KR100199247B1 - Ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 - Google Patents

Ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 Download PDF

Info

Publication number
KR100199247B1
KR100199247B1 KR1019950701274A KR19950701274A KR100199247B1 KR 100199247 B1 KR100199247 B1 KR 100199247B1 KR 1019950701274 A KR1019950701274 A KR 1019950701274A KR 19950701274 A KR19950701274 A KR 19950701274A KR 100199247 B1 KR100199247 B1 KR 100199247B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ras
oligonucleotides
oligonucleotide
seq
antisense
Prior art date
Application number
KR1019950701274A
Other languages
English (en)
Inventor
브레트피. 모니아
수잔엠. 프레이어
데이비드제이. 엑커
Original Assignee
파샬 비. 린네
아이시스 파마큐티컬즈 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 파샬 비. 린네, 아이시스 파마큐티컬즈 인코포레이티드 filed Critical 파샬 비. 린네
Priority claimed from PCT/US1993/009346 external-priority patent/WO1994008003A1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR100199247B1 publication Critical patent/KR100199247B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3527—Other alkyl chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/125—Modifications characterised by incorporating agents resulting in resistance to degradation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 정상 또는 활성화된 형태의 인체의 ras 유전자 발현의 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 인체의 ras 유전자로부터 유도한 RNA 또는 DNA와 특히 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공하며 이러한 올리고뉴클레오티드는 상기 특이 혼성화를 효과적이도록 하는 인식하기에 충분한 뉴클레오티드 단위 및 수를 가진다. 본 발명은 인체의 H-ras 및 Ki-ras와 특이 혼성화 가능한 올리고뉴클레오티드도 제공한다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 연구 목적 뿐만 아니라 진단 용도로 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포나 조직에서 ras 유전자 발현의 조절 및 활성화된 ras 유전자 발현의 특이 조절을 위한 방법도 제공한다. 아울러 H-ras 또는 Ki-ras 유전자의 활성화로 인하여 생기는 질병의 진단, 검출 및 치료 방법이 개시되어 있다.

Description

[발명의 명칭]
ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
[발명의 상세한 설명]
본 출원은 미합중국 특허 제715,196호(1991. 6. 14. 출원), 제958,134호(1992. 10. 5. 출원) 및 제08/007,996호(1993. 1. 21. 출원)의 일부 계속출원이며, 상기의 각각의 본 명세서에서 참고로 인용되었다.
[발명의 분야]
본 발명은 종양형성에 영향을 미치는 활성형태로 간혹 전환되는 천연의 유전자인 ras 유전자의 발현저해에 관한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 ras 유전자의 활성형 발현의 특이성 억제에도 관련된다. 더 나아가 본 발명은 세포나 조직에서 ras 유전자의 정상형과 활성형의 검출에 목적을 두고 있으며, 연구시약 및 연구 및 진단에 대한 키트(Kit)의 기초를 제공할 수 있다. 또한 본 발명은 ras 유전자의 활성에 의해 생기는 질병의 치료에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 ras 유전자의 발현저해를 위한 안정된 올리고뉴클레오티드, ras RNA 표적에 대한 친화도가 향상되도록 더 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 ras RNA표적의 서열-특이성 제거를 위해 더욱 더 변형된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이기도 하다.
[발명의 배경]
세포성장 및 분화를 직접 또는 간접적으로 조절하는 세포질 유전자의 변형은 암의 주원인으로 생각되고 있다. 인간의 종양 형성을 야기시키는 종양유전자(oncogene)라 불리우는 유전자는 30족(family)으로 나눌 수 있다. 그러한 것 중의 하나인 ras 유전자 족은 종종 인간 종양에서 돌연변이된 것으로 발견된다. 정상 상태에서 ras 유전자에 의해 생산된 산물은 정상 세포 성장과 성숙에 관여하는 것으로 생각된다. 단백질 산물의 세 개의 중요한 위치중 하나에서 아미노산의 변화를 야기시키는 rras 유전자의 돌연변이는 암을 유발시킬 수 있는 형태로 전환된다. 그러한 돌연변이를 가지는 유전자를 활성화되었다고 한다. ras 활성화로 되는 점 돌연변이는 발암물질이나 다른 환경 요소에 의해 유도되는 것으로 생각된다. 소장의 선암(adenocarcinomas)의 90% 이상, 대장의 선종(adenoma; 腺腫)과 선암의 약 50%, 폐 선암과 갑상선의 악성종양의 약 50% 및 급성 골수 백혈병과 myelodysplastic 증후군과 같은 피에 관련된 불치병이 활성화된 ras 종양유전자를 포함하는 것으로 알려졌다. 전체적으로 인간 종양의 약 10 내지 20%가 세 개의 ras 유전자(H-ras, K-ras, 또는 N-ras) 중 하나의 돌연변이를 함유한다.
최근에는 개개의 종양 세포에서 활성화된 종양유전자의 발현을 저해하면 세포가 좀더 정상적인 성장으로 되돌아 올 수 있다고 여겨진다. 예를 들어 퍼라미스코등(Nature 1985, 314, 639-642)은 활성화된 ras 유전자로 인해 악성 상태로 전환된 세포에 ras 유전자의 단백질 산물에 결합 가능한 항체를 미세주사로 주입시키면서 세포가 증식 속도를 늦추고 좀더 정상 형태를 가진다고 주장하였다. 이것은 전형적인 암세포의 비제어된 성장에 활성화된 ras 유전자의 산물이 관여한다는 사실을 지지하는 것으로 해석되고 있다.
H-ras 유전자는 즉시 치료하지 않으면 갑작스럽게 죽게되는 유전병인 롱(long) Q-T증후군이라 불리우는 심각한 부정맥(不整脈) 심장병을 야기시키고 있다. 종종 불규칙한 심장고동이 시작되기 전에 어떤 징후도 나타나지 않는다. H-ras 유전자가 롱 Q-T 증후군의 원인이 되는가는 불확실하다. 그러나 상기 증후군의 유전성과 H-ras 유전자를 둘러싸는 크로모좀 11 구역의 특이한 변형체의 존재 사이에 상당히 강한 상관관계가 있다. 그러므로 H-ras 유전자는 롱 Q-T 증후군으로 인한 갑작스런 심장병 죽음이라는 심각한 사태의 유용한 지표가 된다.
ras 유전자의 발현을 조절할 수 있는 조성물질, 특히 ras 유전자의 활성 형태의 발현을 조절할 수 있는 조성물질의 제공이 요청되고 있다. 동물에서 ras 유전자의 검출 및 진단방법의 제공도 요청된다. 또한 ras 유전자 활성화로 인한 질변의 진단 및 치료 방법의 제공도 요구된다. 나아가 ras 유전자의 검출 및 연구를 위한 개선된 연구 키트 및 시약도 요청되고 있다.
종양유전자 발현의 저해는 안티센스 방향(orientatron)으로 Ki-ras 원시 종양유전자(protooncogene)의 2-킬로베이스 단편을 발현시키는 리트로비루스 벡터 또는 플라스미드 벡터를 사용하여 수행할 수 있다(무코파디야 외, (1991) Cancer Research 51, 1744-1748; PCT 특허출원 PCT/US92/01852(WO92/15680); 죠오지 외, (1993) Cancer Research, 53, 1743-1746).
종양유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해는 다양한 종양 유전자족의 역할을 이해하는데 유용한 수단이 된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유전자의 센스 또는 암호화 가닥에 상보적이며 또한 결과적으로 유전자의 mRNA 전사체에 상보적이며 안정되고 특이하게 혼성화할 수 있는 작은 올리고뉴클레오티드이다. 홀트 등(Mol. Cell Biol. 1988, 8, 963-973)은 배양된 HL60 백혈병 세포에 종양유전자 c-myc의 mRNA 전사체와 특이하게 혼성화 가능한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 첨가하면 증식을 억제하고 분화를 유도한다는 것을 보였다. c-myb 종양유전자의 mRNA 전사체와 특이 혼성화할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 골수 백혈병 세포계의 증식을 억제한다는 사실도 알려졌다(안포시 외, Proc. Nat1. Acad. Sci. 1989, 86, 3379-3383). 또한 HL60 배양된 백혈병 세포증식 뿐만 아니라 c-myc 종양유전자의 단백질 산물의 발현도 c-myc mRNA와 특이하게 혼성화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 억제된다는 사실도 알려졌다(워크 스트롬 외, Proc. Nat. Acad. Sci. 1988, 1028-1032). 미합중국 특허 제4,871,838호(보스 외)는 N-ras의 코돈 13에서의 돌연변이를 검출하기 위한 상기 돌연변이에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 공개하고 있다. 미합중국 특허 제4,871,838호(보스 외)는 또한 ras 단백질을 암호화하는 DNA에서의 돌연변이를 검출하는 탐침(probe)으로서 유용한 분자를 개시하고 있다.
상기 모든 경우에 변형되지 않고 올리고뉴클레오티드의 불안정성이 주요한 문제인데, 이것은 세포질 효소에 의해 분해되기 쉽기 때문이다. PCT/US88/01024(존 외)는 HL60 백혈병 세포성장 및 이들 세포에서 DNA합성을 저해하는 증폭된 c-myc 종양유전자의 해독 개시 구역에 혼성화할 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 티드 등은 활성화된 N-ras 종양 유전자에 특이하게 혼성화하는 메틸포스포네이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 가치를 고려하였는데 생화학적 분해에 내성이 있고 인간의 Ht29 배양세포에서 비독성이었으나 N-ras 유전자 발현을 저해하지는 못하였고 이들 세포에 대해서도 어떠한 영향을 미치지 못한다는 것을 알아냈다(Anti-Cancer Drug Design 1988, 3, 117-127). 쥐의 Balb-ras 유전자의 mRNA 전사체에 특이하게 혼성화할 수 있는 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 이들 유전자의 단백질 산물의 해독을 생체외에서 저해할 수 있다는 것도 알려졌다(창 외, Anti-Cancer Drug Design 1989, 4, 221-232; 브라운 외, Oncogene Research 1989, 4, 243-252). Tm이 생체외에서 ras p21 단백질 산물의 해독을 저해하는 이들 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성과 상관관계에 있지 않다는 것은 공지된 사실이다. 창에 의해 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ras 유전자의 해독 개시 구역과 특이하게 혼성화하기 때문에 상기 올릭뉴클레오티드가 활성화된 ras에 대한 선택성을 보이리라고는 기대되지 않았으며 정상(야생형)과 돌연변이된(활성화된) ras 유전자에 대한 이들 올리고뉴클레오티드의 결합력도 비교되지 않았었다.
헬렌과 그의 동료들은 아크리딘 삽입제 및/또는 소수성 말단에 연결된 9합체 인산이에스테르를 이용하여 활성화된(코돈 12가 G→T 전환(transversion)) H-ras mRNA가 선택적으로 저해됨을 주장하였다. 이 화합물은 낮은 소량의 몰 농도에서 RNase H 및 세포 증식 분석에서 돌연변이 ras 정보를 선택적으로 표적함을 보여주었다(새손-베모아라스 외 EMBO J. 1991, 10, 1111-1118). 창과 그의 동료들도 돌연변이 H-ras 정보의 선택적인 표적을 공개하였다; 이때 표적부위는 A→T 전환을 포함하는 H-ras 코돈 61이었으며, 사용된 올리고뉴클레오티드는 11합체 메틸포스포네이트 또는 그것의 소랄렌(psoralen) 유도체이다.
활성을 나타내기 위해 7.5~150μM의 농도를 필요로 하는 이들 화합물은 정상적인 p21에 관련된 돌연변이 H-ras p21 발현을 선택적으로 저해하는 면역침전에 의해 보여졌다(창 외, Brochemistry 1991, 30, 8283-8286).
염기 부정합에 대한 ΔΔG°37을 증가시키는 변형된 뉴클레오티드는 선택성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. ΔΔG°37은 가장 안정된 부정합에 대한 1~2kcal/mol에서 가장 불안정한 부정합에 대한 5~6kcal/mol까지의 범위를 가진다. 그러므로 가능하면 돌연변이 표적부위에 대한 선택성을 최대화하기 위해 안정된 부정합(예를 들어 G→A)을 만들어내는 돌연변이가 불안정한 부정합(예를 들어 C→G, U→G, A→C)을 만들어내는 돌연변이보다 덜 바람직하다. 이러한 예로는 일가족에 특이하게 나타나는 알제이머 병(Alzheimer's disease)과 관련된 상염색체 우세 돌연변이에서 발견될 수 있다.
β-아밀로이드 전구체 유전자의 세 개의 서로 다른 점 돌연변이가 이 질병과 함께 분리된 것으로 알려졌다. 이들 돌연변이는 G→A(ΔΔG°37=+1.2kcal/mol), G→T(ΔΔG°37=+3.9kcal/mol), 및 T→G(ΔΔG°37=6.3kcal/mol)를 포함한다(고아테외, Nature 1991, 349, 704-706; 뮤렐 외, Science 1991, 254, 97-99, 채티어-할린 외, Nature 1991, 353, 844-846). 이 경우 T→G 돌연변이를 표적시키는 것은 돌연변이 β-아밀로이드에 대한 안티센스 올리뉴클레오티드의 가장 큰 선택성을 생성시킨다고 여겨진다.
변형되지 않은 인산이에스테르 뉴클레오시드간 결합 또는 변형된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드만 결합을 DNA 올리고뉴클레오티드가 세포질 RNase H에 의한 표적 RNA의 절단을 활성화시킨다(다글레 외, Nucleic Acids Research, 1990, 18, 4751; 다글레 외, Antisense Research And Development 1991, 1, 11; 및 다글레 외, Nucleic Acids Research 1991, 19, 1805). RNase H는 RNA:DNA 이중가닥의 RNA가닥을 절단하는 앤도뉴클레아제이다; 그러므로 이 효소의 활성으로 RNA 표적이 절단되며, 안타센스 올리고뉴클레오티드의 표적 RNA 발현을 저해하는 성능을 크게 증진시킨다.
발더 등은 Xenopus배(embryo)에서 인산이에스테르 결합 및 포스포로티오에이트 결합 모두 또한 엑소뉴클레아제에 의해 분해되기 쉽다는 것을 지적하였다. 그러한 뉴클레아제 분열은 RNase H 활성화에 유용한 올리고뉴클레오티드를 급격히 고갈시키므로 유해한 것이다. PCT공개 WO/89/05358(발더 외)는 3' 말단 뉴클레오시드간 결합 위치에서 변형되어 RNase H의 기질로 있는 동안 뉴클레아제에 내성이 있게 되는 DNA 올리고뉴클레오티드를 공개하고 있다.
RNase H에 대한 기질 요구사항이 충족되는 한 올리고뉴클레오티드 변형의 유용한 특성을 이용하려는 시도는 결국 키메라 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것으로 진행되었다(길스 외, Anti-Cancer Drug Design 1992, 7, 37; 해아세 외, Biochemistry 1990, 29, 8793; 다글레 외, Nucleic Acids Research, 1990, 18, 4751; 다글레 외, Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1805). 키메라 올리고뉴클레오티드는 둘 또는 그 이상의 화학적으로 다른 구역을 포함하며 각각은 적어도 하나의 뉴클레오티드로 구성된다. 전형적으로 이들 올리고뉴클레오티드는 (예를 들어 뉴클레아제 내성 증가, 세포 포착 증가, RNA 표적에 대한 결합 친화도 증가와 같은)하나 또는 그 이상의 유용한 특성을 제공하는 변형된 뉴클레오티드 구역과 RNase H 분열을 유도하는 능력을 보유하는 변형되지 않은 구역을 포함한다.
이들 접근법은 가장 흔한 메틸포스포네이트와 같은 다양한 주쇄 변형으로 이용되는데, 이것만으로는 RNase H에 대한 기질이 될 수 없다. RNase H-민감성 인산이에스테르 결합을 포함하는 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 생체외에서 RNase H에 의한 표적 RNA절단을 유도할 수 있는 것으로 알려졌다. 대장균 RNase H절단을 유도하는데 필요한 최소한의 인산이에스테르의 길이는 3이나 4 결합 중 하나인 것으로 보고되었다(쿠아틴 외, Nucleic Acids Research 1989, 17, 7253; 푸돈 외, Nucleic Acids Research 1989, 17, 9193). 생체외 포유류의 RNase H 절단 분석법을 사용한 유사한 연구결과도 보고되었다(에그라월 외, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 1990, 87, 1401). 이들 경우에 메틸포스포네이트를 함유하거나 서로 상이한 인산이에스테르 길이를 포함하는 일련의 주쇄 변형에 대해 절단 효능을 실험하였다. 이러한 특성을 가지는 올리고뉴클레오티드에 의해 유도되는 효과적인 RNase H 절단을 위해 필요한 최소한의 인산이에스테르 길이는 5결합길이이다. 더 최근의 연구 기록에 의하면 메틸포스포네이트/인산이에스테르 키메라는 생체외에서 대장균 RNase H를 사용할 때에 표적 RNA 분열에 대한 증가된 특이성과 효능을 보였다(길스 외, Anti-Cancer Drug Design 1992, 7, 37). 이들 화합물은 또한 Xenopus 난모세포 및 포유류의 배양 세포에서 효과적인 안티센스 저해자라는 것도 보고되었다(다글레 외, Nucleic Acids Res. 1990, 18, 4751; 포트 외, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 1991, 88, 1516).
PCT 공개 WO/90/15065(프로엘더 외)는 RNase H가 활성화 되는 동안 엑소뉴클레아제에 저항성을 부여하기 위해 3' 및/또는 5' 말단에서 포스포르아미다이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 결합에 의해 갭이 형성된 키메라 올리고뉴틀레오티드를 공개하고 있다. PCT공개 WO/91/12323(페더슨 외)는 RNase H를 활성화시키지 않는 변형된 주쇄(메틸포스포네이트, 포스포로모폴리데이트(Phosphoromorpholidate). 포스포로피레라지데이트(Phosphoropiperazidate) 또는 포스포르아미다이트)을 가지는 두 개의 구역이 RNase H절단을 활성화하는 중앙의 디옥시뉴클레오티드 구역 양측면에 위치하는 키메라 올리고뉴클레오티드를 공개하고 있다. 2'-디옥시올리고뉴클레오티드는 포스포르아미다이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 결합 부분사이에 인산이 에스테르 연결된 뉴클레오티드의 짧은 부분을 위치시킴으로써 RNase H 활성화를 계속 제공하는 한편 뉴클레아제 분열에 내성이 있어 안정하였다(다글레 외, Nucleic Acids Research 1990, 18, 4751; 다글레 외 Antisense Research And Development 1991, 1, 11; 및 다글레 외, Nucleic Acids Research 1991, 19, 1805). 포스포르아미다이트 함유 올리고뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에는 안정하였으나 각 포스포르아미다이트 결합은 포스포르아미다이트 함유 올리고뉴클레오티드의 Tm 측정값에 있어서 1.6℃ 손실된 것으로 나타났다(다글레 외, Nucleic Acids Research 1991, 19, 1805). 그러한 Tm 값의 손실은 올리고뉴클레오티드와 그것의 표적부위 가닥의 혼성화의 감소를 나타내는 지표이다. 올리고뉴클레오티드가 RNase H에 대한 기질임에도 불구하고 RNase H에 의한 절단 효능은 mRNA에 약하게 혼성화되어 있기 때문에 낮은 것으로 관찰되었다(세손-베모아라 외, EMBO Jurnal 1991, 10, 1111).
RNase H-민감성 디옥시 잔기와 혼합된 2' 리보스 변형을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 주쇄 키메라만큼 특정적이지는 않지만 키메라 올리고뉴클레오티드가 골격의 변형에 한정되는 것은 아니다. 상보적인 RNA 가닥내의 특이 부위에서 대장균 RNase H에 의한 절단을 유도하는 변형되지 않은 디옥시 갭을 포함하는 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드(단독으로는 RNase H에 대한 기질이 될 수 없다)도 사용되었다(유럽 특허공개 260, 032 및 오트수카 외 FEBS Lett. 1987, 215, 327-330). 이들 화합물은 효과적인 표적 RNA 절단을 위한 4염기의 최소한의 디옥시 갭을 필요로 한다. 그러나 이런 성질을 가지는 올리고뉴클레오티드에 대해 포유류의 RNase H를 사용하여 절단 효능은 실험되지 않았고, 세포에서의 안티센스 활성에 대해서도 시험 되지 않았다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대해 불안정하였다.
0-메틸을 제외한 2' 리보스 변형의 RNase H 유도 능력 및 안티센스 활성에 대한 연구는 지극히 제한되어 있었다(쉬미트 외, Biochem. Biophys. Acta 1992, 1130, 41).
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 RNase H를 이용한 표적 RNA 가닥의 절단이 유용할 것이라고 인식되는 한편 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 저항성 및 혼성화의 정확성(fidelity)도 또한 중요하다고 여겨진다. RNase H를 활성화시킬 수 있고 동시에 혼성화 특성을 유지시키거나 증진시키고 뉴클레아제 내성을 제공하는 물질 및 방법에 대한 요구가 오랫동안 있어 왔다. 또한 안티센스 활성을 증진시키는 물질 및 방법도 요청되고 있다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 ras 유전자 발현을 저해하는 ras mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ras 유전자의 활성화된(돌연변이) 형태의 발현을 특이성 있게 억제하는 ras mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ras 유전자 발현을 억제하는 안정된 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ras mRNA에 상보적이며 ras mRNA 표적 부위에 대한 친화도를 증가시켜 ras 유전자의 발현을 억제하는 안정된 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ras mRNA에 상보적이며 RNase H의 기질의 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 세포의 증식을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다. 또한 암세포의 증식을 억제하는 방법도 본 발명의 목적이다.
정상적(야생형)인 ras 유전자의 활성화된 형태로 돌연변이의 검출도 본 발명의 목적이다.
형태학적으로 유사한 종양의 감별 진단 및 활성화된 ras 유전자의 존재에 기초한 위험한 질병의 규명 또한 본 발명의 목적이다.
야생형이 ras 유전자의 활성화된 형태로 돌연변이에 의해 생기는 질병의 진단 및 치료 방법을 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이다.
[발명의 요약]
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 인체 ras 유전자로부터 유도한 DNA 또는 RNA에 상보성을 제공한다. 본 발명의 바람직한 한 실시예로서 인체 H-ras 유전자에서 유도한 DNA 또는 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 유전자의 해독 개시 코돈에 상보적인 것이 바람직하며 CAT 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
본 발명의 다른 구체적 예로서 활성화된 H-ras 유전자의 코돈 12에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 제공되며 바람직하게 CAC 서열을 포함한다. 그러한 예에서 활성화된 H-ras 유전자의 돌연변이된 코돈 12와 우선적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 상기 예에서, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 GAC 서열을 포함한다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 약제학적으로 수용가능한 담체에 용이하게 그리고 바람직하게 존재할 수 있다.
다른 바람직한 구체적인 예에서는 인체 Ki-ras 유전자에서 유도한 DNA나 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 Ki-ras 유전자의 5'-비해독역, 3'-비해독역, 코돈 12 또는 코돈 61에 상보적이다. 본 발명의 다른 바람직한 구체적인 예에 따른 올리고뉴클레오티드는 활성화된 Ki-ras 유전자의 코돈 12에 상보적이며, ACC 서열을 포함한다. 다른 구체적인 예에서는 활성화된 Ki-ras 유전자의 돌연변이된 코돈 12에 상보적이며 우선적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 상기 예에서 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 ACC 서열을 포함한다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 약제학적으로 수용하는한 담체에 용이하게 그리고 바람직하게 존재할 수 있다.
뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성이 증가하도록 변형된 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 뉴클레아제에 대한 증가된 내성은 적어도 하나의 황-함유 뉴클레오티드에 의해 수행되는 것이 바람직하며 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트가 가장 바람직하다.
다른 바람직한 구체적인 예에 따른 ras mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 저해하고 동시에 뉴클레아제에 대한 증가된 내성 ras mRNA 표적 부위에 증가된 결합 친화도를 가지며 RNase H에 대한 기질로 제공된다.
결합 친화도의 증가는 당성분의 2' 위치에 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드의변형에 의해 수행되는 것이 바람직하며, 2'-0-알킬, 2'-0-알킬아미노 또는 2'-플루오로 변형으로 구성되는 것이 가장 바람직하다.
몇몇 바람직한 예로서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 키메라 올리고뉴클레오티드이며 상보적인 ras mRNA에 대한 결합 친화도를 증가시키는 적어도 하나의 구역 및 RNase H에 대한 기질인 구역으로 구성된다.
상기 예에서 RNase H 기질인 구역의 양측면에는 증가된 ras mRNA 결합 친화도를 가지는 두 구역이 존재한다.
본 발명의 다른 측면은 세포나 조직에서 인체 ras 유전자 발현의 조절 및 활성화되는 돌연변이를 보유하고 있는 것으로 생각되는 세포나 조직에서의 활성화된 ras 유전자 발현을 특이성 있게 조절하는 방법을 목적으로 한다.
본 발명의 몇몇 구체적인 예는 ras 유전자의 발현을 억제하고 활성화된 ras 유전자의 발현을 특이성 있게 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 부가적으로 세포나 조직에서 ras 유전자의 검출 및 상기 돌연변이 유전자를 보유하는 것으로 생각되는 세포나 조직이며 활성화된 ras 유전자의 특이서 검출 방법을 목적으로 한다.
상기 방법은 상기의 유전자를 검출하기 위한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드로 인체 ras 유전자를 포함하고 있는 것으로 여겨지는 세포나 조직을 접촉시키는 것으로 구성된다.
본 발명의 또 다른 측면은 ras 유전자의 활성화로 되는 돌연변이를 보유한다고 여겨지는 동물의 진단 및 치료 방법을 목적으로 한다. 상기 방법은 상기의 유전자 발현을 억제, 상기 유전자의 활성화로 의한 질병의 치료 또는 이들의 진단을 효율적으로 하기 위하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드로 동물, 세포, 조직 또는 동물에서 취한 체액을 접촉시키는 것으로 구성된다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 H-ras 해독 개시 코돈(AUG)에 표적되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 ras-루시페라제 융합 단백질 발현이 투여량-감응 저해를 보여주는 막대 그래프이다. 발현정도는 루시페린 첨가시 발광량에 의해 분석된 바와 같이 루시페라제 활성의 측정값에 의하여 평가하였다.
제2도는 활성화된 H-ras의 돌연변이된 코돈-12 구역에 표적되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 ras-루시페라제 융합 단백질 발현의 투여량-감응 저해를 보여주는 막대 그래프이다.
제3도는 안티센스 포스포로티오에이트 화합물에 의한 ras-루시페라제 융합 단백질 발현의 단일-투여량 저해를 보여주는 막대 그래프이다. 발현정도는 루시페린 첨가시 발광량에 의해 분석된 바와 같이 루시페라제 활성의 측정값에 의하여 평가하였다.
제4도는 활성화된 H-ras 유전자와 특이 혼성화 가능한 13개의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대해 얻어진 데이터를 요약한 표와 막대 그래프이다. 각 올리고뉴클레오티드 길이, 특이 혼성화되는 활성화된 ras 유전자 구역, 및 ras-루시페라제 융합 단백질의 발현을 저해하는 활성이 나타나 있다.
제5도는 ras mRNA 표적 서열(5'에서 3'으로 보여짐) 및 H-ras 해독 개시 코돈(AUG) 및 코돈 12구역의 위치와 서열을 보여주고 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 3'에서 5'으로 나타난다. 제5도(a)는 AUG에 표적되는 두 개의 20합체(2502 및 2503) 및 코돈 12에 표적되며 길이가 5 내지 25인 일련의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 제5도(b)는 ras mRNA 표적 서열에 관계된 올리고뉴 클레오티드 2502, 2503, 6168 및 2570을 나타낸다.
제6도는 올리고뉴클레오티드 2502, 2503, 6168 및 이들 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 균일한(uniform) 2'-0-메틸화된 변형의 다양한 투여량에 의한 ras-루시페라제 저해를 보여주는 막대 그래프이다.
제7도는 다양한 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 돌연변이 (빗금쳐진 막대) 및 정상(검은색 막대) ras-루시페라제의 안티센스 저해를 보여주는 막대 그래프이다.
제8도는 투여량-의존성 방법으로 ras의 저해를 나타내는 일련의 8개 패널(Pannel)이다. 실선은 야생형에 대한 저해 활성이며 점선은 활성화된 ras에 대한 저해 활성을 나타낸다.
제9도는 47-단위 H-ras RNA 헤어핀 표적에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 결합을 나타내는 두 개의 도면이다. 제9도(a)는 올리고뉴클레오티드 농도와의 함수로서 균일한 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드(디옥시 넘버=0)로 이루어진 헤어핀 표적 및 9 염기 디옥시 갭을 갖는 2'-0-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드(디옥시 넘버=9)로 이루어진 헤어핀 표적의 겔 이동 분석을 나타낸 도면이다. 레인 1~8은 하기 올리고뉴클레오티드 농도를 포함한다: (1) 0 M: (2) 10-11M: (3) 10-10M: (4) 10-9M: (5) 10-8M: (6) 10-7M: (7) 10-6M: (8) 10-5M: . 제9도(b)는 쉬프트된 헤어핀 표적 분율 대 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도의 관계를 나타낸 도면이다. ◇:디옥시 넘버=17;:디옥시 넘버=9; ▲:디옥시 넘버=7; O:디옥시 넘버=5; △:디옥시 넘버=3; ■:디옥시 넘버=1; □:디옥시 넘버=0. (삽입도면:올리고뉴클레오티드 2570 서열로 나타낸 47-단위 H-ras 헤어된 표적의 구조)
제10도는 2'-0-메틸 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 상보적 H-ras RNA의 RNaes H 의존성 절단을 나타내는 겔을 나타낸 도면이다. 레인을 지정한 명칭은 중심부 디옥시 갭의 길이를 의미한다.
제11도는 ras 코돈-12 RNA서열에 표적되는 포스포로티오에이트 2'-0-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성을 나타내는 두 개의 도면이다. 제11도(a)는 균일한 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드, 균일한 디옥시 올리고뉴클레오티드 및 중심부 1-, 3-, 5-, 7- 또는 9- 염기 디옥시 갭을 포함하는 키메라 2'-0-메틸 올리고뉴클레어티드의 단일-투여량 활성(100nM)을 나타내는 막대 그래프이다. 제11도(b)는 균일한 디옥시(▼) 또는 중심부 4-(■, ◆), 5-(), 7-(+) 또는 9-염기(▲) 디옥시 갭을 포함하는 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드의 투여량-의존성 활성을 나타내는 선그래프이다.
제12도는 ras-루시페라제에 대한 균일한 디옥시 포스포로티오에이트 및 짧아진 키메라 올리고뉴클레오티드의 안티센스 저해 활성을 나타내는 막대 그래프이다.
제13도는 ras에 표적되는 포스포로티오에이트 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드를 사용하여 디옥시 갭 길이와의 함수로서 안티센스 활성 및 RNase H활성 사이의 상관관계를 나타낸 선그래프이다.
제14도는 7-염기 디옥시 갭을 포함하는 포스포로티오에이트 2'-변형된 키메라 올리고뉴클레오티드의 투여량 감응 안티센스 활성을 나타낸 선그래프이다.
(▲), 균일한 디옥시 포스포로티오에이트; (■), 2'-0-펜틸 키메라; (), 2'-0-프로필 키메라; (◆), 2'-0-메틸 키메라; (▼), 2'-플루오로 키메라.
제15도는 포스포로티오에이트와 인산이에스테르 주쇄 및 2'-0-메틸과 2'-디옥시 뉴클레오티드의 다양한 조합을 가지는 키메라 올리고뉴클레오티드에 의한 ras-루시페라제의 투여량-의존성 올리고뉴클레오티드 저해를 나타내는 막대 그래프이다.
제16도는 누드 마이신에서 인체 A549 세포 종양에 대한 ISIS 2503의 항-종양 저해 활성을 나타내는 선그래프이다.
제17도는 누드 마이스에서 인체 A549세포 종양에 대한 양이온성 지질과 함께 투여된 ras 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503의 항-종양 저해 활성을 나타내는 선그래프이다.
제18도는 포스포로티오에이트(P=S) 주쇄를 가지는 2' 디옥시올리고뉴클레오티드에 비교되는 다양한 2' 당 변형 및 인산이에스테르(P=0)골격을 가지는 올리고뉴클레오티드의 Ha-ras에 대한 저해 활성을 나타낸 막대 그래프이다.
제19도는 세 개의 인체 대장암 세포주인, Calu1, SW480 및 SW620에서의 Ki-ras mRNA발현의 안티센스 저해를 나타내는 막대 그래프이다.
제20도는 Ki-ras 특이성 올리고뉴클레오티드인 ISIS 6957 및 ISIS 6958에 의한 SW480 인체 악성종양 세포주 증식의 저해를 보여주는 막대 그래프이다.
제21도는 돌연변이 Ki-ras 코돈-12에 표적되는 올리고뉴클레오티드로 처리될 때 야생형 Ki-ras를 발현시키는 HeLa 세포에 비교되는 돌연변이 Ki-ras를 발현시키는 인체 악성종양 SW480 세포에서의 Ki-ras mRNA 발현의 선택적인 저해를 나타내는 막대 그래프이다.
[발명의 상세한 설명]
악성 종양은 일련의 단계, 암 세포의 성장 조절 특성의 상실로 이르는 점차적인 변화, 즉 연속적인 조절되지 않는 증식, 주변 조직을 침투하는 능력, 및 다른 기관 부위로 전이하는 능력을 거쳐 발전한다. 상체내에서의 주의 깊은 연구에 의해 일반 세포와 암세포의 성장 특성을 규명하게 되었고 세포성장 및 분화를 조절하는 특정 단백질을 규명하게 되었다. 또한, 주의 깊게 조절된 정량적인 생체내 검증에서 세포 형질전환의 연구는 형질전환 세포의 표현형을 유도할 수 있는 특정 유전자를 규명하게 되었다. 그러한 암-유발 유전자 또는 종양유전자는 그들의 단백질 산물의 발현 조절의 변화를 일으키는 돌연변이를 통해 형질전환-유도 성질을 획득하는 것으로 보여진다. 몇몇 경우 그러한 변화는 프로모터나 인핸서와 같은 비-암호화 DNA 조절구역에서 일어나, 종양유전자의 전사활성을 변화시키고 그들의 유전자 산물의 발현을 지나치게 하거나 저하시킨다. 다른 경우에, 유전자 돌연변이는 종양유전자의 암호화 구역에서 일어나, 비활성, 과활성, 또는 정상적인(야생형)유전자 산물과 다른 활성을 나타내는 변화된 유전자 산물을 생성하게 된다.
현재까지 30 이상의 세포 종양유전자족이 규명되었다. 이들 유전자는 그들의 하부 세포 위치 및 그들의 단백질 산물 작용의 추정 기작 양자에 의해 분류된다. ras 종양유전자는 원형질 막 내부에 위치한 관련 단백질을 암호화하는 유전자족이다. ras 단백질은 아미노산 수준에서 상당히 보존되어 있으며, GTP와 높은 친화도와 특이성을 갖고 결합하며, GTP 분해효소(GTPase)활성을 갖는다. ras 유전자 산물의 세포 작용은 알려지지 않았으나, GTP 결합 단백질 또는 G 단백질로 알려진 신호-전달 단백질류와 상당한 염기서열 동족성을 갖는 것과 관련하여, 그들의 생화학적 성질은 ras 유전자 산물이 원형질막을 통과하여 세포밖 신호의 전달에 관련된 기본적인 세포 조절작용에서 기초적인 역할을 한다는 것은 제안되어져 있다. H-ras, K-ras, N-ras로 표시된 세 ras 유전자는 포유류 게늄에서 규명되었다. 포유류 ras 유전자는 그들의 암호화 염기서열 내의 단일의 점 돌연변이에 의해 형질전환-유도 성질을 획득한다. 자연적으로 발생하는 ras 종양유전자의 돌연변이는 코돈 12, 13, 및 61에서 일어난다. H-ras, K-ras, N-ras의 염기서열이 알려져 있다(카폰 외, Nature 302 1983, 33-37; 칸 외, Anticancer Res. 1987, 7, 639-652; 할 및 브라운, Nucleic Acids Res. 1985, 13, 5255-5268). 인체 종양에서 가장 일반적으로 검출되는 활성 ras 돌연변이는 GGC로부터 GTC로의 염기변화로 인하여 ras 단백질 산물의 GTP 분해효소 조절 구역에서 글리신이 발린으로 치환되는 H-ras 유전자의 코돈 12에서 일어난다(타빈 외, Nature 1982, 300, 143-194; 레디 외, Nature 1982, 300, 149-152; 타파로스키 외, Nature 1982, 300, 762-765). 이 하나의 아미노산 변화는 ras 단백질 기능의 정상적인 조절을 없애는 것이며 이에 의해 정상적으로 조절된 세포 단백질이 연속적으로 활성인 것으로 바뀌게 된다. 정상적인 ras 단백질 기능의 조절 해제는 정상적인 성장에서 악성 성장으로의 전환을 가져오게하는 것으로 여겨진다.
본 발명은 인체의 ras 유전자의 발현을 저해하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 인체의 ras 유전자로부터 유도된 선택된 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본 발명은 또한 ras의 돌연변이 형태의 발현을 선택적으로 저해하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명에서 올리고뉴클레오티드는 리보핵산 또는 디옥시리보핵산의 올리고머 또는 폴리머를 의미한다. 이 용어는 천연 염기, 당 및 당간 결합(주쇄)으로 구성되는 올리고머와 유사한 기능을 하는 비-천연 부분을 함유하는 올리고머를 모두 포함하는 것이다. 그러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 자주 천연 형태보다 바람직한데 이는 예를 들어, 증가된 세포내 흡수성 및 뉴클레아제의 존재하에서의 증가된 안정성과 같은 성질 때문이다.
본 발명에 따른 몇몇 바람직한 올리고뉴클레오티드의 특별한 예로는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 짧은 사슬의 알킬이나 시클로알킬 당간 결합 또는 짧은 사슬 헤테로원자나 헤테로고리 당간결합을 포함할 수 있다. CH2-NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-O-CH2, CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2및 O-N(CH3)-CH2-CH2주쇄 (인산이에스테르는 O-P-P-CH2이다)를 가진 결합이 가장 바람직하다. 또한 모르폴리노(morpholino) 골격구조를 갖는 올리고뉴클레오티드도 바람직하다(수머톤과 웰러, 미합중국 특허 제5,034,506호). 단백질-핵산(PNA) 주쇄와 같은 다른 바람직한 구체예에서는 올리고뉴클레오티드의 인산이에스테르 주쇄가 폴리아미드 주쇄로 대치되었고, 염기는 폴리아미드 주쇄의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합되어 있다(닐슨, 에그홀름, 버그, 부카르트 공저, Science. 1991, 254, 1497). 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 하기에 열거된 것 중의 하나를 포함하는 알킬 및 할로겐-치환 당성분을 함유할 수 있다: OH, SH, SCH3, F, OCN, O(CH2)nNH2또는 O(CH2)nNH3(여기에서 n은 1에서 약 10까지이다); C1내지 C10저급알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬; C1; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 분해그룹; 접합체(conjugate); 리포터 그룹; 삽입기; 올리고뉴클레오트디의 약물역학적 특성을 향상시키는 기(基); 또는 올리고뉴클레오티드의 약물활성을 증가시키는 기 및 유사한 특성을 갖는 치환체, 올리고뉴클레오티드는 펜토푸라노실기 대신에 시클로부틸과 같은 당 성분을 가질 수 있다.
다른 바람직한 예는 적어도 하나 이상의 변형된 염기 형태를 포함한다. 그러한 변형된 염기의 몇몇 특정 예로는 2-(아미노)아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로 치환된 알킬아데닌이 있다.
본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시키기 위해 변형되 뉴클레오티드, ras mRNA에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위해 변형된 뉴클레오티드, 및 RNAse H에 대한 기질인 뉴클레오티드를 동시에 포함할 수도 있다. 바람직한 일례에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 ras mRNA에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위해 변형된 하나 이상의 구역, 및 RNAse H에 대한 기질인 구역을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 보다 바람직한 예에서, RNAse H에 대한 기질인 구역의 양측면에 ras mRNA에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위해 변형된 두 구역이 존재하게 된다. 그러한 변형의 효과는 ras 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해를 매우 증가시키게 된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 50 핵산 염기로 구성된다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 30 핵산 염기로 구성되는 것이 바람직하며 보다 바람직하게는 약 13 내지 25 핵산 염기로 구성된다. 알려진 바와 같이 핵산 염기 단위는 인산이 에스테르 또는 다른 결합에 의해 인접한 핵산 염기 단위에 적절하게 결합된 염기-당 조합이다.
본 명세서에서 혼성화는 왓슨-크릭 염기쌍으로도 알려진, 반대 핵산 가닥 또는 한 핵산 가닥의 두 구역 상의 상보적인 염기쌍 사이의 수소결합이다. 구아닌과 시토신은 상보 염기의 예이고 이들 사이에는 세 개의 수소결합이 형성된다. 특이적으로 혼성화 가능하다는 의미는 비-표적 염기서열에 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합을 피하기에 충분히 상보적이라는 것이다. 이것은 오리고뉴클레오티드가 특이적으로 혼성화 가능한 그 표적 핵산의 염기서열에 100% 상보적일 필요는 없다는 것이다.
[ras-루시페라제 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해]
H-ras 해독 개시 코돈 또는 활성화된 H-ras의 코돈-12 점 돌연변이에 표적된 일련의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 실시예 2~5에 기재된 ras-루시페라제 리포터 유전자 계를 사용하여 검색하였다. 이 초기 계열중에서, 6개의 올리고뉴클레오티드는 ras-루시페라제 활성의 상당하고 재생가능한 저해를 가지는 것으로 밝혀졌다. 이들 올리고뉴클레오티드(모두 포스포로티오에이트)의 염기서열, 염기서열 참조 번호 및 염기 서열 ID 번호는 표 1에 나타내었다.
제1도는 정상인 ras-루시페라제 리포터 유전자 또는 돌연변이 ras-루시페라제 리포터 유전자를 발현하는 세포를 포스포로티오에이트 2503(염기서열 ID 번호:2)으로 농도를 증가시키면서 처리하였을 때 투여량-감응 실험을 도시한 것이다. 이 화합물은 H-ras 전사의 해독 개시 코돈에 표적된다. 제1도에 나타냈듯이, 세포를 이 올리고뉴클레오티드로 처리하면 정상 및 돌연변이 ras 표적 모두에 약 50nM의 IC50 값을 나타내면서, ras-루시페라제 활성의 투여량-의존성 저해를 나타낸다. 대조 올리고뉴클레오티드는 20염기 길이의 랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. 결과는 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 감염세포에서 루시페라제 활성의 %로 나타내었다. ras 해독 개시 코돈에 표적된 올리고뉴클레오티드가 정상 및 돌연변이 ras 발현 모두에 효과적일 것으로 예측되는데 이는 두 표적이 AUG 해독 개시 부위 주변구역에 동일한 염기서열 조성을 가지기 때문이다.
제2도는 돌연변이된(활성화된) H-ras RNA의 코돈-12 점 돌연변이에 표적된 화합물인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 2570(염기서열 ID 번호:3)으로 처리한 세포에서 투여량-감응 실험을 도시한 것이다.
대조 올리고뉴클레오티드는 20 염기 길이의 랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. 결과는 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 감염세포에서 루시페라제 활성 %로 나타냈다. 도시한 바와 같이, 이 올리고뉴클레오티드의 농도를 증가시키면서 세포를 처리했을 때 ras-루시페라제의 돌연변이 형태 또는 정상 형태를 발현하는 세포에서 ras-루시페라제 활성의 투여량-의존성 저해를 가져왔다. 그러나 낮은 농도에서 데이터를 주의깊게 살펴보면 올리고뉴클레오티드 2570이 정상 형태에 비해 돌연변이 형태에 거의 3배의 선택성을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 사실, 2570은 ras-루시페라제의 돌연변이 형태에 대해 약 100nM의 IC50 값을 갖는데 비해 돌연변이 되지 않은 형태에 대해서는 약 250nM의 IC50 값을 나타내었다.
제3도는 H-ras의 해독 개시 코돈 또는 코돈 12점 돌연변이에 표적된 단일 투여량(0.5μM)의 올리고뉴클레오티드로 처리한 ras-루시페라제의 정상 형태 또는 돌연변이 형태를 발현하는 세포에서의 전형적인 실험결과를 도시한 것이다. 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 표 1에 나타낸 것으로 시험하였다. 대조 올리고뉴클레오티드(2504)는 20염기 길이의 랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. 결과는 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 감염세포에서 루시페라제 활성 %로 나타냈다. 제3도에 도시한 바와 같이, ras 해독 개시 코돈에 표적된 화합물 2503(염기서열 ID 번호:2)가 ras 루시페라제 활성을 저해하는데 가장 효과적이었다. 활성화된 H-ras의 코돈-12 지점 돌연변이에 표적된 세 화합물 가운데 17-합체 올리고뉴클레오티드 2570(염기서열 ID 번호:3)만이 정상 형태에 비하여 ras-루시페라제의 돌연변이된 형태에 대한 선택성을 나타냈다. 이것은 또한 제4도에도 나타나 있는데, 제4도에는 활성화된 H-ras 유전자에 상보적인 모든 13 안티센스 올리고뉴클레오티드와, 야생형 ras의 코돈-12 구역에 상보적인 스크램블된 대조 올리고뉴클레오티드(1966) 및 대조 올리고뉴클레오티드(2907)에서 얻은 데이터를 종합해 놓았다. 각 올리고뉴클레오티드의 길이, 상보되는 구역 및 ras-루시페라제 융합 단백질의 발현 억제 활성을 도시하였다. 코돈-12 점 돌연변이에 표적된 긴 포스포로티오에이트는 rras-루시페라제 발현에 대한 기본적인 안티센스 활성은 나타내나, ras-루시페라제의 돌연변이 형태의 발현을 선택적으로 저해하지는 않았다. 17 뉴클레오티드 이하 길이의, 코돈-12 점 돌연변이에 표적된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 ras-루시페라제의 어떤 형태에도 활성을 나타내지 않았다. 이것은 효과적인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성이 ras 염기서열에 표적되었다는 것을 나타낸다.
[H-ras와 특이적으로 혼성화 가능한 안티센스 올리고뉴클레오티드]
H-ras AUG코돈에 표적된 세 개의 20-염기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 실시예 2~5에 기재된 일시적 감염 검증에 의해 ras-루시페라제 발현을 저해하는 능력을 비교하였다. 결과는 제5도(a) 및 제5도(b)에 나타냈다. 이들 올리고뉴클레오티드, ISIS 2502(염기서열 ID 번호:1), 2503(염기서열 ID 번호:2) 및 6168(염기서열 ID 번호:7)은, 표 2에 나타나 있으며, HeLa 세포 중에서 단일-투여량(100nM)에서 rras-루시페라제 발현의 저해를 시험하였다. 세 AUG-표적된 올리고뉴클레오티드는 모두 ras-류시페라제 발현을 저해하는데 효과적이었다. 이들 세 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 각 당에서 2'-0-메틸 변형으로 제조되었다. ISID 2503(염기서열 ID 번호:2)의 2'-0-메틸화된 변형 또한 ras-루시페라제 발현을 저해했다. 이것은 제6도에 도시하였다.
[올리고뉴클레오티드 길이는 안티센스 활성 및 특이성에 영향을 미친다]
H-ras 코돈 12 점 돌연변이에 표적된 올리고뉴클레오티드도 ras-루시페라제의 발현을 저해하는데 효과적이었다. 5 내지 25 염기 길이 범위의 일련의 열한개의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제조하여 실시예 2~5에 기재된 일시적 감염 검증으로 돌연변이체 및 야생형의 ras-루시페라제를 저해하는 능력을 시험하였다. 올리고뉴클레오티드는 표 2에 나타냈다. 100nM 올리고뉴클레오티드 농도에서 15 염기 길이 이상의 올리고뉴클레오티드는 돌연변이 H-ras 표적의 발현을 저해하였다. 야생형 ras-루시페라제 발현보다 돌연변이체의 선택적인 저해는 15 내지 19염기 길이에서 관찰되었다. 최대의 선택성은 17-합체 2570(염기서열 ID 번호:3)에서 관찰되었으며 약 4배였다. 2570이 염기서열-특이성 방법으로 작용한다는 것을 확인하기 위해 야생형 H-ras 표적에 완전히 상보적이도록 중심의 아데노신 잔기를 시토신으로 치환한 이 화합물의 변종(2907; 염기서열 ID 번호:19)를 시험하였다. 따라서, 이 올리고뉴클레오티드는 돌연변이 H-ras 염기서열과 완전히 혼성화되었을 때 올리고뉴클레오티드/RNA 이중나선의 중심에서 하나의 부정합을 포함하게 된다. 제7도에 도시한 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 2907은 돌연변이 ras-루시페라제에 비해 야생형 ras-루시페라제 발현을 선택적으로 저해하였으며, 그 차이는 올리고뉴클레오티드 투여량 100nM에서 약 5배였다.
돌연변이 코돈-12 구역에 상보적인 두 개의 16-합체 및 두 개의 18-합체(제5도 및 표 2)를 실시예 2~5에 기재한 대로 시험하였다. 제8도는 투여량-의존성 방법으로 13, 15, 16, 17, 18 및 19 염기의 올리고뉴클레오티드에 대해 측정한 안티센스 활성 및 돌연변이 선택성 실험결과를 도시한 것이다. 이 시험결과는 돌연변이 H-ras 염기서열에 활성인 화합물이 선택성도 나타낸다는 것이며; 16 염기 길이의 올리고뉴클레오티드(염기서열 ID 번호:14 및 염기서열 ID 번호:15) 및 17 염기 길이의 올리고뉴클레오티드(염기서열 ID 번호:3)가 최대의 선택성을 나타냈다(각각 4배 내지 5배). 13 염기 화합물인 2568(염기서열 ID 번호:12)은 어떤 시험 농도에서도 안티센스 활성을 나타내지 않았다.
[디옥시 갭을 가진 키메라 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드]
돌연변이-선택성인 17-합체(2570)의 염기서열에 기초하여, 말단구역이 2'-0-메틸 뉴클레오시드로 구성되고 중심 잔기가 디옥시 갭을 형성한 일련의 키메라 포스포로티오에이트 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 디옥시 잔기의 수는 0(완전히 2'-0-메틸) 내지 17(완전히 디옥시)였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 표 3에 나타냈다.
이들 올리고뉴클레오티드는 실시예 6에 기재된 혼성화 효율, 실시예 8에 기재된 포유류 RNase H를 사용한 생체외에서의 직접적인 RNase H 분해 능력, 및 안티센스 활성으로 특정되었다. 완전한 길이의 H-ras mRNA에 대한 안티센스 활성은, 실시예 9에 기재된 대로, H-ras 유전자 발현을 리포터 유전자 루시페라제에 연결된 ras-감응 인핸서를 사용해 관찰하는 일시적인 동시-감염 리포터 유전자계로 측정하였다.
[단일 가닥 25-합체 RNA 표적에 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 혼성화]
제5도 및 표 2에는 코돈 12 G→U 점 돌연변이를 포함하는 활성화된 H-ras mRNA에 표적된 15 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 염기서열이 나타나있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 5 내지 25 염기 길이이고 점 돌연변이 주변에 중심을 갖고 있다. 4μM 올리고뉴클레오티드 농도에서 돌연변이 및 야생형의 25-합체 RNA 표적을 저해하는 이들 안티센스 포스포로티오에이트의 녹는점(Tm)을 측정하였다. Tm은 사슬길이가 증가함에 따라 높아졌고, 일정 사슬길이에서는 야생형 표적보다 돌연변이 표적에 대해 혼성화될 때 Tm이 더 높았다. 올리고뉴클레오티드 2907은 2570의 중심 아데노신 잔기를 시토신으로 치환하여 야생형 H-ras 표적에 완전히 상보적으로 만든 포스포로티오에이트 17-합체 변종이다. 예견된 바와 같이, 야생형에 대한 이 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 대한 녹는점은 돌연변이 표적에 대한 것보다 높고, 이제 이것은 점 돌연변이 부위에서 올리고뉴클레오티드/RNA 이중나선의 하나의 부정합을 포함하게 된다. 돌연변이 H-ras 표적에 완전히 상보적인 17-합체 포스포로티오에이트(2570)에 대해 올리고뉴클레오티드 농도에 대한 Tm의 의존성으로부터 열역학적 변수를 또한 얻을 수 있다. 이들 데이터는 돌연변이 표적 및 야생형에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화 사이의 자유에너지 차이(ΔΔG°)을 측정하는데 사용하였다. 주어진 올리고뉴클레오티드에 대해, ΔΔ℃는 올리고뉴클레오티드 농도에 대한 Tm의존성으로부터 얻을 수 있다(보러 외, J. Mol. Biol. 1974, 86m 843-853). 2570에 대한 ΔΔG°은 +18kcal/mole로 계산되었다.
야생형 ras보다도 돌연변이를 표적하는 최대 선택도는 ΔΔG°이 증가할 수 록 증가한다. 따라서, ΔΔG°을 증가시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형은 선택성을 증가시킨다. 그러한 변형중의 하나는 2,6-디아미노퓨린으로서, 이것은 dA가 U에 결합하는 것보다 강하게 결합하고 dA가 G에 결합하는 것보다 약하게 결합하여 A-U→A-G 부정합에 대한 ΔΔG°을 증가시키게 되는 것으로 여겨진다. RNase H의 기질 요건 또한 본 발명에 따른 선택성을 얻도록 정립할 수 있다. 효소가 부정합을 제거하거나 결합할 수 없으면, 부정합 RNase H 인식부위에 위치에는 키메라 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것에 의해 ΔΔG°에 따라 얻어지는 것 이상으로 부가적인 선택성을 얻을 수 있다. 이것은 RNase H가 완전히 합치된 이중나선과 하나의 부정합을 포함한 것을 구별할 수 있는 경우에도 발견되었다.
[짧은 올리고뉴클레오티드 표적에 디옥시 갭 올리고뉴클레오티드의 혼성화]
실시예 6에 기재된 대로 25-합체 합성 올리고리보뉴클레오티드 전체에 대한 2'-0-메틸 디옥시 갭 계열의 혼성화 분석을 행한 결과 주어진 올리고뉴클레오티드에 대한 Tm 값이 2'-0-메틸 함량과 직접적으로 상관관계에 있다는 것을 알 수 있었다. 2'-0-메틸 변형은 디옥시 치환기로 대치했을 때 변형당 1.5℃씩 Tm값이 감소했다. 이 실험에서 2'-0-메틸 변형을 포함한 올리고뉴클레오티드의 Tm 값은 동일한 염기서열의 완전한 디옥시 화합물의 Tm값보다 높았다.
[구조적인 RNA 표적에 디옥시 갭 올리고뉴클레오티드의 혼성화]
코돈 12 구역에 안정한 스탭 루프 구조를 포함하는 큰 H-ras 표적에 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 실험을 더 행하였다. 구조적인 H-ras 표적에 대한 안티센스 혼성화의 2'-0-메틸 변형 효과는 실시예 7에 기재된 겔 이동 분석으로 측정하였다.
제9도에 나타냈듯이, 완전한 디옥시 17-합체는 헤어핀 표적으로 가장 불안정한 이중나선을 형성했고; 완전한 2'-0-메틸 17-합체는 가장 안전한 이중나선을 형성했다. 이들 올리고뉴클레오티드에서 디옥시 갭 크기가 감소함에 따른 2'-0-메틸 잔기의 수의 증가는 이중나선의 안정성을 증대시켰다.
RNA 표적의 2차 및 4차 구조는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 영향을 준다. ras 헤어핀 표적에 여러 구역에 혼성화하는 일련의 11-합체 키메라 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. ISIS 5050는 스템 구역의 왼쪽에 혼성화된다(제9도에 헤어핀이 도시된 바와 같음). ISIS 5056은 루프의 왼쪽에 혼성화된다. ISIS 5091은 루프의 오른쪽에 ISIS 5147은 스템의 오른쪽에 혼성화된다. 이들은 모두 2'-0-메틸 구역이 양측면에 존재하는 중심의 5-디옥시 갭을 가진 균일한 포스포로티오에이트이다. 루프의 왼쪽에 표적된 11-합체만이 표적에 측정가능하도록 결합하였다. 다른 111-합체는 측정가능하게 결합하지 않았다. 이들 올리고뉴클레오티드를 길게 전환시키기도 했는데; 이들 13-합체 올리고뉴클레오티드는 모두 헤어핀 표적에 측정가능하게 결합했으며 루프의 왼쪽에 표적된 올리고뉴클레오티드가 겔 이동 분석에서 가장 강한 결합을 한 것으로 나타났다.
[디옥시 갭된 올리고뉴클레오티드에 의해 유도된 RNase H 분해]
상보적 RNA의 RNase H분해를 유도하는 2'-0-메틸 디옥시 갭 올리고뉴클레오티드의 능력을 실시예 8에 기재된 대로 RNase H 공급원으로서 HeLa 핵 추출물을 사용해 생체외 측정을 행했다. 제10도에 도시한 바와 같이, 완전히 변형된 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드 또는 하나의 디옥시 잔기를 포함하는 것에서는 어떠한 분해도 관찰되지 않았다. 셋, 넷, 다섯 일곱 또는 아홉의 디옥시 길이를 가진 올리고뉴클레오티드는 RNase H 분해를 유도할 수 있다. 다섯, 일곱 또는 아홉의 디옥시 갭이 바람직하고 일곱 또는 아홉의 갭이 가장 바람직하다.
[완전한 길이의 ras mRNA에 대한 디옥시 갭된 올리고뉴클레오티드의 안티센스 할성]
2'-0-메틸 변형에 의해 부여된 증가된 표적 친화도를 증가시키는 유익한 특성을 적정 길이의 RNase H-민감성 디옥시 갭을 가진 이들 화합물에 의해 제공되는 안티센스 저해로 알아낼 수 있다. 2'-0-메틸 디옥시 갭 올리고뉴클레오티드에 대해 실시예 9에 기재된 H-ras 트랜스 활성화 리포터 유전자계를 사용해 완전한 길이의 H-ras mRNA에 대한 안티센스 활성시험을 행했다. 안티센스 실험은 처음에는 단일 올리고뉴클레오트디 농도(100nM)에서 행했다. 제11도에 도시한 바와 같이, 다섯 잔기 이상의 디옥시 갭을 포함하는 키메라 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드는 H-ras 유전자 발현을 저해하였다. 이들 화합물은 완전시 디옥시 모화합물보다 더 큰 활성을 나타냈다.
투여량 감응 실험은 네 개의 디옥시 잔기를 포함하는 2'-0-메틸 키메라와 함께, 이들 활성 화합물을 사용하여 행하였다. 제11도(b)에 나타낸 바와 같이, 이들 올리고뉴클레오디드에 의한 완전한 길이의 H-ras의 올리고뉴클레오티드-매개된 저해는 투여량에 의존한다. 가장 활성인 화합물은 7-잔기의 디옥시 키메라로 이것은 완전한 디옥시 올리고뉴클레오티드의 활상보다 약 5배의 활성을 나타낸다.
[짧아진 키메라 올리고뉴클레오티드]
2'-0-메틸 변형에 의해 부여된 증가된 표적 친화도는 짧은 키메라 올리고뉴클레오티드에 활성을 부여하는 것으로 알려졌다. 일련의 짧은 2'-0-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드를 실시예 9에 기재된 대로 Tm 및 안티센스 활성 대 전체길이의 ras에 대해 시험하였다. 표 4는 5염기 또는 7염기 길이의 디옥시 갭을 가진 11, 13, 15 및 17 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드에 대한 Tm을 나타낸 것이다. 완전한 디옥시 13-합체와 대조적으로 2'-0-메틸 13-합체는 둘다 ras 발현을 저해했고, 11-합체중 하나가 활성을 나타냈다. 이것은 표 12에 나타냈다.
상대적인 안티센스 활성 및 키메라 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드에 의해 생체의에서 RNase H 분해를 활성화시키는 능력은 디옥시 길이와 상관관계가 있다(제13도).
[비대칭 디옥시 갭]
키메라 분자의 중심에 디옥시 갭이 있을 필요는 없다. 결합을 증가시키는 2' 위치에서 변형된 한 말단에 그 구역의 뉴클레오티드를 갖고 나머지는 변형되지 않은(2' 디옥시) 키메라 분자도 ras 발현을 저해시킬 수 있는 것으로 나타났다. 디옥시 갭이 17-합체의 5' 또는 3' 측면 또는 분자의 중간에 있는 다른 부위에 위치한 올리고뉴클레오티드 (염기서열 ID번호; 3)(돌연변이 코돈 12에 상보적인 17-합체)는 모두 RNase H 활성화 및 안티센스 활성을 나타냈다. 그러나, 5-염기 갭은 위치에 보다 민감하였으며, 몇 갭 위치는 RNase H의 활성화 및 안티센스 활성에 나쁜 영향을 주었다. 따라서, 7-염기 디옥시 갭이 바람직하다.
[다른 당 변형]
키메라 올리고뉴클레오티드에서 안티센스 활성에 대한 2'-0-메틸 외의 다른 당 변형의 영향을 조사하였다. 이들 변형은 표 5에 나타냈으며, 실시예 6에 기재된 바와 같이 7-염기 디옥시 갭의 양측면에 위치하는 2'-변형되 뉴클레오티드를 갖는 17-합체 올리고뉴클레오티드를 25-합체 올리고뉴클레오티드 상보물과 혼성화했을 때 얻어지는 Tm 값도 기재하였다. 이들 올리고뉴클레오토티드에 대해 2' 위치에서의 알킬 길이와 Tm 사이에 관계가 관찰되었는데, 알킬 길이가 증가하면 Tm이 감소하였다. 2'-플루오로 키메라 올리고뉴클레오티드가 가장 높은 Tm을 나타냈다.
실시예 9에 기재된 트랜스활성화 리포터 유전자 검증을 사용하여 H-ras에 대한 이들 2' 변형된 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성을 시험하였다. 제1-4도 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 이들 2'-변형된 키메라 화합물은 모두 ras 발현을 저해하였으며, 2'-플루오로 7-디옥시 갭 화합물이 가장 활성이 있었다. 중심에 5-디옥시 갭을 가진 2'-플루오르 키메라 올리고뉴클레오티드도 활성이 있었다.
[5-염기 또는 7-염기 디옥시 갭 주변에 2'-0-프로필 구역을 갖는 염기서열 ID 번호]
3의 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 2'-0-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드와 비교하였다. T24 세포내에서의 ras 발현은 7-디옥시 갭 및 균일한 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 2'-0-메틸 및 2'-0-프로필 키메라 올리고뉴클레오티드 모두에 의해 저해되었다. 디옥시 갭이 다섯 뉴클레오티드로 감소되었을 때는 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드만이 ras 발현을 저해하였다.
[암세포에서 H-ras 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해]
ras AUG 구역에 상보적인 두 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(2502, 2503)를 2'-0-메틸 구역이 양측에 존재하는 7-염기 디옥시 갭 및 동일한 염기서열을 갖는 키메라 일리고뉴클레오티드(4998, 5122)와 함께 실시예 10에 기재된 시험을 행했다. 이들 키메라 올리고뉴클레오티드는 표 6에 나타냈다.
화합물 2503은 T24 세포에서의 ras 발현을 71%까지 저해하였고 키메라 화합물(4998)은 ras mRNA를 84%까지 저해하였다. AUG 구역에 또한 상보적인 화합물 2502는 ras RNA 수준을 26%까지 감소시켰고 이 올리고뉴클레오티드의 키메라 변형(5122)은 15% 저해를 나타냈다. 이 검증에는 또한 돌연변이 코돈 12에 표적된 두 올리고뉴클레오티드도 포함되었다. 화합물 2570(염기서열 ID 번호:3)은 ras RNA를 82%까지 감소시켰고 7-디옥시 갭을 가진 이 올리고뉴클레오티드의 2'-0-메틸 키메라 변형(3985)는 ras RNA를 95%까지 감소시켰다.
올리고뉴클레오티드 2570 및 2503에 대해서도 야생형(즉, 활성화되지 않은) H-ras 코돈 12를 갖는 HeLa 세포에서 ras 발현에 대한 효과를 측정했다. 활성화된 코돈 12를 갖는(활성화된 코돈 12를 가진) T24 세포에서 ras발현을 상기 올리고뉴클레오티드 모두가 저해하지만, ras AUG와 특이적으로 혼성화 가능한 올리고뉴클레오티드(2503)만이 HeLa 세포에서 ras 발현을 저해했다. 활성화된 코돈 12와 특이적으로 혼성화 가능한 올리고뉴클레오티드 2570(염기서열 ID 번호:3)은 HeLa 세포에서 ras 발현을 저해하지 않았는데, 이것은 이들 세포에서 활성화된 코돈-12 표적에 결여되었기 때문이다.
활성화된 H-ras의 코돈 12구역에 상보적인 17-합체 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드인 2570과, 2570과 동일한 염기서열을 갖고 각각 5, 7 및 9 염기의 디옥시 갭을 갖는 키메라 포스포로티오에이트 2'-0-메틸 올리고뉴클레오티드 3980, 3985 및 3984(표 3에 기재됨)에 대해 (실시예 10에 기재된 대로) T24 세포에서 ras 발현의 저해를 시험하였다. 완전한 2'-디옥시 올리고뉴클레오티드 2570 및 세 키메라 올리고뉴클레오티드는 T24 세포에서 ras mRNA 수준을 감소시켰다. 화합물 3985(7-디옥시 갭) 및 3984(9-디옥시 갭)은 ras mRNA를 81%까지 감소시켰고 화합물 3980(5-디옥시 갭)은 ras mRNA를 61%까지 감소시켰다. 이 염기서열을 가지나, 5-디옥시(4689) 또는 7-디옥시(4690) 갭의 양측면에 위치하는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 갖는 키메라 올리고 뉴클레오티드는 T24 세포에서 ras mRNA 발현을 저해했고, 7-디옥시 갭이 바람직하였다(82% 저해, vs 5디옥시 갭을 가진 2'-플루오로 키메라는 63% 저해).
[암세포 증식의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해]
활성화된 ras의 코돈 12 구역에 상보적인, 동일 염기서열을 갖는 세 17-합체 올리고뉴클레오티드에 대해 실시예 11에 기재된 T24 암세포 증식에 대한 효과 실험을 하였다. 3985는 2'-0-메틸 뉴클레오티드가 양측면에 존재하는 7-디옥시 갭을 가지고 4690은 2'-0-메틸 뉴클레오티드가 양측면에 존재하는 7-디옥시 갭을 갖는다(모두 포스포로티오에이트). 암세포 증식에 대한 이들 올리고뉴클레오티드의 효과는 노던 블롯 분석에 의해 나타난 ras mRNA 발현에 대한 그들의 효과와 상관관계가 있다; 올리고뉴클레오티드 2570은 세포증식을 61%까지 저해하였고, 2'-0-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드 3985는 82%까지 세포증식을 저해했고 2'-플루오로 키메라 유사체는 93%까지 세포증식을 저해했다.
세포증식에 대한 이들 올리고뉴클레오티드의 투여량-감응 연구에서 저해는 25nN~100nM 범위에서 투여량에 의존하였다. 올리고뉴클레오티드 4690, 3985 및 2570의 IC50 값은 각각 44nM, 61nM 및 98nM이었다. 랜덤 올리고뉴클레오티드 대조군은 시험된 투여량에서 이러한 효과를 나타내지 않았다.
세포증식에 대한 ISIS 2570의 효과는 세포형태 특이적이었다. 이 올리고뉴클레오티드에 의한 T24 세포증식의 저해는 동일 올리고뉴클레오티드(100nM 올리고뉴클레오티드 농도)에 HeLa 세포의 저해보다 4배나 강했다. ISIS 2570은 T24에 존재하나 야생형의 코돈 12를 갖는 HeLa 세포에는 없는 활성화된(돌연변이된) ras 코돈 12에 표적된다.
[주쇄가 변형된 키메라 올리고뉴클레오티드]
상기에서 논의된 올리고뉴클레오티드 균일한 포스포로티오에이트 주쇄를 가졌다. 상기 2' 변형된 키메라 올리고뉴클레오티드는 균일한 인산이에스테르 주쇄에서는 활성을 나타내지 않는다. 갭 구역이 P=S 주쇄를 가진 구역 및 양측에 존재하는 P=O 주쇄를 가진 구역을 가지며, 5-뉴클레오티드 디옥시 갭의 양측면에 존재하는 2'-0-메틸 구역을 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(ISIS 4226). 갭에서 P=O 주쇄를, 그리고 양측면 구역에서 P=S 주쇄를 가진 다른 키메라 올리고뉴클레오티드를 제조하였다(ISID 4223). 이들 올리고뉴클레오티드는 표 7에 나타냈다.
완전히 디옥시이고 하나의 인산이에스테르(ISIS 4248), 두 개의 인산이에스테르(ISIS 4546), 세 개의 인산이에스테르(ISIS 4551), 네 개의 인산이에스테르(ISIS 4593), 다섯 개의 인산이에스테르(ISIS 4606) 또는 열 개의 인산이에스테르(ISIS 4241)를 분자 중심에 포함한 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 또 다른 올리고뉴클레오티드를 합성했다. 이들 올리고뉴클레오티드도 표 7에 나타냈다.
올리고뉴클레오티드를 Dignam etal., Nucleic Acids Res. 1983, 11, 1475-1489에 기재된 대로 뉴클레아제 분해에 대한 감도 측정을 위해 37℃에서 HeLa 세포 조주출물중에서 배양했다. 포스포로티오에이트/2'-0-메틸 윙(wing) 사이에 5-디에스테르 갭을 가진 올리고뉴클레오티드(4233)의 T은 7시간이었다. 포스포로티오에이트/2'-0-메틸 분자내에 5-포스포로티오에이트 갭을 가진 올리고뉴클레오티드의 T은 30분이었다. 하나에서 열까지의 디에스테르 결합을 가진 올리고뉴클레오티드 세트에서, 하나의 인산이에스테르 결합을 가진 올리고뉴클레오티드(4248)는 완전한 포스포로티오에이트 분자 ISIS 2570처럼 뉴클레아제에 대해 안정하여 HeLa 세포 추출물 중에서 5시간 경과 후에도 부해되지 않았다. 2, 3- 및 4-디에스테르 갭을 가진 올리고뉴클레오티드의 T은 5.5시간. 3.75시간 및 3.2 시간이었고 5 및 10 디옥시 결합을 가진 올리고뉴클레오티드의 T은 각각 1.75시간 및 0.9시간이었다.
[주쇄 변형된 키메라 올리고뉴클레오티드의 안xl센스 활성]
안티센스 활성에는 균일한 포스포로티오에이트 주쇄가 필요치 않다. ISIS 4226 및 ISIS 4233을 ISIS 2570(완전히 포스포로티오에이트/완전히 디옥시) ISID 3980(완전히 포스포로티오에이트/디옥시 갭을 가진 2'-0-메틸 윙) 및 ISIS 3961(완전히 인산이에스테르/디옥시 갭을 가진 2'-0-메틸 윙)과 함께 실시예 2~5에 기재된 대로 ras 발현에 대한 영향을 ras-루시페라제 리포터계로 시험하였다. P=S(즉, 뉴클레아제 내성) 갭 구역을 갖는 모든 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 저해하였다. 이것은 제15도에 나타냈다. 분자 중심에 하나의 인산이에스테르(ISIS 4248) 또는 열 개의 인산이에스테르 결합(ISIS 4241)을 포함하는 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 두 개의 완전히 2' 디옥시인 올리고뉴클레오티드에 대해서도 활성검증을 행했다. 하나의 P=O를 포함하는 화합물은 완전한 P=S 분자처럼 활성이 있었으나, 열 개의 P=O를 포함하는 동일 화합물은 완전히 비활성이었다.
[7-염기 디옥시 갭 구역에만 포스포로티오에이트 주쇄를 갖고 2'-0-메틸 또는 2'-0-프로필인 양측면 구역에 인산이에스테르를 갖는 염기서열 ID 번호]
3의 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 2'-0-프로필 양측면 구역을 갖는 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 저해할 수 있었다.
[변형된 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 ras-루시페라제 유전자 발현의 저해]
돌연변이된 코돈 12의 우라실에 상보적인 위치에 2-(아미노)아데닌을 갖는 활성화된 ras의 코돈-12 점 돌연변이에 상보적인 일련의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 아데닌의 2-위치에서 아미노기는 우라실의 2-위치의 산소와 수소결합을 형성할 수 있기 때문에, 일반적인 두 개의 수소결합 대신 세 개의 수소결합이 형성된다. 이것은 활성화된 ras 유전자에 대한 2-(아미노)아데닌-변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 매우 안정화시키는 반면, 야생형 코돈 12에 대한 이 올리고뉴클레오티드의 안정성에는 아무 효과가 없거나 불안정화시키는데, 이는 이 위치에서의 변성된 A-G 부정합 때문이다. 이것은 바람직하게 표적한 대한 변형된 올리고뉴클레오티드의 특이성을 증가시키게 된다.
달리 변형되지 않은 균일하 포스포로티오에이트 17-합체중에 이 위치에 단일 2,6-(디아미노)아데노신을 갖는 올리고뉴클레오티드(염기서열은 2570, 염기서열 ID 번호:3과 동일)는 최소한 2570 염기서열만큼 RNase H 기질로서 효과적이었다. 따라서, 효과적인 안티센스 분자가 될 것으로 예견된다. 동일 염기서열의 디옥시 갭된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에서 이 위치에 단일의 2-(디아미노)아데노신을 갖는 올리고뉴클레오티드도 RNase H활성화를 보여준다.
[생체내 항-암 데이터]
ISIS 2503(염기서열 ID 번호:2)을 실시예 13 및 14에 기재된 대로 생체내 인체 종양에 대한 활성을 평가하였다. 이 연구는 쥐(nude mice)의 피하에 이식되어 이식부위에 종양을 성장시키는 인체의 폐 선암 세포주(A549)를 사용하였다. 이들 세포는 Ha-ras 유전자에 돌연변이를 포함하지 않으나 정상 Ha-ras는 발현시키므로, AUG-배향된 올리고뉴클레오티드 ISIS 2530만 항-암 활성을 형가하였다.
첫 번째 연구에서, 염수중의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 20mg/kg의 투여량으로 복강내 주사에 의해 투여했다. 투약은 종양이 처음으로 보였을 때(종양세포 접종 후 28일) 시작했고 매 2일마다 다시 처리하였다. 제16도에 도시한 바와 같이, 비연관 대조 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 1082로 처리한 후, 종양 성장에 대한 효과는 나타나지 않았으나, Ha-ras-특이성 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503(염기서열 ID 번호:2)에 대해서는 현저한 종양 성장의 저해가 관찰되었다. Ha-ras 화합물의 항암 효과는 첫 투약 후 20일에 관찰되었고 연구기간동안 계속 지속되었다.
두 번째 연구에서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 양이온 지질 조성물(DMRIE:DOPE)로 제조되어 실시예 15에 기재된 대로 피하주사로 투여되었다. 투약은 종양 세포 접종 후 일주일에 시작하였고 4주동안 일주일에 세 번 시행했다. 첫 번째 연구에서 관찰된 바와 같이, Ha-ras-특이성 화합물 ISIS 2503(염기서열 ID 번호:2)는 종양 성장에 현저한 감소를 일으키는 반면 비연관 대조 올리고뉴클레오티드(ISIS 1082)는 뚜렷한 효과를 나타내지 않았다(제17도). 종양부피의 감소는 종양이 가시적으로 나타난 후 20일에 관찰되었고 연구의 잔여기간에 걸쳐 계속되었다.
[세포에서 2'-변형된 인산이에스테르 올리고뉴클레오티드의 안정성]
세포에서 안티센스 활성을 위해서는 뉴클레아제 안전성을 부여하는 올리고뉴클레오티드의 변형이 필요하다. 당의 2' 위치에서의 어떤 변형은 어떤 주쇄 변형없이 세포에서 안티센스 효과를 나타내기에 충분한 뉴클레아제 내성을 부여하는 것을 알 수 있었다. 제18도에 도시한 바와 같이, 균일하게 2'-프로폭시 변형된 인산이에스테르 올리고뉴클레오티드(염기서열 ID 번호:3)는 같은 염기서열을 갖는 포스포로티오에이트 2'-디옥시 올리고뉴클레오티드와 동일한 수준에서 투여 후 24시간에 T24 세포의 Ha-ras 발현을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 균일한 2'-에폭시 인산이에스테르 올리고뉴클레오티드도 동일한 활성을 나타냈다. 2'-펜톡시 변형도 2'-프로폭시만큼의 활성을 나타냈다.
[Ki-ras에 대해 활성인 안티센스 올리고뉴클레오티드]
올리고뉴클레오티드는 인체의 Ki-ras 종양유전자의 암호화 구역 및 5'-비해독역, 3'-비해독역에 상보적이 되도록 고안하였다(맥그라쓰 외, (1983) Nature 304, 501-505). 암호화 구역에 상보적인 올리고뉴클레이티드는 Ki-ras-매개된 형질전환을 일으키는 돌연변이 부위로 알려진 코돈 12 및 16 그리고 형절전환에 관련되지 않는 것으로 알려진 코돈 38에 표적된다. 올리고뉴클레오티드는 표 8에 나타냈다.
Ki-ras 종양유전자의 코돈 12에 돌연변이를 포함하는 세 개의 대장암 세포주를 저해하는 안티센스 할성에 대해 12개의 Ki-ras-특이성 올리고뉴클레오티드를 스크린해서 Ki-ras mRNA 레벨을 측정하여 평가하였다. 제19도에 도시한 바와 같이, 시험 화합물의 절반이 Ki-ras 전사에 대한 현저한 저해 활성(40% 저해 이상)을 나타냈고 가장 활성인 화합물은 5'- 및 3'-비해독 구역에 표적된 것이었다. 그러나 Ki-ras 발현의 현저한 저해는 야생형 코돈 12 및 61에 저항하도록 배향한 화합물에서도 관찰되었다. 뚜렷한 활성을 나타내는 화합물은 모두 시험된 세 암 세포주에 대해 효과적이었다.
이 화합물의 투여량 감응 분석은 5'-UTR에 표적된 ISIS 6958 및 ISIS 6957이 이 계열의 올리고뉴클레오티드 가운데 가장 강력한 Ki-ras 저해자라는 것을 나타낸다. 이들 올리고뉴클레오티드에 대해 Ki-ras 형절전환된 세포주의 증식을 저해하는 능력을 관찰하였다. 대장암 세포주 SW480을 단일 투여량의 올리고뉴클레오티드(200nM)로 처리하고 5일에 걸쳐 세포수를 측정하였다. 제20도에 도시한 바와 같이, Ki-ras특이성 올리고뉴클레오티드는 둘다 SW480 세포의 증식에 대해 효과적 저해자였고, ISIS6957(염기서열 ID 번호:21)이 ISIS 6958(염기서열 ID 번호:20)보다 더 큰 활성을 나타냈다. 이러한 활성 차이는 Ki-ras mRNA 발현의 저해와 상관관계가 있다.
[정상 Ki-ras에 비한 돌연변이 Ki-ras의 저해 선택성]
Ki-ras에 표적된 올리고뉴클레오티드를 관찰하여 정상 Ki-ras에 비해 돌연변이 Ki-ras를 선택적으로 저해하는 능력을 살펴보았다. 돌연변이 Ki-ras를 발현하는 SW480 세포주(코돈 12, G→T 전환) 및 정상 Ki-ras를 발현하는 세포주(HeLa)를 사용하였다. Ki-ras의 5'-비해독구역에 표적된 20합체 포스포로티오에이트인 ISIS 6957, 염기서열 ID 번호:21과 Ki-ras 코돈 12 구역에 표적된 15-합체 포스포로티오에이트인 ISIS 7453, 염기서열 ID 번호:32의 두 올리고뉴클레오티드를 시험했다. 처리후 24시간에 Ki-ras mRNA 수준을 측정하였다. 코돈-12 배양된 화합물을 돌연변이 Ki-ras를 발현하는 세포주에 효과적이다. 그러나 제21도에 도시된 바와 같이, 5'-비해독역에 표적된 Ki-ras 올리고뉴클레오티드는 두 세포주 모두에서 Ki-ras의 발현을 상당히 억제하였다. 돌연변이 Ki-ras에 대한 선택성은 올리고뉴클레오티드 농도와 RNA 표적에 대한 친화도에 의존하는 것을 알 수 있었다.
[디옥시 갭을 가진 Ki-ras 올리고뉴클레오티드]
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(염기서열 ID 번호:21, Ki-ras의 5'-비해독역에 표적됨)를 6 또는 8 뉴클레오티드 길이의 중심 2'-디옥시 갭 구역의 양측면에 존재하는 2'-0-메틸 변형을 갖도록 합성하였다. 갭이 형성된 올리고뉴클레오티드는 노던 블롯 분석으로 측정했을 때 둘다 Ki-ras 발현에 대해 활성을 나타냈다. 균일하게 2'-0-메틸화된 화합물(디옥시 갭 없음)은 비활성이었다. 다른 올리고뉴클레오티드, ISIS 7679(염기서열 ID 번호:33, Ki-ras의 5' 비해독/AUG 구역에 상보적임)도 6- 또는 8-뉴클레오티드 디옥시 갭을 갖도록 합성하였을 때 활성을 나타냈다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 공지의 고체상 합성기술을 통해 용이하게 합성할 수 있다. 그러한 합성에 필요한 장치는 Applied Biosystem사를 비롯한 몇 회사들에 의해 판매되고 있다. 그러한 합성에는 다른 수단들도 사용할 수 있으나, 올리고뉴클레오티드의 실질적인 합성은 당업자에게 용이하다. 이것은 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 마찬가지이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 H-ras 유전자로부터 유도된 mRNA에 상보적이어서 혼성화 가능하도록 고안된다. 그러한 혼성화는 mRNA의 정상적인 기능을 저해하여 세포에서 그 기능을 상실하게 한다. 저해받는 mRNA의 기능은 단백질 해독을 위한 RNA의 전좌(transolation), RNA로부터 단백질의 실질적 해독, 하나 또는 그 이상의 mRNA종을 생성하기 위한 RNA의 접속(splicing), 및 RNA에 의해 개입될 수 있는 독립적인 촉매 활성이다. 그러한 RNA 기능을 저해하는 전체적인 효과는 H-ras 유전자의 발현을 간섭하는 것이다. 본 발명의 몇 올리고뉴클레오티드는 ras mRNA의 RNAse H 분해를 활성화하도록 고안된다.
다른 포유류 ras 유전자, N-ras 및 K-ras의 단백질 생성은 첫 85 아미노산 이상은 H-ras와 동일하다. 세 ras 유전자의 핵산 염기서열은 동일하지 않다고 알려져 있으나, 업자는 본 발명을 이용해 N-ras 및 K-ras 유전자와 특이적으로 혼성화 가능한 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 예는 H-ras mRNA의 코돈 12와 특이적으로 혼성화 가능한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이나, 당업자는 본 발명을 이용해 ras 유전자의 다른 점 돌연변이, 특히 염기서열이 공지되었고 잘 규명된 H-ras, N-ras 및 K-ras의 코돈 12, 코돈 13 및 코돈 61에서의 점 돌연변이와 특이적으로 혼성화 가능한 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 진단, 치료 및 연구시약과 키트로 사용할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 ras 유전자와 혼성화하므로, 이 사실을 입증하기 위해 샌드위치(sandwich) 및 다른 검증을 용이하게 행할 수 있다. 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 ras 종양유전자의 돌연변이(활성화)된 형태에 우선적으로 혼성화하므로, 그러한 검증은 야생형으로부터 활성화된 형태로의 ras 전환에 대해 세포 및 조직을 검색하는데 이용될 수 있다. 그러한 검증은 형태학적으로 유사한 종양의 감별진단 및 ras 유전자 활성화로부터 일어나는 암의 증가된 위험을 검출하는데 이용할 수 있다. ras 유전자와 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 검출하기 위한 수단설비도 널리 수행될 수 있다. 그러한 설비는 효소 결합, 방사능 표지화 또는 다른 적절한 검출수단을 포함할 수 있다. ra 또는 활성화된 ras의 존부를 검출하는 키트를 제조할 수도 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
[실시예]
[실시예 1]
[올리고뉴클레오티드 합성]
디옥시올리고뉴클레오티드 및 그 치환된 형태를 요오드에 의한 산화로 표준 포스포르아미다이트 화학법을 사용하는 자동화된 DNA 합성기(Applied Biosystem모뎀 380B)에서 합성하였다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 위해 표준 산화용기를 아세토니트릴중의 0.2M 3H-1, 2벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드 용액으로 치환해 아인산염 결합의 티아화(thiation)를 단계적으로 행한다. 티아화 대기 단계를 68초로 증가시키고 캡핑 단계를 행하였다. CPG 칼럼으로부터 분해시키고 55℃에서 진한 수산화 암모늄 중에서 탈보호시키고(18시간), 2.5 부피의 에탄올 0.5M NaCl 중에서 두 번 침전시켜 정제하였다. 겔 전기 영동분석을 20% 아크릴 아미드, 8M 우레아, 454 mM 트리스-붕산염 완충액(pH=7.0)중에서 행했다. 올리고뉴클레오티드는 폴리아미드 겔 전기영동에서 완전한 길이의 물질이 80% 이상인 것으로 나타났다.
올리고뉴클레오티드를 자동화된 합성기 및 5'-디메톡시-트리틸 2'-3차-부틸디메틸실릴 3'-0-포스포르아미다이트(American Bionetics)를 사용해 합성했다. A, C 및 G의 엑소시클릭(exocyclic)아민의 보호기는 펜옥시아세틸이었다[Nuc1. Acids Res. 1989, 17, 3501-3571]. 표준 합성 사이클을 변형시켜 테트라졸의 펄스 전달 후 대기 단계를 900초로 증가시켰다. 실온에서 메탄올 암모니아 중에서 밤새 배양하여 탈보호시키고, 진공건조후 테트라히드로푸란중의 1M 테트라부틸암모늄플루오라이드(Aldrich)중에서 실온에서 밤새 배양하여 2'-실릴기를 제거했다. C-18 셉-팍(Sep-Pak)) 카트리지(Waters)를 사용해 정제하고 에탄올로 침전시켰다. 변성 폴리아크릴아미드 전기영동 분석에서 RNA 올리고뉴클레오티드는 90% 이상이 완전한 길이의 물질인 것으로 나타났다.
[실시예 2]
[ras-루시페라제 피포터 유전자 에셈블리]
이 연구에 기재된 ras-루시페라제 리포터는 PCR 기술을 사용해 조합했다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 돌연변이(코돈 12) 및 비-돌연변이(야생형)의 인체 H-ras 유전자 모두의 엑손 1의 5'-구역의 PCR 클로닝에 프라이머로 사용했다. c-H-ras1 활성화된 종양유전자(코돈 12, GGC→GTC)를 포함하는 플라스미드 pT24-C3, 및 c-H-ras 원시-종양유전자를 포함하는 pbc-N1을 American Type Culture Collection사(Bethesda, MD)의 제품으로 구입하였다. 1.9kb 루시페라제 유전자(firefly)를 포함하는 플라스미드 pT3/T7 luc는 Clontech Laboratories(Palo Alto, CA)사의 제품을 사용했다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 주형으로 돌연변이 및 비-돌연변이 H-ras유전자를 사용하는 표준 PCR 반응에 사용하였다. 이들 프라이머는 Nhe Ⅰ 및 HindⅢ 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 양측면이 둘러싸인 정상 및 돌연변이 H-ras의 염기서열 -53 내지 +65(해독개시 자리에 해당)에 상응하는 145 염기쌍의 DNA생성물을 생성한다. 표준절차에 따라 PCR 생성물을 겔 정제하고 침전시키고 세척하여 물에 재현탁시켰다.
P. pyralis 루시페라제 유전자의 클로닝을 위한 PCR 프라이머는 PCR 생성물이 아미노 말단 메치오닌 잔기가 두 개의 아미노산, 아미노말단 리신 잔기와 그 뒤의 루이신 잔기로 대치되는 것을 제외하고는 완전히 길이의 루시페라제 단백질에 암호화하도록 고안되었다. 루시페라제 유전자의 클로닝에 사용되는 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 주형으로, 루시페라제 리포터 유전자를 포함하는, 상용 가능한 플라스미드(pT3/T7-Luc)(Clontech)를 사용하는 표준 PCR 반응에 사용되었다. 이들 프라이머는 유일한 HindⅢ 및 BsshⅡ 제한 엔도누클레아제 자리가 양측면에 존재하는, 루시페라제 유전자에 상응하는 약 1.9kb의 생성물을 생산하였다. 표준절차에 따라 이 분절을 정제하고 침전시키고 세척하여 물에 재현택시켰다.
ras-루시페라제 융합 리포터 유전자의 어셈블리를 완성하기 위해 ras 및 루시페라제 PCR 생성물을 적당히 제한 엔도누클레아제로 절단하여 제한 엔도누클레아제 Nhe Ⅰ, Hind Ⅲ 및 Bssh Ⅱ를 사용하는 스테로이드-유도 가능한 쥐의 유방암 비루스 프로모터 MMTV를 함유하는 발현 벡터에 3-부분 연결(ligation)에 의해 클론시켰다. 생성된 클론은 루시페라제 유전자(firefly)와 프레임에서 융합된 H-ras 5' 염기서열(-53 내지 +65)의 삽입을 가져온다. 생성 발현 벡터는 스테로이드-유도 가능한 MMTV 프로모터의 조절하에 발현되는 ras-루시페라제 융합 생성물을 암호화한다. 이들 플라스미드 구조는 루시페라제에 대해 암호화하는 염기서열을 가진 프레임에서 융합된 활성화된(RA2) 또는 정상(RA4) H-ras 단백질의 아미노산 1-22를 암호화하는 염기서열을 포함한다. ras-루시페라제 융합 mRNA의 해독 개시 코돈은 야생형 H-ras AUG 코돈에 의존한다. 돌연변이 및 정상 H-ras 루시페라제 융합 구조는 표준방법을 사용한 DNA 염기서열 분석으로 확인하였다.
[실시예 3]
[플라스미드 DNA 세포의 감염]
감염은 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons. NY에 Greenberg, M. E.에 의해 기재된 바를 다음의 변형을 가해 수행하였다. HeLa 세포를 60mm 접시에 5×10 세포/접시로 평면배양하고 10μg 또는 12μg의 DNA를 각 접시에 가했는데 그 중 1μg은 라우스 육종 비루스(RSV) 프로모터의 조절하의 쥐의 글루코코르티코이드 수용체를 발현하는 벡터였고 나머지는 ras-루시페라제 리포터 플라스미트였다. 인산칼슘-DNA 공침전물을 3mM EGTA를 함유하는 트리스-완충된 염수[50mM 트리스-C1(pH7.5), 150mM NaCl]로 세척하는 것으로 16-20 시간 후에 제거하였다. 10% 어린 소의 혈청을 포함한 새 배양액을 세포에 가했다. 이때, 세포는 덱사메타손에 의해 리포터 유전자 발현의 활성화전에 미리 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다.
[실시예 4]
[세포의 올리고뉴클레오티드 처리]
플라스미드 감염 후, 세포를 37℃로 예열된 인산염 완충된 염수로 세척하고 5μg/mL N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA)를 포함하는 Opti-MEM을 각 배양판에 가했다(1.0ml/웰). 각 배양판에 50μM용량의 올리고뉴클레오티드를 가하고 37℃에서 4시간 동안 배양했다. 배양액을 제거하고 10% 어린 소의 혈청을 함유하는 DMEM으로 교환하고 지정된 농도의 적정 올리고뉴클레오티드와 세포를 37℃에서 2시간 더 배양한 후 덱사메타손으로 세포를 최종 농도 0.2μM이 되게 처리하여 리포터 유전자 발현을 활성화시켰다. 세포를 회수하여 덱사메타손 자극 후 15시간에 루시페라제 활성을 검증하였다.
[실시예 5]
[루시페라제 검증]
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons, NY에 Greenberg, M. E.에 의해 기재된 대로 세제 트리톤 X-100으로 분해하여 루시페라제를 세포로부터 추출했다. Dynatech ML1000 발광계를 사용해 625μM루시페린(Sigma) 부가에 따라 피크발광을 측정했다. 각 추출물에 대해 추출물의 양을 달리 하여 여러번 루시페라제 검증을 실시했는데 데이터는 검증의 선형 범위로 모아졌다.
[실시예 6]
[녹는점 곡선]
IBM PC컴퓨터와 Gilford Response Ⅱ 분광기를 연결한 Gilford260 분광기를 사용해 260nm에서 흡광도 대 온도 곡선을 측정했다. 완충액은 100mM Na , 10mM 인산염 및 0.1mM EDTA(pH7.0)를 포함했다. 85℃에서 흡광도로부터 측정된 올리고뉴클레오티드 농도는 4μM이었고 흡광계수는 Methods in Enzymol. 1989, 180, 304-325(Puglisi Tinoco)에 기재된 바에 따라 계산했다. Tm 값, 이중나선 형성의 자유에너지 및 결합 상수는 선형 기울기의 기본선을 갖는 두 상태 모형에 데이터를 일치시킴으로써 얻는다(Biochemistry 1983, 22, 256-263(Petersheim. M Turner, D.H.). 기록된 변수들은 최소한 세 실험의 평균이다. 몇 올리고뉴클레오티드에 대해 이중나선 형성의 자유에너지도 또한 Tm 대 log(농도)의 플롯으로 얻었다(Mol. Biol. 1974, 86, 843-853(Borer P.N.외 3인)).
[실시예 7]
[겔 이동 분석]
돌연변이된 코돈 12를 포함하는 47-뉴클레오티드 헤어핀 구조의 ras 표적 전사체를 Biochemistry 1991, 31, 12055-12061(림마 외)에 기재된 바에 따라 제조하고 검출하였다. 100mM 니트륨, 10mM 인산염, 0.1mM EDTA, 100 CPM의 T7-생성 RNA(약 10pM) 및 1 pM 내지 10μM 범위농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 20㎕에서 혼성화 반응을 수행하였다. 반응물은 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 혼성화 후에 생성물을 45mM 트리스-붕산염 및 1mM MgCl(TBM)을 사용하여 20% 변성되지 않은 폴리아크릴 아미드 겔 상에서 분석결정하였다. 전기영동은 10℃에서 수행하였으며 Molecular Dynamics phospborImager를 사용하여 정량하였다.
[실시예 8]
[RNase H분석]
활성화된(코돈 12, G→U)H-ras mRNA의 +23에서 +47의 염기에 대응하는 화학적으로 합성한 25-염기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RNase H분석을 행하였다. 5' 말단-표지된 RNA를 20nM농도로 사용하여 20mM트리스-Cl(pH7.5), 100mM KCl, 10mM MgCl, 1mM 디티오트레이톨, 10μg tRNA 및 4U RNasin을 함유하는 최종 부피가 10㎕인 반응액에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 10배 과량으로 하여 배양하였다. 반응성분을 15분동안 37℃에서 예열시킨 후 서서히 실온으로 온도가 내려가도록 하였다. HeLa 세포 핵 추출액을 포유류 RNase H의 공급원으로 사용하였다. 반응은 핵 추출액 2μg(5㎕)의 첨가에 의해 개시되었으며 37℃에서 10분간 지속되도록 하였다. 페놀/클로로포름 추출에 의해 반응이 종료되었으며 RNA 성분을 에탄올로 침전시켰다. 7M우레아를 포함하는 20% 폴리아크릴아미드 겔 상에 동일 CMP을 부하시켰고 RNA 분해 산물을 전기영동 후 자동방사선법으로 결정하고 가시화시켰다. 분해산물을 Molecular Dynamics Densitometer를 사용하여 정량화하였다.
[실시예 9]
[ras 트랜스활성화 리포터 유전자계]
향상성 SV40 프로모터의 조절하에 활성화된(코돈 12, GGC→GTC)H-ras cDNA 삽입제를 포함하는 발현 플라스미드 pSV2-oil는 Dr. Bruno Tocque(Rhone-Poulenc Sante, Vitry, France)로부터 기증받았다. 이 플라스미드는 스테로이드-유도 가능한 쥐의 유방암 비루스(MMTV) 프로모터의 조절하에 H-ras 발현 플라스미드를 PCR에 의해 제조하기 위한 주형으로 사용되었다. H-ras 암호와 염기서열을 얻기 위해 H-ras 유전자의 570bp암호화 구역을 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 프라이머는 클로닝을 용이하게 하기 위해 5'-구역에 유일한 제한 엔도뉴클레아제를 가지도록 고안하였다. H-ras 코돈 12 돌연변이 종양유전자의 암호화 구역을 포함하는 PCR 산물을 겔 정제하고, 분해하여 클로닝 전에 다시한번 겔 정제하였다. 이 구조는 발현 벡터 pMAMneo(clontech Laboratories, CA)에 삽입제를 클로닝시킴으로써 완성되었다.
ras-감응 리포터 유전3자 pRD053을 ras 발현을 검출하기 위해 사용했다(Owen 외, Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 1990, 87, 3877-3870).
[실시예 10]
[생체내 ras 발현의 노던블롯 분석]
인체의 방광암 세포주 T24를 American Type Culture Collection사로부터 구입하였다. 10% 열-활성화된 송아지 태아의 혈청 및 페니실린과 스트렙토마이신 각각 50 U/㎖로 보충한 L-글루타민(Gibco BRL)으로 McCoy's 5A 배지에서 세포를 성장시켰다. 세포를 10mm 평판에 접종하였다. 70% 교회에 이르렀을 떼 올리고뉴클레오티로 처리하였다. 평판을 10mm 예열된 PBS 및 2.5㎕ DOTMA를 함유하는 Opti-MEM 감소된 -혈청 배지 5㎖로 서척하였다. 그 다음 올리고뉴클레오티드를 필요한 농도로 첨가하였다. 처리한지 4시간 후 배지를 McCoy's 배지로 대치하였다. 올리고뉴클레오티드 처리 후 48시간 후 세포를 회수하고 표준 CsCl 정제방법을 사용하여 RNA를 분리하였다(Kingston R.E., in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY).
인체 상피 암세포주 HeLa 229를 American Type Culture Collection사로부터 구입하였다. 10% 소의 태아 혈청 및 100U/㎖ 페니실린이 보충된 Dullbecco 변성된 Eagle 배지(DMEM)에서 6-웰 평판에 단일층으로서 HeLa 세포를 유지시켰다. 올리고뉴클레오티드 처리 및 RNA 분리는 상기 T24 세포에 기재된 바와 같다.
노던 혼성화; 각 RNA 10μg을 1.2% 아가로스/포름알데히드 겔 상에서 전기영동을 하였고 표준방법에 따라 GeneBind 45 나일론 막(Pharmacia LKB)에 하룻밤동안 전이시켰다(Kingston, R.E., in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY). RNA는 막에 UV-교차결합시켰다. 이중-가닥 P-표지된 탐침을 프라임 유전자 표지키트(Promega)를 사용하여 합성하였다. ras 탐침은 코돈-12에서 GGC가 GTC로 변화되는 돌연변이를 가진 활성화된(돌연변이된) H-ras mRNA의 cDNA의 As1 Ⅰ-Nhe Ⅰ 분절이다. 대조탐침은 G3PDH이었다. 블롯을 QuickHyb혼성화 용액(Stratagene)으로 68℃에서 15분 동안 예비 혼성화시켰다. 10mg/㎖ 연어 혈청 DNA 100㎕와 혼합된 열-변성된 방사성 탐침(2.5×10 계수/2㎖ 혼성화 용액)을 첨가하여 1시간 동안 68℃에서 막을 혼성화시켰다. 블롯을 실온에서 2X SSC/0.1% SDS에서 15분 동안 두 번 세척하였고 60℃에서 0.1X SSC/0.1% SDS로 30분간 한번 세척하였다. 블롯을 자동방사선 사진을 찍고 신호의 강도를 ImageQuant PhosphorImager(Molecular Dynamics)를 사용하고 정량하였다. 7M 우레아 및 RNA 분해 산물을 포함하는 20% 폴리아크릴아미드 겔 상에 부하된 노던블롯을 전기영동, 그 다음 자동방사선 사진으로 결정하고 가시화하였다. 분해산물을 Molecular Dynamics Densitometer를 사용하여 정량하였다.
[실시예 11]
[암세포 증식에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해]
실시예 10에 기재된 대로 세포를 배양해 올리고뉴클레오티드로 처리했다. 세포를 60mm 배양판에 접종해 70% 교회에 이르렀을 때 DOTMA의 존재하에 올리고뉴클레오티드로 처리했다. 시간경과 실험: 첫 날, 세포를 100nM을 최종 농도에서 단일 투여량의 올리고뉴클레오티드로 처리했다. 3일째 성장 배지를 교환하고 5일간 매일 계수 챔버를 사용해 세포를 계수했다. 투여량-감응 실험: 여러 가지 농도의 올리고뉴클레오티드(10, 25, 50, 100 또는 250nM)를 세포에 가하고 3일후 세포를 회수하여 계수했다. T24암세포 증식에 대한 올리고뉴클레오티드 2570, 3895 및 4690의 효과를 시험했다.
[실시예 12]
[2-(아미노)아데닌-치환된 올리고뉴클레오티드의 합성]
하기 사항을 제외하고는 실시예 1에 기재한 대로 올리고뉴클레오티드를 합성했다. 2-(아미노)아데닌이 필요한 위치에서, 포스포르아미다이트를 상용가능한 2-아미노디옥시 아데노신 포스포르아미다이트(Chemgenes)로 치환했다.
[실시예 13]
[A549 세포의 배양]
A549 세포(American Type Culture Collection)를 1g 글루코스/ℓ 및 10% 어린 소의 혈청(FCS, Irvine Scientific)을 함유하는 Dulbecco 변성된 Eagle 배양액(DME) 중에서 6-웰 배양판(Falcon Labware)에다 성장시켜 교회시켰다.
[실시예 14]
[생쥐에서 인체 종앙세포의 올리고뉴클레오티드 처치-복강내 주사]
인체 페암세포를 채취하여 5×10 세포(200㎕)를 생쥐의 안쪽 대퇴에 피하주사하였다. 뚜렸한 종양이 약 한달 후 나타났다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503 및 제조된 비상관 대조 올리고뉴클레오티드 1082(투여량 20mg/kg)를 쥐의 복강내로 투여했다. 10주간 이틀마다 투여했으며 이 기간동안 종양의 성장을 관찰했다.
[실시예 15]
[생쥐에서 인체 종양세포의 올리고뉴클레오티드 처리-양이온성 지질로 피하주사]
인체 폐암세포를 채취하여 5×10 세포(200㎕)를 생쥐의 안쪽 대퇴에 피하주사하였다. 뚜렷한 종양이 약 한달 후 나타났다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503 및 양이온성 지질 조성물(DMRIE/DOPE, 60mg/kg)에서 제조된 비상관 대조 올리고뉴클레오티드 1082(투여량 5mg/kg)를 종양부위에서 쥐의 피하로 투여했다. 암세포 접종 후 일주일에 투약을 시작했으며 4주간만 일주일에 두 번씩 행했고 전체 9주간 종양성장을 관찰했다.
[실시예 16]
[T24 세포에서 2' 변형된 올리고뉴클레오티드의 안정성]
T24 방광암 세포를 실시예 10에 기재된 대로 성장시켰다. 세포를 단일 투여량(1μM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하고 24시간 후 노던 블롯 분석에 의해 Ha-ras mRNA 발현을 검증했다. 시험된 올리고뉴클레오티드는 Ha-ras 코돈 12에 표적된 17 합체, ISIS 2570(염기서열 ID 번호:3)의 유사체였다.
[실시예 17]
[세 개의 대장암 세포주에 대한 Ki-ras 올리고뉴클레오티드의 활성]
인체의 대장암 세포주 Calu1, SW480 및 SW620은 American Type culture Collection(ATCC)사 제품을 사용하여 실시예 10에 HeLa 세포에 대해 기재된 대로 배양하고 보존하였다. 세포를 단일 투여량(200mM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하고 24시간 후 노던 블롯 분석에 의해 Ki-ras mRNA발현을 검증했다. 증식연구를 위해 0일에 세포를 단일 투여량(200mM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하고5일에 걸쳐 세포수를 관찰했따.
[실시예 18]
[돌연변이체 대 야생형 Ki-ras의 올리고뉴클레오티드 저해]
SW480 세포를 상기 실시예에서 기재한 대로 배양했다. HeLa 세포는 실시예 10에서 기재한 대로 배양했다. 세포를 단일 투여량(100nM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하고 24시간 후 노던 블롯 분석에 의해 mRNA의 수준을 측정하였다.
서열목록
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인 : 모니아 외
(ii) 발명의 명칭 : ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
(iii) 서열의 수 : 33
(iv) 주소 :
(A) 받는이 : 제인 매세이 리카타
(B) 거리명 : 210 레이크 드라이브 이스트, 슈이트 201
(C) 도시명 : 체리 힐
(D) 주명 : 뉴저어지
(E) 국명 : 미합중국
(F)우편번호 : 08002
(v) 컴퓨터 해독 형태 :
(A) 중간형 : 디스켓, 3.5인치, 1.44Mb 용량
(B) 컴퓨터 : IBM PS/2
(C) 작동 시스템 : PC-DOS
(D) 소프트웨어 : 워드퍼펙트 5.1
(vi) 출원 자료 :
(A) 출원번호 : n/s
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(vii) 선행 출원 자료 :
(A) 출원번호 : 715,196
(B) 출원일 : 1991년 6월 14일
(vii) 선행 출원 자료
(A) 출원번호 : 958,134
(B) 출원일 : 1992년 10월 5일
(vii) 선행 출원 자료
(A) 출원번호 : 08/007,996
(B) 출원일 : 1993년 1월 21일
(viii) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 재인 매세이 리카타
(B) 등록번호 : 32,257
(C) 참조/서류번호 : ISPH-0033
(ix) 통신 연락처
(A) 전화번호 : (609) 779-2400
(B) TELEFAX : (609) 779-8488
(2) 서열 ID NO : 1에 관한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 헥산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 1:
(2) 서열 ID NO : 2에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 2:
(2) 서열 ID NO : 3에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 17
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 3:
(2) 서열 ID NO : 4에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 19
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 4:
(2) 서열 ID NO : 5에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 5:
(2) 서열 ID NO : 6에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 23
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 6:
(2) 서열 ID NO : 7에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 7:
(2) 서열 ID NO : 8에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 5
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 8:
(2) 서열 ID NO : 9에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 7
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 9:
(2) 서열 ID NO : 10에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 9
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 10:
(2) 서열 ID NO : 11에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 11
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 11:
(2) 서열 ID NO : 12에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 13
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 12:
(2) 서열 ID NO : 13에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 15
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 13:
(2) 서열 ID NO : 14에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 16
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 14:
(2) 서열 ID NO : 15에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 16
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 15:
(2) 서열 ID NO : 16에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 18
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 16:
(2) 서열 ID NO : 17에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 18
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 17:
(2) 서열 ID NO : 18에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 25
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 18:
(2) 서열 ID NO : 19에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 17
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 19:
(2) 서열 ID NO : 20에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 20:
(2) 서열 ID NO : 21에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 21:
(2) 서열 ID NO : 22에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 22:
(2) 서열 ID NO : 23에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 23:
(2) 서열 ID NO : 24에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 24:
(2) 서열 ID NO : 25에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 25:
(2) 서열 ID NO : 26에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 26:
(2) 서열 ID NO : 27에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 17
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 27:
(2) 서열 ID NO : 28에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 28:
(2) 서열 ID NO : 29에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 29:
(2) 서열 ID NO : 30에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 30:
(2) 서열 ID NO : 31에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 31:
(2) 서열 ID NO : 32에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 15
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 32:
(2) 서열 ID NO : 33에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥형태 : 싱글
(D) 위상 : 선형
(iv) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 33:

Claims (15)

  1. 인간 ras 유전자로부터 유도된 선택적인 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 혼성화할 수 있는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 단위로 구성되는 것으로서, 서열 ID 번호:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 26, 28, 31, 32 및 33으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 ras의 발현을 억제할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 뉴클레오티드 단위 사이의 결합기중 최소한 하나가 포스포로티오에이트 변형체로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위중 최소한 하나가 2' 위치에서 변형되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 2' 위치에서의 변형이 2'-O-알킬 또는 2'-플루오로 변형인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 활성 인간 H-ras 유전자를 선별적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 ID 번호:3, 4, 13, 14, 15, 16 및 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항에 있어서, 활성 인간 Ki-ras 유전자를 선별적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 것을 올리고뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 서열 ID 번호:32를 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 서열 ID 번호:2, 3 또는 21로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 최소한 하나의 2'-O-알킬 또는 2'-플루오로 변형을 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  11. 인간 ras 유전자로부터 유도된 선택된 DNA 또는 mRNA와 특이적으로 혼성화할 수 있는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 단위로 구성되는 것으로서, RNAse H에 대하여 기질인 4개 이상의 2'-디옥시뉴클레오티드를 포함하며, 뉴클레아제 내성을 증가시키기 위하여 최소한 하나의 포스포로티오에이트 변형 및 상기 ras DNA 또는 mRNA에 대한 친화도를 증가시키기 위하여 최소한 하나의2'-O-알킬 또는 2'-플루오로 변형을 가지며, 서열 ID 번호:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 26, 28, 31, 32 및 33으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 인간 ras 유전자로부터 유도된 선택적인 DNA 또는 mRAN와 특이적으로 혼성화할 수 있는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 단위로 구성되는 것으로서, 표적친화도를 증가시키기 위하여 2'-O-알킬 또는 2'-플루오르 변형을 가지는 최소한 하나의 뉴클로에티드를 갖는 제1 구역과 RNAse H에 대하여 기질인 4개 이상의 2'-디옥시뉴클레오티드를 가지는 제2 구역을 포함하며, 서열 ID 번호:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 26, 28, 31, 32 및 33으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, RNAse H에 대하여 기질인 상기 구역이 표적 친화도를 증가시키기 위하여 변형된 구역에 의하여 둘러싸이는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  14. 제12항에 있어서, RNAse H에 대한 기질인 상기 구역이 4내지 9개의 2'-디옥시뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
  15. 제12항에 있어서, 뉴클레오티드 단위사이의 결합기중 최소한 하나의 포스포로티오에이트 변형체로 구성되는 것을 특징으로 하는 키메라 올리고뉴클레오티드.
KR1019950701274A 1992-10-05 1993-10-01 Ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 KR100199247B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95813492A 1992-10-05 1992-10-05
US7/958,134 1992-10-05
US799693A 1993-01-21 1993-01-21
US8/007996 1993-01-21
PCT/US1993/009346 WO1994008003A1 (en) 1991-06-14 1993-10-01 ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100199247B1 true KR100199247B1 (ko) 1999-06-15

Family

ID=26677617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019950701274A KR100199247B1 (ko) 1992-10-05 1993-10-01 Ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6117848A (ko)
EP (1) EP0670897A4 (ko)
JP (1) JP2739769B2 (ko)
KR (1) KR100199247B1 (ko)
AU (1) AU680449B2 (ko)
CA (1) CA2146320C (ko)
FI (1) FI951601A (ko)
HU (1) HUT73335A (ko)
IL (1) IL107198A0 (ko)
NO (1) NO951306L (ko)
NZ (1) NZ256974A (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
EP0950097A2 (en) 1996-12-27 1999-10-20 Instituto de Investigaciones Bioquimicas Fundacion Campomar Compositions and methods for tumour therapy
WO2002026967A2 (en) * 2000-09-25 2002-04-04 Thomas Jefferson University Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
US20020165196A1 (en) * 2001-05-07 2002-11-07 Eric Wickstrom Oligonucleotide inhibitors of cancer cell proliferation
US20030054354A1 (en) * 2001-08-23 2003-03-20 Bennett C. Frank Use of antisense oligonucleotide libraries for identifying gene function
US9068234B2 (en) 2003-01-21 2015-06-30 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression
EP2500437B1 (en) * 2003-01-21 2016-11-30 PTC Therapeutics, Inc. Methods for identifying compounds that modulate untranslated region-dependent gene expression and methods of using same
US7713738B2 (en) * 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
US20060154888A1 (en) * 2004-11-09 2006-07-13 Santaris Pharma A/S LNA oligonucleotides and the treatment of cancer
US8283116B1 (en) 2007-06-22 2012-10-09 Ptc Therapeutics, Inc. Methods of screening for compounds for treating spinal muscular atrophy using SMN mRNA translation regulation
WO2009099507A2 (en) * 2008-01-30 2009-08-13 Duke University Treating oncogenic ras driven cancers

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4871838A (en) * 1985-07-23 1989-10-03 The Board Of Rijks Universiteit Leiden Probes and methods for detecting activated ras oncogenes
NZ221244A (en) * 1986-07-31 1990-01-29 Patrick Yelverton Williams Self-locking split nut with conical base
US5459255A (en) * 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5623065A (en) * 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5138045A (en) * 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) * 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
CA2108144A1 (en) * 1991-03-06 1992-09-07 Jack A. Roth Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
WO1994008003A1 (en) * 1991-06-14 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE
US5582986A (en) * 1991-06-14 1996-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of the ras gene
EP0590082B1 (en) * 1991-06-14 1999-10-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of the ras gene
ATE317848T1 (de) * 1991-12-24 2006-03-15 Isis Pharmaceuticals Inc Unterbrochene 2'-modifizierte oligonukleotide
FR2705099B1 (fr) * 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.

Also Published As

Publication number Publication date
FI951601A0 (fi) 1995-04-04
EP0670897A4 (en) 1997-08-06
JP2739769B2 (ja) 1998-04-15
NO951306D0 (no) 1995-04-04
AU680449B2 (en) 1997-07-31
JPH07508657A (ja) 1995-09-28
HU9500979D0 (en) 1995-06-28
EP0670897A1 (en) 1995-09-13
HUT73335A (en) 1996-07-29
NZ256974A (en) 1997-12-19
CA2146320A1 (en) 1994-04-14
US6117848A (en) 2000-09-12
IL107198A0 (en) 1994-01-25
CA2146320C (en) 2004-12-14
NO951306L (no) 1995-04-04
AU5295993A (en) 1994-04-26
FI951601A (fi) 1995-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100354610B1 (ko) 키메라 및 교호결합 올리고뉴클레오티드를 갖는 ｒａｓ 유전자의 안티센스 저해
US5576208A (en) Antisense oligonucleotide inhibition of the RAS gene
AU732144B2 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of RAS
JP3131222B2 (ja) ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド
US6599742B2 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of human serine/threonine protein phosphatase gene expression
JP3121599B2 (ja) ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節
JP4293636B2 (ja) 糖修飾ギャップ付オリゴヌクレオチド
US6187585B1 (en) Oligonucleotide inhibition of epidermal growth factor receptor expression
US20020151511A1 (en) Antisense oligonucleotide modulation of human MDM2 expression
KR100199247B1 (ko) Ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
US20030148989A1 (en) Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
US6399297B1 (en) Antisense modulation of expression of tumor necrosis factor receptor-associated factors (TRAFs)
US6784290B1 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US20040171564A1 (en) Antisense oligonucleotide modulation of human serine/threonine protein phosphatase gene expression
US20030013670A1 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of ras
WO2002090507A2 (en) Oligonucleotide inhibitors of cancer cell proliferation
JP2002519015A (ja) Ｔｎｆｒ１発現のアンチセンスモジュレーション

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20050114

Year of fee payment: 7

LAPS Lapse due to unpaid annual fee