KR100291743B1

KR100291743B1 - Process for preparing glycerol derivative

Info

Publication number: KR100291743B1
Application number: KR1020000045168A
Authority: KR
Inventors: 전길자; 김상희; 양현옥; 서지영; 한소엽
Original assignee: 전길자; 김상희; 한소엽
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2001-05-15
Also published as: KR20000071887A

Abstract

본 발명은 녹용(매화록)의 클로로포름 추출물중에서 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진활성을 나타내는 활성성분으로서 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물의 신규한 합성방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel method for synthesizing a compound represented by the following formula (1) as an active ingredient exhibiting hematopoietic stem cell and platelet progenitor cell proliferation promoting activity in the chloroform extract of Deer Antler (Plum).

상기식에서,In the above formula,

R₁/R₂는 9-옥타데세노일/헥사데카노일, 헥사데카노일/9-옥타데세노일, 헥사데카노일/9,12-옥타데카디에노일, 헥사데카노일/9,12,15-옥타데카트리에노일 또는 헥사데카노일/5,8,11,14-에이코사테트라에노일을 나타내며,R ₁ / R ₂ is 9-octadecenoyl / hexadecanoyl, hexadecanoyl / 9-octadecenoyl, hexadecanoyl / 9,12-octadecadienoyl, hexadecanoyl / 9,12,15 Octadecatenoyl or hexadecanoyl / 5,8,11,14-eicosatetraenoyl,

R₃는 아세틸을 나타낸다.R ₃ represents acetyl.

Description

글리세롤 유도체의 제조방법 {Process for preparing glycerol derivative}Process for preparing glycerol derivatives

본 발명은 녹용(매화록)의 클로로포름 추출물중에서 조혈모세포 및 혈소판 전구세포(megakaryocyte) 증식 촉진활성을 나타내는 활성성분으로서 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물의 신규한 합성방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel method for synthesizing a compound represented by the following formula (1) as an active ingredient exhibiting hematopoietic stem cell and platelet progenitor (megakaryocyte) proliferation promoting activity in chloroform extract of Deer Antler.

[화학식 1][Formula 1]

상기식에서,In the above formula,

R₃는 아세틸을 나타낸다.R ₃ represents acetyl.

본래, 녹용은 사슴과(Cornu cervi)에 속하는 사슴의 각화되지 않은 유각을 채취하여 건조한 것으로 인삼과 더불어 한방에서 가장 널리 사용되고 있는 생약중의 하나이며, 우리나라에서 사용되고 있는 녹용의 기원동물로는 사슴과에 속하는 매화록(Cervus nippon Temminick var. mantchuricus Swinhoe) 및 마록(Cervus elaphus L. Cornu Ceriv Pavum) 등이 있다.Originally, the deer antler is dried by collecting the unhorned shell of the deer belonging to the family Cornu cervi, and is one of the most widely used herbal medicines in Korea with ginseng. Cervus nippon Temminick var. Mantchuricus Swinhoe and Cervus elaphus L. Cornu Ceriv Pavum.

녹용은 예로부터 강장작용, 생장, 발육촉진작용, 조혈작용, 신경쇠약 치료작용, 심부전증 치료작용, 오장육부의 기능항진작용 등 다양한 효능이 있는 것으로 동의보감에 수록되어 있으며, 이외에도 자양보신, 신체활력 증강 및 심근운동개선 효과, 피로회복, 신체 저항력 증진, 건뇌안신효과 등의 효과가 고대문헌에 기록되어 있다.Deer antler has a variety of effects such as tonic, growth, growth promotion, hematopoietic, neurodebilitating, heart failure, and hyperfunction of the five intestines. And effects such as myocardial exercise improvement, fatigue recovery, physical resistance enhancement, pneumonia fiduciary effect, etc. are recorded in ancient literature.

녹용의 신비한 약효를 규명하기 위하여 그의 성분에 관한 다양한 연구가 이루어져 왔으며, 그 결과 녹용으로 부터 유리아미노산과 미량원소, 육탄당 및 오탄당, 헥소사민, 우론산, 시알산, 산 뮤코다당류인 히알우론산과 황산콘드로이틴 A, 다양한 지방산, 프로스타글란딘류 등의 존재가 확인되었으며, 또한 당지질 및 인지질, 콜레스테롤, 히포크산틴, 콜레스트-5-엔-3β, 7α-디올, 콜레스테롤 에스테르, 폴리아민 등이 분리, 보고되었다. 이 밖에도, 녹용에는 에스트론, 에스트라디올 리셉터 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.Various studies have been conducted to investigate the mysterious effects of deer antler, and as a result, free amino acid and trace elements, hexasaccharide and octane sugar, hexamine, uronic acid, sialic acid, and hyaluronic acid, which are acid mucopolysaccharides, The presence of chondroitin sulfate A, various fatty acids, prostaglandins, etc. was confirmed, and glycolipids and phospholipids, cholesterol, hypoxanthine, cholesterol, 5-en-3β, 7α-diol, cholesterol esters, polyamines, etc. were isolated and reported. . In addition, it is known that the antler contains estrone, estradiol receptor, and the like.

따라서 본 발명자들은 민간약으로 뛰어난 약효를 갖는 것으로 알려져 있는 녹용에서 조혈작용에 대한 효능을 갖는 성분을 찾고자 본 연구를 하게 되었다.Therefore, the present inventors have made this study to find an ingredient having an effect on hematopoiesis in antler, which is known to have an excellent drug as a folk medicine.

현재 우리나라에서 제 1위의 사망원인인 암질환은 매년 증가추세인 것으로 알려져있다. 그러나 항암치료를 목적으로 사용되는 화학요법, 방사선 치료요법 등은 암세포 뿐 아니라 일반 정상 골수세포, 특히 면역 및 조혈기능을 조절하는 조혈세포(hematopoietic cell)까지도 동시에 손상시킴으로써 인체의 조혈기관과 면역기능을 마비시키는 것이 심각한 문제점으로 지적되어 오고 있다. 이러한 심각한 골수세포의 손상에 의한 백혈구나 혈소판의 감소로 인한 면역기능의 마비는 곧 사망으로 이어지게 된다. 따라서, 조혈모세포원의 성장을 촉진시켜 저하되어 있는 면역기능 및 혈액세포들의 기능을 증진시킬 필요가 있는 질환, 특히 항암제 투여 및 방사선 조사 후에 골수기능이 저하된 상태에 있는 악성고형암, 악성혈액질환, 재생불량성빈혈, 선천성 간헐적 백혈구 감소증, 선천성 면역 및 조혈모세포 결여증, 말기 신부전증으로 인해 초래되는 빈혈, 백혈구 감소로 인한 감염, 인구 고령화로 인한 골수기능 저하증 등의 임상 각 분야에서 전반적으로 활용될 수 있는 신물질의 개발이 절실히 요청되고 있는 실정이다.Currently, cancer disease, the number one cause of death in Korea, is known to increase every year. However, chemotherapy and radiation therapy used for chemotherapy damage not only cancer cells but also normal normal bone marrow cells, especially hematopoietic cells that regulate immunity and hematopoietic function. Paralysis has been pointed out as a serious problem. Paralysis of immune function due to the reduction of leukocytes or platelets caused by such severe bone marrow cell damage will lead to death. Therefore, diseases that need to promote the growth of hematopoietic stem cell growth and reduced the function of immune and blood cells, in particular, malignant solid cancer, malignant blood disease, It can be used in various clinical fields, such as aplastic anemia, congenital intermittent leukopenia, congenital immunity and hematopoietic cell deficiency, anemia caused by end stage renal failure, infection due to leukocyte reduction, and myelo function due to aging population. The development of new materials is urgently required.

면역기능 및 조혈기능의 증진과 관련하여 조혈모세포에 대한 연구가 활발히 진행되고, 이에 따라 조혈모세포에 대한 지식이 급증함에 따라 최근에 몇가지 조혈모세포 성장촉진인자가 개발되어 이들 중에서 GM-CSF(granulocyte macrophage- colony stimulating factor), G-CSF(granulocyte-colony stimula- ting factor), 에리스로포이에틴(Erythropoietin) 등은 이미 상품화에 성공하였다. GM-CSF와 G-CSF는 과립구 및 거핵구는 물론 조혈모세포의 증식과 분화를 유도하고, 골수로부터 조혈모세포들이 말초혈액으로 이동(mobilization)하는 것을 촉진시킨다.With respect to the enhancement of immune and hematopoietic functions, studies on hematopoietic stem cells have been actively conducted. Accordingly, as the knowledge of hematopoietic stem cells has increased rapidly, several hematopoietic stem cell growth-promoting factors have recently been developed and among them, GM-CSF (granulocyte macrophage) Colony stimulating factor, granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), and erythropoietin have already been commercialized. GM-CSF and G-CSF induce proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells, as well as granulocytes and megakaryocytes, and promote the mobilization of hematopoietic stem cells from bone marrow into peripheral blood.

상기와 같은 조혈모세포 성장촉진인자를 발견하기 위해서, 본 발명자들은 수천년간 동양에서 보혈강장제로 사용되어 온 녹용을 대상으로 하여 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 녹용의 특정 추출물, 특히 녹용의 클로로포름 추출물중에 조혈모세포의 성장을 촉진시키는 물질이 존재함을 확인할 수 있었으며, 이에 대한 지속적인 연구를 통하여 녹용에서 조혈모세포 성장 촉진효능이 가장 높은 성분을 찾아내어 그 성분을 분리, 정제하고, 그 활성성분의 구조를 밝혀내는 한편, 그 활성성분을 화학적으로 합성하는 방법을 개발하는데 성공한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.In order to find the hematopoietic stem cell growth promoting factor as described above, the present inventors conducted a study on the antler, which has been used as a hematopoietic tonic in the East for thousands of years. As a result, the present inventors were able to confirm that there is a substance that promotes the growth of hematopoietic stem cells in a specific extract of deer antler, especially chloroform extract of deer antler. Finding and separating and purifying the components, revealing the structure of the active ingredient, while successfully developing a method for chemically synthesizing the active ingredient, the present invention has been completed.

따라서, 본 발명은 녹용으로 부터 찾아낸 조혈모세포 성장촉진인자의 합성방법을 제공함을 목적으로 한다. 본 발명의 방법에 따라 제조되는 조혈모세포 성장촉진인자는 조혈모세포원의 성장을 촉진시켜 저하된 면역기능 및 혈액세포들의 기능 증진이 필요한 질환, 특히 항암제 및 방사선 조사후 골수기능이 저하된 상태에 있는 악성고형암, 악성혈액질환, 재생불량성빈혈, 선천성 간헐적 백혈구감소증, 선천성 면역 및 조혈 모세포 결여증, 말기 신부전증으로 인해 초래되는 빈혈, 백혈구 감소로 인한 감염, 인구 고령화로 인한 골수기능 저하증 등 임상 각 분야에 전반적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for synthesizing hematopoietic stem cell growth promoting factors found from antler. The hematopoietic stem cell growth promoting factor prepared according to the method of the present invention promotes the growth of a hematopoietic stem cell, which is a disease that requires a reduced immune function and the function of blood cells, in particular, a state in which the bone marrow function is reduced after anticancer drugs and irradiation Malignant solid cancer, pernicious blood disease, aplastic anemia, congenital intermittent leukopenia, congenital immunity and hematopoietic stem cell deficiency, anemia caused by end stage renal failure, infection due to leukocyte reduction, and myeloid dysfunction due to aging population It is expected to be utilized in general.

도 1 은 실시예 1 의 과정에 따르는 녹용(Cervus nippon)의 추출방법을 나타낸 도식이다.1 is a schematic diagram showing a method of extracting antler (Cervus nippon) according to the process of Example 1.

도 2 는 실시예 2 내지 5 의 과정에 따르는 녹용의 클로로포름 추출물(CN-C)의 분획화방법을 나타낸 것이다.Figure 2 shows the fractionation method of chloroform extract (CN-C) of antler according to the procedure of Examples 2 to 5.

도 3 은 실시예 1 내지 5 의 방법에 따라 녹용(매화록)을 추출 및 정제하는 각 단계에서 수득된 분획의 고성능 박층크로마토그램(TLC)을 나타낸 것이다[a: CN-C-2-E-a-Mi, b: CN-C, c: CN-C-2, d: CN-C-2-E, e: CN-C-2-E-a, f: CN-C-2-E-a-Mi].Figure 3 shows a high performance thin layer chromatogram (TLC) of the fraction obtained in each step of extracting and purifying the antler (plum) according to the method of Examples 1 to 5 [a: CN-C-2-Ea- Mi, b: CN-C, c: CN-C-2, d: CN-C-2-E, e: CN-C-2-Ea, f: CN-C-2-Ea-Mi].

도 4 는 실시예 8-2 에 따라 본 발명에서 분리·확인된 녹용 추출물의 활성물질인 화학식 1 의 화합물을 투여한 후의 마우스의 비장 무게를 비교하여 나타낸 그래프이다[1: 대조군, 2: 녹용의 수용성 추출물 투여, 3: GM-CSF 투여, 4: KJ-1 투여, 5: KJ-4 투여, 6: KJ-5 투여, 7: KJ-4+GM-CSF 투여, 8: KJ-5+GM-CSF 투여].Figure 4 is a graph showing the comparison of the spleen weight of mice after administration of the compound of formula 1, the active substance of the antler extract isolated and confirmed in the present invention according to Example 8-2 [1: control, 2: antler Aqueous extract administration, 3: GM-CSF administration, 4: KJ-1 administration, 5: KJ-4 administration, 6: KJ-5 administration, 7: KJ-4 + GM-CSF administration, 8: KJ-5 + GM -CSF administration].

도 5 는 실시예 8-2 에 따라 대조군 마우스의 비장을 절단한 현미경사진 (×200)이다.5 is a micrograph (× 200) of a spleen of a control mouse according to Example 8-2.

도 6 은 실시예 8-2 에 따라 GM-CSF(100U)를 투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.6 is a micrograph (× 200) of a spleen of a mouse administered with GM-CSF (100U) according to Example 8-2.

도 7 은 실시예 8-2 에 따라 화합물 KJ-1을 투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.7 is a micrograph (× 200) of a spleen of a mouse administered with Compound KJ-1 according to Example 8-2.

도 8 은 실시예 8-2 에 따라 화합물 KJ-4를 투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.8 is a micrograph (× 200) of a spleen of a mouse administered with compound KJ-4 according to Example 8-2.

도 9 는 실시예 8-2 에 따라 화합물 KJ-4 와 GM-CSF를 병용투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.9 is a micrograph (× 200) of a spleen of a mouse administered with a combination of Compound KJ-4 and GM-CSF according to Example 8-2.

도 10 은 실시예 8-2 에 따라 화합물 KJ-5를 투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.FIG. 10 is a micrograph (× 200) of a spleen of a mouse administered with Compound KJ-5 according to Example 8-2. FIG.

도 11 은 실시예 8-2 에 따라 화합물 KJ-5 와 GM-CSF를 병용투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.FIG. 11 is a micrograph (× 200) of a spleen of a mouse administered with a compound KJ-5 and GM-CSF in combination with Example 8-2. FIG.

본 발명에 따르면, 먼저 녹용의 클로로포름 추출물 또는 그로부터 분리·정제된 분획들을 유효성분으로 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식촉진용 조성물이 제공된다.According to the present invention, there is provided a composition for promoting proliferation of hematopoietic stem cells and platelet progenitor cells containing chloroform extract of antler or fractions separated and purified therefrom as an active ingredient.

조혈작용(hematopoiesis)은 매우 특수한 기능과 한정된 수명을 가지고 있는 수많은 성숙 혈액세포들이 생성되어 계속적으로 공급되는 일련의 발생과정이다. 조혈계는 발생능력(developmental capacities)의 체계에 따라 정렬될 수 있는 조혈전구세포(hematopoietic precursor cell)들의 매우 복잡한 조직체계로 구성되어 있다. 모든 계통의 성숙 혈액세포들의 근원지는 골수인데 이 골수조직은 여러 단계의 성숙 단계에 있는 세포들을 포함하고 있으며, 골수에서 생성된 혈액세포들은 일정 시간이 지나면 말초조직에서 파괴되고, 이러한 과정은 동물의 일생을 통하여 계속적으로 반복해서 일어나게 된다. 조혈작용은 여러 가지 계통의 세포로 증식, 분화할 수 있는 조혈모세포군(Hematopoietic Stem Cells: HSCs)에 의하여 유지되고 있다. 초기에 조혈모세포는 다능성 조혈모세포(Pluripotent Hematopoietic Stem Cells: PHSCs)라고 하는데, 아직까지도 잘 밝혀져 있지 않은 여러 과정을 거쳐서 매우 다양한 성숙 혈액세포들로 분화할 수 있는 조혈전구세포들을 만들어 내게 되고, 이 조혈전구세포들은 그 다음 단계의 더 분화된 세포들을 생산하게 된다.Hematopoiesis is a series of developmental processes in which a large number of mature blood cells with very specific functions and a limited lifespan are produced and continuously supplied. The hematopoietic system consists of a very complex tissue system of hematopoietic precursor cells that can be arranged according to a system of developmental capacities. The source of mature blood cells of all strains is the bone marrow, which contains cells in various stages of maturation. Blood cells produced in the bone marrow are destroyed in peripheral tissues over a period of time. It happens continually and repeatedly throughout life. Hematopoietic action is maintained by Hematopoietic Stem Cells (HSCs), which can proliferate and differentiate into cells of various lineages. Initially, hematopoietic stem cells are called pluripotent hematopoietic stem cells (PHSCs), which have undergone a number of unknown processes to produce hematopoietic progenitor cells that can differentiate into a wide variety of mature blood cells. Hematopoietic progenitor cells produce the next, more differentiated cells.

HSCs는 두가지 중요한 특징을 가지고 있다. 자신과 똑같은 세포를 만들어낼 수 있는 자기복제(self-renewal) 능력과 성숙된 임파조혈세포의 모든 계통으로 분화할 수 있는 능력이다. 조혈모세포에 대한 연구는 동물에 준치사량(sublethal dose)의 방사선을 조사한 후 골수결핍으로 고통받는 동물에게 정상골수세포를 주사함으로써 이 결핍증이 회복될 수 있다는 것을 처음으로 알게 되었을 때부터 시작되었다. 이러한 전신 방사선 조사를 받은 마우스의 골수회복에 대한 최초의 정량적인 실험으로부터 방사선 조사를 받은 동물의 비장과 골수에서 골수세포와 적혈구 계통의 세포 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 갖는 조혈전구세포의 개념이 도입되었다. 자기복제능력이 있는 다능성 조혈모세포 (PHSCs)에 의한 혈구세포들의 재구성과 조혈계통에 대한 발생생물학적 측면을 이해하기 위하여 순수한 다능성 조혈모세포의 분리가 요구된다. 그러나, 이 세포들은 매우 낮은 비율로서 존재하기 때문에 분리에 어려운 점이 많았으나, 플로우 사이토메트리(flow cytometry)의 도입과 조혈모세포 표지 항원 및 분화항원(differentiation antigen)에 대한 단일클론항체의 개발로 HSCs의 선별이 가능하며 그들의 성질과 특징도 점차적으로 이해하게 되었다.HSCs have two important characteristics. It is the ability to self-renewal to produce the same cells as itself and to differentiate into all lines of mature lymphocytes. The study of hematopoietic stem cells began when the animals first discovered that the deficiency could be recovered by irradiating a sublethal dose of radiation and then injecting normal bone marrow cells into animals suffering from bone marrow deficiency. From the first quantitative experiments on bone marrow recovery of mice subjected to whole body radiation, the concept of hematopoietic progenitor cells with the ability to form cell colonies of bone marrow cells and erythrocytes in the spleen and bone marrow of irradiated animals Was introduced. The isolation of pure pluripotent hematopoietic stem cells is required to understand the reconstitution of hematopoietic cells by self-replicating pluripotent stem cells (PHSCs) and the developmental biological aspects of the hematopoietic system. However, these cells were difficult to isolate because they exist at a very low rate.However, the introduction of flow cytometry and the development of monoclonal antibodies against hematopoietic stem cell labeled antigens and differentiation antigens resulted in HSCs. It is possible to select and to understand their characteristics and characteristics gradually.

본 발명에 따르는 조성물에서 유효성분으로 사용되는 녹용의 클로로포름 추출물 또는 그로부터 분리·정제된 분획들은 다음과 같은 방법에 의해 추출되는 물질이다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 추출·분리방법을 제공한다.Chloroform extract of deer antler or fractions separated and purified therefrom used as an active ingredient in the composition according to the present invention is a substance extracted by the following method. Accordingly, the present invention also provides such an extraction and separation method.

본 발명에 따르면 우선, 녹용을 헥산으로 추출하고, 그 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출하여 수득된 추출액을 감압증류하여 녹용의 클로로포름 추출물(이하에서는 엑기스 CN-C라 한다)을 수득한다. 이러한 본 발명의 추출방법은 예를들어 도 1 로 나타낼 수 있다.According to the present invention, first, the antler is extracted with hexane, and the extraction residue is extracted with chloroform again, and the extract obtained is distilled under reduced pressure to give an chloroform extract (hereinafter, referred to as extract CN-C) of the antler. Such an extraction method of the present invention can be represented by, for example, FIG.

상기한 바와 같은 추출방법에서 사용되는 추출용매인 헥산 및 클로로포름의 양은 각각 사용된 녹용이 잠길 정도의 양이면 충분하며, 일반적으로는 녹용 1㎏에 대하여 헥산 및 클로로포름을 각각 4∼5ℓ정도의 비로 사용한다.The amount of hexane and chloroform, which are the extraction solvents used in the extraction method as described above, is sufficient to cover the amount of antler used, and in general, hexane and chloroform are used at a ratio of about 4 to 5 l for 1 kg of antler. do.

이러한 방법에 의해 수득되는 녹용의 클로로포름 추출물인 엑기스 CN-C 는 계속해서 일련의 실리카겔 칼럼크로마토그래피 및 TLC 방법에 의해 더 분획화시키고 정제한다. 즉, 녹용의 클로로포름 추출물인 엑기스 CN-C 의 후속 처리단계는 a) 엑기스 CN-C를 용리액으로 클로로포름/메탄올을 사용하여 실리카겔 칼럼크로마토그래피하고, 수득되는 분획을 TLC로 처리하여 Rf치에 따라 엑기스 CN-C-1 부터 CN-C-7 까지의 7가지 엑기스를 얻는 단계: b) 상기 단계 a) 에서 수득한 엑기스중 엑기스 CN-C-2를 용리액으로 헥산/에틸아세테이트(10:1)를 사용하여 실리카겔 칼럼크로마토그래피하고, 수득되는 분획을 TLC로 처리하여 Rf치에 따라 엑기스 CN-C-2-A 부터 CN-C-2-F 까지의 6가지 엑기스를 얻는 단계: c) 상기 단계 b) 에서 수득한 엑기스중 엑기스 CN-C-2-E를 용리액으로 헥산/에틸아세테이트/아세트산(20:1:0.5)을 사용하여 실리카겔 칼럼크로마토그래피하고 수득되는 분획을 TLC로 처리하여 Rf치에 따라 엑기스 CN-C-2-E-a 및 CN-C-2-E-b 의 2 가지 엑기스를 얻는 단계: 및 d) 상기의 단계 c) 에서 수득한 엑기스중 엑기스 CN-C-2-E-a를 메탄올에 용해시켜 메탄올-가용성 분획 CN-C-2-E-a-Ms 와 메탄올-불용성 분획 CN-C-2-E-a-Mi를 얻는 단계로 구성된다(CN-C-2-E-a-Ms 와 -Mi의 전개용매: 헥산/에틸아세테이트/아세트산 = 20:1:0.5). 이와 같은 녹용의 클로로포름 추출물 CN-C 의 분획화 및 정제공정은 예를들어 도 2 에 간략해서 나타내었다.Extract CN-C, an chloroform extract of antler obtained by this method, is further fractionated and purified by a series of silica gel column chromatography and TLC methods. That is, the subsequent treatment step of extract CN-C, an chloroform extract of antler, a) extracts CN-C using eluent with silica gel column chromatography using chloroform / methanol, and fractions obtained by TLC to extract according to Rf. Obtaining seven extracts from CN-C-1 to CN-C-7: b) hexane / ethyl acetate (10: 1) was extracted using the extract CN-C-2 in the extract obtained in step a) as eluent. Using silica gel column chromatography and subjecting the fractions obtained by TLC to obtain six extracts from CN-C-2-A to CN-C-2-F according to Rf: c) step b The extract CN-C-2-E in the extract obtained in the above) was subjected to silica gel column chromatography using hexane / ethyl acetate / acetic acid (20: 1: 0.5) as the eluent, and the obtained fraction was treated with TLC to obtain Rf. Two extracts, CN-C-2-Ea and CN-C-2-Eb, And d) methanol CN-C-2-Ea-Ms and methanol-insoluble fraction CN-C by dissolving the extract CN-C-2-Ea in the extract obtained in step c) above in methanol. It is composed of obtaining 2-Ea-Mi (developing solvent of CN-C-2-Ea-Ms and -Mi: hexane / ethyl acetate / acetic acid = 20: 1: 0.5). The fractionation and purification process of such antler chloroform extract CN-C is briefly shown in FIG. 2, for example.

상기한 바와 같은 일련의 정제과정에서 수득되는 엑기스 CN-C-2, CN-C-2-E, CN-C-2-E-a 및 최종적으로 수득되는 메탄올-불용성 분획 CN-C-2-E-a-Mi 도 각각 후술하는 실험예에 의해 입증되는 바와 같이 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진활성을 가지고 있기 때문에 엑기스 CN-C 에 대신하여 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용될 수 있다.The extracts CN-C-2, CN-C-2-E, CN-C-2-Ea and finally the methanol-insoluble fraction CN-C-2-Ea- obtained in the series of purification as described above. Mi can also be used as an active ingredient in the composition of the present invention in place of extract CN-C, because each has a hematopoietic stem cell and platelet progenitor proliferation promoting activity as demonstrated by the experimental examples described below.

또한, 상기의 단계 c) 에서는 단계 b)에서 분리된 엑기스 CN-C-2-D를 헥산/에틸아세테이트를 용리액으로 사용하여 칼럼크로마토그래피시키고 TLC 처리하여 분리되는 2 가지 엑기스 CN-C-2-D-a 및 CN-C-2-D-b 중의 엑기스 CN-C-2-D-b 도 엑기스 CN-C-2-E 와 마찬가지로 사용할 수 있다.In addition, in step c), the extract CN-C-2-D separated in step b) is column chromatographed using hexane / ethyl acetate as the eluent and separated by TLC treatment. The extract CN-C-2-Db in Da and CN-C-2-Db can be used similarly to the extract CN-C-2-E.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 녹용의 클로로포름 추출물 CN-C 중에 함유된 활성성분을 규명하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 최종적으로 수득된 메탄올-불용성 분획 CN-C-2-E-a-Mi 에 대하여 질량분광분석(mass spectrometry)을 수행하였으며, 그 결과 이 분획에는 화학식 1 로 표시되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.In the methanol-insoluble fraction CN-C-2-Ea-Mi finally obtained according to the method of the present invention to identify the active ingredient contained in the chloroform extract CN-C of antler used as an active ingredient in the composition of the present invention. Mass spectrometry was carried out on the result, and as a result, it was confirmed that the fraction contained compounds of the acetyldiacylglycerols represented by the formula (1).

[화학식 1][Formula 1]

상기식에서,In the above formula,

R₁/R₂는 9-옥타데세노일(올레오일)/헥사데카노일(팔미토일), 헥사데카노일(팔미토일)/9-옥타데세노일(올레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12-옥타데카디에노일(리놀레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12,15-옥타데카트리에노일(리놀레노일) 또는 헥사데카노일(팔미토일)/5,8,11,14-에이코사테트라에노일(아라키도노일)을 나타내며,R ₁ / R ₂ is 9-octadecenoyl (oleoyl) / hexadecanoyl (palmitoyl), hexadecanoyl (palmitoyl) / 9-octadecenoyl (oleoyl), hexadecanoyl (palmitoyl) ) / 9,12-octadecadienoyl (linoleoyl), hexadecanoyl (palmitoyl) / 9,12,15-octadecaterienoyl (linolenoyl) or hexadecanoyl (palmitoyl) / 5 , 8,11,14-eicosatetraenoyl (arachidonoyl),

R₃는 아세틸을 나타낸다.R ₃ represents acetyl.

본 발명에 따라 녹용의 클로로포름 추출물 및 그의 분획들에 함유되어 있는 것으로 확인된 활성성분인 화학식 1 의 화합물로는 구체적으로 다음과 같은 5 가지 화합물들이 언급될 수 있다:According to the present invention, as the compound of formula 1 which is an active ingredient found to be contained in the chloroform extract of antler and fractions thereof, five compounds may be specifically mentioned as follows:

1) 화합물 KJ-1 (R₁/R₂=9-옥타데세노일/헥사데카노일, R₃=아세틸)1) Compound KJ-1 (R ₁ / R ₂ = 9-octadecenoyl / hexadecanoyl, R ₃ = acetyl)

1-올레오일-2-팔미토일-3-아세틸글리세롤1-Oleoyl-2-palmitoyl-3-acetylglycerol

2) 화합물 KJ-2 (R₁/R₂=헥사데카노일/9-옥타데세노일, R₃=아세틸)2) Compound KJ-2 (R ₁ / R ₂ = hexadecanoyl / 9-octadecenoyl, R ₃ = acetyl)

1-팔미토일-2-올레오일-3-아세틸글리세롤1-palmitoyl-2-oleoyl-3-acetylglycerol

3) 화합물 KJ-3 (R₁/R₂=헥사데카노일/9,12-옥타데카디에노일, R₃=아세틸)3) Compound KJ-3 (R ₁ / R ₂ = hexadecanoyl / 9,12-octadecadienoyl, R ₃ = acetyl)

1-팔미토일-2-리놀레일-3-아세틸글리세롤1-palmitoyl-2-linoleyl-3-acetylglycerol

4) 화합물 KJ-4 (R₁/R₂=헥사데카노일/9,12,15-옥타데카트리에노일, R₃=아세틸)4) Compound KJ-4 (R ₁ / R ₂ = hexadecanoyl / 9,12,15-octadecatrienoyl, R ₃ = acetyl)

1-팔미토일-2-리놀레닐-3-아세틸글리세롤1-palmitoyl-2-linolenyl-3-acetylglycerol

5) 화합물 KJ-5 (R₁/R₂=헥사데카노일/5,8,11,14-에이코사테트라에노일, R₃=아세틸)5) Compound KJ-5 (R ₁ / R ₂ = hexadecanoyl / 5,8,11,14-eicosatetraenoyl, R ₃ = acetyl)

1-팔미토일-2-아라키도닐-3-아세틸글리세롤1-palmitoyl-2-arachidonyl-3-acetylglycerol

상기한 바와 같이 본 발명에 따라 녹용 추출물로부터 활성성분으로서 분리되어 구조가 확인된 화학식 1 의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들이 녹용에 존재한다는 보고는 본 발명 이전에 전혀 없었다. 상기 화학식 1 의 화합물중에서 하기 화학식 1a 의 화합물, 즉 화합물 KJ-1, KJ-2 및 KJ-3 은 문헌에 공지되어 있는 화합물이며[참고문헌: Journal of High Resolution Chromato- graphy, Vol 19, 497-501 (1996)], 화학식 1b 의 화합물인 화합물 KJ-4 및 KJ-5 는 본 발명 이전에는 알려지지 않았던 신규의 화합물들이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 화학식 1b 로 표시되는 신규화합물 KJ-4 및 KJ-5가 제공된다.As described above, there have been no reports of acetyldiacylglycerols of the general formula (1), which are separated from the antler extract according to the present invention as an active ingredient, and are present in the antler. Among the compounds of Formula 1, compounds of Formula 1a, ie, compounds KJ-1, KJ-2 and KJ-3, are known compounds in the literature [Ref. Journal of High Resolution Chromatography, Vol 19, 497- 501 (1996)], compounds KJ-4 and KJ-5, which are compounds of Formula 1b, are novel compounds that were not known before the present invention. Thus, according to the present invention, novel compounds KJ-4 and KJ-5 represented by the formula (1b) are provided.

상기식에서,In the above formula,

R_1a/R_2a는 9-옥타데세노일/헥사데카노일, 헥사데카노일/9-옥타데세노일 또는 헥사데카노일/9,12-옥타데카디에노일을 나타내며,R _1a / R _2a represents 9-octadecenoyl / hexadecanoyl, hexadecanoyl / 9-octadecenoyl or hexadecanoyl / 9,12-octadecadienoyl,

R_1b/R_2b는 헥사데카노일/9,12,15-옥타데카트리에노일 또는 헥사데카노일/ 5,8,11,14-에이코사테트라에노일을 나타내며,R _1b / R _2b represents hexadecanoyl / 9,12,15-octadecathenyl or hexadecanoyl / 5,8,11,14-eicosatetraenoyl,

R₃는 아세틸을 나타낸다.R ₃ represents acetyl.

도 4 에 나타낸 TLC 결과에 따르면 상기한 화합물 KJ-1, KJ-2, KJ-3, KJ-4 및 KJ-5 의 5 가지 화합물들은 녹용의 클로로포름 추출물인 엑기스 CN-C에서부터 최종 정제단계에서 수득된 메탄올 불용성 분획 CN-C-2-E-a-Mi에 까지 모두 동일한 밴드를 나타내어 물질이 변성없이 유지됨을 알 수 있으며 정제단계가 진행됨에 따라 그 밴드가 더욱 명확해짐을 알 수 있다.According to the TLC results shown in FIG. 4, the five compounds of the compounds KJ-1, KJ-2, KJ-3, KJ-4 and KJ-5 were obtained in the final purification step from the extract CN-C, an chloroform extract of antler. It can be seen that all the same bands were added to the methanol-insoluble fraction CN-C-2-Ea-Mi, so that the material remained without denaturation. As the purification step proceeded, the band became clearer.

비록, 상기 화학식 1 의 화합물이 녹용 추출물로부터 분리, 정제 과정을 거쳐 얻어졌지만, 이들은 다양한 화학적 합성방법에 따라서도 수득될 수 있다. 예를들어, 본 발명자들은 다음과 같은 방법에 의해 화학식 1의 화합물을 화학적으로 합성하는데 성공하였다. 즉, 화학식 1 의 화합물은 a) 포스파티딜콜린인 1-R₁-2-R₂-3-포스포콜린 유도체를 아세트산 및 무수아세트산의 존재하에서 가아세트산분해 (acetolysis)시키거나, b) 글리세롤을 R₁-OH 의 산과 반응시키고, 생성물을 다시 무수아세트산과 반응시킨 후, 생성물을 R₂-OH 의 산과 반응시킴으로써 제조할 수 있다(여기에서 R₁및 R₂는 화학식 1에서 정의한 바와 같다). 이들 방법중에서 출발물질로 글리세롤을 이용하는 방법 b) 가 경제적인 면에서 특히 바람직하게 이용될 수 있다.Although the compound of Formula 1 was obtained through separation and purification from the antler extract, they may be obtained according to various chemical synthesis methods. For example, the inventors have succeeded in chemically synthesizing the compound of Formula 1 by the following method. That is, the compound of formula 1 may be prepared by a) acetic acid decomposition of phosphatidylcholine 1-R _1-2 -R _2-3 -phosphocholine derivatives in the presence of acetic acid and acetic anhydride, or b) glycerol to R _1. It can be prepared by reacting with an acid of —OH, reacting the product with acetic anhydride again, and then reacting the product with an acid of R ₂ —OH (where R ₁ and R ₂ are as defined in formula 1). Among these methods, method b) using glycerol as a starting material can be particularly preferably used economically.

상기한 본 발명의 방법에서 구체적인 제조공정이나 각 단계별 반응조건은 실시예에서 설명하겠으나 간단한 원리를 예를 들어 설명하면 다음과 같다. 화합물 KJ-1 인 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤은 방법 a) 에 따라 시약으로 시판되고 있는 β-팔미토일-γ-올레오일포스파티딜콜린(Sigma사 시약)을 아세트산/무수아세트산(3:2, v/v)에 넣고 150℃에서 반응시키고, 여러 가지 용매를 사용하여 생성된 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤을 칼럼크로마토그래피에 의해 분리함으로써 제조할 수 있다. 또 다른 방법으로 경제적인 합성법인 방법 b) 에 따르면, 우선 글리세롤과 올레산을 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 모노올레오일 글리세롤을 칼럼으로 분리하여 무수아세트산과 디메틸아미노피리딘을 가하여 반응시킨 후, 생성된 모노아세틸 모노올레오일글리세롤을 칼럼으로 분리하고 팔미트산을 가하여 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 KJ-1을 칼럼으로 분리하는 방법에 의해서도 화합물 KJ-1을 제조할 수 있다.In the above-described method of the present invention, specific manufacturing processes or reaction conditions for each step will be described in the following examples. 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol as compound KJ-1 is β-palmitoyl-γ-oleoylphosphatidylcholine (Reagent from Sigma), which is commercially available as a reagent according to method a). To acetic acid / acetic anhydride (3: 2, v / v) and reacted at 150 ° C., and produced 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol using various solvents. It can be prepared by separation by column chromatography. According to another method b), which is an economical synthesis method, first, glycerol and oleic acid are reacted in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and dimethylaminopyridine, and the resulting monooleoyl glycerol is separated by a column, acetic anhydride and dimethyl After reaction by addition of aminopyridine, the resulting monoacetyl monooleoylglycerol was separated by a column, and palmitic acid was added to react dicyclohexylcarbodiimide with dimethylaminopyridine, and the resulting KJ-1 was reacted with a column. Compound KJ-1 can also be produced by a separation method.

화합물 KJ-2 인 1-헥사데카노일-2-9-옥타데세노일-3-아세틸글리세롤의 합성방법은 화합물 KJ-1을 제조하는 상기의 경제적 방법과 동일한 방식으로 수행할 수 있는데, 즉 방법 b) 에 따라 글리세롤과 팔미트산을 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 모노팔미토일글리세롤을 칼럼으로 분리하여 무수아세트산과 디메틸아미노피리딘을 가하여 반응시킨 후, 생성된 모노아세틸 모노팔미토일 글리세롤을 칼럼으로 분리하여 올레산을 가하고 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 KJ-2를 칼럼으로 분리하는 방법에 의해 화합물 KJ-2를 제조할 수 있다.Synthesis of 1-hexadecanoyl-2-9-octadecenoyl-3-acetylglycerol as compound KJ-2 can be carried out in the same manner as the above-mentioned economic method for preparing compound KJ-1, i.e. According to b), glycerol and palmitic acid are reacted in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and dimethylaminopyridine, and the resulting monopalmitoylglycerol is separated by a column, acetic anhydride and dimethylaminopyridine are added, and then produced. The prepared monoacetyl monopalmitoyl glycerol was separated by a column, oleic acid was added, the reaction was carried out in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and dimethylaminopyridine, and the resulting KJ-2 was separated by a column to prepare compound KJ-2. can do.

화합물 KJ-3 인 1-헥사데카노일-2-9,12-옥타데카디엔오일-3-아세틸글리세롤의 제조를 위해서는 방법 a) 에서 출발물질로 사용되는 포스파티딜콜린을 천연물로부터 분리하여 이용할 수도 있다. 즉, 화합물 KJ-3 은 계란에서 추출한 포스파티딜콜린을 아세트산/무수아세트산(3:2, v/v)에 넣고 150℃에서 반응시켜 생성된 KJ-3를 칼럼으로 분리함으로써 수득할 수 있다. 또한, 방법 b) 에 따르는 경제적인 방법으로 글리세롤과 팔미트산을 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 모노팔미토일 글리세롤을 칼럼으로 분리하여 무수아세트산과 디메틸아미노피리딘을 가하여 반응시키고, 생성된 모노아세틸 모노팔미토일 글리세롤을 칼럼으로 분리하여 리놀레산을 넣고 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고 생성물을 칼럼으로 분리시킴으로써 화합물 KJ-3를 제조할 수도 있다.For the preparation of 1-hexadecanoyl-2-9,12-octadecadieoyl-3-acetylglycerol which is compound KJ-3, phosphatidylcholine used as starting material in method a) may be used separately from natural products. That is, compound KJ-3 can be obtained by separating phosphatidylcholine extracted from eggs into acetic acid / acetic anhydride (3: 2, v / v) and reacting at 150 ° C. to separate KJ-3 produced in a column. In addition, glycerol and palmitic acid are reacted in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and dimethylaminopyridine in an economical manner according to the method b), and the resulting monopalmitoyl glycerol is separated by a column to give acetic anhydride and dimethylaminopyridine. Compound KJ-3 can also be prepared by adding a reaction, separating the resulting monoacetyl monopalmitoyl glycerol into a column, adding linoleic acid, reacting in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and dimethylaminopyridine, and separating the product into a column. have.

상기한 각각의 방법과 유사한 방법에 의해 화합물 KJ-4 인 1-헥사데카노일-2-9,12,15-옥타데카트리엔오일-3-아세틸글리세롤 및 화합물 KJ-5 인 1-헥사데카노일-2-5,8,11,14-에이코사테트라엔오일-3-아세틸글리세롤도 동일하게 합성할 수 있다.1-hexadecanoyl-2-9,12,15-octadecathenioyl-3-acetylglycerol which is compound KJ-4 and 1-hexadecanoyl which is compound KJ-5 by methods similar to each of the above -2-5,8,11,14-eicosatetraenyl-3-acetylglycerol can also be synthesized in the same manner.

상기한 바와 같이 녹용 추출물에서 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식촉진활성을 나타내는 활성성분을 경제적으로 화학적 합성방법에 의해 제조할 수도 있기 때문에 값이 비싸고 입수가 어려운 녹용을 원료로 이용하는 대신에 합성방법에 의해 제조된 이들 5가지 물질중의 어느 하나 또는 이들 중의 두가지 이상의 혼합물을 이용함으로써 녹용 추출물과 동등한 놀랄만한 효과를 얻을 수 있다.As described above, active ingredients showing hematopoietic stem cell and platelet progenitor proliferation promoting activity in antler extract may be economically prepared by chemical synthesis method, but instead of using expensive antler, which is expensive and difficult to obtain, as a raw material, By using any one of these five substances or a mixture of two or more of them, a surprising effect equivalent to that of antler extract can be obtained.

따라서, 본 발명에서는 상기 화학식 1 의 화합물 하나 또는 그 이상을 유효성분으로서 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for promoting proliferation of hematopoietic stem cells and platelet progenitor cells containing one or more compounds of Formula 1 as an active ingredient.

본 발명에 따르는 녹용의 클로로포름 추출물 또는 그의 분획 또는 화학식 1 의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진용 조성물은 임상적인 목적으로 투여할 경우에는 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제로 투여 할 수 있다. 주사용 제제, 예를 들면 멸균주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁매질로서 사용한다. 모노-, 디글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용한다.Hematopoietic stem and platelet progenitor proliferation-promoting compositions containing chloroform extract or fractions of the antler according to the present invention or a compound of formula (1) as an active ingredient, when administered for clinical purposes, may be used as an injectable preparation and oral. It can be administered as a formulation. Injectable preparations, for example, sterile injectable aqueous or oleaginous suspensions can be prepared using suitable dispersing, wetting or suspending agents according to the known art. Pharmaceutically acceptable solvents that can be used include water, Ringer's solution and isotonic NaCl solution, and sterile fixed oils are conventionally employed as a solvent or suspending medium. Any non-irritating fixed oil may be used for this purpose, including mono- and diglycerides, and fatty acids such as oleic acid are also used in the preparation of injectables.

경구투여용 고체투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제 등의 형태일 수 있으며, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 고체투여 형태는 본 발명에 따른 고분자 다당류 분획을 수크로즈, 락토즈, 전분 등과 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 마그네슘스테아레이트와 같은 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시킴으로써 제조할 수 있다.The solid dosage form for oral administration may be in the form of capsules, tablets, pills, powders and granules, and particularly, capsules and tablets are useful. Tablets and pills are preferably prepared with enteric agents. Solid dosage forms can be prepared by mixing the polymer polysaccharide fraction according to the present invention with one or more inert diluents such as sucrose, lactose, starch and the like and carriers such as lubricants such as magnesium stearate, disintegrants, binders and the like.

본 발명에 따르는 조성물의 특정환자에 대한 투여용량 수준은 유효성분으로 사용되는 추출물, 분획 또는 화합물의 종류, 조성물이 투여될 개개 환자의 체중, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 그 밖에 본 발명의 조성물을 사용하고자 하는 환자의 조건에 따라 전문가에 의해 다양하게 변화될 수 있을 것이다.The dosage level for a particular patient of the composition according to the present invention is the type of extract, fraction or compound used as the active ingredient, the weight, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, excretion rate of the individual patient to which the composition is to be administered. It may be varied by the expert depending on the condition of the patient, and the mixture of the drug and the patient to use the composition of the present invention.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되나 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.The invention is illustrated in more detail by the following examples, but the invention is not limited in any way by these.

실시예 1Example 1

녹용(매화록) 1.75㎏을 잘게 부숴 비이커에 넣고 녹용이 잠길 정도로 (대략 7ℓ) 헥산을 가하고, 2 시간 동안 80℃에서 가열하여 2 회 추출하고 여과하였다(이 여과액을 추출액 1이라고 함). 추출액 1을 감압하에 증류시키고 건조시켜 엑기스 CN-H 24.6g을 수득하였다.1.75 kg of deer antler (plum) was added to a crushed beaker and hexane was added so that the deer antler was submerged (approximately 7 L), heated at 80 ° C. for 2 hours, extracted twice, and filtered (this filtrate was referred to as extract 1). Extract 1 was distilled off under reduced pressure and dried to give 24.6 g of extract CN-H.

추출액 1을 분리하고 남은 잔사에 클로로포름을 잠길 정도(대략 7ℓ)로 가하고, 2 시간 동안 70℃에서 가열하여 2 회 추출하고 여과하였다(이 여과액을 추출액 2라고 함). 추출액 2를 감압하에서 증류시켜 녹용의 클로로포름 추출물인 엑기스 CN-C 14g을 수득하였다.Extract 1 was separated and chloroform was submerged in the remaining residue (approximately 7 L), heated at 70 ° C. for 2 hours, extracted twice, and filtered (this filtrate was called extract 2). Extract 2 was distilled off under reduced pressure to obtain 14 g of extract CN-C, which was a chloroform extract of antler.

다시 추출액 2를 분리하고 남은 잔사에 70℃ 의 에탄올(대략 6ℓ)을 가하고 하루 동안 90℃에서 가열하여 3 회 추출하고 여과하였다(이 여과액을 추출액 3이라고 함). 추출액 3을 감압하에 증류시켜 엑기스 CN-E 91g을 수득하였다.Extract 2 was separated again, and ethanol (approximately 6 L) at 70 ° C. was added to the remaining residue, and heated at 90 ° C. for three days to extract and filter (this filtrate was called extract 3). Extract 3 was distilled off under reduced pressure to obtain 91 g of extract CN-E.

상기에서 수득된 엑기스 CN-H, CN-C 및 CN-E 각각에 대하여 후술하는 실시예 8에 기재된 바와 같이 조혈작용을 검색한 결과 얻어지는 조혈모세포 증식활성을 지표로 하여 조혈효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-C를 이하의 정제과정에 사용하였다.The extracts CN-H, CN-C, and CN-E obtained as described above are deemed to have a hematopoietic effect based on the hematopoietic stem cell proliferation activity obtained as a result of searching for hematopoietic activity as described in Example 8 below. Extract CN-C was used for the following purification.

실시예 2Example 2

분말 실리카겔 350g에 클로로포름/메탄올(500:1) 혼합용액 650㎖를 가하여 팽윤시킨 후, 열린 칼럼[베드체적(bed volume) = 600∼650㎖]에 충진시켰다. 상기 실시예 1에서 수득한 엑기스 CN-C 14g을 최소량(엑기스를 녹일 수 있는 최소량)의 클로로포름/메탄올(500:1)에 용해시켜 실리카겔이 충진된 칼럼에 적용시켰다. 칼럼에 용리액으로서 클로로포름/메탄올(500:1)을 마르지 않게 넣어주면서 50㎖ 씩의 용출분획을 받은 다음(이때, 공체적 (void volume)은 200㎖임), 이것을 TLC(전개용매: 클로로포름/메탄올 = 300:1)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 분리하였다. 이렇게 하여 모두 7개의 주요 분획을 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압증류하여 건조시켜 엑기스 CN-C-1 내지 CN-C-7를 수득하였다. 이들 7가지의 엑기스에 대하여 후술하는 실시예 8에 기재된 바와 같이 조혈작용을 검색한 결과 조혈효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-C-2를 분리하여 이하의 정제과정에 사용하였다.After swelling by adding 650 ml of a chloroform / methanol (500: 1) mixed solution to 350 g of powdered silica gel, the mixture was filled in an open column (bed volume = 600 to 650 ml). 14 g of extract CN-C obtained in Example 1 was dissolved in a minimum amount (minimum amount capable of melting the extract) in chloroform / methanol (500: 1) and applied to a column filled with silica gel. 50 mL of elution fraction was added to the column as eluent (500: 1) without drying, and the volume (void volume was 200 mL), followed by TLC (developing solvent: chloroform / methanol). = 300: 1), developed with iodine, and separated according to Rf. In this way, all seven major fractions were separated. Each separated fraction was distilled under reduced pressure and dried to obtain extract CN-C-1 to CN-C-7. These seven extracts were extracted for hematopoietic activity as described in Example 8 to be described later, and the extract CN-C-2 which was determined to have a hematopoietic effect was isolated and used in the following purification process.

실시예 3Example 3

실시예 2에서 정제된 분획중 조혈작용 효능이 큰 것으로 확인된 분획 CN-C-2 380㎎을 취하였다. 분말 실리카겔 20g에 헥산/에틸아세테이트(50:1) 혼합용액 50㎖를 가하여 팽윤시켜 칼럼(베드 체적=100㎖)에 충진시켰다. 엑기스 CN-C-2 380㎎을 용리액인 헥산/에틸아세테이트(50:1) 최소량에 용해시켜 실리카겔 칼럼에 적용시켰다. 실시예 2에서와 동일한 방법에 따라 용리액을 넣어주면서 15㎖씩 용출분획을 받아 TLC(전개용매: 헥산/에틸아세테이트 = 50:1)로 전개하고, 요오드로 발색시킨 후 Rf에 따라 6개의 부분으로 분리하였다. 분리된 각각의 부분을 감압증류시키고 건조시켜 각각 CN-C-2-A 내지 CN-C-2-F로 지정된 엑기스를 수득하였다. 이들 6가지의 엑기스에 대하여 후술하는 실시예 8에 기재된 바와 같이 조혈작용을 검색한 결과 조혈효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-C-2-E를 분리하여 이하의 정제과정에 사용하였다.380 mg of fraction CN-C-2, which was found to have high hematopoietic efficacy in the fraction purified in Example 2, was taken. To 20 g of powdered silica gel, 50 ml of a mixed solution of hexane / ethyl acetate (50: 1) was added and swelled to fill a column (bed volume = 100 ml). 380 mg of extract CN-C-2 was dissolved in a minimum amount of hexane / ethyl acetate (50: 1) as eluent and applied to a silica gel column. Following the same method as in Example 2, the eluate was added and the elution fractions were collected in 15 ml, developed by TLC (developing solvent: hexane / ethyl acetate = 50: 1), developed with iodine, and then divided into six parts according to Rf. Separated. Each of the separated portions was distilled under reduced pressure and dried to obtain an extract designated as CN-C-2-A to CN-C-2-F, respectively. These six extracts were extracted for hematopoietic activity as described in Example 8 to be described later, and the extract CN-C-2-E which was determined to have a hematopoietic effect was isolated and used in the following purification process.

실시예 4Example 4

실시예 3에서 정제한 분획중 조혈작용 효능이 높은 것으로 확인된 분획 CN-C-2-E 70㎎을 취하였다. 분말 실리카겔 3.5g에 헥산/에틸아세테이트/아세트산 (20:1:0.5) 혼합용액 10㎖를 가하여 팽윤시켜 칼럼(베드체적=24㎖)에 충진시켰다. 엑기스 CN-C-2-E 70㎎을 용리액인 헥산/에틸아세테이트/아세트산(20:1:0.5) 최소량에 용해시켜 실리카겔 칼럼에 적용시켰다. 실시예 3에서와 동일한 방법으로 용리액을 넣어 주면서 10㎖씩 용출분획을 받아 TLC(전개용매: 헥산/에틸아세테이트/아세트산 = 20:1:0.5)로 전개하고, 요오드로 발색시킨 후 Rf에 따라 두 부분으로 나누어 각각 엑기스 CN-C-2-E-a 및 CN-C-2-E-b로 표시하였다. 이 두가지의 엑기스에 대하여 후술하는 실시예 8에 기재된 바와 같이 조혈작용을 검색한 결과 조혈효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-C-2-E-a를 분리하여 이하의 정제과정에 사용하였다.In the fraction purified in Example 3, 70 mg of fraction CN-C-2-E, which was found to have high hematopoietic effect, was taken. 10 ml of a mixed solution of hexane / ethyl acetate / acetic acid (20: 1: 0.5) was added to 3.5 g of the powdered silica gel, followed by swelling and filling the column (bed volume = 24 ml). 70 mg of extract CN-C-2-E was dissolved in a minimum amount of eluent hexane / ethyl acetate / acetic acid (20: 1: 0.5) and applied to a silica gel column. The eluate was added in the same manner as in Example 3, and the elution fractions were collected by 10 ml and developed by TLC (developing solvent: hexane / ethyl acetate / acetic acid = 20: 1: 0.5), followed by color development with iodine. The portions were expressed as extract CN-C-2-Ea and CN-C-2-Eb, respectively. As a result of searching for hematopoiesis as described in Example 8 described below for these two extracts, the extract CN-C-2-E-a which was determined to have a hematopoietic effect was isolated and used in the following purification process.

실시예 5Example 5

실시예 4에서 분리된 부분 중에서 첫 번째 부분인 엑기스 CN-C-2-E-a 62㎎을 취하였다. 이 엑기스 CN-C-2-E-a에 메탄올 5㎖을 가하여 혼합시켜 메탄올-가용성 부분(엑기스 CN-C-2-E-a-Ms)과 메탄올-불용성 부분(엑기스 CN-C-2-E- a-Mi)으로 분리하였다. 엑기스 CN-C-2-E-a-Ms는 20㎎을 수득하였고, 엑기스 CN-C-2-E-a-Mi는 40㎎을 수득하였다.62 mg of extract CN-C-2-E-a, which was the first of the separated portions in Example 4, was taken. To this extract CN-C-2-Ea, 5 ml of methanol was added and mixed, and the methanol-soluble portion (extract CN-C-2-Ea-Ms) and the methanol-insoluble portion (extract CN-C-2-E-a- Mi). The extract CN-C-2-E-a-Ms obtained 20 mg, and the extract CN-C-2-E-a-Mi obtained 40 mg.

실시예 1∼5에서 수득된 각각의 활성분획들에 대한 TLC 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이 엑기스 CN-C에 있는 밴드가 정제되어 가는 과정에서도 동일하게 나타남을 알 수 있다. 따라서 활성을 나타내는 부분이 정제과정에서 변성되어 나타나거나 없어진 것이 아님을 알 수 있다. 처음에는 다른 부분 때문에 가려졌던 밴드가 정제되어감에 따라 진하게 발색되었다.TLC results of the respective active fractions obtained in Examples 1 to 5 are shown in FIG. 4. As shown in Figure 4 it can be seen that the same in the process of purification of the band in the extract CN-C. Therefore, it can be seen that the part showing activity is not denatured or disappeared during purification. At first, the band, which was covered by other parts, developed deeper as it was refined.

실시예 6Example 6

조혈작용 활성물질의 구조 분석Structure analysis of hematopoietic active substances

실시예 5로부터 최종 정제된 두 물질중에서 메탄올-불용성 부분인 엑기스 CN-C-2-E-a-Mi를 VG70-VSEQ 질량분석기(mass spectrometer)로 분석하였다. 질량분석에 따라 확인된 것으로 녹용 추출물중에 존재하는 활성화합물을 요약하면 다음 표 1에 기재된 바와 같다.The methanol-insoluble portion of the extract CN-C-2-E-a-Mi among the two substances finally purified from Example 5 was analyzed with a VG70-VSEQ mass spectrometer. The active compounds present in the antler extract as confirmed by mass spectrometry are summarized in Table 1 below.

M⁺ M ⁺ M⁺-60 (CH₃COOH, m/z)M ⁺ -60 (CH ₃ COOH, m / z) 화 합 물Compound 637.5637.5 577.5577.5 KJ-1, KJ-2KJ-1, KJ-2 635.5635.5 575.5575.5 KJ-3KJ-3 633.5633.5 573.5573.5 KJ-4KJ-4 658.5658.5 598.5598.5 KJ-5KJ-5

이들 각각의 분리된 화합물 KJ-1, KJ-2, KJ-3, KJ-4 및 KJ-5 는 이하의 실시예 7 에 제시된 물리화학적 데이터와 일치하는 결과를 나타내어 그 구조를 확인할 수 있었다.Each of these isolated compounds KJ-1, KJ-2, KJ-3, KJ-4 and KJ-5 showed a result consistent with the physicochemical data shown in Example 7 below to confirm its structure.

실시예 7.Example 7.

7-1. 1-올레오일-2-팔미토일-3-아세틸글리세롤(KJ-1) 합성7-1. 1-Oleoyl-2-palmitoyl-3-acetylglycerol (KJ-1) synthesis

7-1-1. 글리세롤로 부터의 합성7-1-1. Synthesis from Glycerol

글리세롤(1.0 eq)을 테트라하이드로푸란(20.0 eq)에 용해시키고 디사이클로헥실카보디이미드(0.7 eq)와 디메틸아미노피리딘(0.1 eq)을 가하고 온도를 0℃로 저하시켰다. 여기에 올레산(0.5 eq)을 가하여 4시간 동안 반응시켰다. 생성된 모노올레오일글리세롤을 칼럼크로마토그래피(n-헥산:에틸아세테이트=18:1)에 의해 분리하여 메틸렌클로라이드(20.0 eq)에 용해시키고 아세트산 무수물(1 eq)을 가하여 온도를 -78℃로 저하시켰다. 여기에 디메틸아미노피리딘(0.2 eq)를 가하고 1시간 동안 반응시킨 후, 생성된 모노아세틸 모노올레오일 글리세롤을 칼럼크로마토그래피(n-헥산:에틸아세테이트=18:1)에 의해 분리하였다(수율: 23%). 분리된 모노아세틸 모노올레오일 글리세롤(0.2 eq)을 메틸렌클로라이드(2.0 eq)에 다시 용해시키고, 디사이클로헥실카보디이미드(1.2 eq)와 디메틸아미노피리딘(0.2 eq)을 가한 후, 온도를 0℃로 저하시켰다. 여기에 팔미트산(0.23 eq)을 가하고 2 시간 동안 반응시킨 후, 생성된 목적화합물 KJ-1을 칼럼크로마토그래피(n-헥산:에틸아세테이트=18:1)에 의해 분리하였다(수율: 3.42 %).Glycerol (1.0 eq) was dissolved in tetrahydrofuran (20.0 eq), dicyclohexylcarbodiimide (0.7 eq) and dimethylaminopyridine (0.1 eq) were added and the temperature was lowered to 0 ° C. Oleic acid (0.5 eq) was added thereto and reacted for 4 hours. The resulting monooleoylglycerol was separated by column chromatography (n-hexane: ethyl acetate = 18: 1), dissolved in methylene chloride (20.0 eq), and acetic anhydride (1 eq) was added to lower the temperature to -78 ° C. I was. Dimethylaminopyridine (0.2 eq) was added thereto, followed by reaction for 1 hour, and the resulting monoacetyl monooleoyl glycerol was separated by column chromatography (n-hexane: ethyl acetate = 18: 1) (yield: 23 %). The separated monoacetyl monooleoyl glycerol (0.2 eq) was again dissolved in methylene chloride (2.0 eq), dicyclohexylcarbodiimide (1.2 eq) and dimethylaminopyridine (0.2 eq) were added, and then the temperature was 0 ° C. Lowered. Palmitic acid (0.23 eq) was added thereto and reacted for 2 hours, after which the target compound KJ-1 was separated by column chromatography (n-hexane: ethyl acetate = 18: 1) (yield: 3.42%). ).

7-1-2. 포스파티딜콜린으로 부터의 합성(가아세트산분해)7-1-2. Synthesis from Phosphatidylcholine

포스파티딜콜린(1-올레오일-2-팔미토일-3-포스포콜린) 500㎎을 아세트산/무수아세트산(3:2) 50㎖에 용해시키고 아르곤 가스중에서 8시간 동안 150℃의 오일 베스(oil bath)하에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응용액을 클로로포름/메탄올/물(8:4:3) 30㎖씩으로 3 회 추출하고, 물로 세척한 후 1시간 동안 무수황산나트륨으로 건조시켜 목적화합물 KJ-1 300㎎(수율: 71.3%)을 수득하였다. 합성된 화합물의 구조를 IR,¹H-NMR 및¹³C-NMR 에 의해 확인하였다.500 mg of phosphatidylcholine (1-oleoyl-2-palmitoyl-3-phosphocholine) was dissolved in 50 ml of acetic acid / acetic anhydride (3: 2) and an oil bath at 150 ° C. for 8 hours in argon gas. The reaction was carried out under. After the reaction, the reaction solution was extracted three times with 30 ml each of chloroform / methanol / water (8: 4: 3), washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate for 1 hour to obtain the target compound KJ-1 300 mg (yield: 71.3%) was obtained. The structure of the synthesized compound was confirmed by IR, ¹ H-NMR and ¹³ C-NMR.

IR (CH₂Cl₂) 3018.13 sp²CH 피크, 1744.5 (강) cm^-1카보닐 피크IR (CH ₂ Cl ₂ ) 3018.13 sp ² CH peak, 1744.5 (strong) cm- ¹ carbonyl peak

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.32 (m, 2H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.29 (m, 4H) 카보닐 탄소 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸 그룹 양성자, 1.98 (br, 4H) 알릴 양성자, 1.60 (br, 4H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 44H) 탄화수소 양성자, 0.86 (t, 6H) 지방산 말단 탄소 양성자(t : 삼중선, m : 다중선, dt : 삼중선중의 이중선, dd : 이중선의 이중선, br : 브로드 피크). ¹ H NMR (CDCl ₃ ): δ 5.32 (m, 2H) vinyl proton, 5.24 (m, 1H) glycerol-t-carbon proton, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) glycerol-terminated carbon proton, 2.29 (m, 4H) carbonyl carbon proton, 2.05 (s, 3H) acetyl group proton, 1.98 (br, 4H) allyl proton, 1.60 (br, 4H) carbonyl-β-carbon proton, 1.23 (m, 44H) Hydrocarbon protons, 0.86 (t, 6H) fatty acid terminal carbon protons (t: triplet, m: multiplet, dt: doublet in triplet, dd: doublet in doublet, br: broad peak).

¹³C NMR (CDCl₃) : δ 172.9, 172.5, 170.1 카보닐 피크, 129.8, 129.4 비닐 탄소, 68.6, 62.1, 61.8 글리세롤 탄소 ¹³ C NMR (CDCl ₃ ): δ 172.9, 172.5, 170.1 carbonyl peak, 129.8, 129.4 vinyl carbon, 68.6, 62.1, 61.8 glycerol carbon

7-2. 1-팔미토일-2-올레오일-3-아세틸글리세롤(KJ-2)의 합성7-2. Synthesis of 1-palmitoyl-2-oleoyl-3-acetylglycerol (KJ-2)

7-2-1. 글레세롤로 부터의 합성7-2-1. Synthesis from Glaserol

상기 7-1-1 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 지방산(팔미트산, 올레산)을 사용하여 목적화합물 KJ-2를 합성하였다(수율: 3.45%).The target compound KJ-2 was synthesized using the corresponding fatty acid (palmitic acid, oleic acid) according to the same method as the synthesis method of compound KJ-1 described in 7-1-1 (yield: 3.45%).

7-2-2. 포스파티딜콜린으로 부터의 합성7-2-2. Synthesis from Phosphatidylcholine

상기 7-1-2 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 포스파티딜콜린(1-팔미토일-2-올레오일-3-포스포콜린)을 사용하여 가아세트산분해반응을 수행하여 목적화합물 KJ-2를 합성하였다(수율: 70.2%).Performed acetic acid decomposition using the corresponding phosphatidylcholine (1-palmitoyl-2-oleoyl-3-phosphocholine) according to the same method as the synthesis method of compound KJ-1 described in 7-1-2. The desired compound KJ-2 was synthesized (yield: 70.2%).

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.32 (m, 2H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.29 (m, 4H) 카보닐-측쇄 탄소 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸 그룹 양성자, 1.98 (br, 4H) 알릴 양성자, 1.60 (br, 4H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 44H) 탄화수소 양성자, 0.86 (t, 6H) 지방산 말단 탄소 양성자 ¹ H NMR (CDCl ₃ ): δ 5.32 (m, 2H) vinyl proton, 5.24 (m, 1H) glycerol-t-carbon proton, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) glycerol-terminated carbon proton, 2.29 (m, 4H) carbonyl-side chain carbon protons, 2.05 (s, 3H) acetyl group protons, 1.98 (br, 4H) allyl protons, 1.60 (br, 4H) carbonyl-β-carbon protons, 1.23 (m, 44H) hydrocarbon protons, 0.86 (t, 6H) fatty acid terminal carbon protons

7-3. 1-팔미토일-2-리놀레일-3-아세틸글리세롤(KJ-3)의 합성7-3. Synthesis of 1-palmitoyl-2-linoleyl-3-acetylglycerol (KJ-3)

7-3-1. 글리세롤로 부터의 합성7-3-1. Synthesis from Glycerol

상기 7-1-1 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 지방산(팔미트산, 리놀레산)을 사용하여 목적화합물 KJ-3을 합성하였다(수율 : 3.21%).The target compound KJ-3 was synthesized using the corresponding fatty acid (palmitic acid, linoleic acid) according to the same method as the synthesis method of compound KJ-1 described in 7-1-1 (yield: 3.21%).

7-3-2. 포스파티딜콜린으로 부터의 합성7-3-2. Synthesis from Phosphatidylcholine

상기 7-1-2 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 포스파티딜콜린(1-팔미토일-2-리놀레일-3-포스포콜린)을 사용하여 가아세트산분해반응을 수행하여 목적화합물 KJ-3를 합성하였다(수율 : 74.5%).Performed acetic acid decomposition reaction using the corresponding phosphatidylcholine (1-palmitoyl-2-linoleyl-3-phosphocholine) according to the same method as the synthesis method of compound KJ-1 described in 7-1-2. To prepare the target compound KJ-3 (yield: 74.5%).

7-3-3. 계란으로 부터의 합성7-3-3. Synthesis from Eggs

계란 노른자 9개(약 123.31g)에 에테르 400ℓ를 넣고 교반하여 약 1시간 동안 방치하였다. 위의 녹은 부분만 따라 내어 수욕중에서 용매를 증발시킨 후 300㎖ 정도의 아세톤을 가하고 교반하면 순수하지 않은 포스파티딜콜린이 침전물(2.46g)로 가라앉는다. 이 침전물을 용리액인 클로로포름/메탄올/물 (65:25: 4) 20㎖에 용해시켰다. 분말 실리카겔 150g을 클로로포름/메탄올/물 (65:25: 4) 400㎖ 에 가하여 팽윤시킨 후 열린 칼럼에 채웠다. 순수하지 않은 포스파티딜콜린 침전물을 실리카겔 칼럼에 적용시키고 50㎖씩 분획을 수거하였다. TLC로 표준물질 포스파티딜콜린과 비교하여 순수한 포스파티딜콜린 부분만(300㎎)을 수거하여, 포스파티딜콜린으로 부터 화합물 KJ-1을 제조하는 7-1-2 의 방법과 동일한 방법에 따라 가아세트산분해반응을 수행하여 목적화합물 KJ-3 180㎎을 합성하였다.Nine egg yolks (about 123.31 g) were added with 400 L of ether and stirred for about 1 hour. Following the melted portion of the stomach, the solvent is evaporated in the water bath, and then 300 ml of acetone is added and stirred. The pure phosphatidylcholine sinks into the precipitate (2.46 g). This precipitate was dissolved in 20 mL of eluent chloroform / methanol / water (65: 25: 4). 150 g of powdered silica gel was added to 400 ml of chloroform / methanol / water (65: 25: 4), followed by swelling and filling into an open column. A pure phosphatidylcholine precipitate was applied to the silica gel column and 50 mL fractions were collected. TLC was used to collect only pure phosphatidylcholine moiety (300 mg) as compared to the standard phosphatidylcholine, and subjected to the acetic acid decomposition reaction according to the method of 7-1-2 to prepare compound KJ-1 from phosphatidylcholine. 180 mg of compound KJ-3 was synthesized.

IR (CH₂Cl₂) 3064.45 sp²CH 피크, 1740.64 (강) cm^-1카보닐 피크IR (CH ₂ Cl ₂ ) 3064.45 sp ² CH peak, 1740.64 (strong) cm- ¹ carbonyl peak

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.32 (m, 4H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.72 (m, 2H) 올레핀-탄소 양성자, 2.29 (m, 4H) 카보닐-측쇄 탄소 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸-그룹 양성자, 1.98 (br, 4H) 알릴 양성자, 1.60 (br, 4H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 38H) 탄화수소 양성자, 0.86 (t, 6H, J=6.5Hz, 6.8Hz) 지방산-말단 탄소 양성자 ¹ H NMR (CDCl ₃ ): δ 5.32 (m, 4H) vinyl proton, 5.24 (m, 1H) glycerol-t-carbon proton, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) glycerol-terminated carbon proton, 2.72 (m, 2H) olefin-carbon protons, 2.29 (m, 4H) carbonyl-side chain carbon protons, 2.05 (s, 3H) acetyl-group protons, 1.98 (br, 4H) allyl protons, 1.60 (br, 4H) Carbonyl-β-carbon protons, 1.23 (m, 38H) hydrocarbon protons, 0.86 (t, 6H, J = 6.5 Hz, 6.8 Hz) fatty acid-terminal carbon protons

¹³C NMR (CDCl₃) : δ 172.9, 172.5, 170.1 카보닐 피크, 129.8, 129.4 비닐 탄소, 68.6, 62.1, 61.8 글리세롤-탄소 ¹³ C NMR (CDCl ₃ ): δ 172.9, 172.5, 170.1 carbonyl peak, 129.8, 129.4 vinyl carbon, 68.6, 62.1, 61.8 glycerol-carbon

7-4. 1-팔미토일-2-리놀레노일-3-아세틸글리세롤(KJ-4)의 합성7-4. Synthesis of 1-palmitoyl-2-linolenoyl-3-acetylglycerol (KJ-4)

7-4-1. 글리세롤로 부터의 합성7-4-1. Synthesis from Glycerol

상기 7-1-1 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 지방산(팔미트산, 리놀렌산)를 사용하여 목적화합물 KJ-4를 합성하였다(수율 : 3.17%).The target compound KJ-4 was synthesized using the corresponding fatty acid (palmitic acid, linolenic acid) according to the same method as the synthesis method of compound KJ-1 described in 7-1-1 (yield: 3.17%).

IR (CH₂Cl₂) 3018.13 (약) sp²CH 피크, 1740.64 (강) cm^-1카보닐 피크IR (CH ₂ Cl ₂ ) 3018.13 (weak) sp ² CH peak, 1740.64 (strong) cm- ¹ carbonyl peak

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.30 (m, 6H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.72 (t, 4H) 올레핀-탄소 양성자, 2.29 (m, 4H) 카보닐-측쇄 탄소 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸-그룹 양성자, 1.98 (br, 4H) 알릴 양성자, 1.60 (br, 4H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 32H) 탄화수소 양성자, 0.90 (t, 3H, J=7.5Hz), 0.86 (t, 6H, J=6.5Hz) 지방산-말단 탄소 양성자 ¹ H NMR (CDCl ₃ ): δ 5.30 (m, 6H) vinyl proton, 5.24 (m, 1H) glycerol-t-carbon proton, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) glycerol-terminated carbon proton, 2.72 (t, 4H) olefin-carbon protons, 2.29 (m, 4H) carbonyl-side chain carbon protons, 2.05 (s, 3H) acetyl-group protons, 1.98 (br, 4H) allyl protons, 1.60 (br, 4H) Carbonyl-β-carbon protons, 1.23 (m, 32H) hydrocarbon protons, 0.90 (t, 3H, J = 7.5 Hz), 0.86 (t, 6H, J = 6.5 Hz) fatty acid-terminated carbon protons

¹³C NMR (CDCl₃) : δ 173.2, 172.8, 170.4 카보닐 피크, 131.8, 130.1, 128.3, 128.1, 127.7, 127.0 비닐 탄소, 68.7, 62.3, 62.0 글리세롤 탄소 ¹³ C NMR (CDCl ₃ ): δ 173.2, 172.8, 170.4 carbonyl peak, 131.8, 130.1, 128.3, 128.1, 127.7, 127.0 vinyl carbon, 68.7, 62.3, 62.0 glycerol carbon

7-5. 1-팔미토일-2-아라키도노일-3-아세틸글리세롤(KJ-5)의 합성7-5. Synthesis of 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-3-acetylglycerol (KJ-5)

7-5-1. 글리세롤로 부터의 합성7-5-1. Synthesis from Glycerol

상기 7-1-1 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 지방산(팔미트산, 아라키돈산)을 사용하여 목적화합물 KJ-5를 합성하였다(수율 : 3.31%).The target compound KJ-5 was synthesized using the corresponding fatty acid (palmitic acid, arachidonic acid) according to the same method as the synthesis method of compound KJ-1 described in 7-1-1 (yield: 3.31%).

7-5-2. 포스파티딜콜린으로 부터의 합성7-5-2. Synthesis from Phosphatidylcholine

상기 7-1-2 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 포스파티딜콜린(1-팔미토일-2-아라키도일-3-포스포콜린)을 사용하여 가아세트산분해반응을 수행하여 목적화합물 KJ-5를 합성하였다(수율 : 69.2%).According to the same method as the synthesis method of compound KJ-1 described in 7-1-2, a peracetic acid decomposition reaction was carried out using the corresponding phosphatidylcholine (1-palmitoyl-2-arachidoyl-3-phosphocholine). The target compound KJ-5 was synthesized by the yield (yield: 69.2%).

IR (CH₂Cl₂) 3064.45 (약) sp²CH 피크, 1740.64 (강) cm^-1카보닐 피크IR (CH ₂ Cl ₂ ) 3064.45 (weak) sp ² CH peak, 1740.64 (strong) cm- ¹ carbonyl peak

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.32 (m, 8H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.75 (t, 6H) 올레핀-탄소 양성자, 2.30 (4 중선, 4H) 카보닐-측쇄 탄소 양성자, 2.15∼1.99 알릴 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸-그룹 양성자, 1.65 (m, 2H), 1.55 (br, 2H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 30H) 탄화수소 양성자, 0.86 (m, 6H) 지방산-말단 탄소 양성자 ¹ H NMR (CDCl ₃ ): δ 5.32 (m, 8H) vinyl proton, 5.24 (m, 1H) glycerol-t-carbon proton, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) glycerol-terminated carbon proton, 2.75 (t, 6H) olefin-carbon protons, 2.30 (quartet, 4H) carbonyl-side chain carbon protons, 2.15-1.99 allyl protons, 2.05 (s, 3H) acetyl-group protons, 1.65 (m, 2H), 1.55 (br, 2H) carbonyl-β-carbon protons, 1.23 (m, 30H) hydrocarbon protons, 0.86 (m, 6H) fatty acid-terminated carbon protons

¹³C NMR (CDCl₃) : δ 173.2, 172.8, 170.4 카보닐 피크, 130.4, 128.9, 128.7, 128.5, 128.3, 128.0, 127.8, 127.5 비닐 탄소, 68.9, 62.3, 62.0 글리세롤 탄소 ¹³ C NMR (CDCl ₃ ): δ 173.2, 172.8, 170.4 carbonyl peak, 130.4, 128.9, 128.7, 128.5, 128.3, 128.0, 127.8, 127.5 vinyl carbon, 68.9, 62.3, 62.0 glycerol carbon

실시예 8Example 8

녹용의 조혈작용 효능 검색 방법How to search for hematopoietic effect of deer antler

상기 실시예 1 내지 5 에서 수득된 녹용 추출물 및 그의 정제된 엑기스, 및 합성된 화학식 1 의 화합물들의 조혈작용 효능을 검색하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.The following experiment was conducted to search for the hematopoietic efficacy of the antler extract obtained in Examples 1 to 5, its purified extract, and the synthesized compound of Formula 1.

8-1. 콜로니 형성 효능 시험 (Colony-Forming Unit in Culture)8-1. Colony-Forming Unit in Culture

8-1-1. 마우스의 골수세포 분리8-1-1. Bone Marrow Cell Isolation from Mice

SPF(Specific Pathogene Free: 특정 병원체가 없는) 조건하에서 사육한 생후 6∼10주일된 C57Bl/6계의 수컷 마우스를 사용하여 마우스 다리의 정골과 대퇴골로부터 RPMI 1640 영양배지(Gibco #430-1800)로 세척하여 골수를 분리하였다. 분리한 골수를 여과하여 단세포 부유액으로 만들고, 다시 RPMI 1640 영양배지로 3회 반복 세척한 후 세포수를 측정하였다. 비중이 1.063과 1.075 사이에 있는 간세포(幹細胞: stem cell) 풍부 분획을 얻어서 RPMI로 2회 세척하였다.From the osteopathy and femur of the mouse leg to the RPMI 1640 nutrient medium (Gibco # 430-1800), using C57Bl / 6 male mice aged 6-10 weeks old under SPF (Specific Pathogene Free) conditions. The bone marrow was separated by washing. The isolated bone marrow was filtered to make a single cell suspension, and again washed three times with RPMI 1640 nutrient medium, and the number of cells was measured. Stem cell rich fractions with specific gravity between 1.063 and 1.075 were obtained and washed twice with RPMI.

8-1-2. 시료의 제조8-1-2. Preparation of Sample

모든 녹용 시료는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 100㎎/㎖의 농도가 되도록 용해시켜 이것을 저장용액(stock solution)으로 사용하여 조혈작용 효능 검색에 이용하였다.All antler samples were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 100 mg / ml and used as a stock solution to search for hematopoietic efficacy.

8-1-3. CFU-C(colony-forming unit in culture) 분석8-1-3. Colony-forming unit in culture (CFU-C) analysis

1.1% 메틸셀룰로스판에 상기 8-1-1의 방법으로 분리된 골수세포 1.2×10⁴세포/웰(cell/well)과 상기 8-1-2에서 제조된 각각의 시료를 함께 접종한 후, 37℃ 의 CO₂-인큐베이터에서 배양하고, 1주일 후에 콜로니의 수를 측정하였다. 시료로는 실시예 1 내지 5에서 분리된 녹용 추출물 CN-C, CN-C-2, CN-C-2-E, CN-C-2-E-a 및 CN-C-2-E-a-Mi를 각각 사용하였다. 측정된 결과는 표 2 에 기재하였다. 측정된 결과로부터 다음 식에 의해 콜로니 형성효능(Colony Forming Efficiency: CFE)을 구하였다.After inoculating each sample prepared in 8-1-2 with 1.2 × 10 ⁴ cells / well isolated from the myeloid cells isolated by the method of 8-1-1 on 1.1% methylcellulose plate, Cultured in a CO ₂ -incubator at 37 ° C., the number of colonies was measured after one week. As the sample, antler extracts CN-C, CN-C-2, CN-C-2-E, CN-C-2-Ea and CN-C-2-Ea-Mi isolated in Examples 1 to 5, respectively, were used. Used. The measured results are shown in Table 2. From the measured results, colony forming efficiency (CFE) was obtained by the following equation.

CFE=(시료에 있는 콜로니의 전체수)/(대조군에 있는 콜로니의 전체 수)CFE = (total number of colonies in sample) / (total number of colonies in control)

샘 플Sample 콜로니 형성 효능(0.001 ㎎/㎖)Colony Formation Efficacy (0.001 mg / ml) 샘플의 콜로니수 /대조군의 콜로니수Number of colonies in sample / Number of colonies in control 엑기스 CN-CExtract CN-C 1.111.11 171/154171/154 엑기스 CN-C-2Extract CN-C-2 1.221.22 188/154188/154 엑기스 CN-C-2-EExtract CN-C-2-E 1.231.23 189/154189/154 엑기스 CN-C-2-E-aExtract CN-C-2-E-a 1.291.29 199/154199/154 엑기스 CN-C-2-E-a-MiExtract CN-C-2-E-a-Mi 1.301.30 200/154200/154

상기 표 2에 기재된 결과로부터, 본 발명에 따르는 녹용의 클로로포름 추출물 CN-C 및 그로부터 정제된 각각의 엑기스는 모두 우수한 콜로니 형성 효능을 나타내며, 따라서 조혈작용 효능을 가지고 있음을 알 수 있다.From the results shown in Table 2, it can be seen that the antler chloroform extract CN-C and each extract purified therefrom according to the present invention all exhibit excellent colony forming efficacy and thus have hematopoietic effect.

8-2. 생체내 CFUs(Colony-Forming Unit in Spleen) 분석시험8-2. In vivo CFUs (Colony-Forming Unit in Spleen) Assay

본 발명에 따라 분리된 녹용 추출물중의 활성성분으로 확인된 상기의 화합물(KJ-1, KJ-4 및 KJ-5)이 조혈모세포 증식촉진활성을 가지고 있는지를 확인하기 위하여 후술하는 바와 같이 동물을 이용한 생체내 검색법으로서 준치사량의 방사선을 조사한후 저하된 골수기능의 회복도를 측정하는 방법(CFUs)을 수행하였다.To determine whether the compounds (KJ-1, KJ-4 and KJ-5) identified as active ingredients in the antler extract isolated according to the present invention have hematopoietic stem cell proliferation promoting activity, As an in vivo screening method, a method of measuring the recovery of reduced bone marrow function (CFUs) after irradiating a sub-lethal dose of radiation was performed.

6∼8 주령의 C57Bl/6 마우스를 137-Cs 방사선조사기(irradiator)(CIS #IBL437)를 사용하여 8.0Gy 의 조사량으로 전신에 방사선을 조사한 후 틸과 맥큘로흐(Till ＆ McCulloch)의 방법에 준하여 꼬리정맥을 통해 1.5×10⁵개의 동종골수세포를 주입함으로써 골수이식을 실시하였다. 마우스는 대조군과 합성물질 투여군으로 나누었다. 골수이식 후 1일, 2일, 3일에 각각의 시료들을 투여하고, 14일째에 비장을 적출하여 비장의 무게를 측정하고(표 3, 도 4), 콜로니 형성을 관찰하기 위해 비장 조직을 포르말린으로 고정한 후 절단하여 H/E (Hematoxylin/Eosin) 염색을 실시한 다음 조직학적 구조변화를 검경하였다(도 5 내지 도 11).C57Bl / 6 mice, 6-8 weeks old, were irradiated whole body at a dose of 8.0Gy using a 137-Cs irradiator (CIS # IBL437), followed by Till &McCulloch's method. Bone marrow transplantation was performed by injecting 1.5 × 10 ⁵ allogeneic bone marrow cells through the tail vein. Mice were divided into control and synthetic material administration groups. Each sample was administered on day 1, day 2, and day 3 after bone marrow transplantation, and at day 14, the spleen was removed to determine the weight of the spleen (Table 3, FIG. 4), and the spleen tissue was formalin to observe colony formation. After fixation, the cells were cut and subjected to H / E (Hematoxylin / Eosin) staining, and then examined for histological structural changes (FIGS. 5 to 11).

그 결과, 대조군 및 녹용 수용성 추출물을 투여한 마우스의 비장보다 합성물질을 투여한 마우스 비장이 크기가 더 크고 결절이 많이 생겼으며, 합성물질의 투여량이 증가할 수록 비장의 크기가 더욱 커지고 결절이 더욱 많이 생긴다는 것을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과로부터 화합물 KJ-1 내지 KJ-5의 물질들은 조혈모세포 및 혈소판 증식 촉진활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.As a result, the spleen of the mouse administered with the synthetic material was larger in size and larger in number of nodules than the spleen of the mouse treated with the control and antler water-soluble extracts. I could see a lot. Therefore, from these results, it was confirmed that the compounds of the compounds KJ-1 to KJ-5 have hematopoietic stem cell and platelet proliferation promoting activity.

그 룹group 약 물 투 여 용 량Medicinal water dose 비장무게Spleen weight 대조군Control -- 100100 녹용의 수용성 추출물Water Soluble Extract of Deer Antler -- 115115 GM-CSFGM-CSF 100U/일100U / day 265265 KJ-1KJ-1 0.05㎎/g 마우스/일0.05 mg / g mouse / day 145145 KJ-4KJ-4 0.05㎎/g 마우스/일0.05 mg / g mouse / day 357357 KJ-5KJ-5 0.05㎎/g 마우스/일0.05 mg / g mouse / day 406406 KJ-4 + GM-CSFKJ-4 + GM-CSF 0.05㎎/g 마우스/일 + 100U/일0.05 mg / g mouse / day + 100 U / day 289289 KJ-5 + GM-CSFKJ-5 + GM-CSF 0.05㎎/g 마우스/일 + 100U/일0.05 mg / g mouse / day + 100 U / day 283283 주) 각각의 비장무게는 대조군의 비장 무게를 100으로 하였을 경우의 환산 한 값임.Note) Each spleen weight is the value converted to the spleen weight of the control group to 100.

8-3. 단핵세포(monocyte) 티미딘 흡수시험8-3. Monocyte thymidine uptake test

사람의 전혈(whole blood) 100㎖ 로 부터 단핵세포 5×10⁶세포/㎖ 를 취하여 RPMI-1640+2% FBS 에 현탁시키고 37℃ 의 5% CO₂-인큐베이타에서 배양하였다. 이 세포를 웰 플레이트에 2-3×10⁶세포/4㎖/웰의 농도로 넣은 후 GM-CSF와 KJ-3를 각각 넣고, 37℃ 의 인큐베이타에서 7일간 배양하였다. 이 웰에³H-티미딘 1μCi를 가한 후 24시간 동안 배양하고 트립신분해시키고 베타카운터기로 측정하였다. 그 결과는 표 4 에 기재하였다.Mononuclear cells 5 × 10 ⁶ cells / ml were taken from 100 ml of human whole blood and suspended in RPMI-1640 + 2% FBS and incubated at 37 ° C. in 5% CO ₂ -incubator. The cells were placed in a well plate at a concentration of 2-3 × 10 ⁶ cells / 4 ml / well, and then GM-CSF and KJ-3 were added thereto, and the cells were incubated at 37 ° C. for 7 days. ¹ μCi of ³ H-thymidine was added to the wells, followed by incubation for 24 hours, trypsinized, and measured by beta counter. The results are shown in Table 4.

약제drugs 효능efficacy 실험 ⅠExperiment Ⅰ GM-CSF (100ng/㎖)GM-CSF (100ng / ml) 4.39 (5905 / 1345)4.39 (5905/1345) KJ-3 (0.01㎎/㎖)KJ-3 (0.01mg / ml) 1.48 (1938 / 1345)1.48 (1938/1345) GM-CSF + KJ-3GM-CSF + KJ-3 7.62 (10166 / 1345)7.62 (10166/1345) 실험 ⅡExperiment Ⅱ GM-CSF (100ng/㎖)GM-CSF (100ng / ml) 8.81 (3366 / 382)8.81 (3366/382) KJ-3 (0.01㎎/㎖)KJ-3 (0.01mg / ml) 10.12 (3867 / 382)10.12 (3867/382) GM-CSF + KJ-3GM-CSF + KJ-3 11.60 (4334 / 382)11.60 (4334/382)

8-4. T4/T8 티미딘 흡수시험8-4. T4 / T8 Thymidine Absorption Test

사람의 전혈로부터 단핵세포를 분리하고, 단핵세포로 부터 T 세포를 분리하였다. 이 T 세포를 MACS 키트 칼럼을 이용하여 T4와 T8을 분리하였다. 분리한 세포를 IMDM+10% FBS 로 현탁시켜 웰 플레이트에 2×10⁶세포/4㎖/웰의 농도로 넣은 후 IL-2 20㎍/㎖ 와 KJ-3 0.01㎎/㎖/웰을 가하고 인큐베이타에서 7일간 배양하였다. 이 웰에³H-티미딘 1μCi를 가한 후 24시간 동안 배양하고 트립신 분해시킨 후, 베타카운터기로 측정하였다. 그 결과는 표 5 에 기재된 바와 같다.Monocytes were isolated from human whole blood, and T cells were isolated from monocytes. These T cells were separated from T4 and T8 using a MACS kit column. The separated cells were suspended in IMDM + 10% FBS and placed in a well plate at a concentration of 2 × 10 ⁶ cells / 4 ml / well, followed by addition of 20 μg / ml IL-2 and 0.01 mg / ml / well of KJ-3. Incubated for 7 days in cubetta. ¹ μCi of ³ H-thymidine was added to the wells, incubated for 24 hours, trypsin digested, and measured by beta counter. The results are as described in Table 5.

약제drugs 효능efficacy T4 티미딘 흡수시험 결과T4 thymidine absorption test results IL-2 (20ng/㎖)IL-2 (20ng / ml) 3.73 (2054 / 551)3.73 (2054/551) KJ-3 (0.01㎎/㎖)KJ-3 (0.01mg / ml) 3.80 (2095 / 551)3.80 (2095/551) IL-2 + KJ-3IL-2 + KJ-3 5.10 (2813 / 551)5.10 (2813/551) T8 티미딘 흡수시험 결과T8 thymidine absorption test results IL-2 (20ng/㎖)IL-2 (20ng / ml) 2.22 (1556 / 700)2.22 (1556/700) KJ-3 (0.01㎎/㎖)KJ-3 (0.01mg / ml) 0.55 (385 / 700)0.55 (385/700)

상술한 바와 같이, 본 발명에 따라 분리 및 정제된 녹용의 추출물, 특히 녹용의 클로로포름 추출물과 그로부터 분획화하여 정제된 엑기스는 우수한 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진활성을 나타냄을 알 수 있다. 본 발명에 따라 또한 녹용 추출물 중에서 조혈모세포 및 혈소판 증식촉진활성을 나타내는 활성물질이 분리 및 확인되어 이들을 합성방법에 의해 제조하여 이용할 수도 있게 되었다. 본 발명에 의해 밝혀진 새로운 물질은 조혈모세포 및 혈소판 증식 촉진작용을 함으로써 면역기능 및 혈액 세포들의 기능 증진이 필요한 질환, 특히 항암제 및 방사선 조사후 골수기능이 저하된 상태에 있는 질환 등 임상 각 분야에 걸쳐서 전반적으로 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.As described above, it can be seen that the extract of the antler isolated and purified according to the present invention, in particular the chloroform extract of the antler, and the extract purified by fractionation therefrom exhibit excellent hematopoietic stem cell and platelet progenitor cell proliferation promoting activity. According to the present invention, active substances showing hematopoietic stem cell and platelet proliferation promoting activity were also isolated and identified in the antler extract, and these were also prepared and used by a synthetic method. The new substance disclosed by the present invention is to promote hematopoietic stem cell and platelet proliferation, and to promote immune function and function of blood cells, especially in various clinical fields, such as diseases in which bone marrow function is degraded after anticancer drugs and irradiation. Overall it may be used as a therapeutic agent.

Claims

글리세롤을 R_1a-OH 의 산과 반응시키고, 생성물을 다시 아세트산과 반응시킨 후, 생성물을 R_2a-OH 의 산과 반응시킴을 특징으로 하여 화학식 1a 의 화합물을 제조하는 방법:A process for preparing a compound of Formula 1a characterized by reacting glycerol with an acid of R _1a -OH, reacting the product with acetic acid again, and then reacting the product with an acid of R _2a -OH:

[화학식 1a][Formula 1a]

상기식에서,In the above formula,

R₃는 아세틸을 나타낸다.R ₃ represents acetyl.

제 1 항에 있어서, 반응을 디사이클로헥실카보디이미드 및 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 수행함을 특징으로 하는 방법.The process according to claim 1, wherein the reaction is carried out in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and dimethylaminopyridine.

a) 포스파티딜콜린인 1-R_1b-2-R_2b-3-포스포콜린 유도체를 아세트산 및 무수아세트산의 존재하에서 가아세트산분해(acetolysis)시키거나,a) acetolysis of phosphatidylcholine, 1-R _1b- 2-R _2b- 3-phosphocholine derivatives, in the presence of acetic acid and acetic anhydride, or

b) 글리세롤을 R_1b-OH 의 산과 반응시키고, 생성물을 다시 아세트산과 반응시킨 후, 생성물을 R_2b-OH 의 산과 반응시킴을 특징으로 하여 화학식 1b 의 화합물을 제조하는 방법:b) a process for preparing a compound of formula 1b, characterized in that glycerol is reacted with an acid of R _1b -OH, the product is reacted with acetic acid again, and then the product is reacted with an acid of R _2b -OH.

[화학식 1b][Formula 1b]

상기식에서,In the above formula,

R₃는 아세틸을 나타낸다.R ₃ represents acetyl.

제 3 항에 있어서, 방법 b) 의 반응을 디사이클로헥실카보디이미드 및 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 수행함을 특징으로 하는 방법.4. The process of claim 3 wherein the reaction of process b) is carried out in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and dimethylaminopyridine.