KR100308527B1 - Tissue-specific gene delivery system - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조직 특이성을 갖는 유전자 전달 복합체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 폴리라이신, 루시퍼라아제 DNA, 간세포 표면에 존재하는 수용체에 친화력을 갖는 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민(Gal24BSA) 및 서열 1에 기재된 펩타이드가 함유되어 있어, 작용성 유전자를 간조직 및 간세포에 특이적 및 효과적으로 전달하게 되는 조직 특이성을 갖는 유전자 전달 복합체에 관한 것이다.The present invention relates to a gene delivery complex having tissue specificity, and more particularly, polylysine, luciferase DNA, galactose-modified bovine serum albumin (Gal 24 BSA) having an affinity for receptors present on the surface of hepatocytes, and SEQ ID NO: 1. The peptide described in the present invention relates to a gene delivery complex having tissue specificity that enables specific and effective delivery of a functional gene to liver tissues and hepatocytes.
Description
본 발명은 조직 특이성을 갖는 유전자 전달 복합체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 폴리라이신, 루시퍼라아제 DNA, 간세포 표면에 존재하는 수용체에 친화력을 갖는 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민(Gal24BSA) 및 서열 1에 기재된 펩타이드를함유하고, 작용성 유전자를 간조직 및 간세포에 특이적 및 효과적으로 전달하게 되는 조직 특이성을 갖는 유전자 전달 복합체에 관한 것이다.The present invention relates to a gene delivery complex having tissue specificity, and more particularly, polylysine, luciferase DNA, galactose-modified bovine serum albumin (Gal 24 BSA) having an affinity for receptors present on the surface of hepatocytes, and SEQ ID NO: 1. The present invention relates to a gene delivery complex containing the peptide described in the present invention and having tissue specificity that enables specific and effective delivery of a functional gene to liver tissue and hepatocytes.
일반적인 약물학 분야의 목표는 표적으로 하는 세포 및 조직으로 약품을 특이적으로 전달할 수 있는 방법과 이의 약물학적 조성물을 개발하는 것이다. 또한, 상기 약물학적 조성물을 원하지 않는 세포 또는 조직으로의 부적합한 전달의 결과로 야기되는 일반적인 생리학적 효과의 기피에 있다.The goal of the general field of pharmacology is to develop methods and pharmacological compositions thereof that can specifically deliver drugs to the cells and tissues they target. In addition, the pharmacological composition is to avoid general physiological effects resulting from inadequate delivery to unwanted cells or tissues.
최근의 DNA 재조합 기술과 유전학적인 기술의 도래로 인하여 숙주 세포에서 유전자의 발현을 중재할 수 있는 재조합 발현 구조물 및 약리학적인 기술이 발달하게 되었고, 분자 약물, 특히 유전자 치료가 가능하게 되어 다양한 유전자 질환을 완화시킬 수 있게 되었다.Recent advances in DNA recombination and genetics have led to the development of recombinant expression constructs and pharmacological techniques that can mediate the expression of genes in host cells. It can be mitigated.
한편, 유전자(이하, 치료 유전자로 칭함)를 외부에서 세포로 도입하고 발현하여 세포의 생물학적 결함을 제거하거나, 생체에 필요한 성분을 생산하게 하고 생산된 성분이 다른 기관에서 이용됨으로써, 질병을 치료할 수 있는데, 이를 유전자 치료(gene therapy)라고 한다.Meanwhile, genes (hereinafter referred to as therapeutic genes) may be introduced into cells from outside and expressed to remove biological defects of cells, or to produce components necessary for living bodies, and the produced components may be used in other organs to treat diseases. This is called gene therapy.
효과적인 유전자 치료를 위해서는, 관련 조직의 세포에 유전자 치료제의 효율적인 투여 및 특이도를 증가시키는 것이 요구되는데, 종래 기술에서는 특정 세포로의 유전자 전달이 이루어지지 않았다.Effective gene therapy requires the efficient administration and specificity of gene therapy agents to cells of related tissues, which has not been accomplished in the prior art.
이에, 상기 특정 세포로의 치료 유전자 전달과 관련하여 우(Wu)등은 갈락토즈를 말단에 함유하는 당단백(ASOR)-유전자 복합체가 당단백이 없는 복합체보다도 유조직 세포에 대하여 보다 높은 발현율을 갖지만, 유전자의 효과적 또는 특이적전달에 있어서는 기대 이하의 성과를 나타낸다고 보고하고 있다[J. Biol. Chem. 262, 429 ∼ 4432 (1987)].Thus, in relation to the delivery of therapeutic genes to specific cells, Wu et al., Although the glycoprotein (ASOR) -gene complex containing galactose at the end has a higher expression rate in milk tissue cells than the complex without glycoprotein, Has reported below-expected results in effective or specific delivery [ J. Biol. Chem. 262 , 429-4432 (1987).
따라서, 지금까지는 유전자 치료를 위해서, 치료 유전자를 운반하는 수단으로 다음과 같은 방법이 사용되고 있다.Thus, until now, the following method has been used as a means of transporting therapeutic genes for gene therapy.
우선, 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus)를 사용하는 시스템이 있는데, 이는 삽입한 유전자의 발현효율이 높고, 바이러스 DNA가 염색체 DNA에 통합되기 때문에 발현기간이 상대적으로 길다는 장점을 갖고 있다. 그러나, 패키징 비리온(packaging virion)의 종류에 따라 치료 유전자의 크기가 제한되며, 인체 내에 존재하는 동종의 바이러스와 유전자 재조합을 일으켜 병원성을 나타낼 수 있으며, 또한, 세포 분열이 왕성한 세포에서만 트랜스덕션(transduction)이 일어나는 문제가 있다.First, there are systems using retroviruses and adenoviruses, which have advantages of high expression efficiency of inserted genes and relatively long expression periods because viral DNA is integrated into chromosomal DNA. . However, the size of the therapeutic gene is limited depending on the type of packaging virion, and may cause genetic recombination with homologous viruses existing in the human body, which may be pathogenic, and transduction may be performed only in cells with strong cell division. There is a problem that transduction occurs.
또 다른 치료 유전자의 운반수단으로서 양이온성 리포좀을 사용하는 방법이 있다. 이러한 방법은 감염성이 적고, 면역체계를 자극하지 않아 부작용이 적은 장점을 가지고 있다. 그러나, 세포 내로 주입한 플라스미드 형태의 DNA가 에피좀(episome)상태로 존재하기 때문에, 비정형한(heterologous) 유전자의 발현 현상으로 인하여 일시적인 효과만를 나타내는 문제가 있다.Another method is to use cationic liposomes as a means of transporting therapeutic genes. This method is less infectious and does not stimulate the immune system and has fewer side effects. However, since the DNA in the form of plasmid injected into the cells exists in an episome state, there is a problem of only a temporary effect due to the expression of heterologous genes.
그 밖에, 특정 세포로의 치료 유전자의 운반수단으로는 세포당 수천개가 존재하는 표면 수용체를 활용하여, 특정 세포의 표면 수용체를 인식하는 리간드 부위가 결합된 치료 유전자가 있다. 그러나, 상기 치료 유전자는 라이소좀에 둘러싸여 세포 내로 삽입되기 때문에, 라이소좀내 효소에 의하여 분해되어 치료 효율이감소되는 문제가 있다.In addition, there are therapeutic genes in which a ligand site that recognizes the surface receptor of a specific cell is bound by utilizing a surface receptor that exists in the thousands of cells as a means of transporting the therapeutic gene to a specific cell. However, since the therapeutic gene is surrounded by the lysosome and inserted into the cell, the therapeutic gene is degraded by an enzyme in the lysosome to reduce the treatment efficiency.
상기의 문제점을 해결하기 위하여, 푸소제닉(fusogenic) 펩타이드 또는 결함있는 복제를 갖는 아데노바이러스(replication-defective adenovirus) 등을 이용하여 라이소좀의 경로를 거치지 않고, 유전자를 전달하는 방법이 개발되고 있으나 아직 실용화되고 있지 않다.In order to solve the above problems, a method of delivering a gene without passing through the lysosomal path using a fusogenic peptide or a replication-defective adenovirus having a defective replication, etc., has been developed. It is not put to practical use.
이와 같이, 종래에는 유전자를 세포 및 조직으로 특이적 표적화를 달성하기에는 상기한 바와 같은 여러 가지 문제점들이 있으므로, 이를 해결하기 위한 유전자를 조직 특이적으로 전달할 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구된다.As such, in order to achieve specific targeting of genes to cells and tissues in the related art, there are various problems as described above. Therefore, there is an urgent need for the development of a method for tissue-specific delivery of genes for solving them.
이에, 본 발명은 상기와 같은 종래의 유전자 전달 수단이 갖는 문제를 해결하면서, 작용성 유전자를 간세포에 특이적으로 전달할 수 있고, 세포내에서 라이소좀에 의해 분해되지 않고 작용성 유전자가 발현 및 분비될 수 있는 적합한 유전자 전달 수단을 제공하고자 한다.Accordingly, the present invention solves the problems of the conventional gene delivery means as described above, and can specifically deliver the functional gene to hepatocytes, the functional gene is expressed and secreted without being degraded by the lysosome in the cell It is intended to provide a suitable means of gene transfer that can be.
도 1은 폴리라이신과 DNA의 중량비(㎍)를 달리하여 제조한 복합체의 크기를 레이저광 산란법을 사용하여 측정한 결과이다.1 is a result of measuring the size of the complex prepared by varying the weight ratio (μg) of polylysine and DNA using a laser light scattering method.
도 2는 폴리라이신과 DNA의 중량비(㎍) 및 갈락토오스 수식 알부민의 양을 달리하여 제조한 복합체의 아가로즈 겔 전기영동분석의 사진이다.2 is a photograph of agarose gel electrophoresis of the complex prepared by varying the weight ratio (μg) of polylysine and DNA and the amount of galactose-modified albumin.
도 3은 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체에 대한 전자 현미경 사진이다.3 is an electron micrograph of the gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose modified bovine serum albumin.
도 4a는 Hep G2 세포에 폴리라이신-[메틸-14C]타이미딘 DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체 또는 [메틸-14C]타이미딘 DNA만을 첨가하여 도입된 DNA 양을 살펴본 결과이고, 도 4b는 NIH/3T3 세포에 폴리라이신-[메틸-14C]타이미딘 DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체 또는 [메틸-14C]타이미딘 DNA만을 첨가하여 도입된 DNA 양을 살펴본 결과이다.Figure 4a shows the amount of DNA introduced by adding only the gene transfer complex of polylysine- [methyl- 14 C] thymidine DNA-galactose-modified bovine serum albumin or [methyl- 14 C] thymidine DNA to Hep G2 cells. As shown in FIG. 4B, the gene transfer complex of polylysine- [methyl- 14 C] thymidine DNA-galactose-modified bovine serum albumin or only [methyl- 14 C] thymidine DNA was added to NIH / 3T3 cells. This is the result of examining the amount of DNA introduced.
도 5는 Hep G2 세포에 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체의 도입에 대한 길항제로서 아시알로훼투인(asialofetuin)의 영향을 나타낸 그래프이다.Figure 5 is a graph showing the effect of asialofetuin as an antagonist on the introduction of the gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin into Hep G2 cells.
도 6a는 Hep G2 세포에 있어서, 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체의 발현효율에 대한 GALA의 영향을 나타내는 막대 그래프이고 ; 도 6b는 도 6a와 동일한 실험에 대한 INF7K1의 영향을 나타내는 막대 그래프이고 ; 도 6c는 도 6a와 동일한 실험에 대한 INF6의 영향을 나타내는 막대 그래프이고 ; 도 6d는 도 6a와 동일한 실험에 대한 KALA의 영향을 나타내는 막대 그래프이다.6A is a bar graph showing the effect of GALA on the expression efficiency of the gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin in Hep G2 cells; FIG. 6B is a bar graph showing the effect of INF7K1 on the same experiment as FIG. 6A; FIG. 6C is a bar graph showing the effect of INF6 on the same experiment as FIG. 6A; FIG. 6D is a bar graph showing the effect of KALA on the same experiment as FIG. 6A.
도 7은 Hep G2 세포에 있어서, 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체의 발현효율에 대한 혈장 알부민 및 KALA의 영향을 나타내는 막대 그래프이며, *는 칼슘-포스페이트 방법에 의한 트랜스펙션 활성 값을 표시한다.7 is a bar graph showing the effect of plasma albumin and KALA on the expression efficiency of the gene delivery complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin in Hep G2 cells, and * is the trans by the calcium-phosphate method. Indicates the specification active value.
본 발명은 폴리라이신-루시퍼라아제 DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-서열 1에 기재된 펩타이드로 구성된 것임을 특징으로 하는 간 조직 특이성을 갖는 유전자 전달 복합체에 관한 것이다.The present invention relates to a gene delivery complex having liver tissue specificity, characterized in that it is composed of the peptide described in polylysine-luciferase DNA-galactose-modified bovine serum albumin-SEQ ID NO: 1.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.The present invention will be described in detail as follows.
본 발명은 조직 특이성을 갖는 유전자 전달 복합체에 관한 것으로서, 작용성 유전자에 대한 적합한 담체로 양이온성 폴리라이신을 사용하여 매우 안정한 복합체를 형성하고, 간세포 표면 수용체와 친화력을 갖는 갈락토스 수식 알부민을 가지며, 또한, 작용성 유전자가 라이소좀에 의해 분해되는 것을 피할 수 있도록 하는 푸소제닉(fusogenic) 펩타이드를 함유하고 있어, 간조직 및 간세포에 조직 특이적으로 작용성 유전자의 표적화된 전달이 가능하고 유전자의 높은 발현 효율을 가지는 유전자 전달 복합체에 관한 것이다.The present invention relates to a gene delivery complex having tissue specificity, which uses a cationic polylysine as a suitable carrier for a functional gene to form a very stable complex and has galactose modified albumin having affinity with hepatocyte surface receptors, It contains a fusogenic peptide that allows the functional genes to be avoided from being degraded by the lysosomes, enabling targeted delivery of tissue-specific functional genes to liver tissues and hepatocytes and high expression of the genes. It relates to a gene delivery complex having efficiency.
본 발명의 유전자 전달 복합체는, 상기 복합체를 형성하는 다수의 매개변수에 의해 특성화된다. 상기 매개변수로는 DNA:폴리라이신의 비, DNA의 농도, DNA:갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 비, DNA의 순도, DNA:펩타이드의 비, 복합체의 크기, DNA를 제조하는 방법, 복합체를 제조하는 방법 및 그 밖의 매개변수를 포함하고 있다.The gene delivery complex of the present invention is characterized by a number of parameters that form the complex. The parameters include the ratio of DNA: polylysine, the concentration of DNA, the ratio of DNA: galactose-modified bovine serum albumin, the purity of DNA, the ratio of DNA: peptide, the size of the complex, the method of preparing the DNA, and the preparation of the complex. How-to and other parameters.
상기 복합체에서 DNA의 농도는 약 0.5 ∼ 5 ㎎/㎖, 바람직하게는, 약 0.5 ∼ 2 ㎎/㎖이고, DNA 순도는 약 15 ∼ 100 % 일 때가 복합체 형성에 적합하다. 또한, 상기 DNA:갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 적절한 중량비(㎍)는 약 1:1 ∼ 1:5, 바람직하게는 약 1:1 ∼ 1:3이다.The concentration of DNA in the complex is about 0.5-5 mg / ml, preferably about 0.5-2 mg / ml, and the DNA purity of about 15-100% is suitable for complex formation. In addition, an appropriate weight ratio (μg) of the DNA: galactose-modified bovine serum albumin is about 1: 1 to 1: 5, preferably about 1: 1 to 1: 3.
한편, 본 발명의 유전자 전달 복합체를 혼합 및 제조할 때, 각 성분을 혼합하는 순서에 따라 적합한 유전자 전달 복합체가 제조될 수 있다. 일반적으로 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민:폴리라이신:DNA의 중량비를 3:0.5:1 ∼ 3:1:1(㎍)로 하여 알부민과 폴리라이신을 DNA에 첨가해서 응집을 최소화하는 것이 바람직하고,특히, 알부민을 첨가하기 전에 폴리라이신을 먼저 첨가하면 보다 우수한 결과를 얻을 수 있다. 이때, 음으로 하전된 DNA는 양이온성 폴리라이신 담체(carrier)와 결합하여 매우 안정한 복합체를 형성하는데, 이는 거대 분자의 DNA(≥30kb) 뿐만 아니라, 작은 DNA 단편에도 적용될 수 있다. 그리고, 소량의 용적물에 대하여는 흔들거나 와동시키고, 다량의 용적물에 대해서는 기계적인 혼합 시스템을 사용하여, 서서히 혼합하여야 한다.On the other hand, when mixing and preparing the gene delivery complex of the present invention, a suitable gene delivery complex can be prepared according to the order of mixing each component. In general, it is preferable to add albumin and polylysine to the DNA with a weight ratio of galactose-modified bovine serum albumin: polylysine: DNA to 3: 0.5: 1 to 3: 1: 1 (μg) to minimize aggregation. If polylysine is added before adding albumin, better results can be obtained. In this case, the negatively charged DNA combines with a cationic polylysine carrier to form a very stable complex, which can be applied to small DNA fragments as well as large molecules of DNA (≥30kb). For small volumes, shake or vortex, and for large volumes, mix slowly using a mechanical mixing system.
또한, 유전자 전달 복합체를 주사용으로 사용하기 위해서는 복합체의 크기를 적절히 조절하여야 한다. 즉, 담체(carrier)-DNA 복합체가 거대 입자를 형성하면, 주사바늘을 통과하기가 어렵고 숙주 동물의 부위에 따라 부적합할 수 있기 때문에, 큰 입자로 응집이 되어 침전이 형성되는 것을 막아야 한다. 따라서, 이를 방지하기 위해, DNA:담체(carrier)의 중량비를 1:0.5 ∼ 1:1로 조절하고, 용액중의 DNA와 담체(carrier) 복합체의 전체농도를 5 ㎎/㎖ 미만으로 최소화시킨다. 또한, 거대 응집을 촉진시키는 경향이 있는 EDTA와 같은 킬레이트 및 상당량의 염의 사용을 피한다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 복합체를 제조할 때, 부형제로 물, 포도당/물의 혼합 용액을 사용하는 것이 바람직하다.In addition, in order to use the gene transfer complex for injection, the size of the complex must be properly adjusted. In other words, when the carrier-DNA complex forms a large particle, it is difficult to pass through the needle and may be unsuitable depending on the site of the host animal, and thus, it is necessary to prevent aggregation by forming large particles. Therefore, to prevent this, the weight ratio of DNA: carrier is adjusted to 1: 0.5 to 1: 1, and the total concentration of DNA and carrier complex in solution is minimized to less than 5 mg / ml. In addition, the use of chelates and significant amounts of salts, such as EDTA, which tends to promote large aggregation, is avoided. Therefore, when preparing the complex according to the present invention, it is preferable to use a mixed solution of water and glucose / water as an excipient.
그리고, 제조된 담체(carrier)-DNA 복합체의 육안 식별이 가능하도록 하기 위해서, 자체는 응집되지 않지만, DNA 또는 알부민을 착색시키는 염료를 사용하여 복합체의 형성 유무를 알 수 있다. 또한, 전자 현미경 검사, 레이저광 산란법, 코울터(Coulter) 카운팅/크기 분석법 등 통상적인 방법을 사용하여 측정한 결과, 정맥주사를 통해 간세포로 전달하기에 적당한 유전자 전달 복합체의 직경이 약 200㎚ 이하임을 알 수 있다.In addition, in order to enable visual identification of the prepared carrier-DNA complex, although it is not aggregated itself, it is possible to know whether the complex is formed by using a dye that colors DNA or albumin. In addition, as measured using conventional methods such as electron microscopy, laser light scattering, and Coulter counting / size analysis, the diameter of the gene transfer complex suitable for delivery to hepatocytes by intravenous injection is about 200 nm. It can be seen that the following.
따라서, 상기 유전자 전달 복합체는 포유류 간세포의 증착에 필요한 최소치의 직경을 가져야 하고, 과다하게 농축되어 응집물이 형성되지 않도록 조심해야 한다.Therefore, the gene delivery complex should have the minimum diameter necessary for the deposition of mammalian hepatocytes and care should be taken not to over-concentrate to form aggregates.
때로는, 주사용 담체(carrier)-DNA 복합체를 동결 건조하기도 하는데, 마니톨 또는 트리할로오스(trehalose)와 같은 항냉동제가 담체(carrier)-DNA 복합체의 완충액에 포함된다는 것을 제외하고는, 상기한 복합체와 동일하게 제조된다. 즉, 폴리라이신, DNA, 알부민 및 펩타이드를 혼합한 후에 제조된 복합체를 빠르게 동결 건조시키고, 사용시 멸균된 물로 용해하면, 숙주 동물에 투여하기에 용이한 조성물을 얻을 수 있다.Sometimes the carrier-DNA complex for injection is lyophilized, except that an antifreezing agent, such as mannitol or trihalose, is included in the buffer of the carrier-DNA complex. It is prepared identically to one complex. That is, if the complex prepared after mixing polylysine, DNA, albumin and peptide is rapidly lyophilized and dissolved in sterile water in use, a composition that is easy to administer to the host animal can be obtained.
일반적으로, 다양한 입자크기를 갖는 복합체를 숙주 동물에 투여하여 원하는 표적 조직 및 투여 방식에 적합한 입자의 크기를 결정할 수 있는데, 예를 들면, 동물의 혈류에 주입된 큰 복합체는 간세포보다 비장세포 또는 폐세포에 대하여 보다 큰 친화도를 갖는다.In general, complexes of various particle sizes can be administered to a host animal to determine the size of particles suitable for the desired target tissue and mode of administration. For example, large complexes injected into the bloodstream of an animal may be splenocytes or lungs rather than hepatocytes. Have a greater affinity for the cell.
한편, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 비면역원성, 비독성적, 비감염성이며, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 벡터 유기체의 DNA가 패키징되어 있지 않기 때문에 플라스미드 크기에 제한을 받지 않는다. 따라서, 어떠한 실용적인 크기의 재조합 발현 구조물도 사용될 수 있다.On the other hand, the gene delivery complex according to the present invention is non-immunogenic, non-toxic, non-infectious, and is not limited in plasmid size because DNA of vector organisms such as retroviruses or adenoviruses is not packaged. Thus, any practical size recombinant expression construct can be used.
또한, 기존에는 분리되어 있는 세포에만 유전자 전달이 가능했지만, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 비분리되어 있는 체내 세포에도 적용할 수 있고, 표적화및 유전자 발현 효과의 지속성에 영향을 미칠 수 있도록 유전자 전달 복합체를 변경할 수 있다.In addition, gene transfer was possible only to cells that were previously isolated, but the gene delivery complex of the present invention can be applied to non-isolated body cells, and the gene delivery complex can affect the persistence of targeting and gene expression effects. Can be changed.
그리고, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 본 발명에서 가장 바람직하게 투여될 수 있는 정맥내 주사를 포함하여 복막내 주사, 피하주사, 또는 근육내 주사등 표적 조직내로의 직접 주사 및 폐로의 에어로졸 전달, 피부 표피층을 통해 전달하는 방법으로 특이적으로 작용성 유전자의 전달을 수행할 수 있다.In addition, the gene delivery complex of the present invention includes intravenous injection, subcutaneous injection, or intramuscular injection, such as intraperitoneal injection, intravenous injection, which can be most preferably administered in the present invention, and direct injection into the target tissue and aerosol delivery to the lung, skin The delivery of functional genes can be specifically carried out by delivery through the epidermal layer.
이와 같은 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체를 이용하여 간세포를 대상으로 유전자 치료를 행하는 경우, 도입된 복합체가 분해되지 않고 세포내 핵에 도달해야 하며, 복합체의 구성 성분은 생체유래의 비면역성, 생분해성 고분자이어야 한다. 이러한 관점에서, 본 발명자들은 표면 수용체와 친화력을 높이는 동시에 생체 내에서 면역반응을 자극하지 않는 갈락토즈로 수식한 알부민과 세포 내로 도입된 유전자가 라이소좀에 의해 분해되는 것을 피할 수 있는 푸소제닉(fusogenic) 펩타이드인 KALA로 제조한 유전자 전달 복합체를 간세포에 도입했을 때, 유전자의 발현이 증가됨을 확인할 수 있다.When gene therapy is performed on hepatocytes using the gene delivery complex according to the present invention, the introduced complex must reach the intracellular nucleus without degradation, and the components of the complex are bioimmune non-immune and biodegradable. It must be a polymer. In this regard, the present inventors have found that fusogenic, which enhances affinity with surface receptors and at the same time does not induce degradation of albumin modified with galactose that does not stimulate the immune response in vivo, and genes introduced into cells by lysosomes. When the gene delivery complex prepared with the peptide KALA is introduced into the hepatocytes, the expression of the gene is increased.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
실시예 1 : 루시퍼라아제 DNA를 가지는 플라스미드 RSV의 제조Example 1 Preparation of Plasmid RSV with Luciferase DNA
루시퍼라아제 DNA를 가지는 플라스미드 RSV는 알칼리 분해, 더블 염화 세슘(double cesium chloride) 방법을 사용하여 제조되었다[Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press: New York (1990)].Plasmid RSV with luciferase DNA was prepared using alkaline digestion, double cesium chloride method [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press: New York (1990)]. .
상기 방법을 자세히 하면, 100 ㎍/㎖ 암피실린이 포함된 15 ㎖ LB 배양액에서 단일 콜로니를 포함하는 박테리아를 37℃의 온도에서 12 ∼ 18시간 동안 교반(250 rpm)하면서 배양하였다. 그런 후, 이 배양액에서 3 ∼ 3.5 ㎖을 취하여 4개의 100 ㎍/㎖ 암피실린이 포함된 500 ㎖ LB에 각각 첨가하여 37℃의 온도에서 16 ∼ 18시간동안 교반하면서 배양하였다.In detail the method, bacteria containing a single colony were incubated with stirring (250 rpm) for 12-18 hours at a temperature of 37 ℃ in 15 ml LB culture medium containing 100 μg / ml ampicillin. Then, 3 to 3.5 ml of the culture solution was taken, and each was added to 500 ml LB containing four 100 µg / ml ampicillin and incubated with stirring at a temperature of 37 ° C. for 16 to 18 hours.
배양한 후에, 베크만(Beckman) 원심분리기를 이용하여 4℃의 온도에서 10분 동안 원심 분리하여 박테리아를 회수하였다. 회수된 박테리아를 25 mM HCl 완충액(pH 8)/10 mM EDTA/50 mM 글루코오스의 혼합용액 20 ㎖ 에서 가볍게 재현탁하였다. 상기 재현탁된 박테리아 세포 펠릿에 0.2 N NaOH/1% SDS(Sodium Dodecyl Surfate)의 혼합용액 40 ㎖을 실온에서 첨가한 다음, 약 5분 동안 얼음상에서 상기 혼합물을 가볍게 교반함으로써 세포를 분해하였다. 그 다음에, 분해된 박테리아의 혼합물에 3 M 아세트산칼륨 20 ㎖을 첨가하고, 가볍게 혼합시킨 후, 10분 동안 얼음상에서 저장하여 박테리아 염색체 DNA, RNA 및 SDS/단백질/막 복합체를 포함하는 백색 침전물을 얻은 후, 4℃의 온도에서 15분 동안 10,000 rpm의 속도로 원심 분리하였다.After incubation, the bacteria were recovered by centrifugation at a temperature of 4 ° C. for 10 minutes using a Beckman centrifuge. The recovered bacteria were gently resuspended in 20 ml of a mixed solution of 25 mM HCl buffer (pH 8) / 10 mM EDTA / 50 mM glucose. 40 mL of a 0.2 N NaOH / 1% sodium dodecyl surfate (SDS) mixed solution was added to the resuspended bacterial cell pellet at room temperature, and the cells were digested by gently stirring the mixture on ice for about 5 minutes. Next, 20 ml of 3 M potassium acetate was added to the mixture of digested bacteria, mixed lightly, and stored on ice for 10 minutes to yield a white precipitate containing bacterial chromosomal DNA, RNA and SDS / protein / membrane complex. After obtaining, the mixture was centrifuged at a speed of 10,000 rpm for 15 minutes at a temperature of 4 ° C.
원심분리 후, 상청액을 멸균거어즈를 통해 250 ㎖ 원심분리기병으로 여과하면서 옮기고, 실온에서 이소프로판올 50 ㎖을 첨가하여 혼합한 후, 10분 동안 저장하였다. 그런 후, 실온에서 10분 동안 5,000 rpm의 속도로 원심 분리하여 알코올 함유 상청액을 따라내고, 나머지 상청액을 진공 아스퍼레이션을 사용하여 제거한 다음, 플라스미드 DNA 펠릿을 10분 동안 건조시켰다.After centrifugation, the supernatant was transferred through sterile gauze to a 250 ml centrifuge bottle, filtered, 50 ml of isopropanol was added at room temperature, mixed and stored for 10 minutes. The alcohol-containing supernatant was then decanted by centrifugation at 5,000 rpm for 10 minutes at room temperature, the remaining supernatant was removed using vacuum asperation, and the plasmid DNA pellet was dried for 10 minutes.
건조된 플라스미드 DNA 펠릿을 트리스-HCl(pH 8) 6 ㎖로 용해하고, 0.5 ∼ 0.75 ㎍의 이자 RNase를 첨가하여 플라스미드 DNA로부터 오염 박테리아 RNA를 제거하였다. 그리고, 염화 세슘-에티듐 브로마이드 원심분리법을 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다[Sambrook et al., ibid (1990)].The dried plasmid DNA pellet was dissolved in 6 ml of Tris-HCl (pH 8), and contaminating bacterial RNA was removed from the plasmid DNA by addition of 0.5-0.75 µg of interest RNase. The plasmid DNA was then purified using cesium chloride-ethidium bromide centrifugation (Sambrook et al., Ibid (1990)).
즉, 플라스미드 DNA용액 ㎖당 1 g의 염화 세슘과 0.5 ∼ 0.8㎎의 에티듐 브로마이드를 가하여 용해시킨 후, 상온에서 4분 동안 5,000 rpm의 속도로 원심분리하여 불용성 부유물을 제거한 다음, 혼합용액을 초원심분리용 튜브(Beckman polyallomer Quick-SealTMcentrifuge tube)로 옮겼다. VTi65 로터가 장착된 베크만 초원심분리기내에 튜브를 장착하고 20℃의 온도에서 45,000 rpm의 속도로 16 ∼ 18시간동안 원심 분리한 후, 튜브의 윗 부분에 21 게이지(gauge) 주사기를 꽂아 공기가 유입되도록 한 후, 멸균된 18 게이지(gauge) 주사기를 사용하여 플라스미드 DNA가 함유되어 있는 중간 층 밴드만을 분리한 후, 새로운 초원심 분리 튜브로 옮겼다. 그런 후, 상기와 같은 방법으로 재원심분리하고, 얻은 플라스미드 DNA를 멸균된 팰콘(Falcon)튜브로 옮겼다. 플라스미드 DNA와 동량의 트리스-포화된 1-부탄올을 첨가하여 완전히 혼합시킨 후, 실온에서 5분동안 1,500 rpm의 속도로 원심 분리하는 방법으로, 에티듐 브로마이드가 포함된 부탄올층을 분리하는 과정을 에티듐 브로마이드의 분홍빛이 제거될 때까지 반복하였다. 플라스미드 DNA 용액을 투석막에 장치한 후, 트리스-HCl 완충액(pH 8)을 3 ∼ 4회 교체하면서 48시간 동안 투석하여 남아있는 미량의 에티듐 브로마이드를 제거한 후, 플라스미드 DNA 용액의 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 1 ∼ 18시간동안 DNA를 침전시켰다.That is, 1 g of cesium chloride and 0.5-0.8 mg of ethidium bromide were dissolved per ml of the plasmid DNA solution, followed by centrifugation at 5,000 rpm for 4 minutes at room temperature to remove the insoluble suspended solids. Transfer to a centrifuge tube (Beckman polyallomer Quick-Seal ™ centrifuge tube). The tube was placed in a Beckmann ultracentrifuge equipped with a VTi65 rotor, centrifuged for 16-18 hours at a speed of 45,000 rpm at a temperature of 20 ° C, and a 21 gauge syringe was inserted into the top of the tube to allow air to enter. Afterwards, only a middle layer band containing plasmid DNA was isolated using a sterile 18 gauge syringe and then transferred to a new ultracentrifuge tube. Thereafter, the cells were recentrifuged in the same manner as above, and the plasmid DNA obtained was transferred to sterile Falcon tubes. After mixing the plasmid DNA with the same amount of tris-saturated 1-butanol and thoroughly mixing, centrifuging at 1,500 rpm for 5 minutes at room temperature, the process of separating the butanol layer containing ethidium bromide is performed. Repeat until pinkish broth of thidium bromide was removed. Plasmid DNA solution was placed on the dialysis membrane, followed by dialysis for 48 hours while replacing Tris-HCl buffer (pH 8) three to four times to remove the remaining amount of ethidium bromide, followed by twice the volume of ethanol in the plasmid DNA solution. Was added to precipitate the DNA at -20 ° C for 1-18 hours.
침전시킨 후에, 약 10,000 rpm으로 원심 분리하여 플라스미드 DNA를 수거하였다. 수거한 플라스미드 DNA 펠릿을 3 ㎖의 10 mM 트리스-HCl(pH 8)에서 용해시키고, 용해된 플라스미드를 1/500로 희석하여 A260에서 분광광도법을 사용하여 농도를 결정하였다.After precipitation, the plasmid DNA was harvested by centrifugation at about 10,000 rpm. The collected plasmid DNA pellet was dissolved in 3 ml of 10 mM Tris-HCl, pH 8, the dissolved plasmid was diluted to 1/500 and the concentration was determined using spectrophotometry at A 260 .
실시예 2 : 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 제조 및 확인Example 2 Preparation and Confirmation of Galactose Modified Bovine Serum Albumin
환원당과 단백질이 중성 수용액에서 시프 염기(Schiff's base)를 형성하고, pH 5 이상에서는 선택적으로 시프 염기(Schiff's base)만을 환원하는 시아노보로하이드라이드 음이온(cyanoborohydride anion)을 사용하는 환원 아미노화 방법에 의해 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민을 제조하였다[Kim et al.,약학회지 36, 591 (1992)].Reducing amination method using cyanoborohydride anion, in which a reducing sugar and a protein form a Schiff's base in a neutral aqueous solution, and selectively reduce only the Schiff's base at a pH of 5 or higher. Galactose-modified bovine serum albumin was prepared [Kim et al., Journal of Pharmacy 36 , 591 (1992)].
즉, 소 혈청 알부민 68 ㎎, 갈락토즈 100 ㎎, 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride) 100 ㎎을 0.2 M 인산암모늄 완충액(pH 8.0) 5 ㎖에 완전히 용해시킨 후, 37℃인 차광 항온조에서 14일간 100 rpm의 속도로 교반하면서 반응을 완결시켰다.That is, 68 mg of bovine serum albumin, 100 mg of galactose, and 100 mg of sodium cyanoborohydride were completely dissolved in 5 ml of 0.2 M ammonium phosphate buffer (pH 8.0), followed by 14 in a shading thermostat at 37 ° C. The reaction was completed with stirring at a rate of 100 rpm per day.
반응이 완결된 혼합 용액을 분자량 한계 10 K(MWCO 10 K)의 여과막을 장치한 한외 여과 장치(Ultrafiltration kit, Diaflo™, Amicon Co., Beverly, MA, USA)를 이용하여 증류수를 첨가하면서 여러 번 저분자 분획을 제거한 후, 반응액을 농축시켰다. 얻어진 반응 농축액을 즉시 동결 건조시킨 후, -20℃의 온도에서 보관하였으며, 최종 생성물의 조성을 확인하기 위하여, 단백질 정량은 바이오래드 단백질 분석 장치(Biorad™ protein assay kit)를 이용하고, 갈락토즈의 양은 페놀-황산법[Dubois et al.,Anal. Chem.,28, 350 (1956)]을 이용하여 측정한 결과, 최종 생성물의 알부민:갈락토즈의 몰(mol)비는 1:25이었다.The reaction mixture was completed several times while adding distilled water using an ultrafiltration device (Ultrafiltration kit, Diaflo ™, Amicon Co., Beverly, MA, USA) equipped with a 10 M (MWCO 10 K) filtration membrane. After removing the low molecular fraction, the reaction solution was concentrated. The resulting reaction concentrate was immediately freeze-dried and stored at a temperature of -20 ° C. In order to confirm the composition of the final product, protein quantification was performed using a Biorad ™ protein assay kit, and the amount of galactose Phenol-sulfuric acid method [Dubois et al., Anal. Chem. , 28 , 350 (1956)], and the molar ratio of albumin: galactose in the final product was 1:25.
실시예 3 : 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체 제조Example 3 Preparation of Gene Delivery Complex of Polylysine-DNA-Galactose Modified Bovine Serum Albumin
폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체를 다음과 같이 제조하였다. DNA와 폴리라이신의 중량비(㎍)를 1:1 및 2:1로 하여 유전자 전달 복합체를 제조하였다. 예비실험에서, DNA:폴리라이신이 1:2 내지 1:5의 비로 혼합될 때에는 부적절한 하전이 유발되어 복합체 형성이 제대로 되지 않음을 관찰하였다.A gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose modified bovine serum albumin was prepared as follows. Gene delivery complexes were prepared by setting the weight ratio (μg) of DNA and polylysine to 1: 1 and 2: 1. In preliminary experiments, it was observed that when the DNA: polylysine was mixed at a ratio of 1: 2 to 1: 5, improper charge was induced, resulting in poor complex formation.
유전자 전달 복합체를 제조할 때, DNA:폴리라이신의 중량비가 2:1인 경우의 DNA농도는 100 ㎍/㎖, DNA:폴리라이신의 비가 1:1인 경우에는 DNA농도가 200 ㎍/㎖일 때가 최적이었다. 상기 실시예 1과 동일한 분광 광도법을 사용하여, 복합체를 형성하기 전에 DNA와 폴리라이신의 농도를 결정하였다.When preparing the gene transfer complex, the DNA concentration was 100 μg / ml when the DNA: polylysine weight ratio was 2: 1, and the DNA concentration was 200 μg / ml when the DNA: polylysine ratio was 1: 1. It was optimal. Using the same spectrophotometry as in Example 1, the concentrations of DNA and polylysine were determined before forming the complex.
적량의 DNA(500 ㎍/㎖)를 하나의 튜브에 첨가하고, 적량의 폴리라이신(20 ㎍/㎖)을 다른 튜브에 첨가한 후, 물과 3 M 염화나트륨 용액을 첨가하여 최종 염화나트륨 농도가 0.7 M이 되도록 조절하였다. 각 튜브를 각 5초동안 교반함으로써 혼합시켰다. 그 다음에, 교반하면서 5분 간격으로 폴리라이신 함유 용액 15 ㎕를 DNA 함유 튜브에 천천히 첨가하면, 용액 중에 약간의 입자가 형성되는데, 이 입자가 폴리라이신-DNA 복합체이다. 상기의 용액에 5 M의 염화나트륨 용액을 3 ㎕씩 서서히 적가하여 불용성 입자를 완전히 용해시켰다. 이 단계에서 혼합물을 고속으로 교반할 경우, 형성된 복합체의 보전 및 유용성이 많이 손상될 수 있으므로 주의하여야 한다.An appropriate amount of DNA (500 μg / ml) was added to one tube, an appropriate amount of polylysine (20 μg / ml) was added to another tube, followed by the addition of water and 3 M sodium chloride solution to give a final sodium chloride concentration of 0.7 M. It was adjusted to be. Each tube was mixed by stirring for 5 seconds each. Then, 15 μl of the polylysine-containing solution is slowly added to the DNA-containing tube at 5 minute intervals with stirring to form some particles in the solution, which are polylysine-DNA complexes. To the solution was slowly added dropwise 3 µl of 5 M sodium chloride solution to completely dissolve insoluble particles. Care should be taken when the mixture is stirred at high speed at this stage, as the integrity and usefulness of the formed composites may be much impaired.
유전자 전달 복합체의 폴리라이신:DNA의 비를 0.2:1 ∼ 0.7:1로 혼합하여 제조한 복합체의 평균 입자 크기를 레이저 입도 분포 측정기를 이용하여 측정하였다. 한편, 도 1은 DNA농도를 100 ㎍/㎖로, 폴리라이신 농도를 20 ㎍/㎖로 하여 제조한 복합체의 입도 분포를 나타낸 결과로서, 폴리라이신:DNA의 비가 입자의 하전이 중성을 띄는 0.45:1(w/w)일 때에 가장 큰 입자도(303 ㎚)를 보였음을 나타낸다.The average particle size of the complex prepared by mixing the ratio of polylysine: DNA of the gene transfer complex to 0.2: 1 to 0.7: 1 was measured using a laser particle size distribution analyzer. 1 shows particle size distribution of a complex prepared with a DNA concentration of 100 μg / ml and a polylysine concentration of 20 μg / ml, wherein the ratio of polylysine: DNA is 0.45. When 1 (w / w), the largest particle size (303 nm) was shown.
또한, 폴리라이신:DNA 복합체의 하전을 에티듐 브로마이드로 착색하여 아가로즈 겔 분석 전기 영동법으로 확인하였다. 여기서, 도 2는 0.2㎍의 플라스미드 DNA와 0.02 ㎍, 0.04 ㎍, 0.06 ㎍, 0.08 ㎍, 0.1 ㎍, 0.12 ㎍, 0.14 ㎍의 폴리라이신을 각각 함유하는 복합체를 제조하여 0.65% 아가로즈 겔상에서 전기 영동하였을 때, DNA:폴리라이신의 비가 1:0.5 이상인 복합체는 겔상에서 지체되었음을 나타낸다.In addition, the charge of the polylysine: DNA complex was stained with ethidium bromide and confirmed by agarose gel analysis electrophoresis. Here, FIG. 2 shows a complex containing 0.2 μg of plasmid DNA and 0.02 μg, 0.04 μg, 0.06 μg, 0.08 μg, 0.1 μg, 0.12 μg, 0.14 μg polylysine, respectively, for electrophoresis on 0.65% agarose gel. When done, the complex with a DNA: polylysine ratio of at least 1: 0.5 showed a delay on the gel.
갈락토즈 수식 소 혈청 알부민은 음이온성 생체 고분자로서, 폴리라이신-DNA 복합체와 정전기적 인력에 의해 안정한 결합을 한다. 따라서, 총하전이 양성을 띄는 폴리라이신-DNA 복합체(0.5:1(㎍))에 5 ㎍, 10 ㎍, 15 ㎍, 20 ㎍의 알부민을 다양하게 첨가하여 복합체를 제조한 다음, 아가로즈 겔상에서 전기 영동하였다. 여기서, 도 2는 갈락토즈 치환 알부민의 양이 증가함에 따라 DNA의 에티듐 브로마이드 착색 밴드가 정량적으로 증가했음을 나타내는 아가로즈 겔 전기영동분석 사진이다.Galactose-modified bovine serum albumin is an anionic biopolymer that provides stable binding to polylysine-DNA complexes and electrostatic attraction. Therefore, the complex was prepared by various additions of 5 μg, 10 μg, 15 μg, and 20 μg of albumin to the polylysine-DNA complex (0.5: 1 (μg)) that showed positive total charge, and then the complex was prepared on an agarose gel. Electrophoresis. 2 is an agarose gel electrophoresis photograph showing that the ethidium bromide staining band of DNA quantitatively increased as the amount of galactose substituted albumin increased.
그리고, 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체(3:0.5:1, w/w/w)가 형성된 후에, 평균 입자 크기를 레이저 입도 분포 측정기로 측정하였고, 주사 전자 현미경을 이용하여 복합체의 외관상 구조를 확인한 결과, 구형의 전자밀도가 큰 입자 구조를 보였으며(도 3), 제타 플러스 마이크로일렉트로포레시스(Zeta plus™ microelectrophoresis) 장치를 이용하여 복합체의 제타 퍼텐셜을 측정한 결과, 표면 하전이 양성을 띄는 2.3 ㎷인 것을 확인하였다.After the gene delivery complex (3: 0.5: 1, w / w / w) of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin was formed, the average particle size was measured with a laser particle size distribution meter, and the scanning electron microscope was As a result of confirming the apparent structure of the composite, the spherical electron density showed a large particle structure (FIG. 3), and the zeta potential of the composite was measured using a Zeta plus ™ microelectrophoresis device. , It was confirmed that the surface charge was 2.3 kV with positive.
실시예 4 : 세포에 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체의 도입Example 4 Introduction of a Gene Delivery Complex of Polylysine-DNA-Galactose Modified Bovine Serum Albumin into Cells
상기 실시예 3에서 제조된 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체를 이용하여 플라스미드 DNA를 Hep G2 세포에 도입할 수 있는가를 알아보았다.It was examined whether plasmid DNA can be introduced into Hep G2 cells using the gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin prepared in Example 3.
[메틸-14C]타이미딘을 플라스미드 DNA에 표지하기 위해 퀴아젠 미니프렙 장비(Qiagen™ midiprep kit)를 사용하여 다음과 같이 수행하였다. 100 ㎍/㎖의 암피실린이 첨가된 LB 배양액 2 ㎖에서 단일 콜로니를 포함하는 박테리아를 37℃의 온도에서 250 rpm의 속도로 교반하면서 12 ∼ 18시간동안 배양하였다. 그런 후, 이 배양액의 0.5 ∼ 1 ㎖을 100 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 50 ㎖ 에 첨가하여, 37℃의 온도에서 2시간 동안 교반하면서 배양한 후, [메틸-14C]타이미딘 50 μCi를 첨가하고 2시간 동안 교반하면서 배양하였다. 배양한 후, 10분 동안 원심 분리하여 박테리아를 수거한 다음, 박테리아 펠릿을 RNase A가 함유되어 있는 P1 완충액 4 ㎖로 가볍게 재현탁하고, 여기에 P2 완충액 4 ㎖을 첨가하여, 약 5분 동안 얼음상에서 상기 혼합물을 가볍게 교반하여 세포를 분해하였다. 상기의 분해된 세포 혼합물을 5분 동안 실온에서 방치한 다음, P3 완충액 4 ㎖을 첨가하고, 가볍게 혼합한 후에, 15분 동안 얼음상에서 저장하였다. 박테리아 염색체 DNA, RNA 및 SDS/단백질/막 복합체를 포함하는 백색 침전물을 4℃의 온도에서 30분 동안 12,000 rpm의 속도로 원심 분리하여 용액으로부터 분리하였다.To label [methyl- 14 C] thymidine on plasmid DNA, Qiagen ™ midiprep kit was performed as follows. Bacteria containing a single colony were incubated for 12-18 hours with stirring at 250 rpm at a temperature of 37 ° C. in 2 ml of 100 μg / ml Ampicillin-added LB broth. Then, 0.5 to 1 ml of this culture solution was added to 50 ml of LB to which 100 µg / ml ampicillin was added, followed by incubation with stirring at a temperature of 37 ° C. for 2 hours, followed by [methyl- 14 C] thymidine 50 μCi was added and incubated with stirring for 2 hours. After incubation, the bacteria were harvested by centrifugation for 10 minutes, and then the bacterial pellet was resuspended lightly with 4 ml of P1 buffer containing RNase A, and 4 ml of P2 buffer was added thereto and iced for about 5 minutes. The mixture was digested by gently stirring the mixture on the bed. The lysed cell mixture was left at room temperature for 5 minutes, then 4 ml of P3 buffer was added, mixed lightly and stored on ice for 15 minutes. White precipitates comprising bacterial chromosomal DNA, RNA and SDS / protein / membrane complexes were separated from the solution by centrifugation at 12,000 rpm for 30 minutes at a temperature of 4 ° C.
원심분리 후, 상청액을 멸균 거어즈를 통해 퀴아젠 팁100(Qiagen tip100)으로 여과한 후, QBT 완충액 4 ㎖을 실온에서 첨가하고, 중력에 의해 완충액을 컬럼 밖으로 흘러보냈다. 상기의 퀴아젠 팁을 QC 완충액 10 ㎖로 2번 세척하여 컬럼 밖으로 흘러보낸 다음, QF 완충액 5 ㎖을 첨가하면서 얻은 유출용액을 멸균 튜브에 회수하였다. 유출 용액 부피의 0.7배에 해당하는 이소프로판올을 가한 후, 실온에서 30분 동안 12,000 rpm의 속도로 원심분리한 후, 알코올 함유 상청액을 기울여 따르고, 나머지 상청액을 진공 아스퍼레이션을 사용하여 제거하고, 플라스미드 DNA 펠릿을 얻었다. 상기의 플라스미드 DNA 침전물을 10 mM 트리스-HCl(pH 8) 1 ㎖로 용해하고, 용해된 DNA를 1/500로 희석하여 A260에서 분광광도법을 사용하여 농도를 결정하였으며, 플라스미드 DNA 용액 20 ㎕을 7 ㎖ 섬광 칵테일을 함유하고 있는 섬광병에 첨가하여, 섬광 카운팅에 의해 [메틸-14C]타이미딘의 함량을 결정하였다.After centrifugation, the supernatant was filtered through sterile gauze to Qiagen tip100, then 4 ml of QBT buffer was added at room temperature and the buffer flowed out of the column by gravity. The Qiagen tip was washed twice with 10 ml of QC buffer and flowed out of the column, and then the effluent obtained with the addition of 5 ml of QF buffer was collected in a sterile tube. Isopropanol equivalent to 0.7 times the volume of the effluent solution was added, centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes at room temperature, followed by decantation of the alcohol-containing supernatant, and removal of the remaining supernatant using vacuum asperation and plasmid DNA pellets were obtained. The plasmid DNA precipitate was dissolved in 1 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8), the dissolved DNA was diluted to 1/500, and the concentration was determined using spectrophotometry at A 260 . The content of [methyl- 14 C] thymidine was determined by flash counting by addition to a flash bottle containing a 7 ml flash cocktail.
[메틸-14C]타이미딘 표지된 DNA를 이용하여 방사성 동위 원소가 표지된 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민(3:0.5:1, w/w/w)의 유전자 전달 복합체을 상기 실시예 3과 같이 제조하였으며, 제조된 복합체를 Hep G2 세포(ATCC HB-8065)에 도입하기 위해 다음과 같은 방법을 수행하였다.Gene transfer complexes of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin (3: 0.5: 1, w / w / w) labeled with radioisotopes using [methyl- 14 C] thymidine labeled DNA were described above. It was prepared as in Example 3, and the following method was performed to introduce the prepared complex into Hep G2 cells (ATCC HB-8065).
복합체를 세포에 도입하기 약 24시간 전에, 세포를 6-웰 플레이트(well plate)로 분리하여, 37℃/5% CO2에서 12 ∼ 18시간 동안 배양하거나, 약 70 ∼ 80% 형성될 때까지 배양하였다. 이 때에, 각 웰로부터 배지를 제거하고, 인산 완충액(pH 7.4) 2 ㎖로 세척하였다. 그런 다음, 혈청 함유 배지 1 ㎖을 각 웰 당 첨가하고, 상기 세포를 4시간 동안 37℃의 온도에서 배양한 후, 폴리라이신-[메틸-14C]타이미딘이 표지된 DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체(10 ㎍ DNA/㎖)를 1 ㎖씩 가한 후, 일정 시간 간격으로 배지를 각 웰로부터아스퍼레이션하고, 인산 완충액 2 ㎖로 두 번 세척하였다. 세포를 스크래이퍼로 회수한 후, 섬광 칵테일 7 ㎖을 함유하고 있는 섬광병에 옮기고 과산화수소수 200 ㎕를 가하여 탈색시킨 후에, 섬광카운팅에 의해 Hep G2 세포에 도입된 복합체의 양을 결정하였다.About 24 hours before the complex is introduced into the cells, the cells are separated into 6-well plates and incubated for 12-18 hours at 37 ° C./5% CO 2 or until about 70-80% is formed. Incubated. At this time, the medium was removed from each well and washed with 2 ml of phosphate buffer (pH 7.4). Then, 1 ml of serum-containing medium was added per well, and the cells were incubated at a temperature of 37 ° C. for 4 hours, followed by polylysine- [methyl- 14 C] thymidine-labeled DNA-galactose modification. After 1 ml of gene transfer complex of bovine serum albumin (10 μg DNA / ml) was added, the medium was aspirated from each well at regular intervals and washed twice with 2 ml of phosphate buffer. After the cells were recovered with a scraper, the cells were transferred to a scintillation bottle containing 7 ml of scintillation cocktail, decolorized by adding 200 µl of hydrogen peroxide solution, and the amount of the complex introduced into Hep G2 cells was determined by scintillation counting.
대조군으로서 Hep G2 세포에서의 [메틸-14C]타이미딘 DNA만을 도입한 경우(도 4a)를 살펴보았으며, 세포 표면에 갈락토즈 수용체가 존재하지 않는 NIH/3T3 세포에 대하여도 동일한 실험을 실시하였다(도 4b). Hep G2 세포에 [메틸-14C]타이미딘 DNA만 첨가하였을 경우, 약 10% 정도가 초기에 세포로 도입되었으며, 12시간까지 도입된 DNA 양이 거의 변하지 않았으나, 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체의 경우 6시간 배양할 때까지 도입이 계속 증가하였으며(약 55%), 12시간이 경과한 후에도 45% 이상이 지속적으로 도입되는 양상을 보였다. NIH/3T3 세포의 경우에는, DNA가 없거나 또는 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-폴리라이신-DNA의 유전자 전달 복합체 모두 10% 내외의 낮은 도입양상을 보였다.When only [methyl- 14 C] thymidine DNA was introduced into Hep G2 cells as a control (FIG. 4A), the same experiment was performed for NIH / 3T3 cells without galactose receptors on the cell surface. Was performed (FIG. 4B). When only [methyl- 14 C] thymidine DNA was added to Hep G2 cells, about 10% of the cells were initially introduced into the cells and polylysine-DNA-galactose was not changed until 12 hours. In the case of the gene delivery complex of bovine serum albumin, the introduction continued to increase until culture for 6 hours (about 55%), and more than 45% was continuously introduced after 12 hours. In the case of NIH / 3T3 cells, both the DNA-free or the gene transfer complex of galactose-modified bovine serum albumin-polylysine-DNA showed a low transduction profile of around 10%.
아시알로훼투인(asialofetuin)은 훼투인의 시알릭산을 제거하여 말단에 갈락토즈 잔기를 노출시킨 고분자로서, 본 발명의 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체와 간세포의 갈락토즈 수용체의 상호작용에 대한 길항제로서 사용하였다. 도 5는 아시알로훼투인 2 ㎎ 또는 4 ㎎을 각각 복합체와 동시에 첨가하였을 때, 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자전달 복합체의 도입이 억제되었음을 나타낸다. 아시알로훼투인 2 ㎎을 첨가했을 경우, 첨가한지 3시간 후까지, 첨가하지 않았을 때 도입된 양의 약 50% 정도 감소되었으며, 아시알로훼투인 4 ㎎을 첨가하였을 경우에는 도입이 보다 지속적으로 감소되었다. 상기와 같은 아시알로훼투인을 첨가하는 방법으로, 세포 표면에 갈락토즈 수용체가 존재하지 않는 NIH/3T3 세포에 의한 도입양상을 살펴본 결과, 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체 또는 DNA 단독 투여 시 모두 10% 내외의 낮은 도입양상을 보였다.Asialofetuin is a macromolecule obtained by removing a sialic acid of fetuin and exposing galactose residues at its ends, and the gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin of the present invention and galactose of hepatocytes. It was used as an antagonist for receptor interaction. Figure 5 shows that when 2 mg or 4 mg of asialofetuin were added simultaneously with the complex, respectively, the introduction of the gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin was inhibited. When 2 mg of asialofetuin was added, the amount was reduced by about 50% when not added until 3 hours after the addition, and when 4 mg of asialofetuin was added, the introduction continued to decrease. It became. As a method of adding asialofetuin as described above, the gene delivery complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin was examined as a result of introduction by NIH / 3T3 cells without galactose receptor on the cell surface. Alternatively, all of the DNA alone showed a low transduction pattern of about 10%.
상기 실험의 결과는 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체의 유용성을 입증하였으며, 갈락토즈 수식 고분자를 이용한 유전자 전달 복합체의 유효성을 결정하기 위한 실험실내 표준이 형성되었다.The results of this experiment demonstrated the usefulness of the gene delivery complex of polylysine-DNA-galactose modified bovine serum albumin, and an in vitro standard was established to determine the effectiveness of the gene delivery complex using galactose modified polymers.
실시예 5: 푸소제닉(Fusogenic) 펩타이드의 합성 및 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-펩타이드의 유전자 전달 복합체의 제조Example 5: Synthesis of Fusogenic Peptides and Preparation of Gene Delivery Complex of Polylysine-DNA-Galactose Modified Bovine Serum Albumin-Peptide
4 종의 푸소제닉(fusogenic) 펩타이드는 펩타이드 합성기를 사용하여 다음과 같이 제조하였다. 페놀, 에탄디티올, 티오아니솔의 존재하에 트리플루오로아세트산의 레진으로부터 펩타이드를 잘라낸 후, 에테르로 침전시켜 분리하였다. 침전된 흰색 고체 분말을 20 ㎎/㎖의 농도가 되도록 증류수에 용해시킨 다음, 밀리포아 여과기(Milex™-HV, 0.45 ㎛ 필터 단위)를 이용하여 여과하고, C18역상 크로마토그래피로 정제하였다. HPLC 시스템은 용매 전달 펌프(Hitachi L-7100), 자외선 분광 광도계(Hitachi L-7400), 컴퓨터 및 컬럼(역상, C18)으로 구성되어져 있다. 이동상은 용매 A, 0.05% 트리플루오로아세트산/물 용액, 용매 B, 0.05% 트리플루오로아세트산/아세토니트릴:물(80:20); 전개용리제 0→20% B (4분), 20→60% B (20분); 60→100% B (22분); 100→0% B (30분)이며, 유속은 1.5 ㎖/min, 파장은 220 nm에서 측정하였다.Four fusogenic peptides were prepared as follows using a peptide synthesizer. Peptides were cut out of the resin of trifluoroacetic acid in the presence of phenol, ethanedithiol and thioanisole, and then separated by precipitation with ether. The precipitated white solid powder was dissolved in distilled water to a concentration of 20 mg / ml, then filtered using a Millipore filter (Milex ™ -HV, 0.45 μm filter unit) and purified by C 18 reversed phase chromatography. The HPLC system consists of a solvent delivery pump (Hitachi L-7100), an ultraviolet spectrophotometer (Hitachi L-7400), a computer and a column (reverse phase, C 18 ). The mobile phase was solvent A, 0.05% trifluoroacetic acid / water solution, solvent B, 0.05% trifluoroacetic acid / acetonitrile: water (80:20); Developing eluent 0 → 20% B (4 min), 20 → 60% B (20 min); 60 → 100% B (22 minutes); 100 → 0% B (30 min), flow rate was 1.5 ml / min and wavelength was measured at 220 nm.
여기서, GALA는 서열 2에, INF7K1은 서열 3에, 그리고 INF6는 서열 4에 표시되어 있다, 제조된 4종의 펩타이드를 이용하여 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-펩타이드의 유전자 전달 복합체를 상기 실시예 3과 같이 제조하였다. 즉, 적량의 DNA(500 ㎍/㎖), 폴리라이신(20 ㎍/㎖) 및 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민(300 ㎍/㎖)을 각각의 멸균된 마이크로 튜브에 첨가하여 증류수로 완전히 용해시킨 다음, 교반하면서 5분 간격으로 폴리라이신 함유 용액을 15 ㎕씩 DNA 함유 튜브에 첨가한 후, 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민 함유 용액을 동일한 방법으로 천천히 첨가하여, 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민(3:0.5:1, w/w/w)의 유전자 전달 복합체를 제조하였다.Here, GALA is shown in SEQ ID NO: 2, INF7K1 in SEQ ID NO: 3, and INF6 in SEQ ID NO: 4. A gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin-peptide using four peptides prepared Was prepared as in Example 3. That is, an appropriate amount of DNA (500 [mu] g / ml), polylysine (20 [mu] g / ml) and galactose-modified bovine serum albumin (300 [mu] g / ml) were added to each sterile microtube and completely dissolved in distilled water. 15 μl of the polylysine-containing solution was added to the DNA-containing tube at 5 minute intervals with stirring, and then the galactose-modified bovine serum albumin-containing solution was slowly added in the same manner, and the polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin ( 3: 0.5: 1, w / w / w) gene delivery complexes were prepared.
상기 4종의 흰색 펩타이드 분말을 각각 1,000 ㎍/㎖의 농도로 인산 완충액(pH 8)에 용해시킨 다음, 밀리포아 여과막(Millex™-GS, 0.22 ㎛, Millipore, Molsheim, France)을 통하여 여과한 후, A210에서 분광 광도법을 사용하여 각각의 펩타이드 농도를 결정하였다. DNA:펩타이드의 비가 1:1 ∼ 5:1(w/w)이 되도록 펩타이드를 가하여 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-펩타이드의 유전자 전달 복합체를 형성한 후, 증류수를 첨가하여 DNA 농도가 100 ㎍/㎖이 되도록 희석하였다.Each of the four white peptide powders was dissolved in phosphate buffer (pH 8) at a concentration of 1,000 μg / ml, and then filtered through a Millipore filtration membrane (Millex ™ -GS, 0.22 μm, Millipore, Molsheim, France). The concentration of each peptide was determined using spectrophotometry at, A 210 . Peptide was added so that the ratio of DNA to peptide was 1: 1 to 5: 1 (w / w) to form a gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin-peptide, and then distilled water was added to the DNA concentration. Was diluted to 100 μg / ml.
실시예 6 : 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-펩타이드의 유전자 전달 복합체를 이용하여 트랜스펙션된 세포에서의 유전자 발현의 검출Example 6 Detection of Gene Expression in Transfected Cells Using a Gene Delivery Complex of Polylysine-DNA-Galactose Modified Bovine Serum Albumin-Peptide
폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-펩타이드의 유전자 전달 복합체를 이용하여 Hep G2 세포에 트렌스펙션하고, 루시퍼라제의 발현을 검출하고 복합체의 발현율에 대한 펩타이드의 영향을 확인하여 최적의 유전자 전달 체제를 설계하였다.Optimal gene delivery by transfecting Hep G2 cells using a gene delivery complex of polylysine-DNA-galactose modified bovine serum albumin-peptide, detecting the expression of luciferase and confirming the effect of the peptide on the expression rate of the complex The system was designed.
루시퍼라제 DNA를 Hep G2 세포에 도입하기 약 24시간 전에, 10% 소 태아 혈청과 2 mM 글루타민, 페니실린-스트렙토마이신 100 단위/㎖을 첨가한 DMEM-h배지(GIBCO BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)에서 배양한 Hep G2 세포를 소화액(HBSS용액중의 0.05% 트립신과 0.53 mM EDTA·4Na)으로 처리하여 세포를 24-웰 플레이트로 옮겨서 37℃/5% CO2에서 12 ∼ 18시간 동안 배양하거나, 약 70 ∼ 80% 형성될 때까지 배양하였다. 이 때에, 배지를 각 웰로부터 제거하고, 각 웰을 인산 완충액(pH 7.4) 1 ㎖로 세척하였다. 이어서, 혈청 함유 배지 0.5 ㎖을 각 웰 당 첨가하고, 상기 세포를 4시간 동안 37℃의 온도에서 배양한 후에, 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-펩타이드의 유전자 전달 복합체(10 ㎍ DNA/㎖)를 100 ㎕씩 첨가한 후, 16 ∼ 18시간동안 37℃의 온도에서배양하였다. 배양한 후에, 배지를 아스퍼레이션하고, 각 웰을 인산 완충액 1 ㎖로 세척하고 37℃의 온도에서 24시간 동안 혈청함유 배지 1 ㎖에서 배양하였다.Approximately 24 hours before the introduction of luciferase DNA into Hep G2 cells, DMEM-h medium (GIBCO BRL, Life Technologies, Grand Island, USA) was added with 10% fetal bovine serum and 100 units / ml of 2 mM glutamine, penicillin-streptomycin. NY, USA) Hep G2 cells incubated with digestion (0.05% trypsin and 0.53 mM EDTA 4Na in HBSS solution) to transfer the cells to a 24-well plate for 12-18 hours at 37 ℃ / 5% CO 2 Or incubated until about 70-80% is formed. At this time, the medium was removed from each well and each well was washed with 1 ml of phosphate buffer (pH 7.4). Subsequently, 0.5 ml of serum-containing medium was added per well, and the cells were incubated at a temperature of 37 ° C. for 4 hours before the gene delivery complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin-peptide (10 μg DNA). / ML) was added in 100 μL, and then incubated at 37 ° C. for 16-18 hours. After incubation, the medium was aspherized and each well was washed with 1 ml of phosphate buffer and incubated in 1 ml of serum-containing medium for 24 hours at a temperature of 37 ° C.
루시퍼라제의 활성 측정은 다음과 같이 수행하였다. 배지를 각 웰로부터 아스퍼레이션하고, 인산 완충액(pH 8)으로 두 번 세척한 후 소화액(HBSS용액중의 0.05% 트립신과 0.53 mM EDTA·4Na) 0.4 ㎖을 처리하고 혈청 0.05 ㎖을 첨가한 다음, 세포를 스크래이퍼로 취하여 얼음-냉각된 멸균 마이크로퓨지 튜브로 옮겼다. 세포 현탁액을 4℃에서 4분 동안 4,000 rpm으로 원심 분리하여 상청액을 아스퍼레이션으로 제거한 후, 세포 펠릿에 얼음-냉각된 250 mM 트리스(pH 7.8)/1 mM DTT의 혼합 용액 50 ㎕를 가하고 가볍게 재현탁시킨 후, 액체 질소와 37℃ 항온조에서 반복하여 동결, 해동과정을 3회 실시하여 얻어진 세포 파쇄물을 4℃의 온도에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 얼음-냉각된 멸균 마이크로퓨지 튜브에 첨가하였다.Measurement of the activity of luciferase was performed as follows. The medium was aspirated from each well, washed twice with phosphate buffer (pH 8), treated with 0.4 ml digestion (0.05% trypsin and 0.53 mM EDTA.4Na in HBSS solution), and 0.05 ml serum added. Cells were taken with a scraper and transferred to ice-cooled sterile microfuge tubes. The cell suspension was centrifuged at 4,000 rpm for 4 minutes at 4,000 rpm to remove the supernatant by asperation, and then 50 μl of a mixed solution of ice-cooled 250 mM Tris (pH 7.8) / 1 mM DTT was added to the cell pellet and gently After resuspension, the cell debris obtained by repeated freezing and thawing three times in liquid nitrogen and a 37 ° C. incubator were centrifuged at 13,000 rpm for 15 minutes at a temperature of 4 ° C. and the supernatant was ice-cooled sterile microfuge. Was added to the tube.
혼합 용액 A(25 mM 글라이실글라이신(Glycylglycine)(pH 7.8) 9 ㎖, 0.2 M ATP 100 ㎕, 1 M MgSO4100 ㎕ 및 증류수 800 ㎕) 350 ㎕를 튜브에 각각 첨가하고, 상기 상청액 10 ㎕를 첨가하여 세게 혼합한 후, 혼합 용액 B(25 mM 글라이실글라이신(Glycylglycine)(pH 7.8) 4 ㎖ 및 D-루시페린 1 ㎖)가 첨가된 형광 루미노메타(Lumar™, LB 9501, Berthold, Germany)를 사용하여 30초간 루시퍼라제 활성을 측정하였다(도 6).9 μl of mixed solution A (25 mM Glycylglycine, pH 7.8), 100 μl of 0.2 M ATP, 100 μl of 1 M MgSO 4 and 800 μl of distilled water) were added to the tube, respectively, and 10 μl of the supernatant. Fluorescent luminometer (Lumar ™, LB 9501, Berthold, Germany) to which 4 ml of mixed solution B (25 mM Glycylglycine (pH 7.8) and 1 ml of D-luciferin) were added after intensive mixing. Luciferase activity was measured for 30 seconds using (Fig. 6).
4종의 푸소제닉(fusogenic) 펩타이드중 KALA가 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민의 유전자 전달 복합체의 루시퍼라제 활성 발현을 가장 증가시킨 것으로 나타났다. GALA, INF6, 또는 INF7K1 펩타이드의 경우 매우 낮은 활성 발현을 유도하였으며, DNA 단독 또는 KALA 펩타이드가 없을 경우에도, 매우 낮은 활성 발현을 보였다. 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-KALA의 유전자 전달 복합체의 DNA:KALA의 중량비를 1:1 ∼ 1:5(w/w)로 달리하여 시험한 결과, 중량비가 1:5(w/w)일 때 최대의 루시퍼라제 활성을 보였으며, 이는 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에 비하여 30배 이상 증가된 값이다.Of the four fusogenic peptides, KALA was shown to most increase luciferase activity expression of the gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose modified bovine serum albumin. GALA, INF6, or INF7K1 peptides induced very low activity expression, and even in the absence of DNA alone or KALA peptide, very low activity expression. The weight ratio of DNA: KALA of the polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin-KALA gene delivery complex was varied from 1: 1 to 1: 5 (w / w), and the weight ratio was 1: 5 (w). / w) showed the maximum luciferase activity, which is an increase of more than 30-fold compared to the control without the peptide.
유전자 전달 벡터로 종래에 많이 사용되어 왔던 양이온성 지질-DNA 복합체의 경우에, 혈청 존재하에 트랜스펙션 활성이 급격히 저하되는 것이 보고되었으나[Lee et al.,Biol. Chem.,271, 8481 (1996)], 본 발명의 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-KALA의 유전자 전달 복합체의 경우, 혈청이 존재해도 활성이 그대로 유지되는 양상을 보였다(도 7). 이는 폴리라이신-DNA 복합체가 혈청 알부민과 유사한 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민에 이미 둘러싸여 있어서 상대적으로 혈청에 의한 불활성화를 회피할 수 있었기 때문으로 생각된다. 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-KALA의 유전자 전달 복합체에 의한 루시퍼라제 활성 발현은 기존의 칼슘-포스페이트 침전법에 의한 루시퍼라제 활성 발현값보다도 더 증가된 값이다[Reston et al.,Biochim. Biophys. Acta.,1088, 270 (1991)].In the case of cationic lipid-DNA complexes, which have been conventionally used as gene transfer vectors, it has been reported that the transfection activity is rapidly decreased in the presence of serum [Lee et al., Biol. Chem. , 271 , 8481 (1996)], in the case of the gene transfer complex of the polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin-KALA of the present invention, the activity was maintained even when serum was present (FIG. 7). This is thought to be because the polylysine-DNA complex was already surrounded by galactose-modified bovine serum albumin similar to serum albumin, which relatively avoided inactivation by serum. Luciferase activity expression by the gene transfer complex of polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin-KALA is more than that of luciferase activity by conventional calcium-phosphate precipitation methods [Reston et al., Biochim. Biophys. Acta. , 1088 , 270 (1991).
상기의 결과는 본 발명의 폴리라이신-DNA-갈락토즈 수식 소 혈청 알부민-KALA의 유전자 전달 복합체를 정맥내로 투여하여, 간세포 및 간조직으로 작용성 유전자를 전달할 수 있고, 보다 증가된 발현 효율을 가진 유전자 전달 벡터로서 사용할 수 있는 가능성을 입증하였다.The above results indicate that the gene delivery complex of the polylysine-DNA-galactose-modified bovine serum albumin-KALA of the present invention can be administered intravenously to deliver functional genes to hepatocytes and hepatic tissues, and with increased expression efficiency. The potential for use as gene transfer vectors has been demonstrated.
상기한 바와 같이, 본 발명의 폴리라이신, 루시퍼라아제 DNA, 갈락토즈 수식 소 혈청 알부민 및 서열 1에 기재된 펩타이드를 함유하는 유전자 전달 복합체는 작용성 유전자 또는 이들의 단편을 암호화하는 재조합 발현 구조물을 진핵세포, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 사람 세포로의 효율적인 전달을 중재하여 유전자의 보다 증가된 발현 효율을 갖는다. 특히, 간 질환을 치료하기 위해, 간 조직을 구성하는 간세포에 유전자를 도입하는데 적합하여, 간암, 간염, 간경화, 간경변 및 간지질을 포함하는 사람의 질환을 치료하기에 유용하다.As described above, the gene transfer complex containing the polylysine, luciferase DNA, galactose-modified bovine serum albumin of the present invention and the peptide described in SEQ ID NO: 1 eukaryotic recombinant expression constructs encoding functional genes or fragments thereof. It mediates efficient delivery to cells, preferably mammals, and more preferably human cells, to have increased expression efficiency of genes. In particular, for the treatment of liver disease, it is suitable for introducing genes into the liver cells constituting liver tissue, and is useful for treating diseases of humans including liver cancer, hepatitis, cirrhosis, cirrhosis and liver lipids.
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