KR100313381B1

KR100313381B1 - 암퇘지용사료에사용하기위한첨가제및이를첨가한암퇘지용사료

Info

Publication number: KR100313381B1
Application number: KR1019940025281A
Authority: KR
Inventors: 오니시노리마사; 도리데야스히코; 우에하라아키노리; 고쿠에에이이치
Original assignee: 에가시라 구니오; 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1993-10-05
Filing date: 1994-10-04
Publication date: 2001-12-28
Also published as: CN1066317C; CA2133610C; EP0646322B1; KR950010769A; AU683911B2; DK0646322T3; DE69434973T2; DE69434973D1; US5814333A; ES2285698T3; CA2133610A1; EP0646322A1; US5728398A; AU7307894A; CN1105820A; TW264374B

Abstract

본 발명은 암퇘지의 출산율을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 7,8-디하이드로폴산, 류코보린, 간제제 분말, 미생물의 파열 세포 또는 세포 추출물 등의 형태인 환원된 형태의 폴산을 활성 성분으로서 함유하는 암퇘지 사료용 첨가제, 이러한 첨가제가 첨가된 암퇘지용 사료 및 당해 첨가제를 암퇘지에게 경구 투여하거나 당해 사료를 공급하여 암퇘지를 사육하는 방법을 제공한다.

Description

[발명의 명칭]

암퇘지용 사료에 사용하기 위한 첨가제 및 이를 첨가한 암퇘지용 사료

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 암퇘지의 혈장에서 환원된 형태의 폴산의 양을 증가시키고, 그 결과 암퇘지의 출산율을 향상시키는 작용을 하는 환원된 형태의 폴산을 활성 성분으로서 함유하는, 암퇘지용 사료에 사용하기 위한 첨가제 및 이러한 사료용 첨가제를 첨가한 암퇘지용 사료에 관한 것이다.

폴산은 메티오닌, 세린 및 글루탐산과 같은 아미노산 및 DNA를 구성하는 핵산의 푸린 염기의 합성에 관여하는 조효소이다. 이는 임산부의 역학 검사 및 임신 중인 기니아 피그에 대한 시험을 통해 임신중인 모체에서는 폴산에 대한 수요가 증가하고 혈장중의 폴산과 농도는 감소함을 확인할 수 있다[참조: Pritchard J. A. et al.. Am. J. Obst. Gynecol.. Vol. 104. p. 388 (1969) and Habibzadeh H. C. et al.. Br. J. Nutr.. Vol. 55. p.23 (1986)].

또한, 돼지와 같은 가축에 대하여 암퇘지의 혈장중의 환원된 형태의 폴산의 양이 임신중에는 감소됨이 확인된다[참조: Natsuhori et al.. Final Program and Abstracts Book of 10th International Symposium: "Chemistry and Biology of Pteridines and Flates". p.196 (1993)]. 또한, 임신중인 돼지에 폴산(산화 형태)을 근육내 주사로 투여하여 출산율을 향상시킬 수 있음이 입증되었고[참조: Matte J. J. et al.. J. Anim. Sci.. Vol. 67 P. 426 (1989) and Friendship R. M. et al.. Can Vet. J.. Vol. 32. p.564 (1991)]. 이는 임신중인 돼지(암퇘지)에 폴산을 투여하는 것의 중요성을 나타낸다.

그러나, 근육내 주사로는 암퇘지에 폴산을 투여하기가 실제적으로 번거로우므로 폴산을 사료에 첨가하여 투여(경구 투여)하는 경우 출산율을 향상시키는 것이 매우 바람직하다. 경구 투여를 기본으로 하여 출산율을 향상시키기 위한 수많은 연구가 이미 계속되어 왔다. 그러나, 일부에서는 투여가 효과적이라고 간주하는 반면[참조: Thaler R. C. et al.. J. Anim. Sci.. Vol. 67. p. 3. 360 (1989). Lindemann M. D. et al.. J. Anim. Sci.. Vol. 67. p. 459 (1989) and Lindemann M. D. et al.. J. Anim. Sci.. Vol. 71. p. 239 (1991)]. 또다른 일부에서는 이의 효과에 대해 회의적이다[참조: Easter R. A. et al.. Nutrition Reports International. Vol. 28. p. 945 (1983) and Matte J. J. et al.. Livestock Production Science. Vol. 33. p. 131 (1992)]. 산화된 형태의 폴산의 경구투여의 효과에 관해서는 명백한 학설이 존재하지 않는다.

일반적으로 폴산은 화학적으로 합성한다. 화학적으로 합성된 폴산은 산화된 형태이고, 산화된 형태의 폴산 자체는 조효소로서 작용하지 않는다. 통상적으로는 폴산은 체내로 흡수된 후, 디하이드로폴산 탈수소 효소에 의해 7,8-디하이드로폴산으로 전환된 후, 테트라하이드로폴산(THF) 또는 5-메틸테트라하이드로폴산(5MF)과 같은 환원된 형태의 폴산으로 효소적으로 환원되어 조효소로서 작용을 한다. 따라서, 혈장중의 THF 또는 5MF의 양을 측정함으로써 폴산 투여 효과를 판정할 수 있다. 그러나. 이는 방사성리간드(radioligand) 기술을 기초로 하므로 선행의 측정 법에 의한 선택적인 방법으로 환원된 형태의 폴산만을 측정할 수는 없으며, 따라서 혈장중에 함유되어 있는 환원된 형태의 폴산의 정확한 값을 얻을 수 없다. 본원에 서 환원된 형태의 폴산은 이들이 생리학적으로 활성을 나타내므로 "활성 형태의 폴산"으로 언급될 수 있고, 산화된 형태의 폴산은 이들이 생리학적 활성을 나타내지 않으므로 "불활성 형태의 폴산"으로 언급될 수 있다.

돼지에 폴산을 투여하는 경우의 효과를 분석하기 위해, 전기 화학적 탐지기를 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 혈장중의 활성 형태의 폴산 함유량을 측정하기 위한 HPLC-ECD 방법이 최근 개발되었으며, 이러한 방법을 사용하여 돼지에 폴산을 정맥 주사, 근육내 주사 또는 경구 투여하는 경우에 혈장중의 THF 및 5MF의 생성 정도를 조사할 수 있다. 보다 구체적으로는 체중이 대략 25㎏인 4마리의 돼지에 4가지 인자에 따른 라틴 평방법(Latin square method)에 따라 분배시켜(즉, 폴산(산화된 형태)의 정맥 주사(1㎎/체중 1㎏), 근육내 주사(1㎎/체중 1㎏), 소량 경구투여(1㎎/체중 1㎏) 및 다량 경구투여(50㎎/체중 1㎏) 시험을 수행한다. 이의 결과 혈장중의 THF 및 5MF의 농도는 정맥 주사, 근육내 주사 및 다량의 경구 투여의 경우에 증가한다. 따라서 투여된 폴산(산화된 형태)이 간 등에서 흡수되어 활성 형태의 폴산으로 전환된 것으로 간주된다. 반면, THF 및 5MF는 소량 경구투여한 그룹에서는 혈장중 나타나지 않았다[참조: Eiichi Kokue et al.. "Abstract Book of the 113th Convention of Japan Veterinary Society." p. 112 (1992.]. 래트에 있어서는 산화된 형태의 폴산을 소량 투여하는 경우에도, 환원된 형태의 폴산이 빠르게 증가하는 것으로 공지되어 있다[참조: Tsunematu K. et al. Cong. Anom.. Vol. 30. p. 113 (1990)]

위의 사실로부터 돼지는 불활성 형태의 폴산을 활성 형태의 폴산으로 전환시킬 수 있으나 소화관으로부터 불활성 형태의 폴산을 흡수하는 능력은 래트보다 훨씬 떨어지는 것으로 판단된다. 또한, 불활성 형태의 폴산의 경구 투여에 의해 혈액 혈장중의 활성 형태의 폴산의 농도를 증가시키기 위해서 다량의 불활성 형태의 폴산을 극히 다량으로 돼지에 투여해야만 하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 상기의 선행기술의 관점에서 수행된다. 본 발명의 목적은 혈장중의 환원성 형태의 폴산의 농도를 증가시키고 결과적으로 출산율을 향상시킬 수 있는 암퇘지용 사료에 사용하기 위한 첨가제를 제공하고, 이 첨가제를 첨가한 출산율 향상을 위한 암퇘지용 사료를 제공하는 것이다.

상기 문제를 해결하기 위하여 집중적인 연구를 수행하였다. 이의 결과, 본 발명자들은 사료에 환원된 형태의 폴산을 첨가하고, 이를 암퇘지에 경구 투여하여 돼지의 혈장중의 환원된 형태의 폴산의 농도를 증가시킬 수 있음을 밝혀냈고 이로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 환원된 형태의 폴산의 경구 투여를 통해 암퇘지의 출산율을 향상시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 하기에서 보다 구체적으로 설명될 것이다.

먼저, 본 발명은 환원된 형태의 폴산을 출산율 향상을 위한 활성 성분으로서 함유함을 특징으로 하는 암퇘지용 사료에 사용하기 위한 첨가제에 관한 것이다.

잘 알려진 바대로 암퇘지의 자궁에서 수태를 통해 통상적으로는 여러 마리의태아(다수의 태아)를 생산한다. 그러나, 수태된 여러 마리의 태아 전부를 항상 안전하게 분만하는 것은 아니다. 물론, 돼지의 출산을 다루는 관점에서는 1회의 출산으로 여러 마리의 태아 전부를 안전하게 분만시키는 것이 매우 바람직하다. 본 발명에서 "암퇘지의 출산율 향상"이란 본 발명에 따른 사료 첨가제를 암퇘지에 경구 투여하거나 암퇘지에게 본 발명에 따른 사료를 공급하는 경우 그렇지 않은 경우에 비하여 안전하게 분만된 태아 대 수태된 총 태아의 비율이 증가함을 의미한다.

본 발명에서, '환원된 형태의 폴산'이란 협의의 환원된 형태의 폴산(예: 프테로일(모노)글루탐산)뿐만 아니라 환원된 형태의 기타 다양한 폴산(광의의 폴산)을 의미한다. 환원된 형태의 폴산의 정의에는 협의의 환원된 형태의 폴산과 유사한 생리학적 작용을 나타내는 상기의 환원된 형태의 폴산을 포함하는 것으로 새겨야 한다.

따라서, 본 발명에서 환원된 형태의 폴산은 폴산의 프테리딘 환을 환원시킨 7,8-디하이드로폴산(H₂폴산): H₄폴산[예: 5,6,7,8-테트라하이드로폴산(H₄폴산):5-포밀-H₄-폴산 즉, 류코보린[L-(-)-5-포밀-5,6,7,8-테트라하이드로 폴산], 5,10-메틸렌H₄-폴산, 5-메틸-H₄-폴산, 10-포밀-H₄-폴산, 5-메틸-H₄-폴산, 5-포름이미노-H₄-폴산등]: 및 이들의 유도체, 예를 들어 H₄폴산 각각의 폴리-r-글루탐산 유도체(간장내의 저장 형태의 폴산)을 포함한다. 또한, 본 발명의 환원된 형태의 폴산은 간분말 형태로 및 환원된 폴산을 함유하는 미생물의 파열 세포 또는 세포 추출물 형태로 존재할 수 있음은 당연한다.

그런데, 간은 여러 가지 비타민 대사를 수행하는 기관이며 비교적 고함량의 활성 형태의 폴산을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 예를 들어 돼지 또는 암소의 간을 동결 건조 및 분쇄하여 제조한 간 분말을 암퇘지에 경구 투여하여 출산율을 향상시키는 것에 대하여는 공지된 바가 없다. 사료에 간 분말을 혼입하여 돼지의 혈장중의 THF 및 5MF의 농도를 증가시킨다는 사실을 본 발명자들이 얻어낸 신규한 사항이다.

미생물의 파열 세포 또는 세포 추출물에 관해 언급하자면, 사료용 비타민 공급원으로서 토룰라 효모와 같은 효모를 사용하였다. 그러나, 이들 세포내에 함유된 비타민은 통상적으로 세포벽의 파괴없이 사용되므로 이들 세포내에 함유된 비타민은 단지 미량만이 흡수된다.

이러한, 관점에서, 본 발명자들은 집중적인 조사를 실시하여 환원 형태의 폴산을 쉽게 흡수되는 상태로 만들기 위해, 미생물의 파열 세포 또는 세포 추출물, 즉, 미생물의 세포를 기계적으로 파괴 처리, 효소적 분해처리 또는 자가분해등으로 처리하여 제조한 생성물을 경구 투여하여 돼지의 혈장중의 THF 및 5MF의 양을 증가시킬 수 있음을 밝혀냈다. 따라서 당해 생성물을 임신중인 암퇘지에 투여하여 출산율을 향상시킬 수 있다.

생성물(기계적으로 파열시킨 세포 또는 효소적으로 파열된 세포)이 고함량의 환원된 형태의 폴산을 함유하는 경우 파열 세포 또는 세포 추출물을 제조하기 위한 원료 물질로서 어떠한 미생물도 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 코리네박테리움글루타미쿰(구명칭: 브레비박테리움 락토페르멘튬)(ATCC 13,869, etc.), 코리네박테리움 암노니아겐(구명칭: 브레비박테리움 암노니아겐)(ATCC 6,871, etc.), 브레비박테리움 플라붐(ATCC 13, 826, etc.), 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC 13,032, ATCC 13,060, etc.), 바실루스 서브틸리스(ATCC 13,952, IFO 3,009, IFO 13,169, etc.), 락토콕쿠스 락티스 아종 크레모리스(ATCC 19,257, etc.) 등과 같은 박테리아: 사카로마이세스 세레비시아에(IFO 2,044, IFO 2,375, etc.). 칸디다 유틸리스(구명칭: 토롤롭시스 유티리스)(ATCC 9,226, etc.) 등과 같은 효모: 아스퍼길러스 오리자에(IFO 30,104, etc.). 아스퍼길러스 나이거(IFO 4,414, etc.) 등과 같은 진균류를 포함한다.

미생물에 의해 동화될 수 있는 영양소가 배지에 함유되는 한, 미생물을 배양하는데 어떠한 배양 배지도 사용될 수 있다. 예를 들면, 탄소 공급원(예: 글루코스, 슈크로즈등과 같은 탄수화물, 에탄올, 클리세롤등과 같은 알콜, 아세트산, 프로피온산등과 같은 유기산, 대두유 및 이들의 혼합물): 질소 함유 유기 또는 무기영양소(예: 효모 추출물, 펩톤, 고기 추출물, 옥수수 침지액, 황산암모늄, 암모니아등): 무기영양소(예: 인산염, 마그네슘, 철, 망간, 칼륨등): 비타민(예: 비오틴, 타아민 등)이 적절하게 첨가된 통상적인 배지를 사용할 수 있다.

배양에 있어서, 당해 미생물의 배양에 통상적으로 사용되는 조건이 전혀 변형되지 않고 사용될 수 있다. 예를 들면, 미생물은 영양 배지에서 20 내지 40℃와 pH 4.0 내지 9.5에서 20시간 내지 5일 동안 배양될 수 있다.

배양에 의해 수득되는 미생물의 세포 속에서 생성되는 환원된 형태의 폴산의 양은 p-아미노벤조산, 산화된 형태의 폴산 및/또는 핵산을 배양 배지에 가함으로써 증가될 수 있다. 사용되는 핵산은 구아노신, 이노신, 크산틴, 5`-구아닐산, 5`-이노신산, 5`-크산틸산, 구아노신-5`-디포스페이트 및 구아노신-5`-트리포스페이트를 함유한다. 이러한 첨가제들은 세포에서 생성되는 환원된 형태의 폴산 양이 첨가제를 가하지 않은 경우와 비교하여 증가될 수 있는 양으로, 예를 들면, 1㎎/ℓ내지 1g/ℓ, 바람직하게는 10내지 100㎎/ℓ의 양으로 첨가될 수 있다. 첨가량이 너무 적은 경우, 효과를 수득할 수 없는 반면, 너무 많은 경우, 미생물의 성장을 억제할 수 있다.

따라서, 배양에 의해 수득되는 세포를 적합한 방법으로 배양액으로부터 분리시킨 후 파괴 또는 추출 처리한다. 그러나, 배양 배지의 성분이 암퇘지에 경구 투여될 수 있고, 파괴 처리의 수행에 영향을 끼치지 않는 경우, 배양물은 바로 또는 농축 후 파괴 또는 추출 처리될 수 있다. 더욱이, 파괴 또는 추출 처리되는 세포는 생 세포 또는 사멸 세포일 수 있다.

세포의 파괴 방법에 대해 특별한 제한은 없다. 예를 들면, 파괴는 지금까지 공지된 기계적인 방법 뿐만 아니라 효소를 활용하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 문헌에 공지된 기계적 방법은 전술한 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 미생물의 세포는 "비드 비터(bead beater)" [제조원: Biospec Co.]를 사용하여 유리비드로 파괴될 수 있거나, 세포의 파괴는 압력에 의해 수행될 수 있거나 초음파 파괴기를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 미생물의 세포가 효소에 의해 파괴되는 경우, 방법 자체는 선행 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 배양 세포를 그대로 가열 살균처리한 후, 세포벽 분해 효소를 이에 가하여, 미생물의 세포벽을 분해시킨다. 이러한 분해를 위해, 세포벽을 분해시키거나 파괴시킬 수 있는 한 어떠한 효소도 사용할 수 있다. 리소자임, 프로테아제, 지몰리아제 등과 같은 익히 공지된 효소는 이러한 수행력을 지닌 효소의 전형적인 예이다. 효소의 처리는 공지된 조건에 따라 수행할 수 있다.

또한, 세포의 추출 방법에는 특별한 제한이 없다. 예를 들면, 추출은 세포의 자가분해 또는 온도범위 90 내지 120℃의 뜨거운 물속에서 세포의 가열에 의해 수행될 수 있다.

이렇게 제조되는 파열 세포 또는 세포 추출물은 그대로, 또는 적합하게 농축 되거나 건조된 형태로, 또는 적합한 첨가제를 첨가한 혼합물의 형태로 경구 투여될 수 있다. 대부분의 폴산은 세포벽에 존재하지 않기 때문에, 파열 세포로부터 남아있는 세포벽의 단편을 제거할 수 있다. 가능한 경구투여 형태중에서, 파열 세포 또는 세포 추출물이 사료에 첨가되어 암퇘지가 이러한 사료로 급식되는 형태가 포함됨은 물론이다.

또한, 각종 환원된 형태의 폴산이 개별적으로 사용되거나 2개 이상의 형태가 배합물로 사용될 수 있음은 당연하다.

사용 편이성을 고려하여, 본 발명에 따른 암퇘지용 사료를 적합한 담체등의 첨가 또는 부재하에 농축물, 무수 분말, 과립등을 포함하는 적합한 투여 형태로 분배시킬 수 있다.

둘째로, 본 발명은 본 발명의 암퇘지용 사료 첨가제가 부가되어짐을 특징으로 하는 암퇘지용 사료에 관한 것이다.

이러한 암퇘지용 사료를 제조함에 있어서 특별한 어려움은 없다. 본 발명에 따른 사료 첨가제를 가하는 점을 제외하곤 조제 사료의 제조에 대해 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

이어서, 본 발명의 암퇘지용 사료 첨가제의 첨가에 관하여 고려해야할 점에 대해 설명할 것이다. 그것은 첨가할 양에 관한 것이다. 본 발명의 암퇘지용 사료 첨가제는 첨가 효과가 나타나는 양으로 가할 수 있다. 예를 들면, 암퇘지의 체중 1㎏당 환원된 형태의 폴산을 0.1 내지 100㎍/일을 섭취하는 양으로 가한다. 첨가한 양이 너무 적은 경우, 효과를 수득할 수 없다. 첨가 효과는 심지어 전술한 범위보다 더 많은 양을 가하는 경우에는 증가하지 않으므로 쓸모없을 수 있다.

셋째로, 본 발명은 본 발명에 따른 암퇘지용 사료 첨가제를 암퇘지에 경구 투여하거나, 암퇘지에 본 발명에 따른 사료를 공급함을 특징으로 하여 암퇘지의 출산율을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

출산율을 향상시키는 방법에 있어서, 특별한 어려움은 없다. 섭취되는 환원된 형태의 폴산의 양이 암퇘지의 체중 1㎏당 0.1 내지 100㎍인점을 제외하곤 사육시의 모든 조건은 지금까지 공지된 선행 방법에 따라 사용될 수 있다.

본 발명의 출산 방법에 있어서, 경구 투여 또는 섭식 기간은 다음과 같다. 환원된 형태의 폴산을 투여하는 목적은 암퇘지의 태내에 수태된 여러 마리의 태아를 가능한한 많이, 바람직하게는 수태된 태아 전부를 안전하게 출산시키는 것이므로 교배(수정)시키기 2달전부터 교배 직후에 이르는 시기에 환원된 형태의 폴산의 경구 투여를 시작하여 다수 태아의 안전한 출산 단계로의 성숙이 확인될때까지(예를 들어, 교배후 2개월) 또는 안전하게 분만할때까지 계속 투여한다.

[실시예]

본 발명은 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.

[실시예 1]

(류코보린 투여 효과)

한배 태생의 두 마리 게팅켄 미니 피그(체중 15㎏의 0.7년생 돼지, 시험용 한 마리와 대조용 한 마리)를 사용하여 본 시험을 수행한다.

류코보린(제조원: Sigma Co.) 0.75% 수 현탁액을 전날 굶긴 시험 동물에 체중 1㎏당 50㎎의 양으로 경구로 강제 투여(가는 유연한 튜브를 통해 장내로 직접 주사)한다. 대조를 위해 류코보린 대신에 폴산(산화된 형태, 제조원: Kongo Kagaku Co.)을 사용함을 제외하고 정확히 동일한 방법으로 강제 투여한다.

시험 물질의 투여 후 1,3,6,9 및 24시간째에 혈액 샘플을 수거하고, 2종류의 활성 형태의 폴산, 즉 돼지의 혈장중에 함유되어 있는 테트라하이드로폴산(THF) 및 5-메틸테트라하이드로폴산(5MF)를 정량적으로 분석한다. 대조용으로서 실험 물질의 투여 직전에 혈액을 수거하여 이 혈액에 대해서도 동일한 정량적 분석을 행한다.(대조용)

정량 분석의 구체적인 방법은 다음과 같다: 수거한 혈액 샘플 0.2㎖에 0.5M 과염소산 0.2㎖를 가하고 생성 혼합물을 5,000g x 2min으로 원심 분리를 수행하여 단백질을 제거시킨다. 수득된 상등액 100㎕를 고성능 액체 크로마토그래피시킨다. "페닐 결합상 4.6㎜x 150㎜"의 칼럼(제조원: Irica Co.)을 사용하여 분석한다. 이동상에 있어서, 20mM 아세트산칼륨 완충액(pH 3.6) 및 아세토니트릴 97.5:2.5(v/v)의 혼합물을 사용하고 유속은 0.8㎖/min으로 한다. 탐지를 위해 "전기화학적 탐지기 타입 E-502"(제조원: Irica Co.)를 사용하고 -300mV의 전압에서 측정을 수행한다.

측정 결과를 다음 표 1에 나타내었다.

[표 1]

*: 단위: ng/ml

표 1을 통해 명백히 알 수 있는 바와 같이, 혈장내에서는 THF의 농도는 류코보린을 투여한 즉시 증가되고, 그 다음 5MF의 농도가 증가된다. 유기체의 대사작용시 류코보린이 THF로 변화한 다음 5MF로 변화한다는 사실이 공지되어 있기 때문에 혈액내에서의 두가지 활성 형태의 폴산의 거동 특성은 잘 이해될 수 있다. 혈장내에서의 THF의 농도가 1시간내에 증가한다는 사실은 류코보린의 체내 흡수가 상당히 완만하게 이루어짐을 나타낸다. 한편, 대조용으로 수행된 폴산(불활성 형태)의 경구 투여서, 혈장내에서의 폴산 수준의 변화는 관찰되지 않는다.

[실시예 2]

(7,8-디하이드로폴산의 투여 효과)

한배 태생의 두 마리의 게팅겐 미니 피그(체중이 약 20㎏인 2년생 돼지)를 이용하여 시험을 수행한다.

0.2% 아스코르브산나트륨 용액내에서의 7,8-디하이드로폴산[제조원: Sigma Co.]을 24시간 동안 굶긴 시험 동물에 체중 ㎏당 1 또는 0.2㎎의 양으로 경구 투여 한다. 투여후 혈액 샘플을 수거하고, 혈장내에 함유된 활성 형태의 폴산을 실시예1에서와 동일한 방법으로 정량 분석한다.

두 마리 돼지의 혈장내에서의 THF와 5MF의 농도 변화를 다음 표 2에 나타내었다.

[표 2]

*: 단위: ng/ml

표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 두가지 양의 7,8-디하이드로폴산을 투여하면 THF 농도는 상당히 증가하는 반면 5MF 농도는 다소 감소한다.

[실시예 3]

(간 분말의 투여효과)

돼지 간 분말의 50% 수성 현탁액을 류코보린의 수성 현탁액 대신 간 분말로서 5g의 양(총 0.08㎎의 양으로 산화된 형태 및 환원된 형태의 폴산을 함유)으로 강제-공급하는 것을 제외하고는 시험 동물을 포함하여 실시예 1에서와 정확하게 동일한 방법으로 시험을 반복 수행한다.

결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

*: 단위: ng/ml

표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 간 분말 시험에 있어서, THF 농도는 실속하게 증가하고 5MF 농도도 또한 증가한다. 이는 다량의 5MF가 간 분말내에 함유되어 있기 때문인 것으로 추정된다. 한편, 비교용 그룹에 있어, 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, 혈장내에서의 5MF와 THF의 농도의 증가는 관찰되지 않는다. 간분말 5g내의 폴산의 함량이 0.08g(불활성 형태의 폴산 포함)이라는 사실을 고려하면, 폴산의 체내 흡수가 극도로 양호함을 이해할 수 있을 것이다.

[실시예 4]

(미생물의 파열 세표 제조)

(a) 미생물의 배양

500㎖ 용량의 플라스크에, 아래에 제시된 표 4에 나타낸 조성의 배양 배지 50㎖를 각각 붓는다. 가열에 의해 살균시킨 후, 표 5에 나타낸 각각의 미생물(사용된 박테리아는 먼저 육즙 아가 배지에서 30℃이하에 24시간 동안 배양시켰고, 사용된 효모와 사상균은 먼저 맥아 추출물 아가 배지에서 30℃하에 48 내지 72시간 동안 예비 배양시켰다)의 세포중 하나의 백금이량을 배지에 접종시키고 30℃에서 24내지 78시간 동안 진탕시킴으로써 배양시킨다. 배양시킨 후, 세포를 원심분리에 의해 수집한다.

[표 4]

[표 5]

(b) 미생물의 파열 세포의 제조

이렇게 수거한 미생물을 배양 배지와 동일한 용적의 생리적 식염수로 현탁시킨 다음, 100℃에서 10분 동안 열처리(살균화)한 다음, 원심분리에 의해 세포를 재 수집한다. 세포를 10중량%(습윤 상태)의 농도로 25mM 인산염 완충액(pH 7.0)중으로 현탁시킨다.

박테리아에 대해서는, 난백 리소자임(제조원: Sigma Co.) 0.1중량%와 파파인(제조원: Amano Pharmaceutical Co.) 0.2중량%를 이렇게 제조된 세포 현탁액에 가하고, 혼합물은 37℃에서 12시간 동안 유지시킴으로써 세포벽을 분해 및 파열시켜 파열 세포액을 수득한다. 효모에 대해서는, 효모 세포벽 분해 효소인 "지몰리아제 20T(Zymolyase 20T) "(제조원: Seikagaku Kogyo K. K.) 0.2중량%를 가하고, 혼합물을 37℃에서 12시간 동안 유지시킴으로써 세포벽을 분해 및 파열시켜 파열 세포액을 수득한다. 사상균에 대해서는, 세포 현탁액을 동량(용적)의 0.75㎜의 유리 비이드와 함께 가하고, 비이드 비이터(Beads Beater) (제조원: Biospec Co.)를 사용하여 1분의 세포 파열 처리를 5회 수행한 다음, 경사 분리시켜 유리 비이드를 제거함으로써 상등액을 수득한다.

이렇게 수득된 파열 세포액과 박테리아, 효모 및 사상균의 상등액 각각을 동결건조에 의해 건조시켜 분말(본 발명에 다른 암퇘지 사료용 첨가제의 파열 형태중 하나)을 수득한다.

(C) 폴산의 함량 측정

이렇게 수득된 건조 분말 100g당 함유된 폴산의 양을 엔테로코쿠스 히라에(Enterococcus hirae) ATCC 8043을 사용하여 생물검정에 의해 측정한다. 수득된 결과를 또한 표 5에 나타낸다. 이러한 생물검정에 있어서, 활성 형태의 폴산(환원형태)과 분활성 형태의 폴산(산화 형태)을 둘다 그 총량을 동시에 측정한다. 그러나, 건조 분말내에 함유된 폴산이 미생물로부터 유도된 것이기 때문에 이렇게 수득한 측정값은 대체로 활성 형태를 기본으로 하는 것으로 간주될 수 있다.

[실시예 5]

(미생물의 기계적으로 파열된 세포제조)

실시예 3에서와 동일한 방법으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869와 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13060을 배양시키고, 이들 세포를 수거한 다음 20mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 10중량%의 양으로 현탁시켜 세포 현탁액을 제조한다.

세포 현탁액을 동량의 0.1㎜의 유리 비이드와 혼합하고, 세포를 "비이드 비이터"를 사용하여 1분동안 파열 처리를 10회 반복 수행함으로써 완전히 분열시킨다. 그 다음, 생성물을 원심 분리시켜, 세포진 분획을 원심분리 상등액으로, 그리고 세포벽 분획을 원심분리 잔사로 분리한다.

각각의 분획을 동결건조에 의해 건조시키고, 무수 생성물 100g 내에 존재하는 폴산의 양을 실시예 4에서와 같이 생물검정 수단에 의해 측정한다. 결과를 표 6에 나타내었다.

[표 6]

표 6으로 부터, 폴산이 세포질 분획내에 존재함을 이해할 수 있을 것이다.

[실시예 6]

(폴산 전구체의 첨가에 의한 배양)

실시예 4와 유사한 방법으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13060을 사용하여 세포를 효소 처리하여 분해된 세포 생성물(과열 생성물)을 제조한다.

위에서 사용된 세포는 P-아미노벤조산 100㎎/ℓ, 폴산(산화 형태) 10㎎/ℓ 또는 구아노신 100㎎/ℓ를 가하면서 상기 박테리아를 배양시킴으로써 수득된다.

무수 분말 100g에 함유된 폴산의 함량은 표 7에 제시되어 있다.

[표 7]

[실시예 7]

(미생물의 파열 세포의 투여 효과)

실시예 4에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰의 효소 분해 생성물(1), 실시예 4에서 제조한 사카로마이세스 세레비지아에 IFO 2044의 효소 분해 생성물(2) 및 코리네박테리움 클루타미쿰 ATCC 13869의 효소 분해 생성물(배지에 P-아미노벤조산을 가하여 배양시킨 세포)(3)의 투여 효과는 실시예 1과 유사한 방법으로 시험한다.

시험 동물로서 한배 태생의 4마리의 게팅겐 미니 피그(1년생: 체중 3㎏)를 사용한다. 효소 분해 생성물은 무수 생성물로서 체중 1㎏당 50㎎의 양으로 사용된다. 비교를 위해, 체중 1㎏당 불활성 형태의 폴산[제조원: Kongo Kagaku K. K. ] 50㎎을 사용하여 동일한 시험을 수행한다(비교용).

수득된 결과가 하기의 표 8에 제시되어 있다.

[표 8]

표에서, THF 및 5MF의 양은 ng/ml로 나타내었다.

표 8로부터 하기의 사항을 알 수 있다. 혈장중 THF 값의 증가는 대조용(투여전)의 경우와 비교하여 효소 분해 생성물(1), (2) 및 (3)의 각각의 경우에서 관찰된다. (1) 및 (2)의 경우, THF의 농도는 투여후 신속히 증가된다. (2)의 경우, THF 농도의 증가 속도는 (1) 및 (2)에 비하여 느리다. THF 농도의 증가 정도에 있어서는 (3)이 (1)의 경우보다 크므로 보다 효과적이다. 불활성 형태의 폴산(비교용)은 혈장중 THF 및 5MF 농도에 있어서의 증가 효과를 나타내지 않는다.

[실시예 8]

(필드(field) 시험)

LW종(랜드레이스(Landrace)종과 커다란 요크셔종을 이종 교배하여 형성한 잡종)의 암퇘지(연령: 1.5 내지 4세: 체중 150 내지 200㎏) 60마리(40마리는 시험용 이고, 20마리는 비교용이다)를 사용한다. 실시예 4에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 파열 세포(효소 분해 세포의 무수 생성물) 및 실시예 5에서 제조한 동일한 균주의 파열 세포(원형질 분획의 무수 생성물)를 활성 형태의 폴산함유 생성물로서 사용한다.

교배하기 2달전을 시작으로, 20마리의 암퇘지에 실시예 4에서 제조한 폴산함유 파열 생성물을 하루에 암퇘지당 300㎎의 양으로 첨가한 사료를 계속해서 공급한다. 교배한지 60일 후, 혈장중의 THF 및 5MF의 함량을 실시예 1에서와 같이 분석한다(시험 Ⅰ).

실시예 5에서 제조한 파열 세포에 대해 유사한 시험은 수행한다(시험 Ⅱ). 비교를 위해, 파열 세포를 첨가하지 않으면서 유사한 시험을 수행한다(비교용).

결과가 표 9에 제시되어 있다. 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 폴산 함유 생성물을 투여할 경우(시험 Ⅰ 및 Ⅱ), THF 및 5MF의 함량은 대조용에 비하여 더욱 증가된다.

[표 9]

[표 9 계속]

각각의 시험에서, 미생물의 파열 세포 형태로 폴산을 분만시까지 계속해서 투여한다.

모든 암퇘지는 교배후 약 114일후에 분만한다. 분만 결과는 다음과 같다: 효소 분해 세포를 투여하는 시험(시험 Ⅰ)에서는 평균 11.6마리의 새끼 돼지가 태어났고, 원형질 분획의 무수 생성물을 투여하는 시험(시험 Ⅱ)에서는 평균 11.8마리의 새끼 돼지가 태어났다. 한편, 비교용의 경우에는 평균 10.8마리의 새끼 돼지가 태어났다. 상기 결과로부터, 암퇘지의 혈장중 THF 및 5MF의 값은 효소 분해 세포 및 원형질 분획의 무수 생성물(본 발명)을 투여함으로써 출산율을 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다.

본 발명에 따라, 암퇘지의 혈장에 함유된 활성 형태의 폴산의 농도는 환원된 형태의 폴산을 경구 투여하여 증가시킬 수 있으며, 그 결과 출산율이 용이하게 개선될 수 있다.. 이는 상당한 정도로 돼지의 분만 조절에 기여한다.

Claims

출산율 향상을 위한 활성 성분으로서 환원된 형태의 폴산이 함유되어 있음을 특징으로 하는 암퇘지 사료용 첨가제.
제1항에 있어서, 환원된 형태의 폴산이 7,8-디하이드로폴산, 류코보린, 간 분말 및/또는 미생물의 파열 세포 또는 세포 추출물의 형태인 암퇘지 사료용 첨가제.
제2항에 있어서, 미생물의 파열 세포 또는 세포 추출물이 p-아미노벤조산, 산화된 형태의 폴산 및/또는 핵산을 첨가한 배지에서 배양된 세포로부터 제조되는 암퇘지 사료용 첨가제.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에서 기술한 사료용 첨가제가 함유되어 있음을 특징으로 하는 암퇘지용 사료.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에서 기술한 사료용 첨가제를 암퇘지에게 경구 투여하거나, 제4항에서 기술한 사료를 암퇘지에게 공급함을 특징으로 하여, 암퇘지의 출산율을 향상시키는 방법.