KR100267746B1 - Oral immunological preparation containing egg-yolk antibodies, for prevention and treatment of porcine diarrhea caused by enterotoxigenic escherichia coli - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 어린 돼지에서 높은 발생율을 보이는 병원성 대장균에 의한 설사증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 경구용 면역제제에 관한 것이다.The present invention relates to an oral immunologic agent that can effectively prevent and treat diarrhea caused by Escherichia coli showing a high incidence in young pigs.
병원성 대장균에 의한 돼지의 설사증은 주로 어린일령의 돼지에서 다발하며, 발생률이 높고, 한번 설사증에 걸린 돼지는 치료가 되더라도, 위축돈으로 남게되어 양돈농가에 끼치는 경제적 피해는 매우 크다.Swine diarrhea caused by Escherichia coli is mainly caused in pigs of young age, high incidence, and once treated with diarrhea, even if treated, it remains as atrophy, so the economic damage to pig farms is very significant.
이러한 대장균성 설사증은 병원성 대장균의 감염을 통하여 발생한다. 설사를 일으키는 병원성 대장균은 일반 비병원성 대장균과 다르다. 병원성 대장균은 돼지의 경구를 통하여 감염된 후 소장점막에 부착하여 증식하며, 장독소를 생성하고, 생성된 독소는 장관내의 삼투압을 변화시켜서 설사를 일으키게 된다. 대장균에 감염되어 설사를 나타내는 돼지는 수분의 손실에 의한 탈수증상을 보이며, 심한 경우에는 죽게 된다.E. coli diarrhea occurs through the infection of pathogenic E. coli. Escherichia coli, which causes diarrhea, is different from non-pathogenic Escherichia coli. Escherichia coli is infected through the oral cavity of pigs, attaches to the small intestinal mucosa, proliferates, produces enteric toxins, and changes the osmotic pressure in the intestine, which causes diarrhea. Pigs infected with E. coli and diarrhea show dehydration due to loss of water, and in severe cases die.
이러한 설사증을 일으키는 병원성 대장균은 두가지 주요한 병원성 인자를 갖는다. 즉, 소장의 점막에 부착하여 균의 증식을 유도하는 부착인자와, 증식한 균이 생성하는 장독소로 나눌 수 있다. 병원성 대장균에 의한 돼지의 설사증은 우리나라 뿐만 아니라, 전세계적으로 발생하고 있으며, 각각의 지역에 따라서 원인균의 특성은 조금씩 다르지만, 전술한 공통적인 병원성 인자를 갖는다는 점에서는 동일한 특성을 갖는다.Escherichia coli, which causes such diarrhea, has two major pathogenic factors. That is, it can be classified into adhesion factors that adhere to the mucosa of the small intestine and induce the growth of bacteria, and enterotoxins produced by the bacteria. Pig diarrhea caused by Escherichia coli occurs not only in Korea, but also all over the world, and the characteristics of causative bacteria vary slightly depending on each region, but have the same characteristics in that they have the common pathogenic factors described above.
전세계적으로 대장균 설사증의 예방을 위하여 백신을 통한 예방법을 이용해 왔으며, 현재까지도 이 방법이 가장 광범위하게 사용되고 있다. 백신을 이용한 대장균증의 예방은 분만전의 어미 돼지에게 백신을 접종하여, 어미돼지의 몸에 항체를 만들게 한 다음, 분만후에 초유를 통하여 항체를 새끼돼지에게 전달함으로써 이루어진다.Vaccines have been used worldwide for the prevention of E. coli diarrhea and are still the most widely used. Prevention of E. coli by vaccine is achieved by inoculating a mother pig before delivery, making antibodies to the mother's body, and then delivering the antibody to the piglets through colostrum after delivery.
어미돼지에게 접종하는 백신은 병원성 대장균의 장관내 부착인자를 실험실에서 분리 정제한 성분과, 장독소중 면역원성이 있는 이열성독소를 포함하기도 한다. 즉, 백신을 맞은 어미돼지는 몸안에 병원성 대장균의 부착인자에 대한 항체를 생성하며, 이를 급여받은 새끼 돼지는 경구를 통하여 침입한 병원성 대장균을 소장점막에 부착하지 못하게 함으로써 대장균증에 대한 방어력을 갖게된다. 따라서, 대장균증의 예방을 위해서는 효과적인 백신의 개발, 어미돼지의 항체 형성능, 새끼돼지에의 충분한 초유의 급여 등이 요구된다.Vaccines for mother pigs may contain components obtained by dividing and purifying the intestinal adhesion factor of Escherichia coli in a laboratory, and may also include dimeric toxins that are immunogenic among enterotoxins. In other words, the vaccinated mother pig produces antibodies against the Escherichia coli adhesion factor in the body, and the piglets that have been fed are protected against E. coli by preventing the invading Escherichia coli from invading the small intestine mucosa. . Therefore, in order to prevent E. coli, development of an effective vaccine, antibody forming ability of mother pigs, sufficient colostrum feeding to piglets are required.
현재까지는 실험실에서 분리, 정제한 병원성 대장균의 부착인자에 이열성독소를 첨가한 백신이 가장 효과가 좋은 것으로 알려져 있다. 하지만 실험실에서의 부착인자의 대량 생산은 적절한 배양조건의 설정과 번거로운 정제 과정, 정제 과정중의 오염문제 등으로 아직까지 우리나라에서는 자체 생산을 하지 못하고 있는 실정이다. 이러한 백신을 적절한 시기에 어미돼지에게 접종하였어도 어미돼지의 면역기능과 주위 환경 등의 영향으로 새끼돼지에게 충분한 방어능력을 제공할 수 있는 항체의 형성능이 문제가 되며, 초유중에 충분한 항체가 포함되더라도 분만후 24시간내에 새끼돼지들이 충분한 양의 초유를 섭취하는지 여부가 중요하다. 이러한 세가지 조건들중 하나 혹은 그 이상이 원인이 되어 대장균 설사증이 발생하게 된다.To date, vaccines with dipyrotoxicity added to the adhesion factor of Escherichia coli isolated and purified in the laboratory are known to be the most effective. However, mass production of adhesion factors in laboratories has not yet been produced in Korea due to proper culture conditions, cumbersome purification processes, and contamination during purification. Even if the vaccine is inoculated to the mother pig at the appropriate time, the formation ability of the antibody that can provide sufficient defense ability to the piglets under the influence of the mother's immune function and the surrounding environment is a problem, even if it contains enough antibodies in colostrum It is important whether the piglets get enough colostrum within the next 24 hours. One or more of these three conditions can cause E. coli diarrhea.
이에, 많은 연구자들은 상술한 문제점들을 배제할 수 있는 좀더 효과적인 백신 및 항체 개발에 주력하고 있다. 일례로서 유전자 재조합 백신, 자돈 투여용 생균 백신 등이 연구되고 있으며, 또, 초유중의 항체의 부족, 혹은 충분한 초유섭취의 실패, 모체이행항체의 소실에 의한 대장균 설사증의 발생 등을 예방하기 위하여, 소, 말 혹은 기타 다른 동물에서 대장균 백신을 접종하여 항체를 형성시킨 후, 혈액으로부터 혈청을 분리하여 이를 예방 및 치료에 응용하는 연구들이 보고되었다. 그러나, 백신 개발은 아직까지 뚜렷한 연구성과를 보이지 않고 있으며, 항체 개발은 혈청의 안전성의 문제, 안전성 문제의 극복을 위한 검사비용의 증가, 생산기간의 한계성 등에 의해 혈청의 가격이 상승하여 효과의 우수성과는 별개로 실용성의 문제가 있다.Therefore, many researchers are focused on developing more effective vaccines and antibodies that can rule out the above-mentioned problems. As an example, genetically engineered vaccines, live vaccines for piglet administration, and the like have been studied. In addition, in order to prevent the occurrence of colostral diarrhea due to lack of colostral antibodies, failure of sufficient colostrum ingestion, and loss of maternally transferred antibodies, Studies have been reported in which cows, horses or other animals have been inoculated with E. coli vaccines to form antibodies, which then separate serum from blood and apply it to prevention and treatment. However, vaccine development has not shown any clear research results, and antibody development has a superior effect because of the increase in serum price due to the problem of serum safety, increase of test cost to overcome safety problems, and limitation of production period. Apart from this, there is a problem of practicality.
다른 방법으로는 대장균의 단클론 항체의 이용 가능성이 시도되었으나 실용성이 크게 문제시 되었으며, 또 분리된 병원성 대장균에 대하여 감수성 있는 항생제를 선발하여 처치하는 방법도 있으나, 항생제의 남용으로 인한 내성균의 출현문제와 식육중 항생제 잔류로 인한 국민건강의 위협이 지적되고 있다.Other methods of using E. coli monoclonal antibodies have been attempted, but their practicality has been a major problem. Also, a method of selecting and treating susceptible antibiotics against isolated pathogenic E. coli is used. The threat of public health due to the remaining antibiotics in meat has been pointed out.
한편, 80년대 후반에서 90년대 초에 이르러 몇몇 연구자들에 의해 산란계의 달걀을 이용한 난황항체에 대한 연구가 시작되었으며, 대부분이 혈청중의 항체가의 예측을 목적으로 수행되었다. 시험은 대부분 병원성 대장균을 이용하여 수행되었고, 일부분에 국한되어 부분적으로 수행되었다.In the late 80's and early 90's, some researchers began to study egg yolk antibodies using eggs in laying hens, most of which were performed to predict antibody titers in serum. Trials were mostly carried out using Escherichia coli, but only partially.
이에, 본 발명자들은 상술한 연구결과들을 토대로 하여, 혈청중의 항체가 측정에 그치지 않고, 난황을 면역항체의 대량 생산에 이용하는 경우 일년에 3~4회의 접종으로 계속해서 고면역 달걀을 용이하게 얻을 수 있으며, 더욱이 고도로 면역화된 달걀 1개로 새끼돼지 20두 정도의 1회 투여량을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, based on the above results, the present inventors can easily obtain high-immune eggs by continuously inoculating 3-4 times a year when egg yolk is used for mass production of immune antibodies. In addition, it was confirmed that it is possible to produce a single dose of about 20 piglets with one highly immunized egg, thus completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 병원성 대장균에 의한 돼지의 설사증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 면역제제 및 그의 제조법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an immunologic agent and a method for preparing the same that can effectively prevent and treat diarrhea in pigs caused by Escherichia coli.
상기한 목적을 달성할 수 있는 면역제제의 개발은 크게 두 단계로 구성된다. 즉, 산란계에 접종되어 항체를 형성할 수 있는 시험백신의 제조와, 면역된 닭의 달걀을 이용한 면역제제의 조제로 구성된다.The development of an immunologic agent capable of achieving the above object consists of two steps. That is, it consists of preparation of a test vaccine capable of inoculating the laying hens to form antibodies, and preparation of an immunologic preparation using eggs of immunized chickens.
시험백신의 제조를 위하여, 대장균의 섬모항원들인 K88 항원, K99 항원 및 987p 항원과, 이열성 장독소를 사용한다. 이들은 산란계에 접종되어 고역가의 항체 형성을 유도할 수 있는 항원들이다. 항원들은 대량 생성할 수 있는 조건에서 배양하여 균체에서 이들 항원만을 분리, 정제하여 사용한다. 본 발명자들의 실험에 의하면, 3종의 섬모항원들, K88, K99, 987p을 모두 포함하는 복합백신으로 구성하여 접종하는 경우가 단독 접종시에 비하여 각각의 섬모항원의 항체가가 월등히 높게 나타났다. 즉, 복합백신의 경우 각 섬모항원의 접종량을 각 섬모항원 단독 사용시의 접종량보다 훨씬 적게 하여도 유사한 정도 이상의 항체가를 얻을 수 있다.For the preparation of the test vaccine, E. coli's ciliantigens, K88 antigen, K99 antigen and 987p antigen, and dimeric enterotoxin are used. These are antigens that can be inoculated into laying hens to induce high titer antibody formation. Antigens are cultured under conditions capable of mass production, and only these antigens are isolated and purified from cells. According to the experiments of the present inventors, the antibody vaccine of each ciliated antigen was significantly higher in the case of inoculation composed of a combination vaccine containing all three types of ciliated antigens, K88, K99, and 987p. That is, in the case of the combined vaccine, even if the inoculation amount of each ciliated antigen is much smaller than the inoculation amount of each ciliated antigen alone, an antibody titer of similar or higher degree can be obtained.
다음으로, 면역제제는 제조된 시험백신을 산란계에 접종하여, 면역화된 닭의 달걀의 난황으로부터 분리하여 조제한다. 달걀의 난황에는 고농도의 지방분이 있어 항체의 작용을 용이하게 하기 위해서는 항체만을 고효율로 순수 분리하는 것이 필요하며, 특히 생체에 유해하지 않아야 한다. 본 발명에서는 분리한 난황을 인산완충액(PBS : pH 7.0~7.2)으로 희석시킨 용액에 카라기난을 가한 후 원심분리하여 난황리포단백질을 침전시켜 그 상층액으로부터 얻은 난황 수용성 단백질을 이용한다.Next, the immunization agent is inoculated into the laying hens, and separated from the egg yolk of the egg of the immunized chicken. Egg yolk has a high concentration of fat, so in order to facilitate the action of the antibody it is necessary to separate the antibody purely with high efficiency, in particular should not be harmful to the living body. In the present invention, carrageenan is added to a solution obtained by diluting the separated yolk with a phosphate buffer (PBS: pH 7.0-7.2), followed by centrifugation to precipitate the yolk lipoprotein, thereby using a yolk soluble protein obtained from the supernatant.
난황항체추출법에서, 항체가의 측정을 목적으로 하는 경우에는 주로 클로로포름으로 항체를 추출하였으나, 본 발명에서와 같이 예방 및 치료를 목적으로 하는 면역제제의 경우에는 생체 안전성이 무엇보다 중요하다. 또한, 추출재료의 선정은 생체 안전성 외에도 항체의 회수율을 고려하여야 하는데, 이는 추출중에 추출재료가 항체의 단백질 변성을 유발하여 항체 역가를 감소시키는 경우도 있기 때문이다. 본 발명에서 선정한 카라기난 용액은 식품첨가물로서 공인된 검 용액으로 생체 안전성이 우수하며, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 항체 회수율 및 회수한 항체의 역가가 다른 추출재료에 비해 높다.In the yolk antibody extraction method, the antibody is mainly extracted with chloroform in order to measure the antibody titer. However, in the case of an immunologic agent for the purpose of prevention and treatment as in the present invention, biosafety is most important. In addition, the selection of extract material should take into account the recovery rate of the antibody in addition to the biosafety, since the extract material may cause protein denaturation of the antibody during extraction, thereby reducing the antibody titer. The carrageenan solution selected in the present invention has excellent biosafety as a gum solution certified as a food additive, and as shown in Table 2 below, the antibody recovery rate and the titer of the recovered antibody are higher than those of other extract materials.
이용되는 산란계로는 그 종류가 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 산란율이 높은 백색레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 접종은 피하주사, 근육주사, 복강내 주사 등 일반적인 면역방법을 이용한다.Although the kind is not specifically limited as a scattering system to be used, For example, it is preferable to use a white leg horn system, a Rhode island type, a high-line brown type etc. with a high scattering rate. Inoculation uses a common immunization method such as subcutaneous injection, intramuscular injection and intraperitoneal injection.
항원의 투여량은 원하는 항체가가 얻어지고, 또한 산란계에 대하여 악영향을 미치지 않을 정도의 양을 적당히 선택한다. 바람직하게는 닭마리당 각각의 세가지 섬모항원 및 이열성 독소가 약 100㎍의 농도가 되게 접종한다. 또한, 처음 면역후 추가면역은 목적하는 항체의 항체가에 의해 결정할 수 있다.The dosage of the antigen is appropriately selected so that the desired antibody titer is obtained and the adverse effects on the laying hens are not adversely affected. Preferably each of the three ciliated antigens and dimeric toxins per chicken is inoculated to a concentration of about 100 μg. In addition, additional immunity after initial immunization can be determined by the antibody titer of the antibody of interest.
본 발명의 면역제제는 동결건조시켜 오랫동안 보관하면서 사용할 수 있으며, 질병의 발생 정도에 따라 투여 농도를 자유롭게 조절할 수 있다.The immunological agent of the present invention can be used for long-term storage by lyophilization, and the dosage can be freely adjusted according to the degree of disease.
또한, 면역제제의 설사병 예방 및 치료효과를 향상시키기 위하여, 면역단백질을 증가시킬 수 있는 켈프밀(Kelp meal)을 면역시킬 닭의 사료에 2~4% 첨가할 수도 있으며, 수동면역법인 난황항체에 비특이적 능동면역능을 증강시켜 주기 위하여 면역증강제로서, 예를 들면 국내특허 공개 97-32884호에 개시된 면역증강제 -- 포도상구균(Staphylococcus aureuscowan Ⅰ)의 사(死) 균체 또는 정제 단백질; 보데텔라균(Bordetella pertussisATCC 9797)의 정제 단백질을 유효성분으로 함유함 --를 첨가할 수도 있다.In addition, in order to improve the prevention and treatment of diarrheal diseases of the immunologic agent, 2-4% may be added to the feed of chickens to be immunized with kelp meal, which can increase the immunoprotein, As an adjuvant to enhance non-specific active immunity, for example, an immunopotentiator disclosed in Korean Patent Laid-Open Publication No. 97-32884-dead cells or purified proteins of Staphylococcus aureus cowan I; It may be added-containing purified protein of Bordetella pertussis ATCC 9797 as an active ingredient.
본 발명의 면역제제의 적용방법은 설사증 예방을 위하여 분만직후 모든 신생자돈에, 치료를 위하여 발병초기에 집중적으로 경구투여하는 것이 바람직하다.In the method of applying the immunologic agent of the present invention, it is preferable to administer orally to all newborn piglets immediately after delivery for the prevention of diarrhea, and at the beginning of the onset for treatment.
본 발명에 따른 면역제제는 병원성 대장균의 소장 점막에의 부착을 억제하고 증식된 대장균에 의해 생성되는 장독소에 대해 내성을 나타냄으로써 병원성 대장균에 기인하는 돼지의 설사증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 특히 면역기능이 불완전한 갓 태어난 자돈에게 우수한 면역능력을 줄 수 있으며, 면역형성기간없이 투여즉시 효과를 볼 수 있다. 또한, 직접 먹이거나 사료에 배합하여 급여하는 경구용 제제이기 때문에 누구나 손쉽게 사용할 수 있다.The immunologic agent according to the present invention can effectively prevent and treat diarrhea in pigs caused by Escherichia coli by inhibiting the adhesion of the Escherichia coli to the small intestinal mucosa and exhibiting resistance to enteric toxin produced by Escherichia coli. In particular, it is possible to give an excellent immunity to newborn piglets with incomplete immune function, and the effect can be immediately seen without administration. In addition, anyone can easily use because it is an oral preparation that is fed directly or fed to feed.
이하, 면역제제의 제조법을 단계별로 구체적으로 설명한다.Hereinafter, a method for preparing an immunologic agent will be described in detail.
(1) 시험백신의 제조 :(1) Preparation of test vaccine:
(1-1) 항원의 준비 :(1-1) Preparation of the antigen:
시험백신의 생산을 위한 대장균 섬모항원은 미국 NADC(national animal disease center)에서 분양받아 수의과학연구소에서 보관중인 대장균 균주인 S-175(K88 항원생산용), S-20(K99 항원생산용), S-171(987p 항원생산용) 균주를 밍카배지(Minca broth)에 37℃, 24시간 진탕배양한 후, 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 수집한 균을 사용하였다. 이 균을 적당량의 인산완충액(PBS, Phosphate Buffered Saline)으로 부유하여 0℃에서 2분간 2회 블렌딩한 후, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수거하고, 여기에 0.5%의 포르말린을 가한 후, 암모니움설페이트를 과포화 용액이 되도록 서서히 가하였다. 얻은 과포화된 용액을 25,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하여 5℃에서 이틀간 투석한 후, 최종적으로 0.45㎛ 크기의 여과기로 여과하였다. 생산된 섬모항원은 단백질의 농도를 측정하여, 이후 시험백신의 제조에 사용하였다.Escherichia coli antigens for the production of test vaccines are E. coli strains S-175 (for K88 antigen production), S-20 (for K99 antigen production), which are distributed at the National Animal Disease Center (NADC) in the US S-171 (987p antigen production) strains were cultured in Minca broth (Minca broth) at 37 ° C. for 24 hours, followed by centrifugation at 8000 rpm for 30 minutes. The fungus was suspended in an appropriate amount of Phosphate Buffered Saline (PBS) and blended twice at 0 ° C for 2 minutes, followed by centrifugation at 12,000 rpm for 15 minutes to collect the supernatant, and 0.5% formalin was added thereto. Then, ammonium sulfate was slowly added to become a supersaturated solution. The obtained supersaturated solution was centrifuged at 25,000 rpm for 30 minutes to recover the precipitate, dialyzed at 5 ° C. for two days, and finally filtered through a 0.45 μm filter. The produced ciliated antigen was measured for the concentration of the protein, and then used for the preparation of the test vaccine.
대장균 이열성 독소의 생산은 수의과학연구소에서 보관중인 S-99 균주를, 린코마이신을 45㎎/ℓ가 되게 첨가한 CAYE(casamino acid yeast extract) 배지에서, 37℃에서 24시간동안 진탕배양한 후, 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 균 배양액을 수집하였다. 수집된 배양액에 포르말린을 0.5%가 되게 가하여 장독소를 불활성화시킨 후, 0.45㎛ 크기의 여과기로 여과하여 남은 균을 제거하였다. 여과한 배양액에 암모니움설페이트를 과포화 용액이 되도록 서서히 가한 후, 얻은 과포화된 용액을 25,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하여 5℃에서 이틀간 투석하여 이열성 독소를 생산하였다. 생산된 이열성독소는 단백질 농도를 측정하여, 이후 시험백신의 제조에 사용하였다.Production of Escherichia coli toxin was carried out by shaking the S-99 strain stored in the veterinary science laboratory in CAYE (casamino acid yeast extract) medium containing lincomycin at 45 mg / l for 24 hours at 37 ° C. , The culture medium was collected by centrifugation at 8000 rpm for 30 minutes. Formalin was added to 0.5% of the collected culture solution to inactivate the toxin, and then filtered with a filter of 0.45㎛ size to remove the remaining bacteria. Ammonium sulphate was slowly added to the filtered culture to be a supersaturated solution, and then the obtained supersaturated solution was centrifuged at 25,000 rpm for 30 minutes to recover the precipitate, and then dialyzed at 5 ° C. for two days to produce diarrhea toxin. The dipytoxin produced was measured for protein concentration and then used for preparation of the test vaccine.
(1-2) 시험백신의 제조 :(1-2) Preparation of test vaccine
위에서 얻은 대장균의 세가지 섬모항원(K88, K99, 987p)과 이열성 장독소를 혼합한 후, 알루미늄하이드록사이드겔 혹은 유성보좌제(ISA25, ISA70)를 첨가하여 제조하였다(ISA : Incomplete Seppic Adjuvant).Three ciliated antigens of Escherichia coli (K88, K99, 987p) obtained above were mixed with a dimeric enterotoxin, and then prepared by adding an aluminum hydroxide gel or an oil supplement (ISA25, ISA70) (ISA: Incomplete Seppic Adjuvant). .
(2) 면역 :(2) immunity:
산란계의 면역은 약 20주령의 백색 레그혼계에 상기 (1)단계에서 얻은 시험백신을, 1마리당 각각의 세가지 섬모항원 및 이열성 독소가 약 100㎍가 되게 조정하여 0.5~1㎖로 근육 주사하였다.Immunization of laying hens was intramuscularly injected at 0.5 to 1 ml by adjusting the test vaccine obtained in step (1) to about 100 μg of each of the three ciliated antigens and dimeric toxins per animal in a white leghorn system of about 20 weeks old. .
(3) 난황항체의 추출 및 면역제제의 조제 :(3) Extraction of yolk antibody and preparation of immunologic agent:
난황중의 항체의 추출은, 먼저 고역가의 수집한 달걀을 알코올로 잘 소독한후에 달걀의 노른자만을 50㎖ 원심튜브로 모았다. 노른자의 부피와 동량의 인산완충액(PBS)을 가한 후에 30초간 볼텍스(vortex)하여 난황이 완전히 희석액에 섞이도록 하였다. 희석한 난황액에 두배량의 검용액(0.1%의 카라기난 용액)을 가하고 실온에서 30분간 정치시킨 후, 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수집하고, 이를 여과지(Whatman No. 2 Paper filter)로 여과하였다. 얻은 여과액을 동결건조하여 대장균에 대한 특이항체를 함유하는 난황수용성단백분말을 조제하였다.In the extraction of the antibody in egg yolk, first, the high titer of collected eggs was well sterilized with alcohol, and only the yolks of the eggs were collected in a 50 ml centrifuge tube. After adding the same amount of yolk volume and phosphate buffer (PBS), vortex for 30 seconds so that egg yolk was completely mixed in the diluent. To the diluted yolk solution, twice the amount of the test solution (0.1% carrageenan solution) was added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes, followed by centrifugation at 12,000 rpm for 20 minutes to collect the supernatant, and this was a filter paper (Whatman No. 2 Paper filter). Filtered). The obtained filtrate was lyophilized to prepare an egg yolk soluble protein powder containing specific antibodies to E. coli.
<시험예 1><Test Example 1>
상기 (1)단계에서 얻은 시험백신을 닭에 접종한 후(상기 (2)단계), 백신 접종후 주기별 혈중 및 난황중의 항체가를 효소면역법(ELISA)을 이용하여 조사하였다.After inoculating the chicken with the test vaccine obtained in step (1) (step (2) above), the antibody titers of blood and egg yolk by cycle after vaccination were examined by enzyme-immunoassay (ELISA).
난황중 항체가의 조사를 위한 항체의 추출은 클로로포름을 이용하여 실시하였으며, 혈중 항체가는 닭의 혈액에서 혈청을 분리하여 사용하였다.Extraction of the antibody for investigation of the antibody titer in egg yolk was performed using chloroform, and the serum antibody titer was used by separating serum from the blood of the chicken.
효소면역법은 각각의 세가지 섬모항원을 ELISA용 플레이트에 코팅시킨 후에 PBS액으로 난황은 100배, 혈청은 200배 희석하여 실시하였으며, 405㎚에서 흡광도를 측정하여, 각각의 흡광도를 이용하여 혈중 및 난황중의 항체가를 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.Enzyme immunoassay was performed by coating each of the three ciliated antigens on an ELISA plate and diluting egg yolk 100 times and serum 200 times with PBS, and measuring absorbance at 405 nm. The antibody titer in it was measured. The results are shown in Table 3.
표 3에서 보는 바와 같이, 2차접종후 약 3개월까지도 난황중의 항체가가 높게 유지됨을 확인할 수 있었다.As shown in Table 3, it was confirmed that the antibody titer in egg yolk remained high up to about 3 months after the second inoculation.
<시험예 2><Test Example 2>
상기 (3)단계에서 얻은 면역제제를 이용하여 마우스에 대한 예방 및 치료효과를 시험하였다.The preventive and therapeutic effects on mice were tested using the immunologic agent obtained in step (3).
각각의 섬모항원을 생성하는 균주를 배양하여 공격접종용 균주로 이용하였으며, 조제한 면역제제와 동량을 마우스의 복강에 주사하여 면역제제의 예방 및 치료효과를 시험하였다. 대조군은 공격접종용 균주만을 주사한 경우이다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.Strains producing each ciliated antigen were cultured and used as a strain for challenge vaccination. The prepared immunologic and the same amount were injected into the abdominal cavity of mice to test the prevention and treatment effect of the immunologic. The control group was injected only with the strain for challenge. The results are shown in Table 4.
표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 면역제제는 대조군과 비교할 때 우수한 예방효과를 나타냈으며, 치료효과는 그다지 높지 않았으나 치료의 정도를 마우스의 죽음 여부로 판단하였기 때문에 목적동물의 설사발생의 억제효과와는 차이가 있을 것으로 생각된다.As shown in Table 4, the immunologic agent of the present invention showed an excellent preventive effect when compared to the control group. The therapeutic effect was not very high, but the degree of treatment was judged as the death of the mouse, and thus the inhibitory effect of the diarrhea of the target animal. I think there will be a difference.
<시험예 3><Test Example 3>
상기 (3)단계에서 얻은 면역제제를 이용하여 대장균 설사증이 발생한 농장의 야외자돈을 대상으로 예방 및 치료효과를 시험하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.Using the immunologic agent obtained in step (3), the preventive and therapeutic effects of the outdoor piglets on the farm where E. coli diarrhea occurred were tested. The results are shown in Table 5.
표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 면역제제를 투여한 경우 우수한 예방 및 치료효과를 관찰할 수 있었다.As shown in Table 5, when the immunologic agent of the present invention was administered, excellent prophylactic and therapeutic effects were observed.
본 발명의 경구용 면역제제는, 어미돼지의 초유중 항체의 부족함을 보완하여, 새끼돼지의 방어력을 높히며, 초유를 충분히 섭취하지 못한 새끼돼지들과, 초유를 통한 항체의 소실시기에 새끼돼지들에게 투여함으로써 신속한 질병의 방어효과를 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 난황항체는 식품첨가물을 이용하여 추출하였기 때문에 새끼돼지에게 투여시 매우 안전하며, 항생제 처치시의 내성균의 출현과, 축산물의 항생제 잔류문제를 극복할 수 있다. 즉, 본 발명에서 개발한 면역제제는 기존의 백신접종법 및 항생제처치법과 비교할 때 매우 안전하며, 투여즉시 효과를 볼 수 있는 우수한 예방 및 치료제제로 판단되며, 우리나라 및 전세계에서 가장 많이 발생하는 대장균성 설사증의 예방 및 치료제로 사용되어 양돈농가의 생산성 향상과 고품질 축산물의 생산에 크게 이바지할 것으로 기대된다.Oral immunologic preparations of the present invention, the deficiency of the antibody in the colostrum of the mother pig, to increase the defense of the piglets, piglets that do not consume enough colostrum, and piglets in the small practitioner of the antibody through colostrum When administered to them, a rapid disease defense effect can be obtained. In addition, the yolk antibody of the present invention is very safe when administered to piglets because it is extracted using food additives, it can overcome the emergence of resistant bacteria and antibiotic residues in livestock treatment. In other words, the immunologic agent developed in the present invention is very safe compared to conventional vaccination and antibiotic treatment methods, and is judged to be an excellent prophylactic and therapeutic agent that can be seen immediately upon administration, and is the most common E. coli diarrhea in Korea and around the world. It is expected to be used as a preventive and therapeutic agent for pigs, which will greatly improve the productivity of pig farms and produce high quality livestock products.
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