KR100207951B1 - High expression recombinant vector of e. coli and preparing method of human granulocyte colony stimulating factor - Google Patents
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Abstract
하기식(Ⅰ)의 염기서열을 포함하는 인 과립구 콜로니 자극인자의 유전자.A gene of phosphorus granulocyte colony stimulating factor comprising the nucleotide sequence of the following formula (I).
(상기식에서, W는 상기한 인 과립구 콜로니 자극인자의 유전자의 프로모터 및 샤인-달가노 부위를 포함하는 업스트림 DNA 염기서열을 나타내는 것으로서, 샤인달가노 부위는 샤인-달가노 부위와 개시코돈 사이에 하기식 (e) 내지 (g)로 이루어진 군에서 선택된 염기 서열을 포함하는 7 내지 11 bp의 DNA 염기 서열이고,(Wherein, W represents an upstream DNA sequence including the promoter and shine-dalgano region of the gene of the phosphorus granulocyte colony stimulator as described above, wherein the shinedalgano region is defined between the shine-dalgano region and the initiation codon. A DNA base sequence of 7 to 11 bp comprising a base sequence selected from the group consisting of formulas (e) to (g),
프로모터 부위는 trp 프로모터이며; X는 하기식 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택된 상기한 인 과립구 콜로니 자극인자의 유전자의 5' 말단 DNA 염기서열을 나타내며;The promoter region is a trp promoter; X represents the 5 'terminal DNA sequence of the gene of the above-mentioned phosphorus granulocyte colony stimulator selected from the group consisting of the following formulas (a) to (d);
Y는 상기한 인 과립구 콜로니 자극인자 유전자의 11 내지 174 아미노산 서열에 해당하는 DNA 염기서열을 나타내며; Z는 상기한 인 과립구 콜로니 자극인자 유전자의 종료코돈이하의 전사터미네이터를 포함하는 DNA 염기서열로서, 테트라싸이클린 내성유전자의 전사터니네이터, 박테리오 파지 fd의 전사터미네이터, 스타필로코커스 단백질 A의 전사터미네이터, rrnB 오페론의 전사터미네이터로 이루어진 군에서 선택된다.)를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질 전환 시키면 숙주 세포내에서 매우 안정되게 hG-CSF를 과발현할 수 있다.Y represents a DNA sequence corresponding to the 11 to 174 amino acid sequence of the above phosphorus granulocyte colony stimulator gene; Z is a DNA sequence containing a transcription terminator below the end codon of the phosphorus granulocyte colony stimulator gene, which is a transcription terminator of a tetracycline resistance gene, a transcription terminator of bacteriophage fd, a transcription terminator of Staphylococcus protein A, transforming the host cell using a recombinant vector comprising a rrnB operon transcription terminator) can overexpress hG-CSF in the host cell.
Description
제1도는 hG-CSF 합성유전자의 염기서열 및 5' 말단 변형체의 코돈사용을 나타내는 그림.1 is a diagram showing the nucleotide sequence of the hG-CSF synthetic gene and the codon use of the 5 'terminal variant.
제2도는 발현벡터 pDA123의 제한효소 지도.2 is a restriction map of the expression vector pDA123.
제3도는 발현벡터 pCSF430, pCSF440, pCSF450, pCSF460, pCSF470의 제작도.Figure 3 is a production diagram of the expression vectors pCSF430, pCSF440, pCSF450, pCSF460, pCSF470.
제4도는 발현벡터 pCSF450R의 제작도.Figure 4 is a diagram of the expression vector pCSF450R.
제5도는 발현벡터 pCSF451, pCSF452, pCSF453의 제작도.Figure 5 shows the preparation of the expression vectors pCSF451, pCSF452, pCSF453.
제6도는 W3110/pCSF451 생산균주의 발효공정중의 성장곡선을 나타내는 그림.6 is a graph showing the growth curve of the fermentation process of W3110 / pCSF451 production strain.
제7도는 W3110/pCSF451의 유도시간에 따른 hG-CSF의 발현율 증가를 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)으로 나타낸 것이다.Figure 7 shows the increase in the expression rate of hG-CSF with the induction time of W3110 / pCSF451 by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
[산업상 이용분야][Industrial use]
본 발명은 대장균의 과발현 재조합 벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대장균 발현계(E.coli 발현 시스템)에 적합하게 화학합성된 인 과립구 콜로니 자극인자(human granulocyte-colony stimulating factor : 이하 hG-CSF라 한다.)의 유전자를 이용한 과발현벡터 및 그를 이용하여 대장균내에서 hG-CSF를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an overexpressed recombinant vector of Escherichia coli, and more specifically, human granulocyte-colony stimulating factor (hereinafter referred to as hG-CSF) chemically synthesized in an E. coli expression system (E. coli expression system). An overexpression vector using the gene and a method for mass production of hG-CSF in E. coli using the same.
[종래기술][Private Technology]
재조합 DNA기술(recombinant DNA technology)의 획기적인 발달과 함께 미생물들을 숙주로 사용하여 호르몬(hormone)류(인용참증 : K.Itakura 등, Science 198, 1977 및 D.V.Goeddel 등 Nature 281, 544, 1979), 사이토카인(cytokine)류(인용참증 : A.M. Wang등, Science 228, 149, 1985), 인터페론(interferon)류(인용참증 : T.Taniguchi등, Nature 285, 547, 1980)등과 같은 중요한 생리활성 물질들의 대량 생산이 가능하여졌으며 이들 대량 생산된 생리활성 물질들은 유용한 의약품으로 널리 활용되고 있다.With the breakthrough development of recombinant DNA technology, the use of microorganisms as a host for hormones (citing evidence: K.Itakura et al., Science 198, 1977 and DVGoeddel et al. Nature 281, 544, 1979), Saito Large quantities of important bioactive substances such as cytokines (quotation citation: AM Wang et al., Science 228, 149, 1985), interferons (quotation citation: T.Taniguchi et al., Nature 285, 547, 1980) Production is possible, and these mass-produced bioactive substances are widely used as useful medicines.
이와 같은 재조합 DNA를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에서 사용되는 숙주세포들은 그 사용에 앞서 그들의 유전 및 생리에 대한 연구가 필수적으로 선행되어야 한다. 이런 까닭에 가장 보편적인 숙주세포로 사용되어오고 있는 대장균은 유전자 조작이 비교적 용이하고 사용배지의 값이 싸면서도 균체 생성량을 많이 늘릴 수 있다는 장점 또한 지니고 있어 매우 유용한 숙주로 알려져 있다.Host cells used in the method of producing a target protein using such recombinant DNA must be preceded by the study of their genetic and physiological prior to its use. For this reason, Escherichia coli, which has been used as the most common host cell, is known to be a very useful host because it is relatively easy to manipulate genetically and inexpensive medium, and can increase cell production.
대장균으로부터 목적 단백질을 대량 생산하기 위하여 주로 플라스미드(plamid 또는 벡터라 한다)를 사용한다. 플라스미드는 염색체와는 독자적으로 자기 복제(replication)를 행하며 자세포로 유전정보를 전달하며, 프로모터에 의해 유전정보를 전사(transcription), 번역(translation)하기도 하며 선별마커(selection marker)가 있어 자세포 또는 다른 세포로 운반된 후에도 확인이 가능하다는 특성을 가지고 있다. 따라서 플라스미드에 목적 단백질의 유전자를 클로닝(cloning)시킨 후 그 단백질의 생성을 유도할 수 있다.In order to mass-produce the protein of interest from E. coli, plasmids (called plamids or vectors) are mainly used. Plasmids carry out their own replication with the chromosome and transfer the genetic information to the zygote. They also transcribe and translate the genetic information by the promoter, and have a selection marker so that the plasmid It can be identified even after being transported to other cells. Therefore, after cloning the gene of the protein of interest in the plasmid, it is possible to induce the production of the protein.
이때 목적 단백질의 유전자가 클로닝된 플라스미드를 재조합 벡터라 하며, 이 재조합 벡터로부터 목적 단백질이 생성되는 것을 '발현'이라 하며 이때 사용된 플라스미드를 '발현벡터'라 하며, 목적 단백질의 발현의 안정성이 클수록 발현벡터의 유용성은 증가하게 된다.In this case, the plasmid in which the gene of the target protein is cloned is called a recombinant vector, and the generation of the target protein from the recombinant vector is called 'expression', and the plasmid used is called an 'expression vector'. The utility of expression vectors is increased.
일반적으로 재조합 벡터는 i) 특정 DNA서열을 인지하고 그 부위를 절단하는 제한 효소중, 플라스미드상에 있는 특정 부위를 절단할 수 있는 엔도누클레아제(endonuclease)를 이용하여 원하는 플라스미드상의 특정 부위를 절단하고 ii) 그 부위에 목적 단백질을 발현하는 유전자를 삽입한 후, iii) 절단 부위를 재결합시키는 리가제(ligase)라는 효소를 사용하여 절단 부위를 재결합하는 공정으로 제조된다. 아울러 상기 방법으로 제조합된 벡터를 대장균으로 형질 전환시키고 이 형질전환체를 순수분리하여 적절한 배지에서 배양함으로써 목적하는 단백질을 대량생산할 수 있다.In general, a recombinant vector i) cleaves a specific site on a desired plasmid by using an endonuclease capable of cleaving a specific site on a plasmid, among the restriction enzymes that recognize a specific DNA sequence and cleave the site. And ii) inserting a gene expressing the target protein into the site, and iii) recombining the cleavage site using an enzyme called ligase that recombines the cleavage site. In addition, it is possible to mass-produce the protein of interest by transforming the vector prepared by the above method into Escherichia coli, purely separating the transformant, and culturing in an appropriate medium.
재조합된 벡터의 발현을 유도하기 위하여 주로 사용되는 프로모터(promoter)로는 t게 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, λ PL프로모터등이 있다(I.H.Miller등, The Operon, Cold Spring Harbor, 133∼136, 1980). 그 중 Trp 프로모터(C. Yanofsky 등, Nucleic Acids Res. 9. 6647. 1981)는 트립토판 오페론(operon)으로부터 유래된 것으로 트립토판 프로모터에는 전사 개시를 조절하는 리프레서(repressor)단백질이 인지하고 결합하는 DNA서열인 오퍼레이터(operator)부위를 지니고 있다.Promoters mainly used to induce the expression of recombinant vectors include t promoter, lac promoter, tac promoter, and λ P L promoter (IHMiller et al., The Operon, Cold Spring Harbor, 133-136, 1980). ). Among them, the Trp promoter (C. Yanofsky et al., Nucleic Acids Res. 9. 6647. 1981) is derived from the tryptophan operon. It has an operator site that is a sequence.
리프레서 단백질과 오퍼레이터 부위와의 결합은 세포내의 트립토판 농도에 의해 영향을 받으며, 트립토판의 농도가 높을 때에는 서로가 강하게 결합하여 RNA 폴리머라아제(polymerase)에 의한 전사를 방해한다. 그러나 세포내의 트립토판 농도가 낮거나 인돌 프로피온산(Indole-3-propionic acid)이나 인돌 아크릴산(3-indolacrylic acid : 이하 3-IAA라 함)과 같은 경쟁적 저해제(competitive inhibitor)가 존재하게 되면 리프레서 단백질이 오퍼레이터 부위에서 분리되어지고 이때 RNA 폴리머라아제에 의해 5'에서 3'방향으로 DNA가 mRNA로 전사되어진다. 전사의 순서는 우선 리보솜(ribosome) 결합 부위를 코드화 하는 DNA서열에서 시작하여 목적 단백질의 번역 개시코돈(translation initiation codon : 통상적으로 DNA상에서 ATG이며, 생성된 mRNA에서 AUG이다)과 목적 단백질의 유전자를 전사한 후, 전사 터미네이터(transcription terminator)에 이르면 전사가 정지하게 된다.The binding of the repressor protein to the operator site is influenced by the concentration of tryptophan in the cell, and when the concentration of tryptophan is high, they bind strongly to each other and interfere with transcription by RNA polymerase. However, if the concentration of tryptophan in the cell is low or competitive inhibitors such as indole-3-propionic acid or indole acrylic acid (3-IAA) are present, It is isolated at the operator site and DNA is transcribed into mRNA in the 5 'to 3' direction by RNA polymerase. The sequence of transcription begins with the DNA sequence encoding the ribosomal binding site, followed by the translation initiation codon of the target protein (typically ATG on DNA and AUG on the resulting mRNA) and the gene of the target protein. After transcription, transcription is stopped when a transcription terminator is reached.
이와 같이 생성된 mRNA는 리보솜과 결합하게 되고 리보솜은 서서히 mRNA상을 이동하면서 번역 개시코돈부터 번역을 개시하여 종료코돈(termination codon : 통상적으로 mRNA상에서 UAA, UAG 및 UGA이다)에 이르기까지 유전자를 번역하여 목적 단백질을 생산하게 된다(G. D. Stormo등, Nucleic Acids Res. 10, 2971, 1982).The mRNA thus produced binds to the ribosomes, and the ribosomes slowly move on the mRNA, translating genes from translation initiation codons to initiation and termination codons (typically UAA, UAG and UGA on mRNA). To produce the desired protein (GD Stormo et al., Nucleic Acids Res. 10, 2971, 1982).
플라스미드를 이용하여 과발현 재조합 벡터를 제작함에 있어서 일반적으로 다음과 같은 사항들이 고려되어 왔다.In the preparation of overexpressed recombinant vectors using plasmids, the following points have generally been considered.
첫째, 플라스미드의 자기복제에 관련된 요소, 즉 유전자 복사수(gene copy number) 및 안정성(인용 참증 : D. W. Zabriskie 등, Enzyme Microbiol. Lett. 22, 239, 1984), 둘째, mRNA에 관련된 요소, 즉 mRNA 합성의 개시율(initiation rate)(K. Nakamura 등, EMBO J. 1,771, 1982), 합성의 연장(elongation)과 종료(termination)(인용참증 : T. Platt 등 'Gene functon in prokaryotes', p123, 1983) 및 mRNA의 분해율(인용참증 : S.F. Newbuy 등, cell 51, 1131, 1987), 셋째, 단백질에 관련된 요소, 즉 목적하는 단백질의 번역 개시율(인용참증 : G.D.Stormo 등, Science 198, 1056, 1977), 넷째, 단백질의 분해율(인용참증 : A.L. Goldberg 등 'Maximizing Gene Expression' p287, 1977)등이 숙주 세포와 적합하도록 고려되어 왔다.First, factors related to self-replication of the plasmid, namely gene copy number and stability (quotation: DW Zabriskie et al., Enzyme Microbiol. Lett. 22, 239, 1984), second, elements related to mRNA, ie mRNA Initiation rate of synthesis (K. Nakamura et al., EMBO J. 1,771, 1982), elongation and termination of synthesis (quotation: T. Platt et al. 'Gene functon in prokaryotes', p123, 1983) and the rate of degradation of mRNA (quotation citation: SF Newbuy et al., Cell 51, 1131, 1987), third, protein related factors, that is, the translation initiation rate of the desired protein (citation: GDStormo et al., Science 198, 1056, 1977), and fourth, protein degradation rate (quotation maxima: 'Maximizing Gene Expression' p287, 1977) has been considered to be compatible with host cells.
[발명의 목적][Purpose of invention]
본 발명은 대장균 발현계(E.coli 발현 시스템)에 적합하게 화학합성된 hG-CSF유전자 및 상기 화학합성한 유전자를 이용한 과발현벡터를 제공하며, 아울러 및 상기 과발현벡터를 이용하여 대장균내에서 hG-CSF를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것에 그 목적을 둔다.The present invention provides a hG-CSF gene chemically synthesized in an E. coli expression system (E. coli expression system) and an overexpression vector using the chemically synthesized gene, and in addition, hG- in E. coli using the overexpression vector. Its purpose is to provide a method for mass production of CSF.
[발명의 구성][Configuration of Invention]
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 하기식(Ⅰ)의 염기서열을 포함하는 hG-CSF의 유전자를 제공한다.The present invention provides a gene of hG-CSF comprising the base sequence of the following formula (I) to achieve the above object.
상기식에서, W는 상기한 hG-CSF 유전자의 프로모터 및 샤인-달가노 부위를 포함하는 업스트림(upstream) DNA 염기서열을 나타내며; X는 하기식 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택된 상기한 hG-CSF 유전자의 5' 말단 DNA 염기 서열을 나타내며;Wherein W represents an upstream DNA sequence comprising the promoter and shine-dalgano region of the hG-CSF gene described above; X represents the 5 'terminal DNA base sequence of the hG-CSF gene described above selected from the group consisting of the following formulas (a) to (d);
Y는 상기한 hG-CSF 유전자의 11 내지 174 아미노산 서열에 해당하는 DNA 염기서열을 나타내며; Z는 상기한 hG-CSF 유전자의 종료코돈이하의 전사터미네이터를 포함하는 DNA 염기서열을 나타낸다.Y represents a DNA sequence corresponding to the 11-174 amino acid sequence of the hG-CSF gene described above; Z represents a DNA base sequence including the transcription terminator below the termination codon of the hG-CSF gene.
본 발명의 상기 식(Ⅰ)의 hG-CSF 유전자의 W부위는 샤인-달가노부위와 개시코돈 사이에 하기식 (e) 내지 (g)로 이루어진 군에서 선택되는 DNA 염기서열을 포함한다.W region of the hG-CSF gene of the formula (I) of the present invention comprises a DNA base sequence selected from the group consisting of the following formula (e) to (g) between the shine-dalgano region and the start codon.
또한 본 발명의 상기 식(Ⅰ)의 hG-CSF 유전자의 Y부위는 하기식(Ⅱ)의 DNS 염기서열을 포함한다.In addition, the Y region of the hG-CSF gene of the formula (I) of the present invention includes the DNS base sequence of the following formula (II).
본 발명의 상기 식(Ⅰ)의 hG-CSF 유전자의 상기한 W부위는 trp 프로모터를 포함하며, 아울러 샤인-달가노부위와 개시코돈사이에 7 내지 11bp의 DNA 염기서열을 포함한다.The W region of the hG-CSF gene of the formula (I) of the present invention includes a trp promoter and a DNA sequence of 7 to 11 bp between the shine-dalgano region and the start codon.
본 발명의 상기한 Z부위는 테트라싸이클린 내성유전자의 전사터미네이터, 박테리오 파지 fd의 전사터미네이터, 스타필로코커스 단백질 A의 전사터미네이터, rrnB 오페론의 전사터미네이터로 이루어진 군에서 선택되는 전사터미네이터를 포함한다.The Z region of the present invention includes a transcription terminator selected from the group consisting of a transcription terminator of a tetracycline resistance gene, a transcription terminator of bacteriophage fd, a transcription terminator of Staphylococcus protein A, and a transcription terminator of rrnB operon.
본 발명은 본 발명의 hG-CSF 유전자로부터 발현되는 hG-CSF의 아미노산 서열을 제공한다.The present invention provides an amino acid sequence of hG-CSF expressed from the hG-CSF gene of the present invention.
또한, 본 발명은 본 발명의 hG-CSF 유전자를 포함하는 벡터 및 롭단백질에 해당하는 DNA 염기서열을 포함하는 염기서열이 제거된 벡터를 제공하며, 벡터는 pDA 123, pCSF 430, pCSF 440, pCSF 450, pCSF 450A, pCSF 450B, pCSF 450C, pCSF 450L, pCSF 450M, pCSF 450R, pCSF 451, pCSF 452, pCSF 453, pCSF 460, 및 pCSF 470로 이루어진 군에서 선택된다.The present invention also provides a vector comprising the hG-CSF gene of the present invention and a vector from which the nucleotide sequence including the DNA sequence corresponding to the rob protein is removed, wherein the vector is pDA 123, pCSF 430, pCSF 440, pCSF. 450, pCSF 450A, pCSF 450B, pCSF 450C, pCSF 450L, pCSF 450M, pCSF 450R, pCSF 451, pCSF 452, pCSF 453, pCSF 460, and pCSF 470.
더하여, 본 발명은 본 발명의 hG-CSF 유전자를 벡터에 삽입하고; 상기 염기서열이 삽입된 벡터로 숙주세포를 형질전환하고; 상기 숙주를 배양하는; 공정들을 포함하는 hG-CSF의 생산 방법을 제공한다.In addition, the present invention inserts the hG-CSF gene of the present invention into a vector; Transforming the host cell with the vector into which the base sequence is inserted; Culturing the host; It provides a method of producing hG-CSF comprising the processes.
본 발명은 또한 본 발명의 hG-CSF 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터로 숙주세포를 형질전환하고; 상기 숙주를 배양하는; 공정들을 포함하는 hG-CSF의 생산 방법을 제공한다.The present invention also transforms host cells with a vector of the present invention comprising the hG-CSF gene of the present invention; Culturing the host; It provides a method of producing hG-CSF comprising the processes.
상기한 본 발명의 생산 방법에 있어서, 상기한 숙주는 BE42, DH1, HB101, JM101, LE392, MC1061, NM522, W3110, Y1088로 이루어진 군에서 선택되며 그의 배양은 낮은 농도의 트립토판을 포함하는 배지에서 이루어진다.In the above-described production method of the present invention, the host is selected from the group consisting of BE42, DH1, HB101, JM101, LE392, MC1061, NM522, W3110, Y1088, and the culture thereof is performed in a medium containing a low concentration of tryptophan. .
본 발명은 또한 한국 종균 협회 기탁번호 제KFCC 10837호 에시리키아콜라이 W3110에 포함되는 플라스미드 pCSF450의 특성을 갖는 플라스미드 및 한국 종균 협회 기탁번호 제KFCC 10838호 에세리키아콜라이 W3110에 포함되는 플라스미드 pCSF451의 특성을 갖는 플라스미드를 제공한다.The present invention also relates to a plasmid having the characteristics of the plasmid pCSF450 contained in the Korean spawn association accession no. KFCC 10837 Escherichia coli W3110 and the characteristics of the plasmid pCSF451 included in the Korean spawn association accession No. KFCC 10838 eserikia coli W3110. It provides a plasmid having.
본 발명은 한국 종균 협회 기탁번호 제KFCC 10837호 에세리키아콜라이 W3110의 특성을 갖는 미생물 및 한국 종균 협회 기탁번호 제KFCC 10838호 에세리키아콜라이 W3110의 특성을 갖는 미생물도 제공한다.The present invention also provides a microorganism having the characteristics of the Korean spawn association accession No. KFCC 10837 Escherichia coli W3110 and a microorganism having the characteristics of the Korean spawn association accession No. KFCC 10838 Escherichia coli W3110.
대장균으로부터 hG-CSF의 생성을 극대화시키기 위하여 본 발명에서는 상기한 재조합 벡터의 제조시의 네가지 고려사항을 고려하여 과발현벡터를 제작하였다.In order to maximize the production of hG-CSF from E. coli, in the present invention, an overexpression vector was prepared in consideration of four considerations in the preparation of the recombinant vector.
첫째, 플라스미드에 관련된 사항으로서, 보통 대장균의 플라스미드로부터 생성되어지는 단백질들은 그 유전자의 양(gene dosage)이 많아질수록 생성량도 증가되므로 플라스미드의 복사수(copy number)를 안정하게 늘릴 수 있는 방법을 고안하고자 하였다.First, as for plasmids, proteins produced from E. coli plasmids usually increase in amount as the gene dosage increases, so that the number of copies of the plasmid can be stably increased. It was intended to devise.
일반적으로 플라스미드의 복사수와 안정성은 주로 자기 복제원점인 리플리콘(replicon)에 의해 결정되어지며 플라스미드를 포함하는 유전자 숙주세포의 성장 조건과 생리 등도 플라스미드 안정성에 커다란 영향을 준다(D.W.Zabriskie 등, Enzyme Microbiol, Lett. 22, 239, 1984). 대장균 플라스미드의 자기 복제는 숙주세포인 대장균의 염색체 유전자로부터 만들어지는 많은 효소들을 이용하여 이루어진다. 그러나 플라스미드마다 이용하는 효소가 다르고 그에 따라 자기 복제되는 플라스미드의 양도 달라지게 된다. 플라스미드 복사수를 조절하은 부위는 리플리콘에 존재하는데 현재 사용되고 있는 대부분의 대장균 플라스미드는 임상시료로부터 분리된 pMB1(또는 ColE1) 플라스미드의 리플리콘(J.R.Scott, Microbial. Rev. 48, 1, 1984 : F. Bolivar 등, Gene 2, 95, 1977)을 가지고 있으며 보통 성장하에서 15 내지 20개의 복사수를 유지한다. 자기복제는 출발점으로부터 한 방향으로 진행되며 이때 RNAⅡ가 DNA 합성을 위한 프라이머(primer)로 작용한다(T. Itoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 2450, 1980). RNAⅡ는 DNA 템플리트(template)와 계속 하이브리드(Hybrid)를 형성해가면서 자기 복제를 진행하게 된다. 이때 RNAⅠ이라는 작은 RNA 분자가 자기복제를 방해하기도 한다. 즉, RNAⅠ이 RNAⅡ에 결합함으로써 DNA 템플레이트와 RNAⅡ의 하이브리드화가 방해되는 것이다. RNAⅠ과 RNAⅡ이 결합하면 롭(Rop) 단백질이라는 63개 아미노산의 작은 단백질의 발현이 촉진되며 결과적으로 자기복제를 부정적으로 조절하는 RNAⅠ의 기능은 롭 단백질에 의해 강화되는 것이다(G. Cesareni등, Trends Biochem. Sci. 10: 303, 1985).In general, the number and stability of plasmids are largely determined by the replication origin, which is the origin of self-replication, and the growth conditions and physiology of gene host cells including plasmids also have a great influence on plasmid stability (DWZabriskie et al., Enzyme). Microbiol, Lett. 22, 239, 1984). Self-replication of E. coli plasmids is accomplished using a number of enzymes made from the chromosomal gene of E. coli, the host cell. However, different plasmids use different enzymes, and thus the amount of self-replicating plasmids will vary. The site where the plasmid copy number is controlled is present in the Ripleycone. Most of the E. coli plasmids currently in use are those of the pMB1 (or ColE1) plasmid isolated from clinical samples (JRScott, Microbial. Rev. 48, 1, 1984: F Bolivar et al., Gene 2, 95, 1977) and usually maintains 15 to 20 copies under growth. Self-replication proceeds in one direction from the starting point, where RNA II acts as a primer for DNA synthesis (T. Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 2450, 1980). RNAII will continue to form a hybrid with the DNA template and proceed with self-replication. Small RNA molecules called RNAI may interfere with self-replication. In other words, the hybridization of DNA template and RNAII is hindered by RNAI binding to RNAII. The combination of RNAI and RNAII promotes the expression of a small 63 amino acid protein called the Rob protein. As a result, RNAI's ability to negatively regulate self-replication is enhanced by Rob protein (G. Cesareni et al., Trends Biochem. Sci. 10: 303, 1985).
상기 사실로부터 본 발명자는 플라스미드로부터 롭 단백질의 유전자를 제거 또는 절단시킴으로써 RNAⅠ에 의한 자기복제 방해를 저하시키고 그 결과 hG-CSF의 발현 벡터의 복사수 및 hG-CSF의 발현을 증가시키고자 하였다.From this fact, the present inventors sought to reduce the interference of self-replicating by RNAl by removing or cleaving the gene of the Rob protein from the plasmid and consequently increasing the number of copies of the expression vector of hG-CSF and the expression of hG-CSF.
둘째, mRNA와 관련된 사항이다. 유전자 발현의 첫단계는 RNA 폴리머라제(RNA polymerase)에 의해 촉매되는 전사개시단계(transcription initiation event)이다.Second, it is related to mRNA. The first stage of gene expression is a transcription initiation event catalyzed by RNA polymerase.
대장균에서의 전사개시율은 프로모터의 염기서열에 의해 조절되어지는데, 즉 조절 단백질(regulatory proteins)이 프로모터의 특정한 염기 서열부위에 결합하여 전사메카니즘을 조절한다. 프로모터에 의해 mRNA전사가 개시되어지면 mRNA는 계속 연장(elongation)되어 전사되어진다. 그러나 가끔 비특이적으로 미성숙종료(premature termination)가 나타나기도 한다. 이러한 미성숙 종료부위는 mRNA로 전사되는 프로모터 일부와 목적유전자의 DNA서열에 의하여 결정된다.The initiation rate of transcription in E. coli is regulated by the nucleotide sequence of the promoter, that is, regulatory proteins bind to specific nucleotide sequences of the promoter to regulate the transcription mechanism. When mRNA transcription is initiated by a promoter, mRNA is elongated and transcribed. However, sometimes nonspecific premature termination occurs. This immature termination site is determined by a portion of the promoter transcribed into mRNA and the DNA sequence of the gene of interest.
일반적으로 사람이나 동물의 유전자를 cDNA(complementary DNA)형태로 대장균에서 직접 발현시키고자 할 때, 대부분의 경우 발현이 미비하게 일어나거나 거의 일어나지 않는다. 이런 현상은 여러가지 이유에서 비롯되지만 상기 사항도 중요한 이유중의 하나이다. 따라서 목적 단백질의 유전자를 대장균 발현계에 적합하도록 재구성하여 미성숙 종료를 배제하는 것은 과발현 벡터의 제작에 있어서 요구되는 필수적인 과정이다.In general, when a human or animal gene is directly expressed in E. coli in the form of cDNA (complementary DNA), in most cases, the expression is inadequate or rarely occurs. This phenomenon originates from various reasons, but the above is also one of the important reasons. Therefore, reconstituting the gene of the protein of interest to suit the E. coli expression system to eliminate premature termination is an essential process required for the production of overexpression vectors.
전사 종료는 mRNA, mRNA폴리머라제 및 DNA가 분리되는 점에서 일어나며 이 과정에는 누클레오티드(nucleotide)의 서열, mRNA 전사체(trascript)의 2차구조 및 NusA 및 NusB와 같은 숙주세포의 단백질 등이 영향인자로 관여한다. 따라서 DNA에서 mRNA로 전사하는 과정의 효율은 RNA 폴리머라제가 전사개시부위와 종료부위를 인지하고 작용하는 능력에 따라 달라지게 된다.Transcription termination occurs at the separation of mRNA, mRNA polymerase, and DNA. In this process, factors such as nucleotide sequence, secondary structure of mRNA transcript, and proteins of host cells such as NusA and NusB are affected. To get involved. Therefore, the efficiency of the transcription process from DNA to mRNA depends on the ability of RNA polymerase to recognize and act on transcription initiation and termination sites.
RNA 폴리머라제가 기본적인 기능을 수행하기 위해서 각 프로모터부위와 터미네이터부위는 일반적으로 유사한 공통적 구조를 지니지만 그와 대조적으로 각각의 프로모터 및 터미네이터간의 기능상(효율성 및 효과인자의 의존도)의 차이를 부여하는 구조적 차이도 지니고 있다.In order for RNA polymerase to perform its basic functions, each promoter region and terminator region generally have a similar common structure, but in contrast, a structural structure that gives a difference in function (efficiency and effect factor dependence) between each promoter and terminator. There is a difference.
따라서 과발현 벡터를 제조하기 위해서는 상기한 미성숙종료 현상을 일으킬 수 있는 비특이적 염기서열를 mRNA상으로부터 배제하여야만 한다.Therefore, in order to prepare an overexpression vector, it is necessary to exclude nonspecific sequences from the mRNA that may cause the above-mentioned immature termination.
따라서, 본 발명자는 대장균에 적합하도록 hG-CSF의 유전자를 화학합성하여 미성숙전사 등의 반응을 완전히 배제시키고 hG-CSF 유전자의 3' 말단뒤에는 여러종류의 전사터미네이터를 변경하여 결합시킴으로써 발현효과를 증대시키고자 하였다.Therefore, the present inventors chemically synthesize hG-CSF gene so as to be suitable for Escherichia coli, thereby completely eliminating immature transcripts and increasing the expression effect by altering and binding various transcription terminators after the 3 'end of the hG-CSF gene. I wanted to.
일반적으로 전사터미네이터들이 공통적으로 가지고 있는 구조의 특성으로는 i) 종료부위앞에 서로 대칭되는 서열을 가지며 ii) mRNA전사체(transcript)의 3'말단에 U염기가 존재하고 iii) 대칭되는 서열내에는 G/c염기가 대체로 많이 존재한다는 것이다(T. Paltt The Operon, New York, Cold Spring Harbor, 1980).In general, the characteristics of the structures commonly used by transcription terminators include: i) symmetric sequences before the termination, ii) U base at the 3 'end of the mRNA transcript, and iii) within the symmetric sequence. In general, there are many G / c bases (T. Paltt The Operon, New York, Cold Spring Harbor, 1980).
서로 대칭되는 서열은 줄기-고리 구조(stem-loop structure)를 형성하며 대칭되는 서열의 길이에 따라 줄기(stem)구조의 길이가 달라지며, 대칭되는 서열사이의 길이에 따라 고리(loop)구조의 크기가 달라지게 된다. 이와같은 줄기-고리구조는 RNA 폴리머라제에 의한 전사를 종료시키는 역할을 하고 mRNA전사체의 3'말단에 존재하는 U염기들은 전사체들을 DNA로부터 분리시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.The symmetric sequences form a stem-loop structure and the length of the stem structure varies depending on the length of the symmetric sequence, and the length of the loop structure depends on the length between the symmetric sequences. The size will be different. This stem-ring structure is known to terminate transcription by RNA polymerase, and the U bases present at the 3 'end of mRNA transcripts are known to separate transcripts from DNA.
한편 전사터미네이터는 가능한 한 목적유전자의 3'말단 가까이에 위치하는 것이 바람직한데 이는 RNA 폴리머라제에 의해 불필요한 전사가 일어나는 것을 최소화시켜 mRNA의 안정성을 증가시키고 세포가 사용하는 에너지를 감소시킬 수 있다는 장점이 있다.On the other hand, it is desirable that the transcription terminator be located as close to the 3 'end of the target gene as possible, which minimizes unnecessary transcription by RNA polymerase, thereby increasing the stability of mRNA and reducing the energy used by cells. have.
따라서 본 발명에서는 cDNA 형태의 hG-CSF 유전자 사용을 배제하고, 미성숙 전사종료등이 일어나지 않게 hG-CSF 유전자를 화학합성하였으며 여러 종류의 mRNA 전사터미네이터를 hG-CSF 유전자에 가까이 결합시켜 mRNA의 안정성을 증가시키고 세포가 사용하는 에너지를 감소시킴으로서 이에 따른 발현증가를 유도하고자 하였다.Therefore, the present invention excludes the use of the cDNA-type hG-CSF gene, chemically synthesizes the hG-CSF gene so that immature transcription does not occur, and stabilizes mRNA by binding various mRNA transcription terminators to the hG-CSF gene. Increasing and decreasing the energy used by the cells was intended to induce an increase in expression accordingly.
셋째, 번역(translation)과정과 관련된 사항이다.Third, it is related to the translation process.
번역과정은 mRNA로 부터 폴리펩타이드(polypeptide)가 만들어지는 과정으로 번역 개시단계는 이미 전사과정에서 만들어진 mRNA와 rRNA 및 fMet-tRNA의 결합과 리보솜 단백질인 SI 및 개시인자(initiation factor: 이하 'IF'라 한다)인 IF 1, IF 2, IF 3에 의하여 촉진되어진다(G.D.Stormo, Maximizing Gene Expression p195, Butterworth, Stoneham, Massachusetts, 1986).The translation process is a process in which a polypeptide is produced from mRNA. The translation initiation step is a combination of mRNA and rRNA and fMet-tRNA, which are already produced during transcription, and an SI and initiation factor (IF). And IF 1, IF 2, and IF 3 (GDStormo, Maximizing Gene Expression p195, Butterworth, Stoneham, Massachusetts, 1986).
번역개시효율은 mRNA의 여러 부위에 의해 영향을 받는데, 그중 특히 리보솜의 결합부위인 샤인-달가노(Shine-Dalgarno: 이하 'SD'라 한다)부위, 개시코돈, SD부위와 개시코돈 사이의 간격과 서열 및 mRNA의 2차구조 등이 중요한 요소이다. 특히, hG-CSF의 경우 PL이나 trp 프로모터를 이용한 대장균 발현계에서 목적유전자로 cDNA 자체를 사용한 경우 발현이 전혀 일어나지 않고 hG-CSF유전자와 5' 말단서열의 G-C염기함량을 줄이고 A-T가 풍부한 서열로 변형시켜 사용했을 때 비로소 hG-CSF의 발현이 크게 향상되었는데, 이러한 현상은 여러 가지 가능성을 안고 있지만 상기 사항 중 mRNA 2차구조의 변형으로 리보솜이 mRNA상에 보다 근접하여 번역개시 효율을 증가시킨 결과로 볼수 있다(P.E. Devlin등, Gene 65, 13, 1988).Translation initiation efficiency is affected by several sites in the mRNA, in particular the distance between the binding site of the ribosome Shine-Dalgarno (hereinafter referred to as 'SD'), the start codon, the SD site and the start codon And sequence and mRNA secondary structure are important factors. In particular, in the case of hG-CSF, when the cDNA itself is used as the target gene in the E. coli expression system using the PL or trp promoter, the expression does not occur at all and reduces the GC base content of the hG-CSF gene and the 5 'terminal sequence, When modified, the expression of hG-CSF was greatly improved. This phenomenon has several possibilities, but the modification of mRNA secondary structure of ribosome was closer to the mRNA and increased the translation initiation efficiency. (PE Devlin et al., Gene 65, 13, 1988).
SD부위는 16S rRNA의 3'말단과 상보적인 서열을 가지며 일반적으로 3 내지 6개의 누클레오티드로 구성되어 있고, 개시코돈은 주로 AUG가 사용되나 가끔 GUG, UUG, AUU, AUA등이 사용되기도 한다. 또한 SD부위와 개시코돈 사이의 간격은 보통 9±3개의 누클레오티드로 구성되고 염기조성도 A와 U가 많은 것이 효과적이다. 한편 SD부위와 개시코돈 사이의 간격과 서열을 목적유전자의 5'말단과도 밀접한 관련을 가져 개시코돈 부위의 mRNA 2차 구조 형성에 중요한 역할을 한다(A.C.Looman등, Nucleic Acids Res.12, 7663, 1984).The SD region has a sequence complementary to the 3 'end of the 16S rRNA and is generally composed of 3 to 6 nucleotides. The start codon is mainly AUG, but sometimes GUG, UUG, AUU, AUA, etc. are used. In addition, the interval between the SD region and the start codon is usually composed of 9 ± 3 nucleotides, and the base composition A and U are more effective. On the other hand, the spacing and sequence between the SD site and the start codon are closely related to the 5 'end of the target gene, thus playing an important role in the formation of the mRNA secondary structure of the start codon site (ACLooman et al., Nucleic Acids Res. 12, 7663). , 1984).
따라서 이 부위의 유전자 간격과 서열을 목적 유전자와 적합해지도록 바꾸어 줌으로써 개시코돈 근처의 mRNA 줄기-고리구조를 불안정화시켜 번역개시의 효율을 성공적으로 증가시킬 수 있다(L.H.Teissier 등, Nucleic Acids Res. 12, 7663, 1984 : C.R.Wood등, Nucleic Acids Res. 12, 3937, 1984).Therefore, by changing the gene spacing and sequence of the region to be compatible with the target gene, the mRNA stem-ring structure near the initiation codon can be destabilized and the efficiency of translation initiation can be successfully increased (LHTeissier et al., Nucleic Acids Res. 12). , 7663, 1984: CRWood et al., Nucleic Acids Res. 12, 3937, 1984).
번역이 개시되어 폴리펩타이드를 형성해 나가는 연장(enlongation)단계는 일정한 속도로 진행되지 않는다. 이런 현상은 mRNA의 여러 부위가 이 단계를 조절하기 때문인데, mRNA는 목적하는 유전자의 서열로부터 전사된 것이므로 목적유전자의 코돈활용(codon usage), 코돈전후 관계(codon context)등에 유전자 발현율은 큰 영향을 받는다(H.A. de Boer Maximizing Gene Expression p225, Butterworth, Massachusetts, 1986). 즉 대장균 발현계에서 cDNA 형태의 유전자가 발현이 잘 안되는 주요 원인중의 하나는 대장균에서 분포가 적은 tRNA에 대한 코돈을 사용하였거나 인접코돈간의 적합성이 결여되어있기 때문이다.The enlongation step, in which translation is initiated to form the polypeptide, does not proceed at a constant rate. This is because several regions of the mRNA regulate this stage. Since the mRNA is transcribed from the sequence of the gene of interest, gene expression rate has a great effect on the codon usage of the gene of interest and the codon context. (HA de Boer Maximizing Gene Expression p225, Butterworth, Massachusetts, 1986). In other words, one of the main causes of poor expression of cDNA genes in E. coli expression systems is the use of codons for less distributed tRNAs in E. coli or the lack of compatibility between adjacent codons.
대장균에서 번역과정의 종료단계에서는 3개의 종료 코돈을 인지하는 2개의 방출인자(release factor : 이하 'RF'라 한다)가 관여하게 된다. RF 1은 UAA, UAG를 인지하는 반면에 RF 2는 UAA, UGA를 인지한다(C.T. Caskey, Trends Biochem, Sci, 5, 234, 1980). 3개의 종료코돈의 효율은 각기 다르나 과발현되는 유전자에는 UAA가 주로 사용되는 것으로 알려져 있다(P.M.Sharp 등, Gene 63, 141, 1988). 그러나 번역종료가 확실히 일어나도록 하기 위해서는 2개의 종료코돈이 연달아 위치되도록 디자인하는 것이 이상적인 방법이다.In Escherichia coli, two release factors (hereinafter referred to as' RF's), which recognize three termination codons, are involved in the translational stage. RF 1 recognizes UAA, UAG, while RF 2 recognizes UAA, UGA (C.T. Caskey, Trends Biochem, Sci, 5, 234, 1980). Although the efficiency of the three termination codons is different, it is known that UAA is mainly used for overexpressed genes (P.M. Sharp et al., Gene 63, 141, 1988). However, to ensure that translation termination occurs, it is ideal to design two exit codons in succession.
따라서 본 발명자는 hG-CSF 유전자를 대장균의 코돈 사용과 코돈 전후 관계에 적합하도록 화학 합성하고 3'말단에 TAA, TAG의 번역종료코돈을 연결시켜 번역 종료가 확실히 일어나도록 유도하고자 하였다.Therefore, the present inventors chemically synthesized the hG-CSF gene so as to be suitable for codon codon usage and codon pre-relationship relationship, and tried to induce translation termination by surely connecting the translation end codons of TAA and TAG to the 3 'end.
결국 목적하는 유전자의 발현은 여러과정의 효율에 따라 결정된다.Eventually, the expression of the gene of interest is determined by the efficiency of several processes.
유전자의 양과 안정성, mRNA의 전사 효율 및 안정성, 번역 효율등 어느 하나에 치우치지 않고 모든 단계가 복합적으로 조화를 이루어야 하는데, 목적 단백질로는 발현되지는 않지만 발현을 조절하는 프로모터와 전사터미네이터 등의 염기 조성뿐만 아니라 목적 유전자의 염기조성이 서로 적합성을 이루어야만 각 단계의 효율이 증가되고 목적 단백질의 발현도 증가하게 된다.All steps must be combined in a complex manner without biasing the quantity and stability of genes, the transcriptional efficiency and stability of mRNA, and the translational efficiency.The bases such as promoters and transcription terminators that do not express the target protein but regulate expression Not only the composition but also the base composition of the target genes must be compatible with each other to increase the efficiency of each step and increase the expression of the target protein.
한편 본 발명자는 발현벡터의 유전자에 의한 발현 효과의 증대 이외에도 숙주세포에 의한 발현효과도 고려하여 발현벡터의 유전자의 발현을 더욱 증대시키고자 하였다.On the other hand, the present inventors have tried to further increase the expression of the gene of the expression vector in consideration of the expression effect by the host cell in addition to the increase of the expression effect by the gene of the expression vector.
미생물들은 자신이 가지고 있는 방대한 유전정보에 따라 기능과 구조가 결정되며 여러 환경에 적응하며 생장하는 능력을 갖게 된다(H.P.Meyer 등, Annu. Rev. Microbiol. 39. 29. 1985). 따라서 숙주세포의 유전적 배경(genetic background)은 특정한 목적 산물을 생성하는데 중요한 역할을 한다. 그러나 플라스미드의 안정성, 목적 산물의 분해 등 표면적으로 숙주세포의 역할을 가늠할 수 있는 결정인자가 있기도 하지만 숙주세포에 따라 목적 산물의 생성율이 크게 변화되는 유전학적 측면에서의 이유는 아직 자세히 밝혀져 있지는 않다(P.S. Kaytes등, J.Biotechnol. 4, 205, 1986).Microorganisms determine their function and structure based on their vast genetic information and have the ability to adapt and grow in different environments (H.P. Meyer et al., Annu. Rev. Microbiol. 39. 29. 1985). Thus, the genetic background of the host cell plays an important role in producing a specific desired product. However, although there are determinants that can measure the role of the host cell on the surface such as stability of the plasmid and degradation of the target product, the reason for genetic change in the production rate of the target product greatly varies depending on the host cell. PS Kaytes et al., J. Biotechnol. 4, 205, 1986).
재조합 산물이 과발현되는 대부분의 경우 그 숙주세포는 생장에 나가기 위해 막대한 대사적 부담이 생기게 되고 이로 인해 플라스미드가 분리(segregation)되어 나가는 현상이 일어날 수 있게 되므로 목적 산물을 안정하게 생성하는 숙주세포의 선정은 매우 중요한 작업이다.In most cases where the recombinant product is overexpressed, the host cell is subject to enormous metabolic burden to enter the growth, which may result in segregation of the plasmid, thereby selecting the host cell stably producing the desired product. Is a very important task.
한편 숙주 세포의 유전적 배경이외에도 숙주세포에 관하여 다음의 2가지 사항이 고려되어 선정되어야 한다. 즉 숙주세포의 성장요구성(growth requirement)과 유전자 발현의 조절방식인데 성장요구성에는 1) 비타민, 아미노산, 금속이온 등과 같은 영양원에 대한 요구성과 2) 온도에 대한 민감성 3) 산소 의존성 등으로 이런 요소들은 발효공정의 효율에 커다란 영향을 주게 된다. 또한 유전자 발현의 조절방식은 유전자 발현계(gene expression system)에 따라 목적산물의 유도(induction)방식이 달라진다.In addition to the genetic background of the host cell, the following two factors should be considered and selected for the host cell. In other words, the growth requirement and gene expression of the host cell are regulated. The growth requirement consists of 1) the need for nutrients such as vitamins, amino acids, and metal ions, and 2) sensitivity to temperature, and 3) oxygen dependence. The factors have a great influence on the efficiency of the fermentation process. In addition, the method of controlling gene expression varies depending on the gene expression system (gene expression system).
따라서 프로모터에 따른 숙주세포의 선정도 고려되어야만 한다. 프로모터에 따라 열(heat), 화학유도제(chemical, inducer), 영양기근(nutrient starvation)등 유도방식이 달라지게 되면 숙주세포에 따라 그 반응이 미세할 수도 있고, 크게 변화될 수도 있으므로 숙주세포의 선정은 더욱 중요하게 부각된다.Therefore, selection of host cells according to promoters should also be considered. If the induction method such as heat, chemical inducer, nutrient starvation is changed according to the promoter, the response may be minute or largely changed depending on the host cell. Is more important.
발현벡터와 숙주세포간의 적합성을 바탕으로 생산 균주가 선별되면 그 발현 시스템의 효율을 극대화시키기 위해서 최적배양조건이 확립되어야 한다. 최적 배양조건은 생산균주의 성장이 활발하게 진행되면서 목적 유전자의 발현이 충분히 유도되는 발효공정조건을 의미하여 이에 영향을 주는 요소로는 온도, 산소공급량와 같은 물리적인 요소와 배지조성, pH와 같은 화학적인 요소로 크게 분류할 수 있다. 특히 미생물에서 외래 유전자를 과발현시킬때는 에너지 등의 소비가 커지고 이에 따라 세포의 대사적 부담이 커지게 되므로 영양분, 미량원소 등이 부족하게 되거나 부산물 생성으로 성장이 지연될 수 있다. 한편 발효 공정에서 생산성을 향상시키기 위해서는 발현 벡터의 안정성이 무엇보다 중요한데 발현벡터의 안정성은 숙주세포의 유전적 배경과도 밀접한 관련을 갖지만 배양조건도 커다란 영향을 주는 요소이므로 발효 공정을 통해 발현 벡터가 유리되는 것을 방지해야만 한다.When production strains are selected based on the compatibility between the expression vector and the host cell, optimal culture conditions should be established to maximize the efficiency of the expression system. Optimal culture conditions mean fermentation process conditions in which the expression of the target gene is sufficiently induced as the growth of the production strain is actively progressed. The factors influencing this include physical factors such as temperature and oxygen supply, chemical composition such as medium composition, and pH. It can be largely classified into phosphorus elements. In particular, when overexpressing a foreign gene in a microorganism, the consumption of energy, etc. is increased, thereby increasing the metabolic burden of the cell, which may result in a lack of nutrients, trace elements, or growth by delayed production of by-products. On the other hand, stability of the expression vector is most important for improving productivity in the fermentation process. The stability of the expression vector is closely related to the genetic background of the host cell, but the culture conditions are also a major factor. Must be freed.
따라서 본 발명자는 hG-CSF의 유전자를 대장균시스템에 적합하도록 코돈활용 및 코돈 전후 관계에 맞추어 화학 합성하고, 합성 유전자와 적합하도록 프로모터의 SD부위와 AUG개시코돈사이의 간격과 서열을 변경하여 번역 개시율을 증대시키며, 강력한 전사터미네이터를 번역종료코돈에 가까이 위치하게 하여 mRNA 전사체의 안정성을 증진시킴으로써 hG-CSF의 생산을 극대화시키는 발현벡터의 제작방법을 제공한다. 또한 제작된 hG-CSF의 발현벡터를 여러가지 숙주세포에 형질전환시켜 그 발현율에 따른 숙주세포와의 적합성 여부를 판단하고 이에 따라 선별된 생산 균주를 최적조건의 발효공정을 통해 hG-CSF 생산을 증대시키고자 하였다.Therefore, the present inventors chemically synthesize the gene of hG-CSF according to codon utilization and codon relationship before and after the coliform system, and start the translation by changing the interval and sequence between the SD region of the promoter and the AUG initiator codon so as to be compatible with the synthetic gene. It provides a method of producing an expression vector that increases the rate and maximizes the production of hG-CSF by enhancing the stability of mRNA transcripts by placing a strong transcription terminator close to the translation termination codon. In addition, by transforming the expression vector of the produced hG-CSF to various host cells to determine the suitability with the host cells according to the expression rate and accordingly increase the production of hG-CSF through the fermentation process of the selected production strain according to the optimal conditions I wanted to.
[실시예]EXAMPLE
본 발명은 다음 실시예를 통해 보다 상세히 설명되어진다. 다음 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일뿐 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.The invention is illustrated in more detail by the following examples. The following examples are merely to aid the understanding of the present invention, but the present invention is not limited thereto.
[실시예 1]Example 1
대장균 발현계에 적합하도록 코돈 활용과 코돈전후관계를 고려하여 제1도 및 제2도에서와 같이 hG-CSF 유전자를 디자인하였다.The hG-CSF gene was designed as shown in FIG. 1 and FIG.
5' 말단근처에는 유전자와 발현 벡터내에서 단독으로 존재하는 HindⅢ부위를 만들어 5'말단서열을 변경시킬 수 있도록 하였으며(제1도 참조), hG-CSF 유전자 5'말단 앞에는 EcoRⅠ과 Cla Ⅰ부위를 만들었고 3'말단뒤에는 Sal Ⅰ부위를 만들어 pUC18 및 pDA123 발현벡터(제2도)로의 클로닝을 용이하게 하였다.Near the 5 'end, a HindIII site exists in the gene and expression vector alone to alter the 5' end sequence (see Figure 1) .In front of the 5G end of the hG-CSF gene, the EcoR I and Cla I sites were placed. After the 3 'end, the Sal I site was made to facilitate cloning into the pUC18 and pDA123 expression vectors (Figure 2).
유전자 합성은 표준 시아노에틸 포스포아미디트(standard cyanoethyl phosphoamidite)화학법으로 적절한 크기의 올리고누클레오티드를 합성한 후 16% 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel)을 이용하여 각 올리고누클레오티드를 분리한 다음, 75℃에서 15분간 반응시켜 서로 결합되도록 하였다. 합성 유전자의 크기는 549 bp(base pair)로서 이를 pUC18의 EcoRⅠ과 Sal Ⅰ사이로 클로닝시켜 pCSF18(KFCC-10836 : 한국종균협회 미생물 보관)을 만들었으며, 이로부터 유전자를 분리하여 사용하였다. 한편 합성 유전자 5'말단의 ClaⅠ으로부터 Hind IIII까지의 48 bp는 코돈활용 등을 적절히 변형하여 3가지 종류의 변형체를 더 합성하였으며, 이는 프로모터 부위와의 적합성 여부를 조사하는 하기 실시예 4에서 사용될 것이다. 변형체 A, B, C중 A 변형체는 원래 합성된 유전자에서 누클레오티드 T를 A로 일부교체하여 변형시킨 것이며, B 변형체는 5'말단 10개의 코돈을 cDNA와 동일하게 변형시킨 것이며, C 변형체는 5'말단을 대장균의 주 tRNA(major tRNA)에 대한 코돈으로 변형시킨 것이다.Gene synthesis was performed by standard cyanoethyl phosphoamidite chemistry to synthesize oligonucleotides of appropriate size, and then isolate each oligonucleotide using a 16% polyacrylamide gel. The reaction was carried out at 15 ° C. for 15 minutes to bond with each other. The size of the synthetic gene was 549 bp (base pair), which was cloned between EcoR I and Sal I of pUC18 to make pCSF18 (KFCC-10836: Korean spawn association microorganism storage). On the other hand, 48 bp from the ClaI to the Hind IIII at the end of the synthetic gene was further modified by codon utilization and the like to further synthesize three kinds of variants, which will be used in Example 4 below to examine the suitability of the promoter region. . Variant A, B, or C was modified by partially replacing nucleotide T with A in the originally synthesized gene, and B variant was modified with 5 'terminal 10 codons identical to cDNA, and C variant was 5'. The terminal is modified with codons for the major tRNA of E. coli.
[실시예 2]Example 2
트립토판(trp) 프로모터와 다클로닝 부위(multicloning site)를 포함하는 pDA 123 발현벡터와 pCSF 18 벡터를 제한효소 Cla Ⅰ과 Sal Ⅰ으로 절단하여 얻은 생성물을 1%의 아가로오즈겔(agarose gel)상에 전기영동하여 분리하였다. 3.9 Kb의 발현벡터 pDA 123 단편과 541 bp의 hG-CSF 유전자 단편을 겔로 부터 각각 분리하고, 이들은 4℃에서 16시간동안 효소 T4 리가제(ligase)로 반응시켜 pCSF 440 발현벡터를 제작하였다(제3도 참조). pCSF 440 발현벡터를 대장균 HB101균주로 염화칼슘방법으로 형질전화시킨 후, 이 형질 전환체를 항생제 암피실린을 함유한 LB 고형배지에 플레이팅(plating)하여 pCSF 440 발현벡터를 포함하는 대장균 HB101균주를 선별하였다.The product obtained by cleaving the pDA 123 expression vector containing the tryptophan (trp) promoter and the multicloning site and the pCSF 18 vector with the restriction enzymes Cla I and Sal I was subjected to 1% agarose gel. Separated by electrophoresis. Expression vector pDA 123 fragment of 3.9 Kb and hG-CSF gene fragment of 541 bp were separated from the gel, respectively, and these were reacted with enzyme T4 ligase at 4 ° C. for 16 hours to prepare pCSF 440 expression vector. See also 3). pCSF 440 expression vector was transformed into E. coli HB101 strain by calcium chloride method, and the transformant was plated on LB solid medium containing antibiotic ampicillin to select E. coli HB101 strain containing pCSF 440 expression vector. .
[실시예3]Example 3
본래의 pCSF 440 발현벡터의 SD부위로 부터 개시코돈까지의 유전자 간격은 8bp이다. 이 유전자 간격을 7, 9, 10, 11bp로 변형시키기 위해 프로모터내의 Hpa I부위로부터 개시코돈 앞의 ClaⅠ부위까지를 새로운 서열로 화학합성하여 대체시켰다. 즉 pCSF 440 발현벡터를 HpaI과 Cla I으로 절단하여 약 30bp의 DNA단편을 제거한 다음, 새로운 서열로 합성한 4종류의 올리고누클레오티드를 삽입시켜 각각 pCSE 430, pCSE 450(KFCC10837 : 한국종균협회 미생물수탁), pCSF 460, pCSF 470의 발현벡터를 구성하였다(제3도 참조). 이 발현벡터들은 대장균 W3110균주에 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 LB배지에 접종시키고 37℃에서 4시간 배양시킨 다음, 3-IAA를 50㎍/㎖의 농도가 되게 첨가하여 hG-CSF의 발현을 유도하였다. 3-IAA의 유도 후 4시간 더 배양한 후 균체를 회수하여 hG-CSF의 양을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.The gene interval from the SD region of the original pCSF 440 expression vector to the start codon is 8 bp. In order to modify this gene gap to 7, 9, 10, 11 bp, the Hpa I site in the promoter and the Cla I site before the start codon were chemically synthesized and replaced with a new sequence. In other words, pCSF 440 expression vector was cut with HpaI and Cla I to remove DNA fragments of about 30bp, and then 4 kinds of oligonucleotides synthesized with the new sequence were inserted into pCSE 430 and pCSE 450 (KFCC10837: KPAC10837: Korea spawn) , pCSF 460, pCSF 470 expression vector was constructed (see Figure 3). These expression vectors were inoculated with the transformant obtained by transforming E. coli W3110 strain into LB medium and incubated at 37 ° C for 4 hours, and then 3-IAA was added to a concentration of 50 µg / ml to inhibit the expression of hG-CSF. Induced. After incubation for 4 hours after induction of 3-IAA, the cells were recovered to measure the amount of hG-CSF, and the results are shown in Table 1 below.
주어진 값은 균체로부터 봉입체를 얻어 이를 활성형으로 전환시킨 다음 효소면역 측정법으로 측정한 값이다.The values given are those obtained by encapsulation from cells and converting them into active form followed by enzyme-immunoassay.
[실시예 4]Example 4
SD부위로부터 ATG사이의 DNA서열과 hG-CSF유전자의 5'말단간의 적합성을 알아보기 위하여 pCSF 450 발현벡터에 hG-CSF의 5'말단서열이 변형된 DNA단편으로 교체하였다(실시예 1 참조). pCSF 450 발현벡터를 Cla I과 Hind III로 절단하여 원래 합성한 hG-CSF 유전자의 5'말단 DNA를 제거시키고 여기에 5'말단의 유전자 조성이 변형된 3종류의 DNA단편(실시예 1 참조)를 각각 클로닝하여 pCSF450-A, pCSF450-B, pCSF450-C의 발현벡터를 얻었다. 이 발현벡터들은 각각 대장균 W3110균주에 형질 전환시킨 다음, 상기 실시예 3에서와 같이 hG-CSF의 발현을 유도하여 그 생성량을 측정하고 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.To determine the adequacy of the DNA sequence between the ATG and the 5 'end of the hG-CSF gene from the SD region, the 5' end sequence of the hG-CSF was changed to the pCSF 450 expression vector (see Example 1). . The pCSF 450 expression vector was cleaved with Cla I and Hind III to remove the 5 'terminal DNA of the originally synthesized hG-CSF gene, and 3 kinds of DNA fragments with modified 5' terminal gene composition (see Example 1). Were cloned to obtain expression vectors of pCSF450-A, pCSF450-B, and pCSF450-C. Each of these expression vectors was transformed into E. coli W3110 strain, and then the expression of hG-CSF was induced as in Example 3 to measure the amount thereof, and the results are shown in Table 2 below.
이때 컴퓨터 프로그램인 HIBIO DNASISTM(일본 히다치사)를 이용하여 번역개시코돈 근처의 mRNA 2차 구조의 자유 에너지 값을 구하였고 이를 hG-CSF 생성량과 비교함으로써 mRNA 2차 구조의 불안정화에 의한 생성율 증가효과를 검토하였다. 이 결과는 하기 실시예 5에서 보다 구체적으로 이용되어진다.At this time, HIBIO DNASISTM (Hitachi Co., Ltd., Japan) was used to determine the free energy value of mRNA secondary structure near translation initiation codon and compared with hG-CSF production to increase the production rate by destabilizing mRNA secondary structure. Reviewed. This result is used more specifically in Example 5 below.
[실시예 5]Example 5
상기 실시예 4에서와 같이 SD부위로투더 ATG사이의 DNA서열과 hG-CSF 유전자의 5'말단간의 적합성을 향상시키기 위해 SD부위로부터 ATG 사이의 DNA서열을 변경하였다. 이는 상기 실시예 3 및 실시예 4에서의 효과를 보다 향상시키기 위한 시도로서 실시예 4에서 조사하였던 mRNA 2차 구조의 자유에너지 값에 따른 hG-CSF의 생성량의 증가 효과를 바탕으로 고안되었다. pCSF450 발현벡터의 SD부위로부터 ATG사이의 DNA간격은 원상태의 간격인 9개로 계속 유지한 채 DNA서열만을 일부 교체하기 위해 HIBIO DNASIS 프로그램으로 여러 가지 서열의 가능성을 검토하고 그 중 2가지 서열을 선정하여 특정부위 돌연변이(site directed mutagenesis)기법으로 서열을 변경하였다. 상기 서열 변경은 pCSF 450 발현벡터의 -GTAACGAT-서열중 밑줄친 CG의 서열을 각각 AT와 TA로 변경시킨 것으로서 트랜스포머 티엠 특정부위 돌연변이 키트(TransformerTM Site Directed Mutagenesis kit)(클론택사)를 사용하여 행하여졌다. 선별 프라이머(selection primer)로는 트랜스 올리고(Trans Oligo) Ssp I/EcoRV(5'CTTCCTTTTTCGATATCATTGAAGCATTT3')를 사용하였으며, 변이프라이머(Mutagenic primer)로는 AT로의 변형의 경우 프라이머 1(5'AAAAGGGTAATATATATGACTCCA3')을, TA로의 변형의 경우 프라이머 2(5'AAAAGGGTAATTAATATGACTCCA3')를 각각 사용하였다. pCSF 450 플라스미드DNA(0.05 ㎍/㎖) 2㎕에 선택 프라이머(0.05㎍/㎖) 2㎕, 변이 프라이머(0.05㎍/㎖) 2㎕, 10배 어닐링 완충액(Annealing buffer) 2㎕, 증류수 12㎕를 가하여 잘 섞은 후 100℃에서 3분간 반응시키고 0℃ 빙조에서 5분간 냉각시킴으로서 프라이머들은 DNA주형에 어닐링 시켰다. 어닐링 반응액에 T4 DNA 폴리머라제(2-4 units/㎕) 1㎕ T4 DNA 리가제(4-6 units/㎕) 1㎕, 10배 합성완충액 3㎕, 증류수 5㎕를 가해 잘 섞은 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 변이 DNA를 합성하고 70℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켰다. 위 반응액을 선택제한효소인 Ssp I 으로 절단하여 변이가 안 일어난 DNA를 선형화(linearization)함으로서 변이플라스미드의 비율을 증가시켰다. 이 반응액을 복구 결핍(repair deficient)주인 BMH71-18 mutS 대장균에 형질전환하고 각 형질전환주로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 Ssp I으로 완전히 절단하고 대장균 DH5α 균주에 다시 형질전환하였다. 이 형질전환주들로부터 플라스미드 DNA를 각각 분리하여 EcoR V로 절단하여 변이가 일어난 플라스미드를 선별하고 최종적으로 변이부위의 염기서열 분석을 통하여 CG가 각각 AT와 TA서열로 변형된 플라스미드 pCSF 450L과 pCSF 450M을 얻었다. 이 플라스미드 벡터를 대장균 W3110에 형질전환시켜 상기 실시예 3에서와 동일한 방법으로 발현을 유도한 후 hG-CSF의 생성량을 측정하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.As in Example 4, the DNA sequence between the SD region and the ATG was changed to improve the suitability between the DNA sequence between the ATG and the 5 'end of the hG-CSF gene. This was designed based on the effect of increasing the production amount of hG-CSF according to the free energy value of the mRNA secondary structure examined in Example 4 as an attempt to further improve the effects in Examples 3 and 4. HIBIO DNASIS to partially replace DNA sequence while maintaining DNA gap between SD and ATG of pCSF450 expression vector at the original interval of 9 The program examined the possibility of various sequences and selected two of them and changed the sequence by site directed mutagenesis. The sequence change was performed by using the TransformerTM Site Directed Mutagenesis kit (ClonTex) as the sequence of the underlined CG in the -GTAACGAT-sequence of the pCSF 450 expression vector was changed to AT and TA, respectively. . As a selection primer, Trans Oligo Ssp I / EcoRV (5'CTTCCTTTTTCGATATCATTGAAGCATTT3 ') was used, and as a mutagenic primer, primer 1 (5'AAAAGGGTAATATATATGACTCCA3') was used as a mutation primer. In case of modification to primer 2 (5'AAAAGGGTAATTAATATGACTCCA3 ') was used respectively. 2 µl of pCSF 450 plasmid DNA (0.05 µg / ml), 2 µl of selective primer (0.05 µg / ml), 2 µl of mutant primer (0.05 µg / ml), 2 µl of 10-fold annealing buffer, and 12 µl of distilled water. After the addition, the mixture was reacted for 3 minutes at 100 ° C and cooled for 5 minutes in an ice bath at 0 ° C to anneal the DNA template. 1 µl of T4 DNA polymerase (2-4 units / µl), 1 µl of T4 DNA ligase (4-6 units / µl), 3 µl of 10-fold synthetic buffer solution, and 5 µl of distilled water were mixed well. Reaction DNA was synthesized by reacting for 1 hour at and quenched by heating at 70 ° C for 5 minutes. The reaction solution was cleaved with the restriction enzyme Ssp I to linearize the unmutated DNA to increase the proportion of mutant plasmids. The reaction solution was transformed into repair deficient strain BMH71-18 mutS Escherichia coli, plasmid DNA was isolated from each transformant, completely cleaved with Ssp I, and transformed back into E. coli DH5α strain. Plasmid DNA was isolated from the transformants, digested with EcoR V, and mutated plasmids were selected. Finally, the plasmid pCSF 450L and pCSF 450M transformed into AT and TA sequences by sequencing of the mutated region. Got. This plasmid vector was transformed into E. coli W3110 to induce expression in the same manner as in Example 3, and then the amount of hG-CSF was measured and the results are shown in Table 3 below.
[실시예 6]Example 6
발현벡터의 유전자 복사수를 증가시키기 위해 pCSF450 발현벡터를 제한효소 PvuII와 MscI으로 절단하여 롭 단백질의 유전자가 포함된 0.6 Kb의 유전자 단편을 제거하였다. PvuII와 MscI으로 절단된 발현벡터의 부위는 블런트 말단(blunt end)이므로 롭 단백질 유전자가 제거된 후에도 연결체(linker)없이 T4 리가제에 의해 쉽게 연결되어 졌으며, 이때 발현벡터내의 다른 기능에는 전혀 손상이 없었다(제4도). 이와 같은 방법으로 복사수가 현저히 증가된 pCSF450R을 제작하였고, 이 발현벡터를 대장균 HB101 균주에 형질전환시켜 정상조건하에 성장시켰을때 200 내지 300의 복사수를 나타내었으며, 이 수치는 pCSF 450 발현벡터의 복사수보다 약 10배가량 증가된 것이다. 한편 pCSF450R 발현벡터를 대장균 W3110균주에 형질전환시킨 후 상기 실시예 3에서와 같이 3-IAA로 hG-CSF의 발현을 유도시켰을때 pCSF450에 비해 약 2배의 생성율 증가를 나타내었다.To increase the number of gene copies of the expression vector, the pCSF450 expression vector was digested with restriction enzymes PvuII and MscI to remove the 0.6 Kb gene fragment containing the Rob protein gene. Since the site of the expression vector cleaved with PvuII and MscI is the blunt end, it is easily linked by T4 ligase without a linker even after the rob protein gene is removed. There was no (Figure 4). In this manner, pCSF450R with a significantly increased copy number was produced. When the expression vector was transformed into Escherichia coli HB101 strain and grown under normal conditions, the copy number was 200 to 300, and this value was a copy of the pCSF 450 expression vector. It is about 10 times greater than the number. Meanwhile, when the pCSF450R expression vector was transformed into E. coli W3110 strain, expression of hG-CSF with 3-IAA as in Example 3 showed about a 2-fold increase in production rate compared to pCSF450.
[실시예7]Example 7
mRNA 전사터미네이터에 따른 hG-CSF 유전자의 발현효과를 알아보기 위해 pCSF450 발현벡터에 3종류의 전사터미네이터를 각각 클로닝시켰다. pCSF450 발현벡터의 mRNA 전사터미네이터는 테트라싸이클린(tetracyclin)내성 유전자의 터미네이터에 의해 조절되어 지도록 제작되었는데 이는 pBR322(ATCC31344)로 부터 유래된 것이다.In order to examine the expression effect of hG-CSF gene according to mRNA transcription terminator, three transcription terminators were cloned into pCSF450 expression vector. The mRNA transcription terminator of the pCSF450 expression vector was designed to be regulated by the terminator of the tetracyclin resistant gene, which is derived from pBR322 (ATCC31344).
상용벡터인 pEX-1(클론텍사), pRIT 2T(파마시아사), pKK 233(파마시아사)으로 부터 각각 박테리오파지(bacteriophage) fd의 전사터미네이터, 스타필로코커스(Staphyococcus) 단백질 A의 전사터미네이터, rrnB 오페론의 전사터미네이터를 분리하여 pCSF 450 발현벡터의 테트라싸이클린 내성 유전자의 전사터미네이터와 교체하고 그 교체가 hG-CSF 유전자의 발현에 미치는 영향을 비교하였다. pCSF450 발현벡터와 pEX-1 벡터를 제한효소 Sal I과 Nde I으로 절단한 다음 그 생성물을 1% 아가로스 겔 전기영동하여 2.8Kb의 pCSF450 발현벡터 단편과 0.5Kb의 fd전사터미네이터의 단편을 분리하여 이를 T4 리가제로 연결시켜 pCSF451 발현벡터를 제작하였다. pCSF 450 발현벡터와 pRIT2T 벡터를 pCSF450 발현벡터와 pRIT2T 벡터를 제한효소 Sal I과 PvuII로 절단한 다음 그 생성물을 1% 아가로스 겔 전기영동하여 3.0kb의 pXSF450 발현벡터의 단편과 0.65kb의 스타필로코커스 단백질 A의 전사터미네이터 단편을 분리하고 이를 T4 리가제로 연결시켜 pCSF452 발현벡터를 제작하였다. pCSF450 발현벡터를 제한효소 Sal I과 PvuII로 절단하고 pKK233 벡터를 Sal I과 PvuII로 절단하고 pKK 223 벡터를 Sal I과 Pvu II로 절단하고 pKK 233벡터를 Sal I과 Hinc II로 절단하여 얻은 생성물을 1% 아가로스 겔 전기영동하여 3.0Kb의 pCSF 450 발현벡터의 단편과 0.6Kb의 rrnB 전사터미네이터의 단편을 겔로부터 분리하고 이를 T4리가제로 연결시켜 pCSF453 발현벡터를 제작하였다(제5도 참조). 따라서 pCSF451(KCCF 10838 : 한국종균협회 미생물수탁), pCSF 452, pCSF 453 발현벡터는 상기 실시예 6에서와 같이 단백질 유전자가 제거된 그러나 mRNA 전사터미네이터는 서로 다른 발현벡터들이다. 이 벡터들을 상기 실시예 3에서와 같은 방법으로 대장균 W3110균주에 형질전환시키고 LB 배지에서 배양하면서 3-IAA로 hG-CSF 유전자를 발현시키고 그때의 hG-CSF의 생성율을 측정하고 그 결과를 하기 표 4에 기록하였다. 표 4로부터 전사터미네이터를 변경시켜 클로닝한 발현벡터의 hG-CSF의 생성량이 pCSF 450의 hG-CSF의 생성량보다 크게 증가하였음을 알 수 있었다.Transcription terminator of bacteriophage fd and transcription terminator of Staphyococcus protein A, rrnB operon The transcription terminator of was isolated and replaced with the transcription terminator of the tetracycline resistance gene of the pCSF 450 expression vector and compared the effect of the replacement on the expression of hG-CSF gene. The pCSF450 expression vector and pEX-1 vector were digested with restriction enzymes Sal I and Nde I, and the product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis to separate 2.8Kb pCSF450 expression vector fragment and 0.5Kb fd transcription terminator. The pCSF451 expression vector was constructed by linking with T4 ligase. The pCSF 450 expression vector and pRIT2T vector were digested with the pCSF450 expression vector and pRIT2T vector with restriction enzymes Sal I and PvuII, and the product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. A transcription terminator fragment of Caucus protein A was isolated and linked to T4 ligase to prepare a pCSF452 expression vector. The product obtained by cutting pCSF450 expression vector with restriction enzymes Sal I and PvuII, cutting pKK233 vector with Sal I and PvuII, cutting pKK 223 vector with Sal I and Pvu II, and pKK 233 vector with Sal I and Hinc II Fragment of the 3.0 Kb pCSF 450 expression vector and the fragment of the 0.6 Kb rrnB transcription terminator were separated from the gel by 1% agarose gel electrophoresis and linked to the T4 ligase to prepare a pCSF453 expression vector (see FIG. 5). Therefore, pCSF451 (KCCF 10838: Korean spawn association microorganisms), pCSF 452, pCSF 453 expression vector is a protein gene is removed as in Example 6, but mRNA transcription terminators are different expression vectors. These vectors were transformed into E. coli W3110 strain in the same manner as in Example 3 above, and the hG-CSF gene was expressed with 3-IAA while culturing in LB medium, and then the production rate of hG-CSF was measured. Recorded at 4. It can be seen from Table 4 that the amount of hG-CSF production of the cloned expression vector was changed to be greater than that of pCSF 450.
[실시예 8]Example 8
대장균 W3110을 숙주세포로 했을 때 hG-CSF 생성량이 가장 높은 pCSF 451 발현벡터(상기 실시예 7 참조)를 유전학적 성질이 다른 대장균 숙주세포로 형질전환시켰을 때 숙주세포의 변경에 따른 hG-CSF 생성량을 측정하고 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. hG-CSF 생성량은 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였다.When the pCSF 451 expression vector (see Example 7) having the highest amount of hG-CSF production when E. coli W3110 was used as the host cell was transformed into E. coli host cells having different genetic properties, the amount of hG-CSF production according to the change of the host cell. Was measured and the results are shown in Table 5 below. hG-CSF production amount was measured in the same manner as in Example 3.
[실시예9]Example 9
hG-CSF를 대량생산하기 위하여 W3110/pCSF451 생산균주를 유가배양법으로 발효공정을 실시하였고, 이때 균체생성량과 hG-CSF의 발현율을 조사하였다. 발효 공정은 KF-30L 발효조(한국 발효기사)를 이용하여 하기 표 7의 배지 조성으로 실시하였다.In order to mass-produce hG-CSF, the fermentation process of W3110 / pCSF451 production strain was carried out by the oil price cultivation method, and cell production and expression rate of hG-CSF were investigated. The fermentation process was carried out using the KF-30L fermenter (Korean fermentation company) in the medium composition of Table 7 below.
C. 유도제C. Inducers
3-베타-인돌 아크릴산 500㎎을 에탄올 50ml에 녹여 사용한다.500 mg of 3-beta-indole acrylic acid is dissolved in 50 ml of ethanol.
유도제는 사용하기 30분 전에 조제한다.Inducers are prepared 30 minutes before use.
D. 종균 배양액D. Spawn Cultures
암피실린을 50㎍/㎖ 되게 첨가한 LB배지 500ml에 종균 W3110/pCSF451을 접종하고 37℃ 교반배양기에서 16시간 배양하여 사용한다.Inoculate spawn W3110 / pCSF451 to 500 ml of LB medium containing 50 μg / ml of ampicillin and incubate for 16 hours in a 37 ° C. incubator.
멸균한 복합배지(표 7의 A) 10l에 종배양액 500ml을 접종하여 배양을 시작하였다. 배양을 시작한지 3시간 후(A600 : 7-10)에 유가 배양용 배지중50% 박토트립톤 200ml을 첨가하여 균체의 성장이 대수기에 접어들도록 유도하였다. 이후 1-2시간 배양을 계속하여 균체의 흡광도가 20-30에 이르면 유기배양용 배지중 50% 글루코즈와 25% 카사노미산을 100ml/시간의 속도로 첨가하였다. 카사미노산은 트립토판이 결여된 질소원으로서 배지중에 첨가해도 트립토판의 양을 증가시키지 않는다. 따라서 균체의 흡광도가 40 내지 50에 이르면 배지중에 존재하였던 트립토판은 거의 고갈되며 이때 3-베타-인돌아크릴산 500㎎을 첨가하여 hG-CSF의 발현을 유도하였다.The culture was started by inoculating 500 ml of the seed culture solution in 10 l of sterile complex medium (A of Table 7). Three hours after the start of the cultivation (A600: 7-10), 200 ml of 50% bactotryptone in the fed-batch culture medium was added to induce the growth of the cells. Then, the culture was continued for 1-2 hours, and when the absorbance of the cells reached 20-30, 50% glucose and 25% casanomic acid in the organic culture medium were added at a rate of 100 ml / hour. Casamino acid is a nitrogen source lacking tryptophan and does not increase the amount of tryptophan even when added to the medium. Therefore, when the absorbance of the cells reached 40 to 50, tryptophan in the medium was almost depleted, and 500 mg of 3-beta-indolacrylic acid was added to induce the expression of hG-CSF.
이후 유기배양용 배지의 첨가를 균체의 성장속도에 따라 점차 증가시켰고 배양말기에는 300ml/시간의 속도로 첨가하였다. 배양은 hG-CSF의 발현 유도 후 5 내지 7시간 계속하였으며, 교반속도는 배양초기에 200rpm으로 시작하여 용존산소량에 따라 시간당 50rpm씩 증가시켜 배양말기에는 700 내지 800rpm이 되도록 하였다. 배양종료시 균체의 흡광도는 100 내지 120에 이르렀으며(제6도 참조) 이때 균체의 흡습중량은 100-120 g/ℓ였다. 균체를 회수하여 SDS-폴리아크릴 아미드 젤 전기영동방법으로 hG-CSF의 발현율을 분석하고 그 결과를 제7도에 도시하였다. 제7도로부터 hG-CSF가 대장균 전체 단백질중 30 내지 40%에 이르는 높은 발현율을 나타냄을 알 수 있었다.Since the addition of the medium for the organic culture was gradually increased in accordance with the growth rate of the cells and at the end of the culture was added at a rate of 300ml / hour. The culture was continued for 5 to 7 hours after induction of hG-CSF expression, and the stirring speed was started at 200 rpm at the beginning of the culture and increased by 50 rpm per hour depending on the amount of dissolved oxygen to be 700 to 800 rpm at the end of the culture. At the end of the culture, the absorbance of the cells reached 100 to 120 (see FIG. 6). At this time, the hygroscopic weight of the cells was 100-120 g / l. The cells were collected and analyzed for expression rate of hG-CSF by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and the results are shown in FIG. Figure 7 shows that hG-CSF shows a high expression rate of 30 to 40% of the E. coli total protein.
[발명의 효과][Effects of the Invention]
상기 실시예1 내지 8로부터 본 발명의 hG-CSF 재조합 벡터들은 hG-CSF유전자, 벡터내의 SD부위와 개시코돈사이의 염기서열 및 전사터미네이터의 염기 서열을 변형시키고 벡터내의 롭 단백질을 제거함으로서 종래의 재조합 벡터들에 비하여 숙주세포내에서 월등히 안정하게 과발현됨을 알 수 있었으며, 아울러 본 발명의 벡터는 적당한 숙주세포와 배양조건에서는 더욱 더 안정하게 발현됨을 알 수 있었다.The hG-CSF recombinant vectors of the present invention from Examples 1 to 8 were modified by modifying the base sequence of the hG-CSF gene, the SD region in the vector and the start codon, and the base sequence of the transcription terminator, and removing the Rob protein in the vector. Compared with recombinant vectors, it was found to be overexpressed in the host cell more stably, and the vector of the present invention was more stably expressed in suitable host cell and culture conditions.
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