KR100252547B1 - Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells - Google Patents

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와이 우 죠오지
에이치 우 캐서린
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프레드 마리얀스키
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Abstract

본 발명은 올리고누클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고누클레오티드, 또는 리보자임을, 세포내의 유전자 또는 유전자들의 발현을 차단하기 위하여 특정 세포에 표적화시키기 위한 분자 복합체가 기재된다. 단일 가닥의 폴리- 또는 올리고누클레오티드는 세포-특이적 결합제와 폴리- 또는 올리고누클레오티드-결합제의 포합체와 복합체를 형성한다. 세포-특이적 결합제는 복합체의 내부화를 중재하는 세포 표면 구조에 특이적이다. 그 실예는 간세포의 아시알로당단백질 수용체이다. 폴리- 또는 올리고데옥시누클레오티드-결합제는 세포외부 조건하에서 올리고누클레오티드를 안정하게 복합체화하여 세포내부조건하에서 그것을 방출시킴으로써 표적 RNA와 혼성화할 수 있는 다가양이온 단백질과 같은 화합물이다. 분자 복합체는 생리적 유체중에서 안정하며 가용성이고 안티센스 올리고누클레오티드, 리보자임 또는 다른 단일 가닥의 올리고누클레오티드를 세포안에 선택적으로 도입시켜서 세포내에서 유전자의 발현을 억제시키는데 사용될 수 있다. 올리고누클레오티드는 세포성 유전자(예) 세포성 온코진) 또는 비세포 기원의 유전자(예) 바이러스 온코진, 감염성 병원체의 유전자들)에 대해 특정될 수 있다.The present invention describes oligonucleotides such as antisense oligonucleotides, or ribozymes, molecular complexes for targeting specific cells to block expression of a gene or genes in a cell. Single stranded poly- or oligonucleotides form complexes with conjugates of cell-specific binders and poly- or oligonucleotide-binding agents. Cell-specific binding agents are specific for cell surface structures that mediate internalization of the complex. An example is the asialo glycoprotein receptor of hepatocytes. Poly- or oligodeoxynucleotide-binding agents are compounds such as polycationic proteins that can hybridize to target RNA by stably complexing oligonucleotides under extracellular conditions and releasing them under intracellular conditions. Molecular complexes are stable in physiological fluids and can be used to inhibit the expression of genes in cells by selectively introducing antisense oligonucleotides, ribozymes or other single stranded oligonucleotides into cells. Oligonucleotides may be specified for cellular genes (eg, cellular oncogenes) or genes of non-cellular origin (eg, viral oncogenes, genes of infectious pathogens).

Description

[발명의 명칭][Name of invention]

폴리-또는 올리고누클레오티드의 세포로의 표적화된 전달Targeted Delivery of Poly- or Oligonucleotides to Cells

[발명의 배경][Background of invention]

안티센스 올리고누클레오티드는 세포에서 원하지 않는 유전자 발현을 특이적으로 억제하는 수단으로서 밝은 전망을 갖는다. 올리고누클레오티드를 세포에 전달하는 것이 개선되면 효율이 높아질 것이다. 노출된 안티센스 올리고누클레오티드는 세포에 의해 비특이적으로 및 낮은 효율로 흡수될 수 있다. 흡수율을 증가시키기 위해 몇 가지 방법이 연구되어 왔다. 그 한가지로 레마이트레, 엠(Lemaitre, M.)등은 올리고누클레오티드를 폴리라이신에 공유결합시키면 폴리라이신과 안티센스 DNA의 혼합물과 비교하여 바이러스 유전자 DNA 농도 보다 몇 배 낮게 억제시킨다는 것을 입증하였다[참조:Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 648-652]. 특이적인 항바이러스 효과가 나타났지만, 특이적인 전달은 입증되지 않았다.Antisense oligonucleotides have a bright prospect as a means of specifically inhibiting unwanted gene expression in cells. Improved delivery of oligonucleotides to cells will increase efficiency. Exposed antisense oligonucleotides can be taken up nonspecifically and with low efficiency by cells. Several methods have been studied to increase the absorption rate. For example, Lemaitre, M., et al. Demonstrated that covalent binding of oligonucleotides to polylysine inhibits viral gene DNA concentrations several times lower than the mixture of polylysine and antisense DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652. Specific antiviral effects have been shown, but no specific delivery has been demonstrated.

[발명의 요약][Summary of invention]

본 발명은 폴리- 또는 올리고누클레오티드를 특정 세포에 표적화하여, 유전자(들)의 발현을 억제시키기 위한 가용성이고 표적화가능한 분자 복합체에 관한 것이다. 분자 복합체는 세포 특이적 결합제와 폴리- 또는 올리고누클레오티드 결합제의 컨쥬게이트인 담체에 복합체화되어, 유전자의 RNA 전사체에 혼성화되는 단일 가닥의 폴리- 또는 올리고누클레오티드를 포함한다. 본 발명의 복합체는 RNA 전사체에 혼성화하여, RNA 전사체의 기능을 억제하기에 충분한 양으로 약제학적 허용 용액의 형태로 투여된다.The present invention relates to soluble and targetable molecular complexes for targeting poly- or oligonucleotides to specific cells to inhibit expression of gene (s). Molecular complexes comprise a single strand of poly- or oligonucleotide complexed to a carrier that is a conjugate of a cell specific binder and a poly- or oligonucleotide binder to hybridize to the RNA transcript of the gene. The complex of the present invention is administered in the form of a pharmaceutically acceptable solution in an amount sufficient to hybridize to the RNA transcript and to inhibit the function of the RNA transcript.

폴리- 또는 올리고누클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 안티센스의 경우, RNA에 혼성화하여, RNA의 기능을 억제시키는 안티센스 올리고 데옥시누클레오티드가 사용될 수 있다. 표적화된 RNA는 전형적으로 메신저 RNA이다. 또한, 올리고누클레오티드는 촉매 활성을 갖는 RNA(리보자임)일 수 있다. 안티센스 또는 리보자임 매개성 억제를 위한 표적은 세포기원의 유전자(들) (예를 들어, 세포성 온코진) 또는 비세포성 기원의 유전자(들) (예를 들어, 바이러스성 온코진 또는 바이러스와 같은 감염성 병원체의 유전자)일 수 있다.Poly- or oligonucleotides may be DNA or RNA. In the case of antisense, antisense oligo deoxynucleotides that hybridize to RNA and inhibit the function of RNA can be used. Targeted RNA is typically messenger RNA. In addition, oligonucleotides may be RNA (ribozymes) having catalytic activity. Targets for antisense or ribozyme mediated inhibition are gene (s) of cellular origin (eg, cellular oncogenes) or gene (s) of noncellular origin (eg, viral oncogenes or viruses). Genes of infectious pathogens).

세포 특이적 결합제는, 엔도시토시스에 의해 결합된 리간드의 내부화를 매개하는 세포 표면 구조, 전형적으로 수용체, 예를 들어 간세포의 아시알로당단백질 수용체에 특이적이다. 세포 특이적 결합제는 천연 또는 합성리간드 (예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 당단백질, 탄수화물 등)일 수 있거나 세포 표면 구조에 특이적으로 결합한 후에 결합된 복합체의 내부화를 매개하는 항체 또는 이것의 유사체일 수 있다. 컨쥬게이트의 폴리- 또는 올리고누클레오티드 결합 성분은 세포외 조건하에 단일 가닥 폴리- 또는 올리고누클레오티드와 안정적으로 복합체화되고, 이것을 세포내 조건하에 방출시킴으로써 세포내에서 기능할 수 있는 화합물, 예를 들어 다가양이온이다.Cell specific binding agents are specific for cell surface structures that mediate the internalization of ligands bound by endocytosis, typically receptors, such as the sialalo glycoprotein receptor of hepatocytes. Cell specific binding agents may be natural or synthetic ligands (eg proteins, polypeptides, glycoproteins, carbohydrates, etc.) or may be antibodies or analogs thereof that mediate internalization of the bound complex after specific binding to cell surface structures. Can be. The poly- or oligonucleotide binding component of the conjugate is a compound, for example a polycation, that is stably complexed with a single stranded poly- or oligonucleotide under extracellular conditions and can function intracellularly by releasing it under intracellular conditions to be.

유전자와 담체의 복합체는 폴리- 또는 올리고누클레오티드를 표적 세포에 선택적으로 전달하기 위해 시험관내 또는 생체내에서 사용될 수 있다. 복합체는 생리적 유체내에서 안정하며 가용성이다. 복합체는 생체내 투여될 수 있으며, 생체내에서 표적 세포에 의해 표면 구조 매개성 엔도시토시스 경로를 통해 선택적으로 흡수된다. 흡수된 폴리- 또는 올리고누클레오티드는 이것의 상보적인 RNA와 혼성화됨으로써 RNA의 기능을 억제시켜서, 표적 유전자(들)의 발현을 억제시킨다.Complexes of genes and carriers can be used in vitro or in vivo to selectively deliver poly- or oligonucleotides to target cells. The complex is stable and soluble in physiological fluids. The complex may be administered in vivo and is selectively taken up by a target cell in vivo via a surface structure mediated endocytosis pathway. The absorbed poly- or oligonucleotide hybridizes with its complementary RNA to inhibit the function of the RNA, thereby inhibiting the expression of the target gene (s).

[도면의 간단한 설명][Brief Description of Drawings]

제1도는 HepG2 및 SK Hep1 세포에 의한 복합체화된 안티센스 DNA의 흡수를 도시한다.1 shows the uptake of complexed antisense DNA by HepG2 and SK Hep1 cells.

제2도는 배양 배지 중의 B형 간염 바이러스 표면 항원 농도에 대한 복합체화된 안티센스 DNA의 효과를 도시한다.2 shows the effect of complexed antisense DNA on hepatitis B virus surface antigen concentration in culture medium.

제3도는 안티센스 DNA에 24시간 동안 노출된 후 배지 및 세포로부터 추출된 DNA의 서던 블롯을 도시한다.3 shows Southern blots of DNA extracted from media and cells after exposure to antisense DNA for 24 hours.

[발명의 상세한 설명]Detailed description of the invention

가용성의 표적화가능한 분자 복합체는 단일 가닥의 폴리- 또는 올리고누클레오티드를 생체내에서 표적 세포 또는 조직에 선택적으로 전달하여 유전자 발현을 특이적으로 억제시키기 위해 사용된다. 분자 복합체는 표적 세포에 대해 특이적인 결합제와 DNA 결합제로 구성된 담체에 복합체화된, 전달시키려는 올리고누클레오티드를 포함한다. 복합체는 표적 세포에 의해 선택적으로 흡수되고, 올리고누클레오티드는 표적화된 유전자(들)의 발현을 억제하는 RNA 전사체에 혼성화된다.Soluble targetable molecular complexes are used to selectively deliver single stranded poly- or oligonucleotides to target cells or tissues in vivo to specifically inhibit gene expression. Molecular complexes include oligonucleotides to be delivered complexed to a carrier consisting of a binder specific for the target cell and a DNA binder. The complex is selectively taken up by the target cell and the oligonucleotide hybridizes to an RNA transcript that inhibits the expression of the targeted gene (s).

폴리- 또는 올리고누클레오티드는 세포내 조건하에 특정 RNA에 혼성화되는 단일 가닥 분자이다. 세포내 조건하에 표적 RNA 서열에 적절하게 특이적으로 혼성화되기 위해 필요한 상보성의 정도는 실험적으로 측정될 수 있다.Poly- or oligonucleotides are single-stranded molecules that hybridize to specific RNA under intracellular conditions. The degree of complementarity required to properly hybridize properly to the target RNA sequence under intracellular conditions can be determined experimentally.

바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 안티센스 올리고데옥시누클레오 티드이다. 안티센스 올리고데옥시누클레오티드는 효과적인 농도로 표적에 도달하기에 충분히 안정한 정상적인 올리고데옥시누클레오티드 또는 올리고데옥시누클레오티드의 유사체(예를 들어, 포스페이트 산소 중의 하나가 황 원자로 치환되어 있는 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드)일 수 있다 [참조: Stein, C. A. 및 Cohen, J. S. (1988) Cancer REsearch 48 : 2659-2668]. 안티센스 올리고데옥시누클레오티드는 표준 합성 과정에 의해 제조될 수 있다.In a preferred embodiment, the oligonucleotide is an antisense oligodeoxynucleotide. Antisense oligodeoxynucleotides are normal oligodeoxynucleotides or analogs of oligodeoxynucleotides that are stable enough to reach a target at an effective concentration (eg, phosphorothioate oligonucleotides in which one of the phosphate oxygens is replaced by a sulfur atom). Stein, CA and Cohen, JS (1988) Cancer REsearch 48: 2659-2668. Antisense oligodeoxynucleotides can be prepared by standard synthetic procedures.

안티센스 올리고누클레오티드는 유전자 억제의 다양한 메카니즘에 의해 동작하도록 고안될 수 있다. 일반적으로, 이들 메카니즘은 특정 RNA 서열, 전형적으로는 메신저 RNA에 올리고누클레오티드가 혼성화되는 것을 포함한다. 표적화된 서열은 RNA 코딩 영역에 위치할 수 있거나 RNA의 프로세싱 또는 번역에 필요한 신호 서열일 수 있다. 표적화된 서열은 생물체에서 정상적으로 발견되는 서열이거나 병원성 생물체에서는 발견되지만 이것의 숙주에서는 발견되지 않는 서열일 수 있다. 또한, 올리고누클레오티드는 mRNA 서열의 전사를 억제하는 3중 나선 DNA 구조를 형성할 수 있다.Antisense oligonucleotides can be designed to work by a variety of mechanisms of gene suppression. In general, these mechanisms include hybridization of oligonucleotides to specific RNA sequences, typically messenger RNA. The targeted sequence may be located in an RNA coding region or may be a signal sequence required for processing or translation of RNA. The targeted sequence may be a sequence normally found in an organism or a sequence found in a pathogenic organism but not found in its host. Oligonucleotides can also form triple helix DNA structures that inhibit transcription of mRNA sequences.

그 밖의 구체예에서, 올리고누클레오티드는 촉매 활성을 갖는 RNA 분자, 즉, 리보자임일 수 있다. 리보자임은 이들이 표적화된 RNA 서열을 특이적으로 분해하여, 파괴하기 때문에 유리하다. 리보자임은 미국 특허 제 4,987,071호에 기재되어 있다.In other embodiments, the oligonucleotide may be an RNA molecule having catalytic activity, ie, ribozyme. Ribozymes are advantageous because they specifically degrade and destroy targeted RNA sequences. Ribozymes are described in US Pat. No. 4,987,071.

복합체의 담체 성분은 세포 특이적 결합제와 올리고누클레오티드 결합제의 컨쥬게이트이다. 세포 특이적 결합제는 예를 들어, 엔도시토시스 작용에 의해 내부화룰 매개하는 세포 표면 구조에 특이적으로 결합한다. 표면 구조는 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질 또는 이들의 조합일 수 있다. 이것은 전형적으로 리간드의 엔도시토시스를 매개하는 표면 수용체이다. 따라서, 결합제는 수용체에 결합하는 천연 또는 합성 리간드일 수 있다. 리간드는 세포 표면 구조에 의해 인지되어 위해 충분히 노출되는 작용기를 갖는 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 리간드는 생물체, 예를 들어 바이러스, 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 원생동물 세포)의 성분 또는 인공 담체, 예를 들어 리포솜일 수 있다.The carrier component of the complex is a conjugate of the cell specific binder and the oligonucleotide binder. Cell specific binding agents specifically bind to cell surface structures that mediate internalization by, for example, endocytosis. The surface structure can be a protein, polypeptide, carbohydrate, lipid or a combination thereof. This is typically a surface receptor that mediates the endocytosis of the ligand. Thus, the binder may be a natural or synthetic ligand that binds to the receptor. Ligands can be proteins, polypeptides, carbohydrates, lipids or combinations thereof having functional groups that are sufficiently exposed for recognition by the cell surface structure. The ligand can also be a component of an organism, for example a virus, a cell (eg, a mammalian cell, a bacterial cell, a protozoan cell) or an artificial carrier, for example a liposome.

또한, 결합제는 세포 표면 구조에 결합하는 항체, 항체의 유사체, 예를 들어 단일 사슬 항체일 수 있다.In addition, the binding agent may be an antibody that binds to the cell surface structure, an analog of the antibody, eg a single chain antibody.

담체를 형성하기에 유용한 리간드는 표적화하려는 특정 세포에 따라 달라질 것이다. 간세포를 표적화시키기 위해, 노출된 말단 탄수화물 기를 갖는 당단백질, 예를 들어 아시알로당단백질(갈락토오스-말단)이 사용될 수 있지만, 그 밖의 리간드, 예를 들어 폴리펩티드 호르몬이 또한 사용될 수 있다. 아시알로당단백질의 예로는 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid), 아시알로페투인(asialofetuin) 및 데시알릴화된(desialylated) 수포성 구내염 바이러스가 있다. 이러한 리간드는 말단 시알산과 버금끝마디(penultimate) 갈락토오스 잔기를 갖는 당단백질의 화학적 또는 효소적 탈시알릴화에 의해 형성될 수 있다. 또한, 아시알로당단백질 리간드는, 갈락토오스 말단 탄수화물, 예를 들어 락토오스 또는 아라비노갈락탄을 환원성 락토오스아민화에 의해 커플링시킴으로써 형성될 수 있다.Ligands useful for forming a carrier will vary depending upon the particular cell to be targeted. To target hepatocytes, glycoproteins with exposed terminal carbohydrate groups, such as asialo glycoproteins (galactose-terminus), can be used, but other ligands such as polypeptide hormones can also be used. Examples of asialo glycoproteins include asialorosomucoid, asialofetuin, and desialylated bullous stomatitis virus. Such ligands can be formed by chemical or enzymatic desialylation of glycoproteins having terminal sialic acid and penultimate galactose residues. In addition, asialo glycoprotein ligands can be formed by coupling galactose terminal carbohydrates, such as lactose or arabingalactan, by reductive lactose amination.

분자 복합체를 그 밖의 세포 표면 수용체에 표적화시키기 위해, 다른 유형의 리간드가 사용될 수 있으며, 예를 들어 마크로 파지(림프종)에 대해서는 만노오스, 섬유아세포(섬유육종)에 대해서는 만노오스-6-포스페이트 당단백질, 장세포에 대해서는 고유 인자인 비타민 B12및 지방 세포에 대해서는 인슐린이 사용될 수 있다. 또한, 세포 특이적 결합제는 수용체 또는 수용체 유사 분자, 예를 들어 세포 표면에 있는 리간드(예를 들어, 항원)에 결합하는 항체일 수 있다. 이러한 항체는 표준 과정에 의해 제조될 수 있다.To target molecular complexes to other cell surface receptors, other types of ligands can be used, for example mannose for macrophages (lymphoma), mannose-6-phosphate glycoprotein for fibroblasts (fibrosarcoma), Vitamin B 12 , an intrinsic factor for enterocytes, and insulin for fat cells can be used. In addition, the cell specific binding agent may be an antibody that binds to a receptor or receptor like molecule, for example a ligand (eg, an antigen) on the cell surface. Such antibodies can be prepared by standard procedures.

폴리- 또는 올리고누클레오티드 결합제는 전달시키려는 올리고누클레오티드와 복합체화된다. 올리고누클레오티드와의 복합체화는 표적 세포에 의해 내부화되기 전에 올리고누클레오티드가 세포외에서 유의 수준으로 분해되는 것을 방지할 정도로 생체내에서 충분히 안정해야 한다. 그러나, 복합체는 올리고누클레오티드가 기능적이고 혼성화가능한 형태로 방출되도록 세포내의 적절한 조건하에서 분해될 수 있다. 예를 들어, 복합체는 리소좀의 산성이고 효소 풍부 환경에서 불안정할 수 있다. 결합제와 올리고누클레오티드 사이의 정전기적 인력을 기초로 하는 비공유 결합에 의해 세포외 안정성이 제공되고, 세포내 조건하에 방출가능해 진다.The poly- or oligonucleotide binder is complexed with the oligonucleotide to be delivered. Complexation with oligonucleotides must be sufficiently stable in vivo to prevent oligonucleotides from breaking down to significant levels extracellularly before they are internalized by the target cell. However, the complex can be degraded under appropriate conditions within the cell such that the oligonucleotide is released in a functional and hybridizable form. For example, the complex may be unstable in the acidic and enzyme rich environment of the lysosomes. Non-covalent bonds based on electrostatic attraction between the binder and oligonucleotide provide extracellular stability and become releasable under intracellular conditions.

바람직한 폴리- 또는 올리고누클레오티드 결합제는 음 하전된 핵산 가닥에 결합하는 다가양이온이다. 이들 양 하전된 물질은 폴리- 또는 올리고누클레오티드와 비공유결합하여, 세포외에서는 안정하지만 세포내에서는 폴리- 또는 올리고누클레오티드를 기능성(예를 들어, 혼성화가능한) 분자로서 방출하는 가용성이고 표적화가능한 분자 복합체를 형성할 수 있다. 적당한 다가양이온으로는 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 염기성 단백질, 예를 들어 히스톤, 아비딘, 프로타민 등이 있다. 바람직한 다가양이온은 폴리라이신(예를 들어, 3,800 내지 60,000 달톤)이다. 폴리- 또는 올리고누클레오티드와 방출가능하게 결합시키는데 사용될 수 있는 그 밖의 비공유 결합으로는 수소 결합, 소수성 결합, 정전기적 결합만이 있거나 폴리- 또는 올리고 누클레오티드에 결합된 항폴리 또는 올리고누클레오티드 항체 및 비오티닐화된 누클레오티드를 함유하는 폴리- 또는 올리고누클레오티드에 결합하는 스트렙타비딘 또는 아비딘과 같은 조합이 있다.Preferred poly- or oligonucleotide binders are polycationics that bind to negatively charged nucleic acid strands. These positively charged materials noncovalently bind poly- or oligonucleotides to release soluble and targetable molecular complexes that are extracellularly stable but release the poly- or oligonucleotides as functional (eg, hybridizable) molecules intracellularly. Can be formed. Suitable polycationics include polylysine, polyarginine, polyornithine, basic proteins such as histones, avidin, protamine and the like. Preferred polycationics are polylysine (eg, 3,800 to 60,000 Daltons). Other non-covalent bonds that can be used to releasably bind to poly- or oligonucleotides include anti-poly or oligonucleotide antibodies and biotinylation having only hydrogen bonds, hydrophobic bonds, electrostatic bonds or bound to poly- or oligonucleotides. And combinations such as streptavidin or avidin that bind to poly- or oligonucleotides containing nucleotides.

담체는 세포 특이적 결합제와 올리고누클레오티드 결합제를 화학 결합시킴으로써 형성될 수 있다. 결합은 전형적으로 공유 결합니다. 바람직한 결합은 펩티드 결합이다. 이것은 정, 지. (Jung, G.) 등의 문헌에 기재된 바와 같이 수용성 카르보디이미드에 의해 형성될 수 있다 [참조: (1981) Biochem. Biophys. Res. Commun. 101 : 599-606]. 또 다른 결합은 이황화물 결합이다.The carrier may be formed by chemically binding a cell specific binder and an oligonucleotide binder. Couplings typically covalently bind. Preferred bonds are peptide bonds. This is Jung, Ji. (Jung, G.) et al., Can be formed by water-soluble carbodiimide. (1981) Biochem. Biophys. Res. Commun. 101: 599-606. Another bond is a disulfide bond.

결합 반응은 담체를 형성하는 데에 사용되는 특정한 세포 특이적 결합제와 올리고누클레오티드 결합제에 대해 최적화될 수 있다. 결합 형성은 최대화시키지만 담체 성분의 응집체 형성은 최소화시키는 반응 조건이 고안될 수 있다. 폴리- 또는 올리고누클레오티드 결합제에 대한 세포 특이적 결합제의 최적비는 실험적으로 결정될 수 있다. 다가양이온이 사용되는 경우, 성분들의 몰비는 다가양이온의 크기 및 폴리- 또는 올리고누클레오티드의 크기에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 21량체의 올리고누클레오티드와 복합체화된 폴리라이신에 결합된 아시알로오로소뮤코이드의 컨쥬게이트의 경우, 2:1 내지 1:2의 중량비(아시알로 오로소뮤코이드:올리고누클레오티드)가 사용될 수 있다. 결합되지 않은 성분 및 응집체는 분자 체 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 담체로부터 분리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 컨쥬게이트는 고압 액체 양이온 교환 컬럼(AquaporeTMcation-exchange, Rainin)에서 0.1M 아세트산 나트륨으로, pH 5.0, 2.5, 2.25 및 2.0으로 단계적으로 용리시키면서 정제된다.The binding reaction can be optimized for the specific cell specific binders and oligonucleotide binders used to form the carrier. Reaction conditions may be devised that maximize bond formation but minimize aggregate formation of carrier components. Optimal ratios of cell specific binders to poly- or oligonucleotide binders can be determined experimentally. If a polycation is used, the molar ratio of the components will depend on the size of the polycation and the size of the poly- or oligonucleotide. For example, in the case of a conjugate of asialoorosomucoid bound to polylysine complexed with a 21-mer oligonucleotide, a weight ratio of 2: 1 to 1: 2 (Asialo orosomucoid: oligonucleotide) Can be used. Unbound components and aggregates can be separated from the carrier by molecular sieve or ion exchange chromatography. In a preferred embodiment, the conjugate is purified by step eluting with 0.1 M sodium acetate in a high pressure liquid cation exchange column (Aquapore ™ cation-exchange, Rainin), pH 5.0, 2.5, 2.25 and 2.0.

복합체를 형성시키기 위해 폴리- 또는 올리고누클레오티드와 담체를 혼합시키고, 복합체를 형성시키는 조건하에 인큐베이션시킨다. 예를 들어, 폴리- 또는 올리고누클레오티드와 담체는 2M NaCl 중에서 적절한 비율로 혼합될 수 있고, 용액을 0.15M로 희석시키고, 여과시켜서, 투여가능한 조성물을 제공할 수 있다.The poly- or oligonucleotide and the carrier are mixed to form a complex and incubated under conditions that form the complex. For example, the poly- or oligonucleotide and the carrier can be mixed in a suitable proportion in 2M NaCl and the solution can be diluted to 0.15M and filtered to provide an administrable composition.

분자 복합체는 핵산 가닥의 하나 이상의 복사체를 함유할 수 있다. 물론, 폴리- 또는 올리고누클레오티드의 양은 생성되는 복합체의 용해도를 유지하기에 필요한 양을 초과해서는 안된다. 사용되는 구성물을 위한 담체 대 폴리- 또는 올리고누클레오티드의 바람직한 중량비 또는 몰비는 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.Molecular complexes may contain one or more copies of nucleic acid strands. Of course, the amount of poly- or oligonucleotides should not exceed the amount necessary to maintain the solubility of the resulting complex. Preferred weight ratios or molar ratios of carrier to poly- or oligonucleotide for the constituents used can be determined by routine experimentation.

본 발명의 분자 복합체는 비경구적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 정맥 주사된다. 본 발명의 분자 복합체는 생리학적으로 허용되는 비히클에 포함되어 용액의 형태로 투여된다.Molecular complexes of the invention can be administered parenterally. Preferably, it is injected intravenously. The molecular complex of the present invention is contained in a physiologically acceptable vehicle and administered in the form of a solution.

본 발명의 분자 복합체는 특이적 혼성화를 위한 광범위한 폴리- 및 올리고누클레오티드를 일반적으로 RNA 표적에 표적 전달하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 표적은 3중체 형성에 의한 DNA일 수 있다 [참조: Duvall-Valentine et al., (1992) PNAS 89: 504-508]. 전자의 경우, 치료 목적에 따라, 올리고누클레오티드는 세포 기원의 유전자(들) (예를 들어, 세포성온코진) 또는 비세포성 기원의 유전자(들) (예를 들어, 바이러스 온코진 또는 감염성 병원체, 예를 들어 말라리아, 트리파노솜, 리스테리아 또는 마이코플라스마와 같은 기생충 또는 바이러스의 유전자)의 번역에 대해 유도될 수 있다. 후자의 경우, 안티센스는 표적 유전자의 전사에 대해 유도될 수 있다.Molecular complexes of the present invention can be used for target delivery of a wide range of poly- and oligonucleotides for specific hybridization generally to RNA targets. In addition, the target may be DNA by triplet formation (Duvall-Valentine et al., (1992) PNAS 89: 504-508). In the former case, depending on the therapeutic purpose, the oligonucleotide may be a gene (s) of cell origin (eg, cellular oncogenes) or a gene (s) of noncellular origin (eg, viral oncogenes or infectious pathogens, eg Genes of parasites or viruses, such as malaria, tripanosomes, Listeria or mycoplasma, for example. In the latter case, antisense can be induced for transcription of the target gene.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 간염 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 복합체는, 안티센스 올리고 데옥시누클레오티드를 특히 간세포에 전달하여 간염 바이러스의 생성을 차단하기 위해 사용될 수 있다. 한 가지 방법은, 사람 B형 간염 바이러스가 이것의 간결한 성질 때문에 단지 하나의 폴리아데닐화 신호(누틀레오티드 1903 내지 1923)를 갖는다는 사실을 이용한다. 신호는 모든 B형 간염 바이러스 유도된 mRNA에 대해 공통적이며, 포유동물 세포 신호와는 다르다. 결과로서, 이 영역에 대해 상보적인 안티센스 올리고데옥시누클레오티드는 바이러스 단백질 합성을 차단할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 가닥은 긴 아시알로당단백질 수용체에 대한 리간드와 폴리라이신과 같은 다가양이온 단백질을 포함하는 담체에 복합체화되어, 간을 표적화할 수 있는 가용성 분자 복합체를 제공한다.In one embodiment, the methods of the present invention can be used to treat a hepatitis infection. The complex can be used to deliver antisense oligo deoxynucleotides, particularly to hepatocytes, to block the production of hepatitis virus. One method takes advantage of the fact that human hepatitis B virus has only one polyadenylation signal (Nucleotide 1903 to 1923) because of its compact nature. The signal is common for all hepatitis B virus induced mRNAs and is different from mammalian cell signals. As a result, antisense oligodeoxynucleotides complementary to this region can block viral protein synthesis. In a preferred embodiment, the antisense strand is complexed to a carrier comprising a ligand for the long asialo glycoprotein receptor and a polycationic protein such as polylysine to provide a soluble molecular complex capable of targeting the liver.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 세포 기원의 유전자 발현을 변화시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 정상 또는 비정상 세포성 단백질의 비정상적 생합성, 특히 과발현을 특징으로 하는 질병의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.In another embodiment, the methods of the invention can be used to alter gene expression of cell origin. The methods of the invention may be useful for the treatment of diseases characterized by abnormal biosynthesis, in particular overexpression, of normal or abnormal cellular proteins. The invention is further illustrated by the following examples.

[실시예 1]Example 1

[재료 및 방법][Materials and methods]

[세포 및 세포배양][Cells and Cell Cultures]

조지 액스(George Acs) 박사(Mt. Sinai School of Medicine, NY)로부터 제공받은 사람 간 종양 HepG2 2.2.15 세포, 및 SK Hepl 세포를 이미 공지된 바와 같이 DMEM 및 10% 우태아 혈청 중에서 증식시켰다 [참조: Wu, G. Y. and Wu, C. H. (1987) J. Biol. Chem. 262 : 4429-4432].Human liver tumor HepG2 2.2.15 cells, and SK Hepl cells, received from Dr. George Acs (Mt. Sinai School of Medicine, NY) were grown in DMEM and 10% fetal bovine serum as already known [ See, Wu, GY and Wu, CH (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432].

[표적화가능한 안티센스 DNA의 제조]Preparation of Targetable Antisense DNA

표적화가능한 가용성 DNA 담체를, 이미 공지된 바와 같이 [참조: Wu, G. Y. and Wu, C. H. (1987) J. Biol. Chem. 262 : 4429-4432] 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드를 사용하여, 아시알로오로소뮤코이드를 폴리 L-라이신 (Sigma)(Mr=59,000)에 결합시킴으로써 제조하되, 컨쥬게이트를 아쿠아포어(Aquapore) C-300 칼럼(Rainin)을 사용하고, 0.1M 아세트산나트륨으로 pH 5.0, 2.5, 2.25 및 2.0으로 단계적으로 용리시키는 고압 액체 크로마토그래피 시스템(Rainin)을 사용하여 정제시켰다. 230nm에서의 U.V. 흡수에 의해 검출하여 칼럼으로부터 용리되는 제2피크가 최적 컨쥬게이트 형태인 것으로 결정되었고, 모든 후속 실험에 사용되었다. 폴리아데닐화신호를 포함하는 사람 B형 간염 바이러스(ayw 서브타입) [참조: Hirschman, S. Z. et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5507-5511]의 일부에 상보적인, 바이러스 게놈의 누클레오티드 1903 내지 1923(SEQUENCE ID No.1- TTTATAAGGGTCGATGTCCAT 참조)에 해당하는 21량체 올리고데옥시누클레오티드를 자동 누클레오티드 합성기(Applied Biosystems)에서 포스포로티오에이트 결합에 의해 합성하였다 [참조: Matsukura, M et al.(1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7705-7710]. 대조 표준으로서, 임의의 21량체 서열을 동일한 방식으로 제조하였다. 올리고누클레오 티드의 순도를 브롬화 에티듐으로 염색된 15% 폴리아크릴아미드겔을 통한 전기영동에 의해 측정하였다. 안티센스 DNA를 컨쥬게이트로 적정하여 이미 공지된 바와 같이 [Wu, G. Y. and Wu, C. H.(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-44 32], 아가로오스 겔 지연 시스템을 사용하여 가용성 복합체를 형성시키고, 1.6:1의 중량비의 컨쥬게이트 대 DNA (아시알로오로소뮤코이드 : DNA)을 선택하였다.Targetable soluble DNA carriers are described, as already known, in Wu, G. Y. and Wu, C. H. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432] was prepared by binding an asialoorosomucoid to poly L-lysine (Sigma) (Mr = 59,000) using 1-ethyl-3- (3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide. Purification of the conjugate using a high pressure liquid chromatography system (Rainin) using an Aquapore C-300 column (Rainin) and stepwise eluting with 0.1 M sodium acetate to pH 5.0, 2.5, 2.25 and 2.0 I was. U.V. at 230 nm. The second peak detected by absorption and eluting from the column was determined to be the optimal conjugate form and was used for all subsequent experiments. Human hepatitis B virus (ayw subtype) comprising a polyadenylation signal [Hirschman, S. Z. et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5507-5511, a 21-mer oligodeoxynucleotide corresponding to nucleotides 1903-1923 of the viral genome (see SEQUENCE ID No.1-TTTATAAGGGTCGATGTCCAT), complementary to a portion of the phosphor genome, was phosphorylated in an automated nucleotide synthesizer (Applied Biosystems). It was synthesized by thioate linkage. Matsukura, M et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 7705-7710. As a control standard, any 21-mer sequence was prepared in the same manner. The purity of the oligonucleotides was determined by electrophoresis through 15% polyacrylamide gel stained with ethidium bromide. Antisense DNA was titrated with conjugates, as previously known [Wu, G. Y. and Wu, C. H. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-44 32, soluble complexes were formed using an agarose gel delay system and a conjugate to DNA (Asialoosomucoid: DNA) in a weight ratio of 1.6: 1 was selected.

[복합체화된 안티센스 DNA의 수용체 매개성 흡수에 대한 검정][A assay for receptor mediated uptake of complexed antisense DNA]

올리고누클레오티드의 흡수를 평가하기 위해, 안티센스 DNA를32P로 말단 표지하였다 [참조: Sambrook, J. et al.(1989) Molecular Clonig-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed., vol. 2, pg. 11. 31]. DNA를 단독으로 또는 복합체의 형태로 HepG2와 SK Hep1 세포의 배지에 첨가하여, 첨가되는 안티센스 DNA에 대하여 50μM 용액을 만들었다. 흡수는 아시알로당단백질에 대해 이미 공지된 바와 같이 측정하였다 [참조: Schwartz, A. L. et al.(1981) J. Biol. Chem. 256:8878-8881]. 요약하면, 세포를 37℃에서, 규칙적인 시간 간격으로 리간드와 인큐베이션하고, 디쉬를 4℃로 냉각시킨 다음, 저온 10mM EDTA-포스페이트 완층 식염수로 세척하고, 세포층을 분리하여, 신틸레이션 계수하였다. 세포 표면에 결합된 카운트를 측정하기 위해, 동일한 세트의 세포를 4℃에서 리간드와 인큐베이션하고, 전술한 바와 같이 세척하고, 세포층을 분리하여, 부착성 방사능을 신틸레이션 계수에 의해 측정하였다. 흡수율을 37℃에서의 전체 세포 결합된 카운트와 각각의 시간점에 대한 4℃에서의 세포에 결합된 카운트 사이의 차로서 계산하였다. 모든 시점을 3중으로 측정하였고, 결과를 pmole DNA/106 세포로서 표현되는, 평균 ±SEM으로서 나타내었다.To assess the uptake of oligonucleotides, antisense DNA was end labeled with 32 P. See Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Clonig-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed., Vol. 2, pg. 11. 31]. DNA alone or in the form of a complex was added to the medium of HepG2 and SK Hep1 cells to make a 50 μM solution for the added antisense DNA. Absorption was measured as already known for the asialo glycoprotein. Schwartz, AL et al. (1981) J. Biol. Chem. 256: 8878-8881. In summary, cells were incubated with ligand at regular time intervals at 37 ° C., dishes were cooled to 4 ° C., then washed with cold 10 mM EDTA-phosphate complete saline, and the cell layers separated and scintillation counted. To determine the count bound to the cell surface, the same set of cells were incubated with the ligand at 4 ° C., washed as described above, the cell layers separated and the adherent radioactivity measured by scintillation counting. Uptake was calculated as the difference between total cell bound counts at 37 ° C. and counts bound to cells at 4 ° C. for each time point. All time points were measured in triplicates and results were expressed as mean ± SEM, expressed as pmole DNA / 106 cells.

[안티센스 DNA 및 바이러스 유전자 발현][Antisense DNA and Viral Gene Expression]

바이러스 유전자 발현에 대한 안티센스 DNA의 효과를 측정하기 위해, HepG2 2.2.15 세포를 컨플루언시에 이르기 6일 전에 시이딩하여, 안티센스 DNA만을 함유하는 배지중에서, 복합체화된 안티센스 DNA를 함유하는 배지중에서, 복합체화된 무작위 DNA를 함유하는 배지중에서, 또는 오로지 배지 중에서 37℃에서 인큐베이션하였다. DNA가 첨가된 모든 배지는 DNA에 대해 초기에 50μM였다. 매일, 배지 50㎕를 샘플링하고, 샘플에서 발견된 항원 농도 범위에서 선형 반응을 나타내는 연속 희석된 표준 표면 항원(CalBiochem)을 사용하는 정량을 위해 변형된, 제조업자에 의해 설명된 대로 ELISA(Abbott) 방법에 의해 B형 간염 표면 항원에 대해 검정하였다. 세포수는 트립판블루로 염색된 세포를 현미경하에 계수함으로써 측정하였다. 모든 시점을 3중으로 측정하였으며, 4회 실험의 결과를 ㎍/㎖/106 세포로서 표현되는 평균 ±SEM으로서 나타내었다.To determine the effect of antisense DNA on viral gene expression, HepG2 2.2.15 cells were seeded 6 days prior to confluence, containing medium containing complexed antisense DNA in a medium containing only antisense DNA. Incubated at 37 ° C. in medium containing complexed random DNA, or only in medium. All media added with DNA was initially 50 μΜ for DNA. Daily, 50 μl of medium is sampled and ELISA (Abbott) as described by the manufacturer, modified for quantification using serially diluted standard surface antigens (CalBiochem) that exhibit a linear response in the range of antigen concentrations found in the sample. The method was assayed for hepatitis B surface antigen. Cell counts were determined by counting cells stained with trypan blue under a microscope. All time points were measured in triplicates and the results of the four experiments were expressed as mean ± SEM expressed as μg / ml / 106 cells.

[단백질 분비에 대한 안티센스 DNA의 효과][Effect of Antisense DNA on Protein Secretion]

HepG2 2.2.15 세포를, 제2도에 기재된 복합체화된 DNA 50μM와 인큐베이션하였다. 비활성이 1000 Ci/mmole인 10μCi[35S]-메티오닌(Amersham)을 첨가하여, 새로 합성된 단백질을 표지하는 것을 제외하고는, 24시간 후, 배지를 옮기고, 세포를 인산염 완충 식염수로 세척하고, 1% 황산 도데실 나트륨으로 용해시킨 후, 트리톤 X-100으로 황산 도데실 나트륨을 제거하였다. 배지 및 세포 용해물 둘 모두를 특정 토끼 항-표면 항원 항체(DAKO)로 처리하고, 단백질-A 세파로오스(Sigma 제품)로 침전시켰따. 침전물을 신틸레이션 계수하고, 각각의 지점을 3중으로 검정하였다. 전체 세포 단백질을 비색계 검정(Bio-Rad)에 의해 측정하였다. 3회 실험의 결과를 cpm/mg 세포 단백질로서 표현되는 평균 ±SEM으로서 나타내었다.HepG2 2.2.15 cells were incubated with 50 μM of the complexed DNA described in FIG. After 24 hours, except for labeling the newly synthesized protein with the addition of 10 μCi [ 35 S] -methionine (Amersham) with a specific activity of 1000 Ci / mmole, the medium is transferred and the cells are washed with phosphate buffered saline, After dissolving with 1% sodium dodecyl sulfate, sodium dodecyl sulfate was removed with Triton X-100. Both media and cell lysates were treated with specific rabbit anti-surface antigen antibody (DAKO) and precipitated with Protein-A Sepharose (Sigma). The precipitate was counted for scintillation and each point was assayed in triplicate. Whole cell proteins were measured by colorimetric assay (Bio-Rad). The results of three experiments are shown as mean ± SEM expressed as cpm / mg cell protein.

전체 단백질 합성에 대한 복합체화된 안티센스 DNA의 효과를 평가하기 위해, 전술한 바와같이 복합체화된 DNA로 처리하고, [35S]-메티오닌으로 표지시킨 세포를 배지로부터 분리하였다. 전체 단백질을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 카운트하였다. 3회 실험의 3중 결과를 cpm/mg 세포 단백질로서 표현되는 평균 ±SEM으로서 나타내었다.To assess the effect of complexed antisense DNA on total protein synthesis, cells treated with complexed DNA as described above and labeled with [ 35 S] -methionine were isolated from the medium. Total protein was precipitated with 10% trichloroacetic acid and counted. Triple results of three experiments are shown as mean ± SEM expressed as cpm / mg cell protein.

[바이러스 DNA의 생성에 대한 안티센스 DNA의 효과][Effect of Antisense DNA on Generation of Viral DNA]

세포를 단독 또는 복합체 형태의 안티센스 DNA 50μM와 인큐베이션하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고, HBV DNA를, 셀스, 엠. 에이. (Sells, M. A.)등의 문헌[(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1005-1009]에 기재된 방법에 따라 배지로부터 추출하고, 허트, 비. 제이 (Hirt, B. J.)의 문헌[(1967) Mol. Biol. 26:365-371]에 따라 세포층으로부터 추출하였다. 전체 세포 단백질은 비색계 검정(Bio-Rad)에 의해 측정하였다. 동부피(40㎖)의 배지 및 거의 동일한 갯수의 세포(107개)로부터 추출한 DNA를 아가로오스 겔상에 도포시켰다. HBV DNA를32P로 표지된 프로브로서의 HBV 게놈의 EcoRl-BglII 단편(누클레오티드 0 내지 1982)을 사용하여 서던블롯에 의해 확인하고, 공지된 바와 같이 X-선 필름에 노출시켰다 [참조: Sambrook, J. et al.(1989) Molecular Cloning-A Laboratory Mannal, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed., vol.2, pp. 10.14~10.15]. 상대적 정량은 밀도계에 의해 수행하고, 상응하는 밴드의 신틸레이션 계수에 의해 확인하였다.Cells were incubated with 50 μM of antisense DNA alone or in complex form. After 24 hours, the medium was removed and HBV DNA was collected from Cells, M. a. (Sells, MA) et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1005-1009, and extracted from the medium according to the method described in the following. Hirt, BJ (1967) Mol. Biol. 26: 365-371]. Whole cell proteins were measured by colorimetric assay (Bio-Rad). DNA extracted from eastern blood (40 mL) medium and approximately the same number of cells (10 7 ) was applied on an agarose gel. HBV DNA was identified by Southern blot using EcoRl-BglII fragments (nucleotides 0-1982) of the HBV genome as probes labeled with 32 P and exposed to X-ray films as known, see Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Mannal, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed., vol. 2, pp. 10.14-10.15]. Relative quantification was performed by density meters and confirmed by scintillation coefficients of the corresponding bands.

첫 번째 목적은 단일 가닥 DNA 올리고누클레오티드가 아시알로당단백질 기초 담체에 의해 결합될 수 있는 지의 여부 및 이것이 아시알로당단백질 수용체 함유 세포에 특이적으로 표적화될 수 있는 지의 여부를 결정하는 데에 있다.The first objective is to determine whether single stranded DNA oligonucleotides can be bound by an asialo glycoprotein based carrier and whether it can be specifically targeted to an asialo glycoprotein receptor containing cell.

제1도는 HepG2 및 SK Hepl 세포에 의한 복합체화된 안티센스 DNA의 흡수를 나타낸다. 표적화가능한 가용성 DNA 담체를, 아시알로오로소뮤코이드를 공지된 바와 같이 [Wu, G, Y. and Wu, C. H. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 수용성 카르보디이미드를 사용하여 폴리 L-라이신에 결합시킴으로써 제조하고, “재료 및 방법”단원에 기재한 바와 같이 정제하였다. 컨쥬게이트를, 폴리아데닐화 신호를 포함하는 사람 B형 간염 바이러스의 일부에 대해 상보적이고32P로 표지된 21량체 올리고 데옥시누클레오티드와 복합체를 형성시켰다. DNA를 단독 또는 복합체의 형태로 첨가하여 배지에 첨가되는 안티센스 DNA에 대해 50μM가 되게 하였다. 흡수를 아시알로당단백질에 대해 공지된 바와 같이 [Schwartz, A. L. et al.,(1981) J. Biol. Chem. 256:8878-8881] 결정하였다. 세포를 37℃에서, 규칙적인 시간간격으로 인큐베이션하고, 디쉬를 냉각시키고, 10mM EDTA-포스페이트 완충식염수로 세척하였다. 세포 표면에 결합된 카운트를 측정하기 위해, 동일 세트의 세포를 또한 4℃에서 리간드와 인큐베이션시키고, 전술한 바와 같이 세척한 후, 세포층을 분리하여, 방사능을 신틸레이션 계수에 의해 측정하였다. 흡수는 37℃에서의 세포 결합 카운트와 각각의 시간점에 대한 4℃에서의 세포표면에 결합된 카운트 사이의 차로서 계산하였다. 모든 점을 3중으로 측정하였고, 결과를 pmol DNA/106개 세포로 표현되는 평균 ±SEM으로서 나타내었고, 도면에 사용된 부호의 의미는 다음과 같다: (○), 오로지 안티센스 DNA; (◆), 복합체화된 안티센스 DNA ; (△), 복합체화된 안티센스 DNA + 100배 몰과량의 아시알로오로소뮤코이드. 제1도는 SK Hep1[아시알로당단백질 수용체(-)세포]에서, 안티센스 DNA 단독의 흡수율이 4시간 노출시에 0.05pmole/hr/106개 세포 미만이었음을 나타낸다. 복합체 형태의 DNA와 인큐베이션시키면 이들 세포에서의 흡수율이 개선되지 않았다. 유사하게는, HepG2[아시알로당단백질 수용체(+)] 세포에 의한 안티센스 DNA 단독의 흡수율은 4시간 동안 수용체(-) 세포에서 관찰되는 것 만큼이나 낮았다. 그러나, 수용체(+) 세포에서, 복합체화된 안티센스 DNA는 4시간의 인큐베이션 동안 안티센스 DNA 단독 보다 12배 빠른 평균 속도로 거의 선형적으로 흡수되었다. 복합체화된 안티센스의 축적율은 노출시킨지 4시간 후 안티센스 DNA만에 의한 축적율 보다 12배 높았다. 복합체화된 DNA의 흡수를, 수용체 결합에 대해 경합하는 유리 담체 단백질인 아시알로오로소뮤코이드를 크게 몰과량으로 투여함으로써 실질적으로 완전히 차단시켰다. 이것에 의해 안티센스 DNA의 특정 전달에 아시알로당단백질 수용체가 관여함이 확인되었다.1 shows uptake of complexed antisense DNA by HepG2 and SK Hepl cells. Soluble DNA carriers that can be targeted are described as known asialoorosomucoids [Wu, G, Y. and Wu, CH (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432, prepared by binding to poly L-lysine using water-soluble carbodiimide and purified as described in the “Materials and Methods” section. The conjugate was complexed with a 21-mer oligo deoxynucleotide that was complementary to a portion of the human hepatitis B virus containing a polyadenylation signal and labeled with 32 P. DNA was added alone or in the form of a complex to reach 50 μM for antisense DNA added to the medium. Uptake is known as known for the asialo glycoprotein [Schwartz, AL et al., (1981) J. Biol. Chem. 256: 8878-8881. Cells were incubated at 37 ° C. at regular intervals, the dishes cooled and washed with 10 mM EDTA-phosphate buffered saline. To determine the count bound to the cell surface, the same set of cells were also incubated with ligand at 4 ° C., washed as described above, and then the cell layers were separated, and radioactivity measured by scintillation counting. Uptake was calculated as the difference between cell binding counts at 37 ° C. and counts bound to the cell surface at 4 ° C. for each time point. All points were measured in triplicates and the results were expressed as mean ± SEM expressed in pmol DNA / 10 6 cells and the meanings of the symbols used in the figures are as follows: (○), only antisense DNA; (◆), complexed antisense DNA; (Δ), complexed antisense DNA + 100-fold molar excess of asialoorosomucoid. 1 shows that in SK Hep1 [Asialo glycoprotein receptor (-) cells], the uptake rate of antisense DNA alone was less than 0.05 pmole / hr / 10 6 cells at 4 h exposure. Incubation with the complex form of DNA did not improve uptake in these cells. Similarly, the uptake rate of antisense DNA alone by HepG2 [Asialo glycoprotein receptor (+)] cells was as low as that observed for receptor (−) cells for 4 hours. However, in receptor (+) cells, the complexed antisense DNA was absorbed almost linearly at an average rate 12 times faster than antisense DNA alone during 4 hours of incubation. The accumulation rate of the complexed antisense was 12 times higher than the accumulation rate by antisense DNA only 4 hours after exposure. The uptake of the complexed DNA was substantially completely blocked by the administration of large molar excesses of the asialoorosomucoid, a free carrier protein that competes for receptor binding. This confirmed that the asialo glycoprotein receptor is involved in the specific delivery of antisense DNA.

표적화된 안티센스 DNA가 기능적인 지를 측정하기 위해, B형 간염 바이러스 유전자 발현에 대한 효과를 평가하였다. 제2도는 배양 배지에서의 B형 간염 바이러스 표면 항원 농도에 대한 복합체화된 안티센스 DNA의 효과를 도시한다. HepG2 2.2.15 세포를, 안티센스 DNA만을 함유하는 배지, 복합체화된 안티센스 DNA를 함유하는 배지, 복합체화된 무작위 DNA를 함유하는 배지 또는 오로지 배지중에서 37℃에서 인큐베이션하였다. DNA가 첨가된 모든 배지는 초기에 DNA가 50μM이었다. 매일, 배지를 샘플링하여, 제조업자에 의해 설명된 ELISA(Abbott) 방법을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 변형시킨 방법에 의해 B형 간염 표면 항원의 존재에 대하여 검정하였다. 세포수는 트립판 블루로 염색된 세포를 현미경으로 계수함으로써 측정하였다. 모든 점을 3중으로 결정하였으며, 4회 실험의 결과를 ㎍/㎖/106개 세포로 표현되는 평균 ±SEM으로서 나타내었다.To determine if the targeted antisense DNA is functional, the effect on hepatitis B virus gene expression was evaluated. 2 shows the effect of complexed antisense DNA on hepatitis B virus surface antigen concentration in culture medium. HepG2 2.2.15 cells were incubated at 37 ° C. in a medium containing only antisense DNA, a medium containing complexed antisense DNA, a medium containing complexed random DNA or only medium. All media added with DNA initially had 50 μM of DNA. Daily, the medium was sampled and assayed for the presence of hepatitis B surface antigen by a method in which the ELISA (Abbott) method described by the manufacturer was modified as described in Materials and Methods. Cell number was measured by counting the cells stained with trypan blue under a microscope. All points were determined in triplicate, and the results of four experiments were expressed as mean ± SEM expressed in μg / ml / 10 6 cells.

제2도는 미처리된 대조 세포의 경우, B형 간염 바이러스 표면 항원의 농도는 배지에서, 제1일째에 1㎍/㎖/106개 세포에서 제7일째에 5.5㎍/㎖/106개 세포로 꾸준히 상승하였다. 세포를 안티센스 DNA만에 노출시키면 표면 항원 농도가 미처리된 대조표준보다 30% 더 낮아지는 3일째까지 유의할 만한 효과가 나타나지 않았다. 그럼에도 불구하고, 안티센스 DNA만의 존재하에 표면 항원 농도는 전체 7일의 노출 기간에 걸쳐 꾸준히 증가하였다. 그러나, 복합체화된 안티센스 DNA로 처리하면 미처리된 대조표준과 비교하여, 제1일 후 80%, 제7일째에는 95%를 억제시켰다. 처음 24시간 후 표면 항원 농도의 유의할 만한 증가는 없었다. 크기가 동일한 복합체화된 무작위 DNA는 동일 조건하에 임의의 시점에서도 항원 농도에 대해 효과를 나타내지 않았다.A second turn if the untreated control cells, the concentration of hepatitis B surface antigen in the medium, the first day in 1㎍ / ㎖ / 10 6 cells in claim 5.5㎍ / ㎖ / 10 6 cells on day 7 It has risen steadily. Exposure of cells to antisense DNA alone showed no significant effect until day 3, when the surface antigen concentration was 30% lower than the untreated control. Nevertheless, surface antigen concentrations in the presence of antisense DNA alone increased steadily over the entire 7 day exposure period. However, treatment with complexed antisense DNA inhibited 80% after day 1 and 95% on day 7, compared to untreated control. There was no significant increase in surface antigen concentration after the first 24 hours. Complexed random DNA of the same size had no effect on antigen concentration at any time point under the same conditions.

복합체화된 안티센스 DNA로 처리된 세포의 배지에서 B형 간염 표면 항원의 축적되지 않는 것은 단백질 분비가 차단되기 때문일 수 있다. 이 가능성을 조사하기 위해, 새로운 표면 항원의 합성을 배지 및 세포층에서 측정 하였다. 표 1a에는 복합체화된 안티센스 DNA로 24시간 동안 처리한 후 배지 및 세포 둘 모두에서의 방사성표지된 면역침전성 표면 항원은 미처리된 세포와 비교하여 동일한 범위(80%)로 감소하는 것으로 도시되어 있다. 단백질 분비의 차단이 일어는 경우에 기대되었던 새롭게 합성된 항원의 유의할 만한 세포내 축적은 없었다.Not accumulating hepatitis B surface antigen in the medium of cells treated with complexed antisense DNA may be due to blocked protein secretion. To investigate this possibility, the synthesis of new surface antigens was measured in the media and cell layers. Table 1a shows that after 24 hours of treatment with complexed antisense DNA, radiolabeled immunoprecipitated surface antigens in both medium and cells are reduced to the same range (80%) compared to untreated cells. . There was no significant intracellular accumulation of the newly synthesized antigen that was expected when blocking of protein secretion occurred.

표 1b에는 복합체화된 안티센스 DNA 또는 무작위 DNA 둘 모두 세포층의 새롭게 합성된 전체 단백질에 대해 유의할 만한 효과를 나타내지 않는 것이 도시되어 있다. 복합체화된 안티센스 DNA에 노출된 세포에서 새롭게 합성된 분비된 단백질의 소량, 즉, 2% 감소가 검출되었다. 이것은 표 1a에 주지된 바이러스 표면 항원 합성의 억제의 기여를 반영하는 것으로 여겨진다. 전반적으로, 데이타에 의해, 복합체화된 안티센스 DNA에 의한 B형 간염 표면 항원 합성의 관찰된 억제가 특이적이며, 전체 단백질 합성의 일반화된 억제에 기인될 수 없는 것으로 나타난다.Table 1b shows that neither the complexed antisense DNA nor the random DNA showed a significant effect on the newly synthesized total protein of the cell layer. Small amounts of newly synthesized secreted protein, ie 2% reduction, were detected in cells exposed to complexed antisense DNA. This is believed to reflect the contribution of inhibition of viral surface antigen synthesis, well known in Table 1a. Overall, the data indicate that the observed inhibition of hepatitis B surface antigen synthesis by complexed antisense DNA is specific and cannot be attributed to generalized inhibition of overall protein synthesis.

[표 1a]TABLE 1a

[표 1b]TABLE 1b

*24시간 인큐베이션후 * 24 hours after incubation

+cpm/㎖ 세포 단백질 + cpm / ml cell protein

TCA-트리클로로아세트산TCA-trichloroacetic acid

최종적으로, 바이러스 복제가 영향을 받았는 지를 측정하기 위해, DNA를 올리고 누클레오티드에 24시간 동안 노출시킨 배지 및 세포층으로부터 추출하여, 서던 블롯에 의해 분석하였다. 제3도에는 안티센스 DNA에 24시간 노출시킨 후 배지 및 세포로부터 추출된 DNA의 서던 블롯이 도시되어 있다. 세포는 제2도에 대해 설명된 바와 같이 오로지 안티센스 DNA 또는 제2도에 기재된 복합체 형태의 안티센스 DNA 50μM와 인큐베이션하였다. 24시간 후, 배지를 분리하여, DNA를, 배지로부터 추출하고 [참조: Sells, M. A. et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1005-1009], 세포층으로부터 추출하였다 [참조: Hirt, B. J. (1967) Mol. Biol. 26:365-371]. 전체 세포 단백질을 비색계 검정(Bio-Rad)에 의해 결정하였다. 동일한 부피의 배지 및 거의 동일한 갯수의 세포로부터 추출한 DNA를 아가로오스 겔상에 도포시키고, HBV 게놈의 EcoRl-BglII 단편을32P로 표지된 프로브로서 사용하여 서던 블롯을 수행하고 X-선 필름에 노출시킴으로써 확인하였다 [참조: Sambrook, J. et al.(1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed., Vol. 2, pp. 10.14-10.15]. 상대적인 정량을 밀도계에 의해 수행하였고, 각각 배지 및 세포층에 대해 동일한 부피 또는 세포수로 정규화시킨 상응하는 밴드의 신틸레이션 계수에 의해 확인하였다. 이중 블롯을 수행하였고, 그 중 대표적인 블롯을 상기 나타내었다. 레인 1 내지 4, 세포 용해물; 레인 5 내지 8, 배지; 레인 1과 5, 미처리된 대조표준; 레인 2와 6, 복합체화된 안티센스 DNA로 처리; 레인 3과 7, 복합체화된 무작위 DNA로 처리; 레인 4와 8, 안티센스 DNA만으로 처리. 이완된 원형(RC) 및 단일 가닥(SS) 형태에 대한 예상 위치를 우측에 표시하였다.Finally, to determine if viral replication was affected, DNA was extracted from media and cell layers exposed to oligonucleotides for 24 hours and analyzed by Southern blot. 3 shows Southern blots of DNA extracted from media and cells after 24 hours exposure to antisense DNA. Cells were incubated with 50 μM of antisense DNA only in antisense DNA or complex form described in FIG. 2 as described for FIG. After 24 hours, the medium was separated and DNA was extracted from the medium and described in Sells, MA et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1005-1009], extracted from the cell layer [Hirt, BJ (1967) Mol. Biol. 26: 365-371. Whole cell proteins were determined by colorimetric assay (Bio-Rad). DNA extracted from the same volume of medium and approximately the same number of cells was applied on an agarose gel and subjected to Southern blot using EcoRl-BglII fragment of the HBV genome as a 32 P labeled probe and exposed to X-ray film See Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed., Vol. 2, pp. 10.14-10.15]. Relative quantification was performed by density meters and confirmed by scintillation coefficients of the corresponding bands normalized to the same volume or cell number for the medium and cell layer, respectively. Double blots were performed, representative of which are shown above. Lanes 1 to 4, cell lysates; Lanes 5 to 8, medium; Lanes 1 and 5, untreated control; Lanes 2 and 6, treatment with complexed antisense DNA; Lanes 3 and 7, treated with randomized DNA; Lanes 4 and 8, only treated with antisense DNA. Expected positions for relaxed circular (RC) and single stranded (SS) forms are indicated on the right.

제3도의 레인 1과 5는 미처리된 세포가 이완된 원형 및 단일 가닥의 선형 바이러스 복제성 DNA 형태에 대해 예상된 위치에서 밴드를 생성시킴을 나타낸다. 그 밖의 작은 밴드들은 이 셀라인에 대해 이미 공지된 바와 같이 예를 들어, 2.3kb로 존재하였다 [참조: Sells, M.A. et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1005-1009]. 레인 2와 6은 세포를 복합체화된 안티센스 DNA로 세포를 처리하면 배지내의 모든 바이러스 DNA 형태의 양이 미처리된 세포(레인 1과 5)와 비교하여 약 80% 만큼 감소됨을 보여준다. 레인 3과 7의 복합체화된 무작위 DNA는 동일 조건하에 HBV DNA의 수준에 대해 검출가능한 효과를 나타내지 않았다. 레인 4와 8의 오로지 안티센스 DNA는 HBV를 미처리된 대조표준에 비해 약 30% 만큼 감소시켰다. 트립판 블루 배제에 의해 결정된 생세포의 갯수는 임의의 형태의 DNA에 의한 처리에 의해 영향을 받지 않았다(데이타는 제시되지 않음).Lanes 1 and 5 of FIG. 3 show that untreated cells generate bands at expected locations for relaxed circular and single stranded linear viral replica DNA forms. Other small bands were present, for example, 2.3 kb, as already known for this cell line. See Sells, M.A. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1005-1009]. Lanes 2 and 6 show that treatment of cells with complexed antisense DNA reduced the amount of all viral DNA forms in the medium by about 80% compared to untreated cells (lanes 1 and 5). The complexed random DNA of lanes 3 and 7 showed no detectable effect on the level of HBV DNA under the same conditions. Only antisense DNA in lanes 4 and 8 reduced HBV by about 30% compared to untreated controls. The number of viable cells determined by trypan blue exclusion was not affected by treatment with any form of DNA (data not shown).

다수의 세포 유형이 유리 올리고누클레오티드를 흡수할 수 있는 것으로 이미 밝혀졌다 [참조: Loke, S. L. et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3474-3478]. 로우크(Loke) 등은 흡수율이 올리고누클레오티드의 크기에 반비례함을 밝혔다[참조: Loke, S. L. et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3474-3478]. 그러나 일반적으로, DNA 서열이 길수록, 표적 mRNA 분자에 대한 특이성이 더 크다. 이러한 상반되는 특성에 의해 현재의 안티센스 올리고누클레오티드의 사용과 관련된 보편적인 2가지 문제점, 즉, 비효율적인 흡수율 및 세포 특이성의 결핍이 예증된다. 안티센스올리고누클레오티드의 흡수율을 개선시키기 위해, 레마이트레 등은 올리고누클레오티드를 폴리라이신에 공유결합시키고 [참조: (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652], 유리 DNA로 수득될 수 있는 농도 보다 수 배 낮은 농도에서 항바이러스 효과를 수득하였다. 그러나, 전달은 세포 특이적이지 않았다. 본 발명자들의 흡수 데이타에 의해 올리고누클레오티드의 세포로의 수송이 크게 증가될 수 있을 뿐만 아니라, 흡수가 아시알로 당단백질 기초 DNA-담체 시스템에 의해 매개된 특정 세포에 대해 또한 유도될 수 있는 것으로 나타났다.Many cell types have already been found capable of absorbing free oligonucleotides. See Loke, S. L. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3474-3478. Loke et al. Found that the absorption was inversely proportional to the size of the oligonucleotides (Loke, S. L. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3474-3478. In general, however, the longer the DNA sequence, the greater the specificity for the target mRNA molecule. These opposing properties illustrate two common problems associated with the use of current antisense oligonucleotides: inefficient absorption and lack of cell specificity. To improve the uptake of antisense oligonucleotides, Remytre et al. Covalently bind oligonucleotides to polylysine and (see, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652], antiviral effects were obtained at concentrations several times lower than those obtainable with free DNA. However, delivery was not cell specific. The uptake data of the inventors show that not only can the transport of oligonucleotides to cells be greatly increased, but also that uptake can also be induced for specific cells mediated by the asialo glycoprotein based DNA-carrier system.

번역의 안티센스 매개성 억제에 관여하는 혼성체를 형성시키는 DNA와 mRNA의 혼성화의 특이성 때문에, 시험관내에서의 정상 유전자 발현을 연구하기 위해 안티센스 올리고누클레오티드를 성공적으로 사용하였다 [참조: Bevilaqua, A. 등 (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:831-835]. 유사한 이유로 인해, 안티센스 올리고누클레오티드가 항바이러스 효과에 대해 또한 이미 조사되었다 [참조: Goodchild, J. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5507-5511, 및 Agrawal, S. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 7790-7794]. 예를 들어, 아그로월, 에스. (Agrawall, S.) 등은 전염성 바이러스(HIV)를 안티센스 올리고누클레오티드와 함께 비표적화된 방법으로 세포 배지에 투여하였다 [참조: (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 7790-7794]. 바이러스 복제의 특이적 억제가 입증되었다. 유사하게는, 레마이트레 등은 상당한 특이적 항바이러스 효과를 갖는 세포에 안티센스 올리고누클레오티드가 예비투여된 급성 바이러스 감염의 모형을 연구하였다 [참조: Lemaitre, M. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652]. 본 발명자들의 실험은, 본 발명에 사용된 세포가 통합된 바이러스 게놈에 의해 바이러스가 생성되고 있는 기존의 안정한 바이러스 감염에 걸려 있다는 점에서 이들 종래의 연구들과 차이가 있다. 본 발명자들의 데이터에 의하면, 안정한 감염이 존재했다고 하더라도, 안티센스 올리고누클레오티드의 전달에 의해 바이러스 유전자의 발현이 특이적 방식으로 극적으로 억제될 수 있는 것으로 보인다. 그러나, B형 간염 바이러스의 지속적인 생체내 생성은 통합되지 않은 바이러스 DNA의 존재로 인한 것이 보통이다 [참조: Shafritz, D. et al. (1981) N. Eng. J. Med. 305:1067-1073]. 바이러스 게놈이 숙주의 게놈에 통합되는 것은 온전한 바이러스 입자의 생성이 중단되는 것과 일반적으로 관련이 있다 [참조: Ganem, D. et al. (1982) Rev. Infect. Dis. 4:1026]. 표적화된 안티센스 올리고누클레오티드의 전달이, 통합되지 않은 바이러스 DNA에 의해 발생된 감염의 존재하에 효과적일 수 있는 지는 미지수이다. 그러나, 간염 바이러스로 감염된 HepG2 세포에서의 아시알로당단백질 흡수율은 감염되지 않은 HepG2 세포와 실질적으로 다르지 않은 것으로 밝혀졌으며, 이는 바이러스에 의한 감염이 이들 세포에서의 수용체의 활성을 변화시키지 않았음을 나타낸다. 이것에 의해, 안티센스 올리고누클레오티드의 표적화된 전달이 아시알로당백질 수용체에 의해 자연적으로 감염되는 것이 정상적인 간세포에 일반적으로 적용가능함이 암시된다.Because of the specificity of hybridization of DNA and mRNA to form hybrids involved in antisense mediated inhibition of translation, antisense oligonucleotides have been successfully used to study normal gene expression in vitro. See Bevilaqua, A. et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 831-835. For similar reasons, antisense oligonucleotides have also already been investigated for antiviral effects. Goodchild, J. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5507-5511, and Agrawal, S. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7790-7794. For example, Agrowall, S. (Agrawall, S.) et al. Administered infectious virus (HIV) to cell media in a nontargeted manner with antisense oligonucleotides (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7790-7794. Specific inhibition of viral replication has been demonstrated. Similarly, Lemaitre et al. Studied a model of acute viral infection in which antisense oligonucleotides were pre-administered to cells with significant specific antiviral effects. Lemaitre, M. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652. Our experiments differ from these conventional studies in that the cells used in the present invention suffer from existing stable viral infections in which viruses are produced by the integrated viral genome. Our data show that even if a stable infection is present, expression of viral genes can be dramatically suppressed in a specific manner by delivery of antisense oligonucleotides. However, the sustained in vivo production of hepatitis B virus is usually due to the presence of unintegrated viral DNA. Shafritz, D. et al. (1981) N. Eng. J. Med. 305: 1067-1073]. Integration of the viral genome into the genome of a host is generally associated with the interruption of the production of intact viral particles. Ganem, D. et al. (1982) Rev. Infect. Dis. 4: 1026]. It is unknown whether the delivery of targeted antisense oligonucleotides may be effective in the presence of infection caused by unintegrated viral DNA. However, the asialo glycoprotein uptake rate in HepG2 cells infected with the hepatitis virus was found to be substantially no different from uninfected HepG2 cells, indicating that infection by the virus did not alter the activity of the receptors in these cells. . This suggests that it is generally applicable to normal hepatocytes that the targeted delivery of antisense oligonucleotides is naturally infected by the asialo glycoprotein receptor.

본 실험에 사용된 올리고누클레오티드는 포스포로티오네이트 결합에 의해 함께 결합되어 있다는 점을 유의해야 한다. 이들 결합은 정상적인 포스포디에스테르 결합 보다 누클레아제 분해에 대해 감수성이 약하다. 그러나, 포스포디에스테르 결합을 이용하여 합성한 안티센스 올리고누클레오티드도 효과적이었다. 또한, 안티센스 올리고누클레오티드에 누클레아제 내성을 부여하기 위해 다수의 합성 방법이 개발되었다 [참조: Miller, P.S. et al. (1985) Nucleosides Nucleotides 6:769- 776]. 다가음이온 특성을 보유하는 형태도 수용체 매개성 운반체 시스템에 의해 전달되어 표적화된 방식으로 효율을 높이고 지속시킬 수 있다.It should be noted that the oligonucleotides used in this experiment are bound together by phosphorothionate bonds. These bonds are less susceptible to nuclease degradation than normal phosphodiester bonds. However, antisense oligonucleotides synthesized using phosphodiester bonds were also effective. In addition, a number of synthetic methods have been developed to confer nuclease resistance to antisense oligonucleotides. See Miller, P.S. et al. (1985) Nucleosides Nucleotides 6: 769-776. Forms possessing polyanionic properties can also be delivered by receptor mediated carrier systems to increase and sustain efficiency in a targeted manner.

[생체내에서의 AsOR-폴리 L-라이신-올리고 DNA 복합체의 흡수][Intake of AsOR-poly L-lysine-oligo DNA Complex in Vivo]

AsOR-폴리-L-라이신-올리고 DNA 복합체가 생체내에서 간세포 아시알로 당단백질 수용체에 의해 인식되는 이들의 능력을 보유하는 지를 결정하기 위해, 200 내지 250g의 래트에, AsOR-폴리-L-라이신-[32P]-올리고 DNA만을, 또는 0.15M 멸균 식염수 중의 1000배 몰과량의 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid)와 함께 꼬리정맥을 통해 정맥 주사하였다. 10분 후, 실험 동물을 치사시키고, 혈액, 간, 비장, 폐 및 신장의 샘플을 취하였다. 조직 샘플을 칭량하고, 균질화시키고, 수성 계수용 신틸런트(scintillant)와 혼합하고, β-계수기로32P-방사능에 대하여 계수하였다. 각각의 기관에 의한 방사능 흡수율을 주사된 전체 카운트에 대한 평균 백분율로서 나타내었다. 이들 데이터에 의해, 복합체화된 단일 가닥(안티센스) 올리고 DNA 서열을 간단한 정맥 주사에 의해 간에 특이적으로 표적화시킬 수 있음이 암시된다.To determine if the AsOR-poly-L-lysine-oligo DNA complex retains their ability to be recognized by hepatocyte asialo glycoprotein receptors in vivo, in 200-250 g of rats, AsOR-poly-L-lysine -[ 32 P] -oligo DNA only or intravenously injected via the tail vein with a 1000-fold molar excess of asialorosomucoid in 0.15 M sterile saline. After 10 minutes, the experimental animals were killed and samples of blood, liver, spleen, lungs and kidneys were taken. Tissue samples were weighed, homogenized, mixed with scintillant for aqueous counting and counted for 32 P-radioactivity with β-counter. Radioactivity uptake by each organ is expressed as the average percentage of the total count injected. These data suggest that complexed single stranded (antisense) oligo DNA sequences can be specifically targeted to the liver by simple intravenous injection.

[32P-(올리고누클레오티드) DNA의 AsOR-PL 복합체로서의 분포][Distribution of 32 P- (oligonucleotide) DNA as AsOR-PL Complex]

[주사 백분율(%)][Injection Percentage]

혈액 6.0Blood 6.0

심장 2.1Heart 2.1

폐 4.5Lung 4.5

신장 2.7Height 2.7

비장 3.7Spleen 3.7

간 81Liver 81

[1000배 몰과량의 저온 AsOR과의 경합][Competition with 1000 times molar excess of low temperature AsOR]

[주사 백분율(%)][Injection Percentage]

혈액 74.1Blood 74.1

심장 1.5Heart 1.5

폐 3.2Lung 3.2

신장 4.1Height 4.1

비장 3Spleen 3

간 14.1Liver 14.1

[실시예 2]Example 2

[재료 및 방법][Materials and methods]

프로콜라겐의 생합성에 대한 AsOR-PL-α1(I) 프로콜라겐 안티센스 DNA의 효과를 측정하기 위한 검정Assay to measure the effect of AsOR-PL-α1 (I) procollagen antisense DNA on the biosynthesis of procollagen

[세포 배양 및 처리][Cell Culture and Treatment]

마이클 시아(Michael Shia) 박사(Messachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA)의 호의로 제공받은, 콜라겐을 생성하며, 아시알로당단백질(AsG) 수용체 유전자로 안정하게 트랜스펙션된 마우스 섬유아세포 셀라인(3T3-AsGR)을 DMEM 및 10% FBS에서 증식시켰다. 3T3-AsGR의 컨플루언트 35mm 디쉬를, DMEM과 10% FBS 중에서 37℃에서 12 내지 16시간 동안 α1(I) 안티센스 DNA 만으로(1.3μM 또는 2.7μM) 또는 다양한 농도의 안티센스 DNA 복합체(1.3μM, 1.7μM 또는 2.7μM)로 처리하였다. 배지를 분리하여, [3H]-프롤린 5μCi/㎖, 아스코르베이트 50㎍/㎖ 및 다양한 농도의 안티센스 DNA 또는 복합체를 함유하는 표지화 배지로 교체하였다. 세포를 표지화 배지에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이팅시켰다. 새로 합성된 프로콜라겐과 기타 단백질을 박테리아 콜라게나제 분해에 의해 측정하였다 [참조: Peterkofsky, B. Diegelmann, Biochemistry 10:988-994(1971)].A mouse fibroblast cell line that produces collagen and is stably transfected with an Asialo glycoprotein (AsG) receptor gene, courtesy of Dr. Michael Shia (Messachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA) 3T3-AsGR) was grown in DMEM and 10% FBS. Confluent 35 mm dishes of 3T3-AsGR were treated with α1 (I) antisense DNA alone (1.3 μM or 2.7 μM) for 12-16 hours at 37 ° C. in DMEM and 10% FBS or at various concentrations of antisense DNA complexes (1.3 μM, 1.7 μM or 2.7 μM). The medium was separated and replaced with labeling medium containing 5 μCi / ml [ 3 H] -proline, 50 μg / ml ascorbate and various concentrations of antisense DNA or complex. Cells were incubated at 37 ° C. for 4 hours in labeling medium. Newly synthesized procollagen and other proteins were measured by bacterial collagenase digestion (Peterkofsky, B. Diegelmann, Biochemistry 10: 988-994 (1971)).

[콜라게나제 분해][Collagenase Degradation]

표지화 배지를 분리하여, 별도로 놓아 두었다. 프로테아제 억제제를 함유하는 완충액(0.5M Tris, pH 7.4, 0.4 mM NEM, 0.2mM PMSF, 2.5mM EDTA)을 세포층에 첨가하고, 세포층을 분리하여, 상층액과 함께 풀링시켰다. 전체 혼합물을 다운스(Dounce) 균질기를 이용하여 균질화시키고, 아이스 콜드 TCA를 최종 농도가 15%가 되도록 첨가하였다. TCA 침전성 단백질을 37℃에서 2시간 동안 박테리아 콜라게나제(Form III, Advanced Biofactures, Lynbrook, NY)로 분해시킨 다음, TCA-타닌산을 사용하여 침전시켰다. 상층액 중의 콜라게나제-감수성 방사능을 원심분리에 의해 분리하여, 새로 합성된 프로콜라겐 생성을 측정하였다. 콜라게나제 내성 침전된 방사능을 사용하여 비콜라겐성 단백질 생성을 계산하였다. 모든 검정을 동수의 세포에 대해 표준화시켰다.Labeling medium was separated and set aside. Buffer containing a protease inhibitor (0.5M Tris, pH 7.4, 0.4 mM NEM, 0.2 mM PMSF, 2.5 mM EDTA) was added to the cell layer, and the cell layer was separated and pooled with the supernatant. The entire mixture was homogenized using a Dounce homogenizer and ice cold TCA was added to a final concentration of 15%. TCA precipitating proteins were digested with bacterial collagenase (Form III, Advanced Biofactures, Lynbrook, NY) for 2 hours at 37 ° C. and then precipitated using TCA-tannic acid. Collagenase-sensitive radioactivity in the supernatant was separated by centrifugation to measure newly synthesized procollagen production. Collagenase resistance precipitated radioactivity was used to calculate non-collagenic protein production. All assays were normalized to equal numbers of cells.

[표적화가능한 안티센스 DNA의 제조]Preparation of Targetable Antisense DNA

표적화 가능한 가용성 DNA 운반체를, 공지된 바와 같이 [참조: Wu, G.Y. 및 Wu, C.H. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(Pierce)를 사용하여 아시알로 오로소뮤코이드를 폴리 L-라이신(Sigma)(Mr=41,000)에 결합시킴으로써 제조하되, 단, 컨쥬게이트를, 아쿠아포아(Aquapore) C-300 컬럼(Rainin)과 pH 5.0, 2.5, 2.25 및 2.0의 0.1M 아세트산 나트륨에 의한 단계식 용리를 사용하는 고압 액체 크로마토그래피 시스템(Rainin)을 이용하는 양이온 교환 크로마토그래피 방법에 의해 정제하였다. 230nm에서의 U.V. 흡수에 의해 검출하여, 컬럼으로부터 용리된 제2의 피이크는 최적의 컨쥬게이트 형태인 것으로 결정되었고, 모든 후속 실험에 사용하였다. pro α1 프로콜라겐 mRNA의 5′ 영역에 상보적인 24량체 올리고데옥시 누클레오티드 (서열 ID. No. 2-CCGGAGGTCCACAAAGCTGAACAT 참조)를 자동 누클레오티드 합성기 (Applied Biosystems)에서 포스포디에스테르 결합에 의해 합성하였다 [참조: Matsukura, M. 등, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7705-7710]. 구체적으로, 이 서열은 α1(I) 번역 개시 부위에서 출발하며, 첫 번째 인트론의 일부를 포함하는 pro α1 프로콜라겐의 최초 24개 누클레오티드에 대하여 안티센스이다. 올리고누클레오티드의 순도를 브롬화 에티듐으로 염색시킨 15% 폴리아크릴아미드 겔을 통한 전기영동에 의해 결정하였다. 공지된 바와 같이 [Wu, G.Y, 및 Wu, C.H. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432], 안티센스 DNA를 컨쥬게이트로 적정하여 아가로스 겔 지연 시스템에 의해 가용성 복합체를 형성시키고, 2:1 중량비의 컨쥬게이트 대 DNA(아시알로오로소뮤코이드-폴리라이신(AsOR-PL):DNA)를 선택하였다.Targetable soluble DNA carriers are known as described in Wu, G.Y. And Wu, C.H. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432] binding asialo orosomucoid to poly L-lysine (Mr = 41,000) using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (Pierce). A high pressure liquid chromatography system (Rainin) was prepared using a stepwise elution with an Aquapore C-300 column (Rainin) and 0.1 M sodium acetate at pH 5.0, 2.5, 2.25 and 2.0. Purified by a cation exchange chromatography method. U.V. at 230 nm. Detected by absorption, the second peak eluted from the column was determined to be in optimal conjugate form and used for all subsequent experiments. A 24-mer oligodeoxy nucleotide complementary to the 5 ′ region of pro α1 procollagen mRNA (see SEQ ID NO: No. 2-CCGGAGGTCCACAAAGCTGAACAT) was synthesized by phosphodiester binding in an automated nucleotide synthesizer (Applied Biosystems). Matsukura , M. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7705-7710. Specifically, this sequence starts at the α1 (I) translation initiation site and is antisense for the first 24 nucleotides of pro α1 procollagen, including a portion of the first intron. The purity of the oligonucleotides was determined by electrophoresis through a 15% polyacrylamide gel stained with ethidium bromide. As is known [Wu, G.Y, and Wu, C.H. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432], by titrating antisense DNA with conjugates to form a soluble complex by an agarose gel retardation system, in a 2: 1 weight ratio of conjugate to DNA (Asialosomucoid-polylysine (AsOR- PL): DNA) was selected.

[복합체화된 안티센스 DNA의 수용체 매개성 흡수에 대한 검정][A assay for receptor mediated uptake of complexed antisense DNA]

3T3-AsGR 세포에 있는 아시알로당단백질 수용체의 흡수 능력을 특징화하기 위해, DMEM 및 10% FBS 중의 3T3-AsGR 세포의 컨플루언트 35mm 디쉬를 포스페이트 완충된 식염수(PBS)-10mM EDTA, pH 5.0으로 스트립핑하고, 비활성이 x106cpm/㎍인 [125I]-AsOR 2㎍/㎖과 인큐베이션하였다. 흡수율은 아시알로당단백질에 대해 이미 기술한 바와 같이 측정하였다 [참조: Schwartz, A.L., et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:8878-8881]. 간단히 설명하면, 세포를 37℃에서 규칙적인 시간 간격으로 (0.5, 1, 2 또는 4시간)[125I] AsOR과 인큐베이션시키고, 디쉬를 4℃로 냉각시킨후, 저온 10mM EDTA-포스페이트 완충 식염수로 3회 세척하고, 세포층을 0.1 NaOH로 용해시켜 감마 계수하였다. 이 과정을 3T3-AsGR 세포를 [32P]-DNA-AsOR-PL(1.3μM 안티센스) 또는 1.3μM DNA-[125I]-AsOR-PL(비활성=0.5x106cpm/㎍)과 인큐베이션시킴으로써 반복하여, 안티센스 복합체의 흡수율을 측정하되, 단,32P-표지된 복합체와 인큐베이션된 세포층을 신틸레이션 계수하였다. 병렬 디쉬를 중량이 300배 과다한 저온 AsOR과 방사성 표지된 리간드와 인큐베이션하여, 비특이적 흡수율을 측정하였다. 세포 표면에 결합된 카운트를 확인하기 위해, 동일한 세트의 세포를 4℃에서 리간드와 인큐베이션하고, 상술된 바와 같이 세척한 후 세포층을 분리하고, 부착성 방사능을 신틸레이션 계수에 의해 측정하였다. 흡수율을 각각의 시간점에 대해 37℃에서의 전체 세포 결합된 카운트와 각각의 시점에 대해 4℃에서 세포에 결합된 카운트 사이의 차로서 계산하였다.To characterize the uptake capacity of asialo glycoprotein receptors in 3T3-AsGR cells, a confluent 35 mm dish of 3T3-AsGR cells in DMEM and 10% FBS was phosphate buffered saline (PBS) -10 mM EDTA, pH 5.0. Stripping and incubation with 2 [mu] g / ml [ 125 I] -AsOR with an inactivation x10 6 cpm / [mu] g. Absorption was measured as previously described for asialo glycoproteins. Schwartz, AL, et al. (1981) J. Biol. Chem. 256: 8878-8881. Briefly, cells are incubated at 37 ° C. at regular time intervals (0.5, 1, 2 or 4 hours) [ 125 I] AsOR, the dishes cooled to 4 ° C. and then in cold 10 mM EDTA-phosphate buffered saline. Washed three times, the cell layer was lysed with 0.1 NaOH and gamma counted. This process was repeated by incubating 3T3-AsGR cells with [ 32 P] -DNA-AsOR-PL (1.3 μM antisense) or 1.3 μM DNA- [ 125 I] -AsOR-PL (inactive = 0.5 × 10 6 cpm / μg), The uptake of the antisense complexes was measured, except that the cell layers incubated with the 32 P-labeled complexes were scintillation counted. Parallel dishes were incubated with a 300-fold excess of cold AsOR and radiolabeled ligand to determine nonspecific uptake. To confirm the counts bound to the cell surface, the same set of cells were incubated with ligands at 4 ° C., washed as described above and the cell layers separated, and adherent radioactivity measured by scintillation counting. Uptake was calculated as the difference between total cell bound counts at 37 ° C. for each time point and counts bound to cells at 4 ° C. for each time point.

[RNA 추출 및 RNA 돗트 블롯][RNA Extraction and RNA Dot Blot]

DMEM 및 10% FBS 중의 3T3-AsGR 세포의 컨플루언트 10cm 디쉬를, 하기 성분 중 하나 또는 하기 성분의 조합물과 밤새 인큐베이션하였다: (1) α1(I) 안티센스 올리고누클레오티드(1.3μM 또는 2.7μM); (2) AsOR-PL로 복합체화된 유사한 농도의 안티센스. 전체 세포 mRNA를 구아니디움 티오시아네이트 방법에 의해 추출하였다 [참조: Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)]. 추출된 RNA의 양 및 질을 A260/A280 흡광도 및 브롬화 에티듐으로 염색된 포름 알데하이드 겔에 의해 측정하였다.Confluent 10 cm dishes of 3T3-AsGR cells in DMEM and 10% FBS were incubated overnight with one of the following components or a combination of the following components: (1) α1 (I) antisense oligonucleotide (1.3 μM or 2.7 μM) ; (2) Antisense of similar concentration complexed with AsOR-PL. Whole cell mRNA was extracted by the guanidium thiocyanate method. Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987). The amount and quality of the extracted RNA was determined by A260 / A280 absorbance and formaldehyde gel stained with ethidium bromide.

전체 RNA 20㎍으로 출발하는 돗트 블롯 실험 재료를 20xSSC pH 7.0에 연속 2배 희석하였다. 샘플을 50% 포름아미드, 7% 포름알데하이드, 및 1xSSC pH 7.0중에서 열변성시켰다 [참조: Sambrook, J., et al. Molecular Cloning 7.54, 1989]. 샘플을 슬롯 블롯 장치를 사용하여 니트로 셀룰로오스 필터에 옮기고, 자외선 노출에 의하여 필터에 교차 결합시키고, 42℃에서 3시간 동안 예비혼성화시켰다. 무작위 프라이밍 방법 [참조: Sambrook, J., et al. Molecular Cloning 13.44 (1989)]을 사용하여32P로 표지된 cDNA 프로브는 둘 모두 EcoRl으로 선형화된 래트 pro α1(I) 및 β-악틴, 및 래트의 pro2(I)의 900bp 단편이었다. 니트로셀룰로오스 필터를 프로브(0.5-1.0x107cpm/필터)와 42℃에서 밤새 혼성화시키고, 세척하고, 필름에 노출시켰다. 정량은 필터의 신틸레이션 계수에 의해 수행하였다.Dot blot experimental material starting with 20 μg total RNA was serially diluted 2-fold in 20 × SSC pH 7.0. Samples were thermally denatured in 50% formamide, 7% formaldehyde, and 1 × SSC pH 7.0. Sambrook, J., et al. Molecular Cloning 7.54, 1989]. Samples were transferred to nitro cellulose filters using a slot blot apparatus, crosslinked to the filters by UV exposure, and prehybridized at 42 ° C. for 3 hours. Random priming method [Sambrook, J., et al. Molecular Cloning 13.44 (1989)], the cDNA probes labeled 32 P were both 900bp fragments of rat pro α1 (I) and β-actin linearized with EcoRl, and pro2 (I) in rats. The nitrocellulose filter was hybridized with the probe (0.5-1.0x107 cpm / filter) at 42 ° C. overnight, washed and exposed to the film. Quantification was performed by the scintillation coefficient of the filter.

[노던 블롯]Northern Blot

전체 RNA 샘플(60㎍)을 50% 포름아미드, 2x포름알데히드 조작 완충액, 7% 포름알데히드 중에서 55℃에서 15분간 열변성시켰다 [참조: Sambrook, J., et al. Molecalar Cloning 7.43 (1989)]. 샘플을 포름알데히드겔(1% 아가로오스, 2.2M 포름알데히드)상에서 4시간동안 100 밀리볼트로 얼음상에서 조작하였다. 분자량 및 대조 RNA를 0.1 암모늄 아세테이트 및 브롬화 에티듐 0.5㎍/㎖으로 염색시키고, 형광 룰러로 사진을 찍었다. 나머지 겔을 물로 수 회 세척하고, RNA를 0.5N NaOH로 20분간 가수분해시키고, 20xSSC에 45분간 담가두었다. RNA를 진공하에 1시간 동안 니트로셀룰로오스 필터로 옮겨서, 스트라타링커(Stratalinker)를 사용하여 자외 방사선에 노출시킴으로써 필터에 교차결합시켰다. 예비혼성화 및 혼성화에 대한 조건은 슬롯 블롯 실험에서와 동일하였다.Total RNA samples (60 μg) were heat denatured for 15 min at 55 ° C. in 50% formamide, 2 × formaldehyde engineering buffer, 7% formaldehyde. Sambrook, J., et al. Molecalar Cloning 7.43 (1989)]. Samples were manipulated on ice with 100 millivolts on formaldehyde gel (1% agarose, 2.2 M formaldehyde) for 4 hours. Molecular weight and control RNA were stained with 0.1 ammonium acetate and 0.5 μg / ml of ethidium bromide and photographed with fluorescent ruler. The remaining gel was washed several times with water, RNA was hydrolyzed with 0.5N NaOH for 20 minutes and soaked in 20 × SSC for 45 minutes. RNA was transferred to a nitrocellulose filter under vacuum for 1 hour and crosslinked to the filter by exposure to ultraviolet radiation using a Stratalinker. The conditions for prehybridization and hybridization were the same as in the slot blot experiment.

[결과][result]

[3T3-AsGR 세포의 특징화][Characterization of 3T3-AsGR Cells]

3T3-AsGR 세포는 정상적으로는 아시알로당단백질 수용체를 갖지 않기 때문에, 이들을 아시알로당단백질 수용체 유전자로 형질전환시키면, 1.5x10-9M의 kd, 1.8㎍/㎖에서 [125I]-AsOR과의 결합 포화도, 및 1.8pmole/106개 세포/시간의 [125I]-AsOR의 흡수율을 갖는 것으로 나타났다. 세포 당 아시알로 당단백질 수용체의 갯수는 250,000이었다.Since 3T3-AsGR cells normally do not have asialo glycoprotein receptors, when they are transformed with asialo glycoprotein receptor genes, they are combined with [ 125 I] -AsOR at 1.5 × 10 −9 M kd, 1.8 μg / ml. Binding saturation, and an uptake rate of [ 125 I] -AsOR of 1.8 pmole / 10 6 cells / hour. The number of asialo glycoprotein receptors per cell was 250,000.

3T3-AsGR 세포는 4시간째까지 DNA 18.2pmole/106개 세포/시간의 비율로 α1(I) 안티센스 DNA-AsOR-PL 복합체의 선형 흡수를 나타내었다. 대조적으로, 표지된 α1(I) 안티센스 DNA만의 흡수율은 DNA 0.15pmole/106개 세포/시간이었다. 중량이 300배 과다한 AsOR의 흡수는 α1(I) 안티센스 DNA 복합체의 흡수와 경합하였다.3T3-AsGR cells showed linear uptake of α1 (I) antisense DNA-AsOR-PL complex at a rate of 18.2 pmole / 10 6 cells / hour DNA by 4 hours. In contrast, the uptake rate of only labeled α1 (I) antisense DNA was 0.15 pmole / 10 6 cells / hour DNA. The uptake of AsOR, which is 300 times higher in weight, competes with the uptake of α1 (I) antisense DNA complex.

[콜라겐 합성에 대한 α1(I) 안티센스 DNA 복합체의 효과][Effect of α1 (I) Antisense DNA Complex on Collagen Synthesis]

α1(I) 안티센스 DNA 복합체는 3T3-AsGR 세포에 의한 콜라겐 생성을 억제하였다. 이 억제는 콜라겐 생성에 특이적이었고, 복합체 중의 α1(I) 안티센스 DNA의 농도에 좌우되었다. 이 결과를 하기 표에 나타내었다.α1 (I) antisense DNA complex inhibited collagen production by 3T3-AsGR cells. This inhibition was specific for collagen production and was dependent on the concentration of α1 (I) antisense DNA in the complex. The results are shown in the table below.

[프로콜라겐 I mRNA 수준에 대한 α1(I) 안티센스 DNA 복합체의 효과][Effect of α1 (I) Antisense DNA Complex on Procollagen I mRNA Levels]

α1(I) 안티센스 DNA 복합체는 α1(I) 사슬의 mRNA를 특이적으로 억제하였다. 그러나, 안티센스 DNA 복합체의 고농도(2.7μM)에서는 α1(I)과 α2(I) 사슬 둘 모두의 mRNA가 억제되었다. 하기 표는 여러 가지 돗트 블록 분석의 정량 결과이다.The α1 (I) antisense DNA complex specifically inhibited the mRNA of the α1 (I) chain. However, at high concentrations (2.7 μM) of antisense DNA complexes, mRNAs of both α1 (I) and α2 (I) chains were inhibited. The table below shows the quantitative results of several dot block analyses.

[균등물][Equivalent]

당업자라면 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 특정 과정에 대한 많은 균등물이 있음을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주하며, 하기 특허청구의 범위에 포함된다.Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain that there are many equivalents to the specific procedures described herein using only routine experimentation. Such equivalents are considered to be within the scope of the present invention and are included in the scope of the following claims.

[서열 목록][Sequence list]

(1) 일반정보 :(1) General Information:

(i) 출원인 : 죠지 와이. 우 캐서린 에이치. 우(i) Applicant: George Y. Wu Catherine H. Ooh

(ii) 발명의 명칭 : 폴리- 또는 올리고누클레오티드의 세포로의 표적화된 전달(ii) Name of the Invention: Targeted Delivery of Poly- or Oligonucleotides to Cells

(iii) 서열의 수 : 2(iii) number of sequences: 2

(iv) 통신주소 :(iv) Communication address:

(A) 수신인 : 라히브 앤드 콕필드(A) To: Lahib & Cockfield

(B) 거리 : 스테이트 스트리트 60(B) Street: State Street 60

(C) 시 : 보스턴(C) City: Boston

(D) 주 : 매사추세츠(D) State: Massachusetts

(E) 나라 : 미합중국(E) Country: United States of America

(F) 우편번호 : 02109(F) ZIP Code: 02109

(v) 컴퓨터 판독 형태 :(v) computer readable form:

(A) 매질 타입 : 플로피 디스크(A) Medium type: floppy disk

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성(B) Computer: IBM PC Compatibility

(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS(C) operating system: PC-DOS / MS-DOS

(D) 소프트웨어 : ASCII(D) Software: ASCII

(vi) 현재 출원 데이타(vi) Current application data

(A) 출원번호 :(A) Application number:

(B) 출원일 :(B) filing date:

(C) 분류 :(C) classification:

(vii) 선출원 데이타(vii) elected data

(A) 출원번호 : US 07/864,003(A) Application number: US 07 / 864,003

(B) 출원일 : 03-APR-1992(B) Filed Date: 03-APR-1992

(C) 출원번호 : US 07/788,119(C) Application number: US 07 / 788,119

(D) 출원일 : 04-NOV-1991(D) Filed Date: 04-NOV-1991

(E) 출원번호 : US 07/755,083(E) Application Number: US 07 / 755,083

(F) 출원일 : 05-SEP-1991(F) Filed Date: 05-SEP-1991

(2) SEQ ID NO:1에 대한 정보 :(2) Information about SEQ ID NO: 1:

(i) 서열특성 :(i) Sequence characteristics:

(A) 길이 : 21 누클레오티드(A) Length: 21 nucleotides

(B) 타입 : 핵산(B) type: nucleic acid

(C) 가닥 : 단일(C) strands: single

(D) 위상 : 선형(D) phase: linear

(ii) 분자타입 : DNA(ii) Molecular type: DNA

(iv) 안티센스 : 있음(iv) Antisense: Yes

(ix) 특징 : B형 간염 바이러스의 폴리아데닐화 부위에 상보함(ix) Features: complementary to polyadenylation site of hepatitis B virus

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:1:(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1:

TTATAAGGG TCGATGTCCA T 21TTATAAGGG TCGATGTCCA T 21

2) SEQ ID NO 2:에 대한 정보 :2) Information about SEQ ID NO 2:

(i) 서열특성 :(i) Sequence characteristics:

(A) 길이 : 24 누클레오티드(A) Length: 24 nucleotides

(B) 타입 : 핵산(B) type: nucleic acid

(C) 가닥 : 단일(C) strands: single

(D) 위상 : 선형(D) phase: linear

(ii) 분자타입 : DNA(ii) Molecular type: DNA

(iv) 안티센스 : 있음(iv) Antisense: Yes

(ix) 특징 : α1(I) 번역 출발부위에서 시작하고 첫번째 인트론 부분을 포함하는 프로 α1 프로콜라겐의 처음 24 누클레오티드에 상보함.(ix) Features: complementary to the first 24 nucleotides of pro α1 procollagen starting at the α1 (I) translational start and comprising the first intron portion.

(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:2:(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2:

CCGGAGGTCC ACAAAGCTGA ACAT 24CCGGAGGTCC ACAAAGCTGA ACAT 24

Claims (7)

HBV RNA 폴리아데닐화 부위에 상보적인 단일 가닥 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드를 포함하는 가용성 분자 복합체로서, 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드가 아시알로당단백질 수용체와 다가양이온으로 구성된 담체와 비공유적으로 복합체화된 가용성 분자 복합체.Soluble molecular complex comprising a single stranded polynucleotide or oligonucleotide complementary to an HBV RNA polyadenylation site, wherein the polynucleotide or oligonucleotide is a non-covalently complexed complex with a carrier consisting of an asialo glycoprotein receptor and a polycation Complex. 제1항에 있어서, 다가양이온이 폴리라이신임을 특징으로 하는 가용성 분자 복합체.The soluble molecular complex of claim 1, wherein the polycation is polylysine. 감염된 간세포에서 HBV의 복제를 억제시키기 위한 약제 조성물로서, 제19항의 분자 복합체의 용액과 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제 조성물.A pharmaceutical composition for inhibiting replication of HBV in infected hepatocytes, the pharmaceutical composition comprising a solution of the molecular complex of claim 19 and a physiologically acceptable vehicle. 제3항에 있어서, 다가양이온이 폴리라이신임을 특징으로 하는 약제 조성물.4. A pharmaceutical composition according to claim 3 wherein the polycation is polylysine. 제3항에 있어서, 정맥내 투여됨을 특징으로 하는 약제 조성물.4. A pharmaceutical composition according to claim 3, which is administered intravenously. 제1항에 있어서, 아시알로당단백질 수용체에 대한 리간드가, 간세포에 의한 복합체의 엔도사이토시스를 매개하는 간세포의 아시알로당단백질 수용체와 결합함을 특징으로 하는 가용성 분자 복합체.The soluble molecular complex according to claim 1, wherein the ligand for the asialo glycoprotein receptor binds to the asialo glycoprotein receptor of the hepatocytes that mediates the endocytosis of the complex by the hepatocytes. 제1항에 있어서, 리간드가 아시알로당단백질임을 특징으로 하는 가용성 분자 복합체.The soluble molecular complex of claim 1, wherein the ligand is an asialoglycoprotein.
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