KR100249915B1 - Kinesin sensitive to chemotherapeutic drugs - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포에 1종 이상의 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 유전 억제요소, 그러한 요소를 확인하고 얻는 방법 및 그러한 요소를 사용하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 특히 DNA 손상제에 대한 내성에 관여하는 클로닝된 사람 키네신 중쇄 유전자 같이, 화학치료제에 대한 감응성과 연관된 클로닝된 유전자를 제공한다.The present invention provides genetic inhibitory elements that confer resistance to one or more chemotherapeutic agents, methods for identifying and obtaining such elements, and methods of using such elements. The invention also provides cloned genes associated with sensitivity to chemotherapeutic agents, in particular cloned human kinesin heavy chain genes involved in resistance to DNA damaging agents.

Description

화학치료제에 대한 감응성을 갖는 키네신Kinesin Responsive to Chemotherapy

[도면의 간단한 설명][Brief Description of Drawings]

제1a도 및 제1b도는 NIH 3T3 cDAN로부터의 불규칙 단편 발현 라이브러리(RFEL)의 구성에 대한 개략도이다. 제1a도는 전체 구조의 개략도이다. 제1b도는 cDNA 단편의 표준화를 도시한 도면이다. 제1b도에서, t는 전체 비분획화 cDNA를 나타내고, s 및 d는 수산화 인회석에 의해 분리된 단일 가닥 및 이중 가닥 단편을 나타내고, 시간점은 재어니일링의 주기를 나타내며, 튜불린, c-myc 및 c-fos는 전체 단일 가닥 및 이중 가닥 분획을 사용한 서던 혼성화에 사용되는 프로브를 나타낸다.1A and 1B are schematic diagrams of the construction of an irregular fragment expression library (RFEL) from NIH 3T3 cDAN. 1A is a schematic diagram of the entire structure. FIG. 1B is a diagram illustrating standardization of cDNA fragments. In FIG. 1b, t represents total unfractionated cDNA, s and d represent single-stranded and double-stranded fragments separated by hydroxyapatite, time points represent the period of jaaniring, tubulin, c- myc and c-fos represent probes used for Southern hybridization using whole single stranded and double stranded fractions.

제2도는 cDNA 클로닝에 사용되는 LNCX 벡터 및 어댑터의 구조를 도시한 도면이다. 어댑터의 ATG-센스(SEQ. ID. No.:1) 및 ATG-앤티센스(SEQ.ID.No.:2) 가닥에 대한 누클레오티드 서열이 도시되어 있다.2 shows the structure of LNCX vectors and adapters used for cDNA cloning. The nucleotide sequences for the ATG-sense (SEQ. ID. No .: 1) and ATG-antisense (SEQ. ID. No .: 2) strands of the adapter are shown.

제3도는 화학치료제내성 부여 GSE를 함유하는 세포주를 선택하고, 이들 세포로부터 GSE를 구조하기 위한 전체 개략도이다.3 is an overall schematic diagram for selecting cell lines containing chemotherapeutic imparting GSEs and rescue GSEs from these cells.

제4a 및 제4b도는 사전 선택된 바이러스에 의해 제공되는 에토포시드 내성(제4a도) 및 선택 및 비선택 개체군의 PCR 분석(제4b도)을 보여주는 도면이다. 제4C도는 원래의 플라스미드와 같은 위치 및 배향으로 개별적 PCR-증폭 단편을 LNCX 벡터로 재클로닝하는 개략적 도르를 도시한 도면이다.4A and 4B show etoposide resistance (FIG. 4A) provided by preselected viruses and PCR analysis (FIG. 4B) of selected and unselected populations. 4C shows a schematic diagram of recloning individual PCR-amplified fragments into LNCX vectors in the same position and orientation as the original plasmid.

제5a도 및 제5b도는 IPTG-유도성 프로머터하에서 GSE 항-khcs에 의해 세포에 제공되는 다양한 농도의 에토포시드의 내성을 보여주는 도면(제5a도), 및 이러한 실험에 대한 개략도(제5b도)이다.Figures 5a and 5b show the resistance of various concentrations of etoposide provided to cells by GSE anti-khcs under IPTG-induced promoters (Figure 5a), and a schematic diagram for this experiment (Figure 5b) Degrees).

제6도는 GSE 항-khcs의 누클레오티드 서열(SEQ.ID.No.:3)을 도시한 도면이다.FIG. 6 shows the nucleotide sequence of GSE anti-khcs (SEQ.ID.No.:3).

제7도는 마우스 khcs cDNA의 코드화 영역의 대부분의 누클레오티드 서열(SEQ.ID.No.:4)을 도시한 도면이다.FIG. 7 depicts most of the nucleotide sequence (SEQ.ID.No.:4) of the coding region of mouse khcs cDNA.

제8a 내지 제8d도는 제7도의 누클레오티드 서열로부터 유도된 khcs 단백질 서열과 사람(제8a도), 마우스(제8도b) 과물파리(제8c도) 및 GSE-C(제8d도)로부터 키네신 중쇄 서열의 도트 매트릭스 정렬을 도시한 도면이다.8a to 8d show the khcs protein sequence derived from the nucleotide sequence of FIG. 7 and kinesin from human (FIG. 8a), mouse (FIG. 8b) fruit flies (FIG. 8c) and GSE-C (FIG. 8d) The dot matrix alignment of the heavy chain sequences is shown.

제9a도 및 제9b도는 키네신-유도 GSE의 약제선택 생성에 대한 실험 프로토콜(제9a도), 및 불규칙 단편 KHCS cDNA 라이브러리의 제조에 사용되는 어댑터의 구조(제9b도)를 도시한 도면이다.Figures 9a and 9b show the experimental protocol for the production of drug selection of kinesin-induced GSE (Figure 9a), and the structure of the adapter (Figure 9b) used in the preparation of the irregular fragment KHCS cDNA library.

제10도는 사람 KHCS cDNA의 불규칙 단편 라이브러리 또는 인서트-부재 벡터 바이러스를 운반하는 HT1080 세포에서의 에토포시드 내성을 보여주는 도면이다.10 shows etoposide resistance in HT1080 cells carrying an irregular fragment library of human KHCS cDNA or insert-free vector virus.

제11도는 인서트-부재 벡터 바이러스 또는 항-khcs를 코드화하는 바이러스로 감염된 NIH 3T3 세포의 4일 성장시의 상이한 약제의 효과를 보여주는 도면이다. 약제의 부재하의 세포 성장은 비교되는 개체군에 대해 5%미만의 차이가 있다. 약제농도 단위는 ng/ml이다. 삼중으로 수행되는 대표적인 일련의 평행 검정이 도시되어 있다.FIG. 11 shows the effect of different agents on 4-day growth of NIH 3T3 cells infected with insert-free vector virus or virus encoding anti-khcs. Cell growth in the absence of agent differs by less than 5% for the populations compared. The drug concentration unit is ng / ml. A representative series of parallel assays is shown performed in triplicate.

제12도는 콜히친 또는 빈블라스틴에 의한 처리 후에 항-khcs(실선) 및 대조 세포(파선)를 운반하는 세포의 성장을 보여주는 도면이다. 세포들은 제시된 바와 같이, 4일동안 약제로 인큐베이팅된 후에 2 또는 4일 동안 약제비함유 배지 중에서 인큐베이팅된다. 임의의 단위에 제공되는 세포 성장은 메틸렌 블루 착색에 의해 평가된다.12 shows the growth of cells carrying anti-khcs (solid line) and control cells (dashed line) after treatment with colchicine or vinblastine. Cells are incubated for 4 days with drug, as shown, and then incubated in drug free medium for 2 or 4 days. Cell growth provided in any unit is assessed by methylene blue staining.

제13도는 상이한 약제로 인큐베이팅된 항-khcs GSE-운반 세포(블랙라인) 및 대조 세포(회색 라인)의 세포 성장의 속도론적 분석을 보여주는 도면이다. 세포 성장은 제13도에 기재된 바와 같이 측정된다. 세포는 평판배양되고, 하루후(첫번째 화살표로 표시됨), 지시된 약제가 기재된 바와 같은 농도로 첨가된다. 4일후(두번째 화살표로 표시됨), 평판의 일부로부터 제거된다. 실선은 약제의 연속 제공하의 세포 성장을 나타내고, 파선은 약제의 제거후의 세포 성장을 나타낸다.FIG. 13 shows a kinetic analysis of cell growth of anti-khcs GSE-carrying cells (black lines) and control cells (grey lines) incubated with different agents. Cell growth is measured as described in FIG. Cells are plated and after one day (indicated by the first arrow), the indicated agent is added at the concentration as described. After 4 days (indicated by the second arrow), it is removed from part of the plate. Solid lines indicate cell growth under continuous presentation of the agent and dashed lines indicate cell growth after removal of the agent.

제14도는 LNCX 벡터만으로 감염된 세포 또는 비감염(대조) 세포와 비교하여, 항-khcs GSE를 함유하는 LNCX 벡터에 의한 감염에 의한 일차 마우스 배 섬유아세포의 불멸화의 증가를 보여주는 도면이다.14 shows an increase in immortalization of primary mouse embryonic fibroblasts by infection with LNCX vectors containing anti-khcs GSE compared to cells infected with LNCX vectors alone or uninfected (control) cells.

제15도는 성장 위기(대조)에 있는 사람 피부 섬유아세포와 비교하여, 감염후 4번째 통과시에 항-khcs GSE(항-khcs)를 함유하는 LNCX 벡터에 의한 감염에 의해 일차 사람 피부 섬유아세포의 불멸화의 증가를 보여주는 도면이다.FIG. 15 shows primary human dermal fibroblasts by infection with LNCX vectors containing anti-khcs GSE (anti-khcs) at the fourth pass after infection, compared to human dermal fibroblasts in growth crisis (control). The figure shows the increase of immortalization.

제16도는 다양한 비선택 사람 힐러 세포 및 에토포시드-선택 사람 힐러 세포에서 사람 khcs 유전자 발현의 cDNA-PCR 정량 분석을 보여주는 도면이다. 레인 a는 클론 CS(O)에 대한 결과를 나타내고, 레인 a'는 클론 CX(200)에 대한 결과를 나타내고, 레인 b는 클론 ∑/11(0)에 대한 결과를 나타내고, 레인 b'는 클론 Σ/11(1000)에 대한 결과를 나타내고, 레인 c는 클론 6(O)에 대한 결과를 나타내고, 레인 c'는 클론 6(1000)에 대한 결과를 나타내고, 레인 d는 클론 Σ20(O)에 대한 결과를 나타내고, 레인 d'는 클론 Σ20(1000)에 대한 결과를 나타낸다. 각각의 클론명에 대한 괄호안의 수는 성장 배지에 존재하는 에토포시드의 농도(ng/ml)를 나타낸다. khcs 발현을 나타내는 밴드는 내부 대조군으로서 β-2 매크로글로불린 발현에 대한 밴드와 함께 도시된다.FIG. 16 shows cDNA-PCR quantitative analysis of human khcs gene expression in various non-selective human healer cells and etoposide-selected human healer cells. Lane a represents the result for clone CS (O), lane a 'represents the result for clone CX (200), lane b represents the result for clone ∑ / 11 (0), and lane b' is the clone Results for Σ / 11 (1000), lane c shows results for clone 6 (O), lanes c 'shows results for clone 6 (1000), lanes d for clone Σ20 (O) Lane d 'shows the results for clone Σ20 (1000). The number in parentheses for each clone name indicates the concentration of etoposide present in the growth medium (ng / ml). Bands representing khcs expression are shown with bands for β-2 macroglobulin expression as internal controls.

[발명의 상세한 설명]Detailed description of the invention

[발명의 분야][Field of Invention]

본 발명은 화학치료제에 대한 감응성과 관련된 유전 인자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 이러한 인자를 확인하는 방법, 및 이러한 인자의 사용방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 포유동뮬 키네신(kinesin) 유전자로부터 유도된 유전 억제요소, 및 이와 관련된 치료 및 진단적 사용방법을 제공한다.The present invention relates to genetic factors associated with sensitivity to chemotherapeutic agents. More specifically, the present invention relates to methods of identifying such factors and methods of using such factors. In particular, the present invention provides a genetic inhibitory element derived from a mammalian murine kinesin gene and related methods of therapeutic and diagnostic use.

[관련 기술의 요약][Summary of Related Technologies]

매우 다양한 화학치료제가 사람의 암 치료에 사용되고 있다. 예를들어, 교본[CANCER : Principles ＆ Practice of Oncololgy, 2d Edition, (De Vita et al., eds.), J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA (1985)]에는, 주요 항종양제로서 식물 알칼로이드 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 빈데신 ; 항생제로서 악티노마이신-D, 독소루비신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신 C 및 블레오마이신 ; 항대사물질로서 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 5-플루오로데옥시우리딘, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시토신 아라비노시드, 5-아자-시티딘 및 히드록시우레아 ; 알킬화제로서 시클로포스파미드, 멜팔란, 부술판, CCNU, MeCCNU, BCNU, 스트렙토조토신, 클로람부실, 비스-디아민디클로로-백금, 아제티디닐벤조퀴논 ; 및 그밖의 제제로서 다카르바진, mAMSA 및 미톡산트론이 개시되어 있다.A wide variety of chemotherapeutic agents are used to treat cancer in humans. For example, the textbook CANCER: Principles & Practice of Oncololgy, 2d Edition, (De Vita et al., Eds.), JB Lippincott Company, Philadelphia, PA (1985), describes plant alkaloid vincristine as a major antitumor agent. , Vinblastine and vindesine; Actinomycin-D, Doxorubicin, Daunorubicin, Mithramycin, Mitomycin C and Bleomycin as antibiotics; As an antimetabolite, methotrexate, 5-fluorouracil, 5-fluorodeoxyuridine, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytosine arabinoside, 5-aza-cytidine and hydroxyurea; Cycloalkyl amides such as cyclophosphamide, melphalan, busulfan, CCNU, MeCCNU, BCNU, streptozotocin, chlorambucil, bis-diaminedichloro-platinum, azetidinylbenzoquinone; And other agents are disclosed dacarbazine, mAMSA and mitoxantrone.

에토포시드 및 암사크린 같은 상기 제반 화학치료제는 암의 치료에 매우 유용한 것으로 입증되었다. 불행히도, 일부 종양 세포는 특정한 화학치료제에 대해 내성을 갖게 되고, 일부 경우에는 다중 화학치료제에 대해서도 내성을 갖게 된다. 이러한 약제내성 또는 다중 약제내성은 이론적으로, 약제에 내성을 부여하는 유전 인자의 존재로부터 또는 약제에 감응성을 부여하는 유전 인자의 부재로부터 발생할 수 있다. 인자의 전-유형이 확인되어졌고, 그 유형은 다중 약제내성 유전자인 mdr-1을 포함한다 (참조 : Chen et al., 1986, Cell 47:381-389). 그러나, 인자의 후-유형은 대부분, 아마 부분적으로 비공지된 상태인데, 그것은 그러한 인자의 부재가 열성 형질로 되는 경향이 있기 때문이다.Such various chemotherapeutic agents such as etoposide and amsacrine have proven to be very useful in the treatment of cancer. Unfortunately, some tumor cells become resistant to certain chemotherapeutic agents and, in some cases, to multiple chemotherapeutic agents. Such drug resistance or multiple drug resistance may theoretically arise from the presence of a genetic factor that confers resistance to the drug or from the absence of a genetic factor that confers sensitivity to the drug. A full-type of factor has been identified and the type includes the multidrug resistance gene mdr-1 (Chen et al., 1986, Cell 47: 381-389). However, the post-type of factors is mostly, perhaps partly unknown, because the absence of such factors tends to be recessive traits.

화학치료제에 대한 감응성과 관련된 유전자를 확인하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이러한 유전자의 발견이 유전자 치료 및 적절한 약제디자인 뿐만 아니라, 암 세포와 약물 내성 암세포에 대한 진단적 및 치료학적 접근법 둘 모두를 유도할 수 있기 때문이다. 최근에, 세포독성 약제감응성에 관여하는 것을 포함하는 열성 유전 요소를 단리시키는 난해한 분야에서 일부 발달이 이루어졌다. 로닌슨(Roninson) 등의 미국 특허 제5,217,889호(1993년 6월 8일에 허여됨)에는, 특정 GSE에 상응하는 유전자에 대한 열성형 표현형을 부여하는 우세한 네거티브 인자인 유전 억제요소(GSE)를 얻기 위한 일반화된 방법이 교시되어 있다 [참조예 : 홀쯔마이어(Holzmayer) 등의 문헌(1992, Nucleic Acids Res. 20:711-717)]. 구드코브(Gudkov) 등의 문헌 [1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3231-3235]에는 토포아이소머라제II-상호작용 약제에 대한 내성을 유도하는 토포아이소머라제II cDNA로부터의 GSE의 단리가 교시되어 있다. 1993년 3월 3일에 출원된 공동계류중인 미국 특허 출원 제08/033,986호에는, 본 발명자들에 의해 항암 DNA 손상제인 에토포시드에 대해 내성이 있는 세포의 RNA로부터 단리되는 GSE를 확인하도록 수행되는 실험의 신규한 예상외의 결과가 발견되었음이 기술되어 있다.It is desirable to identify genes associated with sensitivity to chemotherapeutic agents because the discovery of these genes leads to both gene therapy and appropriate drug design, as well as diagnostic and therapeutic approaches for cancer cells and drug resistant cancer cells. Because you can. Recently, some developments have been made in the difficult field of isolating recessive genetic elements, including those involved in cytotoxic drug sensitivity. US Pat. No. 5,217,889 to Roninson et al., Issued June 8, 1993, describes a genetic inhibitory factor (GSE), a predominant negative factor that confers a thermoforming phenotype for genes corresponding to a particular GSE. Generalized methods for obtaining are taught (see, eg, Holzmayer et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 711-717). Gudkov et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3231-3235 teaches the isolation of GSE from topoisomerase II cDNA which induces resistance to topoisomerase II-interacting agents. Co-pending US patent application Ser. No. 08 / 033,986, filed March 3, 1993, was conducted by the inventors to identify GSE isolated from RNA of cells resistant to etoposide, an anticancer DNA damaging agent. It is described that a new unexpected result of the experiment was found.

상기 참고문헌은 마우스 키네신 중쇄 유전자의 일부분에 상동인 앤티센스 RNA를 코드화하는 GSE가 GSE를 발현시키는 세포에 에토포시드 내성을 부여하는 능력을 갖는다는 것을 기술하고 있다. 상기 참고문헌에 기술된 실험은 또한, 이 문헌에 기술된 특정 키네신 중쇄 유전자의 과소 발현이 약제선택 사람 아데노카르시노마 세포의 배양물에서의 천연 에토포시드 내성과 관련됨을 설명하고 있다. 이러한 결과는 특히 예상외의 결과이며, 그 이유는 에토포시드 내성에서의 키네신 유전자의 역할이 본 발명자들의 발견 이전에는 당분야에 공지되어 있지 않았기 때문이다.This reference describes that GSE encoding antisense RNA homologous to a portion of the mouse kinesin heavy chain gene has the ability to confer etoposide resistance to cells expressing GSE. The experiments described in this reference also illustrate that underexpression of certain kinesin heavy chain genes described in this document is associated with natural etoposide resistance in culture of drug-selected human adenocarcinoma cells. These results are particularly unexpected, since the role of the kinesin gene in etoposide resistance was not known in the art prior to our discovery.

키네신은 진핵 세포 미세관을 따르는 소포 또는 매크로 분자의 세포내 운동에 관여하는 한 부류의 운동성 단백질을 포함한다 [참조예 : Vale, 1987, Ann. Rev. Cell Biol. 3:347-378 ; and Endow, 1991, Trends Biochem. Sci. 16: 221-225]. 키네신 유전자의 부류 중에는, 성숙 키네신을 생성시키도록 어셈블링되는 코드화된 키네신 경쇄 및 키네신 중쇄가 있다. 다수의 키네신 유전자가 종래에 단리되었다.Kinesin comprises a class of motility proteins involved in the intracellular movement of vesicles or macromolecules along eukaryotic microtubules. See, eg, Vale, 1987, Ann. Rev. Cell Biol. 3: 347-378; and Endow, 1991, Trends Biochem. Sci. 16: 221-225. Among the classes of kinesin genes are coded kinesin light chains and kinesin heavy chains that are assembled to produce mature kinesin. Many kinesin genes have been isolated conventionally.

게이저(Gauger) 및 골드스타인(Goldstein)의 문헌[1993, J. Biol. Chem. 268:13657-13666]에는 초파리 키네신 경쇄 유전자의 클로닝 및 서열화가 기술되어 있다.Gauger and Goldstein, 1993, J. Biol. Chem. 268: 13657-13666 describe the cloning and sequencing of the Drosophila kinesin light chain gene.

네이본(Navone) 등의 문헌[1992, J. Cell. Biol. 117:1263-1275]에는 사람 키네신 중쇄 유전자의 클로닝 및 서열화가 기술되어 있다.Navone et al., 1992, J. Cell. Biol. 117: 1263-1275 describes the cloning and sequencing of human kinesin heavy chain genes.

가토(Kato)의 문헌[1991, J. Neurosci. 2:704-711]에는 마우스 키네신 중쇄 유전자의 클로닝 및 서열화가 기술되어 있다.Kato, et al., 1991, J. Neurosci. 2: 704-711 describes cloning and sequencing of mouse kinesin heavy chain genes.

시르(Cyr) 등의 문헌[1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10114-10118]에는 랫트 키네신 경쇄 유전자의 클로닝 및 서열화가 기술되어 있다.Cyr et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10114-10118 describes cloning and sequencing of rat kinesin light chain genes.

맥도널드(McDonald) 및 골드스타인의 문헌[1990, Cell 61:991-1000]에는 초파리 키네신 중쇄 유전자의 단리가 기술되어 있다.McDonald and Goldstein [1990, Cell 61: 991-1000] describe the isolation of the Drosophila kinesin heavy chain gene.

코직(Kosik) 등의 문헌[1990, J. Biol. Chem. 265:3278-3283]에는 오징어 키네신 중쇄 유전자의 단리가 기술되어 있다.Kosik et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 3278-3283 describes the isolation of the squid kinesin heavy chain gene.

본 발명자들은 지금까지 예상치 못했던 유전자인 키네신 중쇄 유전자가 항암제에토포시드에 대한 세포 감응성에 관여하고, 이러한 키네신 중쇄 유전자의 기능적 발현의 하향 조절이 이러한 약제에 대한 내성과 관련됨을 설명하였다. 본원에 기재된 추가 실험은 화학치료제내성에 있어서의 키네신 유전자의 역할이 키네신 유전자 부류의 단일 구성원으로 제한되지 않을 수 있음을 제시하였다. 이들 결과는 본 발명자들에 의해 개발된 GSE 기술의 힘을 더 강조하여, 암 세포에서의 약제내성의 예상외의 기작을 설명함으로써, 암 환자 체내의 약제내성을 극복하기 위한 기회 및 수단을 제공한다. 그러한 목적으로 유도된 시약 및 방법이 본원에 제공된다.The present inventors have demonstrated that the kinesin heavy chain gene, a gene that has not been predicted so far, is involved in cellular sensitivity to anticancer etoposide, and that down regulation of functional expression of this kinesin heavy chain gene is associated with resistance to such agents. Further experiments described herein suggested that the role of the kinesin gene in chemotherapeutic resistance may not be limited to a single member of the kinesin gene family. These results further emphasize the power of the GSE technology developed by the present inventors, explaining the unexpected mechanism of drug resistance in cancer cells, thereby providing an opportunity and means for overcoming drug resistance in cancer patients. Provided herein are reagents and methods derived for that purpose.

[발명의 간단한 요약][Simple Summary of Invention]

본 발명은 화학치료제에 대한 감응성과 관련된 유전자로부터 유도된 불규칙 단편이고, 유전 억제요소(GSE)를 발현시키는 세포에 화학치료제및 DNA 손상제에 대한 내성을 부여하는 유전 억제요소를 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 키네신 유전자를 코드화하는 cDNA 및 게놈 DNA로부터 유도되는 GSE를 제공한다. 화학치료제및 다른 DNA 손상제를 포함하는 특정한 항암 치료제종류의 투여에 의해 성공적으로 감소 또는 제거되기 쉬운 종양을 함유하는 적합한 후보 암 환자를 결정하는데에 유용한 진단적 검정이 이러한 암 환자에 의해 생성된 종양 세포 내에서의 키네신 유전자 발현의 수준을 기초로 본 발명에 의해 제공된다. 생체외 약제스크리닝 방법 및 적절한 약제디자인 방법이 또한 본원의 범위에 포함된다.The present invention provides a genetic inhibitor that is an irregular fragment derived from a gene associated with sensitivity to a chemotherapeutic agent and confers resistance to chemotherapeutic agents and DNA damaging agents in cells expressing a genetic inhibitory element (GSE). In particular, the present invention provides GSE derived from cDNA and genomic DNA encoding the kinesin gene. Diagnostic assays useful for determining suitable candidate cancer patients containing tumors that are likely to be successfully reduced or eliminated by administration of certain types of anti-cancer therapeutic agents, including chemotherapeutic agents and other DNA damaging agents, have been produced by these cancer patients. Provided by the present invention based on the level of kinesin gene expression in cells. In vitro drug screening methods and suitable drug design methods are also included within the scope of this application.

본 발명은 1993년 3월 3일에 출원되고 본원에 참고문헌으로 인용된 공동계류중인 미국 특허 출원 제08/033,086호에 기재된 발견에 부분적으로 기초하여, 저항가능한 모든 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 GSE를 확인하고 단리시키는 방법을 제공한다. 특히, 본원에는 모든 키네신 유전자로부터 유도되는 GSE를 확인하는 방법이 제공되어 있으며, 상기 GSE는 GSE를 발현시키는 세포에 DNA 손상제에 대한 내성을 부여할 수 있다. 상기 방법은 키네신 특이적 cDNA로부터 유도된 불규칙 단편 발현 라이브러리로부터의 클론이 잠복된 세포의 화학치료제선택 및 약제내성 세포로부터의 라이브러리 삽입체의 후속적 구조를 이용한다. 제2 측면에서, 본 발명은 생체내에서 GSE로서 작용하고 상기 GSE를 발현시키는 세포에 특정 화학치료제를 포함하는 DNA 손상제에 대한 내성을 부여하는 키네신 유전자로부터 유도된 펩티드를 포함하는 GSE를 제공한다. 제3 측면에서, 본 발명은 화학치료제에 대한 감응성과 관련된 키네신 유전자에 대한 최적화된 억제물질 활성을 갖는 GSE를 수득하는 방법을 제공한다. 이 방법은 화학치료제에 대한 감응성과 관련된 키네신 유전자의 DNA로부터 유도되는 불규칙 단편 발현 라이브러리로부터의 클론이 잠복된 세포의 화학치료제선택, 및 약제내성 세포로부터의 라이브러리 삽입물의 후속적 구조를 이용한다. 특히 바람직하게는, 마우스 또는 사람 키네신 유전자로부터 유도되는 이러한 최적화된 GSE가 제공된다. 제4 측면에서, 본 발명은 세포에 특정 화학치료제를 포함하는 DNA 손상제에 대한 내성을 부여하는 합성 펩티드 및 올리고누클레오티드를 제공한다. 이들 합성 펩티드 및 올리고누클레오티드는 본 발명에 따르는 마우스 또는 사람 키네신 유전자로부터 유도되는 약제내성 부여 GSE의 서열을 기초로 설계된다.The present invention is based in part on the findings disclosed in co-pending US patent application Ser. No. 08 / 033,086, filed March 3, 1993 and incorporated herein by reference, to provide resistance to all resistable chemotherapeutic agents. It provides a way to identify and isolate a GSE. In particular, provided herein are methods for identifying GSE derived from all kinesin genes, which can confer resistance to DNA damaging agents in cells expressing GSE. The method utilizes chemotherapeutic selection of cloned cells from random fragment expression libraries derived from kinesin specific cDNA and subsequent structure of library inserts from drug resistant cells. In a second aspect, the present invention provides a GSE comprising a peptide derived from the kinesin gene that acts as a GSE in vivo and confers resistance to DNA damaging agents, including certain chemotherapeutic agents, to cells expressing the GSE. . In a third aspect, the present invention provides a method for obtaining GSE with optimized inhibitor activity against kinesin genes associated with sensitivity to chemotherapeutic agents. This method utilizes chemotherapeutic selection of cells with clones harboring clones from irregular fragment expression libraries derived from the DNA of the kinesin gene associated with sensitivity to chemotherapeutic agents, and subsequent structure of the library insert from drug resistant cells. Particularly preferably, such optimized GSEs derived from mouse or human kinesin genes are provided. In a fourth aspect, the present invention provides synthetic peptides and oligonucleotides that confer resistance to DNA damaging agents, including certain chemotherapeutic agents. These synthetic peptides and oligonucleotides are designed based on the sequence of drug-resistant imparting GSE derived from the mouse or human kinesin gene according to the present invention.

제5 측면에서, 본 발명은 키네신 유전자의 발현의 부재 또는 과소 발현으로 인해, 1종 이상의 치료적 DNA 손장제에 내성이고, 동시에 치료학적 항-미세관 제제에 대해 감응성이 있는 종양 세포에 대한 진단적 검정을 제공한다. 이러한 진단적 검정은 시험하려는 특정 종양 세포 샘플에서의 모든 특정 키네신 유전자 생성물의 발현 수준을 정량화시키는 단계, 및 키네신 유전자 mRNA 및/또는 단백질의 가변적 양을 발현시키고, 이들의 키네신 유전자 발현 수준과 관련된 화학치료제및 DNA 손상제에 대한 상이한 정도의 저항성을 갖는 세포주의 표준화된 세트로 얻어지는 발현 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 세포주의 표준화된 세트는 조직 유형에 의해, 평가하려는 종양 세포의 조직 유형과 매치된다.In a fifth aspect, the present invention provides for the diagnosis of tumor cells that are resistant to one or more therapeutic DNA handicaps and simultaneously sensitive to therapeutic anti-microtubule agents due to the absence or underexpression of the expression of the kinesin gene. Provide red test. Such diagnostic assays include quantifying the expression level of all specific kinesin gene products in a particular tumor cell sample to be tested, and expressing variable amounts of kinesin gene mRNA and / or protein, and the chemistry associated with their kinesin gene expression levels. Comparing the expression levels resulting from a standardized set of cell lines with different degrees of resistance to the therapeutic and DNA damaging agents. In a preferred embodiment, the standardized set of such cell lines is matched by the tissue type to the tissue type of the tumor cells to be evaluated.

제6 측면에서, 본 발명은 특정 암 화학치료학적 처리 양식을 위한 후보의 적합성을 결정하는 방법을 제공한다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 본 발명은 암 환자가 DNA 손상 화학치료제또는 방사선과 같은 다른 DNA 손상제에 의한 치료를 위한 적합한 후보체인지를 결정하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본원 및 공동계류중인 미국 특허출원 제08/033,086호에 기재된 키네신 중쇄 유전자와 같은 키네신 유전자가 본원에 기술된 바와 같은 세포주의 표준화된 세트와 비교하여 암 환자에 의해 생성된 종양 세포내에서 과발현되거나 과소 발현되는지를 결정한다. 이러한 방법을 이용하는 경우, 특정 화학치료제를 포함하는 DNA 손상제에 의한 치료를 위한 적합한 후보는 종양 세포가 키네신 유전자를 과발현시키는 환자일 것이다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 암 환자가 항-미세관 화학치료제에 의한 치료를 위한 적합한 후보인지를 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 양태의 방법을 이용하는 경우, 항-미세관 제제치료를 위한 적합한 후보는 종양 세포가 세포주의 표준화된 세트 내에서의 발현 수준과 비교하여 키네신 유전자를 과소 발현시키는 환자일 것이다. 본 발명의 이러한 양태의 특히 유용한 구체예에서, 항-미세관 항암제에 의한 치료를 위한 잠재적 후보 암 환자는 DNA 손상제를 사용하는 암의 화학치료에 실피하거나, 이러한 치료 과정에서 내성이 되는 것으로 입증되었다.In a sixth aspect, the present invention provides a method of determining the suitability of a candidate for a particular cancer chemotherapeutic treatment modality. In one preferred embodiment, the present invention provides a method of determining whether a cancer patient is a suitable candidate for treatment with a DNA damaging chemotherapeutic agent or another DNA damaging agent, such as radiation, which method is disclosed herein and in co-pending US patents. A kinesin gene, such as the kinesin heavy chain gene described in Application 08 / 033,086, is compared to a standardized set of cell lines as described herein to determine whether it is overexpressed or underexpressed in tumor cells produced by cancer patients. When using this method, a suitable candidate for treatment with DNA damaging agents, including certain chemotherapeutic agents, will be patients whose tumor cells overexpress kinesin genes. In another embodiment, the present invention provides a method of determining whether a cancer patient is a suitable candidate for treatment with an anti-microtubule chemotherapeutic agent. When using the method of this embodiment, a suitable candidate for anti-microtubule agent therapy would be a patient whose tumor cells underexpress kinesin genes compared to the expression levels in a standardized set of cell lines. In a particularly useful embodiment of this aspect of the invention, a potential candidate cancer patient for treatment with an anti-microtubule anticancer agent is proven to be resistant to, or resistant to, chemotherapy of a cancer using a DNA damaging agent. It became.

제7 측면에서, 본 발명은 화학치료제에 내성인 종양 세포에 대해 유용한 약제제품의 적절한 설계에 대한 출발점을 제공한다. DNA 손상제에 대한 내성 및 항-미세관 화학치료제에 대한 감응성과 관련된 키네신 유전자의 구조, 기능, 정위 및 발현 패턴을 조사함으로써, 키네신 유전자를 과발현시키거나 과소 발현시키는 종양 세포내의 약제내성을 극복하는 약제제품을 생성시키기 위한 방법이 개발될 수 있다.In a seventh aspect, the present invention provides a starting point for the proper design of a pharmaceutical product useful for tumor cells resistant to chemotherapeutic agents. By examining the structure, function, location and expression patterns of kinesin genes associated with resistance to DNA damaging agents and sensitivity to anti-microtubule chemotherapeutic agents, they overcome drug resistance in tumor cells that overexpress or underexpress kinesin genes. Methods for producing pharmaceutical products can be developed.

본 발명의 바람직한 특정 구체예는 하기의 바람직한 특정 구체예의 보다 상세한 설명 및 특허청구의 범위로부터 자명해질 것이다.Certain preferred embodiments of the present invention will become apparent from the following more detailed description of the specific preferred embodiments and the claims.

[바람직한 구체예의 상세한 설명][Detailed Description of Preferred Embodiments]

본 발명은 화학치료제에 대한 감응성 및 내성과 관련된 특이적 유전자 기능을 억제하기 위한 수단에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 억제효과를 갖고 화학치료제를 포함하는 DNA 손상제에 대한 내성을 제공하는 키네신 유전자로부터 유도되는 유전 저해 요소(GSE)를 제공한다. 본 발명은 또한, 이러한 GSE를 확인하는 방법, 및 이들을 사용하는 방법을 제공한다.The present invention relates to means for inhibiting specific gene functions associated with sensitivity and resistance to chemotherapeutic agents. The present invention provides a genetic inhibitory element (GSE) derived from the kinesin gene that has this inhibitory effect and provides resistance to DNA damaging agents, including chemotherapeutic agents. The invention also provides methods of identifying such GSEs and methods of using them.

본 발명의 경우에, 용어 "키네신 유전자"는 모든 키네신 유전자, 특히 포유동물 및 바람직하게는 마우스 또는 사람 키네신 유전자를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 키네신은 진핵 세포에서 미세관을 따라 일어나는 소포 또는 매트로분자의 세포내 이동에 참여하는 많은 관련된 운동성 단백질을 코드화하는 한 부류의 관련 유전자를 포함한다. (발명의 배경 참조). 성숙된 기능성 키네신 분자는 키네신 중쇄 유전자와 키네신 경쇄 유전자의 생성물로 이루어진다. 본 발명은 키네신 경쇄 유전자와 키네신 중쇄 유전자 둘 모두로부터 유도되는 GSE를 포함한다. 상세하게는, 본 발명은 본 발명의 범위내에 DNA 손상제에 대한 내성 또는 감응성을 유발할 수 있는 모든 키네신 유전자 및 이들로부터 유도된 GSE를 함유하도록 의도된다.In the present case, the term "kinesin gene" will be understood to include all kinesin genes, in particular mammals and preferably mouse or human kinesin genes. Kinesin includes a class of related genes that encode many related motility proteins that participate in intracellular migration of vesicles or macromolecules that occur along microtubules in eukaryotic cells. (See background of the invention). Mature functional kinesin molecules consist of the products of the kinesin heavy chain gene and the kinesin light chain gene. The present invention includes GSE derived from both kinesin light chain gene and kinesin heavy chain gene. Specifically, the present invention is intended to contain within the scope of the present invention all kinesin genes and GSEs derived therefrom that may cause resistance or sensitivity to DNA damaging agents.

본 발명의 범주내에 속하는 DNA 손상제로는, 이온화 및 자외선 복사플 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 모든 DNA 손상제, 암사크린, 에토포시드, 독소루비신(아드리마이신), 시스플라틴 및 캠프토테신을 포함하는 특정화학치료제가 있다.DNA damaging agents within the scope of the present invention include all DNA damaging agents including but not limited to ionizing and ultraviolet radiation, amsacrine, etoposide, doxorubicin (adrimycin), cisplatin and camptothecins. Chemotherapy is available.

제1 양태에서, 본 발명은 NIH 3T3 세포로부터의 전체 세포 mRNA로부터 제조된 표준화된 불규칙 단편 발현 라이브러리로부터 단리되고, 토포이조머라제II 약제인 에토포시드에 대한 내성을 제공할 수 있는 능력을 기초로하여 단리된 마우스 키네신 중쇄 유전자의 cDNA로부터 유도된 GSE를 제공한다 (본원의 실시예 1 내지 4, 및 1993년 3월 3일에 출원되고 본원에 참고문헌으로서 인용된 공동계류중인 미국 특허 출원 제08/033,086호에 기재되어 있음). 본 발명자에 의해 발견되기 전에도, 키네신이 어떠한 방식으로도 에토포시드 감응성에 관련되는 점은 의심할 여지가 없었다. 이러한 결과는 GSE를 확인하여 화학치료제에 대한 내성을 위한 유전적 기초에 대한 많은 새롭고 놀라운 정보를 제공하기 위한 일반적 방법의 능력을 입증하는 것이다.In a first aspect, the invention is based on the ability to isolate resistance from a standardized irregular fragment expression library prepared from whole cell mRNA from NIH 3T3 cells and to provide resistance to etoposide, a topoizomerase II agent. Thereby providing a GSE derived from the cDNA of the mouse kinesin heavy chain gene isolated (Examples 1-4 of this application, and co-pending US patent application, filed March 3, 1993 and incorporated herein by reference). 08 / 033,086). Prior to being discovered by the inventors, there was no doubt that kinesin was involved in etoposide sensitivity in any way. These results demonstrate the ability of generic methods to identify GSEs and provide many new and surprising information on the genetic basis for resistance to chemotherapeutic agents.

그 외에, 에토포시드에 대한 내성을 제공하는 키네신-유도 GSE는 세포 작용을 유발시키며, 이는 키네신이 계획된 세포 사멸에 참여할 수 있음을 제시하는 것이다. 따라서, 본 발명의 상기 양태에 따르는 방법은 또한, 노화 및 세포 사멸에 대한 유전적 기초에 대한 유용한 정보를 제공한다. 이러한 점은 발달에 참여하는 유전자를 연구하기 위한 중요한 관련성을 가질 수 있는데, 그 이유는 화학치료제내성 또는 노화와 관련된 유전자를 확인하는데에 사용되는 GSE가 또한 배에서 트랜스유전자로서 발현되어 발달에서의 이러한 유전자의 역할을 결정하기 때문이다. 상기 약제내성 관련 GSE에 상응하는 마우스 키네신 중쇄 유전자의 구조의 설명은 실시예 5에 기술되어 있으며, 상기 GSE의 약제내성 능력의 기능 분석은 실시예 7에 기술되어 있다.In addition, kinesin-induced GSE, which provides resistance to etoposide, induces cellular action, suggesting that kinesin may participate in planned cell death. Thus, the method according to this aspect of the invention also provides useful information on the genetic basis for aging and cell death. This may have important relevance for studying genes involved in development because GSE, which is used to identify genes associated with chemotherapeutic resistance or aging, is also expressed as a transgene in the embryo, and this This is because it determines the role of the gene. The description of the structure of the mouse kinesin heavy chain gene corresponding to the drug resistance related GSE is described in Example 5, and the functional analysis of the drug resistance ability of the GSE is described in Example 7.

제2 양태에서, 본 발명은 DNA 손상제에 내성을 제공하는 키네신 유전자-유도 GSE를 확인하는 방법을 제공한다. 본 방법에 의해 확인되는 GSE는 키네신 유전자와 상동일 것이다. 본 발명의 경우에, 키네신 유전자에 대한 "상동성"이라는 표현은, GSE가 앤티센스 메카니즘을 통해 작용하는지 또는 항유전자 메카니즘을 통해 작용하는 지(즉, 단백질 수준에서 차단의 메카니즘을 통해 작용하는 지)에 따라 2가지의 상이한 의미를 갖는다. 전자의 경우에, GSE가 호오그스틴(Hoogsteen) 또는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 의한 유전자 또는 이것의 mRNA 전사체에 대한 생리학적 조건하에서 혼성화되는 누클레오티드 서열을 갖는 경우에, 앤티센스 또는 항유전자 올리고누클레오티드 또는 폴리누클레오티드인 GSE는 유전자에 대해 상동성이다. 후자의 경우에, GSE가 단백질 분자를 코드화하는 유전자의 일부에 코드화되는 것과 동일하거나, 보존 아미노산 치환체 대한 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 경우에, 단백질 분자로 차단된 GSE는 상기 단백질 분자를 코드화하는 유전자에 대해 상동성이다. 이들 경우 중 어느 하나에 있어서, 실시상의 문제로서, GSE가 유전자, 특히 본원에 기재된 바와 같은 모든 키네신 유전자, 바람직하게는 모든 마우스 또는 사람 키네신 유전자의 기능을 억제하거나 감소시킬 수 있는가를 평가함으로써, GSE가 유전자에 대해 상동성인지가 결정된다.In a second aspect, the invention provides a method of identifying kinesin gene-induced GSE that provides resistance to DNA damaging agents. The GSE identified by this method will be homologous to the kinesin gene. In the case of the present invention, the expression “homology” for the kinesin gene indicates whether the GSE acts through an antisense mechanism or through an antigenic mechanism (ie, through a mechanism of blocking at the protein level). ) Has two different meanings. In the former case, when the GSE has a nucleotide sequence that hybridizes under physiological conditions to a gene by Hoogsteen or Watson-Crick base pair or mRNA transcript thereof, antisense or GSEs that are antigenic oligonucleotides or polynucleotides are homologous to the gene. In the latter case, when the GSE has the same amino acid sequence as that encoded in the part of the gene encoding the protein molecule or has the same amino acid sequence as for the conserved amino acid substituent, the GSE blocked with the protein molecule is assigned to the gene encoding the protein molecule. Homology to. In either of these cases, as a matter of practice, the GSE is assessed by assessing whether the GSE can inhibit or reduce the function of the gene, in particular all kinesin genes as described herein, preferably all mouse or human kinesin genes. It is determined whether the gene is homologous.

본 발명의 상기 양태에 따르는 방법은 키네신 특이적 cDNA 또는 키네신 특이적인 게놈 DNA 불규칙 단편 발현 라이브러리를 표현형으로 스크리닝하여, 특정 화학치료제와 같은 DNA 손상제에 대한 내성을 제공하는 클론을 확인하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 키네신 특이적 cDNA 또는 키네신 특이적 게놈 DNA의 불규칙 단편의 라이브러리는 레트로바이러스 발현 벡터로 클로닝된다. 상기 바람직한 구체예에서, 라이브러리를 함유하는 레트로바이러스 입자는 세포를 감염시키는데에 사용되고, 감염된 세포는 비감염 세포를 사멸시키는 DNA 손상제의 농도에서 생존하는 능력에 대해 시험된다. 바람직하게는, 라이브러리 중의 인서트는 약 100 내지 700 b.p, 및 더욱 바람직하게는 약 200 내지 500 b.p일 것이다. DNA 손상제에 대해 내성인 세포의 클론성 개체군이 단리되면, GSE를 코드화하는 라이브러리 클론이 세포로부터 구조된다. 상기 단계에서, 발현 라이브러리의 인서트의 누클레오티드 서열이 결정될 수 있으며 ; 키네신 유전자 특이적 cDNA 불규칙 단편 발현 라이브러리로부터 유도된 클론에서, 누클레오티드 서열은 키네신 유전자 cDNA 누클레오티드 서열의 일부에 대해 상동성인 것으로 예상된다. 대안적으로, 누클레오티드 서열의 결정 전에, 구조된 라이브러리 클론은 첨가 형질전환 또는 감염 및 선택 검정으로 DNA 손상제및 화학치료제에 대한 내성을 제공하는 능력에 대해 추가로 시험될 수 있다. 물론, 상기 누클레오티드 서열의 결정으로 GSE가 확인된다. 상기의 방법은 실시예 6에서 추가로 예시된다.The method according to this aspect of the invention comprises screening a kinesin specific cDNA or kinesin specific genomic DNA irregular fragment expression library phenotype to identify clones that provide resistance to DNA damaging agents such as certain chemotherapeutic agents. do. Preferably, the library of kinesin specific cDNA or kinesin specific genomic DNA is cloned into retroviral expression vectors. In this preferred embodiment, retroviral particles containing the library are used to infect the cells and the infected cells are tested for their ability to survive at concentrations of DNA damaging agents that kill uninfected cells. Preferably, the insert in the library will be about 100 to 700 b.p, and more preferably about 200 to 500 b.p. Once a clonal population of cells resistant to DNA damaging agents is isolated, library clones encoding the GSE are rescued from the cells. In this step, the nucleotide sequence of the insert of the expression library can be determined; In clones derived from kinesin gene specific cDNA irregular fragment expression libraries, the nucleotide sequence is expected to be homologous to a portion of the kinesin gene cDNA nucleotide sequence. Alternatively, prior to the determination of the nucleotide sequence, the rescued library clones may be further tested for their ability to provide resistance to DNA damaging agents and chemotherapeutic agents in additive transformation or infection and selection assays. Of course, the determination of the nucleotide sequence confirms GSE. The above method is further illustrated in Example 6.

이와 같이, 본 발며은 최적 억제제활성을 갖는 키네신 유전자 유도 GSE를 얻기 위한 방법을 제공한다. 실시예 1에서와 같이 전체 cDNA로부터 제조된 불규칙 단편 라이브러리와 비교하면, 키네신 유전자 특이적 단편으로부터만 제조된 불규칙 단편 발현 라이브러리를 스크리닝함으로써, 키네신 유전자로부터 특이적으로 유도되는 매우 다양한 GSE가 얻어질 수 있다. 결과적으로, 최적 GSE, 즉 화학치료제에 대한 최적 수준의 내성을 제공하는 키네신 유도 GSE를 얻을 수 있는 가능성은 실시예 6에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 단일 유전자 불규칙 단편 라이브러리 근사물을 이용하여 최대화된다.As such, the present invention provides a method for obtaining kinesin gene-induced GSE with optimal inhibitory activity. Compared to an irregular fragment library prepared from whole cDNA as in Example 1, by screening an irregular fragment expression library made only from kinesin gene specific fragments, a wide variety of GSEs specifically derived from the kinesin gene can be obtained. have. As a result, the possibility of obtaining an optimal GSE, ie, kinesin derived GSE, which provides an optimal level of resistance to chemotherapeutic agents is maximized using a single gene irregular fragment library approximation, as described in detail in Example 6. .

본 발명의 상기 양태의 추가 특징은 본 발명의 키네신 유도 GSE의 감염성 레트로바이러스 구체예를 생성시키는 세포의 약제선택에 의해 다수의 키네신 특이적 GSE를 생성시키는 것이다. 상기 양태에서, 키네신 cDNA 또는 키네신 게놈 DNA 특이적 불규칙 단편 발현 라이브러리로 감염된 에코트로프 세포는 DNA 손상제, 바람직하게 및 가장 실질적으로는 에토포시드와 같은 화학치료제에 의해 선택된다. 이에 의해, 각각 약제내성을 제공하는 키네신 유도 GSE를 함유하는 내성 클론의 개체군이 얻어진다. 이들 세포는 본 발명의 GSE의 감염 레트로바이러스 구체예를 생성시킬 수 있기 때문에, 약제내성을 제공할 수 있도록 사전 선택된 다수의 키네신 유도 GSE가 용이하고 효과적으로 생성될 수 있다.A further feature of this aspect of the invention is the generation of multiple kinesin specific GSEs by drug selection of cells which produce infectious retroviral embodiments of the kinesin derived GSEs of the invention. In this embodiment, the echotrope cells infected with kinesin cDNA or kinesin genomic DNA specific irregular fragment expression library are selected by DNA damaging agents, preferably and most substantially by chemotherapeutic agents such as etoposide. Thereby, a population of resistant clones containing kinesin-induced GSE, each of which provides drug resistance, is obtained. Since these cells can produce infectious retroviral embodiments of the GSEs of the invention, a number of kinesin-induced GSEs preselected to provide drug resistance can be produced easily and effectively.

제4 양태에서, 본 발명은 화학치료제에 대한 감응성과 관련된 키네신 유전자의 기능을 억제할 수 있는 합성 펩티드 및 올리고누클레오티드를 제공한다. 본 발명에 따른 합성 펩티드는 본 발명에 따른 GSE에 의해 코드화되는 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에 따르는 합성 올리고누클레오티드는 본 발명에 따른 GSE의 누클레오티드 서열에 상응하는 누클레오티드 서열을 갖는다. GSE가 발견되고 서열화되고, 이것의 배향이 결정되면, 바로 이어서 GSE의 누클레오티드 서열(앤티센스-배향된 GSE에 대해) 또는 GSE에 의해 코드화되는 아미노산 서열(센스-배향된 GSE에 대해)에 상응하는 올리고누클레오티드가 제조된다. 일부 구체예에서, 이러한 합성 펩티드 또는 올리고누클레오티드는 각각, GSE에 의해 코드화된 완전한 서열을 가질 수 있거나, GSE 중에 존재하는 서열의 일부만을 가질 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 펩티드 또는 올리고누클레오티드는 GSE-코드화 또는 GSE 서열의 일부만을 가질 수 있다. 이러한 후자의 구체예에서, 일반적으로 모든 경우는 아니지만, 특정 유전자에 상응하는 많은 독립적 GSE 클론이 동일한 5' 또는 3' 말단을 가질 것이라는 관찰에 의해 부적당한 실험이 파해진다. 이는 많은 GSE가 하나의 임계 종말점을 가지며, 이로부터 단순 이동 실험이 유전자 기능을 저해하는데 필요한 펩티드 또는 올리고누클레오티드의 최소 크기를 결정함을 제시하는 것이다. 펩티드의 경우에, 6 내지 8개만큼 적은 수의 아미노산으로 이루어진 가능성 도메인이 면역글로불린 결합 영역에서 확인되었다. 이와 같이, 상기 크기 또는 더 큰 크기를 갖는 펩티드 또는 펩티드 유사체가 GSE로서 제조될 수 있다. 앤티센스 올리고누클레오티드의 경우에, 유전자 기능의 억제는 생리학적 조건하에서 상응하는 mRNA로 혼성화시키기에 충분한 길이를 갖는 올리고누클레오티드에 의해 조절될 수 있다. 일반적으로, 염기의 수가 약 12개 이상인 올리고누클레오티드가 상기 설명에 적합할 것이다. 바람직하게는, 이러한 올리고누클레오티드의 누클레오티드의 수는 약 12 내지 약 100개일 것이다.In a fourth aspect, the present invention provides synthetic peptides and oligonucleotides capable of inhibiting the function of the kinesin gene associated with sensitivity to chemotherapeutic agents. The synthetic peptides according to the invention have an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence encoded by the GSE according to the invention. Synthetic oligonucleotides according to the invention have a nucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence of a GSE according to the invention. Once the GSE is found and sequenced and its orientation is determined, it immediately follows the nucleotide sequence of the GSE (for antisense-oriented GSE) or the amino acid sequence encoded by the GSE (for sense-oriented GSE). Oligonucleotides are prepared. In some embodiments, such synthetic peptides or oligonucleotides may each have a complete sequence encoded by GSE or may only have a portion of the sequence present in the GSE. In other specific embodiments, the peptide or oligonucleotide may have only part of a GSE-encoding or GSE sequence. In this latter embodiment, inadequate experimentation is broken by the observation that generally, but not all, many independent GSE clones corresponding to a particular gene will have the same 5 'or 3' terminus. This suggests that many GSEs have one critical endpoint, from which simple migration experiments determine the minimum size of peptide or oligonucleotide required to inhibit gene function. In the case of peptides, likelihood domains consisting of as few as six to eight amino acids were identified in the immunoglobulin binding region. As such, peptides or peptide analogs of this size or larger may be prepared as GSE. In the case of antisense oligonucleotides, inhibition of gene function can be controlled by oligonucleotides having a length sufficient to hybridize to the corresponding mRNA under physiological conditions. In general, oligonucleotides with at least about 12 bases will be suitable for the above description. Preferably, the number of nucleotides of such oligonucleotides will be from about 12 to about 100.

본원에 사용되는 용어 "올리고누클레오티드"는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포트리에스테르, 술폰, 실록산, 카아보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 티오에테르, 브릿지화 포스포르아미데이트, 브릿지화 메틸렌포스포네이트 및 브릿지화 포스포로티오에이트 누클레오티드간 결합과 같은 누클레아제내성 누클레오티드간 결합을 갖는 변형된 올리고누클레오티드를 포함한다. 이들 변형된 결합을 함유하는 올리고누클레오티드의 합성은 당분야에서 널리 공지되어 있다 [참조예 : Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews 90 : 543-584 : Schneider and Banner, 1990, Tetrabedron Letters 31 : 335]. 또한, 용어 "올리고누클레오티드"는 변형된 염기 또는 변형된 리보스 또는 데옥시리보스 당을 포함한다.The term "oligonucleotide" as used herein refers to phosphorothioate, methylphosphonate, phosphorodithioate, phosphoramidate, phosphorus ester, sulfone, siloxane, carbonate, carboxymethylester, acetamidate And modified oligonucleotides having internuclease resistant internucleotide bonds such as carbamate, thioether, bridged phosphoramidate, bridged methylenephosphonate and bridged phosphorothioate internucleotide bonds. Synthesis of oligonucleotides containing these modified bonds is well known in the art (see, eg, Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews 90: 543-584: Schneider and Banner, 1990, Tetrabedron Letters 31: 335). The term "oligonucleotide" also includes modified bases or modified ribose or deoxyribose sugars.

제5 양태에서, 본 발명은 유전자 동시 전달 연구에 유용한 우세한 선택성 표지를 제공한다. 본 발명에 따른 GSE가 화학치료제에 대한 내성을 제공하기 때문에, GSE를 발현시키는 벡터의 존재는 GSE의 부재하에 세포독성이 될 적합한 세포독성 약제의 농도에서 벡터-형질전환된 세포의 성장에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따르는 GSE는, 이들의 작은 크기가 이들을 제한된 패키지 용량을 갖는 바이러스 벡터내에도 동시 전달시키려는 유전자와 함께 용이하게 혼입되게 하기 때문에, 우세한 선택형 표지로서 특히 적합하다.In a fifth aspect, the present invention provides a dominant selective label useful for gene co-delivery studies. Since the GSE according to the present invention provides resistance to chemotherapeutic agents, the presence of the vector expressing GSE is facilitated by the growth of vector-transformed cells at a concentration of a suitable cytotoxic agent that will be cytotoxic in the absence of GSE. Can be chosen. GSEs according to the present invention are particularly suitable as dominant selective markers because their small size allows them to be easily incorporated with the genes to be co-delivered even in viral vectors with limited package capacity.

제6 양태에서, 본 발명은 키네신 유전자의 발현의 부재 또는 과소발현으로 인해, 특정 화학치료제를 포함하는 1종 이상의 DNA 손상제에 대해 내성인 종양 세포에 대한 진단적 검정을 제공한다. 특히, 키네신 유전자의 과소 발현이 수반되는 내성인 DNA 손상제의 부류는 시스플라틴, 에토포시드 및 캄프토테신을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 키네신 유전자의 발현의 부재 또는 과소 발현이 화학치료제내성에 대한 자연발생적이고, 의학적으로 중요한 기초인지를 결정하기 위해, 사람 종양 세포는 자발적 약제내성 돌연변이에 대해 선택되도록 세포독성량의 적합한 화학치료제로 처리될 수 있다.In a sixth aspect, the present invention provides diagnostic assays for tumor cells that are resistant to one or more DNA damaging agents, including certain chemotherapeutic agents, due to the absence or underexpression of the kinesin gene. In particular, the classes of resistant DNA damaging agents that involve underexpression of the kinesin gene include, but are not limited to, cisplatin, etoposide and camptothecin. To determine whether the absence or underexpression of the kinesin gene is a naturally occurring, medically important basis for chemotherapeutic resistance, human tumor cells are treated with a suitable cytotoxic amount of chemotherapeutic agent to be selected for spontaneous drug resistance mutations. Can be.

이들 돌연변이체는 관심있는 특정 유전자의 발현 정도에 대해 평가될 수 있다. 발현의 부재 또는 상당히 감소된 발현은 화학치료제내성의 자연 메카니즘을 나타낸다. 본원에 기술된 사람 키네신 중쇄 유전자의 과소 발현이 에토포시드 내성 사람 아데노카르시노마(힐러) 세포의 배양물에서 화학치료제에토포시드에 대한 자연 발생 내성과 관련됨을 나타내는 이러한 실험의 설명은 본원의 실시예 11, 및 본원에서 참고문헌으로 인용되고 1993년 3월 3일에 출원된 공동계류 중인 미국 특허 제08/033,086호에 기술되어 있다. 이러한 검정의 바람직한 구체예에서, 약제내성 및 키네신 유전자 발현의 수준을 정량화시키고 서로 상관시킨 조직 특이적 세포주의 표준화된 세트가 각가의 조직 유형으로부터의 종양을 검정하기 위해 제공된다.These mutants can be assessed for the degree of expression of the particular gene of interest. Absence or significantly reduced expression is indicative of the natural mechanism of chemotherapeutic resistance. The description of this experiment showing that underexpression of the human kinesin heavy chain gene described herein is associated with naturally occurring resistance to the chemotherapeutic etoposide in culture of etoposide resistant human adenocarcinoma (hiller) cells is described herein. Example 11, and co-pending US patent 08 / 033,086, incorporated herein by reference and filed March 3, 1993. In a preferred embodiment of this assay, a standardized set of tissue specific cell lines that quantify and correlate the levels of drug resistance and kinesin gene expression are provided for assaying tumors from each tissue type.

대안적으로, 그리고 바람직하게는, 자연 발생 처리 반응 및 비반응 종양 조직 샘플의 수집은 키네신 유전자의 발현 수준에 대해 시험될 수 있으며, 이들의 처리 결과 및 추정하여 약제-내성 메커니즘과 키네신 유전자 발현 사이에 상관관계가 수립된다.Alternatively, and preferably, collection of naturally occurring treated and unresponsive tumor tissue samples can be tested for expression levels of kinesin genes, and between their treatment results and presumed drug-resistant mechanisms and kinesin gene expression. Correlation is established.

따라서, 이러한 발현의 감소 또는 부재는 관심있는 DNA 손상제또는 화학치료제(들)에 대한 종양 세포 내성에 대한 진단적 감정의 기초가 될 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에 따르는 진단적 검정의 제1 구체예는 키네신 유전자의 서열에 상동인 올리고누클레오티드(들)을 사용한다. 이러한 구체예에서, 종양 샘플로부터 RNA가 추출되고, 표준화된 필터 혼성화 공정, RNase 보호 검정 또는 정량적 cDNA-PCR에 의해 특정 키네신 유전자에 대해 특이적인 RNA가 정량화된다 [참고문헌 : Noonan et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7160-7164]. 본 발명의 이러한 양태에 따르는 진단적 검정의 제2 구체예에서, 키네신 중쇄 또는 키네신 경쇄 단백질의 일부와 동일한 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드에 대한 항체가 증가된다. 사람 키네신 중쇄에 대해 특이적인 항체는 사실상 공지되어 있다 [참고문헌 : Navone et al., supra]. 이들 항체는 시험하려는 종양 세포의 표면 또는 세포 내의 위치에서, 또는 시험하려는 종양 세포로부터 추출된 단백질의 샘플내에 존재하는 관심있는 유전자 생성물의 양을 결정하기 위한 통상적인 정량적 면역 검정(예를 들어, RIA 또는 면역조직화학 검정)에 사용된다.Thus, the reduction or absence of such expression may be the basis for diagnostic sentiment about tumor cell resistance to DNA damaging agents or chemotherapeutic agent (s) of interest. A first embodiment of the diagnostic assay according to this aspect of the invention uses oligonucleotide (s) homologous to the sequence of the kinesin gene. In this embodiment, RNA is extracted from the tumor sample and RNA specific for a particular kinesin gene is quantified by standardized filter hybridization processes, RNase protection assays or quantitative cDNA-PCR [Noonan et al., 1990 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7160-7164. In a second embodiment of the diagnostic assay according to this aspect of the invention, antibodies to synthetic peptides having the same amino acid sequence as part of the kinesin heavy chain or kinesin light chain protein are increased. Antibodies specific for human kinesin heavy chains are known in nature (Navone et al., Supra). These antibodies can be prepared by conventional quantitative immunoassays (eg, RIA) to determine the amount of gene product of interest present at the surface or within the cell of the tumor cell to be tested or in a sample of protein extracted from the tumor cell to be tested. Or immunohistochemistry assays).

본 발명의 이러한 진단적 검정을 위한 특정 사용은 사람의 악성 질환의 완화를 위한 치료를 결정하는데에 있어서 임상적 사용이다. 예를 들어, 본 발명의 키네신 중쇄 유전자가 조직을 구성하는 정상 세포에서 발견된 발현 수준과 비교하여 종양 세포에서 과소 발현되는 지에 대한 결정은 이러한 종양을 갖는 환자가 DNA 손상제를 사용하는 치료적 간섭에 대해 불량한 후부이며, 그 이유는 종양의 이러한 키네신 과소 발현 세포가 이러한 약제에 대해 내성을 가질것으로 예측되기 때문이다. 유사하게, 우연하게 본 발명의 키네신 중쇄 유전자를 과발현시키는 종양 세포는 이러한 제제에 민감하고, 따라서 이러한 제제에 의한 종양 세포 사멸에 가능할 것으로 예측된다. 다른 한편으로, 본원은 키네신 중쇄 유전자 과소 발현 인자가 예를 들어 콜히친, 콜세미드(colcemide), 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 빈데신을 포함하는 항-미세관 제제의 세포 파괴 작용에 민감하다는 실험적 증거를 제공한다. 이러한 결과는, 본 발명의 키네신 중쇄 유전자를 과소 발현시키는 세포를 갖는 종양에 걸린 환자가 DNA 손상제에 의한 처리에 반응할 수 있음을 제시한다.Particular use for this diagnostic assay of the present invention is clinical use in determining treatment for alleviation of malignant disease in humans. For example, the determination of whether the kinesin heavy chain gene of the present invention is underexpressed in tumor cells compared to the expression levels found in the normal cells that make up the tissue may result in therapeutic intervention in patients with such tumors using DNA damaging agents. Poor posterior to, because these kinesin underexpressed cells in the tumor are expected to be resistant to these agents. Similarly, tumor cells that overexpress the kinesin heavy chain gene of the present invention are susceptible to such agents and are therefore expected to be capable of tumor cell death by such agents. On the other hand, the present application provides experimental evidence that the kinesin heavy chain gene underexpression factor is sensitive to the cell disruptive action of anti-microtubule preparations including, for example, colchicine, colcemide, vinblastine, vincristine and vindesine. to provide. These results suggest that patients with tumors having cells that underexpress the kinesin heavy chain gene of the present invention can respond to treatment with DNA damaging agents.

따라서, 본 발명은 DNA 손상제및 그밖의 화학치료적 처리 양식에 대한 개별적 암 환자의 종양 내성 또는 감응성의 특성을 기초로 하는 이해력 있고 공지된 치료학적 간섭을 가능하게 하고, 여기에서, 치료 선택은 DNA 손상제에 대한 특이적 내성의 메커니즘에 기초하고 키네신 중쇄 유전자의 과발현 또는 과소 발현에 의해 조정되는 치료의 개시 전에 이루어질 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에서는, 종양 샘플의 키네신 발현 수준의 검출을 위해, 문헌 [Navone, et al., supra]에 기술되어 있는 항-키네신 중쇄 항체와 같은 키네신 특이적 항체가 특히 유용하다.Accordingly, the present invention enables an understanding and known therapeutic intervention based on the characteristics of tumor resistance or sensitivity of individual cancer patients to DNA damaging agents and other chemotherapeutic treatment modalities, wherein treatment selection It may be based on the mechanism of specific resistance to DNA damaging agents and prior to initiation of the treatment, which is modulated by overexpression or underexpression of the kinesin heavy chain gene. In this embodiment of the invention, kinesin specific antibodies, such as the anti-kinesin heavy chain antibodies described in Navone, et al., Supra, are particularly useful for the detection of kinesin expression levels in tumor samples.

제7 측면에서, 본 발명은 화학치료제에 대한 종양 세포의 내성을 저해할 수 있는 약제의 적하반 설계에 대한 출발점을 제공한다.In a seventh aspect, the present invention provides a starting point for the loading of drip half of a medicament that can inhibit tumor cell resistance to chemotherapeutic agents.

약제감응성에 수반되는 키네신 유전자의 생화학적 기능을 이해하면, 이러한 유전자의 기능을 자극하거나 또는 모방하여, 항암제에 대한 세포독성반응을 증대시키는 약제학적 수단이 제시될 수 있다. 또한, 전사 수준에서 유전자 발현이 상향조절될 수 있다. 이것은 상응하는 키네신 유전자 각각의 프로모터 영역을 클로닝시키고, 특이적 생물학적 자극 인자에 대한 반응을 제공하는 것으로 공지된 cis 요소의 존재에 대한 프로모터 서열을 분석함으로써 수행될 수 있다. 진핵 세포에서, 즉 키네신 중쇄 및 키네신 경쇄 단백질 둘 모두로 이루어진 키네신의 구조로 인해, 키네신 유전자의 발현 조절을 기초로 하는 효과적인 치료학적 간섭을 위해, 적절한 키네신 경쇄 및 중쇄 단백질 둘 모두의 발현의 동등한 상향조절이 요구된다.Understanding the biochemical function of kinesin genes involved in drug sensitivity can suggest pharmaceutical means for stimulating or mimicking the function of such genes to enhance cytotoxic responses against anticancer agents. In addition, gene expression may be upregulated at the level of transcription. This can be done by cloning the promoter region of each of the corresponding kinesin genes and analyzing the promoter sequence for the presence of cis elements known to provide a response to specific biological stimulating factors. Eukaryotic cells, i.e., due to the structure of kinesin consisting of both kinesin heavy and kinesin light chain proteins, for an effective therapeutic interference based on the regulation of expression of the kinesin gene, an equivalent upstream of the expression of both the appropriate kinesin light and heavy chain proteins. Adjustment is required.

대안적으로, 암 세포에서의 키네신 발현은 키네신 중쇄 및 키네신 경쇄의 기능성의 완전 길이 복사체를 코드화하는 재조합 발현 구성체의 공동도입에 의해 증가되어, 이러한 외인성 키네신의 동등한 공동발현이 암 세포에서의 기능성 키네신 분자의 발현을 증가시킨다.Alternatively, kinesin expression in cancer cells is increased by the co-introduction of recombinant expression constructs encoding the full-length copies of the kinesin heavy chain and the kinesin light chain, such that equivalent coexpression of these exogenous kinesins is functional kinesin in cancer cells. Increase the expression of the molecule.

공지된 항암제와 같은 방식으로 이러한 단백질에 영향을 주는 신규한 약제를 개발하기 위해, cDNA 서열로부터 추정되는 단백질 구조가 또한 컴퓨터 지원 약제설계에 사용될 수 있다. 편리한 발현 시스템에서 생성되는 정제된 단백질이 또한, 항암 작용을 갖는 신규의 화합물을 위한 생체외 생화학적 스크린 시스템의 중요한 요소로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 화학치료제내성 부여 GSE를 발현시키는 포유동물 세포가 약제내성을 극복하는 능력에 대해 화합물을 스크리닝하는데에 유용하다. 약제학적 간섭 방법에 있어서, 키네신 경쇄 및 중쇄는 이러한 생체외 스크리닝 시스템에서, 생체외에서 성숙 키네신 분자를 재구성할 수 있는 양으로 존재해야 한다.To develop novel drugs that affect these proteins in the same way as known anticancer agents, protein structures deduced from cDNA sequences can also be used in computer-aided drug design. Purified proteins generated in convenient expression systems can also be used as important elements of ex vivo biochemical screen systems for novel compounds with anticancer activity. Thus, mammalian cells expressing chemotherapeutic tolerant GSEs according to the present invention are useful for screening compounds for their ability to overcome drug resistance. In the pharmaceutical interference method, the kinesin light and heavy chains must be present in such an in vitro screening system in an amount capable of reconstituting the mature kinesin molecule in vitro.

본 발명의 바람직한 특정 구체예는 하기의 바람직한 특정 구체예의 더욱 상세한 설명 및 특허청구의 범위로부터 자명해질 것이다.Certain preferred embodiments of the present invention will become apparent from the following more detailed description of the specific preferred embodiments and the claims.

[실시예 1]Example 1

레트로바이러스 벡터에서의 표준화된 불규칙 단편 cDNA 라이브러리의 생성Generation of Standardized Irregular Fragment cDNA Libraries in Retroviral Vectors

파탄잘리(Patanjali) 등의 문헌[1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1943-1947]의 프로토콜의 변형된 프로토콜을 사용하여, 제1a 및1b도에 도시되어 있는 표준화된 cDNA 개체군을 제조하였다. 폴리(A)⁺RNA를 NIH 3T3 세포로부터 추출하였다. 세포 성장의 여러 단계에서 발현되는 상이한 유전자에 대한 mRNA를 얻기 위해, 신속하게 성장하는 배양물로부터 RNA의 절반을 단리시키고, 완전한 단층 합류점(confluence)에 도달한 휴지 세포로부터 나머지 절반을 단리시켰다. 불규칙적으로 프라이밍 된 cDNA 개체군에서 5'-말단 서열의 과표현(overrepresentation)을 피하기 위해, RNA를 비등에 의해 600 내지 1,000개 누클레오티드의 평균 크기로 단편화시킨다. 그 다음, 이들 RNA 단편을 불규칙적으로 프라이밍 된 이중 가닥 cDNA를 제조하는데에 사용하였다. 그 다음, 이러한 불규칙적으로 프라이밍된 cDNA를 번역 개시를 위한 적당한 관계 및 모든 3개의 가능한 리딩 프레임에서 ATG 코돈을 제공하는 합성 어댑터에 결찰시켰다. 어댑터의 구조(제2도 참조)에 의해, 각각의 단편이 이것의 배향과 무관하게 개시 코돈으로부터 출발하는 방식으로, cDNA의 블런트(blunt)-말단에 대한 이것의 결찰을 결정하였다. 클로닝 벡터 pLNCX가 클로닝 위치 바로 하류에 종결 코돈을 함유하기 때문에, 상기 어댑터에 반대 가닥에 종결 코돈을 제공하지 않는다 (이러한 벡터는 문헌 [Miller and Rosman, 1989, Biotechniques 7:980-986]에 기술되어 있다). 이러한 결찰 혼합물을 PCR 프라이머로서 어댑터의 "센스(sense)" 가닥을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다 (이 방법은 파탄잘리 등의 방법과 대조적으로, 초기 cDNA 제조물을 파지 벡터로 클로닝시킨 후, PCR 프라이머로서 벡터-유도 서열을 사용하여 cDNA 개체군을 증폭시키는 것을 이용한다). PCR은 특정 서열의 불규칙적 과증폭 또는 과소 증폭을 최소화시키고 생성물의 수율을 증가시키기 위해 연속적으로 결합되는 12 단계의 분리 반응으로 수행하였다. PCR-증폭 혼합물을 겔 전기 영동에 의해 크기-단편화시키고, 200 내지 500 bp 단편을 후속 조작을 위해 선택하였다 (이는 파탄잘리의 400 내지 1,600 bp의 단편 크기와는 대조적이다).Patanjali et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. Using a modified protocol of the protocol of USA 88: 1943-1947, the standardized cDNA population shown in Figures 1a and 1b was prepared. Poly (A) ⁺ RNA was extracted from NIH 3T3 cells. To obtain mRNA for different genes expressed at various stages of cell growth, half of the RNA was isolated from rapidly growing culture and the other half from resting cells that reached a complete monolayer confluence. To avoid overrepresentation of the 5'-terminal sequence in an irregularly primed cDNA population, RNA is fragmented by boiling to an average size of 600 to 1,000 nucleotides. These RNA fragments were then used to prepare irregularly primed double stranded cDNAs. This irregularly primed cDNA was then ligated to a synthetic adapter providing ATG codons in the appropriate relationship for translation initiation and all three possible reading frames. The structure of the adapter (see FIG. 2) determines its ligation to the blunt-end of the cDNA in such a way that each fragment starts from the start codon regardless of its orientation. Because the cloning vector pLNCX contains a stop codon just downstream of the cloning position, it does not provide a stop codon on the opposite strand to the adapter (such vectors are described in Miller and Rosman, 1989, Biotechniques 7: 980-986). have). This ligation mixture was amplified by PCR using the "sense" strand of the adapter as a PCR primer (in contrast to the method of Patanzali et al., The initial cDNA preparation was cloned into a phage vector, followed by PCR primers). Amplifying the cDNA population using vector-derived sequences as an example). PCR was performed in twelve stages of separation reactions that were combined in series to minimize irregular over-amplification or under-amplification of specific sequences and to increase product yield. PCR-amplified mixtures were size-fragmented by gel electrophoresis and 200-500 bp fragments were selected for subsequent manipulation (as opposed to 400-1600 bp fragment size of Patanzali).

표준화를 위해, cDNA 제조물을 파탄잘리 등에 의해 설명되고 제1a도에 도시된 바와 같이, 변성시키고, 상이한 재어니일링 시점을 사용하여 재어니일링 시켰다. 각각의 재어니일링된 혼합물로부터의 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA를 수산화 인회석 크로마토그래피에 의해 분리시켰다. 각각의 어니일링 시점으로부터의 단일-가닥 DNA 단편을 어댑터-유도 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시키고, 비교적 충분한 상이한 mRNA 서열에 대한 서던 혼성화에 의해 분석하였다. 각각 고-, 중- 및 저-발현 유전자에 상응하는 튜불린, c-myc 및 c-fos cDNA 서열(제1a 및1b도 참조)의 유사한 특성을 함유하는 분획을 라이브러리 제조에 사용하였다.For standardization, cDNA preparations were denatured and re-annealed using different re-annealing time points, as described by Patanzali et al and shown in FIG. 1a. Single-stranded and double-stranded DNA from each reannealed mixture was separated by hydroxyapatite chromatography. Single-stranded DNA fragments from each annealing time point were PCR-amplified using adapter-derived primers and analyzed by Southern hybridization to relatively sufficient different mRNA sequences. Fractions containing similar properties of tubulin, c-myc and c-fos cDNA sequences (see also 1a and 1b) corresponding to high-, medium- and low-expressing genes, respectively, were used for library preparation.

표준화된 cDNA 제조물을, 레트로바이러스 롱 터미널 반복체 [long terminal repeat(LTR)]에 함유된 프로모터로부터 전사되는 neo(G418 내성) 유전자를 함유하고, 세포 확대 바이러스[cytomegalovirus(CMV)]의 강한 프로모터로부터 삽입된 서열을 발현시키는 MoMLV-기본 레트로바이러스 벡터 pLNCX의 Clal 부위로 클로닝시켰다 (제2도 참조). 대장균의 5개의 후속 대규모 형질전환을 위해, 5 부분으로 분할된 결찰 혼합물을 사용하였다. 형질전환된 박테리아를 총 500개의 한천 평판(직경 : 150㎜)에 플레이팅시키고, 플라스미드 개체군(총 18㎎)을 한천으로 세척해낸 콜로니로부터 분리시켰다.Standardized cDNA preparations contain the neo (G418 resistant) gene that is transcribed from the promoter contained in the retrovirus long terminal repeat (LTR) and from the strong promoter of cytomegalovirus (CMV). It was cloned into the Clal site of the MoMLV-based retroviral vector pLNCX expressing the inserted sequence (see Figure 2). For five subsequent large-scale transformations of E. coli, the ligation mixture divided into 5 parts was used. Transformed bacteria were plated on a total of 500 agar plates (diameter: 150 mm) and plasmid populations (18 mg total) were isolated from colonies washed with agar.

50개의 불규칙적으로 선택한 콜로니로부터 인서트의 PCR 증폭에 의해 측정하여, 총 약 5x10⁷개의 클론이 수득되었으며, 이중 60%를 넘는 양은 표준화된 cDNA의 인서트를 함유한다. 이러한 결과는, 레트로바이러스 플라스미드 발현 벡터에서 3x10⁷개의 재조합 클론의 표준화된 cDNA 라이브러리의 생성 가능성을 나타낸다.As measured by PCR amplification of inserts from 50 randomly selected colonies, a total of about 5 × 10 ⁷ clones were obtained, of which over 60% contained inserts of standardized cDNA. These results indicate the possibility of generating a standardized cDNA library of 3 × 10 ⁷ recombinant clones in retroviral plasmid expression vectors.

[실시예 2]Example 2

바이러스-패키징 세포주 및 NIH 3T3 세포 내로의 레트로바이러스 불규칙 단편 라이브러리의 형질도입Transduction of Retroviral Irregular Fragment Library into Virus-Packaged Cell Lines and NIH 3T3 Cells

실시예 1에 따라 제조한 플라스미드 라이브러리를 레트로바이러스 비리온 단백질을 발현시키는 바이러스-패키징 세포(NIH 3T3의 유도체)로의 형질전환에 의해 레트로바이러스 입자의 혼합물로 전환시켰다 (이러한 세포주의 예는 문헌[Markowitz et al., 1988, Virology 167:400-406]에 기술되어 있다). 에코트로프성 및 암포트로프성 바이러스-패키징 세포주, GP+E86 및 GP+envAm12를 각각 1:1 비로 혼합시키고, 상기 혼합물의 10⁷개의 세포를 표준 칼슘 포스페이트 공동침전 조건하에서 플라스미드 라이브러리를 사용하여 형질전환시켰다. 이러한 형질전환은 에코트로프성 바이러스가 암코트로프성 패키징 세포를 감염시킬 수 있고, 또 그 반대일 수 있기 때문에, 패키징 세포 개체군을 통하여 빠르게 확산되는 에코트로프성 및 암포트로프성 바이러스 입자의 패키징 및 분비를 야기시킨다. NIH 3T3 세포의 감염 후에 수득되는 G418-내성 콜로니의 수에 의해 측정한 바이러스의 수율은 일시적 형질전환 단계 동안 배지 1 mL 당 10⁵개의 감염 단위에 도달하고(1 내지 3일), 그 후에 감소되고(4 내지 8일), 그 다음에 대부분의 패키징 세포 내에서 안정하게 일체화되는 프로바이러스 게놈의 발현으로 인해 신속하게 증가된다. 형질전환 9 내지 12일 후의 바이러스의 수율은 배지 상층액 1 mL 당 10⁶개를 초과한다. 이 단계에서, 상기 라이브러리는 상이한 단편의 매우 명백한 표현을 나타내나, 나중 단계에서, 개별적 바이러스-생성 클론은 개체군내에서 우세해지기 시작하여, cDNA-유도 인서트의 불균일한 표현을 유도한다. 레트로바이러스 개체군의 서열 표현의 균일성을 바이러스 함유 상층액에 의해 감염된 세포로부터 DNA를 신속하게 추출시킨 후에 인서트를 PCR증폭시킴으로써 모니터하였다. 인서트를 먼저 에티듐 브로마이드-염색 아가로오스 겔에서 연속 표본을 생성시키고, 토포이소머라아제II, c-myc 및 튜불린을 포함하는 상이한 프로브를 사용하여 서던 혼성화시킴으로써 분석하였다. 각각의 유전자가 다중 단편의 표본에 의해 표현되는 한은, 상기 라이브러리의 표현성을 충분한 것으로 간주하였다.The plasmid library prepared according to Example 1 was converted to a mixture of retroviral particles by transformation into virus-packaging cells (derivatives of NIH 3T3) expressing retroviral virion protein (examples of such cell lines are described in Markowitz et al., 1988, Virology 167: 400-406). Ecotropic and amphotrovirus virus-packaging cell lines, GP + E86 and GP + envAm12, respectively, were mixed in a 1: 1 ratio, and 10 ⁷ cells of the mixture were transfected using a plasmid library under standard calcium phosphate coprecipitation conditions. Switched. Such transformation results in the packaging and packaging of ecotropic and amphotrovirus virus particles that rapidly spread through the packaging cell population, as the ecotropic virus can infect amphoteric packaging cells and vice versa. Causes secretion The yield of virus, measured by the number of G418-resistant colonies obtained after infection of NIH 3T3 cells, reached 10 ⁵ infectious units per mL of medium (1-3 days) during the transient transformation step, and then decreased. (4-8 days), then rapidly increasing due to the expression of the proviral genome that is stably integrated in most packaging cells. The yield of virus after 9-12 days of transformation is greater than 10 ⁶ per mL of media supernatant. At this stage, the library shows very clear representations of different fragments, but at later stages, individual virus-producing clones begin to prevail in the population, leading to non-uniform representation of cDNA-induced inserts. The uniformity of sequence expression of the retroviral population was monitored by rapid extraction of DNA from cells infected with the virus-containing supernatant followed by PCR amplification of the insert. Inserts were analyzed by first generating serial samples on ethidium bromide-stained agarose gel and Southern hybridization using different probes including topoisomerase II, c-myc and tubulin. As long as each gene is represented by a sample of multiple fragments, the expression of the library was considered sufficient.

다른 구체예에서, 표현성의 손상 없이 불규칙 단편 표준화 cDNA 라이브러리의 NIH 3T3 세포에 형질도입시키기 위해, NIH 3T3 세포를 형질전환의 일시적 단계(1 내지 3일)에서 생성되는 바이러스에 의해 또는 형질전환 10 내지 12일 후에 수집된 고-역가 바이러스에 의해 감염시켰다. 고-역가 바이러스의 경우에, 100ml의 바이러스 현탁액은 10⁸개 보다 많은 감염 단위를 함유한다. "일시적" 바이러스의 경우, NIH 3T3 세포를 바이러스-생성 세포로부터의 배지 500ml를 사용하여, 10⁷개 이상의 재조합 레트로바이러스로 감염시켰다 (각각 100ml의 배지로, 5회 감염). 그 결과로, 크고 복합적인 불규칙 단편 라이브러리를 레트로바이러스 형태로 전환시키고, 이것을 복합성의 손실 없이 비-패키징 세포주로 전달시킬 수 있는 가능성이 설명된다.In another embodiment, in order to transduce NIH 3T3 cells of an irregular fragment standardized cDNA library without impaired expression, NIH 3T3 cells are transformed by a virus generated in the transient stage of transformation (1 to 3 days) or 10 to 10 transgenic. Infected by high-titer virus collected after 12 days. In the case of high-titer viruses, 100 ml of the virus suspension contains more than 10 ⁸ infectious units. For the "transient" virus, NIH 3T3 cells were infected with at least 10 ⁷ recombinant retroviruses using 500 ml of medium from virus-producing cells (5 infections, each with 100 ml of medium). As a result, the possibility of converting large and complex irregular fragment libraries into retroviral forms and delivering them to non-packaged cell lines without loss of complexity is described.

[실시예 3]Example 3

화학치료제에토포시드에 대한 내성을 부여하는 GSE의 단리Isolation of GSE Confers Resistance to Etoposide Chemotherapy

에토포시드 내성을 부여하는 GSE의 선택을 위한 전반적 개략도가 제3도에 예시되어 있다. 내성 표현형이 GSE 발현에 의해 야기되는 세포가 이러한 GSE를 함유하는 바이러스 입자를 생성시킬 것이라는 기대하에, 이러한 선택을 바이러스-생성 패키징 세포에서 직접 수행하였다. 암포트로프성 및 에코트로프성 패키징 세포의 혼합물을 실시예 1에 따라 제조한 LNCX 벡터 중의 cDNA 라이브러리로 형질전환시키고, 바이러스를 9일 동안 개체군을 통해 확산되도록 하였다. G418 내성에 대한 개체군의 소부분의 분석은, 실질적으로 100%의 세포가 neo-함유 프로바이러스를 함유함을 보여주었다. 그 후, 상기 세포를 15일 동안 350 ng/mL 에토포시드에 노출시키고, 2주 이상 동안 약제없이 성장시켰다. 에토포시드 선택 후에, 실험으로 수득한 콜로니의 수와 대조구(비감염 세포 또는 인서트-부재 LNCX 바이러스로 감염된 세포)에서 수득한 세포의 수 사이의 차이는 관찰되지 않았다.An overall schematic for the selection of GSE that confers etoposide resistance is illustrated in FIG. 3. This selection was made directly in virus-producing packaging cells, with the expectation that cells in which the resistant phenotype is caused by GSE expression will produce viral particles containing such GSE. Mixtures of amphoteric and ecotropic packaging cells were transformed with a cDNA library in the LNCX vector prepared according to Example 1 and the virus was allowed to spread through the population for 9 days. Analysis of a small portion of the population for G418 resistance showed that substantially 100% of cells contained neo-containing proviruses. The cells were then exposed to 350 ng / mL etoposide for 15 days and grown without medication for at least 2 weeks. After etoposide selection, no difference was observed between the number of colonies obtained in the experiment and the number of cells obtained in the control (uninfected cells or cells infected with insert-free LNCX virus).

그 후, 생존 세포의 배지 상층액에 존재하는 바이러스를 사용하여 NIH 3T3 세포를 감염시킨 후, 본질적으로 동일한 프로토콜을 사용하여 에토포시드 선택하였다. 에토포시드로 선택된 패키징 세포에 의해 생성된 라이브러리-유도 바이러스로 감염된 NIH 3T3 세포는 인서트-부재 LNCX 바이러스로 감염된 대조구 세포에 비하여 에토포시드-내성 세포의 수에서 상당한 증가를 나타내었으며, 이는 사전 선택된 바이러스 개체군 내의 생물학적 활성 GSE의 존재를 나타내는 것이다 (제4a도 참조).Thereafter, the virus present in the media supernatant of the viable cells was used to infect NIH 3T3 cells, followed by etoposide selection using essentially the same protocol. NIH 3T3 cells infected with library-induced virus generated by packaging cells selected with etoposide showed a significant increase in the number of etoposide-resistant cells compared to control cells infected with insert-free LNCX virus, which was a preselected virus. It indicates the presence of a biologically active GSE in the population (see also FIG. 4a).

에토포시드-선택 NIH 3T3 세포에 함유된 프로바이러스 인서트를 PCR에 의해 분석하였다. 이러한 분석(제4b도 참조)은, 감염된 세포의 비선택 개체군과 비교하여, 특정 단편의 부화를 보여주었다. 각각의 PCR-증폭 단편을, 제4C도에 예시된 바와 같이, 원래의 플라스미드와 동일한 위치 및 배향으로 LNCX 벡터로 재클로닝시켰다. 에토포시드 선택 후에 부화된 총 42개의 프로바이러스 인서트를 재클로닝시키고, NIH 3T3 세포로의 레트로바이러스 형질도입 후에 증가된 에토포시드 내성을 부여하는 능력에 대하여 배치식으로 또는 개별적으로 시험하였다. 3가지 비확인 클론은 에토포시드 내성인 것으로 밝혀졌으며,이는 이들의 생물학적 활성 GSE를 함유함을 제시하는 것이다. 이들 GSE는 항-khcs, VPA 및 VP9-11로 명명된다. 항-khcs로 명명된 클론에 의해 유도된 에토포시드 내성은 제5a도에 예시되어 있다.Proviral inserts contained in etoposide-selective NIH 3T3 cells were analyzed by PCR. This analysis (see also FIG. 4B) showed hatching of specific fragments compared to the non-selected population of infected cells. Each PCR-amplified fragment was recloned into the LNCX vector in the same position and orientation as the original plasmid, as illustrated in Figure 4C. A total of 42 proviral inserts hatched after etoposide selection were recloned and tested batchwise or individually for the ability to confer increased etoposide resistance after retroviral transduction into NIH 3T3 cells. Three unidentified clones were found to be etoposide resistant, suggesting that they contain their biologically active GSE. These GSEs are named anti-khcs, VPA and VP9-11. Etoposide resistance induced by a clone named anti-khcs is illustrated in Figure 5a.

에토포시드 내성을 유도하기 위한 항-khcs GSE 중 하나의 능력을, 바임(Baim) 등의 문헌[1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076]에 기술된 바와 같이, 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)-유도성 프로모토/활성제시스템을 사용하여 추가로 증명하였다. 이러한 시스템의 성분은 박테리아 lac 오퍼레이터의 다중 반복체와 cis로 결합된 인핸서-의존성 프로모터, 및 유전자 발현 LAB265, lca 억제인자로부터 유도된 인공 조절 단백질 및 포유동물 전사 활성제를 포함한다. 항-khcs GSE를 lac 오퍼레이터 서열의 21개 반복체로 보충된 인헨서 비함유 SV40 초기 유전자 프로모터로부터 인서틀 발현시키는 바임 등의 문헌 [a gift of Dr. T. Shenk]에 의해 사용된 유동성 프로모터를 함유하는 플라스미드 pX6.CLN으로 클로닝시켰다. 선택성 마아커를 함유하지 않는 생성된 플라스미드를 neo 유전자를 함유하는 LNCX 플라스미드와 함께 NIH 3T3 세포로 공동 형질전환시켰다.The ability of one of the anti-khcs GSEs to induce etoposide resistance is described by Baim et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072-5076, further demonstrated using an isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) -induced promoto / activator system. Components of this system include enhancer-dependent promoters coupled to cis with multiple repeats of the bacterial lac operator, and artificial expression proteins and mammalian transcriptional activators derived from gene expression LAB265, an lca inhibitor. Vyme et al. Express a anti-khcs GSE from an enhancer-free SV40 early gene promoter supplemented with 21 repeats of the lac operator sequence. Cloned into plasmid pX6.CLN containing the flowable promoter used by T. Shenk. The resulting plasmids that do not contain selective markers were cotransformed into NIH 3T3 cells with LNCX plasmids containing neo genes.

인서트-부재 벡터로 형질전환된 대조구 세포와 함께, G418-선택 형질전환체의 큰 개체군을 5mM IPTG의 존재 또는 부재하에, 증가된 농도의 에토포시드에 노출시켰다. 일반적으로 공동 형질전환 프로토콜이 G418-내성 세포의 단편에서만 GSE의 일체화를 유도할 지라도, 항-khcs에 의한 형질전환은 IPTG에 의존하여 에토포시드 내성을 분명하게 증가시킨다 (제5b도 참조).Along with control cells transformed with the insert-free vector, a large population of G418-selective transformants were exposed to increased concentrations of etoposide in the presence or absence of 5 mM IPTG. In general, although co-transfection protocols induce integration of GSE only in fragments of G418-resistant cells, transformation with anti-khcs obviously increases etoposide resistance depending on IPTG (see also 5b).

[실시예 4]Example 4

화학치료제에토포시드에 대한 내성을 부여하는 GSE의 서열 분석Sequence analysis of GSE confers resistance to chemotherapeutic etoposide

실시예 3에서 기술된 바와 같이 클로닝된 GSE 항-khcs를 표준 디데옥시 서열 공정에 의해 서열화시키고, 유도된 서열은 제6도에 도시하였다.Cloned GSE anti-khcs as described in Example 3 was sequenced by standard dideoxy sequencing process and the derived sequences are shown in FIG.

"센스" 및 "앤티센스" 가닥의 누클레오티드 서열, 및 이들 가닥 각각에 의해 코드화되는 예측된 펩티드의 아미노산 서열을 상동성 연구를 위한 BLAST 네트워크 프로그램을 사용하여, 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 데이터 베이스(National Center for Biotechnology Information data base)에 존재하는 핵산 및 단백질 서열에 대한 상동성에 대해 분석하였다. 항-khcs GSE의 "앤티센스" 가닥에 상응하는 서열은, 진핵 세포의 미세관을 따르는 세포 기관 또는 매크로분자의 세포내 이동에 수반되는 한 부류의 미세관 운동성 단백질인 키네신의 중쇄를 코드화하는 여러 유전자와의 강한 상동성을 나타내었다. 네이본(Navone) 등의 문헌 [1992, J. Cell Biol. 117:1263-1275]에 기술된 바와 같이, 사람 키네신 중쇄(KHC) 유전자와의 가장 높은 상동성이 발견되었다. 따라서, 항-khcs는 본 발명자들이 감응성(약제에 대한) 또는 노화와 관련된 khc에 대해 khcs로 명명한 마우스 khc 유전자에 대한 앤티센스 RNA를 코드화시킨다. 본 발명자들은 키네신 경쇄와 KHCS 단백질의 결합에 의해 형성되는 키네신 분자를 키네신-S로서 언급하여, 이것을 포유동물 세포내에 존재하는 다른 키네신과 구별하였다. 이러한 결과는, GSE에 대한 화학치료제선택이 새로운 유전 요소의 발견을 유도할 수 있고, 또한 종래에 예상하지 못했던 약제감응성에서의 유전자의 역할을 밝혀낼 수 있음을 나타내는 것이다.The nucleotide sequence of the "sense" and "antisense" strands, and the amino acid sequences of the predicted peptides encoded by each of these strands, were prepared using the BLAST network program for homology studies, using the National Center for Biotechnology Information Database (National). The homology to nucleic acid and protein sequences present in the Center for Biotechnology Information data base) was analyzed. The sequence corresponding to the "antisense" strand of the anti-khcs GSE encodes the heavy chains of kinesin, a class of microtubule kinetic proteins involved in intracellular migration of organelles or macromolecules along the microtubules of eukaryotic cells. Strong homology with the gene is shown. Navone et al., 1992, J. Cell Biol. 117: 1263-1275, the highest homology with the human kinesin heavy chain (KHC) gene was found. Thus, anti-khcs encodes antisense RNA for the mouse khc gene, which we named khcs for khc associated with sensitivity (for drugs) or aging. We refer to the kinesin molecule formed by the binding of the kinesin light chain and KHCS protein as kinesin-S, to distinguish it from other kinesins present in mammalian cells. These results indicate that chemotherapeutic selection for GSE may lead to the discovery of new genetic elements and to reveal the role of genes in drug sensitivity that were not previously anticipated.

[실시예 5]Example 5

항-khcs GSE 유전자를 유도하는 유전자의 클로닝 및 분석Cloning and Analysis of Genes That Induce Anti-khcs GSE Genes

실시예 3에서 단리시킨 항-khcs GSE를 람다 gt10 벡터에서 2개의 cDNA 라이브러리 각각으로부터 400,000개의 클론을 스크리닝하기 위한 프로브로서 사용하였다. 이들 라이브러리를 라우(Lau) 및 나탄스(Nathans)의 문헌 [1985, EMBO J. 4: 3145-3151 and 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1182-1186, a gift of Dr. L. Lau]에 기술된 바와 같이, 일치되지 않게 또는 G₀→ G₁전이에서 마우스 BALB/c 3T3 세포의 RNA로부터 통상적 공정에 의해 제조하였다. 제1 라이브러리의 스크리닝은 혼성화 클론을 생성시키지 않지만, 제2 라이브러리로부터의 2개의 상이한 클론은 항-kncs 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이들 클론을 정제하고 서열화시켰다. 서열 분석은 본 발명자들이 796 코돈에 상응하는 마우스 khcs cDNA의 대부분을 단리시켰음을 보여주었다 (전장 사람 KHC cDNA는 963개의 아미노산을 코드화시켰다). 이러한 서열은 제7도에 도시도어 있으며 ; 아미노 말단으로부터 84개의 아미노산을 코드화하는 추가의 252개의 누클레오티드를, 오하라(Ohara) 등의 문헌 [1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5763-5677]에 기술된 바와 같이, "고정 PCR"을 사용하여 단리시킨 5'-특이적 cDNA로부터 결정하였다. 추가의 불분명한 3' 말단 서열은 현재 상기 기술을 사용하여 단리시키고 있는 중이다.The anti-khcs GSE isolated in Example 3 was used as a probe to screen 400,000 clones from each of the two cDNA libraries in the lambda gt10 vector. These libraries are described by Lau and Nathans, 1985, EMBO J. 4: 3145-3151 and 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1182-1186, a gift of Dr. L. Lau] was prepared by conventional procedures from RNA of mouse BALB / c 3T3 cells inconsistent or at G ₀ → G ₁ transition. Screening of the first library did not produce hybridization clones, but two different clones from the second library were found to contain anti-kncs sequences. These clones were purified and sequenced. Sequence analysis showed that we isolated most of the mouse khcs cDNAs corresponding to 796 codons (full length human KHC cDNA encoded 963 amino acids). This sequence is shown in Figure 7; An additional 252 nucleotides encoding 84 amino acids from the amino terminus are described in Ohara et al., [1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5763-5677, was determined from 5'-specific cDNA isolated using "fixed PCR". Further unclear 3 'terminal sequences are currently being isolated using this technique.

사람 [Navone et al., 1992, J. Cell. Biol. 117:1263-1275], 마우스[Kato, 1991, J,. Neurosci, 2:704-711] 및 초파리[McDonald ＆ Goldstein, 1990, Cell 61:991-1000]으로부터 이미 클로닝 된 KHC 단백질을 갖는 khcs 단백질의 서열화된 부분의 도트-매트릭스 정렬을 제8a도 내지 제8c8c에 도시하였으며 ; GSE-C와의 상동 관계를 대조군으로서 도시하였다 (제8d도). 안티-khcs GSE에 상응하는 부분을 브래킷으로 도시하였다. Khcs 유전자는 사람 유전자와 가장 유사하며(97% 아미노산 동일성), 이는 사람 KHC(KHCS) 유전자가 마우스 khcs와 기능적으로 동등함을 제시하는 것이다. 이러한 정렬을 또한 안티-khcs GSE가 상이한 키네신 사이에서 가장 고도로 분기된 지역에 상응함을 보여준다.Human [Navone et al., 1992, J. Cell. Biol. 117: 1263-1275, mouse [Kato, 1991, J,. Neurosci, 2: 704-711] and Drosophila [McDonald & Goldstein, 1990, Cell 61: 991-1000] show dot-matrix alignment of the sequenced portion of the khcs protein with KHC protein already cloned. Shown in; Homology with GSE-C is shown as a control (Figure 8d). The parts corresponding to the anti-khcs GSE are shown in brackets. The Khcs gene is most similar to the human gene (97% amino acid identity), suggesting that the human KHC (KHCS) gene is functionally equivalent to mouse khcs. This alignment also shows that anti-khcs GSEs correspond to the most highly diverged regions between different kinesins.

[실시예 6]Example 6

불규칙 단편 KHCS cDNA 레트로바이러스 라이브러리의 발생 및 KHCS-유도된 GSE의 단리Development of Irregular Fragment KHCS cDNA Retrovirus Library and Isolation of KHCS-Induced GSE

상기 실시예 5에서 기술된 바와 같이, 쥐과동물 khcs 유전자는 네이본 등의 문헌 [1992, J. Cell Biol. 117: 1263-1275]에 기술된 사람 KHC(또는 KHCS) 유전자와 매우 유사하다. 이들 유전자의 기능적 동등성은 또한 KHCS mRNA의 수준이 에토포시드 내성에 대해 선택된 사람 세포에서 감소된다는 관찰에 의해 제시된다 (실시예 8 참조). 결로적으로, 사람 KHCS 유전자가 마우스 khcs와 동등한 기능을 나타냄을 결정하기 위해, 사람 KHCS cDNA의 임의의 불규칙 단편이 에토포시드-내성 GSE로서 작용할 수 있는지를 결정하였다.As described in Example 5, murine khcs genes are described by Navon et al., 1992, J. Cell Biol. 117: 1263-1275, very similar to the human KHC (or KHCS) gene described. Functional equivalence of these genes is also shown by the observation that the level of KHCS mRNA is reduced in human cells selected for etoposide resistance (see Example 8). Condensedly, to determine that the human KHCS gene exhibited the equivalent function as mouse khcs, it was determined whether any irregular fragment of human KHCS cDNA could act as an etoposide-resistant GSE.

전장 사람 KHCS cDNA(길이 2.9 kb. 샌프란시스코 캘리포니아 대학의 알. 발레 박사(Dr. R. Vale)에 의해 제공됨)의 불규칙 DNAasel-발생 단편의 라이브러리를 본질적으로, 하기의 변형과 함께 제9a도에 예시된 프로토콜을 사용하여, 토포이소머라이제II cDNA에 대해서 상기에 기술된 바와 같이 생성시켰다 [참조 : 본원에 참고문헌으로 인용된 공동계류중인 미국 특허 출원 제08/033,086호의 실시예 1]. 특히, 1개 대신에 2개의 합성 어댑터를 DNAasel-발생된 cDNA 단편과의 결찰에 사용하였다. 3개의 ATG 코돈을 포함하는 1개의 어댑터는 Hindlll 클로닝 자리를 함유하였다 (제9b도). 나머지 어댑터는 3개의 판독 프레임 모두에서 번역 중단 코돈을 가지며, Clal 클로닝 자리를 함유하였다 (제9b도). 2개의 어댑터의 등몰량 혼합물과 결찰시킨 후, 첫번 째 및 두번 째 어댑터의 센스 및 앤티센스 가닥을 각각 사용하여 PCR에 의해 cDNA 단편을 증폭시켰다. PCR 생성물을 Clal 및 Hindlll로 절단시키고, pLNCX 플라스미드의 상응하는 자리로 클로닝시켰다. 클로닝 방법의 이러한 변형은 레트로바이러스 벡터로 클로닝시킨 후에 cDNA 인서트의 단부에서 전환된 반복체의 형성을 방지한다.A library of random DNAasel-generating fragments of full-length human KHCS cDNA (length 2.9 kb. Dr. R. Vale, University of California, San Francisco) is illustrated essentially in FIG. 9A with the following modifications. Protocol was used to generate topoisomerase II cDNA as described above (Example 1 of co-pending US patent application Ser. No. 08 / 033,086, incorporated herein by reference). In particular, two synthetic adapters instead of one were used for ligation with DNAasel-generated cDNA fragments. One adapter containing three ATG codons contained the Hindlll cloning site (Figure 9b). The remaining adapters had translation stop codons in all three reading frames and contained Clal cloning sites (Figure 9b). After ligation with an equimolar mixture of two adapters, cDNA fragments were amplified by PCR using the sense and antisense strands of the first and second adapters, respectively. PCR products were cleaved with Clal and Hindlll and cloned into the corresponding sites of the pLNCX plasmid. This modification of the cloning method prevents the formation of converted repeats at the ends of the cDNA insert after cloning into retroviral vectors.

20,000개의 독립적 인서트 함유 클론의 플라스미드 라이브러리를 얻고, 인산칼슘 침전 기술을 사용하여 에코트로프 패키징 세포로 형질전환시켰다. 일시적으로 형질전환된 세포에 의해 방출된 바이러스를 사용하여, 쥐과동물 에코트로프 수용체 [Albritton et al., 1989, Cell 57: 659-666]를 발현시키고 에코트로프 레트로바이러스 [클리블랜드 클리닉 파운데이션(Cleveland Clinic Foundation)의 지. 알. 스타크 박사(Dr. G. R. Stark)에 의해 제공됨] 에 감염되기 쉬운 플라스미드에 의해 형질전환시킨 사람 HT1080 섬유육종 세포주의 유도체인 HT1080/pJET-2TGH 세포, 클론 2를 감염시켰다. 감염 및 G418 선택 후, 이들 세포(이후, HT1080/ER로서 언급됨)를 100㎜ 플레이트당 10⁵개의 세포로 평판배양시키고, 여러 농도의 에토포시드(200-500ng/mL) 중에서 12일 동안 배양시켰다. 약제를 제거한 후, 세포를 7일 이상동안 약제비함유 배지에서 성장시켰다. 이 시점에서, 플레이트의 일부를 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 착색하여, 생존 콜로니의 수를 결정하였다 (제10도). 제10도에 예시된 바와 같이, 250 ng/mL의 에토포시드의 약제농도에서는, GSE-함유 세포를 함유하는 플레이트 중의 약 100배 이상 더 많은 콜로니와 비교하여, 대조 플레이트에는 단지 몇몇의 콜로니만이 존재하였다.A plasmid library of 20,000 independent insert containing clones was obtained and transformed into Ecotrope packaging cells using calcium phosphate precipitation techniques. Using the virus released by the transiently transformed cells, the murine ecotrop receptor [Albritton et al., 1989, Cell 57: 659-666] was expressed and the ecotrop retrovirus [Cleveland Clinic Foundation] )will. egg. Provided by Dr. GR Stark] was infected with clone HT1080 / pJET-2TGH cells, a derivative of the human HT1080 fibrosarcoma cell line, transformed by a plasmid susceptible to infection. After infection and G418 selection, these cells (hereinafter referred to as HT1080 / ER) are plated at 10 ⁵ cells per 100 mm plate and incubated for 12 days in various concentrations of etoposide (200-500 ng / mL) I was. After drug removal, cells were grown in drug free medium for at least 7 days. At this point, a portion of the plate was fixed and stained with crystal violet to determine the number of viable colonies (Figure 10). As illustrated in FIG. 10, at a drug concentration of 250 ng / mL etoposide, only a few colonies are present in the control plate, compared to about 100 times more colonies in the plate containing the GSE-containing cells. Was present.

유사한 실험에서, 팩키징 세포의 바이러스-생성 혼합물을 유사한 에토포시드 선택 처리하였다. 시험된 모든 약제농도에서, 대조구 세포 개체군에서보다 GSE-운반 세포에서의 에토포시드 처리에서 더 많은 콜로니가 생존하였다.In similar experiments, virus-producing mixtures of packaging cells were subjected to similar etoposide selection treatment. At all drug concentrations tested, more colonies survived etoposide treatment in GSE-carrying cells than in control cell populations.

결과는 KHCS cDNA의 불규칙 단편의 레트로바이러스 라이브러리가 사람 세포에서 약제내성을 유도하는 많은 GSE를 함유함을 보여주었으며, 이는 사람 KHCS가 약제내성과 관련됨을 확인하는 것이다. 이들 GSE 중 일부는 쥐과동물 khcs 유전자로부터 원래의 단일 GSE의 약제내성의 선택성 표지로서 더욱 적합한 것으로 여겨진다. 이러한 에토포시드 내성 세포로부터 단리된 바이러스는 다중 키네신-유도된 약제내성 부여 GSE의 수집물을 나타내며, 이의 다중성은 그 자체로 본 발명의 일면이며, 본원에 기술된 바와 같이, 화학치료제를 포함하는 DNA 손상제에 대한 내성을 부여하는데에 유용하다.The results showed that the retroviral library of irregular fragments of KHCS cDNA contained many GSEs that induce drug resistance in human cells, confirming that human KHCS is associated with drug resistance. Some of these GSEs are considered more suitable as selectable markers of drug resistance of the original single GSE from the murine khcs gene. Viruses isolated from such etoposide resistant cells represent a collection of multiple kinesin-derived drug-resistant imparting GSEs, the multiplicity of which is itself an aspect of the invention and, as described herein, includes a chemotherapeutic agent Useful for conferring resistance to DNA damaging agents.

[실시예 7]Example 7

항-khcs GSE의 다중 복사체를 운반하는 세포 개체군의 생성Generation of Cell Populations Carrying Multiple Copies of Anti-khcs GSE

에코트로프성 및 암포트로프성 패키징 세포의 1:1 혼합물을 표준 인산칼슘 공정을 사용하여 항-khcs GSE를 운반하는 레트로바이러스 벡터 pLNCX에 의해 형질전환시켰다. 2주 후에, G418 내성 NIH 3T3 콜로니의 형성에 의해 측정된 바이러스 역가는 "핑-퐁" 감염의 결과로서 mL당 10⁶감염단위를 초과하였다 [참조 : Bodine et al., 1990, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738-3742]. 상기 바이러스-함유 상층액을 사용하여 NIH 3T3 세포를 12시간 간격으로 10회 감염시켰다. 동일한 공정에 의해 수득한 인서트-부재 벡터 바이러스와 유사하게 대조구 세포를 감염시켰다. G418 선택은 100%의 NIH 3T3 세토가 바이러스 감염됨을 보여주었다. 감염된 세포로부터의 DNA를 바이러스 특이적 프로브에 의한 서던 블롯 혼성화에 의해 분석하였다. 이 분석은 감염된 세포가 일체화된 프로바이러스의 다중 복사체를 함유함을 보여주었다.1: 1 mixtures of ecotropic and amphoteric packaging cells were transformed by retroviral vector pLNCX carrying anti-khcs GSE using standard calcium phosphate processes. After two weeks, virus titers measured by the formation of G418 resistant NIH 3T3 colonies exceeded 10 ⁶ infectious units per mL as a result of "ping-pong" infection. See, Bodine et al., 1990, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738-3742. The virus-containing supernatants were used to infect NIH 3T3 cells 10 times at 12 hour intervals. Control cells were infected similarly to the insert-free vector virus obtained by the same process. G418 selection showed that 100% of NIH 3T3 Seto was virus infected. DNA from infected cells was analyzed by Southern blot hybridization with virus specific probes. This analysis showed that the infected cells contained multiple copies of the integrated provirus.

새로 수득한 다중 감염 NIH 3T3 세포는 감소된 성장율 및 평판배양 효율을 특징으로 한다. 그러나, 수회의 통과 후에, 이들의 성장 파라미터는 대조구 세포와 구별할 수 없게 되며, 이는 개체군으로부터의 느린 성장 세포의 제거를 제시하는 것이다. 이 단계에서, 세포를 냉동시키고, 하기 설명되는 실험용으로 사용하였다.Newly obtained multi-infected NIH 3T3 cells are characterized by reduced growth rate and plate culture efficiency. However, after several passes, their growth parameters are indistinguishable from control cells, suggesting the removal of slow growing cells from the population. In this step, cells were frozen and used for the experiments described below.

[실시예 8]Example 8

항-khcs GSE의 다중 복사체를 운반하는 NIH 3T3 세포의 약제내성양식Drug Tolerance of NIH 3T3 Cells Carrying Multiple Copies of Anti-khcs GSE

실시예 7에 기술된 감염된 세포 개체군을 성장 억제검정에 의해 수개의 항암제에 대한 내성에 대해 분석하였다. 이 검정에서는, 웰 1개당 10⁴개의 세포를 12-웰 플레이트에 평판배양시키고, 4일 동안 증가하는 농도의 상이한 약제에 노출시켰다. 상대적 세포의 수를 메틸렌 블루 염색 검정법에 의해 측정하였다 [참조 : Perry et al., 1992, Mutation Res. 276: 189-197].Infected cell populations described in Example 7 were analyzed for resistance to several anticancer agents by growth inhibition assay. In this assay, 10 ⁴ cells per well were plated in 12-well plates and exposed to increasing concentrations of different agents for 4 days. Relative cell numbers were determined by methylene blue staining assay [Perry et al., 1992, Mutation Res. 276: 189-197.

비선택 불균일 세포 개체군으로 수행하는 경우에 이 검정의 상대적 불감성에도 불구하고, 항-khcs GSE를 운반하는 바이러스에 의한 감염은 에토포시드 및 암사크린, 및 더 작은 정도로는, 아드리아마이신, 캄프토테신 및 시스플라틴의 정균 작용에 대한 저항성의 현저한 증가를 유도하였다 (제11도). 이들 약제는 모두 상이한 메카니즘에도 불구하고 DNA 손상을 유도하였다. 동일한 검정 조건하에서, 콜히친 또는 악티노마이신 D에 의해서는 내성의 증가가 관찰되지 않았다 (제11도).Despite the relative insensitivity of this assay when performed with non-selective heterogeneous cell populations, infection with viruses carrying anti-khcs GSE is not limited to etoposide and amsacrine, and to a lesser extent, adriamycin, campto A significant increase in resistance to bacteriostatic action of tessin and cisplatin was induced (FIG. 11). All of these agents induced DNA damage despite the different mechanisms. Under the same assay conditions, no increase in resistance was observed with colchicine or actinomycin D (FIG. 11).

안티-khcs에 의해 부여되는 약제내성의 특성을 추가로 특징화시키기 위해, 상기 기술된 단기간 성장 억제검정 후에, 상이한 약제의 정균 작용 및 세포독성 효과 둘 모두를 측정하는 장기간 성장 억제검정을 수행하였다.In order to further characterize the properties of drug resistance conferred by anti-khcs, after the short-term growth inhibition test described above, a long-term growth inhibition test was performed that measures both bacteriostatic and cytotoxic effects of different drugs.

이들 검정법은 약제의 존재하에서 4일 동안 세포를 인큐베이팅 시킨 후에, 약제의 부재하에 2일 또는 6일 동안 인큐베이팅시켜, 계획적으로 세포를 사멸시킴으로써 수행되며, 이는 종종 약제유도 억제로부터의 회복과 관련된다 [참조 : Kung et al., 1990, Cancer Res. 50: 7307-7317]. 이들 검정은 GSE-운반 세포가 에토포시드 및 아드리아마이신에 대해서는 내성이 있지만, 시스플라틴, 캄프토테신 또는 악티노마이신 D에 대해서는 내성이 없음을 보여주었다. 또한, GSE-운반 세포는 콜히친 및 빈블라스틴에 대해 과민감성이며, 이러한 과민감성은 검정 기간이 증가할수록 더욱 더 분명해지는 것으로 밝혀졌다.These assays are performed by incubating cells for 4 days in the presence of a medicament, followed by incubation for 2 or 6 days in the absence of the medicament, and deliberately killing the cells, often associated with recovery from drug induction inhibition [ See, Kung et al., 1990, Cancer Res. 50: 7307-7317. These assays showed that GSE-carrying cells are resistant to etoposide and adriamycin, but not to cisplatin, camptothecin or actinomycin D. In addition, GSE-carrying cells are hypersensitive to colchicine and vinblastine, and this hypersensitivity has been found to become more and more apparent as the assay period increases.

따라서, 제12도에 도시된 실험에서, 항-khcs GSE를 함유하는 NIH 3T3 세포 및 GSE를 함유하지 않는 대조구 세포를 배양 접시 1개당 2 x 10⁴개의 밀도로 평판배양시키고, 콜히친 또는 빈블라스틴의 농축물 중에서 5일동안 성장시켰다. 이후, 세포를 고정시키고, 착색시킨 후, 생존한 세포의 수를 결정하고, 약제부재하에서의 세포 성장의 백분율로서 나타내었다. 그 결과, 이들 세포내에서의 항-khcs GSE의 발현이 콜히친 및 빈블라스틴 둘 모두에 대한 과민감성을 동반함이 명백히 입증되었다.Thus, in the experiment shown in FIG. 12, NIH 3T3 cells containing anti-khcs GSE and control cells without GSE were plated at a density of 2 × 10 ⁴ per culture dish and colchicine or vinblastine Was grown for 5 days. After the cells were fixed and stained, the number of viable cells was determined and expressed as percentage of cell growth in the absence of drug. As a result, it was clearly demonstrated that the expression of anti-khcs GSE in these cells was accompanied by hypersensitivity to both colchicine and vinblastine.

단기간 및 장기간이 약제검정으로 얻어진 결과들 사이의 불일치를 추가로 조사하기 위해, 에토포시드 250 ng/mL, 캄프토테신 20 ng/mL 및 콜히친 40 ng/mL에 의한 처리 도중 및 후에 세포 성장의 동태를 분석하였다.In order to further investigate the discrepancy between the results obtained with this short-term and long-term drug assay, cell growth during and after treatment with 250 ng / mL etoposide, 20 ng / mL camptothecin and 40 ng / mL colchicine. Dynamics were analyzed.

이들 실험(제13도에 도시됨)에서, NIH 3T3 세포를 5일 동안 상응하는 약제로 처리한 후, 추가로 6일 동안 약제의 존재 또는 부재하에 인큐베이팅시켰다. 선택된 약제농축물은 성장을 억제시키지만, 약제의 지속적인 존재하에서는 세포 사멸을 거의 검출할 수 없었다. 약제노출 11일 후, 대조구 세포의 에토포시드- 또는 캄프토테신-처리된 개체군에서의 총 세포수는 약제노출 5일 후의 세포수보다 거의 적지 않았지만, 콜히친-처리된 대조구 세포 개체군에서는 느린 세포 성장을 여전히 검출할 수 있었다. 약제를 5일 후에 제거하는 실험에서, 세포 성장은 3개으 약제모두에 대해 초기에 활성화되었다. 그러나, 약제의 부재하에 성장시킨 지 약 2일 후에, 에토포시드 또는 캄프토테신으로 처리된 세포의 수는 과다한 세포 사멸로 인해 감소하여, 약제의 부재하에 인큐베이팅시킨 세포 개체군에서의 최종 세포수는 콜히친 또는 캄프토테신의 존재하에 지속적으로 유지시킨 세포에서와 실질적으로 동일하다. 대조적으로, 콜히친으로 사전처리된 세포는 약제로부터 제건된 후에 제함된 세포 사멸만을 일으켜서, 약제로부터 제거 2일 후에 세포 성장을 비교적 미소하게 감소시키고, 콜히친 중에 지속적으로 유지시킨 것과 비교하여 약제로부터 제거된 개체군 중의 총 세포수를 크게 증가시킨다 (제13도).In these experiments (shown in Figure 13), NIH 3T3 cells were treated with the corresponding agents for 5 days, followed by incubation with or without the agent for 6 days. Selected drug concentrates inhibited growth but hardly detect cell death in the presence of drug. After 11 days of drug exposure, the total number of cells in the etoposide- or camptothecin-treated population of control cells was little less than the number of cells after 5 days of drug exposure, but slower cell growth in the colchicine-treated control cell population. Could still be detected. In the experiment with the drug removed after 5 days, cell growth was initially activated for all three drugs. However, after about 2 days of growth in the absence of the drug, the number of cells treated with etoposide or camptothecin decreased due to excessive cell death, resulting in a final cell count in the cell population incubated in the absence of the drug. It is substantially the same as in cells sustained in the presence of colchicine or camptothecin. In contrast, cells pretreated with colchicine only resulted in cell death that was restricted after being removed from the drug, resulting in a relatively slight reduction in cell growth two days after removal from the drug and removal from the drug as compared to the sustained in colchicine. Significantly increase the total number of cells in the population (FIG. 13).

항-khcs GSE의 발현은 이들 약제에 의해 유도된 성장 억제및 재생관련 세포 사멸에 대해 상이한 효과를 나타내었다. 에토포시드로 처리된 세포에서, 항-khcs는 지속적으로 노출시킨 지 5 내지 11일 후에 약제의 성장 억제작용을 동일하게 비교적 작은 정도로 감소시켰다. 또한, 항-khcs GSE는 에토포시드 억제로부터 방출된 개체군에서 세포 사멸의 양을 감소시켰다.Expression of anti-khcs GSE showed different effects on growth inhibition and regeneration-related cell death induced by these agents. In cells treated with etoposide, anti-khcs reduced the growth inhibition of the drug to an equally small degree after 5-11 days of continuous exposure. In addition, anti-khcs GSE reduced the amount of cell death in the population released from etoposide inhibition.

결과적으로, 상기 GSE에 의해 부여된 에토포시드 내성의 증가는 지속적 노출 조건하에서보다는 약제로부터 방출된 후에 훨씬 더 현저해졌다 (제13도). 캄프토테신으로 처리된 세포에서, GSE는 약제의 성장 억제효과를 약간 감소시켰으며, 이는 노출 5일 후에 더욱 현저해지지만, 지속적인 노출 11일 후에는 무시해도 좋을만한 수준으로 감소하였다. 노출 5일 후의 성장 억제의 감소는 약제로부터 제거된 후에 세포 사멸의 약간의 증가를 동반하여, GSE는 캄프토테신 내성의 현저한 장기간의 차이를 발생시키지 않게 된다.As a result, the increase in etoposide resistance conferred by the GSE became even more pronounced after release from the drug than under sustained exposure conditions (FIG. 13). In cells treated with camptothecin, GSE slightly reduced the growth inhibitory effect of the drug, which became more pronounced after 5 days of exposure, but was negligible after 11 days of continuous exposure. The reduction in growth inhibition after 5 days of exposure is accompanied by a slight increase in cell death after removal from the drug, so that GSE does not produce a significant long term difference in camptothecin resistance.

콜히친으로 처리된 개체군에서, 항-khcs GSE는 세포를 약제의 성장 억제효과에 대해 더욱 민감하게 만들며 ; 이러한 효과는 노출을 연장시킴으로써 증가하고, 5일 후에 또는 콜히친 중에서 지속적으로 유지시킨 후에 약제로부터 방출된 개체군에서 동등하게 명백해졌다.In a population treated with colchicine, anti-khcs GSE makes the cells more sensitive to the inhibitory effect of the drug; This effect was increased by prolonging exposure and became equally evident in the population released from the drug after 5 days or after sustained in colchicine.

상기 실험의 결과는 항-khcs GSE가 상이한 DNA-손상제의 정균 작용을 억제함으로써 작용함을 제시하였다. 또한, 상기 GSE는 다른 (캄포토테신) DNA-손상제가 아닌 일부 (에토포시드) DNA-손상제로 처리된 세포에서 약제로부터 방출된 후에 발생하는 계획적 세포 사멸의 정도를 감소시키는 것으로 보인다.The results of this experiment suggested that anti-khcs GSE acts by inhibiting the bacteriostatic action of different DNA-damaging agents. In addition, the GSE appears to reduce the degree of planned cell death that occurs after release from the drug in cells treated with some (etoposide) DNA-damaging agent but not other (camptothecin) DNA-damaging agents.

항-khcs GSE를 함유하는 세포가 콜히친의 정균 작용에 과민감하게 된다는 발견은 잠재적으로 상당한 치료적 관련성을 갖는다. 키네신의 GSE-조정 억제된 세포에서, 항-미세관 제제인 콜히친에 대해 관찰된 과민감성은 미세관을 따라 다양한 구조를 이동시키고, 서로에 대한 미세관의 슬라이딩, 및 미세관의 결합 및 분해에 수반될 수 있는 키네신의 본질적 기능과 기계적으로 관련된 것으로 여겨진다. 항-미세관 제제에 대한 감응성에 대한 항-khcs GSE의 현저한 효과는 또한, 상기 GSE가 세포에서 일반적 키네신 기능에 영향을 미치며, 키네신의 특정 약제반응 특이적 이소형태에 국한되지 않음을 시사한다. 본 발명자들은 KHCS 유전자의 하향조절이 사람 종양 세포에서 약제내성의 본래 메카니즘을 나타냄을 입증하였기 때문에 (실시예 11 참조), 콜히친에 대한 과민감성은 사람의 암에 이러한 유형의 내성을 극복하기 위한 시도를 제공한다.The discovery that cells containing anti-khcs GSE become sensitive to the bacteriostatic action of colchicine has potentially significant therapeutic relevance. In GSE-modulated suppressed cells of kinesin, the hypersensitivity observed for colchicine, an anti-microtubule agent, shifts the various structures along the microtubules, sliding the microtubules to each other, and binding and disassembly of the microtubules. It is believed to be mechanically related to the essential function of kinesin that may be involved. The marked effect of anti-khcs GSE on sensitivity to anti-microtubule agents also suggests that GSE affects general kinesin function in cells and is not limited to specific drug response specific isoforms of kinesin. Since we have demonstrated that downregulation of the KHCS gene represents the inherent mechanism of drug resistance in human tumor cells (see Example 11), hypersensitivity to colchicine attempts to overcome this type of resistance to human cancer. To provide.

[실시예 9]Example 9

항-키네신 GSE의 세포 효과의 평가Assessment of Cellular Effects of Anti-Kinesin GSE

항-khcs GSE를 함유하는 바이러스를 일차 마우스 배 섬유아세포(MEF)의 수명을 증가시키기 위한 능력에 대해 시험하였다. MEF를 표준 트립신 첨가 방법에 의해 생후 10일 된 마우스 배로부터 준비하고, 노화된 세포를 위기 전에 여러 경로로 냉동시켰다. 위기 2주 전에, 노화된 MEF를 인서트의 부재하에 또는 항-khcs의 존재하에 LNCX 벡터를 함유하는 재조합 레트로바이러스로 감염시켰다. 제14도는 위기 2주 후의 MEF 세포 콜로니를 도시한 것이다. 비감염 MEF 세포, 또는 대조 LNCX 바이러스로 감염된 세포와 비교하여, 항-khcs로 감염된 세포는 위기를 극복한 세포의 비율의 큰 증가를 보여주었다. 항-khcs 바이러스로 감염된 위기후 세포는 신생물 형질전환의 현미경적 가시화 특징을 나타내지 않았다. 이들 결과는 항-khcs가 일반적인 노화 섬유아세포의 불멸화를 촉진시킴을 시사하는 것이다. 또한, 이들 결과는 키네신-S의 일반적인 기능이 특정 세포독성 제제에 대한 노출후에 또는 세포 노화 동안 발생하는 계획적인 세포 사멸의 유도와 관련될 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 이들 결과는 화학치료제에 대한 내성을 부여하는 GSE의 단리가 세포 성장 조절에 수반되는 세포 유전자 및 방법을 통찰할 수 있게 함을 시사하는 것이다.Viruses containing anti-khcs GSE were tested for their ability to increase the lifespan of primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs). MEFs were prepared from 10-day-old mouse embryos by standard trypsin addition method, and aged cells were frozen by several routes before crisis. Two weeks before the crisis, aged MEFs were infected with recombinant retroviruses containing LNCX vectors in the absence of inserts or in the presence of anti-khcs. Figure 14 shows MEF cell colonies two weeks after crisis. Compared to uninfected MEF cells, or cells infected with control LNCX virus, cells infected with anti-khcs showed a large increase in the percentage of cells that overcome the crisis. Post-crisis cells infected with anti-khcs virus did not exhibit microscopic visualization characteristics of neoplastic transformation. These results suggest that anti-khcs promotes immortalization of normal aging fibroblasts. These results also suggest that the general function of kinesin-S may be associated with the induction of deliberate cell death that occurs after exposure to certain cytotoxic agents or during cellular aging. These results also suggest that isolation of GSE conferring resistance to chemotherapeutic agents provides insight into cellular genes and methods involved in cell growth regulation.

[실시예 10]Example 10

사람 노화 섬유아세포에 대한 마우스 항-khcs GSE의 생물학적 효과Biological Effects of Mouse Anti-khcs GSE on Human Aging Fibroblasts

일차 마우스 배 섬유아세포의 불멸화를 촉진하기 위한 실시예 4에 기술된 항-khcs GSE의 능력(실시예 9에서 설명됨)은 키네신-S가 정상 마우스 섬유아세포의 불멸화를 억제함으로써 종양 억제제로서 작용할 수 있음을 시사하는 것이다. 이러한 유전자가 사람 세포 내에서도 동일한 역학을 할 수 있는 지를 결정하기 위해, 일차 사람 섬유아세포의 수명에 영향을 미치는 항-khcs GSE의 능력을 조사하였다.The ability of the anti-khcs GSE described in Example 4 to promote immortalization of primary mouse embryonic fibroblasts (described in Example 9) allows kinesin-S to act as a tumor suppressor by inhibiting immortalization of normal mouse fibroblasts. It suggests that there is. To determine whether these genes could perform the same dynamics in human cells, the ability of anti-khcs GSE to influence the lifespan of primary human fibroblasts was examined.

사람 피부로부터 유도된 일차 사람 섬유아세포를 에이징 셀 리포지터리 오브 더 내셔널 인스티튜츠 오브 에이징(Aging Cell Repository of the National Institutes of Aging)으로부터 입수하였다. 세포를 배양기에서의 정상 사람 피부 섬유아세포 성장을 보충하기 위해 일반적으로 사용되는 아미노산 및 비타민 농도의 2배를 사용하여 보충한 20%의 소 태아 혈청을 갖는 DMEM 중에서 성장시켰다. 제5 경로에서의 세포는 대조 pLNCX 바이러스 또는 마우스 안티-khcs GSE를 함유하는 바이러스(상기 실시예 3에서 기술된 바와 같이 생성시킴)로 감염시켰다. 4개의 경로 후에, 대조구 세포를 위험하게 되지만, GSE-함유 세포는 계속해서 성장하고(제15도), 5회 이상의 추가의 경로에서 매우 오랫동안 생존하였다. 이들 결과는 본 발명의 항-khcs GSE가 일차 사람 섬유아세포의 수명을 연장시킬 수 있음을 나타내는 것이며, 이는 KHCS가 사람 세포에서 잠재적인 종양 억제제임을 시사하는 것이다.Primary human fibroblasts derived from human skin were obtained from Aging Cell Repository of the National Institutes of Aging. Cells were grown in DMEM with 20% fetal bovine serum supplemented using twice the amino acid and vitamin concentrations commonly used to supplement normal human skin fibroblast growth in the incubator. Cells in the fifth pathway were infected with control pLNCX virus or virus containing mouse anti-khcs GSE (created as described in Example 3 above). After four pathways, control cells are at risk, but GSE-containing cells continue to grow (Figure 15) and survive very long in five or more additional pathways. These results indicate that the anti-khcs GSE of the present invention can extend the lifespan of primary human fibroblasts, suggesting that KHCS is a potential tumor inhibitor in human cells.

[실시예 11]Example 11

약제내성의 자연 발생 메카니즘에서 감소된 khcs 유전자 발현의 역할의 평가Assessment of the role of reduced khcs gene expression in naturally occurring mechanisms of drug resistance

감소된 khcs 유전자 발현이 약제내성의 자연 발생 메카니즘과 관련되는지를 시험하기 위해, cDNA-PCR에 의해 khcs mRNA 수준을 측정하기 위한 검정을 개발하였다. 이 검정은 mdr-l 유전자 발현을 결정하기 위한 누난(Noonan) 등의 문헌[1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7160-7164]에 기술된 정량적 검정의 변형된 검정이다. 올리고누클레오티드 프라이머는 하기 서열을 갖는다 :To test whether reduced khcs gene expression is associated with a naturally occurring mechanism of drug resistance, an assay was developed to measure khcs mRNA levels by cDNA-PCR. This assay is described by Noonan et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7160-7164, a modified assay of the quantitative assay described. Oligonucleotide primers have the following sequence:

AGTGGCTGGAAAACGAGCTA (SEQ. ID. No. 5) 및AGTGGCTGGAAAACGAGCTA (SEQ.ID.No. 5) and

CTTGATCCCTTCTGGTTGAT (SEQ. ID. No 6).CTTGATCCCTTCTGGTTGAT (SEQ. ID. No 6).

이들 프라이머를 사용하여 항-khcs GSE에 상응하는 마우스 khcs cDNA의 327 bp 세그멘트를 증폭시켰다. 이들 프라이머는 마우스 cDNA 템플레이트를 효과적으로 증폭시켰지만, 게놈 DNA는 증폭시키지 않았으며, 이는 이들이 게놈 DNA에서 적어도 하나의 인트론에 연결되어 있음을 시사하는 것이다. 이들 프라이머를 사용하여, 본 발명자들은 khcs mRNA가 신장, 간 또는 비장에서 보다 마우스 근육 조직에서 더 높은 수준으로 발현됨을 결정하였다.These primers were used to amplify 327 bp segments of mouse khcs cDNA corresponding to anti-khcs GSE. These primers effectively amplified mouse cDNA templates but did not amplify genomic DNA, suggesting that they are linked to at least one intron in genomic DNA. Using these primers, we determined that khcs mRNA was expressed at higher levels in mouse muscle tissue than in kidney, liver or spleen.

또 다른 실험에서는, 네이본 등의 문헌 [1992, J. Cell Biol. 117 : 1263-1275]에 발표된 보고된 사람 KHC 서열을 기초로 하여, 사람 KHCS cDNA의 동종 세그멘트를 증폭시키는 한쌍의 프라이머를 선택하였다. 이들 프라이머의 서열은 하기와 같으며, 이들은 327 bp cDNA 단편을 증폭시켰다 :In another experiment, Navon et al., 1992, J. Cell Biol. 117: 1263-1275, based on the reported human KHC sequence, which was published in 117: 1263-1275, a pair of primers were selected that amplify homologous segments of human KHCS cDNA. The sequences of these primers are as follows and they amplified the 327 bp cDNA fragment:

AGTGGCTTGAAAATGAGCTC (SEQ. ID. No. : 7) 및AGTGGCTTGAAAATGAGCTC (SEQ.ID.No .: 7) and

CTTGATCCCTTCTGGTAGATG (SEQ. ID. No. : 8).CTTGATCCCTTCTGGTAGATG (SEQ. ID. No.: 8).

이들 프라이머를 사용하여, 자발적으로 수득된 에토포시드 내성에 대해 각각 선택된 사람 힐러 세포의 수개의 독립적으로 단리된 개체군에서의 KHCS 유전자 발현의 변화에 대해 시험하였으며 ; β-마이크로글보불린 cDNA 서열을 내부 대조군으로서 증폭시켰다. 제16도는 하기 개체군에 대한 cDNA-PCR 검정의 결과를 나타내는 것이다 : CX(0), LNCX 벡터 바이러스로 감염되고 G418에 의해 선택된 힐러 개체군 ; CX(200), 200 ng/㎖ 에토포시드에 대한 내성에 대해 선택된 동일한 세포 ; Σ11(O), 6(O) 및 Σ21(O), 본원에 참고문헌으로서 인용된 공동계류중인 미국 특허 출원 제08/033,086호의 실시예 1에서 기술된 바와 같은 토포이소머라아제α cDNA로부터 유도되는 상이한 GSE를 함유하는 재조합 레트로바이러스에 의한 힐러 세포의 감염 후에 얻어지고 G418에 의해 선택된 개체군 ; Σ11(1000), 6(1000) 및 Σ21(1000), 1㎍/㎖ 에토포시드에 대한 내성에 대해 선택된 동일한 개체군. 제16도에 도시된 바와 같이, khcs 유전자에 대해 특이적인 PCR 생성물의 수율은 대조세포에서 보다 에포시드-선택된 개체군 각각에서 상당히 더 낮다. 이러한 결과는 khcs 유전자 발현의 감소가 약제내성에 대한 공통적 자연발생 메카니즘임을 시사하는 것이다.These primers were used to test for changes in KHCS gene expression in several independently isolated populations of human healer cells each selected for spontaneously obtained etoposide resistance; β-microglobobulin cDNA sequence was amplified as an internal control. FIG. 16 shows the results of the cDNA-PCR assay for the following populations: CX (0), Healer population infected with LNCX vector virus and selected by G418; CX 200, same cell selected for resistance to 200 ng / ml etoposide; Σ11 (O), 6 (O) and Σ21 (O), derived from topoisomeraseα cDNA as described in Example 1 of co-pending US patent application Ser. No. 08 / 033,086, incorporated herein by reference. Populations obtained after infection of healer cells by recombinant retroviruses containing different GSEs and selected by G418; The same populations selected for resistance to Σ 11 (1000), 6 (1000) and Σ 21 (1000), 1 μg / ml etoposide. As shown in FIG. 16, the yield of PCR products specific for the khcs gene is significantly lower in each of the eposid-selected populations than in control cells. These results suggest that decreased khcs gene expression is a common spontaneous mechanism for drug resistance.

[실시예 12]Example 12

진단적 검정Diagnostic test

상기 실시예에서 나타난 결과는 에토포시드와 같은 특정 화학치료제에 대한 내성의 수준과 상관된 키네신 중쇄 유전자 발현의 널리 특징화된 수준을 갖는 생체외에서의 표준화된 세트의 세포주와 비교하여, 암 환자의 종양 세포에서 키네신 유전자의 발현 정도를 결정하기 위한 진단적 검정의 이용성을 시사한다. 하나의 이러한 표준화된 세트의 세포주는 실시예 11에 기술된 힐러 세포주를 포함한다. 대안적으로, 상이하고 조직 특이적인 표준화된 세트의 세포주를, 예를 들어 만성 골수 백혈병 환자를 평가하기 위한 사람 K562 세포, 또는 급성 전골수 백혈병 환자를 평가하기 위한 사람 HL60 세포를 사용하여, 평가하려는 각각의 세포 유형에 대한 약제선택에 의해 개발하였다.The results shown in the above examples were compared to a standardized set of cell lines in vitro with a widely characterized level of kinesin heavy chain gene expression correlated with the level of resistance to certain chemotherapeutic agents such as etoposide. It suggests the availability of diagnostic assays to determine the degree of expression of kinesin genes in tumor cells. One such standardized set of cell lines includes the healer cell line described in Example 11. Alternatively, a different and tissue specific standardized set of cell lines may be evaluated, for example, using human K562 cells to assess patients with chronic myelogenous leukemia, or human HL60 cells to assess patients with acute promyelocytic leukemia. It was developed by drug selection for each cell type.

키네신에 대한 검정은 특정 항암 치료 양생법에 의한 암환자의 치료의 적합성을 평가한다. 키네신을 과소 발현시키는 종양 세포를 갖는 환자는 방사선 및 에토포시드, 캄프토테신, 시스플라틴 및 아드리아마이신과 같은 화학치료제를 포함하는 DNA 손상제에 의한 치료로는 치료되지 않을 수 있다. 그러나, 이러한 환자들은 콜히친, 콜세미드, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 빈데신과 같은 항-미세관 제제에 의한 치료에 특히 반응성이다. 다른 한편으로는, 키네신을 과발현시키는 종양 세포를 갖는 환자는 예를 들어, DNA 손상제에 의한 치료에 반응성일 수 있고, 항-미세관 제제에 의한 치료로는 치료되지 않을 수 있다. 이들 검정은 우선적으로, 치료적 양생법이 시도되어 실패된 후 보다는, 시도 및 실패 전에 이러한 치료적 판단의 기초를 제공한다. 또한, 이러한 검정은 이전에 DNA 손상제, 특히 특정 항암제로는 치료가 어려웠던 환자가 키네신 유전자-조정 약제내성을 DNA 손상제및 항-미세관 제제둘 모두에 대한 교차-내성을 유발시키는 것으로 예상된 약제내성의 또 다른 메카니즘과 구별함으로써 항-미세관 제제를 사용하는 추가의 화학치료로부터 유리할 수 있는 지를 결정하기 위한 기초를 제공한다.The assay for kinesin assesses the suitability of the treatment of cancer patients by specific chemotherapy regimens. Patients with tumor cells that underexpress kinesin may not be treated with radiation and treatment with DNA damaging agents including chemotherapeutic agents such as etoposide, camptothecin, cisplatin and adriamycin. However, these patients are particularly responsive to treatment with anti-microtubule agents such as colchicine, colsemide, vinblastine, vincristine or vindesine. On the other hand, patients with tumor cells overexpressing kinesin can be reactive, for example, with DNA damaging agents, and not with treatment with anti-microtubule agents. These assays first provide the basis for such therapeutic judgment before trials and failures, rather than after therapeutic regimens have been tried and failed. In addition, these assays are expected to cause kinesin gene-modulated drug resistance to cross-resistant to both DNA damaging and anti-microtubule agents in patients previously untreated with certain DNA damaging agents, particularly certain anticancer agents. Distinguishing it from another mechanism of drug resistance provides a basis for determining whether it may benefit from further chemotherapy using anti-microtubule agents.

상기 설명은 본 발명의 특정 실시예를 강조하는 것이며, 이와 동등한 모든 변경 또는 대안이 첨부한 특허청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 범위 내에 있음을 이해해야 한다.It is to be understood that the above description highlights specific embodiments of the invention, and that all such modifications or alternatives are within the spirit and scope of the invention as set forth in the appended claims.

[서열목록][Sequence list]

(1) 일반적인 사항 :(1) General matters:

(i) 출원인 :(i) Applicant:

(A) 성명 : 보오드 오브 트러스티스 오브 유니버시티 오브 일리노이(A) Name: Board of Trusses of University of Illinois

(B) 스트리트 : 352 헨리 어드미니스트레이션 빌딩, 506 사우쓰 라이트 스트리트(B) Street: 352 Henry Administration Building, 506 South Light Street

(C) 도시 : 어바나(C) City: Urbana

(D) 주 : 일리노이(D) State: Illinois

(E) 국가 : 미합중국(E) Country: United States

(F) 우편번호 : 61801(F) ZIP Code: 61801

(G) 전화 :(G) Phone:

(H) 팩스 :(H) Fax:

(ii) 발명의 명칭 : 화학치료제에 대한 감응성을 갖는 키네신(ii) Title of the Invention: Kinesin with sensitivity to chemotherapeutic agents

(iii) 서열의 수 : 8(iii) number of sequences: 8

(iv) 컴퓨터 판독 형태 :(iv) form of computer reading:

(A) 매체 유형 : 플로피 디스크(A) Medium type: floppy disk

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종(B) Computer: IBM PC compatible model

(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS(C) operating system: PC-DOS / MS-DOS

(D) 소프트 웨어 : Patentln Release #1.0, 버전 #1.25(EPO)(D) Software: Patentln Release # 1.0, Version # 1.25 (EPO)

(v) 현재 출원 상황 :(v) Current application situation:

출원번호 :Application Number:

(2) 서열번호 1에 대한 사항(2) Matters concerning SEQ ID NO: 1

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 20 염기쌍(A) Sequence length: 20 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자형 : cDNA(ii) Molecular type: cDNA

(iii) 추정서열 : 아니오(iii) Estimated Sequence: No

(iv) 앤티센스 : 아니오(iv) Antisense: No

(xi) 서열 : 서열번호 1 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1:

(2) 서열번호 2에 대한 사항 :(2) Details about SEQ ID NO:

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 23 염기쌍(A) Sequence length: 23 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1분쇄(C) Number of chains: 1 grinding

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자형 : cDNA(ii) Molecular type: cDNA

(iii) 추정서열 : 아니오(iii) Estimated Sequence: No

(iv) 앤티센스 : 예(iv) Antisense: Yes

(xi) 서열 : 서열번호 2 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2:

CCATCCATCC ATCGATGATT AAACCATCCATCC ATCGATGATT AAA

(2) 서열번호 3에 대한 사항 :(2) Details about SEQ ID NO:

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 327염기쌍(A) Sequence length: 327 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자형 : cDNA(ii) Molecular type: cDNA

(iii) 추정서열 : 아니오(iii) Estimated Sequence: No

(iv) 앤티센스 : 예(iv) Antisense: Yes

(xi) 서열 : 서열번호 3(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3

(2) 서열번호 4에 대한 사항 :(2) Matters concerning SEQ ID NO:

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 2389염기쌍(A) Sequence length: 2389 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자형 :cDNA(ii) molecular type: cDNA

(iii) 추정서열 : 아니오(iii) Estimated Sequence: No

(xi) : 서열 : 서열번호 4 :(xi): sequence: SEQ ID NO: 4:

(2) 서열번호 5에 대한 사항 :(2) Matters concerning SEQ ID NO:

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 ; 22 염기쌍(A) the length of the sequence; 22 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자형 : cDNA(ii) Molecular type: cDNA

(iii) 추정서열 : 아니오(iii) Estimated Sequence: No

(iv) 앤티센스 : 아니오(iv) Antisense: No

(xi) 서열 : 서열번호 5 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 5:

(2) 서열번호 6에 대한 사항 :(2) Details about SEQ ID NO:

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 ; 25 염기쌍(A) the length of the sequence; 25 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자형 : cDNA(ii) Molecular type: cDNA

(iii) 추정서열 : 아니오(iii) Estimated Sequence: No

(iv) 앤티센스 : 예(iv) Antisense: Yes

(xi) 서열 : 서열번호 6 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 6:

(2) 서열번호 7에 대한 사항 :(2) Matters concerning SEQ ID NO:

(i) 서열의 특성(i) the nature of the sequence

(A) 서열의 길이 : 24 염기쌍(A) Sequence length: 24 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자형 : cDNA(ii) Molecular type: cDNA

(iii) 추정서열 : 아니오(iii) Estimated Sequence: No

(xi) 서열 : 서열번호 7 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 7:

(2) 서열번호 8에 대한 사항 :(2) Details on SEQ ID NO: 8

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 서열의 길이 : 21 염기쌍(A) Sequence length: 21 base pairs

(B) 서열의 형 : 핵산(B) Type of sequence: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 분자형 : cDNA(ii) Molecular type: cDNA

(iii) 추정서열 : 아니오(iii) Estimated Sequence: No

(iv) 앤티센스 : 예(iv) Antisense: Yes

(xi) 서열 : 서열번호 8 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 8:

Claims (18)

세포에 1종 이상의 DNA 손상제에 대한 내성을 부여하는 키네신 유전자로부터 유도된 유전 억제요소(GSE)를 확인하는 방법으로서,A method of identifying a genetic inhibitory element (GSE) derived from a kinesin gene that confers resistance to one or more DNA damaging agents in a cell, (a) 키네신 유전자를 코드화시키는 cDNA의 한 세트의 불규칙 단편을 생성시키는 단계 ;(a) generating a set of irregular fragments of the cDNA encoding the kinesin gene; (b) DNA 단편을 생세포 내에서 DNA 단편을 발현시킬 수 있는 발현 벡터로 전달하여 라이브러리를 수득하는 단계 ;(b) delivering the DNA fragment to an expression vector capable of expressing the DNA fragment in living cells to obtain a library; (c) 단계(b)의 불규칙 단편 라이브러리를 생세포 내에 도입시켜서 생세포를 유전적으로 변형시키는 단계 ;(c) genetically modifying live cells by introducing the irregular fragment library of step (b) into live cells; (d) DNA 손상제의 존재하에 세포를 선택함으로써 키네신 유도 유전억제요소를 함유하는 유전적으로 변형된 생세포를 단리시키거나 부화시키는 단계 ; 및(d) isolating or hatching genetically modified live cells containing kinesin induced genetic inhibitors by selecting cells in the presence of a DNA damaging agent; And (e) 유전적으로 변형된 세포로부터 유전 억제요소를 수득하는 단계를 포함하는 방법.(e) obtaining the genetic inhibitor from the genetically modified cell. 제1항의 방법에 의해 확인된 하기의 서열을 갖는 유전 억제요소 :Genetic inhibitory elements having the following sequences identified by the method of claim 1: 제2항에 있어서, 사람 또는 마우스의 khcs 유전자와 상동인 누클레오티드 서열을 갖는 유전 억제요소.3. The genetic inhibitory element of claim 2 having a nucleotide sequence homologous to the khcs gene of human or mouse. 제2항에 따른 GSE를 발현시키는 포유동물 세포.A mammalian cell expressing GSE according to claim 2. 제3항에 따른 GSE를 발현시키는 포유동물 세포.A mammalian cell expressing GSE according to claim 3. 제1항에 있어서, 유전 억제요소가 센스-배향되는 방법.The method of claim 1, wherein the genetic inhibitory element is sense-oriented. 제1항에 있어서, 유전 억제요소가 앤티센스-배향되는 방법.The method of claim 1, wherein the genetic inhibitory element is antisense-oriented. 제7항의 방법에 따라 생성된 하기의 서열을 갖는 SGE에 의해 코드화된 앤티센스 RNA의 누클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고누클레오티드 :Synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of an antisense RNA encoded by SGE having the following sequence generated according to the method of claim 7: (정정) (a) 사람을 제외한 동물의 종양 또는 악성 세포로부터의 전령 RNA를 포함하는 세포 RNA를 단리시키는 단계 ;(Correction) (a) isolating cellular RNA comprising messenger RNA from tumor or malignant cells of an animal other than human; (b) 사람을 제외한 동물의 종양 또는 악성 세포 내의 키네신 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계 ; 및(b) measuring the expression level of kinesin mRNA in tumors or malignant cells of animals other than humans; And (c) 종양 또는 악성 세포 내의 키네신 mRNA의 발현 수준이 키네신 유전자가 사람을 제외한 동물의 종양 또는 악성 세포 내에서 과발현되는지 또는 과소 발현되는지를 지시하는가의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 진단적 검정 방법.(c) determining whether the expression level of kinesin mRNA in the tumor or malignant cell indicates whether the kinesin gene is overexpressed or underexpressed in tumors or malignant cells of animals other than humans. . (a) 사람을 제외한 동물의 종양 또는 악성 세포로부터 세포 단백질을 단리시키는 단계 ;(a) isolating cellular proteins from tumors or malignant cells of animals other than humans; (b) 사람을 제외한 동물의 종양 또는 악성 세포 내의 키네신 단백질의 양을 측정하는 단계 ; 및(b) measuring the amount of kinesin protein in tumors or malignant cells of animals other than humans; And (c) 종양 또는 악성 세포 내의 키네신 단백질의 양이 키네신 유전자가 사람을 제외한 동물의 종양 또는 악성 세포 내에서 과발현되는지 또는 과소 발현되는지를 지시하는가의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 진단적 검정 방법.(c) determining whether the amount of kinesin protein in the tumor or malignant cell indicates whether the kinesin gene is overexpressed or underexpressed in tumors or malignant cells of animals other than humans. 세포에 1종 이상의 DNA 손상제에 대한 내성을 부여하는 키네신 유전자로부터 유도된 다수의 유전 억제요소(GSE)를 확인하는 방법으로서,A method of identifying multiple genetic inhibitors (GSEs) derived from kinesin genes that confer resistance to one or more DNA damaging agents in a cell, (a) 키네신 유전자를 코드화시키는 cDNA의 한 세트의 불규칙 단편을 생성시키는 단계 ;(a) generating a set of irregular fragments of the cDNA encoding the kinesin gene; (b) DNA 단편을 생세포 내에서 DNA 단편을 발현시킬 수 있는 레트로바이러스 발현 벡터에 전달하여 레트로바이러스 불규칙 단편 발현 라이브러리를 수득하는 단계 ;(b) delivering the DNA fragment to a retroviral expression vector capable of expressing the DNA fragment in living cells to obtain a retroviral irregular fragment expression library; (c) 단계(b)의 레트로바이러스 불규칙 단편 발현 라이브러리를 상기 라이브러리를 포함하는 각각의 레트로바이러스 발현 벡터를 증식시킬 수 있는 배양물 중의 생세포 내에 도입시켜서 생세포의 배양물을 유전적으로 변형시키는 단계 ;(c) genetically modifying the culture of live cells by introducing the retroviral irregular fragment expression library of step (b) into live cells in a culture capable of propagating each retroviral expression vector comprising the library; (d) DNA 손상제의 존재하에 세ㅗ를 선택하여 키네신-유도된 유전 억제요소를 함유하는 유전적으로 변형된 생세포를 분리시키거나 부화시키는 단계 ; 및(d) selecting sebum in the presence of a DNA damaging agent to isolate or hatch genetically modified live cells containing kinesin-derived genetic inhibitors; And (e) 약제내성이 있는 단계(d)의 유전적으로 변형된 생세포가 레트로바이러스 불규칙 단편 발현 라이브러리의 키네신 유도된 유전 억제요소를 증식시키도록 하여, 다수의 키네신-유도된 유전 억제요소를 포함하는 증폭된 불규칙 단편 발현 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함하는 방법.(e) amplification comprising a plurality of kinesin-derived genetic inhibitors, such that the genetically modified live cells of step (d) with drug resistance propagate kinesin induced genetic inhibitors of the retroviral irregular fragment expression library. Generating a randomized fragment expression library. 제11항의 방법에 의해 확인된 하기의 서열을 갖는 유전 억제요소(GSE) :Genetic inhibitory element (GSE) having the following sequence identified by the method of claim 11: 제12항에 있어서, 사람 또는 마우스 khcs 유전자와 상동인 누클레오티드 서열을 갖는 유전 억제요소.13. The genetic inhibitory element of claim 12 having a nucleotide sequence homologous to a human or mouse khcs gene. 제12항에 따른 GSE를 발현시키는 포유동물 세포.A mammalian cell expressing GSE according to claim 12. 제13항에 따른 GSE를 발현시키는 포유동물 세포.A mammalian cell expressing GSE according to claim 13. 제11항에 있어서, 유전 억제요소가 센스-배향되는 방법.The method of claim 11, wherein the genetic inhibitory element is sense-oriented. 제11항에 있어서, 유전 억제요소가 앤티센스-배향되는 방법.The method of claim 11, wherein the genetic inhibitory element is antisense-oriented. 제17항의 방벙에 의해 생성된 하기의 서열을 갖는 GSE에 의해 코드화된 앤티센스 RNA의 누클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고누클레오티드 :A synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence of an antisense RNA encoded by GSE having the following sequence produced by the method of claim 17: