of crystals produced increased toward pH 5.2 and pH 5.4. At pH 6.0, in contrast, insulin aggregates were not seen, producing fine insulin crystals. Insulin crystals were not observed for pH 10.0 and 11.0. This is because the solubility of insulin is increased when the pH is raised at pH 6.0 (Fig. 1), which is due to the melting of all the ultrafine crystals.
실시예 2Example 2
각 pH에 따른 시료를 시버 용액 (2×)을 이용하여 결정화시킬 경우When the sample according to each pH is crystallized using the siber solution (2 ×)
인슐린 분말을 0.1 N 초산 (pH 2.0)에 녹여 3.0 mg/ml 을 만들었다. 이어서 10 N과 1 N 수산화나트륨을 이용하여 인슐린 용액의 pH를 변화시켜가면서 각 pH 4.5, 5.2, 5.4, 6.0, 10.0, 11.0 에서 시료를 취한뒤 시버 용액 (2×)를 1:1로 섞어준 후 침전물의 변화를 광학현미경 (Leica, Germany)으로 관찰하였다 (도.3).Insulin powder was dissolved in 0.1 N acetic acid (pH 2.0) to make 3.0 mg / ml. Subsequently, the pH of the insulin solution was changed by using 10 N and 1 N sodium hydroxide, and the samples were taken at each pH 4.5, 5.2, 5.4, 6.0, 10.0, and 11.0, and the sieve solution (2 ×) was mixed 1: 1. The precipitate was then observed under an optical microscope (Leica, Germany) (Fig. 3).
도3 의 경우 결정화 시작 후 약 30분 뒤에 관찰한 것이다. (A), (B), (F)의 경우 더 큰 결정으로 계속 성장하였다. 반면 초미세 결정들은 더이상 성장하지 않았다. 도2 와 비교해 볼 때 한 가지 특이한 점은 pH 10.0의 경우 결정이 없었으나 시버 용액을 섞어줌으로 인해 초미세 결정이 생성되었다는 점이다. 그리고 이때 이용액의 1-5㎛ 이하 크기의 인슐린 결정은 95% 이상이었다.In the case of Figure 3 it was observed about 30 minutes after the start of crystallization. In case of (A), (B) and (F) it continued to grow with larger crystals. Ultrafine crystals, on the other hand, did not grow anymore. Compared to FIG. 2, one unusual point is that there was no crystal at pH 10.0, but ultrafine crystals were generated by mixing the Siber solution. At this time, the insulin crystals having a size of 1-5 μm or less were 95% or more.
실시예 3Example 3
결정의 크기 분석Crystal Size Analysis
인슐린 용액 (1.0 mg/ml)을 pH를 변화시켜가면서 각 pH 4.7, 5.3, 5.5, 9.0 에서 각 10 ml을 취한 뒤 시버 용액 (2×)을 10 ml 씩 섞어서 결정을 만든 뒤 입자분석기 (Coulter LS200, U.S.A.)를 통해 결정 크기의 분포를 조사하였다 (도4).Take 10 ml of each pH 4.7, 5.3, 5.5, 9.0 while changing the pH of the insulin solution (1.0 mg / ml), mix 10 ml of Siber solution (2 ×) to make crystals. , USA) to investigate the distribution of crystal size (FIG. 4).
단백질 용액의 pH가 알카리로 변할수록 10 ㎛ 이상 크기의 결정들의 비율이 줄어들었고, 5 ㎛ 이하의 미세 인슐린 결정의 차지하는 부피비율은 전체 생성된 결정중 각각 13%, 18%, 29%, 49%로 증가하는 경향을 나타내었다. 즉, pH가 등전점을 지나 알카리로 갈수록 씨로 작용할 수 있는 입자가 증가하게 되고 이들로부터 높은 비율의 5 ㎛ 이하의 미세 인슐린 결정이 생성됨을 알 수 있다.As the pH of the protein solution changed to alkali, the proportion of crystals having a size of 10 μm or more decreased, and the volume fraction of micro insulin crystals of 5 μm or less was 13%, 18%, 29%, and 49%, respectively. It showed a tendency to increase. That is, it can be seen that as the pH passes through the isoelectric point to alkali, the particles capable of acting as seeds increase, and a high proportion of fine insulin crystals of 5 μm or less are produced therefrom.
도5는 pH 9.0에서 생성된 미세 인슐린 결정의 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope) 사진이다. 정방형 (rhombohedral)과 마름모 (rhombs) 모양의 결정이 많이 발견되었다.Figure 5 is a scanning electron microscope (Scanning Electron Microscope) photograph of the fine insulin crystals produced at pH 9.0. Many crystals in the form of rhombohedral and rhombus were found.
실시예 4Example 4
결정의 크기 분석Crystal Size Analysis
입자분석기(CILAS 1064, France)로 씨를 분석하기 위해 실시예 3과 같은 방법으로 pH 6.4, 9.4, 10.14 인슐린 용액(1 mg/ml)을 만들었다. pH 6.4의 경우 초미세 결정이 생성되었으며, 맑은 pH 9.4, 10.14 인슐린 용액에 시버 용액 (2×)을 섞어서 초미세 결정을 만들었다. 또한 pH 9.8 인슐린 용액을 0.22 ㎛ filtering 후시버 용액 (2×)를 섞어서 만든 초미세 결정을 각각 입자분석기로 분석하였다.In order to analyze the seeds with a particle analyzer (CILAS 1064, France), a pH 6.4, 9.4, 10.14 insulin solution (1 mg / ml) was prepared in the same manner as in Example 3. Ultrafine crystals were produced for pH 6.4, and ultrafine crystals were prepared by mixing the Siber solution (2 ×) with a clear pH 9.4, 10.14 insulin solution. In addition, the ultrafine crystals prepared by mixing a 0.22 μm filtering backsiver solution (2 ×) with a pH 9.8 insulin solution were analyzed with a particle analyzer.
pH 6.4에서 얻어진 초미세 결정의 경우 평균 3.96㎛(Diameter at 50%)의 크기였으며 10 ㎛ 이하의 결정이 전체 부피의 약 95%였으며, 5 ㎛ 이하의 결정은 전체 부피의 약 62%로 나타났다.(도6)The ultrafine crystals obtained at pH 6.4 had an average size of 3.96 µm (Diameter at 50%), and crystals less than 10 µm were about 95% of the total volume, and crystals less than 5 µm were about 62% of the total volume. (Figure 6)
반면, pH 9.4, 10.14에서 얻어진 초미세 결정의 경우 각각 평균 2.25㎛, 2.59㎛ (Diameter at 50%)의 크기였으며 10 ㎛ 이하의 결정이 100%였으며, 5 ㎛ 이하의 결정은 전체 부피의 약 95%, 92%로 나타났다.(도7)On the other hand, the ultrafine crystals obtained at pH 9.4 and 10.14 were 2.25 µm and 2.59 µm (Diameter at 50%), respectively, and 100% of the crystals were less than 10 µm, and less than 5 µm were approximately 95% of the total volume. %, 92% (Fig. 7).
pH 9.8 인슐린 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 시버 용액 (2×)를 섞어서 만든 초미세 결정의 경우 평균 1.76 ㎛ (Diameter at 50%) 크기였으며 10 ㎛ 이하의 결정은 전체 부피의 100%였으며, 5 ㎛ 이하의 결정은 전체 부피의 약 95%로 나타났다.(도8)The ultrafine crystals prepared by filtering the pH 9.8 insulin solution with a 0.22 μm filter and then mixing Siber solution (2 ×) had an average size of 1.76 μm (Diameter at 50%) and crystals of 10 μm or less were 100% of the total volume. Crystals of 5 μm or less appeared to be about 95% of the total volume (FIG. 8).
pH 6.4 보다 pH 9.4, 10.14에서 1-5㎛크기의 초미세 결정의 비율이 더 높아지는 것은 알카리로 갈수록 인슐린의 용해도가 높아짐으로 인해 pH 9.4, 10.14 인슐린 용액내에는 녹고 남은 소량의 수 ㎛ 크기의 인슐린 결정과 수십 nm 크기의 미세 입자들이 시버 용액(2×)를 섞어 주었을때 핵으로 작용하여 다시 결정화가 일어나기 때문이다. 이것은 pH 9.8 인슐린 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 시버 용액(2×)를 섞어주었을 때 생성된 결정이 초미세 결정의 비율이 더 높은 것으로 나타남을 통해서도 알 수있다. 즉, 여과를 통해서 수 ㎛ 크기의 결정들은 이미 제거되고 수 nm 크기의 입자들만이 존재하는 용액을 이용하여 결정을 생성하였기 때문에 더 균일하고 미세한 크기의 결정을 얻을 수 있었다.The higher the ratio of ultrafine crystals of 1-5㎛ size at pH 9.4 and 10.14 than pH 6.4 is due to the higher solubility of insulin as alkali, which is dissolved in the pH 9.4, 10.14 insulin solution. This is because crystals and dozens of nanometer-sized particles act as nuclei when they are mixed with a Siber solution (2 ×), resulting in crystallization again. This can be seen from the fact that the crystals produced when the pH 9.8 insulin solution was filtered through a 0.22 μm filter and then mixed with the Siber solution (2 ×) showed a higher proportion of ultrafine crystals. That is, through filtration, crystals of several micrometers in size were removed and crystals were produced using a solution in which only a few nm sized particles were present, thereby obtaining more uniform and finer crystals.
실시예 5Example 5
산에 의해 인슐린 용해도를 감소시킬 경우의 결정화Crystallization When Reducing Insulin Solubility by Acids
인슐린 분말을 0.1N 초산(pH 2.0)에 녹여 3.0㎎/㎖을 만들었다. 이어서 10N, 1N 수산화 나트륨을 이용하여 인슐린 용액의 pH를 변화시켜가면서 pH9.8까지 올린 뒤에 2N HCl을 이용하여 다시 pH를 낮추었다. pH 6.1과 pH 5.0에서 시료를 취하여 입자 분석기를 이용하여 크기를 분석하였다.Insulin powder was dissolved in 0.1N acetic acid (pH 2.0) to make 3.0 mg / ml. Subsequently, the pH of the insulin solution was changed using 10N and 1N sodium hydroxide, and the pH was raised to pH 9.8, and then the pH was lowered again using 2N HCl. Samples were taken at pH 6.1 and pH 5.0 and size analyzed using a particle analyzer.
pH를 낮추면서 약 pH 6.5에서부터 용액이 탁해지기 시작하였으며 약 pH 4.0에서는 다시 맑아졌다.As the pH was lowered, the solution began to turbid from about pH 6.5 and cleared again at about pH 4.0.
준비한 시료를 관찰한 결과 미세 결정임을 알 수 있었고 그 크기는 pH 6.1과 pH 5.0의 경우 평균 크기가 각각 2.0, 2.17㎛였으며 5㎛ 이하 결정의 비율은 각각 94.8%, 99.6%로 나타났다(도 9).As a result of observing the prepared samples, it was found that the crystals were fine crystals, and the average size was 2.0 and 2.17 μm in pH 6.1 and pH 5.0, respectively, and the ratio of crystals below 5 μm was 94.8% and 99.6%, respectively (FIG. 9). .
실시예 6Example 6
알카리에 녹인 인슐린 용액의 인슐린 결정화Insulin Crystallization of Alkaline Dissolved Insulin Solution
0.1N 초산을 pH 12.0으로 조정한 뒤 인슐린 용액(1.0㎎/㎖)을 만든 뒤에 2N HCl을 이용하여 산도를 변화시켜 pH 7.0, 6.0, 5.0일 때 각 500㎕씩 취하여 24웰 플레이트에 넣고 정치시켰다.After adjusting 0.1N acetic acid to pH 12.0, making insulin solution (1.0mg / ml), and changing the acidity using 2N HCl, 500l each of pH 7.0, 6.0, and 5.0 was put in a 24-well plate and allowed to stand. .
그 결과 각 최종 pH에 관계없이 매우 균일한 약 10㎛ 이하의 인슐린 결정이 80%이상 생성되었다. 1,000(x) 관찰을 통해서 다시 한 번 확인 하였으며 입자 분석기로 크기를 분석하여 본 결과 평균 크기(diameter at 50%)는 6.75㎛ 정도임을 알 수 있었다(도 10).As a result, more than 80% of insulin crystals of about 10 μm or less were produced which were very uniform regardless of the final pH. It was confirmed once again through the observation of 1,000 (x), and the size was analyzed by particle analyzer, and the average size (diameter at 50%) was found to be about 6.75㎛ (Fig. 10).
실시예 7Example 7
결정의 크기 조절Scaling of crystals
인슐린 분말을 0.1 N 초산(pH 2.0)에 녹여 10 mg/ml을 만들고 시버 용액을 첨가하여 최종 1 ml, 0.5 mg/ml이 되도록 하여 24-웰 플레이트에 두 개의 웰을 만들었다. 이어 인슐린 분말을 0.1 N 초산(pH 2.0)에 녹여 1.0 mg/ml 을 만든뒤 pH를 변화시켜 pH 10.0으로 변화시켰다. 용액을 1/100 희석한 것과 원액을 각각 10 ㎕ 씩 각각의 웰에 넣고 잘 섞어준 뒤 상온에서 결정화를 시켰다.Insulin powder was dissolved in 0.1 N acetic acid (pH 2.0) to make 10 mg / ml and two wells were prepared in 24-well plates by adding Siber solution to a final 1 ml, 0.5 mg / ml. The insulin powder was then dissolved in 0.1 N acetic acid (pH 2.0) to make 1.0 mg / ml, and then the pH was changed to pH 10.0. Diluted 1/100 of the solution and 10 μl of the stock solution into each well were mixed well and crystallized at room temperature.
희석하여(1/100) 넣어준 경우 약 10∼30 ㎛의 결정들이 생성된 반면 씨용액 원액을 넣어준 경우에는 5∼10 ㎛의 결정들이 생성되었다 (도.11). 이로써 생성되는 결정의 수는 용액내에 존재하는 씨의 수에 의존하며 씨의 양이 많을 수록 동시에 많은 수의 결정이 성장하기 때문에 균일하고 미세한 결정이 생성됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 이상의 씨용액을 이용할 경우 원하는 크기의 매우 균일한 인슐린 결정을 생산해 낼 수 있을 것으로 생각된다.When diluted (1/100), crystals of about 10 to 30 µm were produced, whereas crystals of 5 to 10 µm were produced when seed solution was added (Fig. 11). The number of crystals thus produced depends on the number of seeds present in the solution, and as the amount of seeds increases, a large number of crystals grow at the same time. Therefore, it is thought that the above seed solution can produce very uniform insulin crystals of desired size.
본 발명의 장점을 요약하면 다음과 같다.The advantages of the present invention are summarized as follows.
1. 균일한 초 미세 인슐린 결정을 짧은 (수 초 내지 2분) 시간내에 얻을 수 있다.1. Homogeneous ultrafine insulin crystals can be obtained in a short (several seconds to 2 minutes) time.
2. 10 ㎛ 이하의 초 미세 인슐린 결정을 약 99% 이상의 비율로 생산할 수 있다.2. Ultra fine insulin crystals of 10 μm or less can be produced at a rate of about 99% or more.
3. 생성된 초 미세 인슐린 결정 중 5 ㎛ 이하의 비율은 약 90% 이상이다.3. The proportion of 5 micrometers or less in the ultrafine insulin crystals produced is about 90% or more.
4. 본 발명에서는 씨용액의 농도를 변화시킴으로써 생성되는 결정의 크기를 조절할 수 있다.4. In the present invention, the size of the crystals produced can be adjusted by changing the concentration of the seed solution.
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