KR100313980B1 - 골절예방및치료용약제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 활성 성분으로서 혈소판 인자 4를 포함하는 골절 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 조성물은 조골세포의 분화를 촉진함으로써 골절등과 같이 골 분화 및 증식을 필요로 하는 질환의 예방 및 치료에 효과적이 되도록 한다.
Description
본 발명은 골 형성-관련 질환, 특히 골절을 예방하거나 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
골은, 오래된 골을 새것으로 대체하기 위한 반복된 국소적 골 흡수 및 골 형성에 의한 내골격으로서의 지지 기능을 유지하고, 또한 무기물 균형에 있어 다양한 기계적 응력 및 변화에 대한 신속한 반응을 위해 예비한다. 이러한 골재생은 주로 파골 세포등과 같은 골 흡수 세포 및 조골 세포등과 같은 골 형성 세포에 의해, 이들 두 세포의 결합을 기초로 하여 수행된다. 최근, 조골 세포는 골 형성 기능을 가질 뿐만 아니라, 파골 세포의 분화 및 활성화와도 밀관됨으로써, 세포성 골 재구성에 있어 조절적 중추로서의 역할을 한다는 증가된 가능성이 있다는 보고가 있어왔다[참조: Inoue, T., Mebio (1990), Special Version P. 2-7].
혈소판 인자 4(PF4)는 혈소판의 특징적인 단백질로서, 헤파린에 특이적으로 결합하여 헤파린의 항응고 활성을 중화시킬 수 있다. 또한 추가로, PF4는 백혈구, 단핵구 및 섬유아세포상의 화학 주성(chemotactic) 인자로서 작용할 수 있고, 염증 병변내 백혈구(다핵성 호중구)로부터 방출되는 콜라게나제에 의해 야기되는 상해로부터 조직을 보호하기 위한 항-콜라게나제 활성을 나타낼 수 있음이 공지되어 있다. 또한 사람 PF4는 시험관내 신생 래트 골로부터의 상피소체 호르몬(PTH)-자극된45Ca2+방출을 가역적으로 차단함이 밝혀졌다[참조: Horton, J.E., et al, Biochem. Biophys, Acta. (1980), Vol. 630, p. 459-462]. 최근, 사람 PF4는 사람의 골육종 세포주 Saos-2 및 G-292 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌고, 이로부터 항종양 효과를 기대할 수 있게 되었다[참조: Tatakis, D. N., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), Vol. 187, p. 287-293].
사람 PF4는 70개 아미노산으로 이루어져 있고 소 PF4는 88개 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로, 각각의 서열이 결정된 것으로 밝혀졌다[참조: Hermodson, M., et al., J. Biol. Chem. (1977), Vol. 252, p. 6276-6278; Ciaglowski, R,E., et al., Arch. Biochem. Biophys. (1986), Vol. 250, p. 249-256].
PF4는 혈소판으로부터 프로테오글리칸과의 결합 형태로 방출되지만, 프로테오글리칸은 헤파린으로 대체될 수 있는 것으로 간주된다. 최근, 방사선면역검정에 의해 혈장내 PF4 값의 측정이 연구되었다. PF4 활성은 세포내 기능질 분획화 방법에 의해 분리되는 α-과립 함유 분획중에서 풍부하게 검출되었다. 또한 추가로, PF4는 면역형광 현미경 기술에 의해 혈소판 및 거핵구내에서 검출되는 한편, 거핵구내 이의 합성이 추정된다[참조: Ginsberg, M.H., et al., Blood (1980), Vol. 55, p. 661-668; Ryo, R., et al., Thromb. Res. (1980), Vol. 17, p. 645-652].
다른 한편, 다양한 골 형성 인자가 골 형성 과정중에 참여할 수 있음이 공지되어 있다[참조: Noda, M., BIOmedica (1993), Vol. 8, p. 28-33]. 특히, 에스트로겐, PTH 및 동화성 호르몬이 골 형성을 촉진할 수 있음이 공지되어 있다. PF4는 골 흡수를 억제하는 것으로 공지되어 있지만[참조: Horton, J. E., et al., loc. cit.], PF4가 또한 골형성에 있어 효과적일 수 있음은 제시된 바 없다.
본 발명의 목적은 골 형성에 효과적인 신규한 치료제로서 적용될 수 있는 펩타이드를 제공하는 것이다. 보다 특이적으로, 에스트로겐, PTH 또는 동화성 호르몬과 같이, 이들의 제시된 골형성 촉진 효과와 함께 심각한 부작용을 나타냄으로써 충분한 관측이 요구되어지는 선행분야의 공지된 제제에서 보다 훨씬 안전한 골 형성-촉진 효과를 나타낼 수 있는 펩타이드가 요망되어 왔다.
본원에 이르러, 본 발명자들은 다양한 연구 수행결과, 소 PF4 및 사람 PF4가 골 형성을 촉진할 수 있음을 발견하였고, 이로써 본 발명을 완성시켰다.
사람을 포함한 포유동물의 태아 및 신생아의 혈액내에서 다양한 성장인자가 발견되었고, 이들이 태아 및 신생아가 현저히 성장하는데 있어 다양한 세포 조직의성장을 촉진시킬 수 있는 것으로 간주된다. 다량으로 용이하게 입수가능한 신생송아지 혈청을 출발 물질로서 사용하여, 본 발명자들은 조골 세포-유사 골육종 세포주에서 알칼리 포스파타제(ALPase) 활성을 증가시킬 수 있는 단백질 인자의 정제 및 분리를 시도하였다.
ALPase 촉진 활성 측정에 적용될 수 있는 조골세포-유사 골육종 세포주로서, 예를 들면 ROS 17/2.8 세포주를 사용할 수 있다. 골 형성 지수로서, 조골 세포-유사 골육종 세포주 ROS 17/2.8은 ALPase 활성을 증가시키는 것으로 간주된다; 예를 들면, 형질전한 성장 인자-β(TGF-β)는 ALPase 활성을 증가시키는 것으로 입증되었다[참조: Pfeilschifter, J., et al., Endocrinology (1987), Vol. 121, p. 212-218; Rodan, G.A., et al., Calcium regulating hormones and bone metabolism, Elsevier Science Publishers B.V., (1992), p. 183-196].
다양한 성장 인자가 헤파린에 용이하게 결합될 수 있음이 공지되어 있기 때문에, 먼저 헤파린 친화 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 결합 분획을 분리시킬 수 있다. 그런 다음, 역상 HPLC를 추가 분획에 대해 사용할 수 있다. 각각의 분획의 ALPase 촉진 활성에 대해 측정한다. 그 결과, ROS 17/2.8 세포내에서 ALPase 활성을 증가시킬 수 있는 분획이 발견되었다. 분획의 부분적인 아미노산 서열이 측정되었고, 단백질 데이타베이스를 참조로 그것이 어떠한 공지의 단백질일 수 있는지의 여부에 대해 조사하였다. 그 결과, 상기 서열은 소 PF4의 널리 공지된 아미노산 서열과 일치함으로써 수득된 활성 분획은 PF4인 것으로 평가되었다. 따라서, 시판중인 정제된 사람 PF4의 유사한 연구로, 이의 ALPase 증가 활성을 확인하였다. 즉,상기 활성 분획은 PF4인 것으로 확인되었고, 이로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 유효량의 PF4가 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합되어 포함된, 골절 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 골절을 앓는 환자에게 유효량의 PF4를 투여함을 포함하여, 골절을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 골절 예방 또는 치료제로서의 PF4의 제조방법에 관한 것이다.
PF4는 혈소판으로부터 정제하거나 임의의 공지된 아미노산 서열을 기본으로 하여 PF4 암호화 DNA를 합성하거나, 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 유전자 공학에 의해 PF4 유전자를 클로닝하고 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
PF4는 조골 세포-관련 질환에 대한 치료 또는 예방제로서 사용될 수 있다. 특히, 조골 세포의 촉진된 분화 측면에서 골절 등과 같이 골 분화 및 증식 촉진을 필요로 하는 질환의 치료에 효과적이다.
골절 치료에 있어, 가장 바람직하게는 PF4를 적합한 겔 기재와 혼합한 후 국소적으로 또는 치료될 부위로 바로 적용하는 투여 방법을 채택할 수 있다. 그밖의 경우, PF4는 고도의 수용성으로 인해 수성 주사액을 사용하는 전신적 경로를 통해 투여되거나, 미립자 에어로졸 형태로 비강내 또는 흡입 경로를 통해 투여될 수 있다.
투여량은 국소 투여에 있어서는 1 내지 100㎍/적용부위/환자/일이고, 전신투여에 있어서는 0.1 내지 10mg/㎏/일이다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 설명될 것이다.
실시예 1
신생 송아지 혈청으로부터 PF4의 정제
1)헤파린 친화 크로마토그래피에 의한 부분 정제
신생 송아지 혈청(GIBCO Laboratories Inc.로부터 구입) 1ℓ에 염화나트륨 20.5g을 가한다. 가염 혈청을, 트리스 완충액 A(20mM 트리스-HCl, pH7.5, 0.5M NaCl)로 평형된 헤파린-토요펄 컬럼 (heparin-Toyopearl column, 직경 5cm x 길이 5.5cm, TOSOH CORPORATION으로부터 입수가능)으로 3ml/분의 유속으로 전개시킨다. 그런 다음, 컬럼을 트리스 완충액 A로 완전히 세척한다.
세척후, 헤파린-토요펄 컬럼 상에 흡착된 펩타이드 또는 단백질을 트리스 완충액 B(20mM 트리스-HCl, pH7.5, 1.0M NaCl)로 용출시킨다. 용출액을 분광계를 사용하여 280nm에서의 흡광도를 모니터하면 약 300ml의 분획이 보다 높은 흡광도를 갖는다.
2)역상 HPLC에 의한 정제
상기 방법 1)로부터 수득한 용출액을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 물로 평형시킨 코스모실(Cosmosil) 5C18-300컬럼(직경 4.6mm x 길이 250mm, Nakarai Tesuku K.K.로부터 입수가능)으로 전개시키고, 컬럼을 0.1% TFA를 함유하는 물로 완전히 세척한다. 그런 다음, 흡착된 펩타이드 또는 단백질을 0.1% TFA를 함유하는 0 내지 80% 아세토니트릴 선형 구배로 용출시킨다. 용출액을 214nm에서 흡광도를 모니터하여 매 피크를 수집한다. 용출 패턴을 제 1도에 나타낸다.
실시예 2
매 피크상에서 ALPase 촉진 활성의 측정
조골 세포-유사 골육종 세포주 ROS 17/2.8을 5% 신생 송아지 혈청-함유 F12 배지 1ml내에서 2x104세포/웰로 24-웰 배양 플레이트내로 이식시키고 CO2인큐베이터 내에서 37℃에서 3일간 배양한다. 그런 다음, 배양배지를 제거하고 세포를 F12 배지로 1회 세척한 후, 방법 2)에 의해 수득된 각각의 피크 분획을 함유하는 혈청-비함유 배지(0.2% 소 혈청 알부민-함유 F12 배지) 1ml를 사용하여 추가로 배양하고 추가로 2일간 배양을 지속한다. 그런 다음, 배양 배지를 제거하고, 세포를 둘베코 PBS(GIBCO Laboratories Inc.로부터 입수가능)로 3회 세척한 후, 0.2% 노니뎃(Nonidet) P-40 및 0.9% 염화나트륨 함유 용액 200μl를 가한다. 수득된 혼합물을 실온에서 1시간 정치시켜 세포를 용해한다. 연속적인 원심분리를 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기를 사용하여 5분간 수행하여 상등액을 회수한다. 상등액 20μl에 용액을 가해, 0.1M 글리신, 1mM ZnCl2, ImM MgCl2(pH10.4)중 10mM p-니트로 페닐이 되게하고, 교반 후, 반응을 37℃에서 20분간 진행시킨다. 반응을 420nm에서 흡광도를 측정함으로써 모니터한다. ROS 17/2.8세포내 ALPase 촉진 활성에 대한 제 1도에 나타낸 피크 1의 효능에 대한 측정 결과를 표 1에 나타내며, 이때 용량은 피크 분획중의 단백질 농도를 나타내며, ALPase 활성에 대한 각각의 값은 개개 그룹의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
실시예 3
제1도의 피크 1 펩타이드의 물리화학적 특성의 측정
1) 아미노산 서열분석에 의한 동정
실시예 2에서 활성인 것으로 확인된 분획중 펩타이드를 아미노산 서열기 [Model 477A/120A, Applied Biosystems Inc.로부터 입수가능]를 사용하여 N-말단 서열에 대한 통상적 분석을 실시하였지만, 서열을 측정할 수 없었다. 단백질의 N-말단이 차단된 것으로 추정된다. 따라서, 활성 펩타이드를 분획화하여 이의 부분적인 아미노산 서열의 측정을 수행한다. 약 1nM의 활성 피크 단백질(아미노산 분석에 의해 측정)을 스피드백 농축기(SAVANT Inc.로부터 입수가능)에 의해 건조시키고, 6M 구아니딘·HCl, 0.2M 트리스-HCl 및 2mM EDTA(pH 8.0) 용액 200μl중에 용해시킨다. 그런 다음, 디티오트레이톨(Nakarai Tesuku K.K.로부터 입수가능) 20 나노몰을 가해 반응을 37℃에서 1.5시간 동안 진행시킨다. 반응 혼합물에 4-비닐피리딘 (Aldrich Chemical Co., Inc.로부터 입수가능) 100 나노몰을 가하고 반응을 37℃에서 1.5시간 동안 추가로 진행시킨다. 반응 혼합물을, 0.1% TFA를 함유하는 물로 평형시킨 코스모실 5C18-300컬럼(직경 4.6mm x 길이 250mm, Nakarai Tesuku K.K.로부터 입수가능) 상에서 전개시키고, 컬럼을 0.1% TFA를 함유하는 물로 완전히 세척한다. 그런 다음, 흡착된 펩타이드 또는 단백질을 0.1% TFA를 함유하는 0내지 80% 아세토니트릴 선형 구배로 용출시킨다. 용출액을 214nm에서 흡광도를 모니터하여 매 피크를 수집하여, 피리딘에틸화 단백질을 수득한다.
이와 같이 수득된 단백질을 스피드백 농축기에 의해 건조시키고, 2OmM 트리스-HCl 완충액, 0.1M NaCl(pH 8.5) 500μl 중에 용해시킨다. 20mn 트리스 완충액, 0.1M NaCl (pH 8.5)에 용해된 리실엔도펩티다제(아크로모박터 프로테아제 1(EC 3.4.21.50), Wako Pure Chemical Industries, Ltd.로부터 입수 가능)를 효소 /기질(몰 비)이 1/200이 되도록 이에 가한다. 반응을 30℃에서 16시간 동안 진행시켜 분해반응이 수행되도록 한다. 수득된 펩타이드를 함유하는 용액을 코스모실 5C18-300컬럼(직경4.6mm x 길이250mm, Nakarai Tesuku K.K.로부터 입수가능)으로 분리시켜 매 피크에서 분획을 수집한다. 이와 같이 수득된 2가지 분획의 아미노산 서열을 아미노산 서열기 모델 477A/120A를 사용하여 측정한다.
생성된 아미노산 서열을 단백질 데이타베이스를 근거로 어떠한 동일한 것이 있을 수 있는지의 여부에 대해 조사하여, 이것이 소 PF4임을 확인한다[참조: Ciaglowski, R.E., et al., loc, cit.]. 수득된 아미노산 서열을 서열 목록중 서열확인 번호 1로 나타낸다.
2)전기영동에 의한 분석
제 1도에 나타낸 바와 같은 피크 1 펩타이드의 분자량을 환원 조건하에 SDS 전기영동으로 확인하면 약 11,000 내지 14,000의 겉보기 분자량을 나타낸다. 이 분자량은 소 PF4에 대해 보고된 분자량과 일치한다[참조: Ciaglowski, R.E., et al., loc. cit.].
실시예 4
사람 PF4의 ALPase 촉진 활성의 측정
사람 PF4(Calbiochem Inc.에서 입수가능)를 사용을 위해 정제한다. 이것을 0.1% TFA를 함유하는 물로 평형시킨 코스모실 5C18-300컬럼(직경 4.6mm x 길이 250mm, Nakarai Tesuku K,K.로부터 입수가능) 상에서 전개시키고, 컬럼을 0.1% TFA를 함유하는 물로 완전히 세척한다. 그런 다음, 흡착된 펩타이드 또는 단백질을 0.1% TFA를 함유하는 0 내지 80% 아세토니트릴 선형 구배로 용출시킨다. 용출액을 214nm에서 흡광도를 모니터하여 매 피크의 분획을 수집한다. 용출 패턴을 제 2도에 나타낸다. ROS 17/2.8 세포에서의 이들 분획의 ALPase 촉진 활성 효능을 실시예 2에 기술된 것과 동일한 방식으로 측정하여 활성분획으로서 피크 1을 측정한다. 피크 1의 ROS 17/2.8 세포에서의 ALPase 촉진 활성 효능을 측정하여 수득한 결과를표 2에 나타낸다. 사람 PF4의 아미노산 서열을 서열 확인번호 2에 나타낸다.
[서열 목록]
서열 화인 번호: 1
서열의 길이: 88개 아미노산
서열의 타입: 아미노산
토폴로지 : 선형
분자의 타입: 펩타이드
단편의 타입:
기원:
생물명: 소, 보스 타울루스(Bos taulus)
계통: 혈청
서열의 특징:
존재 위치 :
기타 정보: 첫번째 Xaa는 Pyro-Gln 또는 Glu를, 20번째 Xaa는 AsP 또는 Ser를, 49번째 Xaa는 Thr 또는 Leu를, 57번째 Xaa는 Leu 또는 Ile를 및 72번째 Xaa는 Arg 또는 Asn을 나타낸다.
서열 확인 번호: 2
서열의 길이: 70개 아미노산
서열의 타입: 아미노산
토폴로지 : 선형
분자의 타입: 펩타이드
단편의 타입:
기원:
생물명: 사람, 호모 사피엔스(Homo sapiens)
계통: 혈청
제 1도는 헤파린 친화 크로마토그래피에 결합되어 용출된 분획을 역상 HPLC로 추가로 전개시킨 패턴을 나타내며, 이때 화살표는 소 PF4를 함유하는 활성 분획(피크 1)을 나타낸다.
제 2도는 부분 정제된 사람 PF4가 역상 HPLC로 전개되는 패턴을 나타내며, 이때 화살표는 사람 PF4를 함유하는 활성 분획 (피크 1)을 나타낸다.
Claims (3)
- 유효량의 혈소판 인자 4가 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 혼합되어 포항된, 골절 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 혈소판 인자 4가 사람 혈소판 인자 4인 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 혈소판 인자 4가 소 혈소판 인자 4인 약제학적 조성물.
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