KR100239143B1

KR100239143B1 - Transcription mediator protein(med6p) mutant protein thereof(med6p), mutant gene encoding the mutant protein, and transformed strains by wild type and mutant genes

Info

Publication number: KR100239143B1
Application number: KR1019970037393A
Authority: KR
Inventors: 김영준; 이영철; 민소영; 김병수
Original assignee: 윤종용; 삼성전자주식회사
Priority date: 1997-08-05
Filing date: 1997-08-05
Publication date: 2000-01-15
Also published as: KR19990015343A

Abstract

본 발명에는 전사활성화에 필수적인 역할을 하는, 하기 아미노산 서열 (서열 1)을 가지고 있는 전사조절 매개채 단백질 (Med6p), 이것의 돌연변이 단백질(med6p), 이 돌연변이 단백질을 코팅하는 유전자 (med6) 및 야생형 유전자 (Med6)와 돌연변이형 유전자 (med6)에 의해 형질전환된 균주들이 개시되어 있다.In the present invention, a transcriptional regulatory mediator protein (Med6p), a mutant protein thereof (med6p), a gene coating the mutant protein (med6) and a wild type having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1), which play an essential role in transcriptional activation Strains transformed by the gene (Med6) and the mutant gene (med6) are disclosed.

[서열 1][SEQ ID NO 1]

Description

전사조절 매개체 단백질 (Med6p), 그것의 돌연변이 단백질 (med6p)과 이 돌연변이 단백질을 코딩하는 유전자 및 야생형 및 돌연변이 유전자에 의해 형질전환된 균주Transcription mediator protein (Med6p), its mutant protein (med6p) and genes encoding this mutant protein and strains transformed by wild type and mutant genes

본 발명은 전사조절에 필요한 전사조절 매개체 (mediator)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터 분리된 전사조절 매개체 단백질 (Med6p), 그것의 돌연변이 단백질 (med6p), 이 돌연변이 단백질을 코딩하는 유전자 (med6) 및 이들 유전자들에 의해 형질전화된 균주에 관한 것이다.The present invention relates to a transcriptional mediator required for transcriptional regulation, and more particularly, to a transcriptional mediator protein (Med6p), a mutant protein thereof (med6p), isolated from Saccharomyces cerevisiae. , A gene encoding this mutant protein (med6) and a strain transformed by these genes.

유전자발현의 조절은 정상적인 개체의 발생과 조직 발달의 주요 조절수단이 될 뿐만아니라, 세균이나 바이러스 감염에 대한 면역반응과 같이, 외부 환경변화에 대해 동식물이 나타내는 반응작용을 주요 조절수단이 되기도 한다. 유전자발현이 정상적으로 조절되지 못하는 경우, 기형발생, 암세포로의 전이, 면역결핍, 생체호르몬에 의한 항상성 유실과 같은 심각한 질병이 유발될 수 있다. 예를 들면, 세포의 분화나 사멸을 조절하는 유전자들이 비정상적으로 발현하는 경우 암이 발생할 수 있고, 세균감염시 주 사망요인이 되는 패혈증 (endotoxic shock)은 세균에 대해 숙주의 면역체계가 관련유전자를 과잉발현시킴으로써 일어나는 것으로 밝혀졌다. 그외에도, 단순히 세포의 비정상적 생리현상에 의해 발생되는 것으로 생각되었던 당뇨병이나 뇌졸중의 근본원인도 인슐린, 콜레스테롤의 수용체나 이들의 대사에 관련된 효소들의 비정상적 발현에 의한 것으로 밝혀졌고, 신경계 및 정신계 질환의 주요 원인도 유전자발현의 조절실패에 있다는 견해가 보편화되어 있다.Regulation of gene expression is not only a major means of control of the development and organization of normal individuals, but also of the response of plants and animals to external environmental changes, such as immune responses to bacterial or viral infections. When gene expression is not properly regulated, serious diseases such as teratogenicity, metastasis to cancer cells, immunodeficiency, and loss of homeostasis by biological hormones can be caused. For example, abnormal expression of genes that control cell differentiation or death can cause cancer, and endotoxic shock, a major cause of death during bacterial infection, is that the host's immune system It has been found to occur by overexpression. In addition, the root cause of diabetes or stroke, which was thought to be simply caused by abnormal physiological phenomena of the cells, was found to be due to abnormal expression of insulin, cholesterol receptors, or enzymes involved in their metabolism. The view that the cause also lies in the failure to regulate gene expression is common.

현재, 이러한 질병의 치료를 위하여 사용되는 방법으로는, 문제 유전자의 발현 자체를 조절함으로써 그 원인을 제거하는 직접적인 방법보다는, 부절적한 유전자발현으로 인해 야기된 유해한 세포반응을 억제 또는 중화시키는 간접적 치료방법이 주로 사용되고 있다. 그러나, 간접적인 치료방법은 근본적인 치료라기보다는 단지 질병의 악화를 막거나 질병의 증상이 나타나는 것을 막는 수동적인 방법이라는 점에서 한계가 있다. 최근에는 사이토카인이나 그 수용체와 같이 유전자 활성화의 전단계 물질을 조절함으로써 직접적인 치료효과를 얻으려는 연구가 시도되고 있기는 하지만, 목표유전자 뿐아니라 다른 많은 유전자들의 발현도 영향을 받게 되어 심각한 부작용을 수반하는 경우가 많다. 그러므로 유전자의 발현조절기작을 규명하고, 여기서 얻은 지식을 응용하여 특정 유전자에 대해 인위적으로 그 발현을 조절하는 방법이 질병의 새로운 치료방법으로서 주목을 받고 있다. 유전자발현 조절방법은 상기와 같은 의학적 목적 이외에도 산업적으로도 이용될 수 있는데, 예를 들어, 동식물이나 효모를 이용하여 생물질을 생산하는데 있어서 유전자의 발현을 저절함으로써 생산효율을 증가시킬 수 있다.Currently, the methods used for the treatment of these diseases are indirect treatments that inhibit or neutralize the harmful cellular response caused by inappropriate gene expression, rather than a direct way to eliminate the cause by regulating the expression of the problem gene itself. The method is mainly used. However, indirect treatment is limited in that it is a passive method of preventing the worsening of symptoms or the manifestation of the disease, rather than the fundamental treatment. Recently, research has been attempted to obtain a direct therapeutic effect by regulating the precursors of gene activation, such as cytokines and their receptors, but the expression of many other genes as well as the target gene is affected, which has serious side effects. There are many cases. Therefore, the method of identifying the expression control mechanism of genes and applying the knowledge obtained here to artificially regulate the expression of a specific gene has attracted attention as a new treatment method for the disease. Gene expression control method can be used industrially in addition to the above medical purposes, for example, by increasing the production efficiency by reducing the expression of genes in the production of biomass using plants and plants and yeast.

현재까지 밝혀진 생체내에서의 유전자발현 조절방법중에서도, 전사의 효율을 조절하는 방법이 유전자발현의 초기 단계인 전사과정을 조절한다는 점에서 효율적인 방법이라고 할 수 있다. 전사조절과 관련하여, 전사효소, 전사인자, 활성화제/억제제 (activator/repressor)등의 트랜스적 작용 요소 (trans-acting factor)들과 인핸서 (enhancer)와 프로모터 (promoter) 등의 시스적 작용 요소(cis-element)에 관한 연구가 상당히 많이 이루어졌으며, 그 결과 전사에 필요한 효소와 인자들이 순수분리되고 그 기능이 상당한 수준으로 밝혀졌다. 그러나, 순수 분리된 전술한 효소나 인자만을 시험관내에서 재조합시킨 것만으로는 전사가 이루어지지 않는 경우가 발견됨으로써, 이러한 전사를 조절하기 위해서는 또 다른 인자가 필요한 것으로 밝혀졌다. 이것은 바로 전사활성화 매개체인데, 매개체가 발견됨으로써 활성화제가 어떠한 방법으로 전사기구 (transcription ,achinery)를 조정하는 지를 밝힐 수 있는 길이 열리게 되었다.Among the methods of regulating gene expression in vivo, the method of controlling the efficiency of transcription is an efficient method in that it regulates the transcription process, which is an early stage of gene expression. In relation to transcriptional regulation, trans-acting factors such as transcriptases, transcription factors, activators / repressors, and cisogenic factors such as enhancers and promoters There has been a great deal of research into cis-elements, and the results show that the enzymes and factors necessary for transcription are purely isolated and their function is significant. However, it has been found that transcription is not achieved only by in vitro recombination of purely isolated enzymes or factors in vitro, and it has been found that another factor is required to control such transcription. This is the transcriptional activator, and the discovery of the mediator opens the way to reveal how the activator regulates transcription, achinery.

전술한 전사조절 매개체 이외에, 전사조절신호를 전사효소에 전달해 주는 중간인자로서 다음과 같은 2종류가 더 확인되었다: (1) TATA-결합 단백질 (TBP)와 결합하여 TF II D를 형성하는 TAF_II(Verrijzer, C.P., and R. Tjian, (1996), Trends Biochem. Sci. 21: 338-341 참조), 및 (2) 사람의 USA (upstream stimulatory activity) (Kaiser, K., and M. Meisterernst, (1995), Trends Biochem. Sci., 21: 342-345 참조) 포유동물의 CBP/P300 (Janknecht, R., and T. Hunter, (1996), Nature, 383: 22-23 참조), 이스트의 ADA 복합체 (Horiuchi, J., N. Silverman, G.A. Marcus, and L. Guarente, (1995), Mol. Cell. Biol. 15:1203-1209 참조) 및 HMG 단백질 (Paull, T.T., M. Carey, and R.C. Johnson, Genes Dev. 10: 2769-2781 참조)과 같은 보조활성화제 (co-activator)가 바로 그것들이다. 이러한 중간조절인자는 서로 다른 기작을 이용하여 전사활성화를 조절하므로 이들 각각에 대한 연구가 종합적인 전사조절기작 연구에 필수적이다. 이들 중 전사매개체가 가장 중요한 역할을 하고 있는데, 전사조절 매개체의 존재는 "스켈칭(squelching)" 분석에 의해 처음으로 알려지게 되었다. 즉, 하나의 활성화제를 첨가하면 다른 활성화제에 의한 전사의 자극이 방해를 받게 되는 사실로부터, 하나의 공통된 표적에 대해 두 개의 활성화제가 경쟁을 하고 있다는 것을 알게되었다 (Flanagan, P.M., R.J.d. Kelleher, M.H. Sayre, H. Tschochner, and R.D. Kornberg, (1991) Nature 350: 436-438 참조). 스켈칭 현상은 전사 활성화제의 활성화 영역에 대해 특이적으로 나타나며, 부분적으로 정제된 이스트 단백질 단편을 첨가하는 경우에는 구제될 수 있으나 기본적인 전사기구의 공지된 성분을 첨가하는 경우에는 구제될 수가 없다. 이러한 사실은, 기본적인 전사에 필요한 단백질과는 구별되지만 전사 활성화에 필수적인 역할을 하는 전사조절 매개체라고 하는 새로운 개념의 활성화제가 존재한다는 것을 시사하는 것이며, 실제로 이스트의 전사조절 매개체 활성 분석을 통해 RNA 폴리머라제II와 물리적으로 결합되어 있는 매개복합체가 분리되었다 (Kim, Y.-J., S. Bjorklund, Y. Li, M.H. Sayre, and R.D. Kornberg, (1994), Cell, 77: 599-608 참조). 매개복합체는 약 20개의 폴리펩티드를 포함하고 있는데, 그 중에는 Srb2p, Srb4p, Srb5p, Srb6p, Gal11p, Rgr1p 및 Sin4p와 같은 것들이 있으며, 이들은 각각 별도의 유전학적 연구를 통해 전사 조절제로 작용한다는 사실이 밝혀졌다.In addition to the aforementioned transcriptional regulatory mediators, two more types of intermediate factors that deliver transcriptional control signals to transcriptase were identified: (1) TAF _II , which binds to TATA-binding protein (TBP) to form TF II D (See Verrijzer, CP, and R. Tjian, (1996), Trends Biochem. Sci. 21: 338-341), and (2) human upstream stimulatory activity (USA) (Kaiser, K., and M. Meisterernst, (1995), Trends Biochem. Sci., 21: 342-345) CBP / P300 of mammals (Janknecht, R., and T. Hunter, (1996), Nature, 383: 22-23), yeast ADA complex (Horiuchi, J., N. Silverman, GA Marcus, and L. Guarente, (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 1203-1209) and HMG protein (Paull, TT, M. Carey, and Co-activators such as RC Johnson, Genes Dev. 10: 2769-2781). Since these intermediate regulators regulate transcriptional activation using different mechanisms, studies of each of these are essential for comprehensive transcriptional regulation studies. Of these, transcription media play the most important role, and the presence of transcriptional mediators is first known by "squelching" analysis. In other words, the addition of one activator interferes with the stimulation of transcription by another activator, and we find that two activators compete for one common target (Flanagan, PM, RJd Kelleher, MH Sayre, H. Tschochner, and RD Kornberg, (1991) Nature 350: 436-438). Squelching phenomena appear specific to the activation region of a transcriptional activator and can be rescued when adding partially purified yeast protein fragments, but not when adding known components of basic transcriptional machinery. This suggests that there is a new concept of activator, which is distinct from the proteins required for basic transcription but plays an essential role in transcriptional activation. Mediators physically bound to II were isolated (see Kim, Y.-J., S. Bjorklund, Y. Li, MH Sayre, and RD Kornberg, (1994), Cell, 77: 599-608). The mediator contains about 20 polypeptides, including Srb2p, Srb4p, Srb5p, Srb6p, Gal11p, Rgr1p, and Sin4p, each of which has been shown to act as a transcriptional regulator through separate genetic studies. .

본 발명에서는, 사카로마이세스 세레비지애로 부터 추출한 전사매개체의 구성단백질 중 새로이 발견된 전사조절 매개체 단백질에 대해 그 기능적인 분석에 초점을 두고자 한다.In the present invention, we will focus on the functional analysis of the newly discovered transcriptional regulator media proteins in the constituent proteins of the transcription media extracted from Saccharomyces cerevisiae.

본 발명의 목적은 전사활성화에 필수적인 역할을 하는 매개체 단백질과 이것의 돌연변이 단백질 및 이 돌연변이 단백질을 코딩하는 돌연변이형 유전자 및 야생형 유전자와 돌연변이형 유전자에 의해 형질전환된 균주들을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a mediator protein that plays an essential role in transcriptional activation, a mutant protein thereof, and a mutant gene encoding the mutant protein and a strain transformed by the wild type gene and the mutant gene.

제1a도및 제1b도는 온도-감수성 치사성을 부여하는 med6 ts 유전자의 분리에 관한 실험 결과를 나타내며, 제1c도 내지 제1e도는 각각 재조합 플라스미드의 유전자 지도를 나탄낸다. 제1a도는 비허용온도에서 med6 ts 돌연변이 균주의 성장 결함을 나타내는 도면으로서, MED6 야생형 (YCL10)과 온도-감수성 균주(YCL8)를 합성 포도당 배지에 도말하여 허용온도 (30℃) 또는 비허용온도 (37℃)에서 2-3일간 배양한 결과를 나타내는 사진이고, 제1b도는 med6 ts 유전자가 오픈 리딩 프레임에 6개의 미스센스(missense) 돌연변이를 포함하고 있는 것을 나타내는 도면으로서, 영역 교환 실험에 이용된 BamHI 부위와 함께 돌연변이된 아미노산들과 그들의 위치를 나타내고 있다. 제1c도는 돌연변이 매개체 유전자가 플라스미드 pRS313에 삽입되어 이루어진 재조합 플라스미드 pRS313-med6ts2의 유전자 지도이고, 제1d도는 야생형 전사조절 매개체 유전자가 플라스미드 pRS313에 삽입되어 이루어진 재조합 플라스미드 pRS313-MED6의 유전자 지도를 나타낸다. 또한, 제1e도는 세균에서 전사조절 매개체 유전자 (MED6)를 과잉발현시키기에 적합한 재조합 플라스미드 pET-MED6의 유전자 지도를 나타낸다.Figures 1a and 1b show experimental results for the isolation of the med6 ts gene that confers temperature-sensitive lethality, and Figures 1c to 1e show the genetic maps of the recombinant plasmids, respectively. Figure 1a shows the growth defects of the med6 ts mutant strain at an unacceptable temperature, in which MED6 wild type (YCL10) and temperature-sensitive strain (YCL8) are plated on synthetic glucose medium to allow for (30 ° C) or unacceptable temperature ( 37 ° C.) shows a result of 2-3 days of incubation, and FIG. 1B shows that the med6 ts gene contains six missense mutations in an open reading frame. Along with the BamHI site, the mutated amino acids and their positions are shown. FIG. 1c is a genetic map of the recombinant plasmid pRS313-med6ts2 formed by inserting the mutant mediator gene into plasmid pRS313, and FIG. Figure 1E also shows a genetic map of recombinant plasmid pET-MED6 suitable for overexpressing transcriptional regulatory mediator gene (MED6) in bacteria.

제2a도 및 제2b도는 med6 ts 돌연변이의 전사 결함을 생체내 실험으로 분석한 결과를 나타내는 도면으로서, 제2a도는 med6 ts 유전자가 전사에 미치는 영향을 다양한 유전자를 조사함으로써 알아 본 시험의 결과를 나타내는 사진이고, 제2b도는 GAL1과 SUC2 유전자의 전사에 미치는 med6 ts 돌연변이의 영향을 알아본 시험 결과를 나타내는 사진이다.2a and 2b show the results of in vivo experiments on the transcription defects of the med6 ts mutant, and FIG. 2a shows the results of the test by examining various genes to examine the effects of the med6 ts gene on transcription. Figure 2b is a photograph showing the results of a test for the effect of the med6 ts mutation on the transcription of the GAL1 and SUC2 genes.

제3a도는 교배형 알파인자 생성량 정도를 비교 실험한 결과를 나타내는 사진이다.3a is a photograph showing the results of comparative experiments on the degree of cross-linked alpha factor production.

제3b도는 med6 ts 돌염변이가 알파인자 생산에 관여하는 유전자의 전사에 미치는 영향을 나타내는 겔 사진이다.Figure 3b is a gel photograph showing the effect of med6 ts stone mutations on the transcription of genes involved in alpha factor production.

제4a도 및 제4b도는 야생형과 med6 ts 돌연변이주의 핵 추출물을 이용한 시험관내 전사실험의 결과를 나타내는 도면으로서, 제4a도는 med6 ts 돌연변이가 전사 활성화에 미치는 영향을 나타내는 도면이도, 제4b도는 재조합 Med6 단백질 (r-Med6p)을 첨가함으로써 돌연변이 핵 추출물에서의 전사 결함이 회복되는 것을 보여주는 도면이다.4A and 4B show the results of in vitro transcription experiments using wild-type and med6 ts mutant nuclear extracts. FIG. 4A shows the effect of med6 ts mutations on transcriptional activation. Figure shows that transcriptional defects in mutant nuclear extracts are recovered by adding Med6 protein (r-Med6p).

제5도는 야생형과 돌연변이 Med6p가 정제과정 중 항상 다른 전사조절 매개체 성분들과 함께 정제되는 결과를 나타내는 도면이다.5 is a diagram showing the result that the wild-type and mutant Med6p is always purified along with other transcriptional regulatory media components during purification.

제6a도 및 제6b도는 야생형과 med6 ts 돌연변이 균주로부터 추출한 전사조절 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체의 폴리펩티드 조성을 나타내는 도면으로서, 제6a도는 홀로-폴리머라제에 대한 면역블롯팅 분석격과를 나타내는 도면이며, 제6b도는 홀로-폴리머라제의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 도면이다.6a and 6b show the polypeptide composition of the transcriptional regulatory mediator-RNA polymerase II complex extracted from wild type and med6 ts mutant strains, and FIG. 6a shows the immunoblotting assay for holo-polymerase. 6b is a diagram showing the SDS-PAGE results of the holo-polymerase.

제7a, 7b 도 및 제7c도는 재구성된 전사 시스템에서 야생형과 med6ts 돌연변이 홀로-폴리머라제 활성을 비교해 놓은 도면과 CTD 인산화 반응 결과를 보여주는 도면으로서, 제7a도는 순수한 전사단백질들로만 재구성된 시험관내 전사에 미치는 med6ts 돌연변이의 영향을 보여주는 도면이고, 제7b도는 med6 ts 돌연변이가 TFIIH에 의한 폴리머라제의 CTD 인산화에 미치는 영향을 나타내는 도면이며, 제7c도는 홀로-폴리머라제의 전사와 CTD 인산화의 실험결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.Figures 7a, 7b and 7c show the comparison of wild-type and med6ts mutant holopolymerase activity in a reconstituted transcription system and the results of CTD phosphorylation reaction, and Figure 7a shows in vitro transcription reconstituted with pure transcription proteins only. Figure 7b is a diagram showing the effect of med6ts mutations, Figure 7b is a diagram showing the effect of the med6 ts mutation on the CTD phosphorylation of polymerase by TFIIH, Figure 7c quantifies the results of the transcription and CTD phosphorylation of holo-polymerase It is a graph shown.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 전사조절을 매개하는 단백질로서 하기와 같은 아미노산 서열 1 또는 그 유도체로 되어 있는 전사조절 매개체 단백질 (본 발명자에 의해 Med6p라 명명됨)이 제공된다.In order to achieve the above object, the present invention provides a transcriptional mediator protein (named Med6p by the present inventor) consisting of the following amino acid sequence 1 or a derivative thereof as a protein mediating transcriptional regulation.

[서열 1][SEQ ID NO 1]

상기 전사조절 매개체 단백질은 사카로마이세스 세레비지애로부터 추출된 것이다.The transcriptional regulator protein is extracted from Saccharomyces cerevisiae.

상기 전사조절 매개체 단백질은, 전사조절과 관련하여 특히 기본전사기구의 활성화시 PNA 폴리머라제와 상호작용하여 전사의 초기 활성화단계를 조절한다.The transcriptional mediator protein interacts with PNA polymerase, in particular upon activation of the basic transcriptome, in the regulation of transcriptional regulation to regulate the initial activation phase of transcription.

본 발명의 다른 목적은 상기 전사조절 매개체 단백질 (Med6p)의 돌연변이 단백질로서, 하기와 같은 아미노산 서열 2 또는 그 유도체를 가지고 있는 돌연변이 매개체 단백질 (med6p)에 의해 달성된다.Another object of the present invention is achieved by a mutant mediator protein (med6p) having the following amino acid sequence 2 or a derivative thereof as a mutant protein of the transcriptional regulatory mediator protein (Med6p).

[서열 2][SEQ ID NO 2]

상기, 돌연변이 매개체 단백질은 상기 야생형 전사조절 매개체 단백질의 온도감수성 돌연변이로서, 허용온도인 30℃에서는 야생형과 거의 동일한 활성을 보이지만 비허용온도인 37℃에서는 비활성화되어 생체내 주요 유도성 유전자의 전사결함으로 인해 돌연변이주의 성장을 멈추게 할뿐아니라, 실험관내 실험에서의 전사활성화도 정지시킨다.The mutant mediator protein is a temperature-sensitive mutation of the wild-type transcriptional regulator protein, which exhibits almost the same activity as the wild-type at the allowable temperature of 30 ° C., but is inactivated at the non-acceptable temperature of 37 ° C., resulting in transcription defects of major inducible genes in vivo. Not only does it stop growth of the mutant strain, but it also stops transcriptional activation in in vitro experiments.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 돌연변이 매개체 단백질을 코딩하는 유전자로서 그것의 염기 서열이 하기 서열 3 또는 그 유도체로 되어 있는 돌연변이 유전자 (med6)가 제공된다.In order to achieve another object of the present invention, a mutant gene (med6) having a nucleotide sequence of the following SEQ ID NO: 3 or a derivative thereof is provided as a gene encoding the mutant mediator protein.

[서열 3][SEQ ID NO 3]

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 전사조절 매개체 단백질(Med6p)을 코딩하는 유전자 (MED6)에 의해 형질전환된 균쥬인 사카로마이세스 세레비지애 YCL10 (KCTC 0349BP)이 제공된다.In order to achieve another object of the present invention, Saccharomyces cerevisiae YCL10 (KCTC 0349BP), which is a strain transformed by the gene (MED6) encoding the transcriptional regulator protein (Med6p), is provided.

이때, 상기 전사조절 매개체 유전자 (MED6)의 벡터로는 플라스미드 pBluescript II SK+, pRS313 또는 pRS316이 사용되는데, 그 중 바람직한 것은 플라스미드 pRS313이다. 플라스미드 pRS313이 벡터로 사용될 때, 전사조절 매개체 유전자 (MED6)는 플라스미드 pRS313의 제한효소 자리 EcoR I 과 Bgl II 사이에 삽입된다.At this time, as a vector of the transcriptional regulatory mediator gene (MED6), plasmid pBluescript II SK +, pRS313 or pRS316 is used, of which plasmid pRS313 is preferred. When plasmid pRS313 is used as a vector, the transcriptional regulator mediator gene (MED6) is inserted between the restriction enzyme sites EcoR I and Bgl II of plasmid pRS313.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 돌연변이 전사조절 매개체 유전자 (med6)에 의해 형질전환된 균주인 사카로마이세스 세레비지애 YCL8 (KCTC 0348BP)이 제공된다.Another object of the present invention is Saccharomyces cerevisiae YCL8 (KCTC 0348BP), which is a strain transformed by the mutant transcriptional regulatory mediator gene (med6).

이때, 상기 돌연변이 전사조절 매개체 유전자 (med6)의 벡터로는 플라스미드 pBluescript II SK+, pRS313 또는 pRS316이 사용되는데, 그 중 바람직한 것은 플라스미드 pRS313이다. 플라스미드 pRS313이 벡터로 사용될 때, 전사조절 매개체 유전자 (MED6)는 플라스미드 pRS313의 제한효소 자리 EcoR I 과 Bgl II 사이에 삽입된다.At this time, plasmid pBluescript II SK +, pRS313 or pRS316 is used as a vector of the mutant transcription regulator mediator gene (med6), of which plasmid pRS313 is preferred. When plasmid pRS313 is used as a vector, the transcriptional regulator mediator gene (MED6) is inserted between the restriction enzyme sites EcoR I and Bgl II of plasmid pRS313.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 기재함으로써 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.

먼저, 실시예에서 이용된 재료 및 분석방법 등에 대해 설명하기로 한다.First, materials and analytical methods used in the examples will be described.

1. 균주 및 플라스미드1. Strains and Plasmids

실험용 효모 사카로마이세스 세레비지애 야생형 균주인 YPH500 (유전자형 : MAT α, ade2-101, ura3-52, lys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, GAL+)과 실험에 이용한 pRS313, pRS316 플라스미드는 미국 스탠포드대학의 컨버그 교수(R.D. Kornberg)로부터 입수하였으며, 박테리아에서의 과잉발현을 위한 pET 플라스미드는 노바겐 (Novagen)사에서 구입하여 사용하였다.Experimental yeast Saccharomyces cerevisiae wild type strain YPH500 (genotype: MAT α, ade2-101, ura3-52, lys2-801, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, GAL +) and pRS313 used in the experiment , pRS316 plasmid was obtained from Professor RD Kornberg of Stanford University in the United States, pET plasmid for overexpression in bacteria was purchased from Novagen (Novagen).

2. 배지2. Badge

효모 배향을 위한 완전배지 (YPD)의 조성은 글루코오스 (Difco 제품) 2중량%, 박토펩톤 (Difco 제품) 1중량%, 박토효모추출물 (Difco 제품) 1중량%로 되어 있다.The composition of the complete medium for yeast orientation (YPD) is 2% by weight glucose (from Difco), 1% by weight of bactopeptone (from Difco) and 1% by weight of bacterium yeast extract (from Difco).

3. RNA 제조 및 분석방법3. RNA manufacturing and analysis method

생체내 특정 유전자의 전사량을 측정하기 위해 사카로마이세스 세레비지애 야생형 MED6 (YCL10)과 MED6 돌연변이주 (YCL8)로부터 세포내 전체 RNA를 추출하는 실험을 실시하였다.In order to measure the amount of transcription of a specific gene in vivo, an experiment was performed to extract total RNA from Saccharomyces cerevisiae wild type MED6 (YCL10) and MED6 mutant strain (YCL8).

먼저, 효모 MED6 야생형 (YCL10)과 돌연변이주 (YCL8)를 30℃에서 적절한 배지를 이용하여 초기 대수기까지 성장시켜 (A₆₀₀=0.3 내지 0.4), 2부분으로 나누어서 2.5시간 동안 각각 30℃와 37℃에서 성장시켰다. 통상의 방법에 따라 전체 RNA를 추출하여 260nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하고, 이것들의 순도를 아가로즈 겔상에서의 에티디움브로마이드 (EtBr) 염색을 통해 확인하였다.First, yeast MED6 wild type (YCL10) and mutant strain (YCL8) were grown at 30 ° C. to the initial log phase using an appropriate medium (A ₆₀₀ = 0.3 to 0.4), divided into two parts, 30 ° C. and 37 for 2.5 hours, respectively. Grown at < RTI ID = 0.0 > Total RNA was extracted and quantified by measuring absorbance at 260 nm according to a conventional method, and their purity was confirmed by staining with ethidium bromide (EtBr) on an agarose gel.

S1 뉴클레아제를 이용한 RNA 정량분석을 위해, 30μg의 전체 RNA를 S1 뉴클레아제를 이용하여 분해하였다 (Cormack, B.P., K. Struhl, (1992), Cell, 69: 685-696 참조). 이렇게 하여 얻은 생성물을 10% 변성용 (denaturing) 폴리아크릴아미드겔상에서 분리한 다음 정량장치 (Phosphor- Imager and ImageQuant 소프트웨어, Molecular Dynamics)를 이용하여 정량하였다. S1 뉴클레아제를 이용한 정량분석에 이용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:For RNA quantitation using S1 nuclease, 30 μg of total RNA was digested using S1 nuclease (see Cormack, B.P., K. Struhl, (1992), Cell, 69: 685-696). The product thus obtained was separated on a 10% denaturing polyacrylamide gel and quantified using a quantifier (Phosphor- Imager and ImageQuant software, Molecular Dynamics). The sequence of the oligonucleotides used for quantitation using S1 nuclease is as follows:

DED1: 5'-GCTAAAGAAG CTGCCACCGC CACGGCCACC GTTGTAGCCG C-3' (Chen, W., S. Tabor, and K. Struhl, (1987), Cell, 50: 1047-1055 참조); HIS3: 5'-GGTTTCATTT GTAATACGCT TTACTAGGGC TTTCTGCTCT GTCATCTTG CCTTCGTTA TCTTGCCTGC TCATTT-3' (바로 이전의 문헌과 동일한 문헌 참조);DED1: 5'-GCTAAAGAAG CTGCCACCGC CACGGCCACC GTTGTAGCCG C-3 '(see Chen, W., S. Tabor, and K. Struhl, (1987), Cell, 50: 1047-1055); HIS3: 5'-GGTTTCATTT GTAATACGCT TTACTAGGGC TTTCTGCTCT GTCATCTTG CCTTCGTTA TCTTGCCTGC TCATTT-3 '(see the same literature as before);

TRP3: 5'-GGTAAAGGAA TCGTAGTTGT CAATTAAGAA CCTCATGCTT ACCTTAG-3'(Cormack, B.P., and K. Struhl, (1992), Cell, 69: 685-696 참조);TRP3: 5'-GGTAAAGGAA TCGTAGTTGT CAATTAAGAA CCTCATGCTT ACCTTAG-3 '(see Cormack, B.P., and K. Struhl, (1992), Cell, 69: 685-696);

tRNA^W: 5'-GGAATTTCCA AGATTTAATT GGAGTCGAAA GCTCGCCTTA-3' (바로 이전의 문헌과 문헌과 동일한 문헌 참조);tRNA ^W : 5'-GGAATTTCCA AGATTTAATT GGAGTCGAAA GCTCGCCTTA-3 '(see the same literature as in the previous literature);

rRNA: 5'-TGCCAGTACC CACTTAGAAA GAATAAAAA ACAAATCGTT AGG-3' (바로 이전의 문헌과 문헌과 동일한 문헌 참조);rRNA: 5'-TGCCAGTACC CACTTAGAAA GAATAAAAA ACAAATCGTT AGG-3 '(see the same documents as before).

MED6-9: 5'-GGATTTGTCT TCTTGCCGGA TCCACATAGG CAAAC-3';MED6-9: 5'-GGATTTGTCT TCTTGCCGGA TCCACATAGG CAAAC-3 ';

GAL1: 5'-CACCAATTAG ACTCTACCAG GCGATCTAGC AACAAATCC GG-3';GAL1: 5'-CACCAATTAG ACTCTACCAG GCGATCTAGC AACAAATCC GG-3 ';

SUC2: 5'-GCCATTTGGC ATCTTTTTCA TCGTACCACA ACCCATTTGG GTCATTCATC-3'.SUC2: 5'-GCCATTTGGC ATCTTTTTCA TCGTACCACA ACCCATTTGG GTCATTCATC-3 '.

노던 분석을 위해서는, 각각의 샘플로부터 폴리(A)⁺RNA (1μg)을 0.8% 아가로즈-포름알데히드 겔상에서 분리하여 니트란막 (Nytran membrance)으로 옮겨주었다. 이 막을³²P-표지된 안티센스 RNA로 프로우브 처리하였다 (Sambrook, J., E.F. Fritsch, T. Maniatis, (1989), Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, N.Y. 참조). 노던 분석을 위한 프로우브를 제조하기 위해, 이스트 유전자인 PYK1, MFα1, MATα1, MCM1, BAR1 및 MATα2의 코딩 영역을 PCR 방법으로 증폭시켜 pBlueScript II-SK+(Stratagene)의 복수개의 클로닝 부위에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드들을 적절한 제한효소로 분해하여 T7 또는 T3 RNA 폴리머라제 (Promega)에 의한 시험관내 전사시 주형으로서 이용하였다. 특이적으로 하이브리드된 신호를 전술한 바와 같은 정량장치를 사용하여 정량하였다. 필요한 경우에는, 막을 90℃ 증류수에 10분 동안 프트리핑하여 다른 프로우브와 재하이브리드시켰다. 프로우브 제조에 사용된 각각의 유전자의 PCR 단편은 다음과 같다:For northern analysis, poly (A) ⁺ RNA (1 μg) from each sample was separated on a 0.8% agarose-formaldehyde gel and transferred to the Nytran membrance. This membrane was probed with ³² P-labeled antisense RNA (Sambrook, J., EF Fritsch, T. Maniatis, (1989), Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor , NY). To prepare probes for northern analysis, coding regions of yeast genes PYK1, MFα1, MATα1, MCM1, BAR1 and MATα2 were amplified by PCR method and cloned into a plurality of cloning sites of pBlueScript II-SK + (Stratagene). Cloned plasmids were digested with appropriate restriction enzymes and used as templates for in vitro transcription by T7 or T3 RNA polymerase (Promega). Specifically hybridized signals were quantified using a quantifier as described above. If necessary, the membrane was re-hybridized with other probes by stripping in 90 ° C. distilled water for 10 minutes. PCR fragments of each gene used to make probes are as follows:

PYK1: PYK-1 프라이머 (Xba I 부위를 포함하는, 번역개시부위 +1 내지 +21)와 PYK1-2 프라이머 (EcoRI 부위를 포함하는, +1393 내지 +1412 영역)를 이용하여 ORF 영역을 포함하는 1.4kb (kilo base pair) DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.PYK1: contains an ORF region using a PYK-1 primer (initiation sites +1 to +21, including an Xba I site) and a PYK1-2 primer (+1393 to +1412, including an EcoRI site) 1.4 kb (kilo base pair) DNA was amplified by PCR method.

MFα1: MFα1-1 프라이머 (XbaI 부위가 붙어 있는 +3 내지 +25)와 MFα1-2 프라이머 (EcoRI 부위를 가지고 있는 +478 내지 +498 영역)를 이용하여 508bp DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.MFα1: 508 bp DNA was amplified by PCR using MFα1-1 primers (+3 to +25 with XbaI sites) and MFα1-2 primers (+478 to +498 regions with EcoRI sites).

MFα1: MFα1-1 프라이머 (XbaI 부위가 붙어 있는 +7 내지 +27 영역)와 MFα1-2 프라이머 (EcoRI 부위를 가지고 있는 +507 내지 +528 영역)를 이용하여 537bp DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.MFα1: 537 bp DNA was amplified by PCR using MFα1-1 primer (+7 to +27 region with XbaI site) and MFα1-2 primer (+507 to +528 region with EcoRI site).

MATα2: MATα2-1 프라이머 (XbaI 부위가 붙어 있는 +21 내지 +43)와 MATα2-2 프라이머 (EcoRI 부위를 가지고 있는 +611 내지 +633 영역)를 이용하여 624bp DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.MATα2: 624 bp DNA was amplified by PCR using MATα2-1 primers (+21 to +43 with XbaI sites) and MATα2-2 primers (+611 to +633 regions with EcoRI sites).

MCM1: MCM1-1 프라이머 (XbaI 부위가 붙어 있는 +6내지 +28)와 MCM1-2 프라이머 (PstI 부위를 가지고 있는 +840 내지 +861 영역)를 이용하여 8708bp DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.MCM1: 8708bp DNA was amplified by PCR using MCM1-1 primers (+6 to +28 with XbaI site) and MCM1-2 primers (+840 to +861 area with PstI site).

BAR1: BAR1-1 프라이머 (+51 내지 +72)와 BAR1-2 프라이머 (+1743 내지 +1764 영역)를 이용하여 1.6kb DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.BAR1: 1.6 kb DNA was amplified by PCR using BAR1-1 primers (+51 to +72) and BAR1-2 primers (+1743 to +1764 region).

4. 아미노산 서열 확인방법 및 염기 서열 확인 방법4. Amino acid sequence confirmation method and base sequence confirmation method

순수분리된 전사활성화 매개복합체를 SDS겔에 전개한 후 38kDa 크기의 단백질을 PVDF (polyvinylidenedifluoride) 막에 부착시키고 트립신으로 절단하여 단백질 절편을 HPLC로 순수분리한다. 분리된 단백질 절편에 대해 에드만 방법을 이용하여 아미노산 서열을 확인하였다 (Hwelett Packard G1005 Protein Sequencer 사용). 한편, 염기서열은 디데옥시뉴클레오티를 이용한 표준 생거 (Sanger) 방법에 따라 결정하였다.After the purely isolated transcriptional activation mediators were deployed on SDS gels, 38kDa-sized proteins were attached to PVDF (polyvinylidenedifluoride) membranes and cut with trypsin to purely separate protein fragments by HPLC. The isolated protein fragments were identified for amino acid sequences using the Edman method (using the Hwelett Packard G1005 Protein Sequencer). Meanwhile, the nucleotide sequence was determined according to standard Sanger method using dideoxynucleotides.

[실시예 1]Example 1

1. 야생형 전사조절 매개체 유전자 (MED6)의 분리1. Isolation of Wild-type Transcription Regulator Mediator Gene (MED6)

야생형의 효모로부터 순수분리된 홀로-폴리머라제로부터 38kDa 크기의 전사조절 매개체 단백질을 순수분리하여, 그 아미노산 서열이 상기 서열1로 되어 있는 것을 확인하였다. 이 아미노산 서열과 컴퓨터 프로그램을 이용하여 이 서열을 코딩하는 유전자를 효모의 게놈 데이터 은행으로부터 찾아내었다. 이 유전자 분리하기 위해 PCR 방법을 이용하였으며, 이렇게 하여 분리한 유전자를 MED6라 명명하고 미국의 기탁기관 (Gen Bank, National Center for Biotechnology Information)에 기탁하였다(1996년 11월 14일, genbank 수탁번호 U78080). 한편, 효모의 포자분석 방법에 따라 실험한 결과 이 유전자는 세포의 생존에 필수적이라는 사실을 알아내 었다.A 38 kDa-sized transcriptional regulatory mediator protein was purified purely from holo-polymerase purified from wild-type yeast, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was confirmed. Using this amino acid sequence and a computer program, a gene encoding this sequence was found from the Genome Data Bank of Yeast. The PCR method was used to isolate the gene, and thus, the isolated gene was named MED6 and deposited with the US Depository (Gen Bank, National Center for Biotechnology Information) (November 14, 1996, genbank accession no.U78080). ). On the other hand, experiments with yeast spores revealed that this gene is essential for cell survival.

2. 돌연변이 균주 (돌연변이 매개체 유전자 med6에 의해 형질전환된균주)의 제조2. Preparation of Mutant Strains (Strains Transformed by Mutant Mediator Gene med6)

플라스미드 치환 (shuffling)을 위한 숙주 균주를 제조하기 위하여, 야생형 MED6 유전자를 포함하고 있는 URA3계 단일본 플라스미드 (pRS316)를 YPH500 (Mat α ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63his3-Δ200 leu2-Δ1)에 도입하여 YCL3 균주를 만들었다. YCL3 균주의 염색체성 MED6 본의 오픈리딩프레임 (ORF: poen reading frame)을 LEU2 유전자로 대치함으로써 YCL4 균주 [Mat α ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63his3-Δ200 leu2-Δ1 med6::LEU2 (MED6 on pRS316, URA3)])를 만들었다. MED6 유전자에 무작위적으로 이루어진 돌연변이를 가지고 있는 DAN 단편은 변형된 PCR 방법인 에러 유발성 (error-prone) 폴리머라제 체인 반응(polymerase chain reaction: PCR) 방법 (Leung. D.W., E. Chen, D.V. Goeddel, (1989), Technique, 1: 11-15 참조)에 따라 제조하였다. 약 250 염기쌍(bp)의 플랭킹 서열을 가지고 있는 MED6 유전자 단편들에 대해 PCR을 30회 (94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 60초) 실시하는 동안 Mn²⁺에 의해 유도되는 Taq 폴리머라제의 부정확성에 의해 돌연변이가 이루어졌다. PCR 반응에 사용된 재료는 다음과 같다: 100pmole씩의 올리고뉴클레오티드 [MED6-1 (5' -GGGGGAATT CTTGTGGCTAATCCGGGAAGG-3') 및 MED6-5(5' -GGGGAGATCTCTTC GTCGTCCTGATCAATCAAC-3')] 주형으로서 20ng의 플라스미드 pBS-MED6, 0.1 내지 0.2mM MnCl₂, 2.5mM MgCl₂, 0.25mM씩의 각각의 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTPs), 10mM Tris-HCl (pH 9.0), 50mM KCl, 0.1% Triton X-100 및 5유니트의 Taq 폴리머라제 (100㎕).To prepare host strains for plasmid substitution, URA3-based single plasmids (pRS316) containing wild-type MED6 gene were transferred to YPH500 (Mat α ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2- Δ1) to make the YCL3 strain. YCL4 strain [Mat α ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63his3-Δ200 leu2-Δ1 med6 :: LEU2 by replacing the open reading frame (ORF: poen reading frame) of the YCL3 strain with the LEU2 gene (MED6 on pRS316, URA3)]. DAN fragments containing randomly mutated mutations in the MED6 gene can be modified by the error-prone polymerase chain reaction (PCR) method (Leung. DW, E. Chen, DV Goeddel). (1989), Technique, 1: 11-15). Taq induced by Mn ²⁺ during 30 PCRs (94 ° C. 30 sec, 55 ° C. 30 sec, 72 ° C. 60 sec) on MED6 gene fragments having a flanking sequence of about 250 base pairs (bp) Mutations were caused by inaccuracy of the polymerase. Materials used for the PCR reaction were as follows: 20 ng plasmids of oligonucleotides [MED6-1 (5'-GGGGGAATT CTTGTGGCTAATCCGGGAAGG-3 ') and MED6-5 (5'-GGGGAGATCTCTTC GTCGTCCTGATCAATCAAC-3') at 100 pmole template pBS-MED6, 0.1-0.2 mM MnCl ₂ , 2.5 mM MgCl ₂ , 0.25 mM each deoxynucleotide triphosphate (dNTPs), 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100 and 5 units of Taq polymerase (100 μl).

med6 돌연변이 라이브러리를 만들기 위해, 생체네 갭-리페어를 기본으로 하는 1단계공정 (single-step method)을 이용하였다 (Muhlrad, D., R. Hunter, R. Parker, (1992), Yeast, 8: 79-82 참조). 말단 부분에 약 250bp의 MED6 유전자 측쇄부위를 가지고 있는, 선형화된 HIS3계 CEN-ARS 플라스미드 (pRS313)를 이용하여 med6 돌연변이들인 PCR 생성물들을 주입함으로써 YCL4 균주를 형질전환시켰다. 그 결과, 모두 40,000개의 His⁺형질전환체를 분리하였는데, 그 중의 80% 이상이 선형화된 플라스미드와 돌연변이된 PCR 생성물들간의 동형 재조합으로 생긴 것이었다. 이들 40,000개의 형질전환체 중, 단지 10%만이 5-FOA (5-플루오로오로틴산) 선택법으로 야생형 MED6 유전자를 제거한 후에도 살아있다. 5-FOA 내성 콜로니는 YPD 배지에서 생장하였고, 온도 감수성 (temperature sensitive: ts) 치사성을 나타내는 돌연변이를 분리하였다.To create the med6 mutant library, a single-step method based on biosynthetic gap-repair was used (Muhlrad, D., R. Hunter, R. Parker, (1992), Yeast, 8: 79-82). The YCL4 strain was transformed by injecting PCR products of med6 mutants using a linearized HIS3-based CEN-ARS plasmid (pRS313) having a MED6 gene side chain of about 250 bp in the terminal portion. As a result, all 40,000 His ⁺ transformants were isolated, more than 80% of which resulted from homologous recombination between the linearized plasmid and the mutated PCR products. Of these 40,000 transformants, only 10% survived the removal of the wild type MED6 gene by the 5-FOA (5-fluorourotinic acid) selection method. 5-FOA resistant colonies were grown in YPD medium and the mutations showing temperature sensitive (ts) lethality were isolated.

생존하는 med6 돌연변이 균주 둥에서 온도 감수성 돌연변이를 분리하기 위하여 30℃와 37℃에서의 성장가능성에 대해 2,200개의 라이브러리 세포를 조사하였다. 이렇게 하여 37℃에서 성장에 결함이 있는 3종의 med6 돌연변이 균주를 분리하였다. 가장 뚜렷한 ts 표현형을 가진 돌연변이 균주 (YCL8)를 분리하여 이것을 후속의 분석에 이용하였다 (도 1a 참조).In order to isolate temperature sensitive mutants from surviving med6 mutant strains, 2,200 library cells were examined for their growth potential at 30 ° C and 37 ° C. In this way, three med6 mutant strains having growth defects at 37 ° C were isolated. The mutant strain (YCL8) with the most pronounced ts phenotype was isolated and used for subsequent analysis (see FIG. 1A).

도 1a의 사진을 통해 알 수 있는 바와 같이, YCL8은 포도당 배지를 이용하는 경우 30℃에서는 정상적으로 성장하지만 37℃로 옮기며 2-4시간내에 성장이 중지된다. 이러한 비허용 온도에서, YCL8의 형태는 비정상적으로 되어 복수개의 버드를 가지고 있는 것으로 나타났다.As can be seen through the photo of Figure 1a, YCL8 grows normally at 30 ℃ when using glucose medium, but transfers to 37 ℃ and growth is stopped within 2-4 hours. At these unacceptable temperatures, the shape of YCL8 became abnormal and appeared to have a plurality of buds.

상기 돌연변이 균주는 전사조절 매개체 유전자 (MED6)와 관련하여, 염색체 DNA는 녹아웃 (knock-our) 되어 있고 돌연변이 매개체 유전자 med6가 삽입된 재조합 플라스미드 pRS313-med6ts2 (도 1c 참조)를 포함하는, 사카로마이세스 세레비지애 YCL8로서 1997년 7월 11일자로 대전광역시 소재의 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0348BP로 기탁되어 있다. 이때, pRS313 대신 pBluescript II SK+ (Stratagene)이나 pRS316이 이용될 수도 있다. 한편, 돌연변이 매개체 유전자의 산물인 med6p 단백질에 대해 전술한 방법에 따라 아미노산 서열을 확인한 결과, 전술한 서열2로 되어 있었다.Said mutant strain is associated with a transcriptional regulatory mediator gene (MED6), which contains the recombinant plasmid pRS313-med6ts2 (see FIG. 1C) in which the chromosomal DNA is knocked out and the mutant mediator gene med6 is inserted (see FIG. 1C). Seth Cerevisiae YCL8, deposited on July 11, 1997, with the accession number KCTC 0348BP to the Gene Bank of Biotechnology, Daejeon Metropolitan City. In this case, pBluescript II SK + (Stratagene) or pRS316 may be used instead of pRS313. On the other hand, the amino acid sequence was confirmed according to the method described above for the med6p protein, which is a product of the mutant mediator gene.

도 1c에 도시된 바와 같이, 돌연변이 매개체 유전자는 플라스미드 pRS313의 제한효소 자리 EcoR I 과 Bgl II 사이에 삽입되어 있다.As shown in Figure 1c, the mutant mediator gene is inserted between the restriction enzyme sites EcoR I and Bgl II of plasmid pRS313.

또한, med6 ts 유전자를 씨퀀싱한 결과 오픈리딩프레임에 10개의 뉴클레오티드가 변화된 것으로 나타났는데, 이로 인해 6개의 아미노산이 치환되어 있었다 (도 1b 참조: 도 1b에서 영문기호는 아미노산을 1개의 영문자로 표현하는 국제적인 명명법에 따른 것이다). 여기서, 야생형 MED6 유전자를 이용한 영역 교환 (domain swapping) 실험에 의해, 처음의 3개의 돌연변이가 ts 치사성과 관계가 있는 것을 밝혀졌으며, 그것의 염기서열은 전술한 서열3인 것을 확인되었다.In addition, sequencing of the med6 ts gene showed that 10 nucleotides were changed in the open reading frame, which resulted in 6 amino acid substitutions (see FIG. 1B). In accordance with international nomenclature). Here, domain swapping experiments using wild-type MED6 gene revealed that the first three mutations were related to ts lethality, and its nucleotide sequence was confirmed to be SEQ ID NO: 3.

3. MED6유전자에 의해 형질전환된 균주의 제조3. Preparation of strain transformed by MED6 gene

돌연변이 매개체 유전자 (med6)에 의해 형질전환된 상기 YCL8을 제조할 때 이용한 방법과 동일한 방법에 따라, MED6 유전자의 양측쇄부위가 250bp 정도 포함 되도록 프라이머 (Med6-1과 Med6-5)를 제조하여 효모 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 결과 예상되는 대로의 1.3kb의 DNA 절편을 얻었다. 이 절편의 양말단에 존재하는 EcoR I 과 Bgl II 제한효소자리를 이용하여, 이 절편을 pRS313 플라스미드의 EcoR I 과 Bgl II 제한효소자리 사이에 삽입하여 제조합 플라스미드 pRS313-MED6 (도 1d 참조)를 만들고, 전술한 바와 마찬가지 방법으로 YCL4로부터 pRS313-MED6를 포함하는 YCL10을 제조하였다. 이때, pRS313 대신 pBluescript II SK+ (Stratagene)이나 pRS316이 이용될 수도 있다. YCL10은 전사조절 매개체 유전자와 관련하여, 염색체 DNA는 녹아웃 (knock-out) 되어 있고, 플라스미드 DNA를 포함하고 있는 것이다. 재조합 플라스미드 pRS313-MED6를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 YCL10은 1997년 7워 11일자로 대전광역시 소재의 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 03498BP로 기탁되어 있다.According to the same method used to prepare the YCL8 transformed by the mutant mediator gene (med6), the primers (Med6-1 and Med6-5) were prepared so that both sides of the MED6 gene contained about 250bp. PCR of the genomic DNA as a template resulted in a 1.3 kb DNA fragment as expected. The plasmid pRS313-MED6 (see FIG. 1D) was prepared by inserting the fragment between the EcoR I and Bgl II restriction enzyme sites of the pRS313 plasmid using the EcoR I and Bgl II restriction enzyme sites present at the sock end of the fragment. And YCL10 comprising pRS313-MED6 was prepared from YCL4 in the same manner as described above. In this case, pBluescript II SK + (Stratagene) or pRS316 may be used instead of pRS313. YCL10 is related to the transcriptional regulatory mediator gene, the chromosomal DNA is knocked out and contains plasmid DNA. Saccharomyces cerevisiae YCL10, comprising the recombinant plasmid pRS313-MED6, was deposited on July 11, 1997, with the accession number KCTC 03498BP to the Gene Technology Bank, Daejeon Metropolitan City.

4. 세균에서의 Med6p의 과잉발현을 위한 재조합 플라스미드의 제조4. Preparation of Recombinant Plasmids for Overexpression of Med6p in Bacteria

세균, 특히 E. coli에서 Med6p를 과잉발현시키기 위해, pBS-MED6를 주형으로 하고 MED6-2 프라이머 (5'-GGGGGCCATG GCCCATCACC ATCACCATCA CAACGTGACA CCGTTGGATG AATTGC-3': 여기에서 밑줄친 부분은 NcoI 부위를 나타낸다)와 MED6-4 프라이머(5'-GGGGAGATCT TCTCATATGT AATTTGGGG-3': 여기서 밑줄친 부분은 Bgl II 부위를 나타낸다)를 이용하여, 5'-말단에 히스티딘 6개로 된 태그를 가지고 있는 MED6 ORF 영역을 PCR 방법으로 증폭시켰다. 900bp PCR 생성물을 NcoI과 Bgl II로 분해하여 pET11d (Novagen)의 NcoI/BamHI 부위에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET-MED6 (도 1e 참조)를 만들었다. 세균성 발현체의 최종 클론은 DNA 씨퀀싱에 의해 확인하였고, 재조합체 Med6p와 Srb5p는 각각 플라스미드 pET-MED6와 pET-Srg5를 가지고 있는 균주 BL21(DE3) (Novagen)로부터 분리 정제하였다 (Thompson, C.M., A.J. Koleske, D.M. Chao, and R. A. Young, (1993), Cell, 73: 1361-1375의 방법 참조).To overexpress Med6p in bacteria, particularly E. coli, pBS-MED6 as a template and a MED6-2 primer (5'-GGGGGCCATG GCCCATCACC ATCACCATCA CAACGTGACA CCGTTGGATG AATTGC-3 ': the underlined portion represents the NcoI site) And MED6-4 primer (5'-GGGGAGATCT TCTCATATGT AATTTGGGG-3 ': the underlined part represents the Bgl II site), and PCR method for MED6 ORF region having 6 histidine tags at the 5'-end Amplified by. The 900 bp PCR product was digested with NcoI and Bgl II and cloned into the NcoI / BamHI site of pET11d (Novagen) to produce recombinant plasmid pET-MED6 (see FIG. 1E). Final clones of bacterial expression were identified by DNA sequencing, and recombinant Med6p and Srb5p were isolated and purified from strain BL21 (DE3) (Novagen) with plasmids pET-MED6 and pET-Srg5, respectively (Thompson, CM, AJ Koleske, DM Chao, and RA Young, (1993), Cell, 73: see method of 1361-1375).

5. 단백질 정제5. Protein Purification

800g의 MED6 야생형 세포 [YCL10; Mat α ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 med6;;LEU2 (MED6 on pRS313, HIS3)]와 동일한 양의 med6 ts 돌연변이 세포 [YCL8; Mat α ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 med6:: LEU2 (medt ts on pRS313, HIS3)]로부터 전사조절 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체를 분리 정제하였다. 이 과정에서 4종류의 크로마토그라피를 실시하였다: BioRex 70 IBio-Rad), DEAE-세파로오스 FF (Pharmacia), Biogel-HTP 하이드록시아파타이트 (Bio-Rad) 및 MonoQ HR 10/10 (Pharmacia) (Kim Y.-U., S. Bjouklund, Y.Li, M.H.Sayre, R.D. Kornberg, (1994), Cell, 77: 599-608 참조). 홀로-폴리머라제는 MonoQ HR 10/10 칼럼으로부터 1M 아세트산칼륨을 용출용매로 이용하여 용출시켰고, 피크 형태로 나타낸 분획 (0.5-0.7mg/ml)의 일부 (1㎕)를 이용하여 각각 전사분석 하였다.800 g of MED6 wild type cell [YCL10; Mat α ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 med6 ;; same amount of med6 ts mutant cells [YCL8; LEU2 (MED6 on pRS313, HIS3)]; Transcription mediator-RNA polymerase II complex was isolated and purified from Mat α ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 med6 :: LEU2 (medt ts on pRS313, HIS3). Four types of chromatography were performed in this process: BioRex 70 IBio-Rad), DEAE-Sepharose FF (Pharmacia), Biogel-HTP hydroxyapatite (Bio-Rad) and MonoQ HR 10/10 (Pharmacia) ( Kim Y.-U., S. Bjouklund, Y.Li, MHSayre, RD Kornberg, (1994), Cell, 77: 599-608). Holo-polymerase was eluted from the MonoQ HR 10/10 column using 1M potassium acetate as the elution solvent, and was respectively transcribed using a portion (1 μl) of the fraction (0.5-0.7 mg / ml) indicated in peak form. .

하기 실시예들은 전사조절 매개체 단백질의 기능분석을 위한 실험들에 관한 것이다.The following examples pertain to experiments for the functional analysis of transcriptional regulator protein.

[실시예 2]Example 2

본 실시예는 med6 ts 돌연변이의 RNA 폴리머라제 특이성을 알아보기 위해 이루어졌다.This example was made to determine the RNA polymerase specificity of the med6 ts mutant.

Med6p는 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체의 하나의 성분이므로, MED6의 기능은 RNA 폴라머라제II에 의한 전사로만 제한되는 것으로 보인다. 이러한 가능성을 조사하기 위하여, rRNA, DED1 및 tRNA 유전자 각각의 전사수준에 측정함으로써 RNA 폴리머라제I, II 및 III에 의한 전사에 med6 돌연변이가 미치는 영향을 조사하였다. (도 2a 참조). mRNA에 비해 비교적 반감기가 긴 rRNA와 tRNA의 경우에는, 이들의 전구체 형태에 대해 특이적인 프로우브를 이용하여 이들의 합성율을 측정하였다. 도 2a에 나타나 있는 바와 같이, 예상대로 rRNA와 tRNA 전구체의 수준은 비허용 온도에서 med6 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았고, DED1의 mRNA 수준도 영향을 받지 않았다. 따라서, med6 돌연변이가 특정 RNA 폴리머라제II에 의해 전사되는 유전자에만 영향을 준다는 가능성만이 남게 되었다. 그러므로, 아미노산 대사 (HIS3 및 TRP3) 및 탄소원 대사 (GAL1 및 PYK1)와 관련된 유전자의 전사 활성화 및 MED6자체에 대한 med6 ts 돌연변이의 영향을 조사하였다. med6 ts 돌연변이는 비허용 온도에서 GAL1의 전사를 활성화시키지 않았으며, PYK1 전자를 2-3배 감소시켰다. 그러나, med6 돌연변이 유전자는 TRP3 및 MED6의 전사에는 영향을 주지 않았다. 또한, 동일한 플라스미드에 med6와 HIS3 유전자를 모두 위치시키는 인위적인 조건변화로 인해 HIS3 전사체의 전체 수준이 돌연변이 세포에서 증가된다고 하더라고, HIS3의 활성화된 전사 (+13)에 대해 항상 이루어지는 전사 (+1)의 비가 med6 돌연변이에 의해 변경되지 않았다. 즉, med6 돌연변이는 RNA 폴리머라제II에 의해 전사되는 특정 유전자만의 전사 활성화에 영향을 미치는 것을 나타났다.Since Med6p is a component of the mediator-RNA polymerase II complex, the function of MED6 appears to be limited to transcription by RNA polymerase II only. To investigate this possibility, the effect of med6 mutations on transcription by RNA polymerases I, II and III was examined by measuring the transcriptional levels of rRNA, DED1 and tRNA genes respectively. (See FIG. 2A). For rRNAs and tRNAs that have a relatively long half-life compared to mRNA, their synthesis rates were measured using probes specific for their precursor morphology. As shown in FIG. 2A, as expected, the levels of rRNA and tRNA precursors were not affected by med6 mutations at unacceptable temperatures, and mRNA levels of DED1 were also unaffected. Thus, the possibility remains that med6 mutations only affect genes transcribed by specific RNA polymerase II. Therefore, the effects of med6 ts mutations on the transcriptional activation of genes associated with amino acid metabolism (HIS3 and TRP3) and carbon source metabolism (GAL1 and PYK1) and MED6 itself were investigated. The med6 ts mutant did not activate the transcription of GAL1 at unacceptable temperatures and reduced PYK1 electrons 2-3 times. However, the med6 mutant gene did not affect the transcription of TRP3 and MED6. In addition, transcriptional (+1) always occurs for activated transcription of HIS3 (+13), even though the overall level of HIS3 transcript is increased in mutant cells due to an artificial conditional change that places both the med6 and HIS3 genes in the same plasmid. The ratio was not changed by the med6 mutation. In other words, med6 mutations have been shown to affect transcriptional activation of only certain genes transcribed by RNA polymerase II.

[실시예 3]Example 3

본 실시예는 med6 ts 유전자가 GAL1 및 SUC2 유전자의 전사조절에 미치는 영향을 알아보기 위히 이루어졌다.This example was performed to determine the effect of med6 ts gene on the transcriptional regulation of GAL1 and SUC2 genes.

통상의 방법에 따른 탄소원 이용성에 대한 실험을 실시한 결과, med6 ts 돌연변이가 GAL1의 전사를 활성화시키지 못하는 결함을 가지고 있는 것과 아울러, med6 ts 돌연변이 균주는 포도당 이외의 탄소원이 공급될 때 허용 온도에서조차도 야생형에 비해 성장속도가 2배 내지 3배 느린 것으로 나타났아. 이에 따라, med6 돌연변이가 SUC2 유전자의 전사에 미치는 영향에 대해서도 역시 조사해 보았다. S1 뉴클레아제를 이용한 분석실험 결과, mnd6 ts 돌연변이 균주가 비허용 온도에서 배양되는 경우 갈락토오스 배지에서의 GAL1 전사의 예상되는 활성화와 라피노오스 배지에서의 SUC2 전사의 탈억제가 완전히 저해되었다 (도 2b 참조). 이로부터, Med6p의 ts 활성이 GAL1, PYK1 및 SUC2의 전사 활성화에 주로 영향을 미친다는 것을 알수 있게 되었다.Experiments on the availability of carbon sources according to conventional methods have shown that the med6 ts mutant has a defect that does not activate the transcription of GAL1, and that the med6 ts mutant strain is resistant to wild type even at acceptable temperatures when a carbon source other than glucose is supplied. The growth rate was 2 to 3 times slower. Accordingly, the effects of the med6 mutation on the transcription of the SUC2 gene were also examined. Assays using S1 nuclease completely inhibited the expected activation of GAL1 transcription in galactose medium and the deinhibition of SUC2 transcription in raffinose medium when the mnd6 ts mutant strain was incubated at unacceptable temperature (FIG. 2b). From this, it can be seen that the ts activity of Med6p mainly affects the transcriptional activation of GAL1, PYK1 and SUC2.

[실시예 4]Example 4

본 실시예는 med6 돌연변이가 교배형 특이성 유전자에 미치는 영향을 알아보기 위해 이루어졌다.This example was performed to determine the effect of med6 mutations on the cross-type specific genes.

탄소원 대사의 결함과 비정상적인 형태는, med6 돌연변이가 다른 매개체 돌연변이 유전자 (gal11, rgr1, sin4)와 공유하고 있는 일반적인 표현형이다. 그러므로, med6 ts 유전자가 교배 특이성 유전자의 전사에 있어서 결함을 나타내는 지를 조사하였다. 먼저, 할로 (성장저해) 분석을 이용하여 야생형과 med6 돌연변이 균주에 의해 만들어지는 α-인자의 양을 조사하였다. α-인자의 생산은 시험 균주(MATa, sst1: 교배형 인자 α에 대해 초감수성을 나타내는 균주)의 성장저해영역의 크기를 통해 알 수 있다.Defects and abnormal forms of carbon source metabolism are common phenotypes that med6 mutations share with other mediator mutant genes (gal11, rgr1, sin4). Therefore, it was examined whether the med6 ts gene showed a defect in the transcription of the cross-specific gene. First, the amount of α-factor produced by wild type and med6 mutant strains was investigated using halo (inhibition of growth) analysis. The production of the α-factor can be seen through the size of the growth inhibition region of the test strain (MATa, sst1: strain that exhibits supersensitive to cross-type factor α).

교배형 인자 분석실험의 결과를 나타내는 도 3a을 참조하면, 야생형 균주(YCL4) 주위의 할로의 크기는 mde6 ts 균주 (YCL8)의 경우에 비해 약 3배 크다. 이는 허용온도에서 조차도 med6 ts 돌연변이에 의한 α-인자의 생산이 감소되었다는 것을 의미하는 것이다.Referring to FIG. 3A, which shows the results of a cross-type factor assay, the size of the halo around the wild type strain (YCL4) is about three times larger than that of the mde6 ts strain (YCL8). This means that the production of α-factor by med6 ts mutations was reduced even at acceptable temperatures.

또한, 손상된 α-인자의 생산이 적어도 부분적으로는 MFα1(세포에서 대부분의 α-인자를 코딩함)의 전사활성화 결함에 의한 것인지를 알아 보기 위하여 MFα1전사체의 수준을 측정하였다. 아울러, MFα1 전사에 대한 직접적인 영향과 간접적인 영향을 구별하기 위하여, MFα1의 전사 활성화제 (Matα1p)와 보조활성화제(Mcm1p)의 발현에 대해서도 조사하였다.In addition, the level of MFα1 transcript was measured to determine whether the production of impaired α-factor was at least partly due to transcriptional activation defects of MFα1 (coding most α-factors in cells). In addition, the expression of transcriptional activator (Matα1p) and coactivator (Mcm1p) of MFα1 was investigated to distinguish between direct and indirect effects on MFα1 transcription.

노던 블롯 분석 결과, MFα1의 전사는 제한 온도에서 성장된 med6 돌연변이 균주에서 실질적으로 감소된 반면, MATα1과 MCM1 전사체의 수준에는 영향이 없는 것으로 나타났다 (도 3b 참조). 그러므로, Med6p는 MFα1의 전사 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.Northern blot analysis showed that transcription of MFα1 was substantially reduced in med6 mutant strains grown at limit temperature, while there was no effect on the levels of MATα1 and MCM1 transcripts (see FIG. 3B). Therefore, Med6p has been shown to play an important role in the transcriptional activation of MFα1.

교배형 특이성 유전자의 조절은 전사 활성화 뿐만아니라 전사 억제수준에서도 이루어진다. α-세포에서, BAR1과 같은 a-특이성 유전자의 전사는 억제제 복합체인 Matα2p-Mcm1p에 의해 저해된다. med6 돌연변이가 GAL1과 SUC2 전사의 억제에는 영향을 주지 않는다고 하더라고, 세 개의 전사조절 매개체 성분인 Gal11p, Rgr1p 및 Sin4p가 전사의 양성 및 음성 조절제로서 작용을 하는 것으로 밝혀졌기 때문에 BAR1의 전사 억제시 Med6p의 역할에 대해 조사하였다. 도 3b에도시되어 있는 바와 같이, BAR1 전사체의 억제 정도가 높아지지 않고 비허용 온도에서 med6 돌연변이에 의해 오히려 약간 감소하였다. 이러한 결과는 med6 ts 유전자가 a-특이적 유전자인 BAR1의 전사억제에 영향을 주지 않는 것을 의미하는 것이다.Regulation of cross-specific genes occurs not only in transcriptional activation but also in transcriptional inhibition. In α-cells, transcription of a-specific genes such as BAR1 is inhibited by the inhibitor complex Matα2p-Mcm1p. Although the med6 mutant did not affect the inhibition of GAL1 and SUC2 transcription, the three transcription regulators, Gal11p, Rgr1p and Sin4p, were found to act as positive and negative regulators of transcription, thus inhibiting the transcription of Med6p. The role was investigated. As shown in FIG. 3B, the degree of inhibition of BAR1 transcripts did not increase but rather decreased slightly by med6 mutations at unacceptable temperatures. These results indicate that the med6 ts gene does not affect the transcriptional repression of a-specific gene BAR1.

[실시예 5]Example 5

본 실시예는 med6 ts 돌연변이가 핵 추출물을 이용한 전사에 미치는 효과를 알아봄으로써 전사 활성화과 관련된 그 기능을 알아보기 위한 것이다.This example examines the effects of med6 ts mutations on transcription using nuclear extracts to determine their function related to transcriptional activation.

전술한 생체내시험에서는, Med6p가 RNA 폴리머라제II에의해 전사되는 몇몇 종류의 유전자에 대해 전사를 활성화시키는 작용을 하는 것으로 나타났다. 시험관내 시험에 있어서, 전사 활성화에 미치는 med6 ts 돌연변이의 효과를 조사하기 위해서 야생형과 med6 돌연변이 세포로부터 제조한 핵 추출물의 전사 활성을 조사하였다.In vivo tests described above have shown that Med6p acts to activate transcription for several types of genes transcribed by RNA polymerase II. In in vitro testing, the transcriptional activity of nuclear extracts prepared from wild-type and med6 mutant cells was examined to investigate the effect of med6 ts mutations on transcriptional activation.

도 4a에 도시되어 있는 바와 같이, 야생형과 돌연변이 핵 추출물은 모두 25℃ (레인 1,2,6 및 7)에서 실험하는 경우에는 활성화된 전사 및 기본적 전사에 있어 비슷한 활성을 나타내었다. 25℃에서 전사반응을 개시하기에 앞서서 30-34℃에서 핵 추출물을 10분간 처리한 경우에는, 각각의 효소의 활성은 변화되지 않으면서 기본적인 전사와 활성화된 전사가 모두 점진적으로 감소되는 것으로 나타났다 (활성화 배수 (포스포이미저를 이용한 정량분석을 기준으로 함) 측정법에 따르면 14-16배). 그러나, 37℃에서 돌연변이 추출물을 전처리한 경우에는 기본적인 전사 보다는 활성화된 전사가 크게 감소되었는데 (레인 10), 동일한 조건하에서 야생형 핵 추출물 (레인 5)에 의해서는 16배 활성화되는데 비해 단지 6배만 활성화되었다.As shown in FIG. 4A, both wild-type and mutant nuclear extracts showed similar activity in activated and basic transcription when tested at 25 ° C. (lanes 1,2,6 and 7). When the nuclear extract was treated at 30-34 ° C. for 10 minutes prior to initiating the transcription reaction at 25 ° C., it was shown that both basic and activated transcription were gradually reduced without altering the activity of each enzyme ( Activation fold (based on quantitative analysis with a phosphorusizer) 14-16 times according to the measurement method). However, pretreatment of the mutant extract at 37 ° C. resulted in a significant decrease in activated transcription rather than basic transcription (lane 10), but only six-fold activation compared to 16-fold activation by wild-type nuclear extract (lane 5) under the same conditions. .

이러한 전사 결함이 med6 돌연변이에 의한 것인가를 확인하기 위해 재조합 Med6p (r-Med6p)가 med6 돌연변이 핵 추출물의 전사 결함을 구제할 수 있는 지를 조사하였다 (도 4b 참조). 야생형 핵 추출물에 r-Med6p를 첨가하는 경우, 핵 추출물이 37℃에서 예비배양이 되든 (레인 3, 4: 12배 활성화) 또는 되지 않든 (레인 1,2: 11배 활성화) 기본적 및 활성화된 전사에는 별다른 영향이 없었다. 그러나, 돌연변이를 r-Med6p와 예비배양하는 경우에는, 전사 활성화에 있어서의 온도 의존성 결함 (레인 4: 12배 활성화, 레인 8: 10배 활성화)과 기본적인 전사에 있어서의 온도 비의존성 결함이 야생형 추출물에서 얻은 결과 수준으로 구제되었다 (돌연변이의 홀로-폴리머라제가 허용 조건하에서도 야생형 효소에 비해 약간 낮은 전사 활성을 가지고 있었다) (도 7a 참조, 상세한 설명은 후술함). 이러한 상보적인 활성은 Med6p에 특이적인 것이다: 재조합 Srb5 단백질 (r-Srb5p)은, 동일한 분석방법으로 시험된 경우, 전사에 영향을 주지 않았다 (레인 7, 9: 5배 활성화). 그러므로, 핵 추출물을 이용하여 얻은 시험관내 실험 데이터는 Med6p의 온도 감수성 기능이 기본적인 전사보다는 전사 활성화에 필요하다는 생체내 실험결과를 강하게 지지하는 것이었다.In order to confirm whether these transcription defects are caused by med6 mutations, it was examined whether recombinant Med6p (r-Med6p) could rescue transcriptional defects of med6 mutant nuclear extracts (see FIG. 4B). When r-Med6p is added to the wild-type nuclear extract, whether the nuclear extract is preincubated at 37 ° C. (lane 3, 4: 12-fold activation) or not (lane 1,2: 11-fold activation) basic and activated transcription There was no significant effect. However, when mutants were preincubated with r-Med6p, temperature-dependent defects in transcriptional activation (lane 4: 12-fold activation, lane 8: 10-fold activation) and temperature-independent defects in basic transcription were found in wild-type extracts. It was rescued to the level of results obtained in (the mutant holopolymerase had slightly lower transcriptional activity than wild-type enzyme even under acceptable conditions) (see FIG. 7A, detailed description below). This complementary activity is specific for Med6p: recombinant Srb5 protein (r-Srb5p) did not affect transcription when tested in the same assay (lane 7, 9: 5 fold activation). Therefore, in vitro experimental data obtained using nuclear extracts strongly supported in vivo experimental results that the temperature sensitive function of Med6p is required for transcriptional activation rather than basic transcription.

med6p가 전사에 어떤식으로 영향을 미치는 지를 알아보기 위하여, 복수본 플라스미드상에 존재하는 med6p를 med6p 돌연변이 세포에서 과잉발현시켰다. 그러나, med6p ts 유전자의 수가 증가되어도 돌연변이 세포에서 med6p의 수준은 증가되지 않았다. 그러므로, 돌연변이 세포의 ts 치사성은 억제되지 않았다. 이러한 결과는, med6p의 ts 돌연변이로 인해 홀로-폴리머라제와의 결합이 느슨하게 된다는 것을 시사하는 것인데, 결합이 느슨해지면 발현 수준에 관계 없이 돌연변이 med6p의 급속한 열화가 일어나게 된다.To determine how med6p affects transcription, med6p present on the plural plasmid was overexpressed in med6p mutant cells. However, even if the number of med6p ts genes was increased, the level of med6p in mutant cells was not increased. Therefore, ts lethality of mutant cells was not inhibited. These results suggest that the ts mutation of med6p loosens the binding to the holo-polymerase, which results in rapid degradation of the mutant med6p regardless of the expression level.

[실시예 6]Example 6

본 실시예는 야생형과 med6 ts 돌연변이로부터 추출된 매개체-RNA 폴리머라제II의 폴리펩티드 조성을 알아보기 위한 것이다.This example is to examine the polypeptide composition of mediator-RNA polymerase II extracted from wild type and med6 ts mutations.

먼저, med6 돌연변이만이 전사 활성화 결함과 관계가 있는 것인지를 알아내기 위하여, med6 돌연변이 균주로부터 전사조절 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체(홀로-폴리머라제)를 분리하여 그것의 써브 유니트 조성을 분석하였다. 야생형과 돌연변이 균주로부터 이스트의 전체 세포 추출물을 Bio-Rex70, DEAE-세파로오스, 하이드록시아파타이트 및 MonoQ 칼럼을 이용한 크로마토그라피방법으로 분리하였다. 야생형과 돌연변이 홀로-폴리머라제는 칼럼 크로마토그라피 과정동안 비슷한 생화학적 특성을 가지고 있는 것으로 나타났다.First, to determine whether only med6 mutations are associated with transcriptional activation defects, transcriptional regulator-RNA polymerase II complexes (hol-polymerases) were isolated from med6 mutant strains and their subunit composition was analyzed. Whole cell extracts of yeast from wild-type and mutant strains were isolated by chromatography using Bio-Rex70, DEAE-Sepharose, hydroxyapatite and MonoQ columns. Wild type and mutant holopolymerases were found to have similar biochemical properties during column chromatography.

웨스턴 블롯 실험 결과, Med6p는 정제과정 동안 계속하여 다른 전사조절 매개체 성분들과 함께 이동하였다 (도 5a 참조). 마찬가지로, 돌연변이 Med6 단백질 (med6p)도 또한 정제과정동안 다른 전사조절 매개체 써브유니트와 함께 분리되었다 (도 5b 참조).As a result of Western blot experiment, Med6p continued to migrate with other transcriptional regulatory media components during purification (see FIG. 5A). Likewise, the mutant Med6 protein (med6p) was also isolated along with other transcriptional regulator subunits during purification (see Figure 5b).

도 6a는 홀로-폴리머라제에 대한 면역블롯팅 분석결과를 나타내는 도면인데, 이를 위해 다음과 같은 방법으로 실험하였다. 친화성을 이용하여 분리 정제된 안티-Srb5 항체 (100㎍)를 단백질 A-아가로즈 (Sigma) 비드 (100㎕)와 접합시켰다. Srb5 항체 비드 (30㎕)를 50㎕의 홀로-폴리머라제 분획 (MonoQ 칼럼)과 함께 4℃에서 12시간 동안 배양한 다음 0.8M 아세트산칼륨을 포함하는 1ml의 완충용액 (IP[20mM Tris-Hcl (pH8.0), 0.1mM EDTA, 0.2% Nonidet P-40, 10% (v/v) 글리세롤])로 3회 세척하였다. 결합된 단백질을 5M 요소를 포함하는 30㎕의 완충용액 (IP)으로 2회 용출시켰다. 용출된 단백질을 실버 염색방법으로 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 발색시켰다.Figure 6a is a diagram showing the results of immunoblotting analysis for the holo-polymerase, for this purpose was tested by the following method. The affinity was used to conjugate purified anti-Srb5 antibody (100 μg) with protein A-agarose (Sigma) beads (100 μl). Srb5 antibody beads (30 μl) were incubated with 50 μl of the holo-polymerase fraction (MonoQ column) at 4 ° C. for 12 hours and then 1 ml of buffer solution containing 0.8 M potassium acetate (IP [20 mM Tris-Hcl ( pH8.0), 0.1 mM EDTA, 0.2% Nonidet P-40, 10% (v / v) glycerol]). The bound protein was eluted twice with 30 μl of buffer (IP) containing 5M urea. The eluted protein was developed on a 10% SDS-polyacrylamide gel by silver staining.

그 결과, 야생형 Med6p에 대한 항체를 이용하여 돌연변이 홀로-폴리머라제 분획에서 측정된 med6p의 양은 야생형 분획의 Med6p 양의 단지 약 10-15%에 불과하였다 (도 6a 참조). 항Med6p 항체는 야생형 단백질과 돌연변이 Med6 재조합 단백질 모두에 대해 동일한 정도로 양호하게 가교반응을 나타내는 것으로부터, 돌연변이 분획의 med6p는 다른 전사조절 매개체 성분에 대해 1:1 비율 이하로 존재하는 것을 알 수 있었다. 돌연변이 핵 추출물에 있는 med6p의 전체 양도 또한 야생형 핵 추출물의 경우에 비해 약10-15% 정도인데, 이로부터 돌연변이 홀로-폴리머라제에 med6p가 적게 포함되어 있는 것이 정제과정중에서 돌연변이 단백질이 분해되기 때문만은 아니라는 것을 알 수 있다. 또한, med6p의 분해된 형태는 전체 정제 과정을 통해 다른 분획에서는 검출되지 않았다. 그러므로, 모든 med6p는 생체내에서 매개복합체와 결합된 형태로 존재하는 것으로 보인다.As a result, the amount of med6p measured in the mutant hol-polymerase fraction using the antibody against wild type Med6p was only about 10-15% of the Med6p amount of the wild type fraction (see FIG. 6A). Anti-Med6p antibody showed good crosslinking reaction to both wild type protein and mutant Med6 recombinant protein, indicating that med6p of the mutant fraction was present in a ratio of 1: 1 or less relative to other transcriptional regulatory media components. The total amount of med6p in the mutant nucleus extract is also about 10-15% compared to that of the wild-type nucleus extract, since the mutant hol-polymerase contains less med6p because the mutant protein is degraded during purification. You can see that it is not. In addition, the degraded form of med6p was not detected in other fractions throughout the entire purification process. Therefore, all med6p appears to exist in bound form with mediator complex in vivo.

돌연변이 med6p의 양이 감소되는 경우, 돌연변이 홀로-폴리머라제에 대한 다른 전사조절 매개체 성분들의 결합이 저해되는 지를 알아보기 위해 Srb5p에 대한 항체를 이용하여 야생형과 돌연변이 홀로-폴리머라제를 면역침전반응시키고, 그 반응에 형성된 면역 복합체를 실버 염색법으로 분석하였다.When the amount of mutant med6p is reduced, immunoprecipitation of wild-type and mutant holopolymerases is performed using an antibody against Srb5p to see if the binding of other transcriptional mediator components to mutant hol-polymerases is inhibited, The immune complexes formed in the reaction were analyzed by silver staining.

두 개의 홀로-폴리머라제의 폴리펩티드 조성은, 돌연변이 호롤-폴리머라제의 경우에 38kDa 폴리펩티드 양이 크게 감소된 것을 제외하고는 구별이 불가능하였다 (도 6b 참조). 상기 38kDa 폴리펩티드는 Med6p에 대한 항체와 가교반응하였다. 홀로-폴리머라제의 면역침전실험 결과는, Med6p가 홀로-폴리머라제의 한 성분이며, 홀로-폴리머라제의 그 외의 성분은 돌연변이 홀로-폴리머라제에 결여되어 있지 않다는 것을 의미한다.The polypeptide composition of the two holo-polymerases was indistinguishable except that the amount of 38 kDa polypeptide was greatly reduced in the case of mutant horol-polymerases (see FIG. 6B). The 38 kDa polypeptide was crosslinked with an antibody against Med6p. The results of immunoprecipitation experiments of the holopolymerases indicate that Med6p is a component of the holopolymerase and the other components of the holopolymerase are devoid of mutant holopolymerases.

[실시예 7]Example 7

이전의 연구에 의하면, 전사조절 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체 (홀로-폴리머라제)가 코어-RNA 폴리머라제II와는 구별되는, 가능상의 특징을 세가지 가지고 있다: (1)기본적인 전사의 자극 (5배 내지 10배), (2) 활성화 단백질에 대한 반응성 및 (3) TF II H에 의한 Rpb1 CTD의 인산화율의 실질적인 증가 (10 내지 40배). 그러므로, 본 실시예는 시험관내에서의 전사 (즉, 시험관내에서 재조합된 시스템을 이용한 전사) 여부 및 CTD 인산화율을 알아보기 위한 것이다.Previous studies have shown that the transcriptional mediator-RNA polymerase II complex (hol-polymerase) has three possible characteristics that distinguish it from core-RNA polymerase II: (1) Basic transcriptional stimulation (five-fold) To 10 fold), (2) a substantial increase in reactivity to the activating protein and (3) phosphorylation of Rpb1 CTD by TF II H (10 to 40 fold). Therefore, this example is intended to determine whether in vitro transcription (ie, transcription using a recombinant system in vitro) and CTD phosphorylation rate.

1. 재조합된 시험관내에서의 전사 실험1. Transcriptional experiments in recombinant in vitro

이스트 균주 YCL8과 YCL10으로부터 핵을 추출하였다 (Lue, N.F., and R.D.Kornberg, (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8839-8843 참조). 이 핵 추출물을 이용하여 시험관내 전사를 실시하였다 (Wang, Z., S. Buratowski, J.Q. Svejstrup, W.J. Feaver, X. Wu, R.D. Kornberg, T.F. Donahue, and E.C. Friedberg, (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 2288-2293 참조).Nuclei were extracted from yeast strains YCL8 and YCL10 (see Lue, N.F., and R.D. Kornberg, (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8839-8843). In vitro transcription was performed using this nuclear extract (Wang, Z., S. Buratowski, JQ Svejstrup, WJ Feaver, X. Wu, RD Kornberg, TF Donahue, and EC Friedberg, (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 2288-2293).

특이적인 전사 분석을 통해, med6p의 ts 활성을 알아보기 위하여 CTP와 UTP를 제외한 전사 반응의 모든 성분을 25℃ 또는 37℃에서 10분 동안 예비배양한 다음, 뉴클레오티드를 첨가하여 25℃에서 전사체를 연장시키는 반응을 실시하였다 (도 7a 참조). 이 과정을 보다 상세히 설명하면, 먼저 야생형과 med6 ts 돌연변이 홀로-폴리머라제 (각각 700ng, MonoQ 분획)를 25℃ 또는 37℃에서 10분 동안 다른 보충물 (2개의 주형 (150ng씩의 pJJ470 및 pS(GCN4)²CG), 일반적인 전사인자들, 0.5mM ATP를 포함하며, Ga14VP16 활성화제는 포함 (30ng)하거나 또는 포함하지 않음)과 함께 예비배양하여 개시 복합체를 형성하였다. [α-³²P]UTP (10μCi) 및 CTP를 첨가하고 25℃에서 30분 동안 계속 배양하였다. 개시 복합체 형성 후 결함을 조사하기 위하여, 개시기 (10분, 25℃) 후 열처리 (10분, 37℃)를 실시하고 남아 있는 뉴클레오티드를 첨가함으로써 전사반응 (30분, 25℃)을 개시하였다. 모든 전사 반응시 180mM 아세트산칼륨을 이용하였다. 반응을 50분 동안 계속시켰다. 반응 생성물을 정제하여 7% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하고 전술한 바와 같은 정량장치를 이용하여 정량하였다 (도 7a 참조).Through specific transcription analysis, all components of the transcriptional reaction except CTP and UTP were preincubated for 10 minutes at 25 ° C or 37 ° C for 10 minutes to determine the ts activity of med6p, and then nucleotides were added to the transcript at 25 ° C. An extended reaction was conducted (see FIG. 7A). To explain this process in more detail, first, wild-type and med6 ts mutant holopolymerases (700 ng, MonoQ fraction, respectively) were added to the other supplements (two templates (150 ng of pJJ470 and pS (10 ng) for 10 min at 25 ° C or 37 ° C). GCN4) ² CG), common transcription factors, 0.5 mM ATP, with Ga14VP16 activator with (30 ng) or without) to incubate to form the initiation complex. [α- ³² P] UTP (10 μCi) and CTP were added and continued incubation at 25 ° C. for 30 minutes. In order to examine the defects after the formation of the initiation complex, a transcription reaction (30 minutes, 25 ° C.) was initiated by performing heat treatment (10 minutes, 37 ° C.) after the initiator (10 minutes, 25 ° C.) and adding the remaining nucleotides. 180 mM potassium acetate was used for all transcription reactions. The reaction was continued for 50 minutes. The reaction product was purified and analyzed by 7% modified polyacrylamide gel electrophoresis and quantified using a quantifier as described above (see FIG. 7A).

그 결과, 기본적인 전사에 미치는 med6 ts 돌연변이의 효과에 있어서는, med6 돌연변이 홀로-폴리머라제의 활성이 야생형 홀로-폴리머라제 활성의 70% 인것으로 나타났다 (도 7a, 레인 1, 6). 37℃에서 예비배양하는 경우에는 돌연변이 홀로-폴리머라제의 기본적인 전사 활성이 약간 감소되었다 (도 7a, 레인 3, 8: 2배미만의 감소가 일정하게 관찰되었다).As a result, the effect of the med6 ts mutation on the basic transcription showed that the activity of the med6 mutant holo-polymerase was 70% of the wild-type holo-polymerase activity (FIG. 7A, lanes 1, 6). The preliminary incubation at 37 ° C. slightly reduced the basic transcriptional activity of the mutant holo-polymerase (FIG. 7A, lanes 3, 8: less than 2 folds were consistently observed).

한편, 전사 활성화시 명백한 온도-의존성 결함이 med6 돌연변이 홀로-폴리머라제로부터 관찰되었다. Gal4VP16의 존재하에 25℃에서 전사 반응물을 예비배양하는 경우에는 (도 7a, No) 돌연변이와 야생형 홀로-폴리머라아제 모두 GAL4 인핸서를 함유하는 주형으로부터의 전사를 40배 이상의 수준으로 특이적으로 활성화시켰다 (각각 43배 및 40배, 도 7a, 레인 2, 7). 그러나, 개시 복합체 형성과정에서 열처리 (10분, 37℃)를 실시하고 이어서 25℃에서 연장반응을 실시하는 경우에는 (도 7a, DI), med6 돌연변이 홀로-폴리머라제에 의한 전사 활성화가 감소되었다 (6배, 도7a, 레인 9). 동일한 조건하에서, 야생형 홀로-폴리머라제에 의한 전사 활성화는 단지 약간만 감소되었는데, 이는 아마도 열에 의한 효소들의 비특이적인 불활성화로 인한 것으로 보인다 (28배, 도 7a, 레인 4). 또한, 돌연변이 홀로-폴리머라제에 의한 잘못된 전사 활성화는, 그 결함이 r-Med6p에 의해 구제된다는 사실로부터, 돌연변이 med6p로부터 특이적으로 초래된 것임을 확인하였다. 열처리 과정 중 돌연변이 홀로-폴리머라제에 r-Med6p를 첨가한 경우에는, 그 활성이 야생형 호로, 폴리머라제 수준으로 회복되었다 (24배, 도 7a, 레인 10). 이러한 구제 활성은 Med6p 기능에 특이적인 것이다: r-Srb5p가 돌연변이 홀로-폴리머라제에 첨가된 경우에는 비슷한 효과가 나타나지 않았으며, r-Med6p가 야생형 홀로-폴리머라제에 첨가된 경우에는 전사가 아무런 영향을 받지 않았다.On the other hand, apparent temperature-dependent defects in transcriptional activation were observed from med6 mutant holo-polymerases. When preincubating the transcriptional reactants at 25 ° C. in the presence of Gal4VP16 (FIG. 7A, No) both mutations and wild-type holopolymerases specifically activated transcription from a template containing a GAL4 enhancer to a level of at least 40-fold. (43 and 40 times, respectively, Figure 7A, lanes 2, 7). However, when heat treatment (10 min, 37 ° C.) was performed during the initial complex formation followed by an extension reaction at 25 ° C. (FIG. 7A, DI), transcriptional activation by med6 mutant holopolymerase was reduced ( 6 times, Figure 7a, lane 9). Under the same conditions, transcriptional activation by wild type holo-polymerase was only slightly reduced, presumably due to nonspecific inactivation of enzymes by heat (28-fold, FIG. 7A, lane 4). It was also confirmed that erroneous transcriptional activation by mutant hol-polymerases resulted specifically from mutant med6p from the fact that the defect was rescued by r-Med6p. When r-Med6p was added to the mutant holopolymerase during the heat treatment, the activity was restored to the wild type arc, polymerase level (24 fold, FIG. 7A, lane 10). This rescue activity is specific to Med6p function: similar effects were not seen when r-Srb5p was added to the mutant holo-polymerase, and transcription had no effect when r-Med6p was added to the wild type holo-polymerase. Did not receive.

개시 복합체의 형성되는 기간동안 돌연변이 홀로-폴리머라제를 열처리하는 경우에는 돌이킬 수 없는 결함이 야기된다고 하더라고, 개시 복합체 형성 후의 열 처리는 돌연변이 특이적인 결함을 일으키지 않았다 (도 7a, AI); 돌연변이 홀로-폴리머라제는 전사를 활성화시키는데 있어서 야생형만큼 강력한 것으로 나타났다 (야생형:21배, 돌연변이 15배, 도 7a, 레인 5, 11). 그러므로, Med6p 활성은 초기의 전사 활성화에 필요하며, 일단 개시 복합체가 형성되면 온도-감수성 Med6p 기능이 없어도 된다고 할 수 있다.Although heat treatment of the mutant holo-polymerases during the formation of the initiation complex results in irreversible defects, the heat treatment after initiation complex formation did not result in mutation specific defects (FIG. 7A, AI); Mutant holopolymerases have been shown to be as potent as wild type in activating transcription (wild type: 21 fold, mutant 15 fold, FIG. 7A, lanes 5, 11). Therefore, Med6p activity is required for initial transcriptional activation, and it can be said that once the initiation complex is formed, there is no need for temperature-sensitive Med6p function.

2. med6 돌연변이가 홀로-폴리머라제의 CTD 인산화에 미치는 영향2. Effect of med6 Mutation on CTD Phosphorylation of Holo-polymerase

CTD 인산화는 초기단계에서 연장단계 (elongation step)로 옮겨갈 때 중요한 단계이며, CTD 인산화율이 높을수록 전사 활성이 높다는 것을 의미한다.CTD phosphorylation is an important step in the transition from the initial stage to the elongation step. The higher the CTD phosphorylation rate, the higher the transcriptional activity.

CTD 인산화 분석을 위해, TF II H(40ng), 0.3μCi[γ-³²P]ATP를 포함하는 반응 혼합물과 다른 보충물을 코어- (100ng) 또는 홀로-폴리머라제 (300ng)에 첨가하여 열처리를 하거나 또는 하지 않은 채 반응 용적을 15㎕로 하여 25℃에서 30분 동안 배양하였다. 5㎕의 4×SDS-겔 로딩 완충용액을 첨가함으로써 반응을 중지시키고 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 분석하였다. 전사체와³²P-표지된 Rpb1을 전술한 정량장치를 이용하여 정량하였으며, 그 결과는 다음과 같다.For CTD phosphorylation analysis, the reaction mixture containing TF II H (40 ng), 0.3 μCi [γ- ³² P] ATP and other supplements were added to core- (100 ng) or holo-polymerase (300 ng) to heat treatment. The reaction volume was 15 µl with or without incubation at 25 ° C for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 5 μl of 4 × SDS-gel loading buffer and analyzed using 7.5% SDS-polyacrylamide gel. The transcript and ³² P-labeled Rpb1 were quantified using the above-described quantitative apparatus, and the results are as follows.

먼저, 동일한 양의 폴리머라제가 TF II H에 의해 인산화되는 경우, 양쪽의 홀로-폴리머라제가 코어-폴리머라제에 비해 10배 이상 효율적으로 인산화되는데 (야생형 13배, 돌연변이 10배, 도 7b, 레인 2, 3), 이는 25℃에서의 인산화에 앞서 37℃에서 배양되는 지의 여부에 관계가 없이 나타났다 (야생형 22배, 돌연변이 14배, 도 7b, 레인 5,7). 한편, 돌연변이 홀로-폴리머라제의 CTD 인산화율이 Med6p의 온도 감수성 활성과 무관하다고 하더라도, 동일한 조건하에서 야생형 홀로-폴리머라제의 경우에 비해 30% 정도 낮은 것으로 나타났는데, 이러한 결함은 r-Med6p를 첨가해도 구제되지 않는 것으로 보아 med6 돌연변이의 간접적인 효과때문인 것으로 보인다 (15배, 도 7b, 레인 8).First, when the same amount of polymerase is phosphorylated by TF II H, both holopolymerases are phosphorylated more than 10 times more efficiently than core-polymerase (wild type 13 times, mutant 10 times, FIG. 7B, lanes). 2, 3), which appeared irrespective of whether they were incubated at 37 ° C. prior to phosphorylation at 25 ° C. (wild type 22 times, mutation 14 times, FIG. 7B, lanes 5,7). On the other hand, even though the CTD phosphorylation rate of the mutant holopolymerase was independent of the temperature sensitive activity of Med6p, it was found to be about 30% lower than that of the wild type holopolymerase under the same conditions. It appears to be due to the indirect effect of the med6 mutant because it is not rescued (15-fold, FIG. 7B, lane 8).

도 7c는 상기 전사 및 CTD 인산화율에 대한 실험결과를 그래프로서 나타낸 것이다. 즉, 야생형과 온도 감수성 돌연변이 각각에 있어서, 열처리여부와 열처리 시점이 전사와 CTD 인산화율에 미치는 영향에 대한 도 7b의 결과를 그래프로서 도식적으로 나타낸 것이다.7c graphically shows the results of the transcription and CTD phosphorylation. In other words, in the wild type and temperature sensitive mutants, respectively, graphically shows the results of FIG. 7B on the effect of heat treatment and the time of heat treatment on transcription and CTD phosphorylation.

본 실시예를 통해 알 수 있는 것은, 매개복합체는 전사를 활성화시킬 뿐만아니라 기본적인 전사 및 RNA 폴리머라제II의 최대 써브유니트(Rpb1에 의해 코딩됨)의 카르복시 말단 영역 (CTD)의 인산화를 촉진할 수 있다는 것이다. 전사조절 매개체, TF II F와 코어-RNA 폴리머라제가 결합하면 RNA 폴리머라제II 홀로엔자임 (홀로-폴리머라제)을 형성하게 되는데, 이것은 RNA 폴리머라제II에 의한 시험관내의 전사 활성화시 충분하고도 필요한 조건으로 작용한다.It can be seen from this example that the mediator not only activates transcription but also can promote basic transcription and phosphorylation of the carboxy terminal region (CTD) of the maximum subunit of RNA polymerase II (encoded by Rpb1). Is there. The combination of the transcriptional regulator, TF II F, with the core-RNA polymerase forms RNA polymerase II holozyme (hol-polymerase), which is sufficient and necessary for in vitro transcriptional activation by RNA polymerase II. It acts as a condition.

상기 실시예들을 통해 알 수 있는 바와 같이, 유전학적 관점에서 Med6p는 새로운 부류의 이스트 단백질인데, 활성화제-인핸서 어셈블리의 성분을 구성하는 것도 아니며, 기본적인 전사기구의 성분을 구성하는 것도 아니지만, 전사 활성화에 절대적으로 필요한 것이다. Med6p가 여러 가지 다양한 이스트 프로모터의 전사 활성화에 절대적으로 필요하다는 사실은, 생체내에서의 전사 활성화에 있어서 매개복합체가 매우 중요하며 특수한 작용을 한다는 것을 의미한다. 즉, 전사 활성화에 있어서 Med6p는 TAF_II와 USA와 같은 다른 전사 보조인자와는 다른 의미를 갖는다. 즉, TAF_II는 일반적인 전사 인자인 TBP와 결합하며, 광범위한 생화학적 연구 결과 전사 활성화와 프로모터 선택에 있어서의 그들의 필수적인 역할이 밝혀지기는 했지만, 최근 이스트를 이용하여 TAF_II를 생체내 분석한 결과, TAF_II가 세포의 생존에는 필요하지만 TAF_II가 부족해도 대부분의 테스트된 프로모터의 전사에는 영향이 없는 것으로 나타났다. 그러므로, TAF_II는 세포 사이클 조절 또는 세포 분화에 관련된 필수적인 유전자 써브셋의 전사에는 필요하지만 일반적인 전사 활성화에는 없어도 무방하다. USA라고 불리우는 또 다른 전사 보조인자는 PC4를 포함하여 여러 가지 독립적인 보조인자를 포함하고 있다. PC4는 기본 인자-활성화제 상호작용을 용이하게 해줌으로써 전사를 활성화시키는 것으로 보인다. 포유동물의 PC4의 이스트 호모로그(Tsp1p/sub1p)의 기능을 분석한 결과, 이 단백질은 TF II B와 상호작용하며, 전사 활성화를 촉진하지만 Med6p와는 다르며, 세포의 생존에도 필요하지 않은 것으로 나탄났다.As can be seen from the above examples, from a genetic point of view, Med6p is a new class of yeast proteins that does not constitute a component of the activator-enhancer assembly, nor does it constitute a component of the basic transcription machinery, Is absolutely necessary. The fact that Med6p is absolutely necessary for the transcriptional activation of various different yeast promoters means that the mediator complex has a very important and special action for transcriptional activation in vivo. In other words, Med6p in transcriptional activation has a different meaning from other transcriptional cofactors such as TAF _II and USA. That is, TAF _II binds to TBP, a common transcription factor, and although extensive biochemical studies have revealed their essential role in transcriptional activation and promoter selection, recent in vivo analysis of TAF _II using yeast, Although TAF _II is necessary for cell survival, lack of TAF _II has not been shown to affect transcription of most tested promoters. Therefore, TAF _II is required for transcription of essential gene subsets involved in cell cycle regulation or cell differentiation, but may not be required for normal transcriptional activation. Another transcriptional cofactor called USA includes several independent cofactors, including PC4. PC4 appears to activate transcription by facilitating basic factor-activator interactions. Analysis of the function of the yeast homolog (Tsp1p / sub1p) of PC4 in mammals showed that this protein interacts with TF II B and promotes transcriptional activation but is different from Med6p and is not required for cell survival. .

TAF_II와 Tsp1p/Sub1p에 반해, Med6p는 이스트에서 시험된 대부분의 프로모터의 전사 활성화에 필수적이다. 시험된 유전자 (GAL1, SUC2, PYK1, MFα1 및 HIS3)중에서 단지 HIS3 유전자의 전사 활성화만이 med6 유전자에 의해 영향을 받지 않았으며, 다른 유전자들의 전사 활성화는 유도되지 않은 수준으로 감소되었다.In contrast to TAF _II and Tsp1p / Sub1p, Med6p is essential for transcriptional activation of most promoters tested in yeast. Of the genes tested (GAL1, SUC2, PYK1, MFα1 and HIS3), only the transcriptional activation of the HIS3 gene was unaffected by the med6 gene and the transcriptional activation of other genes was reduced to uninduced levels.

MED6가 본 발명자들이 테스트한 대부분의 프로모터의 전사 활성화에 필요한 것으로 나타났으나, med6 ts 돌연변이는 모든 세포성 프로모터로부터의 전사 활성화에 영향을 주지는 않았다. med6 유전자에 의한 영향은 GAL4 및 MATα1에 의해 조절되는 유전자에 대해서는 확인이 되었으나, GCN4에 의해 조절되는 유전자에 대해서는 확인되지 않았다. 이러한 차이는 돌연변이의 유전자 특이성에 기인하는 것으로 밝혀졌다.While MED6 has been shown to be required for transcriptional activation of most promoters tested by the inventors, med6 ts mutations did not affect transcriptional activation from all cellular promoters. The effect by the med6 gene was confirmed for genes regulated by GAL4 and MATα1, but not for genes regulated by GCN4. This difference was found to be due to the gene specificity of the mutation.

med6 유전자의 또 다른 놀랄만한 점은 유도되지 않았거나 억제된 전사가 아닌 활성화된 전사에만 영향을 준다는 것이다. 또한, 항상 구성적으로 발현되는 유전자의 전사나 높은 CTD-인산화율은 모두 홀로-폴리머라제의 기본적인 전사활성과 비례적인 관계가 있는데, med6 돌연변이에 의해서는 영향을 받지 않는다. 그러므로, RNA 폴리머라제II에 의한 일반적인 전사에 필요한 Srb 단백질과는 달리, Med6p는 활성화된 전사에만 필요하다는 점에서 독특하다. 한편, Rgr1p, Sin4p 및 Gal11p를 포함하여 또 다른 군의 전사조절 매개체는 전사 활성화 뿐만아니라 억제에도 관여한다. 전사조절 매개체의 여러 가지 기능 (기본적인 전사의 활성화, 억제 및 촉진)이 이루어지려면, 다른 종류의 전사조절 매개체 단백질이 필요한 것으로 보이는데, 이와 같은 사실은 매개복합체가 여러 가지 기능영역으로 구성되어 있다는 것을 의미하는 것이다.Another surprise with the med6 gene is that it only affects activated transcription, not induced or suppressed transcription. In addition, the transcription and high CTD-phosphorylation of constitutively expressed genes are all proportionally related to the basic transcriptional activity of the holopolymerase, but are not affected by the med6 mutation. Therefore, unlike Srb protein, which is required for normal transcription by RNA polymerase II, Med6p is unique in that it is only needed for activated transcription. On the other hand, another group of transcriptional regulators, including Rgr1p, Sin4p and Gal11p, are involved in inhibition as well as transcriptional activation. Different functions of transcriptional regulatory mediators (basic activation, inhibition and promotion of transcription) appear to require different kinds of transcriptional mediator proteins, which means that the mediator is composed of several functional domains. It is.

종래에는, 전사활성화의 조절이 전사 활성화제나 폴리머라제의 기능을 조절하므로써 이루어지는 것으로 알려져 있었으나, 실제 활성화제가 어떠한 방법으로 전사를 조절하는 지에 대해서는 밝혀진 바가 없었다. 또한, 활성화제나 일반 전사인자에 속하지 않으면서, 전사활성화를 조절하는 것으로 알려진 단백질은 보고된 바가 없었다. 본 발명에서는, MED6라는 유전자를 새로이 찾아내고 이 유전자가 전사활성화 매개체의 구성요소로서 일군의 특정한 유전자의 전사를 활성화시키는데 필수적이라는 사실로부터 전사조절에 관여하는 새로운 종류의 단백질을 제공할 수 있게 되었다. 즉, 전사조절 매개체 유전자 MED6가 탄소원 이용과 교배형 특이 경로에 관련된 특정한 유전자들의 전자활성화에 절대적으로 필요하지만 모든 유전자의 전사활성화를 조절하는 것은 아니라는 사실을 알아냄으로써, 이들 특정 유전자들만 한정적으로 전사조절할 수 있는 방법의 개발이 가능하게 되었다. 따라서, 본 발명은 효모를 이용한 유전자 발현조절시 상업적으로 유용한 유전자의 발현을 증가 또는 억제하는 방법을 개발하는데 이용될 수 있다.Conventionally, the regulation of transcriptional activation is known by controlling the function of transcriptional activator or polymerase, but it is not known how the activator actually regulates transcription. In addition, no protein has been reported that is known to regulate transcriptional activation without belonging to an activator or a general transcription factor. In the present invention, a new gene called MED6 can be found and a new type of protein involved in transcriptional regulation can be provided from the fact that this gene is essential for activating transcription of a group of specific genes as a component of a transcriptional activation medium. That is, the transcriptional mediator gene MED6 is absolutely necessary for the electron activation of specific genes involved in the use of carbon sources and cross-specific pathways, but it does not regulate transcriptional activation of all genes. Development of the method is now possible. Therefore, the present invention can be used to develop a method for increasing or inhibiting the expression of commercially useful genes in controlling gene expression using yeast.

Claims

전사를 매개하는 작용을 하며, 그것의 아미노산 서열이 하기의 서열 2 또는 그 유도체로 되어 있는 돌연변이 전사조절 매개체 단백질 (med6p).A mutant transcriptional regulator protein (med6p), which functions to mediate transcription, and whose amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 2 or a derivative thereof.

[서열 2][SEQ ID NO 2]

제1항에 있어서, 온도감수성 돌연변이인 것을 특징으로 하는 돌연변이 매개체 단백질.The mutant mediator protein of claim 1, wherein the mutation mediator is a temperature sensitive mutation.

제2항에 있어서, 상기 온도감수성 돌연변이의 비허용온도가 37℃인 것을 특징으로 하는 돌연변이 매개체 단백질.The mutant mediator protein according to claim 2, wherein the non-acceptable temperature of said temperature sensitive mutant is 37 ° C.

제1항의 돌연변이 매개체 단백질을 코딩하는 유전자로서, 그 염기 서열이 하기 서열 3 또는 그 유도체로 되어 있는 돌연변이 매개체 유전저 (med6).A gene encoding the mutant mediator protein of claim 1, wherein the mutant mediator gene base (med6) whose base sequence consists of the following sequence 3 or its derivative (s).

[서열 3][SEQ ID NO 3]

제4항에 돌연변이 매개체 유전자 (med6)에 의해 형질전환된 효모 균주인 스트렙토마이세스 세레비지애 YCL8 (KCTC 0348BP).Streptomyces cerevisiae YCL8 (KCTC 0348BP), a yeast strain transformed by the mutant mediator gene (med6) according to claim 4.

제5항에 있어서, 상기 돌연변이 매개체 유전자 (med6)가 플라스미드 pRS313의 제한효소 자리 EcoR I 과 Bgl II 사이에 삽입된 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 세레비지애 YCL8.The Streptomyces cerevisiae YCL8 according to claim 5, wherein the mutant mediator gene (med6) is present in the form inserted between the restriction enzyme sites EcoR I and Bgl II of plasmid pRS313.