KR100208452B1 - 합텐-표지펩티드 - Google Patents

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베른트 콜프, 미하엘 융
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Abstract

본 발명은, a) 필요하다면 선택적으로 분해될 수 있도록 선택된, 일차 아미노 측쇄 작용기 상의 보호기에 의해 반응성 측쇄 작용기가 블로킹되는 아미노산 유도체로부터 고체상으로 바람직한 아미노산 서열을 가진 펩티드가 합성되고, b) 보호기가, 적어도 하나의 유리 일차 아미노기를 생성하도록 분해되고, c) 합텐-활성 에스테르 유도체가 상기 펩티드의 적어도 하나의 유리 일차 아미노기에 결합되고, d) 바람직하다면, 잔류 보호기가 분해되고, 합텐이, 스테롤, 빌산, 성호르몬, 코르티코이드, 카데놀리드(cardenolides), 카데놀리드-글리코시드, 부타놀리드, 스테로이드-사포게닌 및 스테로이드 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합텐-표지 펩티드의 생성 방법에 관한 것이다.

Description

합텐-표지 펩티드
본 발명은 합텐-표지 펩티드의 제조방법, 이러한 방법에 의해 수득할 수 있는 합텐-표지 펩티드 및 면역학적 검출방법에서의 이러한 펩티드의 용도에 관한 것이다.
체액, 특히 사람 혈청내의 면역 글로블린의 검출은 미생물, 특히 HIV, 간염 바이러스 등과 같은 바이러스에 의한 감염을 진단하는데 사용된다. 검사된 시료내의 특정 면역 글로블린의 존재는 일반적으로, 그 특정 면역 글로블린과 반응하는 하나 또는 수개의 항원과의 반응에 의해 검출된다. 시료액내의 특정 면역 글로블린의 측정방법은 감도가 높고, 확실하며, 간단하고, 신속해야 한다.
최근 몇 년 동안, 검사되는 시료내의 분석물, 예를 들어 특정 항체의 존재가 시각적(예를 들어, 발광 또는 형광), NMR-활성 또는 금속-침전 검출 시스템에 의해 측정될 수 있는, 비방사성 마커기를 기초로 한 검출 시스템이 개발되어 왔다.
EP-A-0 307 149에는, 두개의 재조합 폴리펩티드가 항원으로서 사용되고, 그중 하나가 고체상에 고정화되며, 다른 하나는 마커기를 운반하고, 두 재조합 항원이 시험의 특이성을 증가시키기 위해 다른 유기체에서 발현되는, 항체에 관한 면역학적 시험방법이 개시되어 있다.
EP-A-0 366 673에는, 항체가 정제된 표지 항원 및 고체상-결합 형태의 동일한 정제된 항원과의 반응에 의해 검출되는, 시료내의 항체의 검출방법이 개시되어 있다.
EP-A-0 386 713에는, 다양한 HIV 항원이 두개의 고체 지지물에 고정화되고, 그 각각이 시료의 분취액 및 표지화된 HIV 항원에 접촉되어, 항체의 존재가 적어도 하나의 시험에서의 포지티브 반응에 의해 검출되는, 두개의 고체 지지물을 사용하는 HIV에 대한 항체의 검출방법이 기술되어 있다. 재조합 방법에 의해 제조된 폴리펩티드가 HIV 항원으로서 개시되어 있다.
EP-A-0 507 586에는, 시료가 면역 글로블린에 결합할 수 있는 두개의 항원과 접촉되고, 제1 항원이 고체 지지물에 결합하는데 적합한 기를 함유하며, 제2 항원이 마커기를 함유하는 특정 면역 글로블린에 관한 면역학적 시험을 수행하는 방법이 기술되어 있다. 마커기는 직접적 마커기, 예를 들어 효소, 색소원, 금속 입자, 또는 간접적 마커기, 즉, 항원에 결합되어, 신호-발생기를 운반할 마커기의 수용체와 반응할 수 있는 것일 수 있다. 플루오레세인 유도체가 그러한 간접적 마커기의 예로서 언급되고, 그의 수용체는 계속해서 효소와 결합되는 항체이다. 간염 B 표면 항원과 같은 폴리펩티드가 항원으로서 개시되어 있다. SH기가 플루오레세인을 결합시키기 위해 사용되는 유도화 방법에 의해 이 항원으로 도입된다.
EP-A-0 507 587에는, 시료가 검출되는 항체에 대한 표지화된 항원 및 고체상에 결합할 수 있고 역시 검출되는 항체에 대한 제2 항체와 함께 인큐베이션되는, lgM 항체의 특정 검출방법이 개시되어 있다.
당업계에 공지되어 있는 항체를 검출하는 면역학적 방법에서는, 일반적으로 재조합 DNA 방법에 의해 통상적으로 제조되는 폴리펩티드 항원이 사용된다. 그러나, 그러한 폴리펩티드 항원을 사용할 경우, 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 재조합 폴리펩티드는 종종 단지 융합 폴리펩티드의 형태로 제조되고, 이 경우에 융합된 부분이 시험에서 거짓 포지티브 결과를 유도할 수 있다. 더욱이, 재조합 발현에 의해 제조된 폴리펩티드는 종종 단지 시료 용액에서 매우 낮은 안정성을 갖고, 응집되는 경향이 있다. 추가적 단점은, 때때로 마커기를 그러한 폴리펩티드로 선택적 및 반복적으로 도입시킬 수 없다는 것이다.
더욱이, 재조합 폴리펩티드 항원의 제조는 비용이 많이 들고, 많은 상이한 재조합 폴리펩티드 항원에서 면역반응성의 큰 변화가 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래의 항원의 단점이 적어도 부분적으로 제거된 면역학적 시험용 항원이 간단하고 효율적인 방법으로 제조될 수 있는 방법을 제공하는데 있다. 아울러, 상기 방법은 마커기의 항원으로의 선택적 및 반복적 도입을 가능하게 하여야 한다
이러한 목적은 하기한 바와 같은 합텐-표지 펩티드의 제조방법에 의해 달성된다:
a) 목적하는 아미노산 서열을 가진 펩티드가, 반응성 측쇄기가 보호기에 의해 블로킹된 아미노산 유도체로부터 고체상으로 합성되고, 일차 아미노 측쇄기상의 보호기는 필요하다면 선택적으로 분해될 수 있도록 선택되며,
b) 보호기가 적어도 하나의 유리 일차 아미노기를 형성하도록 분해되고,
c) 합텐-활성 에스테르 유도체가 상기 펩티드의 적어도 하나의 유리 일차 아미노기에 결합되며,
d) 필요하다면, 잔류 보호기가 분해되고,
합텐이 스테롤, 빌산, 성호르몬, 코르티코이드, 카르데놀리드(cardenolide), 카르데놀리드-글리코시드, 부파디에놀리드(bufadienolide), 스테로이드-사포게닌 및 스테로이드 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합텐-표지 펩티드의 제조방법.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 펩티드는 최대길이가 바람직하게는 50개의 아미노산, 특히 바람직하게는 30개의 아미노산이고, 면역학적 검출방법, 특히 특정 면역 글로블린의 측정방법에 매우 적합하다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 펩티드는 거대한 합텐 마커기의 존재에도 불구하고, 면역 글로블린에 대해 높은 친화성 및 특이성을 갖는다는 것이 발견되었다.
본 발명에 따른 방법은 합텐 마커기가 그들의 수 뿐만 아니라 위치에 관하여 선택적으로 도입되도록 한다. 즉, 본 발명에 따른 펩태드 합성에서, 보호기의 선택적 분해 후 합텐과의 반응에 이용될 수 있는 펩티드상의 위치를 특이적으로 선택하는 것은, 사용되는 아미노산 유도체의 일차 아미노기상에 특정 보호기를 사용함으로써 가능하다. 이러한 식으로, 시험의 개선된 반복성 및 감도가 달성된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 장점은, 펩티드 항원의 사용이 lgG, lgM, lgE 및 lgA와 같은 모든 종류의 항체가 인식될 수 있도록 한다는 것이다. 또한 상기 시험은 응집 경향이 없는 한정된 작고 안정한 항원을 사용함으로써 간섭을 덜 받는다.
본 발명에 따른 방법에 의해 펩티드에 결합되는 합텐은, 스테롤, 빌산, 성호르몬, 코르티코이드, 카르데놀리드, 카르데놀리드-글리코시드, 부파디에놀리드, 스테로이드-사포게닌 및 스테로이드 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 스테로이드 골격을 함유하는 분자이다. 이러한 합텐은 특정 수용체, 예를 들어 합텐에 대한 항체 또는 항체 단편에 결합할 수 있다. 상기 합텐은 특히 바람직하게 카르데놀리드 및 카르데놀리드-글리코시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 종류의 물질의 대표적 예는 디곡시제닌(digoxigenin) 디지톡시제닌(digitoxigenin), 지톡시제닌(gitoxigenin), 스트로판티딘(strophanthidin), 디곡신(digoxin), 디지톡신(digitoxin), 디톡신(ditoxin) 및 스트로판틴(strophanthin)이고, 디곡시제닌 및 디곡신이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에서, 합텐-활성 에스테르 유도체는 펩티드의 유리 일차 아미노 측쇄기 및/또는 아미노 말단에 결합된다. 본원에서 활성 에스테르(active ester)란 용어는 펩티드의 다른 반응성기와의 부반응에 의한 간섭이 일어날 수 없는 조건에서, 펩티드의 유리 아미노기와 반응할 수 있는 활성화된 에스테르기를 포함한다. N-히드록시숙신이미드 에스테르가 활성 에스테르 유도체로서 바람직하게 사용된다. 적합한 합텐-활성 에스테르 유도체의 예는, 디곡신-4'-헤미글루타레이트-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 디곡시제닌-3-카르복시메틸 에테르-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 디곡시제닌-3-O-메틸카르보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 디곡시제닌-3-헤미숙시네이트-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 디지톡신-4'-헤미글루타레이트-N-히드록시숙신이미드 에스테르 및 디지톡시제닌-3-헤미숙시네이트-N-히드록시숙신이미드 에스테르이다. 이러한 합텐 유도체는 뵈링거만하임 컴퍼니 게엠베하(Boehringer Mannheim Company GmbH; Mannheim, GER)로부터 상업적으로 입수가능하다. N-히드록시숙신이미드 에스테르외에, 유사한 p-니트로메틸, 펜타플루오로페닐, 이미다졸릴 또는 N-히드록시벤조트리아졸릴 에스테르를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 따른 방법에서, 목적하는 아미노산 서열을 가진 펩티드는 바람직하게는 상업적 펩티드 합성기(예를 들어, Applied Biosystems로부터의 기계 A 431 또는 A 433)를 사용하여 고체상에서 합성된다. 이러한 합성은 아미노산 유도체를 사용하여 바람직하게는 펩티드의 카르복실 말단에서 출발하는 공지된 방법에 따라 수행된다. 바람직하게는, 결합에 필요한 아미노 말단기가 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 잔기로 유도된 아미노산 유도체가 사용된다. 사용되는 아미노산의 반응성 측쇄기는 펩티드 합성의 완료 후 쉽게 분해될 수 있는 보호기를 함유한다. 이것의 바람직한 예는 트리페닐메틸(Trt), t-부틸 에테르(tBu), t-부틸 에스테르(0 tBu), 3차-부톡시카르보닐(Boc) 또는 2,2,5,7,8-펜타-메틸크로만-6-술포닐(Pmc)와 같은 보호기이다. 나중에 합텐으로 유도될 펩티드의 위치에 위치한 리신 잔기 또는 일차 아미노 측쇄기를 함유하는 다른 아미노산 유도체의 아미노 측쇄에는, 특정 반응 조건, 예를 들어 산의 존재하에 정량적으로 분해될 수 있도록 선택된 제1 아미노 보호기가 제공된다. 적합한 산-불안정 보호기의 예는 Boc이다. 합텐의 어떠한 결합도 목적하지 않은 리신 잔기 또는 일차 아미노 측쇄기를 가진 다른 아미노산 잔기의 측쇄기에는, 제1 보호기가 분해될 수 있는 조건에서 그 자체는 분해되지 않도록 선택된 제2 아미노-보호기가 제공된다. 또한, 제2 보호기는 펩티드가 고체상으로부터 분해되고, 모든 다른 보호기가 분해되는 조건에서 안정한 것이 바람직하다. 그러한 제2 보호기의 예는 페닐아세틸과 같은 내산성 보호기이다. 20개의 천연 아미노산 이외에, 펩티드는 또한, β-알라닌, γ-아미노-부티르산, ε-아미노-카프로산, 노르루신 또는 오르니틴과 같은 합성 아미노산도 함유할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 천연 아미노산과 유사하게 보호된 형태로 합성에 사용된다.
합성의 완료 후, 합텐의 결합이 일어나는 위치에 있는 제1 아미노-보호기를 포함한 보호기는, 임의적으로 고체상으로부터 펩티드를 방출시킨 후 분해된다. 그 후에, 이러한 방법으로 수득된 생성물은 바람직하게는 HPLC에 의해 정제된다. 이어서, 합텐, 표지가 펩티드를 유리 일차 아미노기, 즉 펩티드의 아미노 말단기 및/또는 아미노 측쇄기와 반응하는, 목적하는 합텐-활성 에스테르 유도체와 반응시킴으로써 도입된다. 바람직하게는, 유리 일차 아미노기 당 1.5 내지 2.5 당량의 활성 에스테르가 사용된다. 그 후에, 반응 생성물은 바람직하게는 HPLC에 의해 정제된다.
펩티드가 여전히 페닐아세틸과 같은 제2 보호기로 유도된 아미노기를 함유할 경우, 이러한 보호기는 마지막 단계에서 제거된다. 페닐아세틸 보호기는 예를 들어, 유기 용매를 함유하는 수용액에서 고정화되거나 가용성인 페니실린 G 아미다제로 상온에서 효소에 의해 제거될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 펩티드가 분자내 이황화물 다리를 함유한 경우, 펩티드 서열은 합성 완료 후, 그러나 마지막 아미노산의 N-말단 Fmoc-보호기의 분해 전에, 예를 들어 헥사플루오로이소프로판올/디클로로메탄에서 요오드로 고체상에서 산화된 다음(Kamber and Hiskey in Gross E. and Meienhofer J., The Peptides, Academic Press, New York, 1981, pages 145 to 147), N-말단 Fmoc-보호기가 분해된다.
바람직하게는, 면역반응성 에피토프 영역, 즉 항체-결합 펩티드 서열 및 스페이서(spacer) 영역을 포함하는 펩티드가 합성된다.
이러한 경우에, 바람직하게는 적어도 하나의 합텐 표지가 스페이서 영역에 결합된다. 표지가 스페이서 영역에 위치한 펩티드는 종종 면역학적 시험에서 더 좋은 감도를 가진다.
바람직하게는 길이가 1개 내지 10개의 아미노산인 스페이서 영역은, 바람직하게 전하를 함유하거나/함유하고 수소 다리를 형성할 수 있기 때문에, 안정화 및 용해 효과를 갖는다. 더욱이 그것은 입체적으로 수개의 고분자 수용체와 합텐-표지 펩티드의 결합을 용이하게 할 수 있다. 스페이서 영역의 아미노산은 바람직하게는, 글리신, β-알라닌, γ-아미노부티르산, ε-아미노카프로산, 리신 및 구조식 NH2-[(CH2)nO]X-CH2-CH2-COOH(여기서, n은 2 또는 3이고, x는 1 내지 10이다)의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 스페이서 영역은 바람직하게는 적어도 수개의 합성 아미노산 유도체를 함유한다. 스페이서 영역은 바람직하게는 펩티드의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에 위치한다.
병원체, 예를 들어 박테리아, 바이러스 및 원생동물 또는 자기면역 항원으로부터의 에피토프 영역을 함유하는 펩티드가 바람직하게 본 발명에 따른 방법에 의해 합성된다. 면역반응성 에피토프 영역은 바람직하게는 바이러스성 항원, 예를 들어 HIV I, HIV II, HIV 특수형 O 또는 간염 C 바이러스(HCV)로부터 유도된다.
바람직하게는 HIV I, HIV II, 또는 HIV 특수형 O 에피토프는 영역 gp32, gp41 및 gp120으로부터 선택된다. HCV 에피토프는 바람직하게는 비-구조 단백질 영역 NS3, NS4 또는 NS5의 Core/Env 영역으로부터 선택된다.
HIV I, HIV II, 또는 HIV 특수형 O 아미노산 서열의 에피토프 영역은 특히 바람직하게는, 하기의 아미노산 서열 또는 길이가 적어도 6개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개의 아미노산인 그것의 부분 서열로부터 선택된다.:
및
아미노산 서열 (I) 내지 (III)은 HIV I의 gp120 영역으로부터 유도되고, 아미노산 서열 (IV) 내지 (IX)는 HIV I의 gp41 영역으로부터 유도되며, 아미노산 서열 (X)는 HIV II의 gp32 영역으로부터 유도된다. 아미노산 서열 (I) 내지 (X)는 또한 서열표의 서열번호 1 내지 서열번호 10에 개시되어 있다. 서열 (V), (VIII) 및 (X)은 각각 바람직하게 이황화물 다리의 형태로 존재하는 두개의 시스테인을 함유한다. 이러한 서열은 바람직하게는, 합텐 표지, 바람직하게는 디곡시제닌 또는 디곡신 표지, 특히 바람직하게는 디곡시제닌-3-카르복시-메틸 에테르 표지를 가지는, 상기에서 규정된 N-말단 및/또는 C-말단 스페이서를 함유한다. 에피토프 영역내에 위치한 리신 잔기도 임의적으로 표지화된 형태로 존재할 수 있다.
HCV 아미노산 서열의 에피토프 영역은 바람직하게는 하기의 아미노산 서열 또는 길이가 적어도 6개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개의 아미노산인 그것의 부분 서열로부터 선택된다:
및
아미노산 서열 (XI)은 HCV의 NS5 영역으로부터, 서열 (XII) 및 (XVI)는 Core 영역으로부터, 서열 (XIII), (XIV) 및 (XV)는 NS4 영역으로부터, 서열 (XVII)은 NS3 영역으로부터 유도된다. 아미노산 서열 (XI) 내지 (XVII)은 서열표의 서열번호 11 내지 서열번호 17에 개시되어 있다. 상기 언급된 에피토프를 함유하는 펩티드는 바람직하게는, 합텐 표지를 가지는 추가의 스페이서 영역을 함유한다.
본 발명의 또 다른 주제는 최대 길이가 50개, 바람직하게는 30개의 아미노산이고, 아미노 말단 및/또는 아미노 측쇄기가 적어도 하나의 합텐-활성 에스테르 유도체와 결합된 합텐-표지 펩티드이다. 상기 합텐은 바람직하게는 디곡시제닌 또는 디곡신이고, 상기 활성 에스테르는 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다.
본 발명에 따른 펩티드는 바람직하게, 예를 들어 사람 혈청으로부터의 항체와 반응할 수 있는 면역반응성 에피토프 영역 및 적어도 하나의 합텐 표지를 가지는 면역비반응성 스페이서 영역을 포함한다. 이러한 스페이서 영역은 바람직하게 펩티드의 아미노 말단에 위치하고, 길이가 1 내지 10개의 아미노산이다. 에피토프 영역은 바람직하게, HIV I, HIV II 또는 HCV의 아미노산 서열 또는 변형체, 예를 들어 그들의 특수형, 예를 들어 HIV 특수형 O로부터 유도되고, 아미노산 서열 (I) 내지 (XⅦ) 또는 그의 부분 서열중의 하나이다.
또한, 본 발명은 시료액내 특정 항체의 측정을 위한 면역학적 방법에서 항원으로서의 합텐-표지 펩티드의 용도에 관한 것이다. 박테리아, 바이러스 또는 원생동물과 같은 미생물에 의한 감염을 표시하는 그러한 항체가 바람직하게 측정된다. 바이러스에 대한 항체, 예를 들어 HIV 또는 간염 바이러스에 대한 항체가 특히 바람직하게 측정된다. 시료액은 바람직하게 혈청, 특히 바람직하게는 사람 혈청이다. 아울러, 본 발명에 따른 합텐-표지 펩티드는 다리 시험 형식의 면역학적 방법에서 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 시료액이 (a) 상기에서 규정된 합텐-표지 펩티드를 포함하는, 측정되는 항체에 대한 표지화된 제1 항원 및 (b) 신호-발생기를 함유하는 합텐의 수용체와 함께 인큐베이션되고, 항체가 펩티드와의 결합에 의해 검출됨을 특징으로 하는, 시료액내 특정 항체의 면역학적 측정방법에 관한 것이다. 디곡신 또는 디곡시제닌으로 표지화된 펩티드가 바람직하게 제1 항원으로 사용되고, 디곡시제닌 및/또는 디곡신에 대한 항체가 바람직하게 수용체로서 사용된다. 이와 관련하여, 항체란 용어는 또한 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2단편 또는 다른 항체 단편, 예를 들어 유전공학에 의해 변형된 것도 포함하는 의미이다. 수용체는 신호-발생기, 바람직하게는 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락톡시다제, 우레아제 또는 Q-β-레플리카제와 같은 효소에 결합된다. 그러나, 신호-발생기는 또한 색소성, 방사성 또는 NMR-활성기 또는 금속 입자(예를 들어, 금)일 수도 있다. 신호-발생기는 바람직하게는 효소이다.
본 발명에 따른 면역학적 측정방법은 실제로 공지된 시험 형식에 따라, 예를 들어 단일 반응상에서의 균일 면역분석법 또는 하나 초과의 반응상에서의 불균일 면역분석법으로 수행될 수 있다. 항체의 존재가 고체상의 존재하에서 검출되는 불균일 시험 형식이 바람직하게 사용된다. 이러한 시험형식의 한 구체예는 이른바 이중 항원 다리 시험 고안(double antigen bridge test design)이다. 이 경우에, 시료액은 제1 항원 및 (a) 고체상에 결합되거나 (b) 고체상에 결합될 수 있는 형태로 존재하는, 측정되는 항체에 대한 제2 항원과 함께 고체상의 존재하에서 인큐베이션된다. 시료액내의 측정될 항체는 고체상 및/또는 액체상의 표지를 측정함으로써 검출된다. 제2 항원은 바람직하게 비오틴으로 표지화되고, 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상에 결합할 수 있다. 비오틴으로 표지화된 펩티드는 바람직하게 제2 항원으로서 사용된다.
시험 공정은 바람직하게, 시료액을 고체상에서 제1 항원 및 제2 항원과 혼합하여, 제1 항원, 항체 및 고체상-결합 제2 항원의 표지화되고 고정화된 복합체를 수득하는 것으로 이루어진다. 항체를 검출하기 위한 다른 시험 형식과 비교하여, 다리 시험 형식은 감도가 개선된다. 즉, lgG, lgM, lgA 및 lgE와 같은 모든 종류의 면역 글로블린이 특이적으로 인식된다. 즉, 비특이적 반응성이 감소된다. 제1 단계에서 시료액이 제1 및 제2 항원과 혼합되고, 그 후 신호-발생기를 함유한 제1 항원의 합텐 표지의 수용체가 첨가되는 2단계 시험 공정이 사용될 경우, 이중 항원 다리 시험의 특이성 및 감도는 더욱 향상될 수 있다.
고체상-결합 및 합텐-표지 펩티드가 항원으로서 사용되는 이중 항원 다리 시험 형식의 또 다른 장점은, 훅(Hook) 효과의 결과로서, 즉 펩티드당 마커기의 수를 바람직하게는 2 내지 10개의 마커기로 증가시킴으로써, 측정되는 항체의 높은 역가를 가진 시료의 거짓 네거티브 평가의 위험을 감소시킬 수 있다는 것이다. 펩티드 당 합텐 마커기의 수를 증가시킴으로써, 직접 검출가능한 마커기를 사용하는 시험 공정과 비교하여 수용체에 의한 신호 증폭의 결과로서 훅 감도가 향상된다.
본 발명의 또 다른 주제는 측정되는 항체와 반응하는 본 발명에 따른 합텐-표지 펩티드를 적어도 하나 함유하는, 특정 항체의 면역학적 측정용 시약이다. 상기 시약이 이중 항원 다리 시험에 사용될 경우, 그것은 바람직하게, (a) 합텐-표지 펩티드, (b) 신호-발생기를 함유하는 합텐 수용체, 및 (c) 고체상에 결합되거나 고체상에 결합될 수 있는 형태로 존재하는, 측정될 항체와 반응하는 또 다른 항원을 함유한다. 합텐은 바람직하게 카르데놀리드 또는 카르데놀리드-글리코시드, 특히 디곡신 또는 디곡시제닌이고, 합텐의 수용체는 바람직하게 합텐에 대한 항체이며, 신호-발생기는 바람직하게 효소이고, 다른 항원은 바람직하게 비오틴화되고 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상에 결합될 수 있다.
본 발명을 하기 실시예 및 서열표에 의해 보다 구체적으로 설명한다.
서열번호 1은 HIV I의 gp120 영역으로부터의 에피토프의 아미노산 서열이고;
서열번호 2는 HIV I의 gp120 영역으로부터의 다른 에피토프의 아미노산 서열이며;
서열번호 3은 HIV I, 특수형 O의 gp120 영역으로부터의 에피토프의 아미노산 서열이고; 서열번호 4는 HIV I의 gp41 영역으로부터의 에피토프의 아미노산 서열이며;
서열번호 5는 HIV I의 gp41 영역으로부터의 다른 에피토프의 아미노산 서열이고;
서열번호 6는 HIV I의 gp41 영역으로부터의 또 다른 에피토프의 아미노산 서열이며;
서열번호 7은 HIV I, 특수형 O의 gp41 영역으로부터의 에피토프의 아미노산 서열이고;
서열번호 8은 HIV I, 특수형 O의 gp41 영역으로부터의 다른 에피토프의 아미노산 서열이며;
서열번호 9는 HIV I, 특수형 O의 gp41 영역으로부터의 또 다른 에피토프의 아미노산 서열이며;
서열번호 10은 HIV II의 gp32 영역으로부터의 에피토프의 아미노산 서열이며;
서열번호 11은 HCV의 NS5 영역으로부터의 에피토프의 아미노산 서열이고;
서열번호 12는 HCV의 Core 영역으로부터의 에피토프의 아미노산 서열이고;
서열번호 13은 HCV의 NS4 영역으로부터의 에피토프의 아미노산 서열이고;
서열번호 14는 HCV의 NS4 영역으로부터의 다른 에피토프의 아미노산 서열이며;
서열번호 15는 HCV의 NS4 영역으로부터의 또 다른 에피토프의 아미노산 서열이고;
서열번호 16은 HCV의 Core 영역으로부터의 다른 에피토프의 아미노산 서열이며;
서열번호 17은 HCV의 NS3 영역으로부터의 에피토프의 아미노산 서열이다.
[합텐-표지 펩티드의 제조]
합텐-표지 펩티드를 회분식 펩티드 합성기(예를 들어, Applied Biosystems A431 또는 A433)에서 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 고체상 펩티드 합성법에 의해 합성하였다. 표 1의 아미노산 유도체를 각각 4.0당량씩 사용하였다:
리신 유도체 K1은 합텐 표지를 도입시키지 않을 위치를 위해 사용하였다. 리신 유도체 K2는 합텐 표지를 도입시킬 위치를 위해 사용하였다. 리신 유도체 K3는 펩티드의 스페이서 영역과 ε-아미노기를 결합시키기 위해 사용하였다.
아미노산 또는 아미노산 유도체를 N-메틸피롤리돈에 용해시켰다. 펩티드를 400 내지 500㎎의 4-(2'4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시 수지(Tetrahedron Letters 28 (1987), 2107)에서 0.4 내지 0.7㎜ol/g(JACS 95 (1973), 1328)의 로딩으로 합성하였다. 결합 반응은 Fmoc-아미노산 유도체에 대해 4 당량의 디시클로헥실카르보디이미드 및 4 당량의 N-히드록시벤조트리아졸과 함께 반응 매질로서 디메틸포름아미드중에서 20분 동안 수행하였다. 디메틸프롬아미드중의 20% 피페리딘을 사용하여 각 합성 단계 후 20분내에 Fmoc기를 분해시켰다.
시스테인 잔기가 펩티드 서열내에 존재할 경우에는, 헥사플루오로이소프로판올/디클로로메탄중의 요오드를 사용하여, 합성의 완료 후 즉시 고체상에서 산화를 수행한다.
합성 수지로부터 펩티드의 방출 및 산-불안정 보호기 (페닐아세틸 보호기 제외)의 분해는 20㎖의 트리플루오로 아세트산, 0.5㎖의 에탄디티올, 1㎖의 티오아니졸, 1.5g의 페놀 및 1㎖의 물로 상온에서 40분 동안 달성하였다. 그 후, 반응 용액을 300㎖의 냉각된 디이소프로필 에테르와 혼합시키고, 펩티드를 완전히 침전시키기 위해 40분 동안 0℃에서 유지시켰다. 상기 침전물을 여과시키고 디이소프로필 에테르로 다시 세척한 다음, 소량의 50% 아세트산에 용해시키고 동결건조시켰다. 수득한 원료를 정제 HPLC(delta-PAK RP C18칼럼)로 적절한 구배(용리액 A: 물, 0.1% 트리플루오로아세트산, 용리액 B: 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산)를 사용하여 약 120분 동안 정제하였다. 용리된 물질은 이온 분무 질량 분광법에 의해 동정하였다.
합텐 표지, 예를 들어 디곡시제닌 또는 디곡신 표지를 적합한 활성 에스테르 유도체 및 펩티드의 유리 아미노기를 사용하여 용액내에서 도입시켰다. 유도될 펩티디를 PH 8.5의 0.1 M 인산칼륨 완충액 및 DMSO의 혼합물 중에 용해시켰다. 그 후, 동량의 DMSO 중에 용해된 유리 일차 아미노기 당 2 당량의 활성 에스테르를 적가하고, 상온에서 교반시켰다. 분석 HPLC에 의해 반응을 모니터하였다. 정제 HPLC에 의해 생성물을 정제하였다.
펩티드가 여전히 페닐아세틸로 보호된 리실을 함유할 경우, 이 보호기는 일정량의 유기 용매를 함유하는 수성 매질 중에서 페니실린 G 아미다제를 사용하여, 최종 단계로 상온에서 효소 분해하였다. 효소를 예를 들어, 여과에 의해 분리시키고, 펩티드를 정제 HPLC에 의해 정제하였다. 용리된 물질은 이온 분무 질량 분광법에 의해 동정하였다.
HIV I 및 HIV II의 영역 gp120, gp41 및 gp32로부터 유도된 표 2의 펩티드 화합물은 디곡시제닌-3-카르복시메틸 에테르-N-히드록시숙신이미드 에스테르(Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, GER)를 사용하여 제조하였다.
하기 표 3의 펩티드는 HCV의 NS5 영역, NS4 영역 및 Core 영역으로부터 합성하였다.
비오틴-표지 펩티드는 수지 상에서 유도에 의해 N-말단적으로 합성하거나(비오틴 활성 에스테르), 비오틴-ε-유도 리신 잔기(Fmoc-Lys(biotin)-OH)를 사용하여 서열내에 합성하였다.
[실시예 2]
[바람직한 시험 공정에 의한 특이성 및 감도의 개선]
본 발명에 따른 펩티드를 사용하는 이중 항원 다리 시험의 특이성 및 감도는 또한, 시료, 합텐-표지 항원 및 고체상 항원이 제1 단계에서 혼합된 다음, 바람직하게는 1 내지 4시간 후, 특히 바람직하게는 1.5 내지 2.5 시간후에 항-합텐 항체를 첨가하는 시험 공정에 의해 개선될 수 있다.
HIV 에피토프 gp41/1 및 gp41/2 (표 2)를 항원으로서 사용하였다.
바람직한 2단계 시험용 시험 조건은 하기와 같다 :
- 50㎜ol/l 중성 인산칼륨 완충액, pH 7.2, 0.2% 우혈청 알부민 (BSA), 0.2% 나트륨 라우릴술레이트 (SLS) 세정제
- 인큐베이션 시간
- 합텐-표지 및 고체상 항원의 혈청과의 인큐베이션 : 120분
- 항디곡시제닌 항체 및 퍼옥시다제의 접합체(＜Dig＞-POD)와의 인큐베이션 : 60분
- 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤질티아졸린-술포네이트(6)] (ABTS)와의 인큐베이션 : 60분
- 인큐베이션 온도 : 25℃
- 모든 인큐베이션 단계 사이에 결합/유리 분리
다른 2단계 시험용 시험 조건은 하기와 같다 :
- 50㎜ol/l 중성 인산칼륨 완충액, pH 7.2, 0.2% SLS 세정제
- 인큐베이션 시간
- 고체상 항원의 혈청과의 인큐베이션 : 90분
- 합텐-표지 항원 및 ＜Dig＞-POD와의 인큐베이션 : 90분
- ABTS와의 인큐베이션 : 60분
- 인큐베이션 온도 : 25℃
- 모든 인큐베이션 단계 사이에 결합/유리 분리
1단계 시험용 시험 조건은 하기와 같다 :
- 50㎜ol/l 중성 인산칼륨 완충액, pH 7.2, 0.2% BSA, 0.2% SLS 세정제
- 인큐베이션 시간
- 두 항원의 혈청 및 ＜Dig＞-POD와의 인큐베이션 : 120분
- ABTS와의 인큐베이션 : 60분
- 인큐베이션 온도 : 25℃
- 모든 인큐베이션 단계 사이에 결합/유리 분리
시험 결과는 표 4에 제시되어 있다. 더 큰 신호 차이, 즉 포지티브 시료 대 네거티브 시료의 측정된 신호의 비가 바람직한 시험 공정에서 달성된다.
[실시예 3]
본 발명에 따른 펩티드 항원을 이중 항원 다리 시험에서 재조합 폴리펩티드 항원과 비교하였다. 본 발명에 따른 실시예에서, 디곡시젠화된 펩티드 항원 gp41/2(표 2)를 동일한 서열의 비오틴화된 펩티드 항원과 함께 시험하였다. 비교 실시예에서, 디곡시젠화된 폴리펩티드 항원 rec. gp41 (Chang et al., Science 228 (1985), 93-96)을 동일한 서열의 비오틴화된 폴리펩티드와 함께 시험하였다.
시험 결과는 표 5에 제시되어 있다. NC는 네거티브 대조를, PC는 포지티브 대조를 나타낸다. 경계(cut-off) 인덱스는 실험의 포지티브 및 네거티브 평가 사이의 경계이다. 이것은 2 × NC로서 정의된다. 재조합 폴리펩티드 항원으로는 네거티브 및 포지티브 시료 사이의 차이가 거의 없는 반면에, 펩티드 항원은 매우 우수한 차이를 가능하게 함이 표 5로부터 명백하다.

Claims (34)

  1. (a) 일차 아미노 측쇄기 상의 보호기가 필요하다면, 선택적으로 분해될 수 있도록 선택되는 보호기에 의해 반응성 측쇄기가 블로킹된 아미노산 유도체로부터 고체상으로 목적하는 아미노산 서열을 가진 펩티드를 합성하는 단계; (b) 보호기를 분해하여 하나 이상의 유리 일차 아미노기를 형성시키는 단계; (c) 합텐-활성 에스테르 유도체를 상기 펩티드의 하나 이상의 유리 일차 아미노기와 결합시키는 단계; 및 (d) 필요하다면, 잔류 보호기를 분해시키는 단계를 포함하고, 합텐이 스테롤, 빌산, 성호르몬, 코르티코이드(corticoid), 카르데놀리드(cardenolide), 카르데놀리드-글리코시드, 부파디에놀리드(bufadienolide), 스테로이드-사포게닌 및 스테로이드 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 합텐-표지 펩티드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 합텐이 카르데놀리드 및 카르데놀리드-글리코시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 합텐이 디곡시제닌(digoxigenin), 디지톡시제닌(digitoxigenin), 지톡시제닌(gitoxigenin), 스트로판티딘(strophanthidin), 디곡신(digoxin), 디지톡신(digitoxin), 디톡신(ditoxin) 및 스트로판틴(strophanthin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 디곡시제닌 또는 디곡신이 합텐으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 특정 반응 조건하에서 정량적으로 분해될 수 있는 아미노 측쇄의 제1 보호기를 가지는 아미노산 유도체가 합텐이 결합될 펩티드의 위치에 사용되고, 제1 보호기가 분해되는 반응 조건하에서 분해될 수 없는 아미노 측쇄의 제2 보호기를 가지는 아미노산 유도체가 어떠한 합텐도 결합되지 않을 위치에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 산-불안정 제1 보호기 및 산-안정 제2 보호기가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, N-히드록시숙신이미드 에스테르가 활성 에스테르 유도체로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역반응성 에피토프 영역 및 스페이서 영역을 포함하고, 하나 이상의 합텐 표지가 스페이서 영역에 결합된 펩티드가 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 스페이서 영역의 길이가 1 내지 10개의 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 스페이서 영역이 펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 아미노 말단 및 카르복시 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 스페이서 영역이 전하를 가지거나, 수소 다리를 형성할 수 있거나, 전하를 가지고 수소 다리를 형성할 수 있는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 스페이서 영역의 아미노산이 글리신, β-알라닌, γ-아미노부티르산, ε-아미노카프로산, 리신 및 구조식 NH2-[(CH2)nO]X-CH2-CH2-COOH(여기서, n은 2 또는 3이고, x는 1 내지 10이다)를 갖는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, HIV I, HIV II 또는 HCV의 아미노산 서열로부터의 에피토프 영역을 함유하는 펩티드가 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 에피토프 영역이 하기와 같은 HIV I 또는 HIV II 아미노산 서열 또는 길이가 6개 이상의 아미노산인 그것의 부분 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
  15. 제13항에 있어서, 에피토프 영역이 하기와 같은 HCV 아미노산 서열 또는 길이가 6개 이상의 아미노산인 그것의 부분 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
  16. 길이가 50개 이하의 아미노산이고, 아미노 말단, 아미노 측쇄기 또는 아미노 말단 및 아미노 측쇄기를 통해 하나 이상의 합텐-활성 에스테르 유도체와 결합되고, 합텐이 스테롤, 빌산, 코르티코이드, 카르데놀리드, 카르데놀리드-글리코시드, 부파디에놀리드, 스테로이드-사포게닌 및 스테로이드 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 합텐-표지 펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 합텐이 디곡시제닌 또는 디곡신인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 펩티드가 면역반응성 에피토프 영역 및 스페이서 여역을 포함하고, 스페이서 영역이 하나 이상의 합텐 표지를 함유하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 스페이서 영역이 펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 아미노 말단 및 카르복시 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 에피토프 영역이 HIV I, HIV II 또는 HCV의 아미노산 서열로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 에피토프 여역이 하기와 같은 HIV I 또는 HIV II 아미노산 서열 또는 길이가 6개 이상의 아미노산인 그것의 부분 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드:
  22. 제20항에 있어서, 에피토프 영역이 하기와 같은 HCV 아미노산 서열 또는 길이가 6개 이상의 아미노산인 그것의 부분 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드:
  23. 제1항에 따른 방법에 의해 제조된 합텐-표지 펩티드를 항원으로서 사용하는 것을 특징으로 하는, 시료액내 특정 항체의 면역학적 측정방법.
  24. 제23항에 있어서, 시료액이 (a) 제1항에 따른 방법에 의해 제조된 합텐-표지 펩티드를 포함하는 측정되는 항체에 대한 표지화된 제1 항원 및 (b) 신호-발생기를 함유하는 합텐의 수용체와 함께 인큐베이션되고, 항체가 펩티드에 결합함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 디곡신 또는 디곡시제닌으로 표지화된 펩티드가 제1 항원으로서 사용되고, 디곡시제닌, 디곡신, 또는 디곡신 및 디곡시제닌에 대한 항체가 수용체로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 시료액이 고체상의 존재하에서 제1 항원 및 (a) 고체상에 결합되거나 (b) 고체상에 결합될 수 있는 형태로 존재하는 측정되는 항체에 대한 제2 항원과 함께 인큐베이션되고, 측정되는 항체가 고체상, 액체상, 또는 고체상 및 액체상에서 표지를 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 비오틴으로 표지화된 항원이 제2항원으로서 사용되고, 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 비오틴으로 표지화된 펩티드가 제2 항원으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제26항에 있어서, 시료액이 제1 및 제2 항원과 혼합된 다음, 제1 항원의 합텐이 수용체가 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항에 따른 방법에 의해 제조되고 측정되는 항체와 반응하는 하나 이상의 합텐-표지 펩티드를 함유하는 체외(extracorporeal) 시료내 특정 항체의 면역학적 측정용 시약.
  31. 제30항에 있어서, (a) 측정되는 항체와 반응하는 합텐-표지 펩티드; (b) 신호-발생기를 함유하는 합텐의 수용체; 및 (c) 고체상에 결합되거나 고체상에 결합될 수 있는 형태로 존재하고 측정되는 항체와 반응하는 다른 항원을 함유하는 것을 특징으로 하는 시약.
  32. 제16항에 따른 합텐-표지 펩티드를 항원으로서 사용하는 것을 특징으로 하는, 시료액내 특정 항체의 면역학적 측정방법.
  33. 제32항에 있어서, 시료액이 (a) 제16항에 따른 합텐-표지 펩티드를 포함하는 측정되는 항체에 대한 표지화된 제1 항원 및 (b) 신호-발생기를 함유하는 합텐의 수용체와 함께 인큐베이션되고, 항체가 펩티드에 결합함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 측정되는 항체와 반응하는 제16항에 따른 하나 이상의 합텐-표지 펩티드를 함유하는 체외 시료내 특정 항체의 면역학적 측정용 시약.
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