KR100323837B1

KR100323837B1 - 고정화된 레반슈크라제 또는 유기용매 처리된 균체를이용한 저분자량 레반의 제조방법

Info

Publication number: KR100323837B1
Application number: KR1020000000417A
Authority: KR
Inventors: 이상기; 송기방; 장기효; 김철호; 정봉현
Original assignee: 복성해; 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-01-06
Filing date: 2000-01-06
Publication date: 2002-02-07
Also published as: KR20010068479A

Abstract

본 발명은 저분자량 레반의 제조방법에 관한 것으로, 마그네타이트 비드(magnetite bead)에 고정된 레반슈크라제, 또는 레반슈크라제가 발현된 균체를 유기용매로 처리하여 퍼미어빌라이제이션(permeabilization)시킨 균체를 레반슈크라제의 효소원으로 사용하고 설탕을 기질로 하여 레반을 제조하는 본 발명의 방법에 의하면 저분자량의 레반을 경제적이고 효율적으로 대량생산할 수 있다.

Description

고정화된 레반슈크라제 또는 유기용매 처리된 균체를 이용한 저분자량 레반의 제조방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF LOW-MOLECULAR WEIGHT LEVAN BY USING IMMOBILIZED LEVANSUCRASE OR MICROORGANISM CELLS TREATED WITH AN ORGANIC SOLVENT}

본 발명은 저분자량의 레반을 대량생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정제된 레반슈크라제(levansucrase, E.C.2.4.1.10)를 마그네틱 비드에 고정화하거나, 또는 레반슈크라제를 함유한 균체를 유기용매로 퍼미어빌라이제이션(permeabilization)시켜 각각을 레반슈크라제 효소원으로 이용함으로써 저분자량의 레반을 대량생산하는 방법에 관한 것이다.

레반은 Glu-(Fru)_n(여기에서, Glu는 글루코스 잔기, Fru는 프락토스 잔기, n은 약 10¹-10⁵의 수를 나타낸다)로 나타내어지는 수용성 과당 폴리머로서 레반슈크라제의 과당 전이반응에 의해 설탕으로부터 생산된다. 이는 덱스트란과 물리화학적 특성이 유사하여 혈장대용제나 폴리에틸렌글리콜/레반의 수상이상분계 형성을 이용한 단백질의 분리(대한민국 특허출원 공개 제 99-54630 호) 등 덱스트란을 대신하여 사용될 수 있으며, 유화제, 안정화제, 캡슐화 시약 등 폭넓은 분야에 응용되고 있다(Lwibovici et al.,Anticancer Res.,5, 553(1985); 및 Stark et al.,Br. J. Exp. Path.,67, 141(1986)). 최근 레반은 산업용 폴리머 식품(Hatcher et al.,Boprocess, technol.,11, 1(1989)), 화장품, 제약분야에 응용되고 있다(Whiting et al.,J. Inst. Brew.,73, 422(1961); 및 Han,Bioprocess Technol.,12, 1(1990)).

레반의 산업적인 응용에 있어서, 레반의 구조와 크기는 중요한 요소로서 작용한다. 즉, 저분자량의 균일한 크기의 레반은 혈장 대용제나 폴리에틸렌글리콜/레반의 수상이상분계 형성을 이용한 단백질 분획시 유용하게 사용될 수 있으며, 항종양 활성 또는 면역증강 작용에 있어서도 우수한 것으로 알려져 있다. 효소 합성된 레반의 특성은 레반의 가지사슬 형성정도(degree of branch)와 분자량에 의하여 변하게 되며 레반 생성시 반응조건 중 효소 반응온도와 반응액의 pH에 따라서 영향을 받게 된다. 예를들면, 0-37^oC의 반응온도에서 생성되는 레반의 분자량은 반응온도에 반비례하게 된다. 또한, 레반은 몇몇 식물의 저장 탄수화물로서 저분자(분자량: <5,000)로 존재하며, 설탕을 함유한 배지 또는 자연상태에서 미생물의 세포외 합성에 의해 비교적 고분자(> x10⁶)로서 생산될 수 있다(Han Y. W.,Adv. Appl. Microbiol.,35, 171(1990)).

레반슈크라제를 이용하여 레반을 제조하는 방법들은 다수 보고된 바 있는데, 예를 들어, 미국특허 제 4,879,228 호 및 국제특허 공개 제 86-4091 호에서는 대사과정에서 활동하는 미생물을 이용하여 설탕으로부터 레반을 생산하고자 한 바 있으나, 이 방법은 레반의 생산수율이 낮을 뿐만 아니라 부산물과 불순물이 많이 혼재된 레반이 생성되어 정제하는데 많은 어려움이 있으며, 저분자량의 레반을 생산하기 위하여 높은 반응온도(37^oC)를 적용한 결과 저분자량의 레반과 올리고당을 제조할 수는 있었지만 기질 대비 레반의 생성 수율이 10이하로 감소하게 되는 문제점이 발생하였다.

회분법에 의하여 레반을 제조하는 방법에 의해서는 효소를 기질용액과 섞어서 사용하므로 효소의 재사용률이 떨어져 경제적인 면에서 불리하다는 단점이 있으며, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)와 같은 담체에 레반슈크라제를 고정화시켜 레반을 생산하는 방법에 의해서는 오히려 회분법에 의하여 생성된 레반보다 고분자량의 레반이 생성된다는 보고가 있다(Chambert et al.,Carbohydr. Res., 244, 129(1993)).

이에 본 발명자들은 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)의 레반슈크라제 유전자를 이용하여 형질전환된 대장균에서 대량발현된 재조합 레반슈크라제를 이용하여 레반을 생산한 바 있으나(Belghith, H. et al.,Biotechnol. Letts,18, 467(1996), 대한민국 특허공고 제 176410 호 및 제 145946 호), 보다 효율적이고 경제적인 방법으로 저분자량의 레반을 제조하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 마그네타이트 비드에 레반슈크라제를 고정화시키거나 또는 레반슈크라제가 포함된 균체를 유기용매로 퍼미어빌라이제이션(permeabilization)시켜 이들을 각각 레반슈크라제 효소원으로 사용함으로써 이를 달성할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 저분자량의 레반을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 대장균에서 생성된 레반슈크라제를 금속 친화성 크로마토그라피법에 의하여 정제한 결과를 나타낸 것이고,

도 2는 HPLC에서 젤 투과 크로마토그래피 칼럼을 이용하여 레반의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 마그네타이트 비드에 고정화된 레반슈크라제, 또는 레반슈크라제가 발현된 균체를 유기용매 처리하여 퍼미어빌라이제이션(permeabilization)시킨 균체를 레반슈크라제 효소원으로 사용하고 설탕을 기질로 하여 레반을 생산하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에 사용되는 레반슈크라제는 레반슈크라제를 고발현하도록 고안된 균주, 예를 들어 대한민국 특허공고 제 145946 호에서 제조한 재조합 대장균(KCTC 8661P)을 적절한 조건에서 배양한 다음 초음파 파쇄하고 금속 친화성 크로마토그라피(metal affinity chromatography)로 정제하여 수득할 수 있다(도 1).

분리 정제된 레반슈크라제를 고정화 담체 표면에 고정화시키는 방법은 다음과 같다. 먼저, 고정화 담체로서 자철광 산화물(magnetic iron oxide) 5 내지 100 mg을 TiCl₄와 물의 혼합용액(1:10 내지 1:30(v/v), 바람직하게는 1:20(v/v))에 첨가하여 교반한 다음, 1M 암모니아 용액으로 처리하고 다시 교반한다. 이를 pH 3.0 내지 7.0, 바람직하게는 pH 4.0의 초산 완충용액으로 1 내지 5 회, 바람직하게는 3회 이상 세척한다. 이어서 상기 준비된 담체와 레반슈크라제 0.1 내지 2 U, 바람직하게는 0.4 U를 동일한 초산 완충용액에 혼합하고 4^oC에서 30 분 내지 16 시간 동안, 바람직하게는 1 시간 동안 균일한 속도로 교반하여 효소를 담체에 고정화시킨다. 고정화되지 않은 효소는 초산 완충용액으로 유리 효소의 활성이 검출되지 않을 때까지, 예를 들어 3번 이상 세척하여 제거한다.

또한, 레반슈크라제가 발현된 균체를 퍼미어빌라이제이션시켜 레반슈크라제 효소원으로 이용하는 방법은 다음과 같다. 즉, 레반슈크라제 유전자를 포함하는 균체, 예를 들어 재조합 대장균 BL21(DE3)/pEL12(KCTC 8661P)를 적절한 배지에서 배양하고 레반슈크라제의 발현을 유도한 후 원심분리하여 회수한 균체를 초산 완충용액, 바람직하게는 50mM 초산 완충용액(pH 6.0)으로 세척하고, 다시 동일한 초산 완충용액을 첨가하여 10 내지 20 배 농축한 후, 유기용매를 1:10 내지 1:100(유기용매:균체), 바람직하게는 1:10(유기용매:균체)의 비율로 첨가하여 상온에서 3 내지 10분, 바람직하게는 5분 동안 강하게 교반시킨다. 유기용매로서는 톨루엔, CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 등을 사용할 수 있고, 톨루엔을 사용하는 것이 바람직하다. 이어서, 원심분리하여 유기용매를 제거한 후, 초산 완충용액으로 균체를 세척하고 이를 레반슈크라제 효소원(유기용매 처리된 균체)으로 사용한다.

이와 같이 수득된 마그네타이트 비드에 고정화된 레반슈크라제 또는 유기용매 처리된 균체를 이용하여 설탕을 기질로 하여 효소 합성법에 의해 레반을 제조할 수 있다. 효소반응에 사용되는 기질인 설탕의 농도는 10 내지 50(w/v), 바람직하게는 10 내지 20이며, 반응 pH는 4 내지 6, 바람직하게는 pH 4이고, 반응온도는 통상 0 내지 37^oC, 바람직하게는 0 내지 20^oC, 가장 바람직하게는 4℃가 효소의 실활이 적고 효소의 수명이 연장되어 적당하다. 이 때 반응시간은 20 내지 100 시간, 바람직하게는 70 시간 동안 수행한다.

본 발명의 마그네타이트 비드에 고정화된 레반슈크라제 또는 유기용매 처리된 균체를 이용하면 레반의 생산량이 약 12-30 g/ℓ에 이르며, 이 때 수득된 레반의 분자량은 2백만(톨루엔 처리된 균체) 내지 3백만(고정화 효소)으로서, 동일한 조건에서 비처리 효소에 의하여 생성된 레반의 분자량(6백만 이상)에 비해 상당히 작다.

효소반응 방법은 회분식 또는 반회분식(semi-batch reaction)으로 실시할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참 조 예

(1) 단백질 정량법

표준 단백질로 오브알부민을 사용하여 다음과 같이 단백질을 정량하였다.

시료 100㎕에 쿠마시블루액(Bio-Rad protein assay, 바이오래드사 제품) 5 ㎖를 가하여 혼합한 후, 실온에서 10 분간 방치하고, 595nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였다.

(2) 레반슈크라제의 활성 측정

레반슈크라제의 활성은 오뮬란 등의 방법(O'Mullan et al.,Biotechnonol. Lett.,13, 137(1991))에 의해 다음과 같이 측정하였다.

50mM 초산 완충용액(pH 5.0)에 설탕을 1로 용해시킨 후 440 ㎕를 취하고, 여기에 조효소 10 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응액 중 생성된 환원당을 GOD-PAP 키트(베링거마하임사 제품)를 이용하여 정량하였다. 1 분간 1 μM의 포도당을 생성하는 효소활성을 1 유니트(U)로 정의하였다.

(3) 레반 정량법

효소 반응액을 0.45 ㎛ 여과막으로 여과한 다음, 여액 20 ㎕를 HPLC(System Gold, 벡크만사 제품)에 주입하여 레반량을 정량하였다. HPLC 분석조건은 50^oC로 유지시킨 칼럼(Ionpak KS-802, Shodex사 제품)을 이용하여 증류수를 0.4 ㎖/분의 속도로 흘려주었고, 굴절율(refractive index)에 의해 검출하였다.

(4) 레반의 분자량 측정

효소 반응액을 0.45 ㎛ 여과막으로 여과한 다음, 여액 100 ㎕를 HPLC(System Gold, 벡크만사 제품)에 주입하여 각각의 레반이 칼럼을 통과하는 시간을 상호 비교하였다. 분자량의 크기에 따른 칼럼의 통과 시간을 측정하기 위하여, 표준물질로 폴리에틸렌 옥사이드(분자량 8x10⁶), 덱스트란 표준물질(분자량 8x10⁶, 7.5x10⁵, 1.7x10⁵, 4x10⁴)과 수크로즈(분자량 342)를 사용하였다. 두 개의 연결된 칼럼(GPC columns 4,000-1,000, Polymer Laboratories사 제품)을 사용한 것을 제외하고는 HPLC 분석 조건은 상기 (3)과 동일한 방법을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 50℃로 유지시킨 칼럼(Ionpak KS-802, Shodex사 제품)을 이용하여 증류수를 0.4 ㎖/분의 속도로 흘려주었고, 굴절율(refractive index)에 의해 검출하였다.

(5) 레반슈크라제의 정제

레반슈크라제를 고발현하도록 고안된 재조합 대장균 BL21(DE3)/pEL12(KCTC8661P; 대한민국 특허공고 제 145946 호)를 M9-ZB 배지(1ℓ중 트립톤 10g, NaCl 5g, 염화암모늄 1g, 인산이수소칼륨 3g, 인산이나트륨 6g, 포도당 4g, 1M 황산마그네슘 1㎖)에 접종하여 37℃에서 진탕배양하면서 600㎚에서의 흡광도가 0.7에 도달하면 IPTG(시그마사 제품)를 1mM이 되도록 첨가하여 레반슈크라제의 발현을 유도하였다. 3시간 뒤 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 후 초음파로 파쇄하고 파쇄액을 컬럼으로서 Ni-NTA 수지컬럼(큐아젠사 제품)을 사용하고 용출액으로 0.25M 이미다졸(imidazole)을 사용한 금속 친화성 크로마토그라피(metal affinity chromatography)로 정제하였다. 도 1은 정제된 레반슈크라제를 확인한 것으로, M열은 표준 분자량 마커이고, 제1열은 대장균 전체단백질이며, 제2열은 금속 친화성 크로마토그라피로 정제한 레반슈크라제이다.

실 시 예 1 : 레반슈크라제의 고정화 및 레반 생성

(단계 1)

자철광 산화물 50 ㎎에 25 ㎕의 TiCl₄와 500 ㎕의 물을 가하여 4℃에서 1 시간 동안 교반한 다음, 1M 암모니아 용액 280 ㎕을 첨가한 후, 4℃에서 1 시간 동안 다시 교반하였다. 6,000 rpm에서 원심분리하여 화학반응이 끝난 담체를 회수한 후, pH 4.0의 50mM 초산 완충용액으로 3회 세척하였다.

상기 담체와 레반슈크라제 0.4 U을 pH 4.0의 초산 완충용액에 혼합하고 4^oC에서 1 시간 동안 교반한 후 초산 완충용액으로 세척하여 마그네타이트에 고정화된레반슈크라제를 75의 효소 회수율로 수득하였다.

(단계 2)

pH 4.0의 50mM 초산 완충용액 1㎖에 설탕을 10(w/v) 농도가 되도록 녹이고, 상기 단계 1에서 수득한 고정화효소 또는 참조예의 (5)에서와 같이 정제된 레반슈크라제 0.3 U를 첨가한 후 4℃, 10℃, 20℃ 및 37^oC로 온도를 조절하여 70 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 생성된 레반량을 참조예의 (3)과 같이 측정하고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

효소원	반응온도에 따른 상대적인 레반농도 ()
효소원	4^oC	10^oC	20^oC	37^oC
고정화 효소	100	97	84	61
정제된 레반슈크라제	100	94	72	20

상기 표 1에서 보듯이, 두 효소 모두 4℃에서 반응시켰을 때 레반 생성량이 가장 많으며, 온도가 증가될수록 레반의 생산 수율은 감소되었다. 하지만, 효소 고정화에 의하여 레반슈크라제의 온도에 대한 안정성은 크게 증가되어 높은 반응 온도, 즉, 20℃ 또는 37℃에서 고정화되지 않은 레반슈크라제에 비해 고정화된 레반슈크라제에 의해 레반의 생성량이 많음을 알 수 있다.

또한, 상기 두 효소의 최적 pH를 비교한 결과, 각각 pH 4.0(고정화 효소)과 pH 5.0(정제된 레반슈크라제)으로서 고정화에 의하여 효소의 최적 pH가 좀더 산성조건으로 변화되는 것이 관찰되었다. 기질농도에 따른 레반 생성물로의 전환율을조사한 결과 상기 두 효소는 유사한 효소적 특성을 나타내었는데, 기질농도 5%에서는 기질전환율에 큰 변화가 없어 효소활성이 저해되지 않음을 확인하였으며 그 이상의 기질농도에서는 효소활성의 저해가 관찰되었다.

실 시 예 2 : 톨루엔 또는 아세톤 처리된 균체 제조 및 레반 생성

(단계 1)

레반슈크라제 유전자를 포함한 재조합 대장균 BL21(DE3)/pEL12(KCTC 8661P)를 참고예의 (5)에서와 같이 배양하고 레반슈크라제의 발현을 유도한 후, 배양액 1 ℓ를 원심분리하여 회수한 균체를 1/10 분량의 50 mM 초산 완충용액(pH 6.0)으로 세척하고, 회수된 균체에 다시 50mM 초산 완충 용액(pH 6.0) 5㎖를 첨가하여 레반슈크라제를 20배 농축하였다. 농축된 균체 5㎖에 톨루엔 0.5㎖ 및 0.05㎖, 및 아세톤 0.5㎖을 각각 가하고, 상온에서 5 분 동안 강하게 교반한(vortexing) 다음, 원심분리하여 톨루엔 및 아세톤을 제거한 후, 50mM 초산 완충용액(pH 6.0)으로 균체를 2번 세척하여 톨루엔 또는 아세톤 처리된 균체를 수득하였다.

(단계 2)

10설탕을 함유한 50 mM 초산 완충용액(pH 4.0) 1 ml에 상기 톨루엔 또는 아세톤 처리된 균체, 및 비처리 균체 100㎕를 각각 첨가한 후, 4^oC에서 6 시간 동안 반응시켜 생성된 레반의 농도를 하기 표 2에 나타내었다.

처리 방법	상대적인 레반농도 ()
비처리 균체	35
톨루엔 처리된 균체(톨루엔:균체 = 1:100)	87
톨루엔 처리된 균체(톨루엔:균체 = 1:10)	100
아세톤 처리된 균체(아세톤:균체 = 1:10)	29

상기 표 2에서 보듯이, 톨루엔이 1:10의 비율(톨루엔:균체)로 처리된 균체는 비처리 균체와 비교하여 효소활성이 3배 정도 높았으며, 톨루엔으로 처리한 경우가 아세톤으로 처리한 경우보다 효소활성이 3.5배 높은 것으로 나타났다. 반면 아세톤 처리군에서는 비처리군보다 레반 생성율이 낮게 나타나 레반슈크라제의 경우 아세톤 처리는 적당하지 않은 것으로 나타났다.

실 시 예 3 : 톨루엔 처리된 균체의 반응온도에 따른 레반 생성

1:10의 비율(톨루엔:균체)로 톨루엔 처리된 균체를 사용하고, 반응온도를 하기 표 3과 같이 4℃, 10℃, 20℃ 및 37℃로 하는 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 온도에 따라 생성된 레반의 농도를 측정하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

효소원	반응온도에 따른 상대적인 레반농도 ()
효소원	4^oC	10^oC	20^oC	37^oC
톨루엔 처리된 균체	100	100	83	43
정제된 레반슈크라제	100	94	72	20

상기 표 3에서 보듯이, 상기 반응 조건에서 톨루엔 처리된 균체에 의한 최적 레반 생성 온도는 4℃였으며, 정제된 레반슈크라제와 비교시, 온도에 대한 안정성은 크게 증가되어, 높은 반응온도, 즉, 20℃ 또는 37℃에서는 정제된 레반슈크라제를 사용한 경우에 비해 레반의 생성량이 많음을 알 수 있다.

또한, 기질농도에 따른 레반 생성물로의 전환율을 조사한 결과 상기 두 효소는 유사한 효소적 특성을 나타내었는데, 기질농도 5%에서는 기질전환율에 큰 변화가 없어 효소활성이 저해되지 않음을 확인하였으며 그 이상의 기질농도에서는 효소활성의 저해가 관찰되었다.

실 시 예 4 : 생성된 레반의 분자량 측정

고정화되지 않은 레반슈크라제(참고예의 (5)), 고정화된 레반슈크라제(실시예 1의 단계 1) 및 톨루엔 처리된 균체(실시예 3)에 의하여 4℃의 반응 온도에서 실시예 2의 방법으로 생성된 레반의 분자량을 참고예의 (4)와 같이 젤 투과 크로마토그라피(gel permeation chromatography)법으로 분석하였다.

그 결과, 동일한 반응조건에서 고정화되지 않은 유리효소에 의하여 합성된 레반의 분자량은 6백만 이하로 관찰되었으며, 톨루엔 처리된 균체로부터 생성된 레반은 약 2백만 정도로 측정되었고, 고정화 효소에 의하여 생성된 레반의 분자량은 약 3백만 정도로 측정되어 톨루엔 처리된 균체나 고정화된 효소에 의하여 생성된 레반은 유리 효소로부터 생성된 레반에 비하여 저분자량인 것을 알 수 있다(도 2).

실 시 예 5 : 고정화된 효소의 재사용 시험

고정화된 효소의 재사용 가능성을 다음과 같은 방법으로 조사하였다. 50mM 초산 완충용액(pH 4.0) 1㎖에 설탕을 10(w/v) 농도가 되도록 녹이고, 실시예 1의 단계 2에서 제조된 고정화 효소 0.3 U를 첨가한 후 4^oC에서 6시간 동안 반응시키고 반응이 종결된 후 원심분리하여 고정화된 효소를 회수하였다. 회수된 고정화 효소에 다시 기질용액(50mM 초산 완충용액(pH 4.0) 1㎖에 설탕이 10(w/v) 농도로 첨가된 용액)을 첨가하여 상기와 동일하게 효소반응을 수행한 후 잔존 효소활성을 조사하고 상기 절차를 반복 실시하였다.

	고정화 효소의 재사용 빈도
	1회	2회	3회	4회
잔존 효소활성()	100	84	52	15

표 4에서와 같이 3회 반복사용시까지 50이상의 활성이 존재하였으며 4회 반복시에는 처음 효소활성의 약 15정도만이 잔존하는 것으로 나타났다. 따라서 마그네타이트 비드(magnetite bead)의 표면에 레반슈크라제를 고정화한 경우 효소 반응 생성물이 거대분자인 레반인 관계로 효소 재사용율이 낮아 약 3회 정도의 효소 재사용이 가능하였다.

이와 같이 레반슈크라제를 마그네타이트에 고정화하거나 레반슈크라제가 발현된 균체를 유기용매 처리하여 레반슈크라제 효소원으로 사용함으로써 효소의 안정성을 증가시키고 반복적인 사용을 가능하게 하여 경제적으로 저분자량의 레반을 제조할 수 있으며, 의약품, 식품, 화장품 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

마그네타이트 비드(magnetite bead)에 고정화된 레반슈크라제를 이용하여 설탕을 기질로 하여 레반을 생산하는 방법.
레반슈크라제가 발현된 균체를 유기용매 처리하여 퍼미어빌라이제이션(permeabilization)시킨 균체를 이용하여 설탕을 기질로 하여 레반을 생산하는 방법.
제 2 항에 있어서,

유기용매가 톨루엔인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

4 ℃ 내지 37 ℃의 반응온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.