KR100186757B1 - 20(에스)-진세노사이드 알에이치1 및 20(에스)-프로토파낙사트라이올의 제조방법 - Google Patents

20(에스)-진세노사이드 알에이치1 및 20(에스)-프로토파낙사트라이올의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍삼의 특유성분인 천연형인 일반식(Ⅰ)의 20(S)-진세노사이드 Rh1과 일반식(Ⅱ)의 20(S)-프로토파낙사트라이올을 제조하는 방법에 관한 것임. 20(S)-진세노사이드 Rh1과 20(S)-프로토파낙사트리올은 진세노사이드 Re나 진세노사이드 Rg1을 락타제와 반응시켰을 때 혼합물 상태로 얻어지며 실리카겔 칼람 크로마토그래피에 의하여 간단하게 분리됨. 본 발명에 의하면 제조방법이 간단하고 20(S)-진세노사이드 Rh1의 수율이 높음.
식중 R은

Description

20(S)-진세노사이드 Rh1의 제조방법
본 발명은 다음 일반식(I)으로 표시되는 20(S)-프로토파낙사트라이올-6-O-β-D-글루코피라노사이드 [20(S)-진세노사이드 Rh1이라 함]의 제조방법에 관계되는 것으로서, 특히 20(S)-진세노사이드를 효소를 이용하여 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 식중 R은을 나타낸다.
본 발명에 의하면 전술한 일반식(I)에서 R이 H인 20(S)-프로토파낙사트라이올이 부산물로 얻어진다.
상기 일반식(I)의 20(S)-진세노사이드 Rh1은 실험적 간장해 억제작용, 혈소판 응집억제작용, 선용 활성화작용 및 멜라닌합성 촉진작용이 있는 성분으로 이미 알려져 있고, 20(S)-프로토파낙사트라이올 역시 이미 알려진 물질이나 생리적 활성에 대해서는 구체적으로 밝혀지지 않았다.
인삼 특유의 약리활성 사포닌인 진세노사이드 유도체들은 다마란계의 트리테르페노이드인 프로토파낙사다이올과 프로토파낙사트라이올의 알코올성 수산기에 글루코오스, 람노스, 키실로스 또는 아라비노스와 같은 당류가 에테르 결합한 화합물들로서 현재까지 고려 인삼에서 약 30여종의 유도체들이 밝혀져 있다. 또한 인삼 사포닌은 아글리콘에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당류의 수 또는 결합위치에 따라 약리 효능이 각각 다르다는 것이 이미 밝혀져 있으며, 특히 수삼이나 백삼에 함유되어 있는 주요 사포닌의 약리 효능에 대해서는 많은 연구가 진행되어 왔으나 주로 홍삼에만 존재하는 미량사포닌의 약리 효능에 관한 연구는 상대적으로 적은 편이다.
홍삼은 수삼을 수증기 처리하여 제조하는데 이 과정에서 구조적으로 불안정한 진세노사이드의 아글리콘 C-20위치에 결합되어 있는 배당체 결합이 쉽게 가수분해됨과 동시에 수산기가 반전 평형을 일으켜 C-20(R)과 C-20(S)의 이성체가 생성된다. 따라서 홍삼에는 프로사포게닌인 2-(RS)-진세노사이드 Rg2, Rg3, Rh1 및 Rh2가 수삼이나 백삼에 비해 많이 함유되어 있다. 특히 진세노사이드 Rh1은 홍삼만이 갖고 있는 고유성분이지만 20(RS) 이성체 혼합물로 존재하기 때문에 20(S)-진세노사이드 Rh1 만을 분리하는데는 많은 어려움이 있다. 또한 화학적인 방법에 의해 인삼에 많이 함유된 트라이올 타입 사포닌으로부터 20(S)-진세노사이드 Rh1 또는 20(S)-프로토파낙사트라이올을 제조할 수도 있으나 제조과정에서 C-20위치의 수산기의 반전 평형에 의하여 C-20(R)과 C-20(S) 이성체 혼합물의 생성, 탈수, 히드록실화 등과 같은 바람직하지 못한 부반응을 동반하기 때문에 수율이 극히 낮고 여러 단계의 반응을 거쳐야 하는 등의 문제점이 있다(대한민국 특허 제4066호, 제8291호 참조).
본 발명자들은 인삼의 주요 트라이올형 사포닌인 진세노사이드 Re 또는 Rg1을 미생물에서 분리한 락타제와 반응시키면 단기간 내에 C20위치의 배당체 결합이 선택적으로 절단되어 천연형인 20(S)-진세노사이드 Rh1이 20(S)-프로토파낙사트라이올과의 혼합물 상태로 고수율로 생성된다는데 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 진세노사이드 Re 또는 Rg1을 물이나 완충 용액과 같은 수성 용매 또는 완충 용액과 유기용매의 혼합액 중에서 락타제 효소와 함께 반응시켜, 20(S)-진세노사이드 Rh1과 20(S)-프록토낙사트라이올의 혼합물을 얻고 이 혼합물로부터 20(S)-진세노사이드 Rh1을 분리하는 방법으로 구성된다.
전술한 20(S)-진세노사이드 Rh1을 분리하는 과정에서 20(S)-프록토파낙사트리올이 부산물로 얻어진다.
본 발명에 사용되는 용매는 pH4~8, 특히 pH4~6범위의 완충용액이 바람직하지만, 그 외에 효소의 활성을 저하시키지 않는 기타의 수용 용매도 사용할 수 있다. 또한 수성 용매와 유기용매의 혼합액을 반응 용매로 사용할 수도 있는데, 유기용매로는 물과 혼화되는 것이라면 특별히 제한을 받지 않으나 그 중에서도 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 저급 알코올, 아세토니트릴, 디옥산, 디메틸설폭사이드, 아세톤 등이 바람직하다. 유기 용매는 수성 용매에 30%를 초과하지 않는 범위로 혼합하는 것이 좋으나, 유기용매의 혼합비율은 반응에 사용되는 진세노사이드를 용해시킬 수 있고 효소의 활성을 저하시키지 않는 범위이라면 전술한 범위를 초과하도록 사용할 수도 있다. 용매의 사용량은 사용한 기질을 기준으로 1~50% 농도, 특히 2~30% 농도가 되도록 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면 효소로는 페니실리움속에서 분리한 락타제가 사용되며, 효소의 첨가방법은 효소의 불활성화가 일어나지 않는 방법이라면 특별히 제한을 받지 않는다. 예를 들면 진세노사이드 Re 또는 Rg1을 용해시킨 용액에 효소를 첨가하거나 효소를 수용액 상태로 진세노사이드 Re 또는 Rg1과 혼합하는 방법이 사용될수 있다.
반응온도는 효소의 불활성화가 일어나지 않는 온도 조건이어야 하며 수성 용매만을 사용하는 경우는 60℃ 이하, 수용성용매와 유기용매의 혼합액을 사용하는 경우는 40℃ 이하가 바람직하다. 본 발명에 사용되는 반응시간 역시 효소의 활성이 유지되는 기간이라면 특별히 제한을 받지 않으나 1~72시간, 바람직하게는 24~48시간이 적당하다.
본 발명에 의한 20(S)-진세노사이드-Rh1 및 20(S)-프로토파낙사트라이올 제조방법의 일례를 설명하면 다음과 같다.
진세노사이드 Re 또는 Rg1을 인산 완충용액이나 초산완충용액에 용해시킨 다음, 여기에 페니실리움속에서 분리한 락타제를 가하고 20~60℃ 에서 1~72시간 반응시킨 후 비등 수욕조에서 10분 가열하여 효소를 불활성화시키고 천연형의 20(S)-진세노사이드 Rh1과 20(S)-프로토파낙사트라이올이 혼합된 혼합 반응액을 얻는다. 이와 같은 효소적 방법에 의하면 종래 화학적 방법을 사용하는 경우보다 수율이 높고 단기간 내에 반응이 이루어지며 20(S)형의 진세노사이드 유도체만이 생성되기 때문에 실리카겔 칼람크로마토그래피(클로로포름-메탄올-물 = 90 : 10 : 5)에 의하여 쉽게 20(S)-프로토파낙사트라이올로부터 20(S)-진세노사이드 Rh1를 분리시킬수 있다. 본 발명에 의하여 제조된 진세노사이드 유도체들은 다음과 같은 물리화학적 성상을 나나태어 이들을 20(S)-진세노사이드 Rh1 및 20(S)-프로토파낙사트라이올로 동정하였다.
20(S)-진세노사이드 Rh1의 물리화학적 성상
mp : 210-212℃(분해)
IR(cm-1) : 3420(히드록실), 1636(올레피닉)
Positive FAB-MS : m/z 639.5(M+1)+
1H-NMR(δ) : 5.04(1H, d, J=7.78 Hz, β-아노머릭)
13C-NMR(ppm) : 16.4, 16.7, 17.3, 17.6, 23.0, 25.8, 26.8, 27.0, 27.8, 31.2, 31.7, 32.0, 35.8, 39.4, 39.6, 40.3, 41.1, 45.2, 48.2, 50.2, 51.6, 54.7, 61.4, 63.1, 71.0, 71.8, 73.0, 75.4, 78.1, 78.6, 79.5, 80.0, 105.9, 126.3, 130.8
20(S)-프로토파낙사트라이올의 물리화학적 성상
mp : 219-222℃
IR(cm-1) : 3420(히드록실), 1636(올레피닉)
Positive FAB-MS : m/z 477.4(M+1)+
13C-NMR(ppm) : 16.4, 16.7, 17.3, 17.6, 23.0, 25.8, 26.8, 27.0, 27.8, 31.2, 31.7, 32.0, 35.8, 39.4, 39.6, 40.3, 41.1, 45.2, 48.2, 50.2, 51.6, 54.7, 61.4, 71.0, 73.0, 78.1, 78.6, 126.3, 130.8
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
진세노사이드 Re 1g을 0.1M 초산완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50ml로 정용한 다음, 페니실리움속에서 분리한 락타제 5g을 첨가하고 50℃ 수욕상에서 교반하면서 48시간 동안 반응시킨다. 박층크로마토그라피를 이용하여 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 반응액은 수포화부탄올로 추출, 농축하여 20(S)-진세노사이드 Rh1과 20(S)-프로토파낙사트라이올의 혼합물이 90% 이상 함유된 분말상 반응생성물을 얻었다. 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(클로로포름-메탄올-물= 90 : 10 : 5 )에 의하여 반응생성물로부터 20(S)-진세노사이드 Rh1 432mg과 20(S)-프로토파낙사트라이올 59mg을 얻었다.
[실시예 2]
진세노사이드 Re 1g을 20% 아세토니트릴을 함유하는 초산완충용액(pH5.0)에 용해시켜 전체를 50ml로 정용한 다음, 페니실리움속에서 분리한 락타제 5g을 첨가하고 20℃에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액을 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 수포화 부탄올로 추출하고 농축하여 분말상의 반응생성물 0.87g을 얻었다. 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(클로로포름-메탄올-물= 90 : 10 : 5 )에 의하여 반응생성물로부터 20(S)-진세노사이드 Rh1 420mg과 20(S)-프로토파낙사트라이올 56mg을 얻었다.
[실시예 3]
진세노사이드 Re 1g을 0.1M 인산완충용액(pH 4.8)에 용해시켜 전체를 50ml로 정용한 다음, 페니실리움속에서 분리한 락타제 5g을 첨가하고 37℃ 수욕상에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 박층크로마토그라피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 반응액은 수포화 부탄올로 추출하고 농축하여 20(S)-진세노사이드 Rh1과 20(S)-프로토파낙사트라이올이 함유된 분말상 반응생성물을 얻었다. 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(클로로포름-메탄올-물= 90 :10 : 5 )에 의해 반응생성물로부터 20(S)-진세노사이드 Rh1 406mg과 20(S)-프로토파낙사트라이올 51mg을 얻었다.
[실시예 4]
진세노사이드 Rg1 1g을 30% 에탄올을 함유하는 시트레이트-포스페이트 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50ml로 정용한 다음, 페니실리움속에서 분리한 락타제 3g을 첨가하고, 20℃에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 가열하여 반응을 종료시킨 다음 다이아이온 HP-20 수지를 충전시킨 칼럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하고 반응생성물은 메탄올로 용출시켜 농축한다. 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(클로로포름-메탄올-물= 90 : 10 : 5)에 의해 농축액으로부터 20(S)-진세노사이드 Rh1 409mg과 20(S)-프로토파낙사트라이올 53mg을 얻었다.
[실시예 5]
진세노사이드 Rg1 1g을 시트레이트 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50ml로 정용한 다음, 페니실리움속에서 분리한 락타제 5g을 첨가하고 20℃에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 가열하여 반응을 종료시키고 다이아이온 HP-20수지를 충진시킨 칼럼에 흡착시킨 후, 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하고 반응생성물은 메탄올로 용출시켜 농축한다. 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(클로로포름-메탄올-물= 90 : 10 : 5 )에 의해 농축액으로부터 20(S)-진세노사이드 Rh1 395mg과 20(S)-프로토파낙사트라이올 48mg을 얻었다.

Claims (6)

  1. 진세노사이드-Re, Rg1 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 것을 pH 4~7의 완충용액 중에서 효소인 락타제와 반응시켜 일반식(I)로 표시되는 20(S)-진세노사이드 Rh1을 제조하는 방법.
    식중 R은를 나타낸다.
  2. 제1항에서, 20(S)-진세노사이드 Rh1이 20(S)-프로토파낙사트라이올의 혼합물 상태로 얻어지고 이 혼합물로부터 칼럼크로마토그래피에 의하여 20(S)-진세노사이드 Rh1이 분리됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에서, 락타제가 페니실리움속에서 분리한 효소임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에서, 완충용액이 저급알콜, 아세톤 디옥산, 디메틸설폰사이드, 아세토니트릴중에서 선택된 유기용매와 함께 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에서, 유기용매가 완충용액의 중량을 기준으로 30% 이하로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에서, 반응이 10-50℃ 범위에서 진행됨을 특징으로 하는 방법.
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