KR100209772B1

KR100209772B1 - A gene encoding angiogenesis-inducing protein bovine angiogenin, and recombinant vector thereof

Info

Publication number: KR100209772B1
Application number: KR1019970006275A
Authority: KR
Inventors: 장수익; 김경희; 유욱준
Original assignee: 장수익
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 1999-07-15
Also published as: KR970021300A

Abstract

본 발명은 신생혈관 유도 단백질인 보바인(소)안지오제닌을 암호화하는 유전자와 이의 재조합 발현벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 닭의 융모영양막에서 신생혈관을 유도하는 능력을 가지고 있는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자 및 이 유전자를 E. coli에서 단백질로 발현시켜주는 재조합 발현벡터를 제공한다.The present invention relates to a gene encoding bovine (small) angiogenin, which is an angiogenic protein, and a recombinant expression vector thereof, and more particularly, to a bovine eye having the ability to induce angiogenesis in chicken chorion membranes. Provided are a gene encoding geogenin and a recombinant expression vector expressing the gene as a protein in E. coli.

Description

신생혈관 유도단백질인 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자 및 이의 재조합 발현벡터Gene encoding the angiogenic protein bovine angiogenin and its recombinant expression vector

[산업상 이용 분야][Industrial use]

본 발명은 신생혈관 유도단백질인 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자 및 이의 재조합 발현벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신생혈관을 유도하는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 bAng 유전자 및 이를 E. coli에서 발현시킬 수 있는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.The present invention relates to a gene encoding bovine angiogenin, which is an angiogenic protein, and a recombinant expression vector thereof, and more particularly, to a bAng gene encoding bovine angiogenin, which induces angiogenesis, and E. coli. It relates to a recombinant expression vector that can be expressed in.

[종래 기술][Prior art]

신생혈관의 형성(angiogenesis)은 신생혈관 유도인자(angiogenic factor)에 의해 일어나며, 배성장, 생식, 발달 및 상처 회복과 같은 정상적인 경우 이러한 신생혈관의 형성은 정상적인 조절을 받게되지만, 신생 혈관 형성의 조절에 이상이 생기면 다음과 같은 여러 가지의 질병이 발생하게 된다 (Folkman , J. and Shing, Y. (1992) J. Biol. Chem., 267, 10931-10934). 즉, 당뇨병환자의 망막에 새로 형성된 모세 혈관이 유리질에 침투하여 눈을 멀게 하는 당뇨병성망막증, 모세 혈관이 관절에 침투하여 연골을 파괴시키는 류마치스성 관절염, AIDS 환자에게 자주 나타나는 카포시육종등이 그 예이다. 한편, 특히 악성종양의 경우는 자신의 성장을 위해 영양분을 흡수하고 노폐물을 배출하는 통로로서 새로운 모세 혈관을 계속적으로 유도하므로, 암의 성장 및 전이 또한 신생혈관의 형성에 의존한다고 볼 수 있다.Angiogenesis is caused by angiogenic factors, and in normal cases such as embryonic growth, reproduction, development, and wound healing, the formation of neovascularization is under normal control, but the regulation of neovascularization is regulated. A variety of diseases can occur when the disease occurs (Folkman, J. and Shing, Y. (1992) J. Biol. Chem., 267, 10931-10934). Examples include diabetic retinopathy in which the newly formed capillaries in the retina of diabetic patients infiltrate the glass and blind the eyes, rheumatoid arthritis in which the capillaries penetrate the joints and destroy cartilage, and Kaposi's sarcoma that is frequently seen in AIDS patients. to be. On the other hand, especially in the case of malignant tumors because they continue to induce new capillaries as a pathway for absorbing nutrients and their waste for their growth, cancer growth and metastasis also depends on the formation of neovascularization.

따라서, 신생혈관의 형성을 유도하는 물질을 발견하고 이의 작용기전을 밝힐 수 있다면, 신생혈관 유도에 기인하는 여러 질병을 치료할 수 있는 계기가 된다. 이에 따라 1970년대부터 국외에서는 많은 과학자들이 신생혈관 유도인자를 발견하려고 노력을 하였다. 1985년 하버드 의과대학의 Bert L. Vallee 박사 연구실에서 최초로 신생혈관 유도단백질인 휴먼 안지오제닌이 인간의 결장 선암 세포(human colon adenocarcinoma cell)의 세포 배양액(cell conditioned medium)으로 부터 분리되었다(Fett, J. W., Strydom, D. J., Lobb, R. R., Alderman, E. M., Bethune, J. L., Riordan, J. F., and Vallee, B. L. (1985) Biochemistry, 24, 5480-5486). 이후, 휴먼 안지오제닌과 같은 신생혈관 유도 활성을 갖는 보바인 안지오제닌이 보바인의 혈장 (Bond, M. D. and Vallee, B. L. (1988) Biochemistry, 27, 6282-6287) 및 우유 (Spik, G, Tartar, A., and Montreuil, J. (19-11-1987) International extension of french patent No. 8715984) 에도 존재함이 밝혀졌으며, 또한 이로부터 보바인 안지오제닌이 분리되었다.Therefore, if the discovery of a substance that induces the formation of neovascularization and its mechanism of action can be revealed, it is an opportunity to treat various diseases due to neovascularization. Accordingly, since the 1970s, many scientists from abroad have tried to find neovascular inducers. In 1985, at Bert L. Vallee's laboratory at Harvard Medical School, human neogiogenin, an angiogenic protein, was isolated from the cell conditioned medium of human colon adenocarcinoma cells (Fett, JW, Strydom, DJ, Lobb, RR, Alderman, EM, Bethune, JL, Riordan, JF, and Vallee, BL (1985) Biochemistry, 24, 5480-5486). Subsequently, bovine angiogenin having neovascular inducing activity, such as human angiogenin, was applied to bovine plasma (Bond, MD and Vallee, BL (1988) Biochemistry, 27, 6282-6287) and milk (Spik, G, Tartar, A., and Montreuil, J. (19-11-1987) International extension of french patent No. 8715984), which also isolated bovine angiogenin.

현재, 휴먼 안지오제닌의 경우는 이를 암호화하는 유전자가 클로닝되었고 이를 E. coli에서 발현시킬 수 있는 발현벡터가 개발되어 있다 (Kurachi, K., Davie, E. W., Strydom, D. J., Riordan, J. F., and Vallee, B. L. (1985) Biochemistry, 24, 5494-5499). 그러나, 보바인 안지오제닌의 경우, 이의 아미노산서열은 밝혀져있지만 이를 암호화하는 유전자가 아직 클로닝되어 있지 않고 또한 이를 E. coli에서 발현시킬 수 있는 발현벡터도 개발되어 있지 않고 있다(Bond, M. D. and Strydom, D. J. (1988) Biochemistry, 28, 6110-6113).Currently, in the case of human angiogenin, a gene encoding the same has been cloned and an expression vector capable of expressing it in E. coli has been developed (Kurachi, K., Davie, EW, Strydom, DJ, Riordan, JF, and Vallee, BL (1985) Biochemistry, 24, 5494-5499). However, in the case of bovine angiogenin, its amino acid sequence is known, but the gene encoding it is not cloned yet, and no expression vector capable of expressing it in E. coli has been developed (Bond, MD and Strydom). , DJ (1988) Biochemistry, 28, 6110-6113).

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 신생혈관 유도 단백질인 안지오제닌의 작용기전을 이해하고, 응용성이 높은 안지오제닌의 신 억제제 개발 및 발견을 위해서 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자와 이를 E. coli에서 대량 발현시킬 수 있는 보바인 안지오제닌의 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.The present invention is to solve the above problems, an object of the present invention is to understand the mechanism of action of angiogenin, an angiogenesis protein, and to improve the applicability of angiogenin anabolic inhibitor for the development and discovery of bovine angio It provides a gene encoding the gene and recombinant expression vector of bovine angiogenin which can be expressed in E. coli mass.

도 1은 보바인의 혈장 및 우유에서 분리된 닭의 융모영양막에서 신생혈관을 유도하는 능력을 가진 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자인 bAng 유전자의 염기서열 및 이 염기서열에 따른 아미노산 서열.1 is a nucleotide sequence of the bAng gene which is a gene encoding bovine angiogenin having the ability to induce neovascularization in the chorion of chickens isolated from plasma and milk of bovine and amino acid sequence according to this base sequence.

도 2는 본 발명에 따른 bAng 유전자에 의해 발현된 보바인 안지오제닌 염기서열(bAng) 및 휴먼 안지오제닌 염기서열(hAng)의 비교.2 is a comparison of bovine angiogenin nucleotide sequence (bAng) and human angiogenin nucleotide sequence (hAng) expressed by the bAng gene according to the present invention.

도 3은 본 발명에 따른 bAng 유전자를 발현시키는 재조합 발현벡터 pGEX-bAng.Figure 3 is a recombinant expression vector pGEX-bAng expressing the bAng gene according to the present invention.

도 4는 GSH-친화 크로마토그래피를 이용한 GST(Glutathione S-transferase) 융합 보바인 안지오제닌의 분리 용출 프로파일.Figure 4 is an isolated elution profile of GST (Glutathione S-transferase) fusion bovine angiogenin using GSH-affinity chromatography.

도 5는 GST 융합 보바인 안지오제닌의 트롬빈 처리 후, Mono-S 양이온 교환 크로마토 그래피를 이용한 보바인 안지오제닌의 분리 용출 프로파일.5 is a separation elution profile of bovine angiogenin using Mono-S cation exchange chromatography after thrombin treatment of GST fused bovine angiogenin.

도 6은 E. coli에서 발현시킨 보바인 안지오제닌의 각 분리 단계에 따른 SDS-PAGE 결과.6 is SDS-PAGE results according to each separation step of bovine angiogenin expressed in E. coli.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기의 염기서열로 표시되는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자를 제공한다.In order to achieve the above object of the present invention, the present invention provides a gene encoding bovine angiogenin represented by the following nucleotide sequence.

또한 본 발명은 하기의 염기서열로 표시되는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding bovine angiogenin represented by the following nucleotide sequence.

상기 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자의 전사 개시 부위가 시작되는 1 위치로 부터 -33 위치에 타타 박스 서열을 가지는 것이 바람직하며,It is preferable to have a tata box sequence at position -33 from position 1 at which the transcription initiation site of the gene encoding bovine angiogenin starts,

상기 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자의 135 위치로 부터 202 위치에 신호 펩타이드의 유전자를 가지는 것이 바람직하고,It is preferable to have a gene of a signal peptide at position 202 from position 135 of the gene encoding the bovine angiogenin,

상기 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자의703 위치와 707 위치에 mRNA 전사의 폴리아데닐화에 관여하는 AATAAA 서열을 가지는 것이 바람직하다.It is preferable to have an AATAAA sequence involved in polyadenylation of mRNA transcription at positions 703 and 707 of the gene encoding bovine angiogenin.

본 발명은 또한 상기 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자와, 상기 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자를 발현시킬 수 있는 발현벡터가 결합된 보바인 안지오제닌을 발현하는 재조합 발현벡터를 제공하며,The present invention also provides a recombinant expression vector expressing bovine angiogenin to which a gene encoding the bovine angiogenin and an expression vector capable of expressing the gene encoding the bovine angiogenin are combined. ,

상기 발현벡터는 pGEX-2T 및 pET-11a로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하고,The expression vector is preferably selected from the group consisting of pGEX-2T and pET-11a,

상기 발현벡터는 하기의 구조를 가지는 보바인 안지오제닌을 발현하는 pGEX-bAng인 재조합 발현벡터가 바람직하다.The expression vector is preferably a recombinant expression vector of pGEX-bAng expressing bovine angiogenin having the following structure.

[대표적인 실시예]Representative Example

도 1은 본 발명에 따른 신생혈관을 유도하는 특성을 갖는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 bAng 유전자의 염기 서열을 도시한 것이다.Figure 1 shows the nucleotide sequence of the bAng gene encoding bovine angiogenin having the characteristics of inducing neovascularization according to the present invention.

도 1로부터, 상기한 bAng 유전자는 818 염기 쌍의 염기서열에서 보바인 안지오제닌을 암호화하는 부분은 이미 밝혀진 아미노산 서열과 비교하거나 다른 종의 유전자들과의 비교를 통하여 확인된다. 203 위치에서 시작되는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 bAng 유전자로서, bAng 유전자는 203 위치에서 580 위치까지의 378 염기 쌍으로 구성된다. bAng 유전자는 개시코돈(initiation codon)으로부터 업스트림(up-stream)에 타타 박스 서열(TATA box sequence)이 -33 위치에 존재한다. 또 mRNA 전사의 폴리아데닐화에 관여하는 AATAAA 서열이 703과 707 위치에 존재한다.From FIG. 1, the bAng gene is identified by comparing the amino acid sequence already known or the genes of other species in the base sequence of 818 base pairs encoding bovine angiogenin. The open reading frame starting at position 203 is the bAng gene, which consists of 378 base pairs from position 203 to position 580. The bAng gene has a TATA box sequence at position -33 upstream from an initiation codon. AATAAA sequences involved in polyadenylation of mRNA transcription are present at positions 703 and 707.

도 2는 본 발명에 따른 신생혈관을 유도하는 특성을 갖는 bAng유전자에 의해 발현되는 보바인 안지오제닌의 염기서열을 휴먼 안지오제닌의 염기서열과 비교한 것이다. 따라서 보바인 안지오제닌의 염기서열 번호 4는 도 1에서 표시된 염기서열 번호 206과 동일하다.Figure 2 compares the base sequence of bovine angiogenin expressed by the bAng gene having the characteristics of inducing angiogenesis according to the present invention with the base sequence of human angiogenin. Therefore, nucleotide sequence 4 of bovine angiogenin is the same as nucleotide sequence 206 shown in FIG.

상기한 보바인 안지오제닌은 bAng의 염기 서열로부터 계산할 때,126개의 아미노산으로 구성되어 있다. 계산된 아미노산은 이미 발표된 보바인 안지오제닌의 아미노산 서열과 동일하므로 bAng 유전자는 보바인 안지오제닌을 암호화하고 있음이 확인되었다. 참고로 보바인 안지오제닌은 휴먼 안지오제닌의 아미노산 서열과 64% 동일하다((Bond, M. D. and Strydom, D. J. (1988) Biochemistry, 28, 6110-6113).The above-mentioned bovine angiogenin is composed of 126 amino acids as calculated from the base sequence of bAng. Since the calculated amino acid is identical to the amino acid sequence of bovine angiogenin already published, it was confirmed that the bAng gene encodes bovine angiogenin. For reference, bovine angiogenin is 64% identical to the amino acid sequence of human angiogenin (Bond, M. D. and Strydom, D. J. (1988) Biochemistry, 28, 6110-6113).

본 발명은 또한 도 1에 나타낸 염기서열 및 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하고 신생혈관을 유도하는 특성을 갖는 bAng 유전자에 의해 발현되는 보바인 안지오제닌을 제공한다.The present invention also provides bovine angiogenin, which is composed of the nucleotide sequence and amino acid sequence shown in FIG. 1 and is expressed by the bAng gene having the characteristics of inducing angiogenesis.

도 3은 본 발명에 따른 bAng 유전자를 E. coli에서 발현시킬 수 있는 재조합 발현벡터 pGEX-bAng를 나타낸 것이다. 보바인 안지오제닌 유전자는 pGEX-2T 벡터의 BamH1 자리에 삽입되었고, 이렇게 구축된 발현 벡터 pGEX-bAng 는 보바인 안지오제닌이 GST와 융합되어 발현된다. 융합단백질 GST-보바인 안지오제닌은 GSH-친화 크로마토그래피를 이용하여 쉽게 분리할 수 있으며, 트롬빈으로 이 융합단백질을 처리하여 보바인 안지오제닌을 GST로부터 분리할 수 있다.Figure 3 shows a recombinant expression vector pGEX-bAng that can express the bAng gene in E. coli according to the present invention. The bovine angiogenin gene was inserted at the BamH1 site of the pGEX-2T vector, and the expression vector pGEX-bAng thus constructed was expressed by fusion of bovine angiogenin with GST. The fusion protein GST-bovine angiogenin can be easily separated using GSH-affinity chromatography, and the bovine angiogenin can be separated from GST by treating this fusion protein with thrombin.

도 4는 GSH-친화 크로마토그래피를 이용한 GST(Glutathione S-transferase)융합 보바인 안지오제닌의 분리 용출분획(fraction)프로파일을 나타낸 것이다. SDS-PAGE에서 약 42kDa 의 분자량을 가짐을 확인할 수 있다(참조, 도 6 (A)의 레인 5).Figure 4 shows the separation fraction profile of GST (glutathione S-transferase) fusion bovine angiogenin using GSH-affinity chromatography. It can be seen from the SDS-PAGE that it has a molecular weight of about 42 kDa (see lane 5 in FIG. 6 (A)).

도 5는 GST 융합 보바인 안지오제닌의 트롬빈 처리 후, Mono-S 양이온 교환 크로마토 그래피를 이용한 보바인 안지오제닌의 분리 용출분획 프로파일이다. 융합단백질 GST-보바인 안지오제닌을 트롬빈으로 처리한 후, SDS-PAGE상에서 분자량이 26 kDa인 GST와 분자량이 약 16 kDa인 보바인 안지오제닌으로 분리된다(참조, 도 6 (A)의 레인 6). 양이온 교환 크로마토 그래피를 이용하여 분리된 보바인 안지오제닌은 SDS-PAGE상에서 순수한 단일 밴드로서 나타난다(참조, 도 6의 레인 7).FIG. 5 is an isolated elution fraction profile of bovine angiogenin using Mono-S cation exchange chromatography after thrombin treatment of GST fused bobbin angiogenin. After treating the fusion protein GST-bovine angiogenin with thrombin, it is separated on GDS having a molecular weight of 26 kDa and bovine angiogenin having a molecular weight of about 16 kDa on SDS-PAGE (see FIG. 6 (A)). Lane 6). Bovine angiogenin isolated using cation exchange chromatography appears as a pure single band on SDS-PAGE (see lane 7 in FIG. 6).

도 6은 보바인 안지오제닌을 E. coli에서 발현시킨 후, 각 분리단계에 대한 SDS-PAGE결과이다. 도 6의 왼쪽 사진(A)중, 레인 1은 표준 분자량 단백질이며, 레인 2는 재조합 발현벡터 pGEX-bAng가 들어 있는 E. coli를 IPTG로 유도하지 않은 경우이고, 레인 3은 재조합 발현벡터 pGEX-bAng가 들어 있는 E. coli를 0.1 mM IPTG로 유도한 경우이고, 레인 4는 인클루젼 바디(inclusion body)로 발현된 융합단백질을 변성시킨 후 가용화/리폴딩 (refolding)시킨 것이고, 레인 5는 이를 GSH-친화 크로마토그래피에 로딩한 후 GSH로 용출시킨 것이고, 레인 6은 상기 레인 5에서 수득된 융합단백질을 트롬빈으로 처리한 것이고, 레인 7은 Mono-S 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 보바인 안지오제닌의 분리결과이고, 레인 8은 우유에서 분리한 보바인 안지오제닌의 결과이다. 도 6의 오른쪽 사진(B)는 SDS-PAGE 젤의 웨스턴 블라팅 (Western blotting)한 후 우유에서 분리한 보바인 안지오제닌에 대한 항체를 이용하여 면역 염색 결과이다.Figure 6 shows the expression of bovine angiogenin in E. coli, SDS-PAGE results for each separation step. In the left photo (A) of FIG. 6, lane 1 is a standard molecular weight protein, lane 2 is a case where E. coli containing the recombinant expression vector pGEX-bAng is not induced with IPTG, and lane 3 is a recombinant expression vector pGEX-. E. coli containing bAng was induced with 0.1 mM IPTG. Lane 4 was solubilized / refolded after denaturation of the fusion protein expressed in the inclusion body. This was loaded on GSH-affinity chromatography and eluted with GSH, lane 6 was treated with thrombin of the fusion protein obtained in lane 5, and lane 7 was bovine angio using Mono-S cation exchange chromatography. The result of the separation of xenin, lane 8 is the result of bovine angiogenin isolated from milk. Figure 6 (B) of the right is an immunostaining result using an antibody against bovine angiogenin isolated from milk after Western blotting of the SDS-PAGE gel.

다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.The following describes preferred embodiments to aid the understanding of the present invention. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

[실시예]EXAMPLE

실시예 1:올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)의 제작Example 1 Preparation of Oligonucleotides

보바인 안지오제닌 유전자를 클로닝하는데에 사용하기 위하여, 이미 발표된 보바인 안지오제닌의 아미노산서열과 휴먼 안지오제닌의 아미노산 서열을 참고로 합성된 5가지의 올리고뉴클레오티드를 다음에 나타내었다.For use in cloning the bovine angiogenin gene, five oligonucleotides synthesized with reference to the previously published amino acid sequence of bovine angiogenin and the amino acid sequence of human angiogenin are shown below.

[서열표 1][SEQ ID NO: 1]

ANG-1 : 5'-GCAGGATCCGA(A/G)TA(C/T)TG(C/T)TT(C/T)AA(C/T)ATGATG-3'ANG-1: 5'-GCAGGATCCGA (A / G) TA (C / T) TG (C / T) TT (C / T) AA (C / T) ATGATG-3 '

[서열표 2][SEQ ID NO: 2]

ANG-2 : 5'-GACGATTCAA(C/T)AA(A/G)AA(C/T)GA(C/T)AT(A/C/T)AA(C/T)GC-3'ANG-2: 5'-GACGATTCAA (C / T) AA (A / G) AA (C / T) GA (C / T) AT (A / C / T) AA (C / T) GC-3 '

[서열표 3][SEQ ID NO: 3]

ANG-2R : 5'-GAGGAATTCG(G/A)TT(T/A/G)AT(G/A)TC(G/A)TT(C/T)TT(G/A)TT-3'ANG-2R: 5'-GAGGAATTCG (G / A) TT (T / A / G) AT (G / A) TC (G / A) TT (C / T) TT (G / A) TT-3 '

[서열표 4][SEQ ID NO: 4]

ANG-3 : 5'-GCACTGCAGCCNCC(T/C)TT(A/G)TG(T/C)TT(A/G)CA(G/A/T)AT-3'ANG-3: 5'-GCACTGCAGCCNCC (T / C) TT (A / G) TG (T / C) TT (A / G) CA (G / A / T) AT-3 '

[서열표 5][SEQ ID NO: 5]

ANG-4 : 5'-GTCGTCGACAT(A/G)AANGA(T/C)TC(A/G)TC(A/G)AA(A/G)TG-3'ANG-4: 5'-GTCGTCGACAT (A / G) AANGA (T / C) TC (A / G) TC (A / G) AA (A / G) TG-3 '

폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction) 및 방사선이 표지된 DNA 프로브(probe) 합성Polymerase chain reaction and synthesis of radiolabeled DNA probes

보바인의 간 cDNA 라이브러리(bovine liver cDNA library)를 템플레이트로 하고 100 pmole의 ANG-1와 ANG-3 프라이머(primer)와 2.5 mM dNTP, 1.5mM MgCl₂, 0.01mM KCl의 조건하에서 2.5 단위의 Taq DNA 폴리머라제와 30 ㎕의 미네랄 오일을 첨가하여 보통 35 cycle로 반응을 진행하였다. 템플레이트 DNA의 변성은 94℃에서 150초, 어닐링(annealing)은 45℃에서 60초, 중합반응은 72℃에서 120초 동안 수행하였다.Bovine liver cDNA library as a template and 2.5 units of Taq under conditions of 100 pmole of ANG-1 and ANG-3 primers, 2.5 mM dNTP, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.01 mM KCl DNA polymerase and 30 μl of mineral oil were added, and the reaction proceeded in 35 cycles. The denaturation of template DNA was performed at 94 ° C. for 150 seconds, annealing at 45 ° C. for 60 seconds, and polymerization at 72 ° C. for 120 seconds.

증폭된 DNA는 M13mp19 RF DNA를 Pst I, Bam HI 제한효소로 처리하여 서브클로닝(subcloning)한 후, XL1-Blue에 트랜스포메이션(transformation)시켜 단일가닥(single stranded)DNA를 정제하였다. 정제된 DNA가 보바인 안지오제닌 유전자를 포함하는지를 확인하기 위하여 6% polyacrylamide gel(PAGE)을 이용한 시컨싱(sequencing)을 실시하여 조사하였다.The amplified DNA was subcloned by treating M13mp19 RF DNA with Pst I and Bam HI restriction enzymes, and then transformed into XL1-Blue to purify single stranded DNA. In order to confirm that the purified DNA contains the bovine angiogenin gene, sequencing using 6% polyacrylamide gel (PAGE) was performed.

상기와 같이 준비된 1-2㎍의 단일가닥 DNA를 랜덤 프라이머(random primer)와 함께 끓인 후 35℃ 이하로 서서히 온도를 내려주는 조건하에서 어닐링을 실시하였고, α-³²P-dCTP, dCTP, Klenow DNA 폴리머라제(7단위)를 넣어 37℃에서 45분 반응시켜 중합반응을 유도하였다. 100 μM의 dCTP로 체이스(chase)하여 합성을 길게하고, 또 65℃에서 5분간 처리함으로써 Klenow 효소의 활성을 불활화시켰다. Bam H1, Pst 1로 처리한 후 페놀/클로로포름 추출과정을 거쳐 에탄올을 처리하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 상기 DNA를 4% PAGE로 분리한 후, 방사선 물질이 표지된 DNA 부분만을 잘라내고 투석막에 넣고 1시간 동안 150 V로 투석하였다. 투석막으로 부터 방사선이 표지된 DNA(프로브)용액을 얻어 3 ml의 칵테일 용액(cocktail solution)과 섞고 액체 방사선 측정기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선의 양을 조사하였다.After 1-2 ug of single-stranded DNA prepared as described above boiled together with a random primer (annealed random primer) and then annealed under the conditions of gradually lowering the temperature below 35 ℃, α- ³² P-dCTP, dCTP, Klenow DNA Polymerase (7 units) was added and reacted at 37 ° C. for 45 minutes to induce a polymerization reaction. The synthesis was extended by chase with 100 μM of dCTP, followed by treatment at 65 ° C. for 5 minutes to inactivate Klenow enzyme activity. After treatment with Bam H1 and Pst 1, phenol / chloroform extraction was performed to treat ethanol to precipitate DNA. After the precipitated DNA was separated by 4% PAGE, only a portion of the DNA labeled with radioactive material was cut out, placed in a dialysis membrane, and dialyzed at 150 V for 1 hour. Radiation-labeled DNA (probe) solution was obtained from the dialysis membrane, mixed with 3 ml of cocktail solution, and the amount of radiation was investigated using a liquid scintillation counter.

게놈 라이브러리 검색Genome Library Search

1) 1차 검색1) Primary Search

보바인의 간 게놈 라이브러리를 80mm 플레이트에 10,000 pfu의 밀도로 플레이팅하고 37℃에서 5시간 배양하였다. 나이론 막을 이용하여 트랜스퍼한 후 변성화 용액(1.5 M NaCl, 0.5 N NaOH), 중성화 용액(1.5 M NaCl, 0.5 M Tris, pH 8.0)에 적시고 2 X SSC(0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate)로 세척하였다. UV-crosslinker를 이용하여 막에 고정시킨 후 20 ml의 혼성화 용액(6 X SSC, 30% 포름알데하이드, 5X 덴하르트 용액, 0.1% SDS, 100 mg(초음파 처리 청어 정자,sonicated herring sperm DNA)/ml)에 넣어 42℃에서 약 2시간 배양 시켰다. 이후 상기에서 준비한 DNA 프로브(8x10⁶cpm)를 이용하여 혼성화 용액에서 12시간 이상 혼성화시켰다. 2 X SSC, 0.1% SDS와 1 X SSC, 0.1% SDS 용액에서 각각 세척하고 65℃ 0.5 X SSC, 0.1% SDS와 65℃ 0.1 X SSC, 0.1% SDS 용액을 이용하여 스트린전시(stringency)를 높인 후 -70℃에서 48시간 동안 X-ray 필름에 노출시켰다.Bobane's liver genome library was plated on 80 mm plates at a density of 10,000 pfu and incubated at 37 ° C. for 5 hours. Transfer using a nylon membrane, then wet with denaturation solution (1.5 M NaCl, 0.5 N NaOH), neutralization solution (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris, pH 8.0), and use 2 X SSC (0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate). Washed. 20 ml of hybridization solution (6 X SSC, 30% formaldehyde, 5X Denhardt's solution, 0.1% SDS, 100 mg (sonicated herring sperm DNA) / ml after immobilization to the membrane using a UV-crosslinker) ) Was incubated at 42 ° C. for about 2 hours. Then, using the DNA probe (8x10 ⁶ cpm) prepared above it was hybridized in the hybridization solution for more than 12 hours. Wash in 2 X SSC, 0.1% SDS, 1 X SSC and 0.1% SDS solutions, respectively, and measure stringency using 65 ° C 0.5 X SSC, 0.1% SDS and 65 ° C 0.1 X SSC, 0.1% SDS solution. It was then exposed to X-ray film for 48 hours at -70 ℃.

2) 2차 검색2) secondary search

1차 검색의 결과 양성 신호와 일치되는 부위의 플라크(plaque)를 선택한 후, 적절한 수로 조절하고 1차와 동일한 조건하에서 2차 검색을 실시하였다.As a result of the primary search, the plaques of the sites that matched the positive signal were selected, adjusted to appropriate numbers, and subjected to the secondary search under the same conditions as the primary.

3) 3차 검색3) 3rd search

2차 검색 결과 양성 신호와 일치되는 부위의 플라크를 선택한 후, 적절한 수로 조절하고 2차와 동일 조건하에서 3차 검색을 실시하였다. 이때 얻는 1개의 클론을 λbAng로 명명하였다.After the second search, the plaques of the sites matching the positive signal were selected, adjusted to appropriate numbers, and the third search was performed under the same conditions as the second. One clone obtained at this time was named λbAng.

사든 블러팅(Southern blotting)Southern blotting

3차 검색으로 얻은 플라크부터 λDNA를 추출하고, 약 1-1.5 ㎍을 취하여 적당한 제한효소(SacI , EcoRI, XhoI, HindIII, XhoI-Hind III)로 처리한 후, 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 이후 이 반응액을 1% agarose gel로 분리하고, 탈퓨린화(depurination, 0.25N HCl), 변성화(1.5M NaCl, 0.5N NaOH), 중화(1.5M NaCl, 0.5M Tris, pH 8.0) 및 2×SSC 용액으로 처리한 후 Hybond-N+ 막에 트랜스퍼시켰다. 상기 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 준비된 210 bp의 DNA를 랜덤 프라이머를 이용하여 α-³²P-dCTP로 표지한 후 분리 정제하고 프로브를 준비하였다. 이 프로브를 사용하여 게놈라이브러리 검색에서 사용한 것과 같은 방법으로 혼성화하였다.Λ DNA was extracted from the plaque obtained by the third search, and treated with appropriate restriction enzymes (SacI, EcoRI, XhoI, HindIII, XhoI-Hind III) by taking about 1-1.5 μg, and reacted at 37 ° C. for 2 hours. The reaction solution was then separated by 1% agarose gel, depurination (0.25N HCl), denaturation (1.5M NaCl, 0.5N NaOH), neutralization (1.5M NaCl, 0.5M Tris, pH 8.0) and After treatment with 2 × SSC solution, transfer to Hybond-N + membrane. The 210 bp DNA prepared by the polymerase chain reaction was labeled with α- ³² P-dCTP using a random primer and then separated and purified to prepare a probe. This probe was used to hybridize in the same way as used for genome library search.

유전자 매핑(mapping)Gene mapping

상기 사든 블라팅으로부터 얻은 DNA 단편을 적절한 제한효소(PstI, Kpn I, EcoRI, HindIII, SacI, BamHI, XhoI, XbaI등)를 이용하여 절단하고 1% agarose gel에서 전기영동하였다. 이후 DNA 전기 영동 형태로 부터 적절한 위치의 제한효소 부위를 추정하였다.DNA fragments obtained from the sad blotting were digested with appropriate restriction enzymes (PstI, Kpn I, EcoRI, HindIII, SacI, BamHI, XhoI, XbaI, etc.) and electrophoresed on 1% agarose gel. The restriction site at the appropriate position was then estimated from the DNA electrophoresis pattern.

DNA 염기서열 결정DNA sequence determination

상기 유전자 매핑에서 얻은 DNA 단편을 M13mp18과 M13mp19 RF DNA에 서브클로닝하였다. 이후 이로부터 M13 단일가닥 phage DNA를 분리하고 이를 염기서열의 주형으로 사용하였다. 약 1 ㎍의 주형에 1 pmole의 유니버설 프라이머를 이용하여 37℃에서 30분 동안 어닐링시켰다. 그리고, α-³⁵S-dATP(600 Ci/mmol)와 시쿼네이즈(sequenase)를 여기에 첨가하였다. 이 혼합물을 3.5 ㎕씩 2.5 ㎕의 종결 혼합물로 분주하고 4 ㎕의 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 이를 염기서열 젤(gel)에 로딩하였다. 유전자 매핑결과 크기가 큰 DNA 단편들은 pUC19, pBluescript SK(-/+)벡터에 서브클로닝하였다. 이후 이로부터 이중 가닥 DNA를 분리하고 이를 염기서열의 주형으로 사용하였다. 약 2-3 ㎍ 정도의 DNA를 2M NaOH, 2mM EDTA의 용액을 이용하여 변성시킨 후 3 M sodium acetate (pH 5.2)로 중화하고 에탄올로 침전시켜 7 ㎕의 물에 녹였다. DNA 염기서열 반응은 위의 단일가닥 phage DNA의 경우와 동일하게 진행하였다.DNA fragments obtained from the gene mapping were subcloned into M13mp18 and M13mp19 RF DNA. Thereafter, M13 single-stranded phage DNA was isolated and used as a template for nucleotide sequence. About 1 μg of template was annealed at 37 ° C. for 30 minutes using 1 pmole universal primer. And α- ³⁵ S-dATP (600 Ci / mmol) and sequenase were added thereto. The mixture was aliquoted into 3.5 μl of 2.5 μl of termination mixture and 4 μl of stop solution was added to stop the reaction and then loaded onto a sequencing gel. As a result of gene mapping, large DNA fragments were subcloned into pUC19 and pBluescript SK (-/ +) vectors. Thereafter, double-stranded DNA was separated therefrom and used as a template for nucleotide sequence. About 2-3 μg of DNA was denatured using a solution of 2M NaOH, 2mM EDTA, neutralized with 3M sodium acetate (pH 5.2), precipitated with ethanol, and dissolved in 7 μl of water. DNA sequencing reaction was performed in the same manner as the above single-stranded phage DNA.

재조합 발현벡터 pGEX-bAng의 구축Construction of Recombinant Expression Vector pGEX-bAng

보바인 안지오제닌 유전자의 양말단에 제한효소 부위를 만들어 pGEX-2T 벡터로 삽입시키기 위하여 Bam H1 자리와 개시 코돈을 함유하는 NdeI 자리가 동시에 생성되도록 프라이머를 설계하였다. 설계된 프라이머는 다음과 같다.The primers were designed to simultaneously generate a Bam H1 site and an NdeI site containing an initiation codon to create a restriction enzyme site at the sock end of the bovine angiogenin gene and insert it into the pGEX-2T vector. The designed primers are as follows.

[서열표 6][SEQ ID NO: 6]

bAng-01 : 5'-ATCGGATCCCTAGTGGCGTGGAGTGAT-3'bAng-01: 5'-ATCGGATCCCTAGTGGCGTGGAGTGAT-3 '

(Bam HI)(Bam HI)

[서열표 7][SEQ ID NO: 7]

bAng-02 : 5'-GCAGGATCCCATATGGCTCAAGATGACTACAGA-3'bAng-02: 5'-GCAGGATCCCATATGGCTCAAGATGACTACAGA-3 '

(Bam HI)(NdeI)(Bam HI) (NdeI)

폴리머라제 연쇄 반응은 50ng 주형 DNA, 100 pmole 프라이머(bAng-01, bAng-02), 2.5mM dNTPs, 1.5 mM MgCl₂가 포함되도록 총반응액 50㎕를 준비하고, 30㎕의 미네랄 오일을 첨가한 뒤 게놈 라이브러리 검색 시에 사용했던 조건과 동일하게 수행하였다. 폴리머라제 연쇄 반응 생성물을 pBluescript SK(-) 벡터에 서브클로닝한 후 염기서열을 결정하고 보바인 안지오제닌의 유전자가 올바르게 증폭되었음을 확인하였다.For polymerase chain reaction, 50 μl of total reaction solution was prepared to include 50 ng template DNA, 100 pmole primer (bAng-01, bAng-02), 2.5 mM dNTPs, 1.5 mM MgCl ₂ , and 30 μl of mineral oil was added. The same conditions were used as in the later genome library search. After subcloning the polymerase chain reaction product into the pBluescript SK (-) vector, the sequence was determined and confirmed that the gene of bovine angiogenin was correctly amplified.

재조합된 융합 단백질 GST-보바인 안지오제닌의 발현 및 정제Expression and Purification of Recombinant Fusion Protein GST-Bovine Angiogenin

박테리아는 LB배지에서 배양하고 이때 10mg/ml의 암피실린(ampicillin)을 첨가하였다. 재조합된 융합 단백질 GST-보바인 안지오제닌은 OD₆₀₀가 약 0.5-0.6일 때 0.1mM IPTG로 발현을 유도하였다. IPTG를 넣지 않은 상태에서의 pGEX-bAng/XL1-Blue를 네가티브 컨트롤(negative control)로 사용하였다. 융합단백질은 인클루젼 바디로 발현되었으므로 이를 용해된 자연상태의 단백질로 변화시키기 위하여 배양된 세포를 수확하고 200 mM Tris-Cl (pH 7.6), 10% 슈크로스, 2.5 mM PMSF의 완충용액을 원래 배양 부피의 1/10에 현탁시켰다. 여기에 100 ㎍/ml의 라이소자임, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA를 첨가하고 찬 얼음물에서 45분 반응시키고 E. coli 세포벽을 파괴하였다. 새로운 PMSF를 2.5 mM이 되도록 첨가한 후 초음파 처리하고 17,300g, 25분, 4℃에서 원심분리기로 침전물을 모아 2.3 mM PMSF가 포함된 Tris-슈크로스 완충용액을 이용하여 세척한 후 찬 얼음물을 이용하여 다시 세척하여 세포에 포함된 슈크로스 성분을 제거하였다. 이후 34,800g에서 30분간의 원심분리로 침전물을 모은 후, 7 M guanidine chloride, 100 mM potassium phosphate (pH 7.5), 100 mM mercaptoethanol이 함유된 완충용액을 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시켜 단백질을 서서히 녹였다. 100부피의 50 mM Tris-Cl (pH 8.5), 100 mM NaCl에 녹여 놓은 혼합물을 방울방울 떨어뜨린 후 20-24시간 정도 방치시키고 4℃에서 6-10시간 섞어주고 염의 농도를 1M까지 증가시킴으로써 용해된 단백질로 전환시켰다. 16,300g, 30분, 4℃에서 원심분리 후 상층액을 모아 아미콘사 PM10 막을 이용하여 200배 정도로 농축시켰다. 이후, 6부피의 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)완충용액을 첨가한 후 다시 한번 더 농축시켰다.The bacteria were incubated in LB medium at which time 10 mg / ml of ampicillin was added. Recombinant fusion protein GST-bovine angiogenin induced expression with 0.1 mM IPTG when OD ₆₀₀ was about 0.5-0.6. PGEX-bAng / XL1-Blue without IPTG was used as negative control. Since the fusion protein was expressed as an inclusion body, the cultured cells were harvested and the buffer solution of 200 mM Tris-Cl (pH 7.6), 10% sucrose, 2.5 mM PMSF was changed to convert the protein into a soluble natural protein. Suspension was at 1/10 of the culture volume. 100 μg / ml of lysozyme, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA was added thereto, reacted for 45 minutes in cold ice water, and the E. coli cell wall was destroyed. Add new PMSF to 2.5 mM, sonicate, collect precipitate by centrifuge at 17,300 g, 25 min, 4 ° C, wash with Tris-Sucrose buffer containing 2.3 mM PMSF, and use cold ice water Again to remove the sucrose components contained in the cells. Then, precipitates were collected by centrifugation at 34,800 g for 30 minutes, and then buffered with 7 M guanidine chloride, 100 mM potassium phosphate (pH 7.5) and 100 mM mercaptoethanol was added and reacted for 3 hours at 37 ° C. Melted. The mixture dissolved in 100 volumes of 50 mM Tris-Cl (pH 8.5) and 100 mM NaCl was dropped and left to stand for 20-24 hours. Converted to protein. After centrifugation at 16,300 g, 30 minutes, and 4 ℃, the supernatant was collected and concentrated to about 200-fold using Amicon's PM10 membrane. Thereafter, 6 volumes of 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) buffer solution was added and concentrated again.

상기 농축 시료를 1 X PBS에 의해 평형화된 GSH-친화 컬럼에 7-8 ml정도 로딩하였다. 이후, PBS 완충용액을 이용하여 컬럼을 세척하고 결합하지 않은 다른 단백질을 완전히 제거하였다. 50 mM Tris-Cl (pH 9.6), GSH 완충용액을 이용하여 융합단백질을 용출시켰으며 12% SDS-PAGE를 실시하여 융합단백질의 정제를 확인하였다.The concentrated sample was loaded by 7-8 ml into a GSH-affinity column equilibrated with 1 × PBS. Thereafter, the column was washed with PBS buffer and other proteins not bound were completely removed. The fusion protein was eluted using 50 mM Tris-Cl (pH 9.6), GSH buffer and purified by fusion protein by 12% SDS-PAGE.

GSH-친화 컬럼을 이용하여 정제한 GST-보바인 안지오제닌을 10 단위의 트롬빈으로 처리하고, 12% SDS-PAGE를 실시하여 GST와 보바인 안지오제닌이 서로 분리되었음을 확인하였다. 끝으로 이 용액을 Mono-S 양이온 교환 칼럼에 로딩한 후, 용출하여 보바인 안지오제닌을 순수하게 분리하였다.GST-bovine angiogenin purified using a GSH-affinity column was treated with 10 units of thrombin, and 12% SDS-PAGE was performed to confirm that GST and bovine angiogenin were separated from each other. Finally, the solution was loaded on a Mono-S cation exchange column, followed by elution to purely separate bovine angiogenin.

닭의 융모영양막에서 신생혈관을 유도하는 능력을 가지고 있는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자 및 이 유전자를 E. coli에서 단백질로 발현시킬 수 있는 발현 벡터의 제공으로 이 보바인 안지오제닌의 대량 생산이 가능하며, 이를 이용하여 신생혈관 유도 및 저하에 기인하는 여러 질병을 치료할 수 있는 계기가 마련되었다.The gene encoding bovine angiogenin, which has the ability to induce angiogenesis in chicken chorion, and an expression vector capable of expressing this gene as a protein in E. coli, provides a large amount of this bovine angiogenin. It is possible to produce and use it to cure various diseases caused by neovascular induction and degradation.

Claims

하기의 염기서열로 표시되는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자.A gene encoding bovine angiogenin represented by the following nucleotide sequence.

제 1항에 있어서, 상기 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자의 전사 개시 부위가 시작되는 1 위치로 부터 -33 위치에 타타 박스 서열을 가지는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자.The gene encoding bovine angiogenin according to claim 1, wherein the gene encoding bovine angiogenin has a tata box sequence at position -33 from position 1 at which the transcription initiation site of the gene encoding bovine angiogenin starts.

제 1항에 있어서, 상기 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자의 135 위치로 부터 202 위치에 신호 펩타이드의 유전자를 가지는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자.The gene encoding bovine angiogenin according to claim 1, which has a gene of a signal peptide at positions 202 to 202 of the gene encoding bovine angiogenin.

제 1항에 있어서, 상기 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자의703 위치와 707 위치에 mRNA 전사의 폴리아데닐화에 관여하는 AATAAA 서열을 가지는 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자.The gene encoding bovine angiogenin according to claim 1, having an AATAAA sequence involved in polyadenylation of mRNA transcription at positions 703 and 707 of the gene encoding bovine angiogenin.

제 1항의 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자와;A gene encoding the bovine angiogenin of claim 1;

상기 보바인 안지오제닌을 암호화하는 유전자를 발현시킬 수 있는 발현벡터가;An expression vector capable of expressing a gene encoding the bovine angiogenin;

결합된 보바인 안지오제닌을 발현하는 재조합 발현벡터.Recombinant expression vector expressing bound bovine angiogenin.

제 5항에 있어서, 상기 발현벡터는 pGEX-2T, pET-11a로 이루어진 군에서 선택되는 보바인 안지오제닌을 발현하는 재조합 발현벡터.The recombinant expression vector of claim 5, wherein the expression vector expresses bovine angiogenin selected from the group consisting of pGEX-2T and pET-11a.

제 6항에 있어서, 상기 발현벡터는 하기의 구조를 가지는 보바인 안지오제닌을 발현하는 pGEX-bAng인 재조합 발현벡터.The recombinant expression vector of claim 6, wherein the expression vector is pGEX-bAng expressing bovine angiogenin having the following structure.