KR100306331B1 - Bicyclo polyaza macrocyclocarboxylic acid complex, its conjugate, its preparation method and its use as contrast agent - Google Patents

Abstract

비사이클로폴리아자매크로사이클로카복실산과 Gd, Mn 또는 Fe 이온의 착체가 개시되었다. 착체는 생물학적 활성물질, 예를들어 항체 또는 항체 절편에 공유결합하여 결합체를 형성할 수 있다. 착체 및 결합체들은 진단 목적을 위한 조영제로서 유용하다. 착체 및 결합체의 제조방법이 개시되었다.Complexes of bicyclopolyaza macrocyclocarboxylic acids with Gd, Mn or Fe ions have been disclosed. The complex may be covalently linked to a biologically active substance, such as an antibody or antibody fragment, to form a conjugate. Complexes and conjugates are useful as contrast agents for diagnostic purposes. Methods for preparing complexes and conjugates have been disclosed.

Description

[발명의 명칭][Name of invention]

비사이클로폴리아자매크로사이클로카복실산 착체, 그의 결합체, 그의 제조방법 및 조영제로서의 그의 용도Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes, their conjugates, methods for their preparation and their use as contrast agents

[발명의 상세한 설명]Detailed description of the invention

본 발명은 자기 공명 영상화(magnetic resonance imaging, MRI)에서 조영제로서 사용하기 위한, 비사이클로폴리아자매크로사이클로카복실산을 포함하는 착체 및 그의 결합체에 관한 것이다.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to complexes and combinations thereof comprising bicyclopolyazacyclocyclocarboxylic acids for use as contrast agents in magnetic resonance imaging (MRI).

상기 착체 및 결합체의 제조방법도 역시 제공된다. 본 발명을 보다 잘 이해할 수 있도록 하기에서 MRI에 대한 간단한 배경설명이 제공된다.Methods of making such complexes and conjugates are also provided. A brief background on MRI is provided below to better understand the present invention.

[발명의 배경][Background of invention]

MRI는 동물 체내, 바람직하게는 인간 체내의 연조직의 우수한 해상도의 횡단면 이미지를 제공하는 비침습성(non-invasive) 진단기술이다.MRI is a non-invasive diagnostic technique that provides good resolution cross-sectional images of soft tissue in the animal body, preferably in the human body.

상기 기술은 자기 모멘트 [수학식에 의해 정의된 바와같음: G. M. Barrow, Physical Chemistry, 3rd Ed., McGraw-Hill, NY(1973) 참조]를 가지고 주어진 자기장에서 정렬하는 특정 원자 핵(예: 물 양성자)의 특성을 기초로 한다. 일단 정렬되면, 이러한 평형 상태는 양성자를 자기장과의 정렬상태로부터 기울게 하는 외부의 고주파(RF) 펄스를 가함으로써 교란될 수 있다. RF 펄스가 끝나면, 핵은 그들의 평형 상태로 돌아가고 이것이 일어나는데 필요한 시간은 완화시간(relaxation time)으로서 알려져 있다. 완화 시간은 스핀-격자(T1) 완화 및 스핀-스핀(T2) 완화로서 알려진 두 개의 변수로 이루어지고, 이들 완화 측정치들이 분자 구성의 정도 및 양성자와 주변 환경의 상호 작용에 대한 정보를 준다.The technique involves a specific atomic nucleus (eg, water protons) aligned in a given magnetic field with a magnetic moment (as defined by the equation: GM Barrow, Physical Chemistry, 3rd Ed., McGraw-Hill, NY (1973)). Based on the characteristics of Once aligned, this equilibrium can be disturbed by applying an external high frequency (RF) pulse that tilts the protons from alignment with the magnetic field. At the end of the RF pulses, the nuclei return to their equilibrium and the time required for this to occur is known as the relaxation time. Relaxation time consists of two variables known as spin-lattice (T1) relaxation and spin-spin (T2) relaxation, and these relaxation measures provide information about the degree of molecular composition and the interaction of protons with the surrounding environment.

살아있는 조직의 수분함량은 상당하고 조직(type)간에 함량 및 환경에 있어서 변화가 존재하므로, 양성자 밀도 및 완화 시간을 반영하는 생물학적 유기체의 진단상이 수득된다. 검사하는 조직내에 존재하는 양성자의 완화시간(T1 및 T2)의 차이가 클수록, 수득된 상에서 콘트라스트가 커진다[J. Magnetic Resonance 33, 83-106 (1979)].Since the moisture content of living tissue is significant and there is a change in content and environment between types, a diagnosis of biological organisms is obtained that reflects proton density and relaxation time. The greater the difference in relaxation time (T1 and T2) of protons present in the tissue being examined, the greater the contrast in the obtained phase [J. Magnetic Resonance 33, 83-106 (1979).

대칭성 전자 기저 상태를 갖는 상자성(paramagnetic) 킬레이트는 가까운 위치의 물 양성자의 T1 및 T2 완화 속도에 극적으로 영향을 줄 수 있고, 이러한 점에서 킬레이트의 유효성은 부분적으로 자기 모멘트를 제공하는 부대전자(unpaird electrons)의 수에 관련된다는 것이 공지되어 있다[Magnetic Resonance Annual 231-266 Raven Press, NY(1985)]. 또한 이러한 유형의 상자성 킬레이트가 살아있는 동물에 투여될 때, 다양한 조직의 T1 및 T2에 대한 그의 효과가 직접 관찰되었고, 킬레이트 집중 지역에서 증가된 콘트라스트가 관찰된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, MRI에 의해 얻어진 진단정보를 증대시키기 위해 안정한 무독성 상자성 킬레이트를 동물에 투여하는 것이 제안되어 왔다[Frontiers of Biol. Energetics 1, 752-759(1978); J. Nucl. Med. 25, 506-513(1984); Proc. of NMR Imaging Symp. (Oct. 26-27, 1980); F. A. Cotton et at., Adv. Inorg. Chem. 634-639(1966)]. 이러한 방식으로 사용된 상자성 감속 킬레이트는 콘트라스트 증강제 또는 조영제로서 명명된다.Paramagnetic chelates with symmetrical electron ground states can dramatically affect the T1 and T2 relaxation rates of water protons in close proximity, in which the effectiveness of the chelates is in part unpaired, providing a magnetic moment. It is known to relate to the number of electrons (Magnetic Resonance Annual 231-266 Raven Press, NY (1985)). It has also been found that when this type of paramagnetic chelate is administered to living animals its effects on T1 and T2 of various tissues are directly observed and increased contrast is observed in the chelate concentration zones. Therefore, it has been proposed to administer stable nontoxic paramagnetic chelates to animals to augment the diagnostic information obtained by MRI [Frontiers of Biol. Energetics 1, 752-759 (1978); J. Nucl. Med. 25, 506-513 (1984); Proc. of NMR Imaging Symp. (Oct. 26-27, 1980); F. A. Cotton et at., Adv. Inorg. Chem. 634-639 (1966). Paramagnetic slowing chelates used in this manner are termed contrast enhancers or contrast agents.

MRI 조영제의 고안에 착수하는 경우, 다수의 상자성 금속 이온을 고려할 수 있다. 그렇지만, 실제로 가장 유용한 상자성 금속 이온은 가돌리늄(Gd⁺³), 철(Fe⁺³), 망간(Mn⁺²) 및 (Mn⁺³), 및 크롬(Cr⁺³)이며, 그 이유는 상기 이온들이 그들의 큰 자성 모멘트 덕분에 물 양성자에 대해 가장 큰 효과를 나타내기 때문이다. 비-착화 형태(예를들어, GdCl₃)에서, 상기 금속 이온들은 동물에게 유독하므로, 단순한 염 형태로의 이들의 사용은 배제된다. 따라서, 유기 킬레이트화제(리간드로서도 역시 언급됨)의 기본적인 역할은 주변의 물 양성자의 T1 및 T2 완화 속도에 대한 그의 바람직한 영향은 유지하면서 동물에게 무독성인 상자성 금속을 제공하는 것이다.When embarking on the design of MRI contrast agents, a number of paramagnetic metal ions can be considered. In practice, however, the most useful paramagnetic metal ions are gadolinium (Gd ⁺³ ), iron (Fe ⁺³ ), manganese (Mn ⁺² ) and (Mn ⁺³ ), and chromium (Cr ⁺³ ), because the ions This is because they have the greatest effect on water protons thanks to their large magnetic moment. In non-complexed forms (eg GdCl ₃ ), the metal ions are toxic to animals, so their use in simple salt form is ruled out. Thus, the basic role of organic chelating agents (also referred to as ligands) is to provide non-toxic paramagnetic metals to animals while maintaining their desirable effect on the T1 and T2 relaxation rates of surrounding water protons.

MRI 분야의 기술은 매우 광범위하여, 철저하게 하려한 것은 아니지만, 하기 요약은 단지 상기 분야 및 구조에 있어서 거의 유사한 다른 화합물에 대한 개관으로서 제공된 것이다. 미합중국 특허 제 4,899,755 호는 Fe⁺³-에틸렌-비스(2-하이드록실페닐글리신) 착체 및 그의 유도체를 사용하여 동물의 간 또는 담관에서 양성자 NMR 완화 시간을 변경하는 방법을 개시하고, 다양한 다른 화합물들중에서 피리딘 매크로사이클로메틸렌 카복실산의 가능한 용도를 제시하고 있다. 미합중국 특허 제 4,880,008 호(미합중국 특허 제 4,899,755 호의 CIP)는 래트의 간조직에 대한 추가의 상 데이터를 개시하고 있으나, 어떠한 부가적인 화합물도 밝히지 않는다. 미합중국 특허 제 4,980,148 호는 비-환식 화합물인 MRI에 대한 가돌리늄 착체를 개시하고 있다. 브론등의 문헌[C. J. Broan et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1739-1741(1990)]은 몇몇 이 작용성 매크로사이클릭 포스핀산 화합물을 기술한다. 브론등의 문헌[C. J. Broan et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1738-1739(1990)]은 트리아자비사이클로 화합물인 화합물들을 기술한다. 애잼리 등의 문헌[I. K. Adzamli et al., J. Med. Chem. 32, 139-144(1989)]은 NMR 상을 위한 가돌리늄 착체의 비환식 포스포네이트 유도체를 기술한다.The technology in the field of MRI is very extensive and not intended to be exhaustive, but the following summary is merely provided as an overview of other compounds that are almost similar in the field and structure. US Pat. No. 4,899,755 discloses a method of altering proton NMR relaxation time in the liver or bile duct of an animal using Fe ^{+ 3} -ethylene-bis (2-hydroxyphenylglycine) complex and derivatives thereof, and various other compounds Among them, possible uses of pyridine macrocyclomethylene carboxylic acid are suggested. U.S. Patent 4,880,008 (CIP of U.S. Patent 4,899,755) discloses additional phase data for liver tissue of rats, but does not reveal any additional compounds. U.S. Patent No. 4,980,148 discloses gadolinium complexes for MRI, which are non-cyclic compounds. Bron et al., CJ Broan et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1739-1741 (1990) describe several bifunctional macrocyclic phosphinic acid compounds. Bron et al., CJ Broan et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1738-1739 (1990), describe compounds that are triazabicyclo compounds. Ajamley et al., IK Adzamli et al., J. Med. Chem. 32, 139-144 (1989) describe acyclic phosphonate derivatives of gadolinium complexes for NMR images.

요즈음, 미합중국에서 구입할 수 있는 시판되는 유일한 조영제는 가돌리늄과 디에틸트리아민펜타아세트산의 착체이다(DTPA-Gd⁺³-MAGNEVIST^TM, Shering 사 제품). MAGNEVIST^TM는 세포외액에 자유롭게 분포한 후, 비뇨기계를 통해 효과적으로 제거되므로 비-특이적/관류제로서 간주된다. 뇌 손상에 수반하는 혈액/뇌 장벽의 파괴가 환부내로 조영제의 관류를 허용하므로 MAGNEVIST^TM는 뇌 손상의 진단에 있어 극히 유용한 것으로 밝혀졌다. MAGNEVIST^TM외에, 게르벳사(Guerbet)가 대환식 관류제(DOTAREM^TM)를 상업적으로 시판하고 있으며 이는 현재 유럽에서만 구입할 수 있다. 다수의 다른 유력한 조영제들이 다양한 계발 단계에 있다.These days, the only commercially available contrast agent available in the United States is a complex of gadolinium and diethyltriaminepentaacetic acid (DTPA-Gd ^{+ 3-} MAGNEVIST ^™ , available from Shering). MAGNEVIST ^™ is considered a non-specific / perfusion agent because it is freely distributed in the extracellular fluid and then effectively removed through the urinary system. MAGNEVIST ^™ has been found to be extremely useful in the diagnosis of brain injury, as the destruction of the blood / brain barrier accompanying brain injury allows perfusion of contrast medium into the affected area. In addition to MAGNEVIST ^™ , Guerbet commercially markets DOTAREM ^™ , which is currently only available in Europe. Many other potent contrast agents are in various stages of development.

비-특이적/관류제 보다는, 영상화 하고자 하는 조직에 대한 부위 특이성을 가질 수 있는 조영제가 개발된다면 유리할 것이다. 본 발명은 Gd⁺³, Mn⁺²또는 Fe⁺³으로부터 선택된 금속이온과 착화된 하기 식(I)의 비사이클로폴리아자매크로사이클로카복실산인 리간드를 포함하는 신규한 착체 및 약제학적으로 허용되는 그의 염에 관한 것이다.It would be advantageous if contrast agents were developed that could have site specificity for the tissue to be imaged rather than non-specific / perfusion agents. The present invention provides a novel complex comprising a ligand which is a bicyclopolyazacyclocyclocarboxylic acid of formula (I) complexed with a metal ion selected from Gd ⁺³ , Mn ⁺² or Fe ⁺³ and a pharmaceutically acceptable salt thereof It is about.

상기식에서,In the above formula,

(상기식들에서, X 및 Y는 독립적으로 H, OH, C₁-C₃알킬 또는 COOH 이고;Wherein X and Y are independently H, OH, C ₁ -C ₃ alkyl or COOH;

R⁷은 H 또는 OH 이며;R ⁷ is H or OH;

R⁴는 H, NO₂, NH₂, 이소티오시아네이토, 세미카브아지도, 티오세미카브아지도, 말레이미도, 브로모아세트아미도 또는 카복실임);R ⁴ is H, NO ₂ , NH ₂ , isothiocyanato, semicarbagedo, thiosemicarbagedo, maleimido, bromoacetamido or carboxyl);

단, 적어도 2개의 R은이어야 하며;Provided that at least two R's Must be;

A는 CH, N, C-Br, C-Cl, C-OR¹, C-OR², N⁺-R³X^-또는이고A is CH, N, C-Br, C-Cl, C-OR ¹ , C-OR ² , N ⁺ -R ³ X ^- or ego

(상기식들에서, R¹은 H, C₁-C₅알킬, 벤질, 또는 적어도 하나의 R⁴로 치환된 벤질이고;In which R ¹ is H, C ₁ -C ₅ alkyl, benzyl, or benzyl substituted with at least one R ⁴ ;

R²는 C₁-C₁₆알킬아미노이고;R ² is C ₁ -C ₁₆ alkylamino;

R³은 C₁-C₁₆알킬, 벤질, 또는 적어도 하나의 R⁴로 치환된 벤질이고;R ³ is C ₁ -C ₁₆ alkyl, benzyl, or benzyl substituted with at least one R ⁴ ;

R⁴은 상기에 정의된 바와같고;R ⁴ is as defined above;

X^-는 Cl^-, Br^-, I^-또는 H₃CCO₂ ^-임);X ^- is Cl ^-, Br ^-, I ^- or H ₃ CCO ₂ ^- Im);

Q 및 Z는 독립적으로 CH, N, N⁺-R³X^-, C-CH₂-OR¹또는 C-C(O)-R⁵이고Q and Z independently are ^{CH, N, N + -R 3} X -, C-CH 2 -OR 1 or CC (O) -R ⁵ and

(상기식들에서, R¹및 R³은 상기에 정의된 바와 같고;Wherein R ¹ and R ³ are as defined above;

R⁵는 -O-(C₁-C₃알킬), OH 또는 NHR⁶(여기에서, R⁶는 C₁-C₅알킬 또는 생물학적 활성 물질임)이며;R ⁵ is —O— (C ₁ -C ₃ alkyl), OH or NHR ⁶ , wherein R ⁶ is C ₁ -C ₅ alkyl or a biologically active substance;

X^-는 상기에 정의된 바와 같음);X ⁻ is as defined above);

단, a) Q, A 또는 Z가 N 또는 N⁺-R³X^-이면, 다른 두 그룹들은 CH 이어야 하고;However, a) Q, A or Z is N or N ⁺ -R ³ X ^- If, the other two groups and must be CH;

b) A가 C-Br, C-Cl, C-OR¹또는 C-OR²이면, Q 및 Z는 둘다 CH 이어야 하고;b) if A is C-Br, C-Cl, C-OR ¹ or C-OR ^2, then both Q and Z must be CH;

c) R², R⁴및 R⁶가 존재할 경우, 그들의 합은 1을 초과할 수 없으며;c) when R ² , R ⁴ and R ⁶ are present their sum cannot exceed 1;

d) Q 또는 Z 중 단 하나만이 C-C(O)-R⁵일 수 있고, Q 또는 Z 중 하나가 C-C(O)-R⁵이면, A는 CH 이어야 한다.d) If only one of Q or Z can be CC (O) -R ⁵ , and if either Q or Z is CC (O) -R ^5, then A must be CH.

식(I)의 이작용성 착체는 본 발명의 결합체를 제조하기에 바람직하다. 그러한 리간드들은 반드시 하나의 R이Difunctional complexes of formula (I) are preferred for preparing the conjugates of the invention. Such ligands must have one R

R이R is

이거나 Or

(상기식에서, R⁴및 R⁷은 상기에 정의된 바와 같음);In which R ⁴ and R ⁷ are as defined above;

A가 C-OR¹, C-OR²(여기에서, R¹및 R²는 상기에 정의된 바와 같음) 또는 하기식의 것이거나A is C-OR ¹ , C-OR ² , wherein R ¹ and R ² are as defined above, or of the formula

(상기식에서, R⁴는 상기에 정의된 바와 같음);In which R ⁴ is as defined above;

A가 CH 이고, Q 또는 Z 중의 하나가 CH이고 다른 하나는 C-C(O)-R⁵또는 C-CH₂-OR¹(여기에서, R¹및 R⁵는 상기에 정의된 바와 같음)이고;A is CH, one of Q or Z is CH and the other is CC (O) —R ⁵ or C—CH ₂ —OR ¹ , wherein R ¹ and R ⁵ are as defined above;

특히 R⁵는 NHR⁶(여기에서, R⁶는 생물학적 활성물질임)인 리간드들이다.In particular R ⁵ are ligands that are NHR ⁶ , wherein R ⁶ is a biologically active substance.

식(I)의 리간드들은 가돌리늄(Gd⁺³), 철(Fe⁺³) 및 망간(Mn⁺²), 바람직하게는 Gd⁺³과 같은 다양한 금속 이온과 착체를 형성한다. 이렇게 형성된 착체들은 그 자체로서 사용되거나 덱스트란, 폴리펩티드, 또는 항체 또는 그의 절편을 포함하는 생물학적 활성 분자와 같은 더 큰 분자에 공유결합함으로써 부착되고 진단목적으로 사용될 수 있다. 상기의 결합체 및 착체들은 조영제로서 유용하다.The ligands of formula (I) form complexes with various metal ions such as gadolinium (Gd ⁺³ ), iron (Fe ⁺³ ) and manganese (Mn ⁺² ), preferably Gd ⁺³ . The complexes thus formed can be used as such or attached and diagnostically used by covalent attachment to larger molecules such as dextran, polypeptides, or biologically active molecules, including antibodies or fragments thereof. The above conjugates and complexes are useful as contrast agents.

본 발명의 착체 및 결합체는 특이적인 총 전하를 제공하도록 변형될 수 있다. 예를들어, 금속 이온이 +3 일 때 하기의 것들을 얻을 수 있다:Complexes and conjugates of the invention can be modified to provide specific total charges. For example, when the metal ion is +3, the following can be obtained:

(A) 총 중성 전하(A) total neutral charge

R이이고;R is ego;

X 및 Y가 모두 H인 경우;X and Y are both H;

(B) 총 +1 전하(B) total +1 charge

A, Q 또는 Z 중의 하나가 N⁺-R³X^-(여기에서, R³및 X^-는 상기에 정의된 바와같음)이고;One of A, Q or Z is N ⁺ -R ³ X ^- wherein R ³ and X ^- are as defined above;

세 개의 R이이고;Three R ego;

X 및 Y는 모두 H와 같거나; 또는X and Y are both equal to H; or

A, Q 및 Z가 CH 이고; X 및 Y가 H 이고;A, Q and Z are CH; X and Y are H;

하나의 R이 H 일 때.When one R is H.

착체 및 결합체는 모두 동물에 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 형태로 조제될 수 있다. 암과 같은 질병 상태의 진단을 위해 본 발명의 리간드를 다른 금속 이온과 함께 사용하는 것도 가능하다. 상기의 착체 및 결합체의 용도는 또다른 동시계류중인 출원에 논의되어 있다.Both complexes and conjugates may be formulated in a pharmaceutically acceptable form for administration to an animal. It is also possible to use the ligands of the present invention with other metal ions for the diagnosis of disease states such as cancer. The use of such complexes and conjugates is discussed in another co-pending application.

착체는 명명할 목적으로 하기와 같이 번호가 매겨진 식(I)의 리간드를 가진다.The complex has ligands of formula (I) numbered as follows for naming purposes.

본 발명은 목적하는 조직으로 조영제의 부위 특이적 전달을 가능케 하는 중성 또는 +1 전하를 갖는 조영제의 개발에 관한 것이다. 관심 지역에서의 증가된 콘트라스트의 이점은, 세포외 약제를 사용했을 때 분명하거나 분명하지 않을 수 있는 비특이적 관류로부터 비롯된 콘트라스트에 대조적으로 조직 친화성에 기초한다. 식(I)의 리간드의 특이성은 착체의 총 전하 및 친유성 특성을 조정함으로써 조절될 수 있다. 착체의 전하의 전체적 범위는 +1 내지 0이다. 예를 들어, +1 총 전하를 가진 착체에 대해서는 심장 및/또는 뼈로의 흡수가 예상되는 반면; 착체의 총 전하가 0 일때(따라서 중성), 착체는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 능력을 가질 수 있고 정상적인 뇌의 흡수가 가능할 수 있다.The present invention relates to the development of a contrast agent with a neutral or +1 charge which allows for site specific delivery of the contrast agent to the tissue of interest. The benefit of increased contrast in the region of interest is based on tissue affinity in contrast to contrast resulting from nonspecific perfusion that may or may not be apparent when using extracellular agents. The specificity of the ligand of formula (I) can be adjusted by adjusting the total charge and lipophilic properties of the complex. The overall range of charge of the complex is from +1 to 0. For example, absorption into the heart and / or bone is expected for complexes with +1 total charge; When the total charge of the complex is zero (and therefore neutral), the complex may have the ability to cross the blood brain barrier and allow for normal brain absorption.

조직 특이성은 원하는 표적 조직에 대해 특이성을 갖는 천연 또는 합성 거대 분자에 대한 킬레이트의 이온성 또는 공유 결합성 부착에 의해서도 역시 실현될 수 있다. 상기 접근 방법의 가능한 한 가지 응용방법은 환부 조직에 상자성 킬레이트를 수송하여 MRI에 의한 시각화를 가능하게 하는 킬레이트 결합된 단일 클론성 항체의 사용을 통한 것이다. 또한, 거대분자에 대한 상자성 킬레이트의 부착은 조영제의 능률을 더욱 증가시켜 비결합된 킬레이트에 비해 개선된 콘트라스트를 일으킬 수 있다. 로퍼에 의한 최근의 연구(미합중국 특허 제 4,880,008 호 및 제 4,899,755 호)는 친유성의 변화가 조직-특이적 약제를 야기할 수 있고 증가된 친유성 특성은 혈액 단백질과의 비-공유결합성 상호작용을 선호하여 완화도의 상승을 야기한다는 것을 증명하였다.Tissue specificity can also be realized by ionic or covalent attachment of chelates to natural or synthetic macromolecules having specificity for the desired target tissue. One possible application of this approach is through the use of chelated bound monoclonal antibodies that transport paramagnetic chelates to affected tissue to allow visualization by MRI. In addition, the attachment of paramagnetic chelates to macromolecules can further increase the efficiency of the contrast agent, resulting in improved contrast compared to unbound chelates. Recent studies by loafers (US Pat. Nos. 4,880,008 and 4,899,755) have shown that changes in lipophilicity can lead to tissue-specific agents and increased lipophilic properties result in non-covalent interactions with blood proteins. Preference has been shown to cause an increase in mitigation.

또한, 중성전하를 가진 식(I)의 본원 조영제는, 킬레이트와 단백질 사이의 바람직하지 않은 이온성 상호 작용이 최소화되어 항체 면역 반응성을 유지하므로 본 발명의 결합체를 형성하기에 특히 바람직하다. 또한 본 발명의 중성 착체는 DTPA-Gd⁺³에 비해 삼투성을 감소시키므로, 주사시 불쾌감을 경감시킬 수 있다.In addition, the contrast agent of formula (I) having a neutral charge is particularly preferred for forming the conjugates of the present invention since the undesirable ionic interaction between the chelate and the protein is minimized to maintain antibody immune reactivity. In addition, since the neutral complex of the present invention reduces osmoticity as compared to DTPA-Gd ⁺³ , it can reduce the discomfort during injection.

이론에 의해 구속되고자 하는 것은 아니지만, 대전된(예를들어, 심장을 위한 +1) 본 발명의 착체가 만들어지면, 상기 킬레이트 이온성 전하의 변화가 생체내 편재에 영향을 줄 수 있다고 믿어진다. 그러므로, 만약 항체 또는 다른 지시 잔기가 동일한 부위에 대하여 특이적이라면, 결합체는 부위 특이적 전달을 돕기 위한 두개의 부분을 나타내게 된다.While not wishing to be bound by theory, it is believed that changes in the chelate ionic charge can affect in vivo ubiquity when the complex of the present invention is made charged (eg, +1 for the heart). Therefore, if the antibody or other indicator residues are specific for the same site, the conjugate will show two parts to aid site specific delivery.

식(I) 및 본 발명에 사용된 용어들은 하기와 같이 더 정의된다.The terms used in formula (I) and the present invention are further defined as follows.

“C₁-C₃알킬”, “C₁-C₅알킬”, “C₁-C₁₈알킬”은 직쇄 및 측쇄 알킬 그룹을 모두 포함한다.“C ₁ -C ₃ alkyl”, “C ₁ -C ₅ alkyl”, “C ₁ -C ₁₈ alkyl” include both straight and branched chain alkyl groups.

“동물”은 온혈 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함한다."Animal" includes warm blooded mammals, preferably humans.

“생물학적 활성물질”은 예를들어, 덱스트린, 펩타이드, 또는 수용체에 대한 특이적 친화성을 갖는 분자, 또는 바람직하게는 항체 또는 항체 절편을 말한다.A “biologically active substance” refers to a molecule, or preferably an antibody or antibody fragment, that has a specific affinity for, for example, dextrin, peptide, or receptor.

“항체”는 다클론성, 단클론성, 키메라형 항체 또는 이종항체중 어느 것, 바람직하게는 단클론성 항체를 말한다. “항체 절편”은 Fab 절편 및 F(ab′)₂절편, 및 목적 항원 결정기 또는 항원 결정기들에 대해 특이성을 갖는 항체의 어느 부분을 포함한다. “방사선 금속 킬레이트/항체 결합체” 또는 “결합체”라는 용어를 사용할 때, “항체”는 반합성 또는 유전공학적 변형체를 포함하여, 전항체 및/또는 항체 절편을 포함하도록 되어 있다. 가능한 항체들은 1116-NS-19-9(항-결장직장암), 1116-NS-3d(항-CEA), 703D4(항-인간폐암), 704A1(항-인간폐암), CC49(항-TAG-72), CC83(항-TAG-72) 및 B72.3 이다. 하이브리도마 세포주 1116-NS-19-9, 1116-NS-3d, 703D4, 704A1, CC49, CC83 및 B72.3은 아메리칸 타입컬쳐 콜렉션에 기탁번호 ATCC HB 8059, ATCC CRL 8019, ATCC HB 8301, ATCC HB 8302, ATCC HB 9459, ATCC HB 9453 및 ATCC HB 8108로 각각 기탁되었다."Antibody" refers to any of polyclonal, monoclonal, chimeric, or heterologous antibodies, preferably monoclonal antibodies. “Antibody fragments” include Fab fragments and F (ab ′) ₂ fragments, and any portion of an antibody having specificity for the desired antigenic determinant or antigenic determinants. When using the term “radioactive metal chelate / antibody conjugate” or “conjugate”, “antibody” is intended to include whole antibodies and / or antibody fragments, including semisynthetic or genetically modified variants. Possible antibodies include 1116-NS-19-9 (anti- colorectal cancer), 1116-NS-3d (anti-CEA), 703D4 (anti-human lung cancer), 704A1 (anti-human lung cancer), CC49 (anti-TAG- 72), CC83 (anti-TAG-72) and B72.3. Hybridoma cell lines 1116-NS-19-9, 1116-NS-3d, 703D4, 704A1, CC49, CC83, and B72.3 have been deposited in the American TypeCulture Collection No. ATCC HB 8059, ATCC CRL 8019, ATCC HB 8301, ATCC Deposited as HB 8302, ATCC HB 9459, ATCC HB 9453 and ATCC HB 8108, respectively.

본원에서 사용된 “착체”는 금속 이온과 착화된 본 발명 화합물, 예를들어 식(I)의 착체(여기에서, 적어도 하나의 금속 원자는 킬레이트됨)를 말한다; “결합체”는 항체 또는 항체 절편에 공유결합에 의해 부착된 금속 이온 킬레이트를 말한다. “이 작용성 배위자(coordinator)”, “이작용성 킬레이트화제” 및 “작용화된 킬란트(chelant)”는 상호교환적으로 사용되고, 금속 이온을 킬레이트할 수 있는 킬란트 부분 및 항체 또는 항체 절편에 공유결합에 의해 부착되기 위한 수단으로서 작용할 수 있는 킬란트 부분에 공유 결합된 부분을 갖는 화합물을 말한다.As used herein, “complex” refers to a compound of the invention complexed with a metal ion, such as a complex of formula (I), wherein at least one metal atom is chelated; “Conjugate” refers to a metal ion chelate attached covalently to an antibody or antibody fragment. “Coordinator,” “bifunctional chelating agent,” and “functionalized chelant” are used interchangeably and are directed to chelate moieties and antibodies or antibody fragments that can chelate metal ions. It refers to a compound having a portion covalently bound to a chelant moiety that can act as a means for attachment by covalent bonds.

본원에 기술된 이작용성 킬레이트화제(식(I)로 나타냄)는 금속이온을 킬레이트화하여 금속 이온 킬레이트(본원에서 “착체”로서도 역시 언급됨)를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 작용화 부분(식(I)에서 R², R⁴및 R⁶로 나타냄)의 존재 때문에, 착체는 덱스트란, 수용체에 대해 특이적 친화성을 갖는 분자와 같은 생물학적 활성 물질에 공유결합에 의해 부착될 수 있거나, 바람직하게는 항체 또는 항체 절편에 공유 결합에 의해 부착될 수 있다. 이렇게 본 원에 기술된 착체는 항체 또는 항체 절편에 공유결합에 의해 부착될 수 있거나 수용체에 대해 특이적 친화성을 가지며, 본원에서 “결합체”로서 언급된다.The bifunctional chelating agents described herein (indicated by Formula (I)) can be used to chelate metal ions to form metal ion chelates (also referred to herein as “complexes”). Due to the presence of the functionalized moiety (represented by R ² , R ⁴ and R ⁶ in formula (I)), the complex is covalently attached to a biologically active substance such as dextran, a molecule having specific affinity for the receptor. Or, preferably, covalently attached to the antibody or antibody fragment. Thus the complexes described herein may be covalently attached to an antibody or antibody fragment or have a specific affinity for a receptor and are referred to herein as “conjugates”.

본 원에 사용된, “약제학적으로 허용되는 염”은 동물, 바람직하게는 포유동물의 치료 또는 진단에 유용할 정도로 충분히 무독성인 식(I)의 착체 또는 결합체의 임의의 염 또는 염들의 혼합물을 의미한다. 이렇게, 염들은 본 발명에 따라 유용하다. 대표적인 염들은 예를들어, 황산, 염산, 인산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 락트산, 말레산, 푸마르산, 팔미트산, 콜산, 팔모산, 점액산, 글루탐산, 글루콘산, d-캄포르산, 글루타르산, 글리콜산, 프탈산, 타르타르산, 포름산, 라우르산, 스테르산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 소르브산, 피크르산, 벤조산, 신남산 및 다른 적당한 산을 포함하는 유기 및 무기 원 양쪽으로부터 표준 반응에 의해 형성된 염들이다. 또한 암모늄 또는 1-데옥시-1-(메틸아미노)-D-글루시톨과 같은 유기 및 무기 원, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온 및 다른 유사한 이온으로부터 표준 반응에 의해 형성된 염들이 포함된다. 특히 바람직한 것들은 염이 칼륨, 나트륨 또는 암모늄인 식(I)의 착체 또는 결합체의 염들이다. 또한 상기 염들의 혼합물도 역시 포함된다.As used herein, a “pharmaceutically acceptable salt” refers to any salt or mixture of salts of a complex or combination of formula (I) that is nontoxic enough to be useful for the treatment or diagnosis of an animal, preferably a mammal. it means. As such, salts are useful according to the invention. Representative salts are, for example, sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, succinic acid, citric acid, lactic acid, maleic acid, fumaric acid, palmitic acid, cholic acid, palmoic acid, slime acid, glutamic acid, gluconic acid, d-camphoric acid, glutamic acid Organic and inorganic sources including tartaric acid, glycolic acid, phthalic acid, tartaric acid, formic acid, lauric acid, steric acid, salicylic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, sorbic acid, picric acid, benzoic acid, cinnamic acid and other suitable acids Salts formed by standard reactions from both sides. Also included are salts formed by standard reactions from organic and inorganic sources such as ammonium or 1-deoxy-1- (methylamino) -D-glucinol, alkali metal ions, alkaline earth metal ions and other similar ions. Particularly preferred are the salts of the complex or conjugate of formula (I) wherein the salt is potassium, sodium or ammonium. Also included are mixtures of these salts.

본 발명의 착체 또는 결합체는 식(I)의 리간드를 포함한다. 리간드들은 다양한 방법으로 제조된다. 상기 방법에 대한 통상적인 일반적 합성 방법은 하기에 주어진 반응도식들에 의해 제공된다.Complexes or conjugates of the present invention include a ligand of formula (I). Ligands are prepared in a variety of ways. Typical general synthetic methods for this method are provided by the schemes given below.

도식 1에서는, Q, A 및 Z는 CH 이고, 하나의 R은 H이고 다른 두 개의 R은 하기 식과 같거나 세 개의 R이 모두 하기 식과 같은 식(I)의 화합물이 제조된다.In Scheme 1, compounds of formula (I) are prepared in which Q, A and Z are CH, one R is H and the other two R are as follows, or all three R are as shown below.

[도식 1]Scheme 1

도식 2는 A가 C-Br이고 Q 및 Z가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.Scheme 2 produces a compound of formula (I) wherein A is C-Br and Q and Z are CH.

[도식 2]Scheme 2

도식 3은 A가이고; R⁴가 H, NO₂, NH₂또는 SCN 이며; Q 및 Z가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.Scheme 3 has A ego; R ⁴ is H, NO ₂ , NH ₂ or SCN; Prepare compounds of formula (I) wherein Q and Z are CH.

[도식 3]Scheme 3

도식 4는 A가 C-OR²(여기에서, R²는 C₁-C₅알킬아미노임)이고; Q 및 Z가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.Scheme 4 wherein A is C-OR ² , wherein R ² is C ₁ -C ₅ alkylamino; Prepare compounds of formula (I) wherein Q and Z are CH.

[도식 4]Scheme 4

도식 5는 A가 CH이고, Q 또는 Z 중의 하나는 CH이고 다른 Q 또는 Z는 C-C(O)-R⁶또는 C-CH₂-R⁶(여기에서, R⁶는 상기 정의된 바와 같다)인 식(I)의 화합물을 제조한다.Scheme 5 wherein A is CH, one of Q or Z is CH and the other Q or Z is CC (O) -R ⁶ or C-CH ₂ -R ⁶ , wherein R ⁶ is as defined above. The compound of formula (I) is prepared.

[도식 5]Scheme 5

도식 6은 Z가 C-CH₂-OB_Z또는 C-C(O)-R⁵(여기에서, R⁵는 -O-(C₁-C₃알킬), OH 또는 NHR⁶(여기에서, R⁶는 상기에 정의된 바와 같음)임)이고; Q 및 A가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.Scheme 6 shows that Z is C-CH ₂ -OB _Z or CC (O) -R ⁵ , wherein R ⁵ is -O- (C ₁ -C ₃ alkyl), OH or NHR ⁶ (wherein R ⁶ is As defined above); Prepare compounds of formula (I) wherein Q and A are CH.

[도식 6]Scheme 6

도식 7은 A가 N 또는 N⁺-R⁵X^-(여기에서, R⁵는 C₁-C₁₆알킬이고 X^-는 할라이드임)이고; Q 및 Z가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.Scheme 7 wherein A is N or N ⁺ -R ⁵ X ^- wherein R ⁵ is C ₁ -C ₁₆ alkyl and X ^- is halide; Prepare compounds of formula (I) wherein Q and Z are CH.

[도식 7]Scheme 7

도식 8은 Q가 N⁺-R⁵X^-(여기에서, R⁵는 C₁-C₁₆알킬이고, X^-는 할라이드임)이고; A 및 Z가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.Scheme 8 wherein Q is N ⁺ -R ⁵ X ^- wherein R ⁵ is C ₁ -C ₁₆ alkyl and X ^- is halide; To prepare a compound of formula (I) wherein A and Z are CH.

[도식 8]Scheme 8

도식 9는 Q가 N 또는 N⁺-R⁵X^-(여기에서, R⁵는 C₁-C₁₆알킬이고, X^-는 할라이드임)이고; A 및 Z가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.Scheme 9 wherein Q is N or N ⁺ -R ⁵ X ^- wherein R ⁵ is C ₁ -C ₁₆ alkyl and X ^- is halide; To prepare a compound of formula (I) wherein A and Z are CH.

[도식 9]Scheme 9

도식 10은 6번 위치의 R이 Scheme 10 shows that R at position 6

(상기식에서, R⁴는 NO₂또는 NH₂임)이고; A, Q 및 Z가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.Wherein R ⁴ is NO ₂ or NH ₂ ; Prepare compounds of formula (I) wherein A, Q and Z are CH.

[도식 10]Scheme 10

도식 11은 9번 위치의 R이 Scheme 11 shows that R in position 9

(상기식에서, R⁴는 NO₂또는 NH₂임)이고; A, Q 및 Z가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.Wherein R ⁴ is NO ₂ or NH ₂ ; Prepare compounds of formula (I) wherein A, Q and Z are CH.

[도식 11]Scheme 11

도식 12는 n이 1(그러나 n이 2 또는 3이면 시약의 상응하는 변화로 역시 적용할 수 있다)이고;Scheme 12 is where n is 1 (but if n is 2 or 3, also applicable to the corresponding change in reagent);

6번 위치의 R이R at position 6

(상기식에서, R¹은 -OH 임)인 T를 가지고; X 및 Y가 H이고 3번 및 9번 위치의 R이 COOH인 T를 가지고; A, O 및 Z가 CH인 식(I)의 화합물을 제조한다.(Wherein R ¹ is —OH); X and Y are H and R in positions 3 and 9 have COOH; To prepare a compound of formula (I) wherein A, O and Z are CH.

[도식 12]Scheme 12

상기 도식에서, 일반적 공정 설명은 목적 반응 단계를 수행하는데 이용할 수도 있는 구체적 단계를 예시한다. 상기 공정 단계의 일반적 설명은 다음과 같다.In the above schemes, the general process description illustrates the specific steps that may be used to carry out the desired reaction step. A general description of the process steps follows.

합성 도식 1은 티오닐 클로라이드를 사용한 상업적으로 시판하는 비스피리딜알콜(1)의 할로겐화로 개시된다. 알콜을 친전자성 기질로 전환시키기 위한 유사한 절차, 예를 들면 톨루엔 설포닐 클로라이드, HBr 또는 HCl로 처리하는 공정은, 후속적인 폐환 반응에서 우수하게 작용하는 유사한 반응성을 갖는 생성물을 생성할 것이다. 대환화 절차는 문헌에서 많이 찾아볼 수 있으며, 목적하는 테트라아자대환(3)은 문헌[Stetter et al., Tetrahedron 37, 767-772(1981)]의 방법에 따라 제조하였다. 보다 온화한 조건을 이용하여 양호한 수율의 유사한 대환을 수득하는 보다 일반적인 절차가 공개되었다[A.D. Sherry et al., J. Org. Chem. 54, 2990-2992(1987)]. 중간체 대환(3)의 탈토실화[(4)를 수득함]는 산성 조건하에서 양호한 수율로 달성된다. 환원직 탈토실화 절차는 또한 문헌에 공지되어 있으며 본 발명의 반응 순서에 적응될 수 있다.Synthetic Scheme 1 begins with the halogenation of a commercially available bispyridyl alcohol (1) with thionyl chloride. Similar procedures for converting alcohols to electrophilic substrates, such as the treatment with toluene sulfonyl chloride, HBr or HCl, will produce products with similar reactivity that will work well in subsequent ring closure reactions. Macrocycling procedures can be found in the literature, and the desired tetraazacyclic ring (3) was prepared according to the method of Stetter et al., Tetrahedron 37, 767-772 (1981). More general procedures have been published, using milder conditions to obtain a similar yield in good yield [A.D. Sherry et al., J. Org. Chem. 54, 2990-2992 (1987). Detosylation of the intermediate ring 3 (to obtain (4)) is achieved in good yield under acidic conditions. Reductive rectification detosylation procedures are also known in the literature and can be adapted to the reaction sequence of the present invention.

도식 10, 11 및 12는 대환식 질소 위치중 하나에 방향족 니트로벤질 치환체를 도입하는 합성 방법을 서술하고 있다. 통상적으로, 대환식 아민을 아세토니트릴 또는 DMF와 같은 유기 용매중에서 상온으로 탄산 칼륨과 같은 비-친핵성 염기를 사용하여 모노-N-작용화한다. 그 다음, 나머지 질소 위치에 대한 추가적인 작용화는 앞의 도식들에 기술된 방법 및 조건에 의해 수행한다. 목적 킬레이트화 잔기의 도입후에, 수중 산화 백금 및 수소를 사용하여 니트로 그룹을 환원시킨다. 이러한 형태에서, 킬레이트화제는 보다 큰 합성 또는 천연 분자에 부착할 수 있도록 하는 결합 기술과 양립할 수 있다.Schemes 10, 11 and 12 describe synthetic methods for introducing aromatic nitrobenzyl substituents at one of the cyclocyclic nitrogen positions. Typically, the cyclocyclic amine is mono-N-functionalized with a non-nucleophilic base such as potassium carbonate at room temperature in an organic solvent such as acetonitrile or DMF. Further functionalization of the remaining nitrogen positions is then carried out by the methods and conditions described in the previous schemes. After introduction of the desired chelating moiety, the nitro group is reduced using platinum oxide and hydrogen in water. In this form, the chelating agent is compatible with binding techniques that allow for attachment to larger synthetic or natural molecules.

본 발명의 착체를 형성시키기 위해 사용된 금속 이온은 Gd⁺³, Mn⁺², Fe⁺³이며, 예를 들면 알드리치 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Company)에서 상업적으로 시판한다. 존재하는 음이온은 할라이드, 바람직하게는 클로라이드이거나 또는 염을 함유하지 않는 상태이다(산화 금속).Metal ions used to form the complexes of the present invention are Gd ⁺³ , Mn ⁺² , Fe ⁺³ and are commercially available, for example, from Aldrich Chemical Company. The anions present are halides, preferably chlorides or free from salts (metal oxides).

본 발명의 “상자성 핵종”은 스핀 각 운동량 및/또는 오비탈 각 운동량을 나타내는 금속 이온을 의미한다. 2 가지 유형의 운동량을 조합하여, 부대전자를 갖는 원자에 주로 의존하고 상기 원자의 환경에 약간 의존하는 방식으로 관찰된 상자성 모멘트를 제공한다. 본 발명의 실시에 유용한 것으로 밝혀진 상자성 핵종은 가돌리늄(Gd⁺³), 철(Fe⁺³) 및 망간(Mn⁺²)이며, Gd⁺³가 바람직하다.By “paramagnetic nuclide” of the present invention is meant a metal ion representing spin angular momentum and / or orbital angular momentum. The two types of momentum are combined to give the paramagnetic moments observed in a way that depends mainly on the atom with the quasi-electron and slightly depends on the environment of the atom. Paramagnetic nuclides found to be useful in the practice of the present invention are gadolinium (Gd ⁺³ ), iron (Fe ⁺³ ) and manganese (Mn ⁺² ), with Gd ⁺³ being preferred.

착체는 당해분야에 공지된 방법으로 제조한다. 따라서, 예를 들면 문헌[Chelating Agents and Metal Chelates, Dwyer & Meller, Academic Press(1964), Chapter 7]을 참조하시오. 또한 문헌[Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, (edited by Kameko, et al.,)john Wiley & Sons(1974)]의 아미노산 제조방법을 참조하시오. 착체 제조방법의 한 예는 5 내지 7의 pH에서 수성 조건하에 비사이클로폴리아자매크로사이클로포스폰산을 금속 이온과 반응시킴을 포함한다. 형성된 착체는 화학 결합에 의한 것이며, 안정한, 예를 들면 리간드로부터 상자성 핵종의 분리에 대하여 안정한, 상자성 핵종 조성물을 생성한다.Complexes are prepared by methods known in the art. Thus, see, eg, Chelating Agents and Metal Chelates, Dwyer & Meller, Academic Press (1964), Chapter 7. See also Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, (edited by Kameko, et al., John Wiley & Sons (1974)). One example of a method for preparing a complex includes reacting a bicyclopolyazacyclocyclophosphonic acid with a metal ion under aqueous conditions at a pH of 5-7. The complex formed is by chemical bonding and produces a paramagnetic nuclide composition that is stable, for example, against separation of paramagnetic nuclides from ligands.

본 발명의 착체는 약 1:1 이상, 바람직하게는 1:1 내지 3:1, 보다 바람직하게는 1:1 내지 1.5:1의 리간드 대 금속의 몰비로 투여한다. 착화되지 않은 리간드는 동물에 독성이거나 또는 심박동 정지 또는 저 칼슘형성 경련을 유발할 수도 있으므로, 매우 과량의 리간드는 바람직하지 않다.The complexes of the present invention are administered in a molar ratio of ligand to metal of at least about 1: 1, preferably 1: 1 to 3: 1, more preferably 1: 1 to 1.5: 1. Unconjugated ligands are toxic to animals or may cause cardiac arrest or low calcium formation cramps, so very excess ligands are undesirable.

본원에 기술한 결합체에 사용할 수도 있는 항체 또는 항체 절편은 당해분야에 공지된 기법으로 제조할 수 있다. 매우 특이적인 단클론성 항체는 당해분야에 공지된 하이드리드화 기법으로 생성시킬 수 있다(예를 들면 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497(1975)] 및 [Eur. J. Immunol, 6, 511-519(1976)]참조). 상기 항체는 정상적으로 매우 특이적인 반응성을 갖는다. 항체 표면적화 결합체에서, 임의의 목적 항원 또는 불완전 항원(hasten)에 대해 유도된 항체를 사용할 수도 있다. 결합체에 사용된 항체는 단클론성 항체 또는 목적 항원결정기(들)에 대해 높은 특이성을 갖는 그의 절편인 것이 바람직하다. 본 발명에 사용된 항체는 예를 들면, 종양, 세균, 곰팡이, 바이러스, 기생균, 마이코플라스마, 분화 및 기타 세포막 항원, 병원체 표면 항원, 독소, 효소, 알레르겐, 약물 및 임의의 생물학적 활성 분자에 대해 유도될 수도 있다. 항체 및 항체 절편의 몇몇 예는 1116-NS-19-9, 1116-NS-3d, 703D4, 704A1, CC49, CC83 및 B72.3 이다. 이들 항체는 모두 ATCC에 기탁되었다. 보다 완전한 항원 목록은 미합중국 특허 제 4,193,983 호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 결합체는 다양한 암의 진단에 특히 바람직하다.Antibodies or antibody fragments that may be used in the conjugates described herein can be prepared by techniques known in the art. Highly specific monoclonal antibodies can be produced by hydriding techniques known in the art (see, eg, Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)) and Eur. J. Immunol, 6 , 511-519 (1976). The antibody normally has very specific reactivity. In antibody surface area conjugates, antibodies directed against any desired antigen or incomplete antigen (hasten) may be used. The antibody used for the conjugate is preferably a monoclonal antibody or fragment thereof having high specificity for the desired epitope (s). Antibodies used in the present invention are induced against, for example, tumors, bacteria, fungi, viruses, parasites, mycoplasma, differentiation and other cell membrane antigens, pathogen surface antigens, toxins, enzymes, allergens, drugs and any biologically active molecules. May be Some examples of antibodies and antibody fragments are 1116-NS-19-9, 1116-NS-3d, 703D4, 704A1, CC49, CC83, and B72.3. All these antibodies have been deposited with the ATCC. A more complete list of antigens can be found in US Pat. No. 4,193,983. The conjugates of the present invention are particularly preferred for the diagnosis of various cancers.

본 발명은 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클과 함께 이용된다. 상기 제제를 제조하는 방법은 공지되어 있다. 상기 제제는 현탁액, 주사액 또는 기타 적합한 제제의 형태일 수 있다. 보조제의 존재 또는 부재하에 생리학적으로 허용되는 현탁 매질을 사용할 수 있다.The present invention is used with physiologically acceptable carriers, excipients or vehicles. Methods of preparing such formulations are known. The formulations may be in the form of suspensions, injections or other suitable formulations. Physiologically acceptable suspension media can be used in the presence or absence of an adjuvant.

“유효량”의 제제를 진단에 사용한다. 용량은 질환 및 동물의 신체적 변수, 예를 들면 중량에 따라 달라진다. 생체내 진단도 또한 본 발명의 제제를 사용한다.An "effective amount" formulation is used for diagnosis. Dosage depends on the disease and physical parameters of the animal, eg weight. In vivo diagnostics also use the formulations of the invention.

본 발명의 몇몇 킬레이트화제의 다른 용도로는 신체로부터 바람직하지 않은 금속(예: 철)의 제거, 다양한 목적, 예를 들면 진단 시약으로서의 목적을 위한 중합체 지지체에 부착 및 선택적 추출에 의한 금속 이온의 제거가 포함될 수 있다. 적어도 2 개의 R에 P(O)R¹OH에 해당하는 T를 갖는 일반식(I)의 리간드는 스케일 억제제로서 금속 이온 조절에 사용할 수도 있다. 상기 리간드는 화학양론적 양보다 적은 양으로 사용할 수 있다. 미합중국 특허 제 2,609,390; 3,331,773; 3,336,221 및 3,434,969 호에 개시된 화합물에 대해 유사한 용도가 알려져 있다.Other uses of some chelating agents of the present invention include the removal of undesirable metals (eg iron) from the body, attachment to polymeric supports for various purposes, for example as diagnostic reagents and removal of metal ions by selective extraction. May be included. Ligands of formula (I) having T corresponding to P (O) R ¹ OH in at least two Rs may also be used for metal ion regulation as scale inhibitors. The ligand may be used in an amount less than the stoichiometric amount. US Patent No. 2,609,390; 3,331,773; Similar uses are known for the compounds disclosed in 3,336,221 and 3,434,969.

본 발명은 하기 실시예를 참조로 보다 명확해질 것이며, 실시예는 본 발명을 단지 예시하려는 것 뿐이다.The present invention will become more apparent with reference to the following examples, which are intended only to illustrate the invention.

하기 실시예에 사용된 일부 용어는 다음과 같이 정의된다:Some terms used in the following examples are defined as follows:

LC = 액체 크로마토그래피, 정제는 수동으로 팩킹된 Q-세파로즈(Q-Sepharose)^TM음이온 교환 컬럼(23 x 2cm)이 장착된 Dionex 2010i 시스템을 사용하여 저압에서 수행하였다.LC = liquid chromatography, purification was performed at low pressure using a Dionex 2010i system equipped with a manually packed Q-Sepharose ^™ anion exchange column (23 × 2 cm).

DMF = 디메틸포름아미드DMF = dimethylformamide

AcOH = 아세트산AcOH = acetic acid

ICP = 유도적으로 커플링된 플라스마ICP = Inductively Coupled Plasma

g = 그램g = grams

mg = 밀리그램mg = milligrams

kg = 킬로그램kg = kilograms

㎖ = 밀리리터Ml = milliliters

㎕ = 마이크로리터Μl = microliters

[pH 안정성 일반 절차][pH stability general procedure]

0.1N HCl 중의 3 x 10^-4M¹⁵⁹GdCl₃2㎕를 3 x 10^-4M GdCl₃담체 용액 2㎖에 가하여¹⁵⁹GdCl₃또는¹⁵³SmCl₃모액을 제조하였다. 이어서, 탈이온수중의 적절한 리간드 용액을 제조하였다. 이어서, 리간드(100 내지 500㎕의 탈이온수에 용해시킨 것)를 2㎖의¹⁵⁹GdCl₃모액과 합한 후, 완전히 혼합시켜 산성 용액(pH=2)을 수득함으로써 1:1 리간드/금속 착체를 제조하였다.2 μl of 3 × 10 ⁻⁴ M ¹⁵⁹ GdCl ₃ in 0.1N HCl was added to 2 mL of 3 × 10 ⁻⁴ M GdCl ₃ carrier solution to prepare a ¹⁵⁹ GdCl ₃ or ¹⁵³ SmCl ₃ mother liquor. Then an appropriate ligand solution in deionized water was prepared. The ligand (dissolved in 100-500 μl deionized water) was then combined with 2 ml of ¹⁵⁹ GdCl ₃ mother liquor and then thoroughly mixed to give an acidic solution (pH = 2) to prepare a 1: 1 ligand / metal complex. It was.

이어서, 용액의 pH를 0.1N NaOH를 사용하여 7.0 으로 상승시켰다. 이어서, 착체 용액 시료를 세파덱스(Sephadex)^TMG-50 컬럼에 통과시키고, 4:1 식염수(85% NaCl/NH₄OH)로 용출시킨 후, 2 x 3㎖ 분획을 수거하여 착체로서의 금속 %를 측정하였다. 그 후, 합한 용출액중에서의 방사능의 양을 수지위에 잔류하는 것(비-착화된 금속은 수지상에 잔류한다)과 비교하였다. 1M NaOH 또는 1M HCl을 사용하여 착체 용액 분취량의 pH를 조정하고 전술한 이온 교환 방법을 사용하여 착체로서 존재하는 금속의 %를 측정함으로써 pH 안정성 프로필을 제작하였다. Sm 결과는 실험적 비교에 의해 본 발명 리간드의 착화 및 생체내분포에 대해 동일한 것으로 알려졌다.The pH of the solution was then raised to 7.0 with 0.1 N NaOH. The complex solution sample was then passed through a Sephadex ^™ G-50 column, eluted with 4: 1 saline (85% NaCl / NH ₄ OH), and then a 2 × 3 mL fraction was collected to give the% of metal as a complex. Was measured. Thereafter, the amount of radioactivity in the combined eluates was compared to remaining on the resin (non-complexed metal remained on the resin). PH stability profiles were prepared by adjusting the pH of the complex solution aliquot using 1M NaOH or 1M HCl and measuring the percentage of metal present as complex using the ion exchange method described above. Sm results were found to be identical for complexing and in vivo distribution of the ligands of the invention by experimental comparison.

[출발 물질][Departure material]

[실시예 A]Example A

[2,6-비스(클로로메틸)피리딘의 제조][Production of 2,6-bis (chloromethyl) pyridine]

냉각(빙욕)시킨 티오닐 클로라이드 100㎖에 24g(0.17몰)의 2,6-비스(하이드록시메틸)피리딘을 가하였다. 30 분후에, 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 1.5시간동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후에, 생성된 고체를 여과시키고, 벤젠으로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 이어서, 고체를 포화 NaHCO₃로 중화시키고, 여과한 후, 건조시켜 23.1g(71.5%)의 표제 생성물을 회색을 띤 백색 결정성 고체(융점 74.5-75.5℃)로서 수득하였다.24 g (0.17 mol) of 2,6-bis (hydroxymethyl) pyridine was added to 100 ml of cooled (frozen) thionyl chloride. After 30 minutes, the reaction mixture was allowed to warm to room temperature and refluxed for 1.5 hours. After cooling the reaction mixture to room temperature, the resulting solid was filtered, washed with benzene and dried under vacuum. The solid was then neutralized with saturated NaHCO ₃ , filtered and dried to give 23.1 g (71.5%) of the title product as a greyish white crystalline solid (melting point 74.5-75.5 ° C.).

생성물의 다른 특성:Other properties of the product:

¹H NMR(CDCl₃) ; δ 4.88(s, 4H), 7.25-7.95(m, 3H). ¹ H NMR (CDCl ₃ ); δ 4.88 (s, 4H), 7.25-7.95 (m, 3H).

[실시예 B]Example B

[3,6,9-트리스(P-톨릴설포닐)-3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔의 제조][Preparation of 3,6,9-tris (P-tolylsulfonyl) -3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene]

1,4,7-트리스(p-톨릴설포닐)디에틸렌트리아민 이나트륨 염 6.9g(11.4 밀리몰)의 DMF 용액(92㎖)을 교반하고 질소하에 100℃로 가열하였다. 용액에 37㎖의 DMF 중의 2,6-비스(클로로메틸)피리딘(실시예 A의 절차로 제조함) 2g(11.4밀리몰)을 45분간 적가하였다. 첨가가 완료되면 반응 혼합물을 40℃에서 12시간동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물에 50 내지 75㎖의 물을 가하여 NaCl이 즉시 용해된 후, 표제 생성물이 침전되었다. 그후, 생성된 슬러리를 여과시키고 고체를 물로 세척한 후 진공하에 건조시켰다. 표제 생성물 6.5g(86%)(융점 168-170℃, 분해)을 연한 갈색 분말로 수득하였다.6.9 g (11.4 mmol) of DMF solution (92 mL) of 1,4,7-tris (p-tolylsulfonyl) diethylenetriamine disodium salt was stirred and heated to 100 ° C. under nitrogen. To the solution was added dropwise 2 g (11.4 mmol) 2,6-bis (chloromethyl) pyridine (prepared in the procedure of Example A) in 37 mL of DMF for 45 minutes. When the addition was complete the reaction mixture was stirred at 40 ° C. for 12 h. Then, 50-75 mL of water was added to the reaction mixture to immediately dissolve NaCl, and then the title product precipitated out. The resulting slurry was then filtered and the solid washed with water and dried under vacuum. 6.5 g (86%) of the title product (melting point 168-170 ° C., decomposition) were obtained as a light brown powder.

생성물의 다른 특성:Other properties of the product:

¹H NMR(CDCl₃) ¹ H NMR (CDCl ₃ )

δ 2.40(s, 3H), 2.44(s, 6H), 2.75(m, 4H), 3.30(m, 4H), 4.28(s, 4H), 7.27(d, 2H), 7.34(d, 4H), 7.43(d, 2H), 7.65(d, 4H), 7.75(t, 1H); 및δ 2.40 (s, 3H), 2.44 (s, 6H), 2.75 (m, 4H), 3.30 (m, 4H), 4.28 (s, 4H), 7.27 (d, 2H), 7.34 (d, 4H), 7.43 (d, 2 H), 7.65 (d, 4 H), 7.75 (t, 1 H); And

¹³C NMR ¹³ C NMR

δ 21.48, 47.29, 50.37, 54.86, 124.19, 127.00, 127.11, 129.73, 135.04, 135.74, 138,95, 143.42, 143.73, 155.15.δ 21.48, 47.29, 50.37, 54.86, 124.19, 127.00, 127.11, 129.73, 135.04, 135.74, 138,95, 143.42, 143.73, 155.15.

[실시예 C]Example C

[3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔의 제조][Production of 3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene]

48% HBr과 빙초산을 64:35 비로 혼합하여 HBr과 AcOH의 용액을 제조하였다. 112㎖의 HBr/AcOH 혼합물에 5.5g(8.2밀리몰)의 3,6,9-트리스(p-톨릴설포닐)-3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔(실시예 B의 절차로 제조)을 가하고, 반응 혼합물을 72 시간동안 지속적으로 교반하면서 온화하게 가열 환류시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 원래 부피의 대략 1/10로 농축시켰다. 남은 용액을 격렬하게 교반하고, 15 내지 20㎖의 디에틸 에테르를 가하였다. 생성된 회색을 띤 백색 고체를 여과시켜, 디에틸 에테르로 세척하고, 진공하에 건조시켰다. 이어서, 무수 테트라하이드로브로마이드 염을 10㎖의 물에 용해시키고, NaOH(50% w/w)로 pH 9.5로 조정하고, 클로로포름으로 4 시간동안 계속 추출하였다. 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 후에, 클로로포름을 증발시켜 연한갈색 오일을 수득하고, 상기 오일을 실온에서 방치시켜 서서히 결정화하여 1.2g(71%)의 표제 생성물(융점 86-88℃)을 수득하였다.A solution of HBr and AcOH was prepared by mixing 48% HBr and glacial acetic acid in a 64:35 ratio. 5.5 g (8.2 mmol) of 3,6,9-tris (p-tolylsulfonyl) -3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 in 112 ml HBr / AcOH mixture (15), 11, 13-triene (prepared in the procedure of Example B) was added and the reaction mixture was heated to reflux with gentle stirring for 72 hours. The reaction mixture was then cooled to room temperature and concentrated to approximately 1/10 of the original volume. The remaining solution was stirred vigorously and 15-20 mL of diethyl ether was added. The resulting greyish white solid was filtered off, washed with diethyl ether and dried under vacuum. The anhydrous tetrahydrobromide salt was then dissolved in 10 ml of water, adjusted to pH 9.5 with NaOH (50% w / w) and extraction continued with chloroform for 4 hours. After drying over anhydrous sodium sulfate, chloroform was evaporated to give a light brown oil which was left at room temperature to slowly crystallize to give 1.2 g (71%) of the title product (melting point 86-88 ° C.).

생성물의 다른 특성:Other properties of the product:

¹H NMR(CDCl₃) ¹ H NMR (CDCl ₃ )

δ 2.21(m, 4H), 2.59(m, 4H), 3.06(s, 3H), 3.85(s, 4H), 6.89(d, 2H), 7.44(t, 1H); 및δ 2.21 (m, 4H), 2.59 (m, 4H), 3.06 (s, 3H), 3.85 (s, 4H), 6.89 (d, 2H), 7.44 (t, 1H); And

¹³C NMR δ 48.73, 49.01, 53.63, 119.67, 136.29, 159.54. ¹³ C NMR δ 48.73, 49.01, 53.63, 119.67, 136.29, 159.54.

[실시예 D]Example D

[3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,6,9-트리아세트산(PCTA)의 제조][Production of 3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene-3,6,9-triacetic acid (PCTA)]

2.1g(15밀리몰)의 브로모아세트산의 수용액(15㎖)을 실온에서 교반하면서 0.8g(3.8 밀리몰)의 3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔(실시예 C의 절차로 제조)에 가하였다. 완전히 용해된 후, 반응 혼합물을 빙욕으로 냉각시키고 NaOH(50% W/W)를 서서히 가함으로써 pH를 9로 조정하였다. 소량의 NaOH를 가함으로써 반응이 끝날때까지 pH를 9로 유지시켰다. 1.5 시간후 pH를 계속 조사하면서 반응혼합물을 60℃로 가온시켰다. pH가 더 이상 떨어지지 않으면, 반응물을 실온으로 냉각시키고 수용액을 동결 건조시켜 백색 고체를 수득하였다. 이어서, 고체를 최소량의 뜨거운 물에 용해시키고 실온에서 12 시간동안 방치한다. 생성된 결정을 여과하고 진공하에 건조시켜 1.2g(70%)의 표제 생성물을 삼나트륨 염(융점 378-380℃)으로서 수득하였다.0.8 g (3.8 mmol) of 3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15) was stirred at room temperature with 2.1 g (15 mmol) aqueous solution of bromoacetic acid (15 mL). ), 11, 13-triene (prepared in the procedure of Example C). After complete dissolution, the reaction mixture was cooled in an ice bath and the pH was adjusted to 9 by the slow addition of NaOH (50% W / W). A small amount of NaOH was added to keep the pH at 9 until the end of the reaction. After 1.5 hours the reaction mixture was warmed to 60 ° C. while the pH was continuously investigated. If the pH no longer dropped, the reaction was cooled to room temperature and the aqueous solution was lyophilized to yield a white solid. The solid is then dissolved in a minimum amount of hot water and left at room temperature for 12 hours. The resulting crystals were filtered and dried in vacuo to yield 1.2 g (70%) of the title product as trisodium salt (melting point 378-380 ° C.).

생성물의 다른 특성:Other properties of the product:

¹H NMR(D₂O) δ 2.76(m, 4H), 3.36(m, 4H), 3.47(s, 2H), 4.10(s, 4H), 7.31(d, 2H), 7.84(t, 1H); 및 ¹ H NMR (D ₂ O) δ 2.76 (m, 4H), 3.36 (m, 4H), 3.47 (s, 2H), 4.10 (s, 4H), 7.31 (d, 2H), 7.84 (t, 1H) ; And

¹³C NMR δ 53.83, 57.31, 57.40, 59.48, 62.36, 125.47, 143.72, 152.67, 172.15, 177.41. ¹³ C NMR δ 53.83, 57.31, 57.40, 59.48, 62.36, 125.47, 143.72, 152.67, 172.15, 177.41.

[실시예 E]Example E

[3,9-비스(나트륨 메틸렌설포네이트)-3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔(PC2S)의 제조][Production of 3,9-bis (sodium methylenesulfonate) -3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene (PC2S)]

1.03g(50 밀리몰)의 3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔(실시예 C의 절차로 제조)의 수용액(10.0㎖) 및 0.5㎖의 진한 HCl의 용액을 실온에서 10분간 교반하였다. 생성된 용액을 8.6의 pH를 갖는다. 이어서, 1.37g(10.2 밀리몰)의 HOCH₂SO₃Na 및 5㎖의 탈이온수를 용액에 가하였다. 이어서, 60℃에서 10분간 용액을 가열하였고, pH는 5.6 이었다. 냉각시킨 후에, 1M 수산화나트륨으로 pH를 9.0으로 조정한 후, 동결건조시켜 목적 생성물을 백색 고체(정량적 수율)로서 수득하였다.Aqueous solution of 1.03 g (50 mmol) of 3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene (prepared in the procedure of Example C) (10.0) Ml) and 0.5 ml of concentrated HCl were stirred for 10 minutes at room temperature. The resulting solution has a pH of 8.6. Then 1.37 g (10.2 mmol) of HOCH ₂ SO ₃ Na and 5 mL of deionized water were added to the solution. The solution was then heated at 60 ° C. for 10 minutes and the pH was 5.6. After cooling, the pH was adjusted to 9.0 with 1M sodium hydroxide and then lyophilized to give the desired product as a white solid (quantitative yield).

생성물의 다른 특성:Other properties of the product:

¹H NMR(D₂O) ¹ H NMR (D ₂ O)

δ 2.87(t, 4H), 3.18(t, 4H), 3.85(s, 4H), 4.11(s, 4H), 7.03(d, 2H), 7.55(t, 1H); 및δ 2.87 (t, 4H), 3.18 (t, 4H), 3.85 (s, 4H), 4.11 (s, 4H), 7.03 (d, 2H), 7.55 (t, 1H); And

¹³C NMR(D₂O) δ 48.52, 54.04, 58.92, 79.09, 123.90, 141.37, 161.87. ¹³ C NMR (D ₂ O) δ 48.52, 54.04, 58.92, 79.09, 123.90, 141.37, 161.87.

[실시예 F]Example F

[3,9-비스(메틸렌니트릴)-3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔의 제조][Production of 3,9-bis (methylenenitrile) -3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene]

10㎖의 3,9-비스(나트륨 메틸렌설포네이트)-3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔(실시예 E의 절차로 제조)의 수용액에 10㎖의 0.06g(12.24 밀리몰)의 시안화나트륨을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 용액의 pH는 약 10 이었다. 진한 수산화 나타륨으로 pH를 13 이상으로 조정하여 침전된 생성물을 클로로포름(3 x 20㎖)으로 추출한 후, 황산 마그네늄으로 건조시키고, 여과시켰다. 용매를 제거하고 진공하에 농축시켜 목적 생성물 1.00g(71%)을 왁스상 백색 분말로서 단리하였다.10 ml of 3,9-bis (sodium methylenesulfonate) -3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene (of Example E 10 mL of 0.06 g (12.24 mmol) sodium cyanide was added to the aqueous solution of the procedure). The reaction mixture was stirred at rt for 3 h. The pH of the solution was about 10. The precipitated product was extracted with chloroform (3 x 20 mL) by adjusting the pH above 13 with concentrated sodium hydroxide, dried over magnesium sulfate and filtered. The solvent was removed and concentrated in vacuo to isolate 1.00 g (71%) of the desired product as a waxy white powder.

생성물의 다른 특성:Other properties of the product:

¹H NMR(CDCl₃) ¹ H NMR (CDCl ₃ )

δ 2.03(brs, 4H), 2.64(m, 4H), 3.82(s, 4H), 3.90(s, 4H), 7.14(d, 2H), 7.62(t, 1H); 및δ 2.03 (brs, 4H), 2.64 (m, 4H), 3.82 (s, 4H), 3.90 (s, 4H), 7.14 (d, 2H), 7.62 (t, 1H); And

¹³C NMR(CDCl₃) ¹³ C NMR (CDCl ₃ )

δ 46.08, 46.64, 52.89, 60.78, 115.31, 122.02, 137.57, 157.33.δ 46.08, 46.64, 52.89, 60.78, 115.31, 122.02, 137.57, 157.33.

[실시예 G]Example G

[3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,9-디메틸렌니트릴-6-(2-메톡시-5-니트로페닐)메틸 아세테이트의 제조][3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene-3,9-dimethylenenitrile-6- (2-methoxy-5- Preparation of Nitrophenyl) Methyl Acetate]

200mg(0.73 밀리몰)의 3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,9-디메틸렌니트릴(실시예 F의 절차로 제조)의 THF 용액 7㎖에 223mg(0.73 밀리몰)의 브로모-(2-메톡시-5-니트로페닐)메틸아세테이트를 가하였다. 생성된 용액을 실온에서 12 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물에 100mg의 K₂CO₃를 가하고 혼합물을 2시간동안 더 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고 여액을 진공하에 농축시켰다. 이어서 생성된 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 5% CH₃OH/CHCl₃)로 정제하였다.200 mg (0.73 mmol) of 3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene-3,9-dimethylenenitrile (Procedure of Example F 223 mg (0.73 mmol) of bromo- (2-methoxy-5-nitrophenyl) methylacetate was added to 7 ml of THF solution. The resulting solution was stirred at rt for 12 h. 100 mg of K ₂ CO ₃ was added to the reaction mixture, and the mixture was further stirred for 2 hours. The reaction mixture was then filtered and the filtrate was concentrated in vacuo. The resulting crude product was then purified by column chromatography (silica gel, 5% CH ₃ OH / CHCl ₃ ).

[실시예 H]Example H

[3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,9-아세트산-6-(2-메톡시-5-니트로페닐)아세트산의 제조][3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene-3,9-acetic acid-6- (2-methoxy-5-nitrophenyl ) Production of Acetic Acid]

3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,9-디메틸렌티르릴-6-(2-메톡시-5-니트로페닐)메틸 아세테이트(실시예 G의 절차로 제조)를 6N HCl 중에서 환류하에 12시간동안 교반하였다. 이어서, 용액을 냉각시키고 진공하에 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 물에 용해시키고 동결 건조시켜 목적 생성물을 수득하였다.3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene-3,9-dimethyllentyryl-6- (2-methoxy-5- Nitrophenyl) methyl acetate (prepared in the procedure of Example G) was stirred for 12 h at reflux in 6N HCl. The solution was then cooled and concentrated in vacuo. The residue was then dissolved in water and freeze dried to afford the desired product.

[실시예 I]Example I

[3,9-디아세트산-3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리옌(PC2A)의 제조][Production of 3,9-diacetic acid-3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene (PC2A)]

30㎖의 HCl(37%) 및 mg(2.5 밀리몰)의 3,9-비스(메틸렌니트릴)-3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔(실시예 F의 절차로 제조)의 진한 수용액을 환류하에 2시간동안 가열하였다. 냉각후, 수용액을 증발건조시킨 후, 탈이온수(2 x 10㎖)로 공동증발시켜 과량의 HCl을 제거하였다. 진한 NaOH를 사용하여 반응 혼합물의 pH를 7로 조정하였다. 생성된 중성 용액을 먼저 탈이온수로, 이어서 1M HCl로 용출되는 양이온 교환 컬럼(SP-세파로즈^TM, 1.5 x 50cm)상에서 크로마토그래피하였다. 생성물을 포함하는 산성 분획을 증발 건조시킨 후, 탈 이온수(3 x 10㎖)와 함께 공동 증발시켜 과량의 HCl을 제거하였다. 진한 수용액을 동결건조시켜 최종 생성물을 백색 고체로서 단리하였다.30 mL of HCl (37%) and mg (2.5 mmol) of 3,9-bis (methylenenitrile) -3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11 A concentrated aqueous solution of, 13-triene (prepared in the procedure of Example F) was heated under reflux for 2 hours. After cooling, the aqueous solution was evaporated to dryness and then co-evaporated with deionized water (2 × 10 mL) to remove excess HCl. Concentrated NaOH was used to adjust the pH of the reaction mixture to 7. The resulting neutral solution was chromatographed on a cation exchange column (SP-Sepharose ^™ , 1.5 × 50 cm) eluted first with deionized water and then with 1M HCl. The acidic fraction containing the product was evaporated to dryness and then co-evaporated with deionized water (3 × 10 mL) to remove excess HCl. The concentrated aqueous solution was lyophilized to isolate the final product as a white solid.

생성물의 다른 특성:Other properties of the product:

¹H NMR(D₂O) ¹ H NMR (D ₂ O)

δ 2.84(s br, 4H), 3.18(m, 4H), 3.77(s, 4H), 4.35(s, 4H), 7.63(d, 2H), 8.23(t, 1H); 및δ 2.84 (s br, 4H), 3.18 (m, 4H), 3.77 (s, 4H), 4.35 (s, 4H), 7.63 (d, 2H), 8.23 (t, 1H); And

¹³C NMR(D₂O) ¹³ C NMR (D ₂ O)

δ 47.45, 54.33, 59.73, 60.36, 127.20, 149.31, 155.60, 177.74.δ 47.45, 54.33, 59.73, 60.36, 127.20, 149.31, 155.60, 177.74.

[최종 생성물][Final product]

[실시예 1]Example 1

[¹⁵³Sm-3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,6,9-트리메틸렌카복실산(¹⁵³Sm-PCTA)의 착체의 제조][ ¹⁵³ Sm-3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene-3,6,9-trimethylenecarboxylic acid ( ¹⁵³ Sm-PCTA) Preparation of Complexes]

3.8mg의 리단드를 0.517㎖의 탈이온수(pH=2)에 용해시킴으로써 실시예 D의 리간드의 용액을 제조하였다. 이어서, 40㎕의 리간드 용액을 미량의¹⁵³SmCl₃을 함유하는 수성 SmCl₃·H₂O(0.01N HCl 중의 3 x 10^-4M) 2㎖와 합하여 1:1 리간드/금속 착체를 제조하였다. 완전히 혼합한 후, 착체 용액의 시료를 세파덱스^TM컬럼을 통해 통과시키고, 4:1 염수(0.85% Nacl/NH₄OH)로 용출시키고, 2 x 3㎖ 분획을 수거함으로써 착체로서의 금속%를 측정하였다. 이어서, 합한 용출액중의 방사능의 양을 수지상에 남은 것과 비교하였다. 이러한 조건하에서, 착체는 용출물로 제거되고 비-착화된 금속은 수지상에 잔류한다. 이러한 방법으로 착화(complexation)는 92%로 측정되었다. 수지를 통과한 용액의 시료를 pH 연구를 위해 사용하였다. 이어서, 상기의 일반 절차를 사용하여 pH 안정성을 측정하였다. 수지를 통과한 후 표제 생성물에 대한 착화는 1:1의 리간드 대 금속 비율에서 98% 이상으로 측정되었다.A solution of the ligand of Example D was prepared by dissolving 3.8 mg of redand in 0.517 mL of deionized water (pH = 2). Then a 1: 1 ligand / metal complex was prepared by combining 40 μL of ligand solution with ₂ mL of aqueous SmCl ₃ · H ₂ O (3 × 10 ⁻⁴ M in 0.01 N HCl) containing trace amounts of ¹⁵³ SmCl ₃ . After complete mixing, the sample of the complex solution was passed through a Sephadex ^™ column, eluted with 4: 1 brine (0.85% Nacl / NH ₄ OH), and the 2% 3 mL fractions were collected to determine the percent metal as a complex. It was. The amount of radioactivity in the combined eluates was then compared with that left on the resin. Under these conditions, the complex is removed with the eluent and the non-complexed metal remains on the resin. In this way, complexation was measured at 92%. Samples of solutions that passed through the resin were used for pH studies. The pH stability was then measured using the above general procedure. Complexing for the title product after passing through the resin was determined to be greater than 98% at a ligand to metal ratio of 1: 1.

[생체내 분포][In vivo distribution]

[일반 절차][General Procedure]

스프레그 다울리(Sprague Dawley) 래트를 5일간 순응시킨 후 꼬리 정맥을 통해 100㎕의 착체 용액을 주입하였다. 래트는 주입시 150 내지 200g으로 계량되었다. 30분 후에 래트를 경부 탈구에 의해 죽이고 해부하였다. 각 조직에서의 방사능 양을 다중채널 분석기에 연결된 Nal 섬광 계수기로 계수하여 측정하였다. 계수된 방사능을 각 조직 또는 기관에서의 용량%를 측정하기 위해 100㎕ 표준물에서의 방사능과 비교하였다.Sprague Dawley rats were allowed to acclimate for 5 days and then injected with 100 μl of complex solution through the tail vein. Rats were weighed from 150 to 200 g at injection. After 30 minutes rats were killed by dislocation and dissected. The amount of radiation in each tissue was measured by counting with a Nal scintillation counter connected to a multichannel analyzer. Counted radioactivity was compared to radioactivity in 100 μl standard to determine the percent dose in each tissue or organ.

혈중 용량%는 혈액이 체중의 7%인 것으로 가정하여 계산하였다. 뼈에서의 용량%는 대퇴골에서의 용량%에 25를 곱하여 계산하였다. 근육에서의 용량%는 근육이 체중의 43%인 것으로 가정하여 계산하였다.Percent blood volume was calculated assuming blood was 7% of body weight. The dose percentage in bone was calculated by multiplying the dose percentage in femur by 25. Percent dose in muscle was calculated assuming that the muscle is 43% of body weight.

기관 생체내분포 이외에, 포스포네이트가 수산화 인회석에 결합하는 그의 능력으로 알려져 있으므로 뼈줄 편재 효율에 대해 일반식(I) 화합물의 킬레이트를 조사하였다.In addition to organ in vivo distribution, phosphonates are known for their ability to bind to hydroxyapatite, and chelates of general formula (I) compounds were investigated for bone line localization efficiency.

[실시예 1]Example 1

여러 조직중 실시예 1의 착체(¹⁵³Sm-PCTA)의 주입 용량%를 표 1에 나타내었다. 숫자는 데이터당 5마리 래트의 평균치를 나타낸다.The percent injection volume of the complex of Example 1 ( ¹⁵³ Sm-PCTA) among various tissues is shown in Table 1. Numbers represent the mean of 5 rats per data.

[표 1]TABLE 1

혈액 대 뼈 비율(용량%)은 7이었다. 간 대 뼈 비율은 3.5이었다. 근육 대 뼈 비율은 4.8 이었다.Blood to bone ratio (% volume) was 7. Liver to bone ratio was 3.5. Muscle to bone ratio was 4.8.

[영상화 실험][Imaging experiment]

[일반적 절차][General Procedure]

2㎖의 탈이온수에 적절한 양의 각 착체를 용해시켜 주사액(0.5M)을 먼저 제조하였다. 그 후, 경우에 따라 1M HCl 또는 NaOH를 사용하여 용액의 pH를 7.4로 조정하였다. 이어서, 각 용액의 총 Gd 함량을 ICP분석으로 측정하였다.An injection solution (0.5 M) was first prepared by dissolving each complex in an appropriate amount in 2 mL of deionized water. Thereafter, the pH of the solution was adjusted to 7.4 with 1M HCl or NaOH, if appropriate. The total Gd content of each solution was then determined by ICP analysis.

마취시킨 스프레그 다울리 래트에 전술한 금속 용액중 하나를 0.05 내지 0.1 밀리몰 Gd/체중 kg의 용량으로 근육내 주입하였다. 그 후, 다양한 시간 간격으로 상을 취하여 제로(0) 시간에 취한 비-주입된 대조구와 비교하였다.Anesthetized Sparrow Dawley rats were injected intramuscularly with one of the aforementioned metal solutions at a dose of 0.05-0.1 mmol Gd / kg body weight. The images were then taken at various time intervals and compared to the non-injected controls taken at zero time.

[실시예 II]Example II

Gd-PCTA 착체(Sm Cl₃·H₂O 대신에 GdCl₃·H₂O를 사용하여, 실시예 1에서 기술한 방법에 따라 제조함)는 신장 피질 뿐만 아니라 주변 신장 조직의 밝기 증대와 함께 비뇨기계에 의해 신속하게 흡수되었다.Gd-PCTA complexes (Sm Cl ₃ · GdCl ₃ · using H ₂ O, prepared according to the method described in Example 1 in place of H ₂ O) is urinary with a brightness increase in the surrounding kidney tissue as well as the renal cortex Quickly absorbed by the machine.

본 발명의 다른 양태는 본 명세서를 참조로 하거나 본원에 개시된 본 발명의 실시를 참조로 하여 당해분야에 숙련된 자에게 명백할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예로서 간주되어야 하며, 본 발명의 진정한 범주 및 진의는 하기 청구범위에 나타나 있다.Other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art with reference to this specification or with reference to the practice of the invention disclosed herein. It is intended that the specification and examples be considered as exemplary only, with a true scope and spirit of the invention being indicated in the following claims.

Claims (22)

Gd⁺³, Mn⁺²또는 Fe⁺³으로부터 선택된 금속이온과 착화된 하기 식(I)의 비사이클로폴리아자매크로사이클로카복실산 화합물을 포함하는 착체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염.A complex or pharmaceutically acceptable salt thereof comprising a bicyclopolyazacyclocyclocarboxylic acid compound of formula (I) complexed with a metal ion selected from Gd ⁺³ , Mn ⁺² or Fe ⁺³ . 상기식에서, R은 수소,또는이고 (상기식들에서, X 및 Y는 독립적으로 H, OH, C₁-C₃알킬 또는 COOH이고; R^7H또는 OH이며; R⁴는 H, NO₂, NH₂또는 이소티오시아네이토임); 단, 적어도 2개의 R은이어야 하며; A는 CH, C-Br, C-Cl 또는 C-OR¹이고 (상기식들에서, R¹은 H 또는 C₁-C₅임); Q 및 Z는 독립적으로 CH, 또는 C-CH₂-OR¹이고 (상기식들에서, R¹는 상기에 정의된 바와 같음); 단, A가 C-Br, C-Cl 또는 C-OR¹이면, Q 및 Z는 둘다 CH 이어야 한다.Wherein R is hydrogen, or (Wherein X and Y are independently H, OH, C ₁ -C ₃ alkyl or COOH; R ^7H or OH; R ⁴ is H, NO ₂ , NH ₂ or isothiocyanato ); Provided that at least two R's Must be; A is CH, C-Br, C-Cl or C-OR ¹ (wherein R ¹ is H or C ₁ -C ₅ ); Q and Z are independently CH, or C-CH ₂ -OR ¹ , wherein R ¹ is as defined above; Provided that if A is C-Br, C-Cl or C-OR ^1, then both Q and Z must be CH. 제1항에 있어서, 상기 금속이 Gd⁺³인 착체.The complex of claim 1 wherein said metal is Gd ^{+ 3} . 제1항에 있어서, A, Q 및 Z가 CH이고, X 및 Y가 H인 착체.The complex according to claim 1, wherein A, Q and Z are CH and X and Y are H. 제1항에 있어서, X 및 Y가 H인 착체.2. The complex of claim 1, wherein X and Y are H. 제1항에 있어서, A, Q 및 Z가 CH인 착체.The complex of claim 1 wherein A, Q and Z are CH. 제1항에 있어서, A, Q 및 Z가 CH이고, 하나의 R이 하기 식을 갖는 착체.The complex according to claim 1, wherein A, Q and Z are CH and one R has the following formula. 상기식에서, X, Y 및 R⁴는 제1항에 정의된 바와같다.Wherein X, Y and R ⁴ are as defined in claim 1. 제1항에 있어서, A가 C-OR′(여기에서, R¹은 제1항에 정의된 바와 같다)인 착체.The complex of claim 1, wherein A is C-OR ′ wherein R ¹ is as defined in claim 1. 제1항에 있어서, A가 CH이고, Q 또는 Z 중의 하나가 CH이고 다른 하나가 C-CH₂-OR¹(여기에서, R¹은 제1항에 정의된 바와같다)인 착체.The complex of claim 1, wherein A is CH, one of Q or Z is CH and the other is C-CH ₂ -OR ¹ , wherein R ¹ is as defined in claim ¹ . Gd⁺³, Mn⁺²또는 Fe⁺³으로부터 선택된 금속이온과 착화된 하기 식(I)의 비사이클로폴리아자매크로사이클로카복실산 화합물을 포함하고, 텍스트란, 펩타이드, 수용체에 대한 특이적 친화성을 갖는 분자, 항체 또는 항체 절편중에서 선택된 생물학적 활성물질에 공유결합된 결합체.A bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid compound of formula (I) complexed with a metal ion selected from Gd ⁺³ , Mn ⁺² or Fe ⁺³ , and has a specific affinity for text, peptide, receptor A conjugate covalently bound to a biologically active material selected from molecules, antibodies or antibody fragments. 상기식에서, R은 수소,또는이고 (상기식들에서, X 및 Y는 독립적으로 H, OH, C₁-C₃알킬 또는 COOH이고; R⁷은 H 또는 OH이며; R⁴는 H, NO₂, NH₂또는 이소티오시아네이토임); 단, 적어도 2개의 R은 CO₂H 그룹을 가져야 하며; A는 CH, C-Br, C-Cl 또는 C-OR¹이고 (상기식들에서, R¹은 H 또는 C₁-C₅임); Q 및 Z는 독립적으로 CH, 또는 C-CH₂-OR¹이고 (상기식들에서, R¹는 상기에 정의된 바와 같음); 단, A가 C-Br, C-Cl 또는 C-OR¹이면, Q 및 Z는 둘다 CH 이어야 한다.Wherein R is hydrogen, or (Wherein X and Y are independently H, OH, C ₁ -C ₃ alkyl or COOH; R ⁷ is H or OH; R ⁴ is H, NO ₂ , NH ₂ or isothiocyane Itoim); Provided that at least two R's must have a CO ₂ H group; A is CH, C-Br, C-Cl or C-OR ¹ (wherein R ¹ is H or C ₁ -C ₅ ); Q and Z are independently CH, or C-CH ₂ -OR ¹ , wherein R ¹ is as defined above; Provided that if A is C-Br, C-Cl or C-OR ^1, then both Q and Z must be CH. 제9항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 절편이 단클론성 항체 또는 그의 절편인 결합체.10. The conjugate of claim 9, wherein said antibody or antibody fragment is a monoclonal antibody or fragment thereof. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 절편이 B72.3인 결합체.The conjugate of claim 10, wherein said antibody or antibody fragment is B72.3. 제9항, 제10항 및 제11항중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속이온이 Gd⁺³인 결합체.The binder according to any one of claims 9, 10 and 11, wherein the metal ion is Gd ⁺³ . 제9항에 있어서, X 및 Y가 H인 결합체.10. The conjugate of claim 9, wherein X and Y are H. 제9항에 있어서, A, Q 및 Z가 CH인 결합체.10. The conjugate of claim 9, wherein A, Q and Z are CH. 제9항에 있어서, Q, A 및 Z가 CH이고, 하나의 R이 하기 식을 갖는 결합체.The conjugate of claim 9 wherein Q, A and Z are CH and one R has the formula: 상기식에서, R⁴및 R⁷은 제9항에 정의된 바와같다.Wherein R ⁴ and R ⁷ are as defined in claim 9. 제9항에 있어서, A가 C-OR¹(여기에서, R¹은 제9항에 정의된 바와같다)를 갖는 결합체.10. The combination of claim 9, wherein A has C-OR ¹ , wherein R ¹ is as defined in claim 9. 제9항에 있어서, A가 CH이고, Q 또는 Z 중 하나가 CH인 결합체.10. The conjugate of claim 9, wherein A is CH and one of Q or Z is CH. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항의 착체를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는, 자기공명영상(MRI)에서 치료 대상자에게 조영제로 사용하기 위한 약학 제제.A pharmaceutical formulation for use as a contrast agent for a subject in a magnetic resonance imaging (MRI) containing the complex of any one of claims 1 to 8 together with a pharmaceutically acceptable carrier. 제9항, 제10항 및 제11항중 어느 한항의 결합체를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는, 자기공명영상(MRI)에서 치료 대상자에게 조영제로 사용하기 위한 약학 제제.A pharmaceutical formulation for use as a contrast agent for a subject in a magnetic resonance imaging (MRI), comprising the conjugate of any one of claims 9, 10 and 11 together with a pharmaceutically acceptable carrier. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항의 리간드를 하나의 성분으로서 갖는 진단제로서 사용하기 위한 키트.A kit for use as a diagnostic agent having the ligand of any one of claims 1 to 8 as one component. 제1항의 비사이클로폴리아자매크로사이클로카복실산을 pH 5 내지 7의 수성 조건하에 Gd⁺³, Mn⁺³또는 Fe⁺³으로부터 선택된 금속 이온과 반응시킴을 포함하는 제1항의 착체의 제조방법.A process for preparing the complex of claim 1, comprising reacting the bicyclopolyazacyclocyclocarboxylic acid of claim 1 with a metal ion selected from Gd ⁺³ , Mn ⁺³ or Fe ⁺³ under aqueous conditions of pH 5-7. 제21항에 있어서, 상기 비사이클로폴리아자매크로사이클로카복실산 화합물이 3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,6,9-트리메틸렌카복실산인 방법.22. The method of claim 21, wherein the bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid compound is 3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15), 11,13-triene-3,6 , 9-trimethylenecarboxylic acid.