KR100225465B1 - Process for preparing farnesyl transferase marked with histidine - Google Patents
Process for preparing farnesyl transferase marked with histidineInfo
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Abstract
본 발명은 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소 (Farnesyltransferase) 및 그의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to histidine-labeled Farnesyltransferase and a method for preparing the same.
보다 상세하게는, 본 발명은 아미노산 서열에는 변화없이 알파-소단위체의 5'-말단 염기 서열이 대장균 선호 코돈으로 변형된 새로운 파네실 전이효소 유전자, 알파-소단위체 및 베타-소단위체가 결합되고 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소, 이를 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터 및 이를 이용하여 용해성을 갖는 파네실 전이효소를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 파네실 전이효소 단백질은 파네실 전이효소 저해제를 선별하는데 유용하게 사용될 수 있으며 히스티딘 표지를 포함하여 용이하게 분리·정제한다.More specifically, the present invention relates to a new panesyl transferase gene, alpha-subunit and beta-subunit in which the 5'-terminal nucleotide sequence of the alpha-subunit is transformed into an E. coli preferred codon without changing the amino acid sequence. The labeled panesyl transferase, an expression vector which can be produced in E. coli, and a method for mass production of soluble panesyl transferase using the same, wherein the panesyl transferase protein of the present invention is a panesyl transferase inhibitor It can be usefully used for screening and is easily separated and purified including histidine label.
Description
본 발명은 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소 (Farnesyltransferase) 및 그의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to histidine-labeled Farnesyltransferase and a method for preparing the same.
보다 상세하게는, 본 발명은 아미노산 서열에는 변화없이 알파-소단위체의 5'-말단 염기 서열이 대장균 선호 코돈으로 변형된 새로운 파네실 전이효소 유전자, 알파-소단위체 및 베타-소단위체가 결합되고 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소, 이를 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터 및 이를 이용하여 용해성을 갖는 파네실 전이효소를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 파네실 전이효소 단백질은 파네실 전이효소 저해제를 선별하는데 유용하게 사용될 수 있으며 히스티딘 표지를 포함하여 용이하게 분리·정제된다.More specifically, the present invention relates to a new panesyl transferase gene, alpha-subunit and beta-subunit in which the 5'-terminal nucleotide sequence of the alpha-subunit is transformed into an E. coli preferred codon without changing the amino acid sequence. The labeled panesyl transferase, an expression vector which can be produced in E. coli, and a method for mass production of soluble panesyl transferase using the same, wherein the panesyl transferase protein of the present invention is a panesyl transferase inhibitor It can be usefully used for screening and is easily separated and purified including histidine label.
Ras 단백질은 세포가 성장하고 분화하는데 중요한 역할을 하는 21 kDa 크기의 단백질로서, 구아닌 뉴클레오타이드와 결합하여 구아노신 트리포스페이트 (GTP)를 구아노신 다이포스페이트 (GDP)로 가수분해하는 작용을 한다. 이와 같이 Ras 단백질은 세포 내의 특이적인 GTPase 회로를 조절하는 분자 스위치로 작용하므로 세포 신호전달계에서 매우 중요하다 (Bourne, H. R., Sanders, D. A., McCormick, F., Nature, 1991, 349, 117).Ras protein is a 21 kDa protein that plays an important role in cell growth and differentiation, and binds to guanine nucleotides to hydrolyze guanosine triphosphate (GTP) to guanosine diphosphate (GDP). As such, the Ras protein acts as a molecular switch that regulates specific GTPase circuits in the cell and is therefore very important in cellular signaling (Bourne, H. R., Sanders, D. A., McCormick, F., Nature, 1991, 349, 117).
Ras 단백질로서 포유동물 세포는 3가지ras유전자로부터 아미노산 188개로 이루어진 K-Ras-4B 단백질 또는 아미노산 189개로 이루어진 H-Ras, K-Ras-4A 및 N-Ras 단백질을 생성한다. 이들 단백질의 아미노산 번호 12, 13 및 61 번에 위치하는 아미노산들은 GTP 의 인산기와 근접하여 있어 이들 아미노산 잔기들이 GTP 가 가수분해되는 과정에 관여하는 물 분자의 공간적 위치에 영향을 주므로 Ras 단백질의 GTPase 효소 활성을 저해한다. 구체적으로 인체에서 발생하는 몇몇 암 세포는 상기 아미노산 위치에서 돌연변이가 생긴 것이 관찰되는데, 이 돌연변이로 인해 Ras 단백질 고유의 GTPase 효소 활성이 저해되면 GTP 가 계속적으로 결합되어 있는 상태가 되므로 비정상적인 성장 신호가 지속적으로 전달되게 된다. 이러한 신호 전달체계의 이상으로 발암성이 유발되는 것으로 보고되어 있다. 실제로 이들 발암성 을 갖는ras유전자는 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암 등과 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Bos, J. L., Cancer Res., 1989, 49, 4682).As a Ras protein, mammalian cells produce K-Ras-4B proteins consisting of 188 amino acids or H-Ras, K-Ras-4A and N-Ras proteins consisting of 189 amino acids from three ras genes. The amino acids located at amino acid numbers 12, 13 and 61 of these proteins are in close proximity to the phosphate groups of GTP, and these amino acid residues affect the spatial position of the water molecules involved in the process of hydrolysis of GTP. Inhibits activity. Specifically, some cancer cells occurring in the human body are observed to have a mutation at the amino acid position. When this mutation inhibits the Ras protein-specific GTPase enzyme activity, the GTP is continuously bound and abnormal growth signals are maintained. To be delivered. Carcinogenicity has been reported to be caused by abnormalities in these signaling systems. In fact, these carcinogenic ras genes are known to be closely related to pancreatic cancer, bladder cancer, lung cancer and skin cancer (Bos, JL, Cancer Res., 1989, 49, 4682).
Ras 단백질은 세포막 내에 부착되어야 상기와 같은 생물학적 활성을 나타내게 된다. 따라서 Ras 단백질은 세포막에 부착되기 전에 다양한 효소 단백질이 작용하는 과정을 거쳐야 한다. 구체적으로 파네실화에 관여하는 Ras 파네실 전이효소 (Farnesyltransferase), Ras 단백질의 카복시 말단에 존재하는 3개 아미노산으로 구성된 AAX 펩타이드 절단효소, 메칠 전이효소 및 팔미토일 전이효소 등이 작용하여 단백질이 전이된 다음 그의 카복시 말단이 변형되어야 한다. 상기 과정 중 첫 번째인 파네실화는 파네실 전이효소 (Farnesyltransferase)에 의해 이루어지는데, 이는 Ras 단백질의 카복시 말단에 존재하는 CA1A2X 라는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 기질로서 사용한다. 여기서 C 는 시스테인이고 A1 및 A2 는 전기적 부하를 띄지 않는 지방족 아미노산이며 X 는 메티오닌, 알라닌 및 세린 등이다.Ras protein must be attached to the cell membrane to exhibit such biological activity. Therefore, Ras protein has to go through various enzyme proteins before they attach to the cell membrane. Specifically, Ras farnesyltransferase involved in panesylation, AAX peptide cleavage enzyme consisting of three amino acids present at the carboxy terminus of Ras protein, methyl transferase and palmitoyl transferase are used to transfer proteins. Then its carboxy terminus must be modified. The first of these processes, panesylation, is accomplished by Farnesyltransferase, which uses a peptide consisting of four amino acids, CA1A2X, present at the carboxy terminus of the Ras protein as a substrate. Where C is cysteine, A1 and A2 are aliphatic amino acids with no electrical load and X is methionine, alanine and serine.
이러한 파네실화 반응은 시스테인 부위에서 일어나 황에테르 결합을 형성하는데, 특히 H-Ras 와 N-Ras 단백질의 경우는 그의 카복시 말단 근처에 존재하는 또 다른 시스테인에서 팔미토일화도 일어난다. 파네실화의 결과로 Ras 단백질은 친소성이 증가되어 세포막 내에 부착될 수 있으며, 파네실화된 Ras 단백질은 다시 그의 카복시 말단의 3개 아미노산 AAX 의 펩타이드가 절단효소에 의해 제거되면서 메틸화되므로, Ras 단백질의 파네실기가 세포막 내의 지질층 또는 다른 수용체와 용이하게 결합되게 한다고 알려져 있다.This panesylation reaction occurs at the cysteine site to form sulfur ether bonds, especially for H-Ras and N-Ras proteins, where palmitoylation occurs at another cysteine near its carboxy terminus. As a result of the panesylation, the Ras protein can be attached to the cell membrane with increased affinity, and the panesylated Ras protein is methylated again by the cleavage of the three amino acids AAX at its carboxy terminus by cleavage enzymes. It is known that farnesyl groups readily bind to lipid layers or other receptors in the cell membrane.
실제로 Ras 단백질이 세포막 내에 최적의 조건으로 부착되기 위해서는 상기의 모든 변형 단계가 필요하지만 Ras 단백질이 활성을 나타내는데는 파네실화 자체만으로 충분하다고 보고되어 있다. 따라서, 상기 파네실화 과정을 차단하면 돌연변이로 인해 유발되는 Ras 단백질의 발암성을 효과적으로 저해할 수 있으므로 파네실화를 저해하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Buss, J. E. et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 787).Indeed, although all of the above modification steps are necessary for optimal attachment of Ras proteins to cell membranes, it is reported that panesylation alone is sufficient for Ras protein activity. Therefore, blocking the panesylation process effectively inhibits the carcinogenicity of Ras proteins caused by mutations, so studies are being actively conducted to inhibit panesylation (Buss, JE et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 787).
Ras 파네실 전이효소는 49 kDa 분자량을 갖는 알파-소단위체 및 46 kDa 분자량을 갖는 베타-소단위체로 구성되어 있으며, 관련된 Ras 단백질이 파네실화되는 과정에 촉매로서 작용한다 (Casey, P. J., Science, 1995, 268, 221). Ras 단백질의 발암성과 관련이 있는 파네실 전이효소는 현재 그의 활성, 작용 기전, 구조 및 저해제 등에 대하여 다양한 연구가 진행되고 있는데, 이를 위하여 파네실 전이효소를 대량으로 생산하는 것이 필요하다.Ras farnesyl transferase consists of alpha-subunits with 49 kDa molecular weight and beta-subunits with 46 kDa molecular weight and acts as a catalyst in the process of panicylation of related Ras proteins (Casey, PJ, Science, 1995). , 268, 221). Panesyl transferase, which is related to the carcinogenicity of Ras protein, is currently undergoing various studies on its activity, mechanism of action, structure, and inhibitor, and for this, it is necessary to produce a large amount of panesyl transferase.
구체적으로 골드스타인 (Goldstein) 등이 파네실 전이효소의 두 소단위체에 해당하는 유전자 염기 서열을 밝히고 (Goldstein, J. L. et al., Genomics, 1993, 18, 105), 오머(Omer) 등은 파네실 전이효소의 두 소단위체를 동시에 대장균에서 성공적으로 발현시킨 바 있다 (Omer, et al., Biochemistry, 1993, 32, 5167). 또한 비숍 (Bishop, W. R.) 등은 바큘로바이러스 (Baculovirus) 를 이용하여 곤충세포에서 파네실 전이효소를 성공적으로 발현시킨 바 있다 (Bishop, W. R. et al., J.B.C., 1995, 270, 30611). 그러나 상기의 방법으로는 용해성이 있는 파네실 전이효소를 대량으로 생산할 수 없고 정제 과정이 까다로와서 고수율로 파네실 전이효소를 얻는데는 많은 어려움이 있었다.Specifically, Goldstein et al. Revealed gene sequences corresponding to two subunits of panesyl transferase (Goldstein, JL et al., Genomics, 1993, 18, 105), and Omer et al. Two subunits of the real transferase have been successfully expressed simultaneously in E. coli (Omer, et al., Biochemistry, 1993, 32, 5167). Bishop, W. R. et al. Have also successfully expressed panesyl transferase in insect cells using baculovirus (Bishop, W. R. et al., J.B.C., 1995, 270, 30611). However, the above method cannot produce a large amount of soluble farnesyl transferase, and since the purification process is difficult, there are many difficulties in obtaining faresyl transferase in high yield.
이에 본 발명자들은 파네실 전이효소를 효율적으로 대량 생산하기 위하여, 아미노산 서열에는 변화없이 알파-소단위체의 5'-말단 염기 서열이 대장균 선호 코돈으로 변형된 파네실 전이효소 유전자를 중합효소 연쇄반응으로 얻고, T7 박테리아 파아지의 작동 유전자를 사용하여 상기 알파-소단위체 및 베타-소단위체를 결합시킨 재조합 단백질을 생산하는 발현 벡터를 제조하고, 이를 대장균에 형질전환시킨 다음 이로부터 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소를 대량으로 발현시키고 히스티딘 표지 친화 칼럼 등으로 분리·정제하여 그의 생산성을 획기적으로 증대시킴으로써 본 발명을 완성하였다.In order to efficiently produce large amounts of farnesyl transferase, the present inventors used a polymerase chain reaction of a farnesyl transferase gene in which the 5'-terminal sequence of the alpha-subunit was transformed into an E. coli preferred codon without changing the amino acid sequence. And an expression vector that produces a recombinant protein that combines the alpha- and beta-subunits using the working genes of the T7 bacterial phage, transforms it into E. coli, and then histidine-labeled panesyl The present invention was completed by expressing a large amount of transferase, separating and purifying by histidine-labeled affinity column, and the like, and dramatically increasing its productivity.
본 발명은 아미노산 서열에는 변화없이 5'-말단 염기 서열이 대장균 선호 코돈으로 변형된 알파-소단위체 유전자를 이용하여 생산된 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소 단백질을 제공함에 그 목적이 있다.It is an object of the present invention to provide a histidine-labeled panesyl transferase protein produced using an alpha-subunit gene in which the 5'-terminal sequence is modified into an E. coli preferred codon without changing the amino acid sequence.
구체적으로, 본 발명은 파네실 전이효소를 알파-소단위체 및 베타-소단위체가 결합된 재조합 단백질 형태로 제공하고, 그의 베타-소단위체의 카복시 말단에 이소류신-아스팜산-글루탐산-글루탐산-페닐알라닌의 아미노산 서열을 포함하고, 알파-소단위체의 아미노 말단에 6개의 히스티딘 아미노산을 포함한다.Specifically, the present invention provides a farnesyl transferase in the form of a recombinant protein in which alpha-subunit and beta-subunit are combined, and an amino acid of isoleucine-aspam acid-glutamic acid-glutamic acid-phenylalanine at the carboxy terminus of the beta-subunit A sequence and six histidine amino acids at the amino terminus of the alpha-subunit.
또한, 본 발명은 아미노산 서열에는 변화없이 알파-소단위체의 5'-말단 염기 서열이 대장균 선호 코돈으로 변형된 파네실 전이효소 유전자를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 서열번호 7 의 염기 서열을 가지는 알파-소단위체 유전자를 포함하는 파네실 전이효소 유전자를 제공한다.It is also an object of the present invention to provide a panesyl transferase gene in which the 5'-terminal sequence of the alpha-subunit is modified into an E. coli preferred codon without changing the amino acid sequence. Specifically, the present invention provides a farnesyl transferase gene comprising an alpha-subunit gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
또한, 본 발명은 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소를 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 서열번호 5의 파네실 전이효소의 베타-소단위체 유전자, 6개 히스티딘 코돈 및 서열번호 7 의 의 알파-소단위체 유전자 등을 포함하는 발현 벡터 pRGT7 FTase β-His FTase α 를 제공한다.It is also an object of the present invention to provide an expression vector capable of producing histidine-labeled panesyl transferase in Escherichia coli. Specifically, the present invention provides an expression vector pRGT7 FTase β-His FTase α comprising a beta-subunit gene of panesyl transferase of SEQ ID NO: 5, six histidine codons, and an alpha-subunit gene of SEQ ID NO: 7; do.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터 pRGT7 FTase β-His FTase α로 형질전환된 대장균 BL21 균주 (수탁번호 : KCTC 8782P)를 제공한다.In addition, the present invention provides E. coli BL21 strain (Accession Number: KCTC 8782P) transformed with the expression vector pRGT7 FTase β-His FTase α.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 대장균을 사용하여 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소를 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.It is also an object of the present invention to provide a method for producing histidine-labeled panesyl transferase using the transformed Escherichia coli.
구체적으로 본 발명은 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 파네실 전이효소의 발현을 유도하고 이로부터 조세포 용출액을 얻어 히스티딘 표지 친화 크로마토그래피 등을 수행함으로써 파네실 전이효소의 알파-소단위체 및 베타-소단위체가 결합된 단백질을 분리·정제한다.Specifically, the present invention cultures the transformed Escherichia coli, induces the expression of panesyl transferase, obtains crude cell eluate therefrom, and performs histidine-labeled affinity chromatography to perform alpha-subunits and beta- of panesyl transferase. Isolate and purify proteins bound with subunits.
또한, 본 발명에서 제조한 파네실 전이효소 단백질은 본 효소의 활성을 억제하는 저해제를 선별하는데 사용될 수 있고, 이러한 파네실 전이효소 저해제는 항암제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.In addition, the farnesyl transferase protein prepared in the present invention may be used to select an inhibitor that inhibits the activity of the present enzyme, and such farnesyl transferase inhibitor may be usefully used as an anticancer agent.
도 1a 는 본 발명의 파네실 전이효소 (Farnesyltransferase)의 베타-소단위체 유전자를 Colo 205 세포에서 클론하여 그의 염기 서열 및 이로부터 유추한 그의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.Figure 1a shows the nucleotide sequence of the beta-subunit gene of the Farnesyltransferase of the present invention in Colo 205 cells and its base sequence and its amino acid sequence inferred therefrom.
도 1b 는 본 발명의 파네실 전이효소 (Farnesyltransferase)의 알파-소단위체 유전자를 Colo 205 세포에서 클론하여 그의 염기 서열 및 이로부터 유추한 그의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.Figure 1B shows the nucleotide sequence of the alpha-subunit gene of Farnesyltransferase of the present invention in Colo 205 cells and its base sequence and its amino acid sequence inferred therefrom.
도 2 는 본 발명의 파네실 전이효소 유전자를 클로닝하는 전체 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.Figure 2 schematically shows the whole process of cloning the farnesyl transferase gene of the present invention.
도 3 은 본 발명에서 정제한 파네실 전이효소 (알파-소단위체 및 베타-소단위체)를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 그 결과를 나타낸 것이다.Figure 3 shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the farnesyl transferase (alpha-subunit and beta-subunit) purified in the present invention.
도 4 는 본 발명에서 정제한 파네실 전이효소의 활성을 오토래디오그래피를 수행하여 나타낸 것이다.Figure 4 shows the activity of the purified farnesyl transferase in the present invention by performing autoradiography.
레인 1 : 파네실화된 기질인 H-Ras 단백질Lane 1: H-Ras protein, a panesylated substrate
도 5 는 본 발명의 발현 벡터가 포함하는 파네실 전이효소의 베타-소단위체 및 알파-소단위체 유전자 사이의 변화된 염기 서열을 나타낸 것이다.Figure 5 shows the changed base sequence between the beta- and alpha- subunit genes of the farnesyl transferase contained in the expression vector of the present invention.
본 발명은 Ras 단백질의 발암성과 관련이 있어 새로운 항암제를 개발하는데 효과적인 표적이 될 수 있는 파네실 전이효소를 히스티딘이 표지된 단백질 형태로 제공한다.The present invention provides panesyl transferase in the form of histidine-labeled protein, which may be an effective target for developing a new anticancer agent in connection with the carcinogenicity of Ras protein.
본 발명은 상기 파네실 전이효소를 효율적으로 발현시키기 위하여, 아미노산 서열에는 변화없이 파네실 전이효소 알파-소단위체의 5'-말단 염기 서열이 대장균 선호 코돈으로 변형된 새로운 파네실 전이효소 유전자를 제공한다. 구체적으로 본 발명의 파네실 전이효소 유전자는 서열번호 7 의 염기 서열을 가지는 알파-소단위체 유전자를 포함하는데, 이 때 천연형 파네실 전이효소 알파-소단위체의 염기 서열과 차이가 있는 부분은 굵은 알파벳으로 표시한다 (서열 7 참조).The present invention provides a new panesyl transferase gene in which the 5'-terminal sequence of the panesyl transferase alpha-subunit is modified into an E. coli preferred codon without changing the amino acid sequence. do. Specifically, the farnesyl transferase gene of the present invention includes an alpha-subunit gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the part that is different from the base sequence of the native panesyl transferase alpha-subunit is bold. Mark it alphabetically (see Sequence 7).
본 발명은 상기 알파-소단위체 유전자를 이용하여 알파-소단위체 및 베타-소단위체가 결합되고 히스티딘 표지를 포함하는 파네실 전이효소를 제공하는데 (도 1 및 도 5 참조), 이와 같이 알파-소단위체와 베타-소단위체를 함께 발현시키면 이들이 서로 결합하는 것이 용이하여 전체 활성도를 가지고 용해성이 큰 파네실 전이효소를 대량 생산할 수 있고, 히스티딘이 표지되어 상기 단백질을 용이하게 정제한다.The present invention provides an alpha-subunit gene and a farnesyl transferase comprising a histidine label bound to alpha-subunit and beta-subunit (see FIGS. 1 and 5). When the beta-subunits are expressed together, they are easy to bind to each other, thereby producing a large amount of far-soluble farnesyl transferase with total activity, and histidine is labeled to easily purify the protein.
또한, 본 발명은 상기 파네실 전이효소를 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 파네실 전이효소의 베타-소단위체 유전자, 6개 히스티딘 코돈 및 알파-소단위체 유전자 등을 포함하는 발현 벡터 pRGT7 FTase β-His FTase α를 제공한다 (도 2 참조).The present invention also provides an expression vector capable of producing the farnesyl transferase in E. coli. Specifically, the present invention provides an expression vector pRGT7 FTase β-His FTase α comprising a beta-subunit gene, six histidine codons and an alpha-subunit gene of panesyl transferase (see FIG. 2).
이 때 본 발명은 구아닌(G)과 시토신(C) 염기의 비율이 높은 알파-소단위체 유전자의 앞쪽에 베타-소단위체 유전자를 포함시킨 발현 벡터를 제조함으로써 대장균에서 재조합 단백질의 발현율을 증가시킨다. 상기 알파-소단위체의 염기 서열은 구아닌과 시토신 염기가 적게 삽입되는 워블 부위 (Wobble site)를 고려하여 변형시킨다.At this time, the present invention increases the expression rate of recombinant protein in Escherichia coli by preparing an expression vector including a beta-subunit gene in front of an alpha-subunit gene having a high ratio of guanine (G) and cytosine (C) bases. The base sequence of the alpha-subunit is modified in consideration of the wobble site into which less guanine and cytosine base are inserted.
본 발명은 상기 발현 벡터에 포함되는 파네실 전이효소 유전자를 분리하기 위하여, 인간 Colo 205 세포 (ATCC # CCL 222)를 이용하여 RNA 를 추출하고 이로부터 파네실 전이효소의 cDNA 단선을 합성하여 이를 주형으로 이용한 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행한다.The present invention extracts RNA using human Colo 205 cells (ATCC # CCL 222) to isolate the farnesyl transferase gene included in the expression vector, and synthesizes the cDNA disconnection of farnesyl transferase from the template. The polymerase chain reaction (PCR) was used.
이 때 PCR 의 시발체로는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4 의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드를 합성하여 사용한다 (서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4 참조). 구체적으로 서열번호 1의 시발체는 파네실 전이효소의 베타-소단위체의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 Nde I 인지 부위를 포함하고, 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 시발체는 제한효소 Cla I 인지 부위와 상기 베타-소단위체의 카복시 말단의 염기 서열을 13번째 염기부터 포함한다. 그리고 서열번호 3의 시발체는 제한효소 Cla I 인지 부위, SD 서열 (Shine-Dalgarno sequence) 및 종결 코돈에 더하여 알파-소단위체의 아미노 말단의 염기 서열 및 6개의 히스티딘 코돈을 포함하고, 서열번호 4 의 시발체는 종결 코돈, 제한효소 Xho I 인지 부위 및 상기 알파-소단위체의 카복시 말단의 염기 서열을 16번째 염기부터 포함한다.At this time, the oligonucleotide having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4 is used as a primer of PCR (see SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4). Specifically, the primer of SEQ ID NO: 1 includes a nucleotide sequence corresponding to the amino terminal of the beta-subunit of panesyl transferase and a restriction enzyme Nde I recognition site, and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is restriction enzyme Cla I The nucleotide sequence at the carboxy terminus of the recognition site and the beta-subunit is included from the 13th base. And the primer of SEQ ID NO: 3 contains the amino acid base of the alpha-subunit and 6 histidine codons in addition to the restriction enzyme Cla I recognition site, the SD sequence (Shine-Dalgarno sequence) and the termination codon, The primer comprises the stop codon, the restriction enzyme Xho I recognition site and the base sequence of the carboxy terminus of the alpha-subunit starting from the 16th base.
그 결과, 서열번호 5 의 염기 서열 및 이로부터 유추한 서열번호 6 의 아미노산 서열을 가지는 파네실 전이효소의 베타-소단위체 유전자 및 서열번호 7 의 염기 서열 및 이로부터 유추한 서열번호 8 의 아미노산 서열에 더하여 아미노 말단에 6개의 히스티딘 코돈을 가지는 새로운 파네실 전이효소의 알파-소단위체의 유전자를 얻는다 (도 1, 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 서열 8 참조).As a result, the beta-subunit gene of panesyl transferase having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 derived therefrom and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 inferred therefrom In addition, the gene of the alpha-subunit of the new farnesyl transferase having six histidine codons at the amino terminus is obtained (see FIG. 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8).
상기의 과정으로 얻은 파네실 전이효소의 알파-소단위체 및 베타-소단위체 유전자를 T7 작동 유전자를 가지는 플라스미드 벡터 pRGT7 에 삽입하여 본 발명의 발현 벡터 pRGT7 FTase β-His FTase α를 제조한다. 본 발명의 발현 벡터는 파네실 전이효소의 베타-소단위체 및 알파-소단위체 사이에 도 5 에 보는 바와 같은 변화된 염기 서열을 가지는 파네실 전이효소 유전자를 포함한다. 그 결과, 본 발명은 베타-소단위체의 카복시 말단에 이소류신-아스팜산-글루탐산-글루탐산-페닐알라닌의 아미노산 서열을 포함하고, 알파-소단위체의 아미노 말단에 6개의 히스티딘 서열을 포함하는 재조합 파네실 전이효소 단백질을 얻는다.The expression vector pRGT7 FTase β-His FTase α of the present invention was prepared by inserting the alpha-subunit and beta-subunit genes of the farnesyl transferase obtained by the above procedure into the plasmid vector pRGT7 having the T7 effector gene. The expression vector of the present invention comprises a farnesyl transferase gene having a changed base sequence as shown in FIG. 5 between beta- and alpha-subunits of farnesyl transferase. As a result, the present invention comprises an amino acid sequence of isoleucine-aspam acid-glutamic acid-glutamic acid-phenylalanine at the carboxy terminus of a beta-subunit, and six histidine sequences at the amino terminus of the alpha-subunit. Obtain enzyme protein.
본 발명의 발현 벡터 pRGT7 FTase β-His FTase α를 대장균 BL21 균주에 형질전환시킨 다음 그 형질전환된 대장균을 1997년 1월 29일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8782P).The expression vector pRGT7 FTase β-His FTase α of the present invention was transformed into Escherichia coli BL21 strain, and the transformed Escherichia coli was deposited on 29 January 1997 at the Biotechnology Research Institute of Korea Institute of Science and Technology (Accession Number: KCTC). 8782P).
본 발명은 상기에서 제조한 발현 벡터 및 대장균 형질전환체를 이용하여 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소를 제조하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing histidine-labeled panesyl transferase using the expression vector and E. coli transformants prepared above.
구체적으로 상기 대장균 형질전환체를 배양하여 파네실 전이효소의 발현을 유도하고 이로부터 조세포 용출액을 얻어 히스티딘 표지 친화 크로마토그래피 등을 수행함으로써 파네실 전이효소의 알파-소단위체 및 베타-소단위체가 결합된 재조합 단백질을 분리·정제한다. 그 결과, 파네실 전이효소가 약 46kDa 크기의 베타-소단위체 및 약 49kDa 크기의 알파-소단위체로서 용해되는 단백질 형태로 생산됨을 확인한다 (도 3 참조).Specifically, the E. coli transformants are cultured to induce the expression of panesyl transferase, and coarse cell eluates are obtained from the histidine-labeled affinity chromatography to bind alpha-subunits and beta-subunits of panesyl transferase. The purified recombinant protein is isolated and purified. As a result, it was confirmed that the farnesyl transferase is produced in the form of a protein that is dissolved as a beta-subunit of about 46kDa size and an alpha-subunit of about 49kDa size (see FIG. 3).
또한, 본 발명은 기존에 알려져 있고 현재까지 계속 사용하고 있는 H-Ras 단백질을 기질로 하여 상기에서 정제한 파네실 전이효소의 활성을 오토래디오그래피 등을 수행하여 측정한다 (Moores, S. et al., JBC, 1991, 266, 14603) (도 4 참조). In addition, the present invention measures the activity of the farnesyl transferase purified above using the H-Ras protein known and still in use as a substrate by performing autoradiography or the like (Moores, S. et al. , JBC, 1991, 266, 14603) (see Figure 4).
그 결과, 상기에서 제조한 파네실 전이효소 단백질은 본 효소의 활성을 억제하는 저해제를 선별하는데 효과적으로 사용될 수 있고, 이렇게 선별된 파네실 전이효소 저해제는 항암제 등으로 이용될 수 있다.As a result, the farnesyl transferase protein prepared above can be effectively used to select an inhibitor that inhibits the activity of the present enzyme, and the selected farnesyl transferase inhibitor can be used as an anticancer agent.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.The following examples illustrate the invention and are not intended to limit the scope of the invention.
실시예 1 파네실 전이효소 유전자의 분리 및 클로닝Example 1 Isolation and Cloning of Panesyl Transferase Gene
(단계 1) RNA 추출(Step 1) RNA Extraction
본 발명의 파네실 전이효소 유전자를 분리하기 위하여, 인간 Colo 205 세포 (ATCC # CCL 222)를 이용하여 RNA 를 다음에 기술한 RNAzolB 방법으로 추출하였다 (카탈로그 # CS-105, Biotecx Laboratories, INC).In order to isolate the farnesyl transferase gene of the present invention, RNA was extracted using the RNAzolB method described below using human Colo 205 cells (ATCC # CCL 222) (catalog # CS-105, Biotecx Laboratories, INC).
5×106세포에 1 ml RNA Zol B 용액을 첨가시키고 10 ml 피펫을 몇 번 통과시켜 세포막을 파쇄시킨 다음 0.1 ml 의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 잘 혼합시켜 4℃ 에서 5분 동안 방치하였다. 15분 동안 4℃ 에서 12,000 g 로 원심분리하여 상층액을 깨끗한 튜브에 옮기고 다시 동일한 양의 이소프로판올을 첨가하여 4℃ 에서 15분 동안 방치한 다음 4℃에서 12,000 g 로 15분 동안 원심분리하여 RNA 를 침전시켰다. 침전된 RNA 에 75% 에탄올을 잘 섞은 다음 4℃ 에서 7,500 g 로 8분 동안 원심분리하여 깨끗한 RNA 침전물을 얻었다. 이를 DEPC (diethylpyrocarbonate)로 처리된 물에 녹여 다음 단계에 이용하였다.1 ml RNA Zol B solution was added to 5 × 10 6 cells and the cell membrane was crushed by several passes through a 10 ml pipette, and then 0.1 ml of chloroform was added, mixed well for 15 seconds, and left at 4 ° C. for 5 minutes. Transfer the supernatant to a clean tube by centrifugation at 12,000 g at 4 ° C. for 15 minutes, add the same amount of isopropanol, leave for 15 minutes at 4 ° C., and then centrifuge at 12,000 g at 4 ° C. for 15 minutes. Precipitated. 75% ethanol was mixed well with the precipitated RNA and then centrifuged at 7,500 g for 8 minutes at 4 ° C to obtain a clean RNA precipitate. It was dissolved in water treated with DEPC (diethylpyrocarbonate) and used for the next step.
(단계 2) 유전자의 분리(Step 2) Gene Isolation
파네실 전이효소의 cDNA 단선을 얻기 위하여, 위에서 얻은 RNA 용액 13.5μl 를 취하고 65℃ 에서 10분 동안 가열하여 RNA 2차 구조를 풀어준 다음 1.0μl의 RNase 억제제 (Rnasin, 1 U/μl, 프로메가, 미국), 260 nm 에서 흡광도가 5.0 인 2μl 의 올리고(dT)12-18 시발체 (Gibco BRL, 미국)를 가하였다. 이를 70℃ 에서 10분 동안 놓아두고 여기에 2.0μl의 10배 농축된 (이하 10×) 몰로니 류케미아 바이러스 (M-MULV)의 역전사효소 반응용액, 1μl 10 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP 가 각각 10mM 농도로 포함) 혼합액, 1μl (1 U/μl) M-MULV 역전사효소 (New England Biolabs사)를 첨가하여 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA 가닥을 합성하였다.To obtain cDNA disconnection of farnesyl transferase, 13.5 μl of the RNA solution obtained above was taken and heated at 65 ° C. for 10 minutes to release the RNA secondary structure, followed by 1.0 μl of RNase inhibitor (Rnasin, 1 U / μl, promega , USA), 2 μl of oligo (dT) 12-18 primer (Gibco BRL, USA) with absorbance 5.0 at 260 nm was added. It was left for 10 minutes at 70 ° C., and a reverse transcriptase reaction solution of 2.0 μl of 10-fold concentrated (hereinafter 10 ×) Moroni Ryuchemia virus (M-MULV), 1 μl 10 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, cDNA strands were synthesized by adding 1 μl (1 U / μl) M-MULV reverse transcriptase (New England Biolabs), a mixture of dTTP at a concentration of 10 mM each, and reacting at 37 ° C. for 1 hour.
(단계 3) 유전자의 클로닝(Step 3) Cloning of Genes
파네실 전이효소 유전자를 클로닝하기 위하여, 상기에서 분리한 cDNA 를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.In order to clone the farnesyl transferase gene, a polymerase chain reaction (PCR) was performed using the cDNA isolated above.
PCR 을 수행하는데 사용한 4개의 올리고 뉴클레오타이드를 다음의 과정으로 고안하여 핵산 합성기 (DNA synthesizer, Applied Biosystems사, 미국)로 합성하였다. 서열번호 1의 염기 서열을 가지는 시발체는 파네실 전이효소의 베타-소단위체의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 Nde I 인지 부위를 포함하고, 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 시발체는 제한효소 Cla I 인지 부위와 상기 베타-소단위체의 카복시 말단에 해당하는 염기 서열을 13번째 염기부터 포함한다. 그리고 서열번호 3의 염기 서열을 가지는 시발체는 제한효소 Cla I 인지 부위, SD 서열 (Shine-Dalgarno sequence) 및 종결 코돈에 더하여 파네실 전이효소의 알파-소단위체의 아미노 말단에 해당하는 염기 서열 및 6개의 히스티딘에 해당하는 염기 서열을 포함하고, 서열번호 4의 염기 서열을 가지는 시발체는 종결 코돈, 제한효소 Xho I 인지 부위 및 상기 알파-소단위체의 카복시 말단에 해당하는 염기 서열을 16번째 염기부터 포함한다 (서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4 참조).Four oligonucleotides used to perform PCR were designed in the following procedure and synthesized with a nucleic acid synthesizer (DNA synthesizer, Applied Biosystems, USA). A primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 includes a nucleotide sequence corresponding to the amino terminal of the beta-subunit of panesyl transferase and a restriction enzyme Nde I recognition site, and a primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is a restriction enzyme. The nucleotide sequence corresponding to the carboxy terminal of the Cla I recognition site and the beta-subunit is included from the 13th base. And the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is a base sequence corresponding to the amino terminus of the alpha-subunit of the farnesyl transferase in addition to the restriction enzyme Cla I recognition site, the SD sequence (Shine-Dalgarno sequence) and the termination codon and 6 The primer containing the base sequence corresponding to the histidine of the dog, and having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 includes a base codon, a restriction enzyme Xho I recognition site, and a base sequence corresponding to the carboxy terminus of the alpha-subunit from the 16th base (See SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4).
상기에서 합성한 cDNA 가닥을 주형으로 다음의 과정으로 PCR 을 수행하는데, cDNA 주형 2μl, 10μl의 10× 농축 반응용액, 6μl의 25 mM 염화마그네슘, 2μl의 10 mM dNTP, 각 3μl 의 0.75 μg 의 서열번호 1 및 서열번호 2의 시발체, Taq 중합효소 0.4μl (5 U/μl, Promega, 미국)에 75μl의 증류수를 넣어 반응액 1을 제조하였다. 또한 위에서 언급한 시발체만을 제외한 성분이 모두 들어 있는 튜브 속에 각 3μl의 0.75μg의 서열번호 3 및 서열번호 4의 시발체를 넣어 반응액 2를 제조하였다. 상기 반응액 1 및 반응액 2 을 각각 94℃에서 1분 30초; 50℃에서 1분; 72℃에서 1분 30초의 반응을 30회 반복하였다. 그 결과 반응액 1 에서 1311 염기쌍의 파네실 전이효소 베타-소단위체의 유전자를 얻고, 반응액 2 에서 1137 염기쌍의 알파-소단위체의 유전자를 얻었다. 기존의 통상적인 방법으로 페놀/클로로포름 및 100% 에탄올을 차례로 처리하여 DNA 를 추출하고 이를 TE 완충용액에 녹여 다음 단계에 이용하였다.PCR was performed using the synthesized cDNA strand as a template by the following procedure, including 2 μl of cDNA template, 10 μl of 10 × concentrated reaction solution, 6 μl of 25 mM magnesium chloride, 2 μl of 10 mM dNTP, and 3 μl of 0.75 μg of sequence.
상기 TE 완충용액에 녹인 파네실전이효소의 베타-소단위체 단편 16μl 에 10× 제한효소 반응 완충용액 2μl 와 제한효소 Nde I 과 Cla I 을 1μl 씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 한편 상기 TE 완충용액에 녹인 파네실 전이효소의 알파-소단위체 단편 16μl 에는 10× 제한효소 반응 완충용액 2μl 와 제한효소 Cla I 과 Xho I 을 1μl 씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음 통상적인 방법으로 원하는 제한효소 인지 부위를 가지는 DNA 절편을 얻을 수 있었다.To 16 μl of the beta-subunit fragment of the panesyl transferase dissolved in the TE buffer, 2 μl of 10 × restriction enzyme reaction buffer and 1 μl of restriction enzymes Nde I and Cla I were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Meanwhile, 16 μl of the alpha-subunit fragment of the panesyl transferase dissolved in the TE buffer was added with 2 μl of 10 × restriction enzyme reaction buffer and 1 μl of restriction enzymes Cla I and Xho I and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Next, the DNA fragment having the desired restriction enzyme recognition site was obtained by the conventional method.
(단계 4) 파네실 전이효소의 알파-소단위체 및 베타-소단위체 유전자를 포함하는 발현 벡터의 제조(Step 4) Preparation of Expression Vectors Containing Alpha-Subunit and Beta-Subunit Genes of Panesyl Transferase
본 발명의 파네실 전이효소 유전자를 클로닝하기 위하여, 플라스미드 벡터 pRGT7 (T7 작동 유전자를 가지는 대장균용 벡터; Hyun-ho Chung, Science, 259, 806, 1993)을 제한효소 Nde I 와 Xho I 를 이용하여 완전히 절단하고 1% 아가로스 젤 상에서 분리한 다음 상기에서 얻은 두 개의 파네실 전이효소 DNA 절편과 다음과 같이 연결시켰다.To clone the farnesyl transferase gene of the present invention, the plasmid vector pRGT7 (E. coli vector with T7 agonist; Hyun-ho Chung, Science, 259, 806, 1993) was used with restriction enzymes Nde I and Xho I. After complete cleavage and separation on a 1% agarose gel, the two farnesyl transferase DNA fragments obtained above were linked as follows.
파네실 전이효소의 알파-소단위체 및 베타-소단위체 유전자 각각 0.1μg, 0.1μg 의 제한효소 Nde I 및 Xho I 로 절단한 플라스미드 벡터 pRGT7, 2μl 의 10× 연결 반응용액 (500mM 트리스-염산, pH 7.8, 100mM 염화마그네슘, 100mM DTT, 10mM ATP), 10 U 의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20μl가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 반응용액을 대장균 HB101(ATCC # 33694)컴피턴트 세포에 첨가하여 형질전환시킨 다음 LB-앰피실린 (50μg/ml 농도의 앰피실린을 포함하는 LB 배지) 평판에 평판하여 대장균 형질전환체를 선별하였다. 상기 클로닝 과정을 도 2 에 도시하였다.10 × ligation reaction solution of plasmid vector pRGT7, 2 μl (500 mM Tris-hydrochloric acid, pH) digested with 0.1 μg and 0.1 μg of restriction enzymes Nde I and Xho I, respectively, of the alpha- and beta-subunit genes of panesyl transferase 7.8, 100mM magnesium chloride, 100mM DTT, 10mM ATP), 10 U T4 DNA ligase was added and distilled water was added to a total volume of 20μl and reacted at 16 ℃ for 12 hours. The reaction solution was added to E. coli HB101 (ATCC # 33694) competent cells and transformed, and the E. coli transformants were selected by plating on LB-ampicillin (LB medium containing 50 μg / ml of ampicillin). . The cloning procedure is shown in FIG.
실시예 2 히스티딘 표지를 포함하는 파네실 전이효소 단백질의 발현Example 2 Expression of Panesyl Transferase Proteins Containing Histidine Labels
본 발명의 발현 벡터 pRGT7 FTase β-His FTase α 를 대량 추출하여 대장균 BL21 컴피턴트 세포에 첨가하고 하나한의 방법 (J. Mol. Biol., 116, 1983, 557)에 따라 형질전환시킨 다음 LB 앰피실린 평판에 평판하여 대장균 형질전환체를 선별하였다. 대장균 형질전환체를 3 ml 의 LB-앰피실린 배지에 접종하여 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음 0.4mM IPTG (isopropylthiogalactoside)가 되도록 첨가하고 3시간 동안 다시 배양하여 단백질의 발현 정도를 조사하였다. 구체적으로 12,000g 에서 5분 동안 원심분리하여 배양 상층액은 버리고 침전물에 100μl의 TE 완충용액을 넣고 잘 흔들어 준 다음 100μl 의 램리 완충용액 (Laemli, et al., Nature, 227, 1970, 680)을 넣어 잘 섞고 12% SDS- 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하여 코마시 블루 용액으로 단백질을 염색하였다. 그 결과, 약 46kDa 크기의 베타-소단위체 및 약 49kDa 크기의 알파-소단위체가 발현됨을 확인하였다 (도 3 참조).The expression vector pRGT7 FTase β-His FTase α of the present invention was extracted in bulk and added to E. coli BL21 competent cells and transformed according to one method (J. Mol. Biol., 116, 1983, 557), followed by LB ampi E. coli transformants were selected by plating on the silin plates. E. coli transformants were inoculated in 3 ml of LB-ampicillin medium and incubated at 37 ° C. for 3 hours, then added to 0.4 mM IPTG (isopropylthiogalactoside), and cultured again for 3 hours to investigate the expression level of the protein. Specifically, centrifugation at 12,000 g for 5 minutes, discard the culture supernatant, add 100 μl of TE buffer to the precipitate, shake well, and then 100 μl of Ramley buffer (Laemli, et al., Nature, 227, 1970, 680). The mixture was mixed well and electrophoresed on a 12% SDS-polyacrylamide gel to stain proteins with Coomassie Blue solution. As a result, it was confirmed that the beta-subunit of about 46kDa size and the alpha-subunit of about 49kDa size were expressed (see FIG. 3).
상기에서 형질전환된 대장균 BL21/pRGT7 FTase β-His FTase α를 1997년 1월 29일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8782P).The transformed Escherichia coli BL21 / pRGT7 FTase β-His FTase α was deposited on January 29, 1997 to the Biotechnology Research Institute of Korea Institute of Science and Technology (Accession Number: KCTC 8782P).
또한, 상기와 동일한 조건으로 대장균 형질전환체를 배양한 다음 12,000g에서 5분 동안 원심분리하여 배양 상층액은 버리고 다시 침전물에 100μl의 TE 완충용액 (10mg/ml 농도의 라이소자임 포함)을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 방치하였다. 이를 다시 12,000g 에서 5분 동안 원심분리하여 상층액 100μl 에 100μl 램리 완충용액을 넣고 잘 섞은 다음 다시 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 코마시 블루 용액으로 단백질을 염색하였다. 그 결과, 상기 용액에 용해되는 파네실 전이효소의 알파-소단위체 및 베타-소단위체를 확인할 수 있었다.In addition, after incubating the E. coli transformants under the same conditions as above, the culture supernatant was discarded by centrifugation at 12,000 g for 5 minutes, and 100 μl of TE buffer solution (including 10 mg / ml lysozyme) was added to the precipitate. It was left for 30 minutes at ℃. This was again centrifuged at 12,000 g for 5 minutes, 100 μl of Ramley buffer solution was added to 100 μl of the supernatant, mixed well, and then stained with Comash blue solution by 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. As a result, it was possible to identify alpha-subunits and beta-subunits of farnesyl transferase dissolved in the solution.
실시예 3 파네실 전이효소 단백질의 분리·정제Example 3 Isolation and Purification of Panesyl Transferase Protein
상기 실시예에서 사용한 발현 벡터 pRGT7 FTase β-His FTase α 가 들어있는 대장균 BL21 균주를 LB 배지 (박토트립톤 10g, 염화나트륨 10g, 효모 추출물 5g/l) 500ml 에 접종한 다음 600nm 에서의 흡광도가 0.4가 될 때 IPTG 를 첨가하여 4시간 더 진탕 배양하였다.The E. coli BL21 strain containing the expression vector pRGT7 FTase β-His FTase α used in the above example was inoculated into 500 ml of LB medium (10 g of bactotriptone, 10 g of sodium chloride, 5 g / l of yeast extract), and the absorbance at 600 nm was 0.4. When shaken, IPTG was added and further shaken for 4 hours.
(단계 1) 세포 파쇄(Step 1) Cell Crushing
대장균 형질전환체를 500ml 배양하여 12,000g의 값으로 원심분리하고 배양 상층액을 버린 다음 침전물을 히스티딘 부착 완충용액 (His binding buffer) 20ml에 용해시켜 세포 파쇄기 (sonicator)로 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 12,000g 에서 30분 동안 원심분리한 다음 침전물을 버리고 상충액은 4℃에서 보관하여 다음 단계에 사용하였다.500 ml of E. coli transformants were cultured, centrifuged at a value of 12,000 g, the culture supernatant was discarded, and the precipitate was dissolved in 20 ml of histidine attachment buffer (His binding buffer), and the cells were disrupted by a cell sonicator. The cell lysate was centrifuged at 12,000 g for 30 minutes, then the precipitate was discarded and the supernatant was stored at 4 ° C. for use in the next step.
(단계 2) 히스티딘 표지 친화 칼럼에 첨가(Step 2) Add to histidine labeled affinity column
노바겐 (Novagen) 회사에서 구입한 히스티딘 부착 레진(Histidine Binding Resin, Cat # 69670-2) 10ml 을 미니 칼럼에 패킹한 다음 50ml 증류수를 통과시키고 Ni-장전 완충용액 (Ni-charge buffer) 20ml 로 활성화시키고 히스티딘 부착 완충용액 50ml 을 통과시킴으로 칼럼을 동일화시켰다. 여기에 위에서 제조한 용액을 0.5 ml/분 속도로 통과시켜 칼럼에 히스티딘 표지를 포함하는 파네실 전이효소가 부착되도록 하였다. 이에 히스티딘 부착 완충용액 50ml 을 통과시켜 비특이적으로 부착한 (non-specific binding) 단백질을 제거하고 다시 세척 완충용액 (60 mM 이미다졸, 500 mM 염화나트륨, 20 mM 트리스, pH 8.0) 20 ml 로 약하게 부착되어 있는 다른 단백질을 제거하였다. 다음 용출 완충용액 (20 mM 트리스, 1 M 이미다졸, 500 mM 염화나트륨, pH 8.0)으로 파네실 전이효소를 용출시켰다. 그 결과를 도 3 에 도시하였다.10 ml of Histidine Binding Resin (Cat # 69670-2) from Novagen was packed in a mini column, passed through 50 ml of distilled water and activated with 20 ml of Ni-charge buffer. Column was identified by passing through 50 ml of histidine attachment buffer. The solution prepared above was passed through at a rate of 0.5 ml / min so that the panesyl transferase including histidine label was attached to the column. 50 ml of histidine attachment buffer was passed through to remove non-specific binding protein, and again weakly attached to 20 ml of washing buffer (60 mM imidazole, 500 mM sodium chloride, 20 mM Tris, pH 8.0). Other proteins present were removed. Panesyl transferase was eluted with the following elution buffer (20 mM Tris, 1 M imidazole, 500 mM sodium chloride, pH 8.0). The results are shown in FIG.
실시예 4 정제된 파네실 전이효소에 의한 기질 H-Ras 의 파네실화Example 4 Panesylation of Substrate H-Ras by Purified Panesyl Transferase
본 발명에서 정제한 파네실 전이효소의 활성을 측정하기 위하여, 기질로서 기존에 알려져 있고 현재까지 계속 사용하고 있는 H-Ras 단백질을 사용하였다 (Moores, S. et al., JBC, 1991, 266, 14603). 이를 기질로 이용하여 파네실화를 검출하기 위하여 정제한 파네실 전이효소 10 nM, 기질인 H-Ras 단백질 20 nM, 또 다른 기질인 파네실 피로포스페이트 (Farnesyl pyrophosphate, FPP, Amersham 카탈로그 # TRK 917) 0.5 nM, 10× 완충용액 (50 mM HEPES, 25 mM 염화마그네슘, 25 mM 염화칼륨, 1 mM DTT, 20 nM 염화아연) 10μl을 첨가하여 전체 부피가 100μl 가 되도록 증류수를 첨가한 다음 37℃에서 30분 동안 방치하였다. 이 중 70μl를 취하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에 로딩하여 전기영동한 다음 고정용액 (40% 에탄올, 10% 아세트산)으로 고정시키고 증폭 용액 (Amplify Solution, Amersham 카탈로그 # NAMP 100)을 넣어 파네실화 신호를 증폭하였다. 다음 30분 내지 1 시간 동안 80℃로 젤을 가열해 주는 동시에 진공을 사용하여 젤상에 존재하는 모든 물기를 제거하고 X-선 현상 필름으로 감광함으로써 파네실화가 나타나는 것을 확인하였다 (도 4 참조).In order to measure the activity of the purified farnesyl transferase in the present invention, H-Ras protein, which has been known and continues to be used as a substrate, was used (Moores, S. et al., JBC, 1991, 266, 14603). 10 nM of purified panesyl transferase, 20 nM of H-Ras protein as substrate, and farnesyl pyrophosphate (FPP, Amersham catalog # TRK 917) 0.5 Add 10 μl of nM, 10 × buffer (50 mM HEPES, 25 mM magnesium chloride, 25 mM potassium chloride, 1 mM DTT, 20 nM zinc chloride) to add distilled water to a total volume of 100 μl and then at 37 ° C. for 30 minutes. It was left. 70 μl of this was taken, loaded onto SDS-polyacrylamide gel, electrophoresed, fixed with fixed solution (40% ethanol, 10% acetic acid), and added to the amplify solution (Amplify Solution, Amersham catalog # NAMP 100) for panesylation signals. Was amplified. Next, the gel was heated to 80 ° C. for 30 minutes to 1 hour while vacuum was used to remove all the water present on the gel and exposed to an X-ray developing film to confirm the appearance of panesylation (see FIG. 4).
본 발명은 아미노산 서열에는 변화없이 5'-말단 염기 서열을 대장균 선호 코돈으로 변형시킨 파네실 전이효소 알파-소단위체 유전자를 파네실 전이효소 베타-소단위체 유전자와 결합시켜 발현시킴으로써, 히스티딘이 표지된 파네실 전이효소를 대장균에서 활성도가 크고 용해성이 있는 상태로 대량 생산할 수 있다.According to the present invention, histidine is labeled by binding and expressing a panesyl transferase alpha-subunit gene in which a 5'-terminal sequence is transformed into an E. coli preferred codon without changing the amino acid sequence. Farnesyl transferase can be produced in large quantities in E. coli with high activity and solubility.
본 발명의 제조방법은 기존의 제조방법과 비교하여 그 생산성이 획기적으로 증가되고 정제 과정이 매우 간편한 큰 잇점이 있어 앞으로 그 이용성이 크게 기대되는데, Ras 단백질의 발암성을 억제하는 파네실 전이효소 저해제를 선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.The production method of the present invention has a great advantage in that the productivity is greatly increased and the purification process is very simple compared to the existing production method, and its usefulness is expected in the future. A farnesyl transferase inhibitor which inhibits the carcinogenicity of Ras protein It can be useful for screening.
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