KR0184779B1

KR0184779B1 - 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 분리정제된 사포닌 변이체, 이의 분리정제 방법 및 이를 함유하는 백신 제형

Info

Publication number: KR0184779B1
Application number: KR1019960010630A
Authority: KR
Inventors: 소홍섭; 윤혜성; 권영선; 조중명
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1995-04-13
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 1999-04-01
Also published as: DE69605094T2; TW442293B; BR9606311A; EP0765333B1; US5817314A; JPH09510740A; AU5290096A; MX9601378A; DK0765333T3; WO1996032401A1; DE69605094D1; ATE186541T1; JP2761809B2; CN1262958A; ES2140837T3; CA2190344A1; AU678941B2; CA2190344C; CN1044478C; AR001618A1

Abstract

본 발명은 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 사포닌을 분리정제하는 방법, 이에 의해 분리정제된 신규한 사포닌 및 이를 면역 보조제로 포함하는 백신 제형에 관한 것으로, 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물을 한외 투석막으로 투석하는 단계, 투석액을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계, 및 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 간단한 분리정제방법에 의하면, 독성이 낮고 항원의 면역 증강 효과가 우수한 신규 사포닌을 얻을 수 있다.

Description

퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 분리정제된 사포닌 변이체, 이의 분리정제방법 및 이를 함유하는 백신 제형

제1도는 퀼라야 사포나리아(Quillaja saponaria)의 표피 추출물을 투석 및 원심분리한 후 상층액을 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리한 결과.

제2도는 본 발명에 따라 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물로부터 분리정제된 사포닌들을 실리카겔 박막 크로마토그래피한 다음 사포닌의 당 부위 만을 염색한 결과.

제3도는 본 발명에 따라 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 분리정제된 각 사포닌의 면역 보조 활성을, B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg)을 사용하여 비교한 결과.

제4도는 시판 사포닌 분말인 Quil-A로부터 분리정제된 사포닌들을 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리한 결과.

제5도는 본 발명에 따라 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 분리정제된 신규 사포닌 QS-L1의 분자량을 질량분석기로 측정한 결과를 나타낸 것.

제6도는 본 발명에 따라 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 분리정제된 사포닌 분획물 및 Quil-A의 농도에 따른 면양 적혈구 용혈 정도를 나타낸 것.

제7도는 인삼으로부터 분리한 사포닌 분획물 GS-1, GS-2, GS-3 및 GS-4의 HPLC 피크.

제8도는 사포닌 성분 QS-L1의 세포성 면역 반응 보조 증강 효과를 측정하여 자극 계수(SI)로 나타낸 결과이다.

본 발명은 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)의 표피 추출물로부터 면역 보조제로 사용할 수 있는 신규한 사포닌을 분리정제하는 방법, 이에 의해 분리정제된 신규 사포닌 및 이를 함유하는 면역 보조제 조성물에 관한 것이다.

유전공학 기술의 발전은 바이러스 표면항원 단백질 등을 항원으로 하는 재조합 백신의 개발에 큰 기여를 했지만, 현재 인류의 건강에 큰 위협이 되고 있는 HIV(human immunodeficiency virus), HCV(Hepatitis C virus)등의 백신은 아직 개발되지 못하고 있다. 그 이유중 하나는 면역성이 약한 이들 재조합 단백질의 면역성을 향상시키기 위해 필요한 효율적인 백신 보조제가 아직 개발되어 있지 못한 때문이다. 따라서 재조합 항원 단백질의 백신 효율성을 증대시키기 위한 신규 면역 보조제의 개발이 매우 시급한 실정이다.

현재 사용되는 면역 보조제로는 수산화알루미늄(aluminum hydroxide, 이하 알럼(Alum)이라 칭함) 외에 아직 개발중에 있는 사포닌계, 오일 에멀젼(oil emulsion)계, 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A)계, 사이토카인계, 프르인트 면역 보조제(Freund's completeincomplete adjuvant) 등이 있다(Fransois M et al., TiPs, 141, 174-178(1993)).

이와 같은 면역 보조제들은 각각 면역 보조제로서의 활성, 안정성 및 유용성 등의 면에서 일부 바람직하지 않은 단점을 가지고 있다. 예컨대, 생쥐 등의 동물 면역시 주로 사용되는 프로인트 면적보조제는 인체에 사용시 면역부위에 육아종(granulomas)등의 심한 부작용이 나타나는 문제점이 있다. 알럼은 인체에 사용이 허가된 유일한 면역 보조제로서 다른 면역 보조제에 비하여 부작용이 적은 반면, 면역 보조 활성이 약해서 HIV, HCV 등의 표면항원, HSV(Herpes Simplex virus), 주혈흡층증(schistosomiasis), 백일해(wooping cough) 및 티푸스열(typoid) 등의 면역 보조제로 사용될 경우 면역원성 향상 효과가 거의 나타나지 않는 등 그 효용성이 상당히 제한적일 뿐 아니라(Sanchez- Pescador et al., J. Immunol., 141, 1720-1727(1988); James S. L. et al., J. Immunol., 140, 2753-2759(1988); Edelman R., Rev. Infect Dis., 2, 370-383(1980)), 체액성 면역 반응만을 유도한다는 단점이 있어 세포성 면역반응이 중요한 방어기작이 되는 질병에 있어서는 한계를 나타내게 되었다.

한편, 사포닌은 트리테르펜(triterpene)과 배당체(glycoside)로 구성되는 구조를 가지며 계면활성제 특성을 나타내는데, 세포 고정제 및 식품 첨가제로서 사용되고 있다. 특히 남미산 식물인 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 추출한 사포닌은 체액 및 세포성 면역반응을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며(Espinet R. G., Gac. Vet., 13, 268-273(1951); Daisgaard K., Arch. Gesamte Virus Forsoh, 44, 243-254(1974); Morein B., Nature, 322, 287-288(1988)), 현재 겔 투과 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피 등의 방법을 거쳐 정제된 사포닌이 상업적으로 시판되고 있다(Quil A: Isocotec AB사, 스웨덴). 그라나, 상기 Quil A는 여전히 많은 양의 비활성 독성 물질을 함유하고 있으며, 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HLPC)로 분리하였을 때 최소한 20개 이상의 사포닌 성분들로 분리되는 것으로 밝혀졌다(Kersten et al., Infect. Immun., 56, 432-438(1988)). 이처럼 사포닌 구성성분이 다양하고 독성이 높은 Quil A를 인체에 직접 사용하는 것은 문제가 있다.

최근에는 이들 사포닌 추출물로부터 다양한 구성을 가지는 개개의 사포닌 성분들을 정제하여 독성이 낮으면서도 활성이 높은 사포닌 성분 만을 면역 보조제로 사용하는 가능성에 대한 연구가 계속되어 오고 있다. 예컨대, 켄실(Kensil) 등은 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 추출한 사포닌을 RP-HPLC로 분리하였을 때 최소한 28개 이상의 사포닌 성분들로 분리되는 것을 보고하였다. 이 중에서도 QS(혹은 QA)-18로 명명된 성분이 주된 독성을 나타내고, QS-21로 명명된 성분은 독성이 비교적 낮고 높은 면역 보조 활성을 나타내며, 그외 QS-7 및 QS-17등의 성분들도 면역 보조제 활성을 가지고 있는데, 이들 성분들은 메탄올을 이용한 용출, 실리카겔 흡착 및 메탄올을 사용한 RP-HPLC를 통하여 정제할 수 있다고 기술하고 있다(Kensil et al., J. Immunol., 146, 431-437(1991); Kensil et al., 미합중국 특허 제5,057,540호, 1991). 또한 상기 QS-21을 면역 보조제로 사용할 경우 HIV를 비롯한 다양한 바이러스 항원의 면역원성을 향상시킬 수 있다고 보고한 바 있다(Kensil et al., JAMA, 199, 1423-1427(1991); Wu et al., J. Immunol., 148, 1519-1525(1992)).

한편, 상기 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 기존에 알려진 성분 이외에 보다 높은 면역 보조 활성을 나타내는 성분들을 추출하기 위한 시도들은 계속되어 왔다. 커스텐(Kersten)등은 Quil-A로부터 소소성 크로마토그래피를 통하여 최소한 23개 이상의 사포닌 성분들을 분리할 수 있었으며, 상기 QS-21보다 더 낮은 독성 및 더 높은 면역 보조 활성을 나타내는 성분을 정제하여 스테롤, 포스포리피드, 항원과의 혼합에 의해 면역 촉진 복합제(ISCOMS)라는 형태의 면역증강 제형을 만들 수 있음을 보고하였다(국제 특허출원 공개 제 WO 92/06710호). 이는 분리방법에 따라 효율적인 면역 보조제를 찾을 수 있는 가능성을 제시한 것이며, 또한 사포닌의 정제 방법 자체도 개선이 가능하며, 사포닌 자체보다는 다른 사포닌 이외의 성분과의 혼합사용에 의해 더욱 큰 면역 증강효과를 보이는 제형을 만들 수 있음을 시사해 준다. 그러나, 상기 켄실 등에 의한 정제 방법은 메탄올을 비롯한 유기용매를 필수적으로 사용하므로, 인체에 주사용으로 사용하는 백신에 함유되는 면역 보조제의 정제에 사용하기에는 부적당한 점이 있다. 게다가 복잡한 정제 단계로 구성되어 있어 원목의 표피 추출룰로부터 개개의 사포닌을 순수 분리하는 각 공정마다 그 순도와 구성비가 일정하게 유지되기가 힘들 뿐 아니라, QS-21 자체도 독성을 나타낸다는 문제점이 제기되어 왔다. 그 외에 케스텐 등의 정제 방법은 단일 크로마토그래피 과정으로 각 사포닌을 분리해 낼 수는 있으나, 출발 물질이 원목의 표피 추출물이 아니라 이미 정제 단계를 거친 Quil A이기 때문에 대량 생산시 비효율적 이라는 단점이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 이러한 종래의 문제점을 해결하고 보다 효율적으로 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 사포닌을 분리 정제하는 방법 및 이에 의해 분리정제된 신규의 사포닌을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 정제되어, 보다 독성이 낮고 면역증강 효과가 높은 신규의 사포닌 성분을 포함하는 면역 보조제를 사용하여 항원의 면역성을 증강시키는 방법 및 상기 면역 보조제를 포함하는 백신 제형을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물을 한외 투석막으로 투석하는 단계, 투석액을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계, 및 C4 역상 고압 액체 크로마토그리피로 분리하는 단계를 포함하는, 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 사포닌을 분리정제하는 방법, 그리고 상기 방법에 의하여 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 분리정제된, 분자량 956(m/z)의 사포닌을 제공한다.

본 발명에서는 또한 상기의 사포닌을 면역 보조제로 포함하는 백신 제형, 및 상기 사포닌을 단독으로 또는 다른 면역 보조제와 함께 면역 보조제로 사용하는 것을 특징으로 하는, 항원의 면역성을 증강시키는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하는 다음과 같다.

먼저 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피(cambium layer)를 물로 추출한 다음 동결건조시켜 표피 추출물을 얻는다. 이를 40mM 아세트산을 함유하는 증류수에 재용해시킨 후 용액을 원심분리하여 표피 추출물에 존재하는 불용성 물질을 제거한다. 상등액을 한외 분자량 12 내지 14 kDa의 한외 투석막을 이용하여 투석함으로써 사포닌 이외의 작은 분자량을 가진 수용성 물질을 제거한다. 이어서 투석액을 원심 분리하여 상등액만을 분리함으로써 40mM 아세트산 용액에 불용해 상태로 남아 있는 물질을 제거한 후, 상층액을 동결건조시켜 다량의 사포닌이 함유된 분말을 얻는다. 0,1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 증류수에 상기 추출물 분말을 재용해시킨 다음, 동일한 조성의 증류수료 평형화시킨 C4 역상 고압 액체 크로마토드래피 컬럼을 통과시킨다. 이어서 흡착된 사포닌은 적절한 농도의 아세토니트릴 농도 구배를 가하여 용출시킨다. 서로 다른 용출시간대에 분리되어 나오는 사포닌을 함유하는 분획들을 각각 수거함으로써 순수한 사포닌을 얻을 수 있다. 이들 분획은 최소한 90 내지 97% 순도로 각각의 사포닌을 함유한다.

본 발명의 정제 방법에 따르면 약 32개 이상의 사포닌이 분리될 수 있는데, 그 중 비교적 수율이 높으면서 우수한 면역 보조 활성을 나타내는 5개의 사포닌을 각각 QS-L1, QS-L2, QS-L3, QS-L4 및 QS-L5 로 명명하였다. 특히 QS-L1 으로 명명된 사포닌은 고압 액체 크로마토그래피 및 실리카겔 박막 크로마토그래피 분석 결과, 기존에 발견되지 않은 신규의 사포닌으로 밝혀졌으며 그 면역 보조 활성도 가장 높게 나타났다. 상기 QS-L1 사포닌의 분자량을 질량 분석기로 측정한 결과 956(m/z)으로 공지된 사포닌 성분들과 많은 차이를 나타내었다.

또한 시판되는 사포닌 분말인 Quil-A(Suferfos Biosector a/s사, 덴마크)에 본 발명의 정제 방법을 적용하는 경우에도 상기와 동일한 결과를 얻을 수 있다. 즉, 먼저 200mg/㎖ 농도의 Quil-A를 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 증류수에 녹인 후, 이를 C4 역상 고압 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고 아세토니트릴 농도 구배에 의해 흡착되어 있는 사포닌을 용출시킴으로써, 신규의 사포닌인 QS-L1을 포함하여 약 32개 이상의 사포닌을 분리할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 분리된 사포닌들 QS-L1 내지 QS-L5의 수율은 공급원에 따라, 즉 퀼라야 사포나리아 몰리나 표피 추출물로부터 정제하는지 또한 시판 Quil-A 사포닌 분말로부터 정제하는지 여부에 따라 조금씩 달라진다. 특히 신규 사포닌인 QS-L1은 표피 추출물로부터 정제할 때 더 많은 양을 얻을 수 있다.

상기와 같이 본 발명의 방법에 의해 분리 정제된 사포닌 QS-L1, QS-L2, QS-L3, QS-L4 및 QS-L5 각각을 5마리씩의 CD-1 생쥐의 복강에 여러가지 용량으로 주사하여 생쥐에 미치는 독성을 측정하였다. 이때 QS-L1 사포닌 성분은 QS-L5(켄실 등의 문헌의 'QS-21'로 추정됨)에 비해 훨씬 적은 독성을 나타내었으며 또한 500㎍을 주사한 생쥐(체중 약 30g)에서도 독성을 보이지 않았다.

이어서 QS-L1, QS-L2, QS-L3, QS-L4, QS-L5 분획물 각각의 면역 보조 활성을 측정한다. 면역 보조 활성의 측정은 여러가지 항원에 대하여 실시될 수 있으며, 또한 사포닌 분획물을 단독으로 항원에 첨가하거나, 알럼 등에 흡착된 형태의 항원에 첨가하여 면역 보조 활성을 측정할 수 있다. 또한 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 사포닌 분획물 이외에 인삼(홍삼 분말)으로부터 분리 정제된 사포닌 성분들(GS-1, GS-2, GS-3, GS-4)의 면역 보조 효과도 함께 조사하여 비교하였다. 인삼 사포닌 분획물과 QS-L1은 단독으로 사용할 경우 비슷하게 낮은 활성을 보였다. 그러나 QS-L1 성분은 단독으로 항원과 함께 주사하였을 때는 QS-L5('QS-21'에 해당)에 비해 현저히 낮은 활성을 보이나 알럼에 흡착된 항원에 혼합사용시에는 항체역가를 3∼4배 이상 증가시킬 수 있는 상승적인 면역증강 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 반면, 인삼 사포닌 중의 GS-1은 알럼에 흡착된 항원과 혼합사용하였을 경우에도 별다른 면역 증강 효과를 보이지 않은 것으로 보아, QS-L1 분획물만이 알럼과 혼합 사용시 우수한 면역증강 효과를 보임을 알 수 있었다.

따라서 본 발명의 신규 사포닌을 함유하는 면역 보조 백신 제형 중 바람직한 것은 알럼 및 QS-L1을 함께 포함하는 것으로, 이 경우 알럼은 항원과 흡착된 형태로 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 백신 제형이 적용될 수 있는 항원의 종류는 제한되지 않으며, B형 간염 표면 항원, HIV 항원, HCV 항원등 다양한 항원을 사용할 수 있으며, 항원의 종류와 항원성의 정도, 항원을 투여할 대상 및 바라는 면역의 정도에 따라 조성물 중의 항원 농도를 조절할 수 있다.

본 발명의 백신 제형은 용액 또는 현탄액 중 어느 하나의 형태로서 주사 가능한 것 또는 용액이나 현탁액으로 제조하기에 적당한 고체 형태로 제조된다. 또한 본 발명의 제형은 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합될 수 있으며 적당한 부형제의 예를 들면 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이 있으며 이들의 조합도 사용될 수 있다. 또한 필요한 경우, 습윤제, 유화제, pH 완충제 등을 함유할 수도 있다.

상기 제형의 1회 투여량은 제형의 형태에 따라 여러 방법으로 예방학적 및/또는 치료학적 효과를 나타낼 수 있는 양이며, 치료할 개체, 항원의 종류 및 항원성, 개체의 항체 합성 능력, 및 바라는 면역의 정도에 따라 좌우되나, 1회 투여량 중 알럼의 양은 50㎍ 내지 1㎎이 바람직하고, QS-L1의 양은 1 내지 500㎍이 바람직하고 10 내지 50㎍의 양이 더욱 바람직하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀더 구체적으로 예시하고자 하나, 본 발명의 범위가 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1 : 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina) 표피 추출물로부터 사포닌의 분리 및 정제]

(단계 1) 사포닌 추출물의 제조

퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피를 증류수로 추출한 다음 동결건조시켜 사포닌 분말을 50% 이상 함유하는 표피 추출물(Berghausen Corp., 제품번호 제12/7/93호)을 얻은 후, 이것을 40mM 아세트산 수용액애 최종 농도 250㎎/㎖로 용해시켰다. 이 용액을 원심분리기(Beckman J2-21, JA 14)로 12,000 rpm 에서 30분간 원심분리하여 표피 추출물에 존재하는 불용성 물질을 제거하였다. 그 다음, 한외 분자량 12 내지 14 kDa의 한외 투석막(Spectrum Medical Industries Inc., 제품번호 제132676호, MWCO 12-14,000)을 이용하여 50배 부피의 40mM 아세트산 용액으로 2회 투석함으로써 사포닌 이외의 작은 분자량을 가진 수용성 물질을 제거하였다. 투석막을 다시 원심분리하고 상층액만을 분리함으로써 용액에 남아 있는 불용성 물질을 완전하게 제거한 후, 동결건조시켜 고순도의 사포닌 추출물 분말을 얻었다.

상기 공정에 따라 얻어진 사포닌 추출물은 실리카겔 박막 크로마토그래피 결과 현재 시판중인 Quil A 와 사포닌 구성 및 그 순도가 거의 유사함을 알수 있었다.

(단계 2) C4 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의한 사포닌의 확인

상기 단계 1에서 얻어진 사포닌 추출물을 0.1% 트리플루오로 아세트산 용액에 최종 농도 20㎎/㎖로 용해하였다. 이 용액 0.1㎖를 하기 표 1의 ＃ 1에서와 같은 조건으로 평형화시킨 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼(Vydac, C4 RP-HPLC, 4.6x250mm)에 분당 1㎖의 속도로 통과시키고 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 아세토니트릴 농도구배에 의해 흡착되어 있는 사포닌을 용출시켰다. 흡광도는 214nm에서 측정하였다. 제1도는 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물을 투석 및 원심분리하여 얻은 사포닌 추출물을 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리한 결과이다.

상기의 방법으로 크로마토그래피 하였을 때 32개 이상의 사포닌이 서로 다른 용출시간에 분리되어 나오는데, 이를 각각의 용출 시간별로 수집하여 개개의 사포닌을 정제하였다. 상기의 사포닌 추출물중 각 사포닌 구성비는 최저 0.13% 에서 최고 32% 까지 다양하게 분포되어 있었다. HBsAg을 항원으로 사용하여 각 사포닌의 면역 보조제 활성을 측정하여, 비교적 높은 면역원성 향상 효과를 나타내는 5개 사포닌을 각각로 명명하였다. 이들 각각의 구성비는 표 2에 나타낸 바와 같으며, 전체 크로마토그래피상의 위치는 제1도에 도시한 바와 같다.

분리된 상기의 각 사포닌을 동결건조시킨 다음 동일한 역상 고압 액체 크로마토그래피를 반복 실시함으로써 모든 사포닌들을 90 내지 97%의 순도로 정제할 수 있었다.

(단계 3) 실리카겔 박막 크로마토그래피

상기 단계 2에서 정제된 5가지의 사포닌 각 1㎍ 및 단계 1에서 얻은 사포닌 추출물 40㎍을 실리카겔 박막 크로마토그래피 컬럼(E. M. Science, Si60 HPTLC)에 넣고 분리 용매(클로로포름:메탄올:증류수=62:32:6, v:v:v)로 3∼4시간 동안 분리시킨 후, 80℃ 건조기에서 약 1시간 건조시켰다. 그 다음 바이알 시약(Bial's reagent; Orcinol Ferric Chloride;; SIGMA, 제품번호 제0-7875호)을 분무시킨 뒤 다시 80℃의 건조기에서 30분 동안 건조시켜 각 사포닌의 당 부위를 선택적으로 염색하였다. 제 2도는 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물로부터 분리 정제된 사포닌들을 실리카겔 박막 크로마토그래피한 다음 사포닌의 당 부위 만을 염색한 결과이다. 제2도에서 제 1열은 Quil-A, 제2 내지 6 열은 QS-L1 내지 QS-L5의 TLC 상에서의 이동결과를 나타낸다. 여기에서 보듯이 각 사포닌은 단일 밴드로 나타났다.

(단계 4) 정제된 사포닌의 면역 보조 활성 측정

본 발명의 정제된 사포닌의 면역 보조 효과를 측정하기 위하여 알럼에 흡착된 B형 간염 표면 항원을 제조하였다. 제조방법은 B형 간염 백신 제품을 시판하고 있는 (주)LG 화학의 유박스 제조방법을 참조하여, B형 간염 표면 항원 100㎍ 대 알럼(3% 수산화 알루미늄) 2500㎍의 비율로 흡착되도록 농도를 조정하였다. 완충액은 10mM 인산 나트륨 완충액(인산나트륨 이염기 7HO 1.2mM, 인산 칼륨 8.8mM, 염화나트륨 0.8%)을 사용하였다. 상기 비율로 혼합한 B형 간염 표면항원과 알럼을 상온에서 6시간 동안 오비탈 교반기에서 교반시켜 알럼에 단백질이 흡착되게 하였다. 그 다음 알럼에 흡착된 표면 항원을 생쥐의 면역에 바로 사용하였다.

또한 본 발명의 정제 방법에 의하여 분리된 사포닌 성분의 면역 보조 효과를 알아보기 위하여, 이들을 알럼에 흡착된 B형 간염 표면 항원과 혼합하여 면역에 사용하였다. 즉, 각각의 사포닌를 각각 2㎎/㎖ 농도로 증류수에 녹인 후 100㎍ B형 간염 표면 항원/2500㎍ 알럼/㎖에 50㎕를 첨가하여 혼합 형태의 면역 보조제를 가진 표면 항원 면역 주사액을 만들어, 생쥐의 등피하 2군데에 각각 50㎕씩 총 0.1㎖를 주사하였다. 생쥐는 일본의 찰스 리버 연구소로부터 입수한 생후 7 내지 8주된 Balb/C 암컷종이며 각 그룹당 5마리를 사용하였다. 1차 면역한지 3주후에 동량의 상기 혼합 항원 주사액을 동일한 방법으로 2차 면역시키고, 다시 17일 경과후 생쥐의 꼬리로부터 혈액을 채취하여 표면 항원에 대한 항체 역가를 측정하여 면역 보조 효과를 비교하였다.

항체 활성은 하기와 같이 측정하였다. 정제된 B형 간염 표면 항원 단백질을 50mM 붕산나트륨 완충액(pH 9.0)에 0.5㎍/㎖ 농도로 용해시킨 후 미세역가판(Dynatech, Immulon type 1, U. S. A)의 각 웰당 200㎕씩 넣은 후 37℃에서 2시간 흡착시켰다. 항원이 흡착되고 남은 용액을 버린 후, 0.2% 젤라틴이 함유된 인산염 생리식염수를 250㎕씩 넣고 37℃에서 2시간 더 반응시켰다. 이 역가판을 0.05% 트윈 20이 함유된 인산염 완충 생리식염수(이하 세척액)로 1회 세척하였다. 이어서, 상기에서 얻은 생쥐의 혈액을 0.25% 젤라틴, 1.0mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 0.02% 티메로살이 들어있는 인산염 완충 생리식염수를 가지고 400배로부터 2배씩 연속적으로 희석하여 각 웰에 넣고 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 반응이 완료된 역가판을 세척액으로 5회 세척하였다. 양고추냉이 과산화효소가 접합된 항 생쥐 IgG 항체(American Qualex, 제품번호 제 A106PS호, U.S.A)를 상기 생쥐 혈액 희석시 사용했던 동일 완충액으로 1:4000으로 희석하여 각 웰당 200㎕씩 넣고 2시간 더 반응시킨 후, 반응이 완료된 역가판을 다시 세척액으로 5회 세척하였다. 50mM 시트르산염/인산염 용액(pH 5.5)에 O.P.D. 정제(Sigma)를 10㎎/5㎖ 농도로 넣고 각 웰에 200㎕씩 가하여 상온의 암실에서 30분동안 반응시킨 후, 더 이상 반응이 진행되지 않도록 4N 황산을 50㎕씩 첨가하고 492nm 파장에서 흡광도를 측정하였다(Flowlab. Titertek Multiscan Plus). 측정된 흡광도 값으로부터 항체 역가의 계산은, 흡광도가 0.5이상이 될 때까지의 희석 배수의 역수로 정하였다. 각 그룹당 다섯마리의 생쥐를 사용하여 항체 역가를 얻은 후 이를 평균하여 그 결과를 하기 표 3 및 제3도에 나타내었다.

표 3 및 제3도에서 Alum은 알럼에 흡착된 형태의 표면 항원 단독으로 면역시킨 결과를 나타내며, Alum + QS-L1, Alum + QS-L2, Alum + QS-L3, Alum + QS-L4 및 Alum + QS-L5는 알럼에 흡착된 표면항원에 각각의 사포닌 분획물을 첨가한 혼합 면역 보조제 형태의 항원을 면역시켜 얻은 결과를 나타낸다.

QS-L1을 비롯한모두 알럼과 섞어 표면항원의 면역시 알럼 단독보다 훨씬 월등한 면역증강 효과를 나타내었으며 특히형태는 가장 우수한 면역 증강 효과를 나타냈다.

제3도는 각 사포닌의 면역 보조 활성을 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg)을 사용하여 비교한 결과이다.

[실시예 2 : Quil-A로부터 사포닌의 분리 정제]

시판 사포닌 분말인 Quil-A(Suferfos Biosector a/s사, 덴마크)로부터 실시예 1과 동일한 방법으로 사포닌을 분리 정제하였다. 먼저 20㎎/㎖ 농도의 Quil-A를 0.1% 트리플루오로아세트산 용액이 함유된 증류수에 녹인 다음 실시예 단계 1과 동일하게 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 개개의 사포닌을 분리하였다. 제4도는 시판 사포닌 분말인 Quil-A로부터 분리 정제된 사포닌들을 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리한 결과이다.

Quil-A로부터 분리 정제된 사포닌들을 실시예 1의 단계 3과 동일하게 박막 크로마토그래피한 다음 당 부위 만을 선택적으로 염색한 결과는 제2도 제1열에 나타내었다.

[실시예 3 : 사포닌 QS-L1의 분자량 측정]

VG Quattro LC/MS에서 이온화 방법은 전자 분무 이온화법(ESI)을 사용하였으며 이동상 용액으로 아세토니트릴, 증류수, 아세트산(60:40:0.5) 혼합 용액을 사용하여, 본 발명에 따라 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 분리 정제된 사포닌 QS-L1의 분자량을 측정하였다. 제5도는 질량분석기로 측정한 QS-L1의 분자량을 나타낸 것으로, 여기에서 보듯이 QS-L1의 이온화된 Na⁺형태의 분자량은 979.4(m/z)로 나타났다. 따라서 순수한 QS-L1의 분자량은 Na의 분자량 23을 감한 956(m/z)이다. 이는 커스텐 등이 사포닌 면역 보조제로 주장한 QA-3의 분자량 1862 정도와는 커다란 차이를 보이며(WO 92/06710 참조), 또한 켄실 등에 의해 공지된 QS-17, QS-18 및 QS-21의 분자량(m/z)이 각각 2371, 2174 및 2012인 것과도 커다란 차이를 나타낸다. 따라서 QS-L1은 이들 공지된 사포닌 성분과는 다른 신규 성분임을 알 수 있다.

[실시예 4 : 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물로부터 분리정제된 사포닌 QS-L1, QS-L2, QS-L3, QS-L4, QS-L5 분획물과 Quil-A의 독성시험]

저급(crude)의 퀼라야 사포닌 성분을 생쥐에 투여하면 주로 간의 괴사(necrosis)를 유발시키는 독성을 보인다. 퀼라야 사포나리나 몰리나로부터 본 발명의 방법에 따라 분리 정제된사포닌 개별 분획물과 사포닌 성분들이 혼합된 형태로 있는 Quil-A 성분의 독성을 알아보기 위해, 일본의 찰스리버 연구소로부터 구입한 8주령 CD-1 생쥐 수컷의 피하에 각각의 성분을 표 4에 나타낸 바와 같은 용량으로 주사하고 72시간 이내에 죽는 생쥐의 마리수를 세었다.

대조군으로서는 사포닌 성분이 들어있지 않은 생리식염수를 투여하였다. 본 발명의 결과와 공지된 결과(Charlotte R. K. et al., J. of Immunol. 146, 431-437(1991))와 비교하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

이상의 결과로부터 알 수 있듯이, Quil-A 성분은 상당한 독성을 갖는데 이 Quil-A 성분의 독성의 주원인은 QS-L4 분획물('QS-18'에 해당되는 것으로 추정)에 있으며 QS-L1, QS-L2 성분은 거의 독성을 나타내지 아니하였다. QS-21에 해당되는 것으로 추정되는 QS-L5 성분 500㎕을 주사한 그룹에서는 5마리중 3마리가 죽어 상당한 독성이 있음을 나타내었다. 또한 QS-L1 성분은 다른 분획물에 비해 거의 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.

또한, 상기 사포닌 분획물들의 독성을 다른 측면에서 확인하기 위해, 커스텐 등에 의해 공지된 방법(WO 92/06710) 또는 켄실 등의 방법(미국 특허 제 5,057,540호; 1991)을 참고하여, 이들 사포닌 분획물이 면양 적혈구를 용혈시키는 정도를 조사하였다. 먼저, 사포닌분획물과 Quil-A를 각각 500㎍/㎖의 농도에서 시작하여 생리식염수를 사용하여 연속적으로 2배씩 희석하여 시료 용액을 준비하였다. 면양 적혈구는 면양으로부터 채혈후 알세베르씨 용액(Alserver's solution)에 섞여 있는 것을 한국 메디칼사로부터 구입하여 사용하였다.

5㎖의 면양 적혈구를 15㎖ 원추형 튜브에 넣은 후 2000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상층액을 버린 다음 10㎖의 생리식염수를 가하여 동일 조건으로 2회 세척한다. 세척 후 침전된 면양 적혈구 부피를 확인하고 생리식염수를 가하여 최종 4%(v/v) 현탁액이 되도록 농도를 조정하였다. 용혈 정도를 측정하기 위해 96웰 둥근 바닥 플레이트에 4% 면양 적혈구 현탁액 150㎕와 상기에서 준비한 사포닌 시료 용액 각각을 50㎕씩 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 미세역가판용 원심분리기(한일, 한국)을 이용하여 2500 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상층액을 100㎕씩 취하여 편평한 바닥의 96웰 미세역가판에 넣고 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 제6도는 본 발명에 따라 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 분리정제된 사포닌 분획물 및 Quil-A의 농도에 따른 면양 적혈구 용혈 정도를 나타낸 것이다. 이로부터 본 발명에 따라 분리된 신규 사포닌인 QS-L1은 500㎍/㎖의 농도에서도 용혈 독성을 나타내지 않는 반면, QS-L3, QS-L4, QS-L5, Quil-A 등은 20㎍/㎖의 농도에서도 상당한 용혈 독성을 나타낼 수 있음을 알 수 있다. 이러한 결과는 QS-L1을 효과적인 면역 보조 제형으로 단독 또는 알럼에 흡착된 항원과 혼합 사용시 10㎍에서 500㎍까지도 독성을 수반하지 않고 안전하고 효과적으로 사용할 수 있음을 말해주는 것이다.

[실시예 5 : 정제된 사포닌 QS-L5의 면역 보조 활성 측정]

본 발명에 따라 정제된 QS-L5 성분의 면역 보조 효과를 측정하기 위해 상기 실시예 1의 단계 4에서와 같이, B형 간염 표면 항원 100㎍ 대 알럼(3% 수산화알루미늄) 2500㎍의 비율로 흡착되도록 농도를 조정하였다. 이때 흡착을 돕기 위해 10mM 인산나트륨 완충액(인산나트륨 이염기 7H₂O 1,2mM, 인산칼륨 8.8mM, 염화나트륨 0.8%, pH 6.3∼6,5)을 사용하였다.

상기 비율의 농도로 혼합한 B형 간염 표면 항원과 알럼을 상온에서 6시간 동안 오비탈 교환기에서 교반시켜 알럼에 단백질이 흡착되게 하였다. 이어서 알럼에 흡착된 표면항원을 생쥐의 등피하 2군데에 50㎕씩 총 0.1㎖를 주사하였다. 또한 정제된 QS-L5 사포닌 분획물은 2㎎/㎖ 농도로 생리식염수에 녹인 후, 알럼에 흡착되지 않은 B형 간염 표면 항원이 100㎍/㎖의 농도로 생리식염수에 녹아 있는 용액에 50㎕를 첨가하여 QS-L5 함유 형태의 표면 항원 면역 주사액을 만들어 생쥐의 등피하 2군데에 50㎕씩 총 0.1㎖를 주사하였다. 또한 상기에서 제조된 알럼 흡착 표면 항원 주사액 1㎖에 50㎕(2㎎/㎖ 농도)의 QS-L5 사포닌 분획물을 넣어 알럼 + QS-L5의 혼합 표면 항원 주사액을 만들어 상기와 동일한 방법에 의해 면역하였다.

항체 생성의 양성 대조군으로서는 이미 생쥐 등의 동물 면역에 사용되고 있는 프로인트 완전 보조제(Freund's complete adjuvant, FCA)를 200㎍/㎖ 농도의 B형 간염 항원에 동량 섞어 유중수(water in oil) 형태로 유화시킨 후 생쥐의 복강에 0.1㎖씩 주사하였다. 실험에 사용된 생쥐는 일본의 찰스리버 연구소로부터 입수한 생후 7 내지 8주된 Balb/c 암컷종이며 각 그룹당 5마리를 사용하였다. 1차 면역후 FCA 면역 주사 형태를 제외한 동량의 상기 언급된 항원 면역 주사액들을 3주후에 동일한 방법으로 2차 면역시켰다. FCA 면역 주사액은 2차 면역 주사부터는 완전 보조제 대신 불완전 보조제(incomplete adjuvant)로 대치하여 주사하였다. 3차 면역은 이로부터 3주후에 다시 동일한 방법으로 시행되었다. 생성된 항체역가를 검정하기 위해 면역후 다음 면역이 진행되기 2∼3일 전에 꼬리로부터 혈액을 채취하였다.

실시예 1의 단계 4에서와 동일한 방법으로 항체 활성을 측정하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

상기 표 6에서 Alum은 표면 항원이 알럼에 단독으로 흡착된 형태로 면역시킨 것이고, QS-L5는 표면 항원에 알럼 없이 QS-L5 사포닌 분획물만을 넣은 것이며, Alum+QS-L5는 알럼에 흡착된 표면항원에 QS-L5 사포닌 분획물을 섞어준 혼합형태의 면역 주사액을 주사한 결과이며, FCA는 프로인트 면역 보조제와 섞인 면역 주사액을 주사한 결과이다. 이로부터 QS-L5는 이미 샤롯 등에 의해 밝혀진 QS-21에 해당하며, 알럼보다 나은 면역 보조 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 QS-L5 단독으로 항원과 함께 주사할 때 보다는, 알럼에 흡착된 항원에 QS-L5를 첨가하여 혼합된 항원을 주사할 경우 훨씬 증강된 면역 보조 효과를 가짐을 알 수 있다.

[실시예 6 : C4 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의한 인삼 사포닌의 정제]

인삼 사포닌 추출물을 0.1% 트리플루오로 아세트산 용액에 최종농도 20㎍/㎖로 용해하였다. 동일한 조성의 트리플루오로 아세트산 용액으로 평형화시킨 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼(Vydac, C4 RP-HPLC, 10x250mm)에 상기 용액 2㎖를 분당 3㎖의 속도로 통과시키고 하기 표 7과 같은 아세토니트릴 농도구배를 가하여 흡착되어 있는 사포닌을 용출시켰다. 흡광도는 214nm에서 측정하였다. 제7도는 인삼으로부터 분리한 사포닌 분획물 GS-1, GS-2, GS-3 및 GS-4의 HPLC 피크를 나타낸 것이다.

상기의 방법으로 크로마토그래피를 실시하였을 때 16개 이상의 사포닌이 서로 다른 용출시간에 분리되어 나오는데, 이를 1.5㎖ 분획으로 수집하여 개개의 사포닌을 정제하였다. 상기의 사포닌 추출물중 각 사포닌의 구성비는 최저 0.6%에서 최고 18%까지 다양하게 분포되어 있었다. 10% 이상의 비교적 높은 구성비를 나타내는 4개 사포닌을 각각 GS-1, GS-2, GS-3 및 GS-4로 명명하였다. 이들 각각의 전체 크로마토그래피상에서의 위치는 제7도에 도시한 바와 같다.

[실시예 7 : 정제된 임삼 사포닌 분획물 GS-1, GS-2, GS-3, GS-4의 면역 보조 활성 측성]

정제된 인삼 사포닌 분획물 GS-1, GS-2, GS-3, GS-4의 면역 보조 효과를 알아보기 위해 알럼에 흡착되지 않은 B형 간염 표면 항원(sAg)이 100㎍/㎖ 농도로 생리식염수에 녹아 있는 용액에, GS-1, GS-2, GS-3 및 GS-4 분획물을 20% EtOH에 2㎎/㎖ 농도로 녹인 용액을 각각 50㎕ 첨가하여 각 분획물 함유 표면 항원 면역 주사액을 만든 다음 생쥐의 등피하 2군데에 50㎕씩 총 0.1㎖를 주사하였다. 또한 100㎍/㎖ 농도의 표면 항원 1㎖에 2㎎/㎖ 농도의 QS-L1 사포닌 분획물 50㎕씩을 첨가한 후 상기와 동일한 양을 생쥐에 주사하였다. 이후 상기 실시예 1 단계 4와 같은 방법으로 항체 활성을 측정하였으며 양성 대조구로서는 상기 실시예 1 단계 4에서 제조한 알럼 흡착 표면 항원을 사용하였다.

각 그룹당 다섯마리 생쥐를 사용하여 항체 역가를 얻은 후 이를 평균하여 하기 표 8에서와 같은 결과를 얻었다. 인삼 사포닌 분획물 GS-1, GS-2, GS-3, GS-4 모두 단독으로 항원과 함께 사용시 QS-L1과 비슷한 낮은 면역 보조 활성을 보였다. 특히 QS-L1는 단독으로 사용될 때 알럼 단독 제형보다 훨씬 면역 보조 효과가 낮게 나타났는데, 실시예 5에서 QS-L5 단독 제형이 알럼 단독 제형보다 높은 효과를 나타낸 것과는 좋은 대조를 이루고 있다. 이중 GS-1 사포닌 성분은 하기 실시예 8에서 알럼에 흡착된 표면 항원과 혼합된 제형 형태로형태의 혼합 면역 주사 제형과의 면역 증강 효과를 비교하였다.

[실시예 8 : 신규 사포닌 QS-L1을 면역 보조제로 포함하는 백신 제형]

앞의 실시예들에서 측정된 사포닌들의 면역 증강 효과와 독성 정도 등을 고려해볼 때 본 발명의형태의 면역 보조제가 QS-L5 등에 비해 독성이 월등히 낮으면서도 우수한 면역 보조 효과를 갖는 것으로 나타난다. 커스텐 등이 Quil-A로부터 다양한 사포닌 분획물을 얻고 이를 스테롤, 포스포리피드 등과의 혼합에 의해 ISCOMS 이라는 형태의 면역 보조제형을 개발한 바 있으나(국제특허 출원공개 제 WO 92/06710호), 스테롤이나 포스포리피드를 경구용으로 사용할 경우에는 무해하여 식품으로 사용하는 것이 가능하지만 주사제형으로서는 아직까지 그 안정성을 보장 받은 바 없다. 반면, 본 발명에 사용된 알럼은 인체에 주사제형 면역 보조제로 사용하는 것이 이미 전세계적으로 허가되어 있으며 안정성이 입증되어 있으므로 본 발명의 알럼 + QS-L1 형태 면역 보조제를 포함하는 백신 제형이 ISCOMS보다 훨씬 우수하고 안전하다 할 수 있다. 본 실시예에서는 상기 QS-L1 분획물을 다른 면역 보조제와 혼합하여 사용한 백신 제형의 면역 증강 효과를 측정키 위해 다음과 같은 방법에 의해 QS-L1을 면역 보조제로 함유하는 주사용 백신 제형을 만들었다.

먼저 현재 시중에서 시판되어 유통되고 있는 재조합 B형 간염 백신인 EuVax((주)LG 화학, 의약품사업부)를 구입하였다. 이는 B형 간염 표면 항원 20㎍/Alum 500㎍/㎖ 농도로 되어 있다. 증류수 및 20% EtOH에 각각 2㎎/㎖ 농도로 녹아 있는 QS-L1과 인삼 사포닌 GS-1 분획물을 상기 백신에 5㎕씩 첨가하여 각각 Alum + QS-L1, Alum + GS-1 혼합 면역 주사 제형을 만들었다. 이때 사폰닌이 들어 있는 EuVax 자체도 대조군으로 준비하였다. 또한 알럼에 흡착되지 않는 B형 간염 표면 항원 20㎍/㎖에 상기 2㎎/㎖ 농도의 QS-L1과 GS-1을 각각 50㎕씩 첨가하여 Alum + QS-L1, Alum + GS-1 면역 제형과의 면역 증강 효과를 비교하기 위해 준비하였다. 양성 대조군으로서는 최종농도 20㎍/㎖의 에멀젼 형태로 준비된 프로인트 완전보조제(2차 부터는 불완전 면역 보조제) 제형을 상기 실시예 5에서와 동일한 방법으로 준비하였다.

위에서 준비된 프로인트 완전 면역 보조 제형을 제외한 이외의 제형들을 생쥐의 등피하 2군데에 각각 50㎕씩 총 0.1㎖를 주사하였으며 프로인트 완전 면역 보조 제형은 생쥐의 복강에 0.1㎖씩 주사하였다. 이어서 상기 실시예 1 단계 4와 같은 방법으로 생쥐를 면역시킨 후 항체 활성을 측정하여 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 표 9에서 보듯이 QS-L1 사포닌 분획물 단독의 면역 보조 효과는 알럼에 비해 월등히 낮으며 또한 인삼 사포닌 GS-1 분획물 역시 단독으로는 낮은 면역 보조 활성을 나타내었다. 그러나 알럼에 흡착된 형태의 혼합 면역 주사 제형에서는, 인삼 사포닌 GS-1의 경우는 GS-1 사포닌이 거의 면역 보조제로서 큰 기여를 못하는 반면, Alum + QS-L1 제형의 경우 첨가된 QS-L1 사포닌이 알럼에 비해 3∼4배 이상의 높은 면역 증강효과를 나타낼 수 있으므로 알럼 단독보다 훨씬 우수한 면역 보조 제형으로 이용될 수 있다. 이러한 결과들은 알럼과 QS-L1 사포닌 분획물 사이에 인삼 사포닌 GS-1 성분과는 다른 특별환 상호 작용이 존재하여 면역 증강 효과를 발휘함을 의미한다.

[실시예 9 : QS-L1 사포닌 분획물의 세포성 면역 반응 보조 증강 효과 측정]

상기 실시예 8에서 보여준 체액성 면역 보조 활성 외에, 세포성 면역 반응에 미치는 QS-L1 사포닌 성분의 보조 활성을 조사하기 위하여, 동일 면역 보조 제형을 주사한 생쥐의 비장 세포에 B형 간염 표면 항원을 처리하여 비장 세포의 증식 반응을 측정(proliferatioon assay) 하였다. 증식 반응의 측정은 비아스 등에 의해 공지된 방법(Byars et al., Vaccine 9, 309-317(1991))을 참조하였다. 즉, 상기 실시예 8에서의 제형에 의해 면역된 생쥐에서 3차 주사 후 2주가 경과한 다음, 비장을 무균적으로 적출하여 이로부터 비장 세포를 얻었다. 이 비장 세포를 U자형 96웰 조직 배양용 플레이트에 각 웰당 2x10세포가 들어가도록 넣었다. 이때 사용된 배양 배지는 RPMI-1640 배양액에 10% 소태아 혈청, 2mM 글루타민을 첨가한 것을 사용하였다. 이렇게 준비된 비장세포 용액에 B형 간염 표면 항원(sAg)이 최종적으로 1㎍/㎖ 농도가 되도록 첨가하고, sAg를 첨가하지 않은 웰을 대조군으로 하여(각각 4웰씩) 37℃, 7% CO농도의 배양기에서 4일동안 배양하였다. 배양후 0.5μCi/웰이 되도록H-티미딘(Amersham Cat. No. TRK 686)을 첨가한 후 24시간 더 배양하였다. 배양이 완료되면 스카트론(Skatron)사의 세포 수확기를 사용하여 세포를 포획한 후 세포내로 투입된H-티미딘 양을 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 결과는 하기식을 사용하여 자극 계수(Stimulation index; SI)로 나타내었다.

제8도는 본 발명에 따라 분리 정제된 사포닌 QS-L1의 세포성 면역 반응 보조 증강 효과를 측정하여 자극 계수(SI)로 나타낸 결과이다. 두번의 개별적인 실험을 시행하여, 첫번째 실험에서 각각의 면역 보조제 그룹당 2마리씩의 생쥐가 사용되었으며(a), 두번째 실험에서는 그룹당 4마리씩의 생쥐를 사용하였다(b). 여기에서 보듯이 세포성 면역의 보조에 있어서도 알럼보다 알럼에 QS-L1을 섞어서 사용한 경우에 월등한 면역 증강 효과를 나타냄을 알 수 있다.

상기 각각의 실시예의 결과로부터 본 발명의 정제 방법은 기존의 정제 방법에 비하여 새로운 QS-L1의 존재를 확인하는데 효과적임을 알 수 있으며, 본 발명의 정제 방법에 의해 정제된 사포닌은 독성이 상대적으로 낮으면서 높은 면역 보조 활성을 가지며 또한 QS-L1 사포닌 분획물을 알럼과 함께 면역 보조제로 사용할 경우 세포성 및 체액성 면역 증강 효과를 효율적으로 얻을 수 있음을 알 수 있다. 따라서 이러한 정제방법, 이에 의해 분리정제된 사포닌은 면역 보조제의 개발 및 궁극적으로는 백신의 개발에 크게 기여할 수 있을 것이다.

본 발명은 특정의 구체적인 실시예를 통하여 기술되었지만, 본 발명이 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니며 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 자명한 발명의 변형 및 치환도 본 발명에 포함된다.

Claims

퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)의 표피 추출물을 한외 투석막으로 투석하는 단계, 투석액을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계 및 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는, 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 사포닌을 분리정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 표피 추출물을 아세트산 수용액에 용해시킨 후 아세트산 수용액에 투석하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 12 내지 14 kDa의 한외 투석막을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 0.1% 트리플루오로 아세트산을 포함하는 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 역상 고압 액체 크로마토그래피를 실시함을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항중 어느 한 항의 방법에 따라 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 정제된 사포닌 QS-L1.
제5항에 있어서, 분자량이 956(m/z)인 사포닌 QS-L1.
제5항의 사포닌 QS-L1을 면역 보조제로 포함하는 백신.
제7항에 있어서, 면역 보조제로 수산화알루미늄을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제8항에 있어서, 상기 수산화알루미늄이 항원에 흡착된 것임을 특징으로 하는 백신.
제9항에 있어서, 상기 항원이 B형 간염 표면 항원임을 특징으로 하는 백신.
제7항에 있어서, 상기 사포닌 QS-L1의 투여량이 1 내지 500㎍인 것을 특징으로 하는 백신.