KR100305726B1 - The Method for Expressing Polypeptides in E.coli Using Carboxypeptidase Y propeptide as a Fusion partner, Recombinant Vector Used thereby and Transformant thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장균에서 폴리펩타이드의 효율적 발현을 위한 새로운 융합 파트너 CPY(Carboxypeptidase Y) 프로펩타이드와 재조합 벡타 및 그의 형질전환체에 관한 것이다. 더욱 자세하게는 폴리펩타이드의 분리정제를 간단하게 하기 위해 CPY 프로펩타이드 N-말단에 친화성 태그를 붙이고 발현된 융합 폴리펩타이드로부터 목적 폴리펩타이드를 얻기 위해 프로펩타이드 C-말단에 화학적 또는 프로테아제에 의한 절단 부위를 도입한 융합 파트너에 관한 것이다. 유전자의 발현에 있어서, 진핵생물의 활성 단백질등을 대장균등의 원핵생물에 발현시 소형 폴리펩타이드들은 분해에 쉽게 노출되는 위험을 안고 있다. 이러한 문제점에 대하여 본 발명은 상기 융합 파트너를 이용함으로써 대장균에서 분해되기 쉬운 소형 폴리펩타이드들을 안정적으로 생산할 수 있다.The present invention relates to a novel fusion partner Carboxypeptidase Y (CPY) propeptide, recombinant vector and transformants thereof for efficient expression of polypeptides in E. coli. More specifically, a cleavage site by chemical or protease at the propeptide C-terminus to obtain the desired polypeptide from the expressed fusion polypeptide with the affinity tag at the CPY propeptide N-terminus to simplify the purification of the polypeptide. It is about a fusion partner who introduced this. In expression of genes, small polypeptides are easily exposed to degradation when prokaryotic proteins are expressed in prokaryotes such as E. coli. In this regard, the present invention can stably produce small polypeptides that are easily degraded in E. coli by using the fusion partner.

Description

카복시펩티다제 Ｙ 프로펩타이드를 융합 파트너로 하여 대장균에서 폴리펩타이드를 발현하는 방법 및 이에 사용된 재조합 벡타 및 그 형질전환체 {The Method for Expressing Polypeptides in E.coli Using Carboxypeptidase Y propeptide as a Fusion partner, Recombinant Vector Used thereby and Transformant thereof}Method for Expressing Polypeptides in E. coli Using Carboxypeptidase Y propeptide as a Fusion partner, A method for expressing a polypeptide in E. coli using a carboxypeptidase Ｙ propeptide as a fusion partner Recombinant Vector Used hence and Transformant

본 발명은 대장균에서 폴리펩타이드의 효율적 발현을 위한 새로운 융합 파트너 카복시펩티다제 Y(이하 CPY라고 칭함) 프로펩타이드에 관한 것으로 자세하게는 목적하는 폴리펩타이드의 분리정제를 간단하게 하기 위해 CPY 프로펩타이드 N-말단에 히스티딘 태그를 그리고 C-말단에 화학적 또는 프로테아제에 의한 절단부위를 도입한 융합파트너에 관한 것이다. 대장균은 성장속도가 빠르고 배양이 수월하며 유전적 특성 등이 잘 알려져 있어 외래 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현 생산하기 위한 숙주세포로써 가장 널리 사용되고 있다. 하지만 외래 단백질 발현시 많은 경우에 있어서 발현된 단백질이 비용해성 결합체로 세포내에 존재하므로 활성형의 단백질을 얻기 위한 복잡한 리폴딩 및 분리정제 공정이 필요하여 산업적 사용이 제한되는 단점도 지니고 있다(Edward, R. L. and J. M. McCoy, Curr. Opin. Biotechnol. 1995, 6:501-506). 또한 호르몬과 같은 소형 폴리펩타이드를 대장균에서 직접 발현하는 경우 세포내에서 프로테아제에 의해 발현된 폴리펩타이드들이 대부분 분해되는 문제점 때문에 대장균은 소형 폴리펩타이드의 발현을 위한 숙주세포로써 치명적인 단점을 지니고 있다.The present invention relates to a novel fusion partner carboxypeptidase Y (hereinafter referred to as CPY) propeptide for efficient expression of polypeptides in E. coli, specifically CPY propeptide N- to simplify the purification of the desired polypeptide. It relates to a fusion partner having a histidine tag at the end and a cleavage site by chemical or protease at the C-terminus. E. coli is widely used as a host cell for expressing and producing foreign proteins or polypeptides because of its fast growth rate, easy cultivation, and well-known genetic characteristics. However, in many cases, the expressed protein is present in the cell as an insoluble conjugate when foreign protein is expressed, which requires a complicated refolding and separation and purification process to obtain an active protein. RL and JM McCoy, Curr. Opin. Biotechnol. 1995, 6: 501-506). In addition, when a small polypeptide such as hormone is directly expressed in Escherichia coli, Escherichia coli has a fatal disadvantage as a host cell for expression of a small polypeptide because most polypeptides expressed by proteases are degraded in cells.

이에 상기 문제점의 해결을 위하여 '파트너'라고 불리우는 유전자와 발현하고자 하는 폴리펩타이드 유전자를 융합하여 발현하므로써 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하고 또한 '파트너' 부분에 친화성 태그를 도입하므로써 분리정제도 수월하게 할 수 있는 유전자 융합기술이 개발되어 왔다(Nilsson, B. et al., Curr. Opion. Struct. Biol., 2, 569-575, 1992; Nygren, P. A. et al., Trends Biotechnol., 12, 184-188; Hockney, R. C., Trends Biotechnol., 12, 456-463, 1994; Lavallie, E. R. and McCoy, J. M., Curr. Opin. Biotechnol., 6, 501-505, 1995; Nilsson, J. et al., Prot. Express. Purif., 11, 1-16, 1997). 현재까지 개발된 융합 파트너들은 목적 폴리펩타이드의 발현후 분리정제, 또는 목적 폴리펩타이드의 용해도를 증가시켜 발현된 폴리펩타이드들의 폴딩(Folding)을 용이하게 하기 위한 목적으로 대부분 개발되어 왔으며 소형 폴리펩타이드의 분해를 억제하는데 초점을 맞추어 개발된 융합 파트너는 극히 드물다. 그러나 분해되기 쉬운 소형 폴리펩타이드들을 대장균에서 생산하기 위해서는 분해를 최대한 억제하므로써 발현량을 최대화할 수 있는 융합 파트너의 개발이 우선 고려되어야 한다.In order to solve the above problems, it is possible to stably express a polypeptide by fusing and expressing a gene called 'partner' and a polypeptide gene to be expressed, and to facilitate separation and purification by introducing an affinity tag into the 'partner' part. Gene fusion techniques have been developed (Nilsson, B. et al., Curr. Opion. Struct. Biol., 2, 569-575, 1992; Nygren, PA et al., Trends Biotechnol., 12, 184-) 188; Hockney, RC, Trends Biotechnol., 12, 456-463, 1994; Lavallie, ER and McCoy, JM, Curr. Opin.Biotechnol., 6, 501-505, 1995; Nilsson, J. et al., Prot Express.Purif., 11, 1-16, 1997). The fusion partners that have been developed up to now have been developed for the purpose of facilitating the separation of the expressed polypeptides or the folding of the expressed polypeptides by increasing their solubility. Few fusion partners have been developed with a focus on containment. However, in order to produce small polypeptides that are easily degraded in Escherichia coli, development of a fusion partner that can maximize expression by inhibiting degradation as much as possible should be considered.

유전자 융합기술은 '파트너' 유전자의 선택이 매우 중요하다고 할 수 있다. 즉, '파트너' 부분의 특성에 따라 융합 폴리펩타이드의 발현량이 결정되며 발현 후 목표 폴리펩타이드의 폴딩등이 영향을 받을 수 있다. 대장균에서 폴리펩타이드 (특히 소형 폴리펩타이드)의 안정적 발현을 위한 융합 '파트너'의 개발은 상업적으로 매우 중요하다고 할 수 있다. 따라서 본 발명의 목적은 소형 폴리펩타이드를 대장균에서 안정적으로 발현할 수 있는 새로운 융합 파트너와 이의 재조합 벡타 및 형질전환체를 개발함에 있다.In gene fusion technology, the selection of the 'partner' gene is very important. That is, the expression amount of the fusion polypeptide is determined according to the characteristics of the 'partner' portion, and the folding of the target polypeptide after the expression may be affected. The development of fusion 'partners' for the stable expression of polypeptides (especially small polypeptides) in E. coli is of great commercial importance. Accordingly, an object of the present invention is to develop a new fusion partner and recombinant vector and transformant thereof capable of stably expressing small polypeptides in E. coli.

도 1은 대장균에서 CPY 프로펩타이드 발현을 아크릴 아마이드 젤 전기영동으로 나타낸 것이다.1 shows acrylamide gel electrophoresis of CPY propeptide expression in Escherichia coli.

레인 1: 단백질 크기 마커Lane 1: protein size marker

레인 2: 형질전환되지 않은 대장균의 전체 단백질Lane 2: total protein of untransformed Escherichia coli

레인 3: CPY 프로펩타이드 발현 플라스미드로 형질전환된 대장균의 전체 단백질Lane 3: Total protein of E. coli transformed with CPY propeptide expression plasmid

도면 2-5는 융합 파트너를 이용하여 소형 펩타이드 생산을 위한 벡타의 제작과정을 나타낸 것이다.Figures 2-5 show the construction of a vector for the production of small peptides using a fusion partner.

도 2는 엔테로키나제로 절단될 수 있는 융합 연어 칼시토닌 전구체 발현벡타 (pEHCPYE-SCT)의 제작에 관한 것이다.Figure 2 relates to the construction of fused salmon calcitonin precursor expression vector (pEHCPYE-SCT) that can be cleaved with enterokinase.

도 3은 시아노젠 브로마이드로 절단될 수 있는 융합 연어 칼시토닌 전구체 발현벡타(pEHCPYM-SCT)의 제작에 관한 것이다.Figure 3 relates to the production of fused salmon calcitonin precursor expression beta (pEHCPYM-SCT) that can be cleaved with cyanogen bromide.

도 4는 엔테로키나제로 절단될 수 있는 융합 인체 부갑상선 호르몬 단편 발현벡타(pEHCPYE-hPTHF)의 제작에 관한 것이다.4 relates to the construction of a fused human parathyroid hormone fragment expression vector (pEHCPYE-hPTHF) that can be cleaved with enterokinase.

도 5는 엔테로키나제로 절단될 수 있는 융합 인체 글루카곤 발현벡타 (pEHCPYE-GLU)의 제작에 관한 것이다.5 relates to the construction of fused human glucagon expression vector (pEHCPYE-GLU) that can be cleaved with enterokinase.

도 6은 대장균에서 융합 연어 칼시토닌 전구체 발현을 아크릴 아마이드 젤 전기영동으로 나타낸 것이다.Figure 6 shows the expression of fused salmon calcitonin precursor in E. coli acrylamide gel electrophoresis.

레인 1: 단백질 크기 마커Lane 1: protein size marker

레인 2, 6: 형질전환되지 않은 대장균의 전체 단백질Lanes 2 and 6: total protein of untransformed Escherichia coli

레인 3: 플라스미드 pEHCPYM-SCT로 형질전환된 대장균의 전체단백질Lane 3: whole protein of E. coli transformed with plasmid pEHCPYM-SCT

레인 4: 플라스미드 pEHCPYM-SCT로 형질전환된 대장균의 비용해성 분획 단백질Lane 4: insoluble fraction protein of Escherichia coli transformed with plasmid pEHCPYM-SCT

레인 5: 플라스미드 pEHCPYM-SCT로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질Lane 5: Soluble fraction protein of Escherichia coli transformed with plasmid pEHCPYM-SCT

레인 7: 플라스미드 pEHCPYE-SCT로 형질전환된 대장균의 전체 단백질Lane 7: Total protein of Escherichia coli transformed with plasmid pEHCPYE-SCT

레인 8: 플라스미드 pEHCPYE-SCT로 형질전환된 대장균의 비용해성 분획 단백질Lane 8: insoluble fraction protein of Escherichia coli transformed with plasmid pEHCPYE-SCT

레인 9: 플라스미드 pEHCPYE-SCT로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질Lane 9: Soluble fraction protein of Escherichia coli transformed with plasmid pEHCPYE-SCT

도 7은 대장균에서 융합 인체 부갑상선 호르몬 단편 발현을 아크릴아마이드 젤 전기영동으로 나타낸 것이다.Figure 7 shows the expression of fusion human parathyroid hormone fragment in E. coli by acrylamide gel electrophoresis.

레인 1: 단백질 크기 마커Lane 1: protein size marker

레인 2: 형질전환되지 않은 대장균의 전체단백질Lane 2: whole protein of untransformed Escherichia coli

레인 3: 플라스미드 pEHCPYE-hPTHF로 형질전환된 대장균의 전체단백질Lane 3: total protein of E. coli transformed with plasmid pEHCPYE-hPTHF

레인 4: 플라스미드 pEHCPYE-hPTHF로 형질전환된 대장균의 비용해성 분획 단백질Lane 4: insoluble fraction protein of Escherichia coli transformed with plasmid pEHCPYE-hPTHF

레인 5: 플라스미드 pEHCPYE-hPTHF로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질Lane 5: Soluble fraction protein of Escherichia coli transformed with plasmid pEHCPYE-hPTHF

도 8은 대장균에서 융합 인체 글루카곤 발현을 아크릴아마이드 젤 전기영동으로 나타낸 것이다.Figure 8 shows the expression of fused human glucagon in E. coli acrylamide gel electrophoresis.

레인 1: 단백질 크기 마커Lane 1: protein size marker

레인 2: 형질전환되지 않은 대장균의 전체단백질Lane 2: whole protein of untransformed Escherichia coli

레인 3: 플라스미드 pEHCPYE-GLU로 형질전환된 대장균의 전체단백질Lane 3: whole protein of E. coli transformed with plasmid pEHCPYE-GLU

레인 4: 플라스미드 pEHCPYE-GLU로 형질전환된 대장균의 비용해성 분획 단백질Lane 4: insoluble fraction protein of E. coli transformed with plasmid pEHCPYE-GLU

레인 5: 플라스미드 pEHCPYE-GLU로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질Lane 5: Soluble fraction protein of Escherichia coli transformed with plasmid pEHCPYE-GLU

도 9는 융합 연어 칼시토닌의 시아노젠 브로마이드와 엔테로키나제로 절단을 아크릴아마이드 젤 전기영동하여 확인한 것이다.Figure 9 is confirmed by acrylamide gel electrophoresis of the cleavage with cyanogen bromide and enterokinase of fused salmon calcitonin.

레인 1: 단백질 크기 마커Lane 1: protein size marker

레인 2: 원형 연어 칼시토닌Lane 2: round salmon calcitonin

레인 3: 시아노젠 브로마이드 처리 전 융합 연어칼시토닌 전구체Lane 3: fused salmon calcitonin precursor before cyanogen bromide treatment

레인 4: 시아노젠 브로마이드 처리 후Lane 4: after cyanogen bromide treatment

레인 5: 엔테로키나제 처리 전 융합 연어칼시토닌 전구체Lane 5: fused salmon calcitonin precursor before enterokinase treatment

레인 6: 엔테로키나제 처리 후Lane 6: After Enterokinase Treatment

도 10은 융합 인체 부갑상선 호르몬의 엔테로키나제로 절단을 아크릴아마이드 젤 전기영동하여 확인한 것이다.10 is confirmed by acrylamide gel electrophoresis of the enterokinase cleavage of the fused human parathyroid hormone.

레인 1: 단백질 크기 마커Lane 1: protein size marker

레인 2: 원형 인체 부갑상선 호르몬 단편Lane 2: circular human parathyroid hormone fragment

레인 3: 엔테로키나제 처리전 융합 인체 부갑상선 호르몬 단편Lane 3: fusion human parathyroid hormone fragment prior to enterokinase treatment

레인 4: 엔테로키나제 처리 후Lane 4: After Enterokinase Treatment

도 11은 융합 인체 글루카곤의 발현, 금속 친화성 크로마토그래피 및 엔테로키나제 절단 결과를 아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인한 것이다.Figure 11 shows the expression of fused human glucagon, metal affinity chromatography and enterokinase cleavage results by acrylamide gel electrophoresis.

레인 1: 단백질 크기 마커Lane 1: protein size marker

레인 2: 원형 인체 글루카곤Lane 2: circular human glucagon

레인 3: 금속 친화성 크로마토그래피로 정제된 융합 인체 글루카곤Lane 3: Fused Human Glucagon Purified by Metal Affinity Chromatography

레인 4: 정제된 융합 인체 글루카곤의 엔테로키나제 처리 후Lane 4: After Enterokinase Treatment of Purified Fusion Human Glucagon

효모 사카로마이세스 세레비지애에서 발현되는 카복시펩티다제 Y(이하 CPY라고 칭함)는 61,000 달톤의 세린계 프로테아제로 세포내에서 단백질의 수송, 분해, 활성화에 관여한다. 532개의 아미노산으로 구성된 비성숙 단백질 상태에서는 활성이 없지만 N말단 20개의 시그날 펩타이드가 소포체에서 절단되고 다음 91개의 프로펩타이드가 골지체 내에서 절단되면서 활성이 있는 성숙 CPY의 형태를 지닌다 (Cayo, R. et al., J. Biol. Chem, 1994, 269(9): 7006-7012). 이 과정중 CPY의 프로펩타이드는 프로 CPY의 세포내 이동에 필수적인 역할을 하는 부분으로 소포체에서 골지체로 이동 중 다른 프로테아제의 공격을 막아주며, 단백질 폴딩, 소팅 (sorting) 등에도 영향을 준다. CPY 프로펩타이드는 대부분 극성의 아미노산으로 구성되어 있으며 알파-헬릭스 구조를 갖고 있을 것으로 추정된다(Winther, J. R. and P. Sorensen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88: 9330-9334).Carboxypeptidase Y (hereinafter referred to as CPY) expressed in yeast Saccharomyces cerevisiae is a 61,000 Daltons serine protease that is involved in the transport, degradation and activation of proteins in cells. It is inactive in a mature protein state consisting of 532 amino acids but takes the form of an active mature CPY, with the N-terminal 20 signal peptide cleaved from the endoplasmic reticulum and the next 91 propeptides cleaved within the Golgi apparatus (Cayo, R. et. al., J. Biol. Chem, 1994, 269 (9): 7006-7012). CPY propeptide during this process plays an essential role in intracellular migration of pro CPY. It prevents other proteases from moving from endoplasmic reticulum to Golgi, and affects protein folding and sorting. CPY propeptide is composed mostly of polar amino acids and is believed to have an alpha-helix structure (Winther, J. R. and P. Sorensen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88: 9330-9334).

본 발명은 이러한 CPY 프로펩타이드의 특성에 착안하여 대장균에서 폴리펩타이드의 효율적이고 안정적인 발현을 위한 융합 파트너로 CPY의 프로펩타이드 부분을 선택하여 이를 이용함으로써 소형 폴리펩타이드 호르몬들의 발현을 유도하는 것을 그 내용으로 한다.The present invention focuses on the characteristics of the CPY propeptide to induce the expression of small polypeptide hormones by selecting the propeptide portion of CPY as a fusion partner for efficient and stable expression of the polypeptide in E. coli. do.

융합 파트너의 선택시 고려되어야 할 사항으로는 융합 폴리펩타이드 발현량과 더불어 발현된 융합 폴리펩타이드의 간단한 정제 및 융합 파트너와 목표 폴리펩타이드의 융합부위 절단을 통해 활성형의 목표 폴리펩타이드를 고효율로 얻는 것이다. 본 발명은 이를 위하여 융합 파트너인 CPY 프로펩타이드의 N-말단에 6개의 히스티딘를 도입하여 금속이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 쉽게 정제될 수 있게 하고 또한, CPY 프로펩타이드와 목표 폴리펩타이드의 연결 부위, 즉 프로펩타이드의 C-말단에는 메티오닌(Methionine) 혹은 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys과 같은 특정 아미노산 서열을 도입하여 시아노젠 브로마이드(CNBr)의 처리 또는 엔테로키나제와 같은 특정 프로테아제에 의해 융합 파트너와 목표 폴리펩타이드를 절단하여 활성형의목표 폴리펩타이드를 효율적으로 얻을 수 있도록 하고 있다. 이하 상기의 융합 파트너를 연어 칼시토닌 전구체, 인체 부갑상선 호르몬 단편, 인체 글루카곤과 같은 소형 폴리펩타이드의 발현에 관하여 적용하기로 한다.In selecting a fusion partner, consideration should be given to high-efficiency target polypeptides obtained by simple purification of the expressed fusion polypeptide and cleavage of the fusion site of the fusion partner and the target polypeptide, together with the expression of the fusion polypeptide. The present invention can be easily purified by metal ion affinity chromatography (IMAC) by introducing six histidines at the N-terminus of the CPY propeptide fusion partner for this purpose, and also the linking site of the CPY propeptide and the target polypeptide, In other words, at the C-terminus of the propeptide, a specific amino acid sequence such as Methionine or Asp-Asp-Asp-Asp-Lys is introduced to treat the cyanogen bromide (CNBr) or to a fusion partner with a specific protease such as enterokinase. By cutting the target polypeptide, it is possible to efficiently obtain the active target polypeptide. The above fusion partner will be applied for expression of small polypeptides such as salmon calcitonin precursor, human parathyroid hormone fragment, human glucagon.

칼시토닌은 체내 칼슘 대사를 조절하는 폴리펩타이드 호르몬으로써 C세포로 불리우는 체내 분비 세포로부터 분비된다. 칼시토닌은 뼈로부터 칼슘이 소실되는 것을 저해하고 신장으로부터 배출되는 칼슘을 재흡수시키는 기능을 가지고 있으므로 골다공증 치료제로 사용되고 있다(Martha, V. L. et al, Bio/Technology, 1993, 11: 64-70). 칼시토닌은 인체, 돼지, 소, 양, 래트(rat), 연어, 뱀장어, 닭 등의 8종류의 동물에서 11종류의 칼시토닌이 정제되어 1차구조가 결정되었으며 (연어에는 3종류, 뱀장어에는 2종류의 칼시토닌이 존재한다), 이들 칼시토닌은 모두 32개의 아미노산으로 이루어진 단쇄의 폴리펩타이드로 N말단과 7번째의 시스테인 (cystein)이 이중 황 결합으로 연결되어 환상을 형성하고 있다(Martial, K. et al, Biochem. Biophys. Res. Comm, 1990, 171: 1111-1114). 본 발명에서는 연어 칼시토닌 생산에 사용되는 연어 칼시토닌 전구체 (C말단에 글리신(glycine)이 첨가된 33개의 아미노산으로 구성됨)를 앞써 언급한 융합 파트너를 이용하여 대장균에서 발현한다. 칼시토닌 전구체의 발현에서는 융합 파트너와 칼시토닌 전구체의 절단을 위하여 CPY 프로펩타이드 C-말단에 메티오닌 혹은 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)를 도입한다. 메티오닌 다음은 시아노젠 브로마이드(CNBr)에 의해 화학적으로 절단이 되며 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 다음은 프로테아제인 엔테로키나제(Entrokinase)에 의해 절단이 된다(Sassenfeld, H. M., TIBTECH, 1990, 8: 88-93). 메티오닌을 절단부위로 도입한 경우 CPY 프로펩타이드 내에도 메티오닌이 1개(54번째) 존재하므로써 유전자 서열을 부분치환(Site-directed mutagenesis)하여 번역시 발린으로 생산되도록 유전자를 조작한다.Calcitonin is a polypeptide hormone that regulates calcium metabolism in the body and is secreted from secretory cells called C cells. Calcitonin has been used as a treatment for osteoporosis because it has the function of inhibiting the loss of calcium from bone and reabsorbing calcium from the kidney (Martha, V. L. et al, Bio / Technology, 1993, 11: 64-70). Calcitonin was purified from 11 kinds of calcitonin from 8 kinds of animals such as human body, pig, cow, sheep, rat, salmon, eel, chicken and so on.The primary structure was determined (3 types for salmon and 2 types for eel). Calcitonin), and these calcitonins are all short-chain polypeptides consisting of 32 amino acids, and the N terminus and the seventh cysteine are connected by double sulfur bonds to form a ring (Martial, K. et al. , Biochem. Biophys.Res. Comm, 1990, 171: 1111-1114). In the present invention, the salmon calcitonin precursor (comprising 33 amino acids added with glycine at the C terminus) used for salmon calcitonin production is expressed in E. coli using the aforementioned fusion partner. In expression of the calcitonin precursor, methionine or Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DDDDK) is introduced at the CPY propeptide C-terminus for cleavage of the fusion partner and calcitonin precursor. Methionine is then chemically cleaved by cyanogen bromide (CNBr) and Asp-Asp-Asp-Asp-Lys followed by cleavage by the protease Enterokinase (Sassenfeld, HM, TIBTECH, 1990, 8: 88-93). When methionine is introduced as a cleavage site, the gene is manipulated to be produced as valine during translation by site-directed mutagenesis by the presence of one (54th) methionine in the CPY propeptide.

인체 부갑상선 호르몬(hPTH)은 인체 부갑상선에서 생산되는 84개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드 호르몬으로써 신장과 뼈에서 칼슘의 항상성을 조절하는 기능을 가지고 있다. 이러한 생물학적 활성 때문에 인체 부갑상선 호르몬은 골다공증 치료제로 개발되고 있다(Morel F, In Grrep, R.O., Vol. 39, Academic perss, 271, 1983 ; Norman A W et al, Endocrinol. Rev., 3, 336, 1982). 본 발명은 인체 부갑상선 호르몬의 84개 아미노산 중 주요 활성부위인 N-말단 34개의 폴리펩타이드를 발현에 이용하며 엔테로키나제에 의해 융합 파트너와 절단될 수 있도록 한다.Human parathyroid hormone (hPTH) is a polypeptide hormone composed of 84 amino acids produced by the human parathyroid gland and has the function of regulating the homeostasis of calcium in the kidneys and bones. Due to this biological activity, human parathyroid hormone has been developed as a therapeutic agent for osteoporosis (Morel F, In Grrep, RO, Vol. 39, Academic perss, 271, 1983; Norman AW et al, Endocrinol. Rev., 3, 336, 1982) . The present invention utilizes N-terminal 34 polypeptides, the major active sites of 84 amino acids of the human parathyroid hormone, for expression and can be cleaved with fusion partners by enterokinase.

글루카곤은 포유동물의 췌장세포에서 생산되는 29개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드 호르몬으로써 랑게르한스의 알파세포에 의해 생산된다. 글루카곤은 간장의 글리코겐 생성과 글루코스 생성을 촉진함으로써 체내 혈당량을 조절하는 역할을 한다(Unger, R. H., New Engl. J. Med., 1981, 304:1518-1524). 본 발명은 목적 산물인 글루카곤과 융합 파트너가 엔테로키나제에 의해 절단될 수 있도록 한다.Glucagon is a polypeptide hormone consisting of 29 amino acids produced in mammalian pancreatic cells and produced by Langerhans' alpha cells. Glucagon plays a role in regulating blood glucose in the body by promoting glycogen and glucose production in the liver (Unger, R. H., New Engl. J. Med., 1981, 304: 1518-1524). The present invention allows the desired product glucagon and fusion partner to be cleaved by enterokinase.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 하나 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are intended to illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.

<실시예 1> 사카로마이세스 세레비지애 유래의 CPY 프로펩타이드 유전자의 제작 및 발현Example 1 Preparation and Expression of CPY Propeptide Gene from Saccharomyces cerevisiae

CPY 프로펩타이드 유전자의 제작을 위하여 사카로마이세스 세레비지애의 게노믹 DNA를 분리하여 이를 모형사슬로 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다(Perkin Elmer, GeneAmp PCR 2400, USA). PCR에 사용된 프라이머는 DNA 합성기(Applied Biosystems 사(미국) 제품, Model 391)로 합성하였으며 염기서열은 다음과 같다.For the production of CPY propeptide gene, genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae was isolated and subjected to PCR (Polymerase Chain Reaction) as a model chain (Perkin Elmer, GeneAmp PCR 2400, USA). Primers used for PCR were synthesized by a DNA synthesizer (Applied Biosystems, Inc., Model 391) and the base sequence is as follows.

(서열번호 1)(SEQ ID NO 1)

5'- CTA GGC CAT ATG ATC TCA TTG CAA AGA CCG5'- CTA GGC CAT ATG ATC TCA TTG CAA AGA CCG

(서열번호 2)(SEQ ID NO: 2)

5'- AAA GTC CCA CTC GAG CTT CGT TTT GAT TGC TTC AGG GAA TTT5'- AAA GTC CCA CTC GAG CTT CGT TTT GAT TGC TTC AGG GAA TTT

프라이머는 발현 벡타에 삽입될 수 있도록Nde I제한효소 절단부위를 도입하여 설계하였으며 최종적으로 pET22b+(Novagen사, 미국)벡타에 직접 연결될 수있도록 제한효소 절단부위Xho I을 도입하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 1 : 287 bp)은 제한효소Nde I과Xho I으로 절단 후 아가로스 젤에서 분리하여 pET22b+ 벡타에 삽입하였고 발현을 위하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 형질전환되지 않은 대장균과 형질전환된 대장균을 앰피실린이(ampicillin)이 50 μg/mL 들어있는 LB(효모엑기스 0.5%, 트립톤 1%, NaCl 1%) 액체배지에 각각 접종하여 37^oC에서 배양하면서 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)의 첨가에 의해 발현을 확인하였다(Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, New York, 1989).도면 1에서 볼 수 있듯이 CPY 프로펩타이드는 분자량이 약 10.1 KDa의 소형임에도 불구하고 전체단백질 중 약 30%정도 발현되었으며 발현된 CPY 프로펩타이드는 대부분 불용성 응집체로 존재하였다. 초음파 파쇄 후 얻어진 CPY 프로펩타이드의 불용성 응집체는 3 M Urea를 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액에 쉽게 용해되었으며, 2 mM EDTA를 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액을 이용, 투석에 의해 리폴딩이 이루어졌다. 리폴딩 과정 중에 불용성 비활성형 응집체는 전혀 관측되지 않았다. 따라서 CPY 프로펩타이드는 비교적 소형임에도 불구하고 대장균 내에서 분해되지 않고 불용성 응집체로 안정되게 발현되며, 발현된 불용성 응집체는 낮은 농도의 urea에서도 용해되고 리폴딩도 용이하게 이루어지는 특성을 갖고 있는 것이 확인되었다. 이것은 대장균에서 단독으로 발현시 분해가 되기 쉬운 폴리펩타이드의 안정적 발현을 위한 융합 파트너로써 사용시 많은 장점을 제공한다.The primer was designed by introducing an Nde I restriction enzyme cleavage site to be inserted into the expression vector, and finally a restriction enzyme cleavage site Xho I was introduced so that it could be directly linked to pET22b + (Novagen, USA). The fragment obtained by PCR (fragment 1: 287 bp) was digested with restriction enzymes Nde I and Xho I , separated from agarose gel, inserted into pET22b + vector, and transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression. Untransformed Escherichia coli and transformed Escherichia coli were inoculated in LB (yield 0.5%, tryptone 1%, NaCl 1%) liquid medium containing 50 μg / mL of ampicillin, respectively, at 37 ^o C. Expression was confirmed by the addition of Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) in culture (Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, second edition.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, New York) , 1989). As shown in Fig. 1, CPY propeptide was expressed as about 30% of all proteins despite its small molecular weight of about 10.1 KDa, and the CPY propeptide was expressed as an insoluble aggregate. Insoluble aggregates of CPY propeptide obtained after sonication were readily dissolved in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing 3 M Urea, and 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing 2 mM EDTA. Refolding was done by dialysis. No insoluble inactive aggregates were observed during the refolding process. Therefore, despite the relatively small size of the CPY propeptide, E. coli was not degraded and stably expressed as insoluble aggregates, and the expressed insoluble aggregates were confirmed to have the characteristics of being easily dissolved and refolded even at low concentrations of urea. This offers many advantages when used as a fusion partner for stable expression of polypeptides that are prone to degradation upon expression alone in E. coli.

N-말단에 6개의 히스티딘을 가지는 CPY 프로펩타이드 유전자의 제작을 위하여 새로운 프라이머를 설계하였으며 그 염기서열은 다음과 같다.A new primer was designed for the production of the CPY propeptide gene having six histidines at the N-terminus and its nucleotide sequence is as follows.

(서열번호 3)(SEQ ID NO: 3)

5'- CTA GGC CAT ATG CAT CAC CAT CAC CAC CAC ATC TCA TTG CAA AGA CCG5'- CTA GGC CAT ATG CAT CAC CAT CAC CAC CAC ATC TCA TTG CAA AGA CCG

(서열번호 4)(SEQ ID NO: 4)

5'- CAG CTT CGT GTC AAC GAT ATC CCC5'- CAG CTT CGT GTC AAC GAT ATC CCC

프라이머는 발현 벡타에 삽입될 수 있도록Nde I제한효소 절단부위를 도입하였고 히스티딘 태그 6개와 아미노산 91개의 CPY 프로펩타이드가 발현될 수 있도록 설계하였으며 최종적으로EcoR V로 절단될 수 있도록 제한효소 절단부위를 도입하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 1 : 301 bp)은 제한효소Nde I과EcoR V로 절단 후 아가로스 젤에서 분리하여 pBluescript SK+ 벡타(Stratgene사, 미국)에 삽입하였다. 상기와 같이 서브클로닝(subcloning)된 플라스미드를 pBCPYE라고 명명하였다.The primers introduced Nde I restriction enzyme cleavage site for insertion into expression vector, designed to express CPY propeptide of 6 histidine tags and 91 amino acids, and finally, restriction enzyme cleavage site for cleavage with EcoR V. It was. The fragment obtained by PCR (fragment 1: 301 bp) was digested with restriction enzymes Nde I and EcoR V , separated from agarose gel, and inserted into pBluescript SK + beta (Stratgene, USA). The plasmid subcloned as above was named pBCPYE.

<실시예 2> 친화성태그를 가진 시아노젠 브로마이드 절단용 CPY 프로펩타이드 유전자의 제작Example 2 Preparation of CPY Propeptide Gene for Cyanogen Bromide Cleavage with Affinity Tag

융합용 파트너의 60번째 아미노산(CPY 프로펩타이드 54번째 아미노산)은 메티오닌이므로 시아노젠 브로마이드를 이용한 절단시 융합 파트너의 중간부분의 절단이 생긴다. 이러한 융합 파트너의 절단을 피하기 위하여 60번째 메티오닌을 발린으로 부분 돌연변이를 유도하였다. 유전자 치환을 위하여 사용된 프라이머는 다음과 같다.Since the 60th amino acid (CPY propeptide 54th amino acid) of the fusion partner is methionine, the cleavage with the cyanogen bromide causes cleavage of the middle portion of the fusion partner. In order to avoid cleavage of this fusion partner, partial mutations were induced with the 60th methionine valine. Primers used for gene replacement are as follows.

(서열번호 5)(SEQ ID NO: 5)

5'- CCA GGT TGT GAG CCT TGA AAC5'- CCA GGT TGT GAG CCT TGA AAC

(서열번호 6)(SEQ ID NO: 6)

5'- GTT TCA AGG CTC ACA ACC TGG5'- GTT TCA AGG CTC ACA ACC TGG

실시예 1에서 제작한 pBCPYE를 모형사슬로 각각의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 pfu 폴리머라제(polymerase)를 사용하였으며 이는 높은 재연성을 나타내는 효소로 알려져있다. 10 사이클(cycle)의 PCR로 얻어진 증폭산물은 제한효소Dpn I으로 모형 벡타인 pBCPY를 처리하고 나머지를 형질전환하여 pBCPYM을 얻었다. 여기서 얻어지는 단편(단편 2 : 301 bp)은 실시예 1에서 얻어진 단편과크기 및 사용은 동일하며 단지 60번째 아미노산만 발린으로 치환된 것이다.PCR was carried out using pBCPYE prepared in Example 1 using each primer as a model chain. PCR used pfu polymerase, which is known as an enzyme with high reproducibility. The amplified product obtained by 10 cycles of PCR was treated with the model vector pBCPY with restriction enzyme Dpn I and transformed with the rest to obtain pBCPYM. The fragment (fragment 2: 301 bp) obtained here is identical in size and use to the fragment obtained in Example 1, and only the 60th amino acid is substituted with valine.

<실시예 3> 융합 연어 칼시토닌 전구체 발현 벡타의 제작Example 3 Preparation of Fusion Salmon Calcitonin Precursor Expression Vector

연어 칼시토닌 전구체 유전자의 제작을 위하여 연어 유래의 칼시토닌 전구체 유전자를 가진 pYSCT1(대한민국 특허 제 171160호 : KCTC 기탁번호 제 0171BP)를 모형사슬로 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다.For the production of salmon calcitonin precursor gene, pYSCT1 (Korean Patent No. 171160: KCTC Accession No. 0171BP) having a calcitonin precursor gene derived from salmon was subjected to PCR (Polymerase Chain Reaction) in a model chain. Primers used for PCR are as follows.

(서열번호 7)(SEQ ID NO: 7)

5'- GGG GAT ATC ATG TGT TCT AAC TTG TCT AC5'- GGG GAT ATC ATG TGT TCT AAC TTG TCT AC

(서열번호 8)(SEQ ID NO: 8)

5'- GGG GAT ATC GAT GAC GAT GAC AAA TGT TCT AAC TTG TCT AC5'- GGG GAT ATC GAT GAC GAT GAC AAA TGT TCT AAC TTG TCT AC

(서열번호 9)(SEQ ID NO: 9)

5'- ATC AAA GCT GTC GAC TCA GGA GGA GGA AGG TGC GAG CGC5'- ATC AAA GCT GTC GAC TCA GGA GGA GGA AGG TGC GAG CGC

프라이머는 CPY 프로펩타이드와 연결될 수 있도록EcoR V제한효소 절단 부위를 도입하였고 시아노젠 브로마이드로 절단될 수 있는 메티오닌 1개 또는 엔테로키나제로 절단될 수 있는 아스파라긴 4개와 라이신 1개(DDDDK), 그리고 33개의 칼시토닌 전구체를 코딩하는 유전자가 발현될 수 있도록 설계하였으며 최종적으로Sal I으로 절단될 수 있도록 제한효소 절단 부위를 도입하였다. PCR로 얻어진 두 단편(단편 3, 4 : 112 bp, 124 bp)은 제한효소EcoR V와Sal I으로 절단하여 아가로스 젤로 분리 후 pBluescript SK+ vector에 삽입하였다. 상기와 같이 서브클로닝된 플라스미드를 각각 pBMSCT, pBESCT라고 명명하였다. 한편 pET22b+ 벡타를Nde I과Sal I으로 절단하여 얻어진 약 5500 염기쌍의 단편 7과 실시예 1, 2에서 제작된 301 염기쌍의 단편 1, 2 그리고 pBESCT, pBMSCT를EcoR V와Sal I으로 절단하여 아가로스 젤 상에서 분리한 칼시토닌 전구체 유전자 단편 3, 4를 각각 리가제로 연결하였다. 완성된 벡타는 T7 촉진인자와 T7 종결인자에 의해 유전자의 번역이 이루어지고 CPY 프로펩타이드와 융합된 칼시토닌 전구체 유전자가 발현될 수 있도록 제작되었으며 각각 플라스미드 pEHCPYE-SCT, pEHCPYM-SCT라고 명명하였다(도면 1, 2). 두 종류의 벡타는 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다(Sambrook, J., Fritsch, E. E., Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York). 형질전환체E.coliBL21(DE3)/pEHCPYE-SCT,E.coliBL21(DE3)/pEHCPYM-SCT는 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0587BP, KCTC 0588BP번으로 기탁하였다.The primers introduced an EcoR V restriction enzyme cleavage site for linkage with CPY propeptide, one methionine that could be cleaved with cyanogen bromide, or four asparagine and one lysine (DDDDK) that could be cleaved with enterokinase, and 33 A gene encoding a calcitonin precursor was designed to be expressed and a restriction enzyme cleavage site was introduced to finally be cleaved with Sal I. Two fragments obtained by PCR (fragments 3, 4: 112 bp and 124 bp) were digested with restriction enzymes EcoR V and Sal I , isolated with agarose gel, and inserted into pBluescript SK + vector. The subcloned plasmids were named pBMSCT and pBESCT, respectively. On the other hand, fragment 7 of about 5500 base pairs obtained by cleaving pET22b + vector with Nde I and Sal I , fragments 1 and 2 of 301 base pairs prepared in Examples 1 and 2, and pBESCT and pBMSCT were digested with EcoR V and Sal I. Calcitonin precursor gene fragments 3 and 4 isolated on gels were linked with ligase, respectively. The completed vector was designed to translate the gene by T7 promoter and T7 terminator and to express calcitonin precursor gene fused with CPY propeptide and named plasmids pEHCPYE-SCT and pEHCPYM-SCT, respectively (Fig. 1). , 2). Two vectors were transformed into E. coli BL21 (DE3) (Sambrook, J., Fritsch, EE, Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual.2nd edition.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York). Transformants E. coli BL21 (DE3) / pEHCPYE-SCT and E. coli BL21 (DE3) / pEHCPYM-SCT were deposited with the KCTC 0587BP and KCTC 0588BP at the Biotechnology Research Institute Gene Bank.

<실시예 4> 융합 인체 부갑상선 호르몬 단편(1-34) 발현 벡타의 제작<Example 4> Preparation of fusion human parathyroid hormone fragment (1-34) expression vector

인체 부갑상선 호르몬 단편(1-34 아미노산) 유전자의 제작을 위하여 인체 부갑상선 호르몬 분비생산을 위한 효모용 벡타 pG10hPTH(1-84) (대한민국 특허출원번호 97-47147 : KCTC 균주 기탁번호 0363BP)를 모형사슬로 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다.Yeast vector pG10hPTH (1-84) (Korean Patent Application No. 97-47147: KCTC Strain Accession No. 0363BP) for yeast for the production of human parathyroid hormone fragment (1-34 amino acid) gene for the production of human parathyroid hormone fragment (1-34 amino acid) gene PCR was performed. Primers used for PCR are as follows.

(서열번호 10)(SEQ ID NO: 10)

5'- GGG GAT ATC GAT GAC GAT GAC AAA TCT GTT TCT GAA ATT CAA TTG5'- GGG GAT ATC GAT GAC GAT GAC AAA TCT GTT TCT GAA ATT CAA TTG

(서열번호 11)(SEQ ID NO: 11)

5'- GGG GTC GAC TCA GAA GTT GTG AAC GTC5'- GGG GTC GAC TCA GAA GTT GTG AAC GTC

프라이머는 CPY 프로펩타이드와 연결될 수 있도록EcoR V제한효소 절단부위를 도입하였으며 엔테로키나제로 절단될 수 있는 아스파라긴 4개와 라이신 1개(DDDDK), 그리고 34개의 인체 부갑상선 호르몬(활성부위)을 코딩하는 유전자가 발현될 수 있도록 설계하였으며 최종적으로Sal I로 절단될 수 있도록 제한효소 절단부위를 도입하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 5 : 115 bp)은 제한효소EcoR V와Sal I으로 절단하여 아가로스 젤로 분리 후 pBluescript SK+ 벡타에 삽입하였다. 상기와 같이 서브클로닝된 플라스미드를 pBEhPTHF라고 명명하였다. 한편 실시예 3에서 사용한 단편 7과 실시예 1에서 제작된 301 염기쌍의 단편 1 그리고 제한효소EcoR V와Sal I으로 절단하여 아가로스 젤로 분리한 인체 부갑상선 호르몬 단편(1-34) 유전자를 리가제로 연결하여 발현 벡타 pEHCPYE-hPTHF를 얻었다(도면 3). 제작된 벡타는 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였으며 형질전환체E. coliBL21(DE3)/ pEHCPYE-hPTHF는 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0589BP번으로 기탁하였다.Primer introduced EcoR V restriction enzyme cleavage site to connect with CPY propeptide and gene encoding 4 asparagine, 1 lysine (DDDDK) and 34 human parathyroid hormone (active site) that can be cleaved by enterokinase It was designed to be expressed and finally a restriction enzyme cleavage site was introduced to be cleaved with Sal I. The fragment obtained by PCR (fragment 5: 115 bp) was digested with restriction enzymes EcoR V and Sal I , separated with agarose gel, and inserted into pBluescript SK + vector. The plasmid subcloned as above was named pBEhPTHF. On the other hand, fragment 7 used in Example 3 and fragment 1 of the 301 base pair prepared in Example 1, and human parathyroid hormone fragment (1-34) gene cleaved with restriction enzymes EcoR V and Sal I and separated by agarose gel were linked with ligase. The expression vector pEHCPYE-hPTHF was obtained (FIG. 3). The produced vector was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), and transformant E. coli BL21 (DE3) / pEHCPYE-hPTHF was deposited with KCTC 0589BP in the Bank of Biotechnology.

<실시예 5> 융합 글루카곤 발현 벡타의 제작Example 5 Preparation of Fusion Glucagon Expression Vector

인체 글루카곤 유전자의 제작을 위하여 인체 유래의 글루카곤 유전자를 단일사슬로 합성하여 접합하였다. 글루카곤 구조 유전자 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 하기 서열을 갖는 4개의 올리고뉴클레오티드 서열번호 12,서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 나누어 DNA 합성기 (Applied Biosystems사, Model 391, 미국)를 사용하여 합성하였다.For the production of human glucagon gene, the human glucagon gene was synthesized in a single chain and conjugated. The polynucleotide encoding the glucagon structural gene sequence was divided into four oligonucleotides SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 using the DNA synthesizer (Applied Biosystems, Model 391, USA) Synthesized.

(서열번호 12)(SEQ ID NO: 12)

5'- CTA GAT AAA AGG CAT TCA CAG GGC ACA TTC ACC AGT GAC TAC AGC AAG TAT-3'5'- CTA GAT AAA AGG CAT TCA CAG GGC ACA TTC ACC AGT GAC TAC AGC AAG TAT-3 '

(서열번호 13)(SEQ ID NO: 13)

3'- TA TTT TCC GTA AGT GTC CCG TGT AAG TGG TCA CTG ATG TCG TTC ATA GAC CTG AGG-5'3'- TA TTT TCC GTA AGT GTC CCG TGT AAG TGG TCA CTG ATG TCG TTC ATA GAC CTG AGG-5 '

(서열번호 14)(SEQ ID NO: 14)

5'- CTG GAC TCC AGG CGT GCC CAA GAT TTT GTG CAG TGG TTG ATG AAT ACC TGA ACA G-3'5'- CTG GAC TCC AGG CGT GCC CAA GAT TTT GTG CAG TGG TTG ATG AAT ACC TGA ACA G-3 '

(서열번호 15)(SEQ ID NO: 15)

3'- TCC GCA CGG GTT CTA AAA CAC GTC ACC AAC TAC TTA TGG ACT TGT CAG CT-5'3'- TCC GCA CGG GTT CTA AAA CAC GTC ACC AAC TAC TTA TGG ACT TGT CAG CT-5 '

상기 올리고뉴클레오티드 서열번호 12, 13, 14, 및 15을 각각 1μl(100 pmoles)씩 혼합하여 폴리뉴클레오티드 인산화 효소(T4 polynucleotide kinase, 베링거 만하임사, 독일)로 인산화 시킨 다음 회합(annealing)반응으로 이중쇄를 형성시켰다. 리가제(T4 DNA ligase, 베링거 만하임사)로 각각의 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 연결한 다음 아가로스 젤 전기영동하여 글루카곤 구조 유전자를 코딩하는 약 110 염기 쌍의 단편을 분리하였다. 분리된 단편은 아가로스 젤로 분리 후 pBluescript SK+ 벡타에 삽입하였다. 상기와 같이 서브클로닝된 플라스미드를 pBEGLU라고 명명하였다. pBEGLU를 이용하여 제한효소 부위와 파트너 절단부위를 넣기위해 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다.The oligonucleotides Nos. 12, 13, 14, and 15 were mixed with 1 μl (100 pmoles), respectively, and phosphorylated with a polynucleotide kinase (T4 polynucleotide kinase, Boehringer Mannheim, Germany) and then double-stranded by an annealing reaction. Was formed. Ligase (T4 DNA ligase, Boehringer Mannheim) linked each double-stranded oligonucleotide followed by agarose gel electrophoresis to separate fragments of about 110 base pairs encoding the glucagon structural gene. The separated fragments were separated with agarose gel and inserted into pBluescript SK + vector. The plasmid subcloned as above was named pBEGLU. PCR was performed using pBEGLU to add restriction sites and partner cleavage sites. Primers used for PCR are as follows.

(서열번호 16)(SEQ ID NO: 16)

5'- GGG GAT ATC GAT GAC GAT GAC AAA CAT TCA CAG GGC ACA TTC ACC5'- GGG GAT ATC GAT GAC GAT GAC AAA CAT TCA CAG GGC ACA TTC ACC

(서열번호 17)(SEQ ID NO: 17)

5'- GGG GTC GAC TCA GGT ATT CAT CAA CC5'- GGG GTC GAC TCA GGT ATT CAT CAA CC

프라이머는 CPY 프로펩타이드와 연결될 수 있도록EcoR V제한효소 절단 부위를 두었으며 엔테로키나제로 절단될 수 있는 아스파라긴 4개와 라이신 1개 (DDDDK), 그리고 29개의 인체 글루카곤 유전자가 발현될 수 있도록 설계하였으며 최종적으로Sal I로 절단될 수 있도록 제한효소 절단부위를 두었다. PCR로 얻어진 단편(단편 5 : 115 bp)은 제한효소EcoR V와Sal I으로 절단하여 아가로스 젤로 분리 후 실시예 3에서 사용한 단편 7과 실시예 1에서 제작된 301 염기쌍의 단편 1과 함께 리가제로 연결하여 발현 벡타 pEHCPYE-GLU를 얻었다(도면 4). 제작된 벡타는 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였으며 형질전환체E.coliBL21(DE3)/pEHCPYE-GLU는 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0590BP번으로 기탁하였다.The primers have an EcoR V restriction enzyme cleavage site for linkage with CPY propeptide and are designed to express 4 asparagine, 1 lysine (DDDDK), and 29 human glucagon genes that can be cleaved by enterokinase. A restriction enzyme cleavage site was placed so that it could be cleaved with Sal I. The fragment obtained by PCR (fragment 5: 115 bp) was digested with restriction enzymes EcoR V and Sal I , separated with agarose gel, and then fragment 7 of fragment 3 used in Example 3 and fragment 1 of 301 base pair prepared in Example 1, followed by ligase. In connection, expression vector pEHCPYE-GLU was obtained (Fig. 4). The produced vector was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), and the transformant E. coli BL21 (DE3) / pEHCPYE-GLU was deposited with KCTC 0590BP in the Bank of Biotechnology.

<실시예 6> 융합 폴리펩타이드들의 발현Example 6 Expression of Fusion Polypeptides

형질전환체E.coliBL21(DE3)/pEHCPYE-SCT,E.coliBL21(DE3)/pEHCPYM-SCT,E.coliBL21(DE3)/pEHCPYE-hPTHF,E.coliBL21(DE3)/pEHCPYE-GLU는 LB(효모 엑기스 0.5%, 트립톤 1%, NaCl 1%) 고체배지에서 배양하였다. 배양된 균체는 앰피실린 (ampicillin)이 50 μg/mL 들어있는 LB 액체배지에 접종하여 0.6 OD까지 배양시킨 후 1 mM 농도의 IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가한 다음 3시간 더 배양하여 융합 폴리펩타이드 유전자들이 발현되도록 하였다.Transformants E. coli BL21 (DE3) / pEHCPYE-SCT, E.coli BL21 (DE3) / pEHCPYM-SCT, E.coli BL21 (DE3) / pEHCPYE-hPTHF, E.coli BL21 (DE3) / pEHCPYE-GLU Were incubated in LB (yeast extract 0.5%, tryptone 1%, NaCl 1%) solid medium. The cultured cells were inoculated in LB liquid medium containing 50 μg / mL of ampicillin and cultured up to 0.6 OD, followed by addition of 1 mM concentration of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside), followed by further 3 hours. Fusion polypeptide genes were expressed.

<비교예 1> 형질전환 되지않은 대장균의 IPTG를 이용한 발현 유도Comparative Example 1 Induction of Expression of Untransformed Escherichia Coli Using IPTG

플라스미드를 갖지않은 대장균을 실시예 6과 동일한 방법과 조건으로 LB 액체배지에서 성장시켰다.E. coli without the plasmid was grown in LB medium using the same methods and conditions as in Example 6.

<실시예 7> 발현 유도된 융합 단백질들의 발현확인Example 7 Expression Confirmation of Expression-Induced Fusion Proteins

실시예 6 및 비교 실시예 1에서 얻은 배양액을 5,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 균체를 각각 회수하였다. 발현된 융합 폴리펩타이드의 용해도를 알아보기 위하여 각각의 균체를 초음파 파괴(Branson사 Sonifier 450, 3 KHz, 3 watts, 5 min)하여 용해성 분획과 비용해성 분획으로 나누어 발현을 확인하였다. 분리된 균체는 전체 분획, 용해성 분획, 비용해성 분획으로 나누어 단백질 용해 완충액 (12 mM Tris-Cl, pH 6.8, 5% glycerol, 2.88 mM 머캅토에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브로모페놀 블루) 100 ㎕에 녹이고 100℃에서 5 분간 가열하여 생성된 용액 중 각 10 ㎕씩을 0.75 mm 두께의 15% 분리 젤 (separating gel; pH 8.8, 가로 10 cm, 세로 6 cm) 위에 5% 저장 젤 (stacking gel; pH 6.8, 가로 10 cm, 세로 2 cm)을 덮은 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩한 후 100-300 볼트, 25 mA로 1 시간 동안 전기영동하고 쿠마시 염색액으로 염색하였다. 융합 칼시토닌 전구체의 젤 스케닝 결과(BioRad, Imaging Densitometer GS-700, USA) IPTG 유도 후 발현율은 시아노젠 브로마이드 절단용 융합 칼시토닌 전구체와 엔테로키나제 절단용 융합 칼시토닌 전구체가 각각 46.7%와 42.3%였고 대부분이 비용해성 분획에 존재하여 전체 발현량 중 94.2%와 91.6%가 불용성 응집체(inclusion body)로 존재하였다(도면 5). 하지만 융합 인체 부갑상선 호르몬 단편의 경우 발현율은 전체 단백질 중 47.6%였으며 불용성 응집체에 79.4%, 용해성 분획에 20.6%가 존재함이 확인되었다(도면 6). 한편 융합 글루카곤은 14.1%의 비교적 낮은 발현율을 보였으나 비용해성 분획에는 33.8%, 용해성분획에는 66.2%가 존재하였다(도면 7). 따라서, 융합 글루카곤의 경우는 대장균의 파쇄 후 불용성 응집체의 용해 및 리폴딩(refolding)과정 없이 용해성 분획을 직접 정제에 적용할 수 있다는 장점이 있다.The cultures obtained in Example 6 and Comparative Example 1 were centrifuged at 5,000 rpm for 5 minutes to recover the cells. In order to determine the solubility of the expressed fusion polypeptide, each cell was ultrasonically disrupted (Branson Sonifier 450, 3 KHz, 3 watts, 5 min), and the expression was confirmed by dividing into a soluble fraction and a non-soluble fraction. The isolated cells were divided into whole fraction, soluble fraction and non-soluble fraction by protein lysis buffer (12 mM Tris-Cl, pH 6.8, 5% glycerol, 2.88 mM mercaptoethanol, 0.4% SDS, 0.02% bromophenol blue) 100 Each 10 μl of the resulting solution by dissolving in μl and heating at 100 ° C. for 5 minutes was added to a 5% stacking gel on a 0.75 mm thick 15% separating gel (pH 8.8, 10 cm wide, 6 cm long); After loading onto a polyacrylamide gel covered with pH 6.8, 10 cm wide, 2 cm long), it was electrophoresed at 100-300 volts, 25 mA for 1 hour and stained with Coomassie stain. Results of gel screening of the fusion calcitonin precursor (BioRad, Imaging Densitometer GS-700, USA) The expression rate after IPTG induction was 46.7% and 42.3%, respectively, for the fusion calcitonin precursor for cyanogen bromide cleavage and the fusion calcitonin precursor for enterokinase cleavage. In the soluble fraction, 94.2% and 91.6% of the total expression amount was present as an insoluble inclusion body (Fig. 5). However, the expression rate of the fused human parathyroid hormone fragment was 47.6% of the total protein, 79.4% in the insoluble aggregate and 20.6% in the soluble fraction (Fig. 6). On the other hand, fusion glucagon showed a relatively low expression rate of 14.1%, but 33.8% was found in the insoluble fraction and 66.2% in the soluble component fraction (Fig. 7). Therefore, in the case of fused glucagon, there is an advantage that the soluble fraction can be directly applied to purification without dissolving and refolding insoluble aggregates after crushing E. coli.

<실시예 8> 시아노젠 브로마이드와 엔테로키나제를 이용한 융합 칼시토닌 전구체와 융합 인체 부갑상선 호르몬 단편의 절단Example 8 Cleavage of Fused Calcitonin Precursor and Fused Human Parathyroid Hormone Fragment Using Cyanogen Bromide and Enterokinase

발현된 융합 칼시토닌 전구체의 비용해성 분획을 각각 분리하여 8 M 유레아(urea)에 24시간 용해시켰다. 용해된 융합 칼시토닌 전구체는 투석 막 (Spectrum사, USA, 분자량 3500)을 사용하여 유레아를 제거한 후 동결건조하였다. 각각의 융합 칼시토닌 전구체는 시아노젠 브로마이드와 엔테로키나제 1 unit(50 μg 융합 단백질를 절단할 수 있는 농도)로 절단하였다. 시아노젠 브로마이드 처리의 경우 50 μg의 융합 칼시토닌 전구체를 70% 포름산에 완전히 용해시킨 후 g 융합 단백질당 200 mg 시아노젠 브로마이드 농도로 16시간 상온에서 반응하였다. 한편 엔테로키나제 절단용 융합 칼시토닌 전구체 50 μg을 10 X 반응완충용액 (20 mM Tris-Cl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl₂)과 함께 엔테로키나제 1 unit으로 처리하여 역시 상온에서 24시간 반응하였다. 융합 칼시토닌 전구체는 절단 후 소형 폴리펩타이드의 절단확인을 위하여 트리신-SDS(Tricine-sodiumdodecylsulfate)-아크릴아마이드 젤을 사용하였다(Hermann, S. etal, 1987, Anal. Biochem., 166: 368-379). 16. 5% 분리 젤(separating gel; pH 8.45, 가로 12 cm, 세로 10 cm)에는 밴드의 해상력을 높이기 위하여 유레아(urea, 6 M)를 첨가하였고 그 위에 큰 분자량 단백질의 분리 및 작은 분자량 단백질의 해상력 증가를 목적으로 10% 공간 젤(spacer gel; pH 8.45, 가로 12 cm, 세로 2 cm)을 두었으며 4% 저장 젤(stacking gel; pH 8.45, 가로 12 cm, 세로 2 cm)에 샘플을 로딩하였다. 절단된 융합단백질 50 ㎕씩을 각각 단백질 용해 완충액 (12 mM Tris-Cl, pH6.8, 5% glycerol, 2.88 mM 머캅토에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브로모페놀 블루) 50 ㎕에 녹이고 100℃에서 5 분간 가열하여 생성된 용액 중 각 20 ㎕씩을 로딩한 후 100-300 볼트, 30 mA로 2 시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤은 고정액(Fixing solution: 50% 메탄올, 10% 아세트 산)에서 30분동안 고정화한 후 쿠마시 염색액으로 염색하였다(도면 8). 원형 칼시토닌(시그마사, 미국) 5 ㎍과 비교할 때 젤 스케닝 결과 시아노젠 브로마이드 절단용 융합 칼시토닌 전구체는 66.3%의 절단율을 보였고 엔테로키나제 절단용 융합 칼시토닌 전구체는 99% 이상의 높은 절단율을 각각 나타내었다. 발현된 융합 인체 부갑상선 호르몬 단편 또한 비용해성 분획을 분리하여 동일한 방법으로 회수한 후 동량을 엔테로키나제(1 Unit)로 10 X 반응완충용액과 함께 상온에서 24시간 반응하여 트리신 아크릴 아마이드 전기영동하였으며 인체 부갑상선 호르몬 단편(시그마사, 미국) 2 ㎍을 control로 비교할 때 젤 스케닝 결과 99% 이상의 절단율을 보였다(도면 9).The insoluble fractions of the expressed fused calcitonin precursors were each isolated and dissolved in 8 M urea for 24 hours. The dissolved fusion calcitonin precursor was lyophilized after removal of urea using a dialysis membrane (Spectrum, USA, molecular weight 3500). Each fusion calcitonin precursor was digested with 1 unit of cyanogen bromide and enterokinase (a concentration capable of cleaving 50 μg fusion protein). In the case of cyanogen bromide treatment, 50 μg of the fused calcitonin precursor was completely dissolved in 70% formic acid, followed by reaction at room temperature for 16 hours at 200 mg cyanogen bromide concentration per fusion protein. Meanwhile, 50 μg of the fusion calcitonin precursor for enterokinase cleavage was treated with 1 unit of enterokinase with 10 X reaction buffer solution (20 mM Tris-Cl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl ₂ ) to react at room temperature for 24 hours. It was. As the fusion calcitonin precursor, tricine-sodiumdodecylsulfate (acrylamide) gel was used for cleavage of small polypeptides after cleavage (Hermann, S. etal, 1987, Anal. Biochem., 166: 368-379). . 16. In a 5% separating gel (pH 8.45, 12 cm wide and 10 cm long), urea (6 M) was added to increase the resolution of the bands. A 10% spacer gel (pH 8.45, 12 cm wide and 2 cm long) was placed for increased resolution and samples were loaded onto a 4% stacking gel (pH 8.45, 12 cm wide and 2 cm long). It was. 50 μl of the cleaved fusion protein was dissolved in 50 μl of protein lysis buffer (12 mM Tris-Cl, pH6.8, 5% glycerol, 2.88 mM mercaptoethanol, 0.4% SDS, 0.02% bromophenol blue) at 100 ° C. Each 20 μl of the resulting solution by heating for 5 minutes was loaded and then electrophoresed at 100-300 volts, 30 mA for 2 hours. After the electrophoresis gel was fixed in a fixed solution (50% methanol, 10% acetic acid) for 30 minutes and stained with Coomassie stain (Fig. 8). Compared to 5 μg of circular calcitonin (Sigma, USA), gel scanning showed that the fused calcitonin precursor for cyanogen bromide cleavage showed a 66.3% cleavage rate and the fusion calcitonin precursor for enterokinase cleavage showed a high cleavage rate of more than 99%, respectively. . The expressed fusion human parathyroid hormone fragment was also recovered from the insoluble fraction by the same method, and the same amount was reacted with enterokinase (1 Unit) for 10 hours with 10 X reaction buffer solution at room temperature for electrophoresis of tricin acrylamide. Compared to 2 μg of parathyroid hormone fragments (Sigma, USA) as a control, gel screening showed a cut rate of 99% or more (Fig. 9).

<실시예 9> 금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 융합 인체 글루카곤의 정제 및 엔테로키나제를 이용한 절단Example 9 Purification of Fused Human Glucagon Using Metal Affinity Chromatography and Cleavage Using Enterokinase

융합 글루카곤의 경우 용해성 분획으로부터 융합 글루카곤을 분리하기위해 금속친화성 태그인 6개의 히스티딘을 이용한 금속친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 레진은 Pharmacia사(스웨덴)의 Fast Flow Chelating Sepharose를 사용하였고 컬럼은 Amicon사(미국)의 G 10 X 250을 사용하였다. 충진 부피가 5 mL가량 되도록 레진을 넣고 증류수로 충분히 씻어준 후 니켈용액(NiSO₄)을 통과시키면 레진과 금속 이온간의 결합이 이루어진다. 결합을 이루지 못한 금속이온은 다시 증류수로 제거하였으며 20 mM sodium acetate, 1 M NaCl 완충용액으로 평형화시켰다. 여기에 1.0 mL/min의 유속으로 시료를 로딩한 후 완충용액으로 충분히 세척하고 0-500 mM 이미다졸(imidazole) 농도구배를 주어 융합 단백질 분획을 회수하였다. 금속 친화성 컬럼에서 정제된 융합 글루카곤은 상기 실험과 동일하게 엔테로키나제 처리 후 실시예 8과 같은 방법으로 트리신 아크릴아마이드 전기영동하였다(도면 10). 인체 글루카곤(시그마사, 미국) 5 ㎍을 control로 사용하였으며 젤 스캐닝 결과 99% 이상의 절단율을 나타내었다.In the case of fused glucagon, metal affinity chromatography was performed using six histidines, metal affinity tags, to separate the fused glucagon from the soluble fraction. Resin was used as Fast Flow Chelating Sepharose from Pharmacia (Sweden) and G 10 X 250 from Amicon (US). After filling the resin so that the filling volume is about 5 mL, wash it well with distilled water, and pass the nickel solution (NiSO ₄ ) to form a bond between the resin and the metal ion. Unbound metal ions were removed again with distilled water and equilibrated with 20 mM sodium acetate and 1 M NaCl buffer. The sample was loaded at a flow rate of 1.0 mL / min, washed well with a buffer solution, and given a concentration gradient of 0-500 mM imidazole to recover the fusion protein fraction. Fused glucagon purified on a metal affinity column was subjected to tricin acrylamide electrophoresis in the same manner as in Example 8 after enterokinase treatment in the same manner as in the above experiment (Fig. 10). 5 ㎍ of human glucagon (Sigma, USA) was used as a control and the gel scanning resulted in a cut rate of 99% or more.

본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 CPY 프로펩타이드를 융합용 파트너로 이용하여 대장균에서 단백질 또는 소형 폴리펩타이드들을 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 사카로마이세스 세레비지애 유래 CPY 프로펩타이드를 연어 칼시토닌 전구체, 인체 부갑상선 호르몬 단편, 인체 글루카곤과같은 소형 폴리펩타이드 호르몬들을 대상으로 하여 대장균에서 실험 한 결과 대장균 내에서 분해되지 않고 불용성 응집체로 안정되게 발현됨을 확인할 수가 있다. 또한 발현된 CPY 프로펩타이드 불용성 응집체는 낮은 농도의 유레아(urea)에서도 용해되고 리폴딩(Refolding)도 용이하게 이루어지는 특성을 갖고 있는 것이 확인됨으로써 본 발명이 대장균에서 단독으로 발현시 분해되기 쉬운 폴리펩타이드의 안정적 발현을 위한 융합 파트너로써 매우 유용함을 알 수 있다.The present invention relates to a method for efficiently producing proteins or small polypeptides in Escherichia coli using Saccharomyces cerevisiae CPY propeptide as a fusion partner, and according to the present invention, Saccharomyces cerevisiae is derived. The CPY propeptide was tested in E. coli against small polypeptide hormones such as salmon calcitonin precursor, human parathyroid hormone fragment, and human glucagon. In addition, it was confirmed that the expressed CPY propeptide insoluble aggregate has a property of being dissolved in a low concentration of urea and easily refolding. It is found to be very useful as a fusion partner for stable expression.

Claims (13)

대장균을 이용한 폴리펩타이드의 발현에 있어서, 유전자 단계에서 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드 유전자를 융합파트너로 하여 목적하는 폴리펩타이드 유전자와 융합된 재조합 벡타를 제조하는 과정; 및 전기과정에 의해 얻은 재조합 벡타를 대장균에 발현시켜 얻은 융합한 폴리펩타이드로부터 융합파트너를 절단한 후 융합 파트너와 분리하는 과정에 의해 목적하는 폴리펩타이드를 얻는 것을 특징으로 하는 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드를 융합 파트너로 하여 대장균에서 폴리펩타이드를 발현하는 방법.In the expression of the polypeptide using E. coli, the step of preparing a recombinant vector fused with the desired polypeptide gene using the carboxypeptidase Y propeptide gene as a fusion partner in the gene step; And a carboxypeptidase Y propeptide, characterized by obtaining the desired polypeptide by cleaving the fusion partner from the fused polypeptide obtained by expressing the recombinant vector obtained in the above-mentioned Escherichia coli and separating it from the fusion partner. To express a polypeptide in E. coli as a fusion partner. 제 1항에 있어서, 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드는 N-말단에 친화성 태그를 붙이고 C-말단에 화학적 또는 프로테아제에 의한 절단부위가 도입된 것을 특징으로 하는 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드를 융합 파트너로 하여 대장균에서 폴리펩타이드를 발현하는 방법.2. The carboxypeptidase Y propeptide is fused to a carboxypeptidase Y propeptide, wherein the carboxypeptidase Y propeptide is tagged with an affinity tag at the N-terminus and a cleavage site by chemical or protease is introduced at the C-terminus. A method of expressing a polypeptide in E. coli as a partner. 제 2항에 있어서, N-말단의 친화성 태그는 6개의 히스티딘이 직쇄로 연결되고, C-말단은 메티오닌 또는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys으로 구성되는 것을 특징으로 하는 카복시 펩티다제 Y 프로펩타이드를 융합 파트너로 하여 대장균에서 폴리펩타이드를 발현하는 방법.3. The carboxypeptidase Y of claim 2, wherein the N-terminal affinity tag comprises six histidines linked linearly and the C-terminal consists of methionine or Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. A method of expressing a polypeptide in E. coli using the propeptide as a fusion partner. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 융합 파트너의 절단에는 C-말단이 메티오닌, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys에 대하여 각각 시아노젠 브로마이드, 엔테로키나제가 사용됨을 특징으로 하는 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드를 융합 파트너로 하여 대장균에서 폴리펩타이드를 발현하는 방법.Carboxypeptidase Y according to claim 2 or 3, wherein the cleavage of the fusion partner uses cyanogen bromide and enterokinase at the C-terminus for methionine and Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, respectively. A method of expressing a polypeptide in E. coli using the propeptide as a fusion partner. 제 1항에 있어서, 목적물인 폴리펩타이드는 활성형의 연어 칼시토닌 전구체, 인체 부갑상선 호르몬 단편(hPTH(1-34)) 및 인체 글루카곤임을 특징으로 하는 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드를 융합 파트너로 하여 대장균에서 폴리펩타이드를 발현하는 방법.The polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide of interest is an active salmon calcitonin precursor, human parathyroid hormone fragment (hPTH (1-34)) and human glucagon. A method of expressing a polypeptide in a. 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드를 이용하여 제작된 연어 칼시토닌 전구체 발현벡터 pEHCPYE-SCT.Salmon calcitonin precursor expression vector pEHCPYE-SCT prepared using carboxypeptidase Y propeptide. 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드를 이용하여 제작된 연어 칼시토닌 전구체 발현벡터 pEHCPYM-SCT.Salmon calcitonin precursor expression vector pEHCPYM-SCT prepared using carboxypeptidase Y propeptide. 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드를 이용하여 제작된 인체 부갑상선 호르몬 단편 발현벡터 pEHCPYE-hPTHF.Human parathyroid hormone fragment expression vector pEHCPYE-hPTHF prepared using carboxypeptidase Y propeptide. 카복시펩티다제 Y 프로펩타이드를 이용하여 제작된 인체 글루카곤의 발현벡터 pEHCPYE-GLU.Expression vector pEHCPYE-GLU of human glucagon prepared using carboxypeptidase Y propeptide. 청구항 6의 발현벡타로 형질전환된 형질전환체Transformant transformed with the expression vector of claim 6 E.coliBL21(DE3)/pEHCPYE-SCT (KCTC 0587BP). E. coli BL21 (DE3) / pEHCPYE-SCT (KCTC 0587BP). 청구항 7의 발현벡타로 형질전환된 형질전환체Transformant transformed with the expression vector of claim 7 E.coliBL21(DE3)/pEHCPYM-SCT (KCTC 0588BP). E. coli BL21 (DE3) / pEHCPYM-SCT (KCTC 0588BP). 청구항 8의 발현벡타로 형질전환된 형질전환체Transformant transformed with the expression vector of claim 8 E. coliBL21(DE3)/pEHCPYE-hPTHF (KCTC 0589BP). E. coli BL21 (DE3) / pEHCPYE-hPTHF (KCTC 0589BP). 청구항 9의 발현벡타로 형질전환된 형질전환체Transformant transformed with the expression vector of claim 9 E.coliBL21(DE3)/pEHCPYE-GLU (KCTC 0590BP). E. coli BL21 (DE3) / pEHCPYE-GLU (KCTC 0590BP).