KR0173131B1 - Walk-through mutagenesis - Google Patents

Abstract

본 발명은 돌연변이체의 라이브러리를 제조하기 위하여 예정된 아미노산을, 단백질의 예비선택된 영역(또는 여러개의 상이한 영역들)에 예비 선택된 한 세트의 위치들의 각각의 및 모든 위치에 도입시키는 돌연변이생성법에 관한 것이다. 이 방법은 특정 아미노산이 단백질의 구조 및 기능에 결정적인 역할을 수행한다는 전제를 토대로한다. 라이브러리는 고비율의 소망하는 돌연변이체를 함유하고, 스크리닝에 적당한 크기를 가지도록 제조될 수 있다. 이들 라이브러리는 단백질 구조 및 기능에서 특이한 아미노산들의 역할에 대한 연구 및 효소, 항체, 단일사슬 항체 및 촉매작용 항체 같은 신규한 또는 개선된 단백질 및 폴리펩티드의 개발에 사용될 수 있다.The present invention relates to mutagenesis wherein the amino acids intended to prepare a library of mutants are introduced into each and every position of a preselected set of positions in a preselected region (or several different regions) of the protein. This method is based on the premise that certain amino acids play a crucial role in the structure and function of proteins. Libraries contain high proportions of the desired mutants and can be prepared to have a size suitable for screening. These libraries can be used for the study of the role of specific amino acids in protein structure and function and for the development of new or improved proteins and polypeptides such as enzymes, antibodies, single chain antibodies and catalyzed antibodies.

Description

[발명의 명칭][Name of invention]

워크-쓰루우 돌연변이생성Walk-through mutagenesis

[발명의 상세한 설명]Detailed description of the invention

[발명의 배경][Background of invention]

본 발명은 워크-쓰루우(walk-through) 돌연변이생성에 관한 것이다.The present invention relates to walk-through mutagenesis.

돌연변이생성은 단백질구조 및 기능연구의 강력한 수단이다. 돌연변이는 관심의 단백질을 코드화하는 클론된 유전자의 누클레오티드 서열에서 만들어질 수 있으며, 변형된 유전자는 단백질의 돌연변이체를 생성하도록 발현될 수 있다. 야생형 단백질과 생성된 돌연변이체의 성질을 비교함으로써 단백질의 구조적 통합성 및/또는 생화학적 기능, 예컨대 단백질의 결합 및/또는 촉매활성에 본질적인 개개의 아미노산 또는 아미노산들의 도메인의 확인이 가능해진다.Mutation is a powerful means of studying protein structure and function. Mutations can be made in the nucleotide sequence of the cloned gene encoding the protein of interest, and the modified gene can be expressed to produce a mutant of the protein. By comparing the properties of the resulting mutants with the wild type protein, it becomes possible to identify individual amino acids or domains of amino acids that are essential for the structural integrity and / or biochemical functions of the protein, such as the binding and / or catalytic activity of the protein.

그러나, 돌연변이 생성에는 여러 가지 제한이 따른다. 대다수의 돌연변이체가 생성될 수 있고 그러한 것들로부터 실제로 선택이 가능하지 않다는 그러한 제한중에서도, 돌연변이체들은 많은 정보를 제공해주거나 또는 바람직한 특성을 가질 것이다. 예를 들면, 단백질의 특정 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입이 단백질에 국소적 또는 전체적 영향을 미치는지, 및 그에따라 유용한 정보 또는 기능을 산출하는지의 여부를 예측할 수 있는 신빙성있는 방법이 없다.However, there are several limitations to the generation of mutations. Among such limitations that the majority of mutants can be generated and are not actually selectable from them, the mutants will provide a lot of information or have desirable properties. For example, there is no reliable way to predict whether substitution, deletion or insertion of a particular amino acid of a protein has a local or global effect on the protein and thus yields useful information or function.

이러한 한계 때문에 돌연변이생성에 의해 단백질의 특성을 개선하려는 시도는 대부분이, 특이적이고 잠정적으로 중요한 단백질영역, 예컨대 단백질의 활성부위 영역이나 또는 그 주변에 한정되는 돌연변이의 생성 및 분석에 의존해왔다. 그러나, 돌연변이가 단백질의 특정영역에 제한된다 하더라도, 가능한 돌연변이의 수는 매우 크며, 이것은 생성된 돌연변이체의 확인 및 평가가 어렵거나 불가능하게 만든다. 예를 들어, 모든 다른 자연 발생 아미노산으로 한 아미노산 위치를 치환 시킨다면 19개의 상이한 단백질 변이체가 생긴다. 만약 여러 위치가 한꺼번에 치환된다면, 변이체의 수는 시수함수적으로 증가한다. 단백질의 7개의 아미노산 위치에서 모든 아미노산의 치환이 일어난다면, 19x19x19x19x19x19x19 또는 8.9x10⁸개의 단백질 변이체가 생성되며, 이들로부터 유용한 돌연변이체가 선택되어야 한다. 돌연변이생성의 효과적인 사용을 위해서는, 돌연변이의 형태 및 수는 생성된 돌연변이 단백질의 수가 스크리닝을 위해 적당한 수로 유지되는 약간의 제한기준을 적용받아야 한다.Because of these limitations, attempts to improve the properties of proteins by mutagenesis have largely relied on the generation and analysis of mutations that are confined to or around specific and potentially important protein regions, such as active regions of proteins. However, even if mutations are limited to specific regions of the protein, the number of possible mutations is very large, making the identification and evaluation of the resulting mutants difficult or impossible. For example, replacing one amino acid position with all other naturally occurring amino acids results in 19 different protein variants. If several positions are substituted at once, the number of variants increases time-wise. If all amino acid substitutions occur at the 7 amino acid positions of the protein, 19x19x19x19x19x19x19 or 8.9x10 ⁸ protein variants are generated, from which useful mutants must be selected. For effective use of mutagenesis, the form and number of mutations must be subject to some limitations in that the number of mutant proteins produced is maintained at an appropriate number for screening.

단백질에서 매우 특이적인 돌연변이를 유발하기 위해 개발되었던 돌연변이 생성법은 부위특정 돌연변이이다. 이 방법은 특정 단백질기능에 포함되는 것으로 알려져 있거나 추측되는 작은 부의의 연구에는 가장 유용하다. 이 방법에서 누클레오티드 치환(점(point) 돌연변이)은, 코드화된 아미노산 서열에 있는 다른 아미노산에 대해 한 아미노산의 원하는 치환을 야기하기 위해 DNA 서열의 규정된 위치에서 이루어진다. 이 방법은 올리고누클레오티드를 매개로 한다. 돌연변이를 만들고자 하는 단백질영역을 코드화하는 DNA에 상보하지만 염기치환(들)이 바람직한 위치(들)에서 부적합하게 짝지어진 염기(들)을 포함하고 있는 합성 올리고누클레오티드가 제조된다. 돌연변이된 올리고누클레오티드는 변화(들)을 포함하는 새로운 DNA 스트란드의 합성을 프라임하기 위해 사용되며, 그러므로, 돌연변이 유전자의 합성을 유도한다[Zoller, M. J. and Smith, M., Meth. Enzymol. 100, 468(1983)참조].Mutagenesis, which has been developed to cause very specific mutations in proteins, is site-specific mutations. This method is most useful for small negative studies that are known or suspected to be involved in specific protein functions. In this method, nucleotide substitutions (point mutations) are made at defined positions in the DNA sequence to cause the desired substitution of one amino acid for another amino acid in the encoded amino acid sequence. This method is mediated through oligonucleotides. Synthetic oligonucleotides are prepared that contain a base (s) complementary to the DNA encoding the protein region to be mutated but improperly paired at the desired position (s). Mutated oligonucleotides are used to prime the synthesis of new DNA strands containing change (s), and therefore induce the synthesis of mutant genes [Zoller, M. J. and Smith, M., Meth. Enzymol. 100, 468 (1983).

부위특정돌연변이의 변형들이 과정의 양상을 최적화하기 위해 개발되었다. 대부분의 경우 이런 변형법들은 허트키슨 등의 원래의 방법[Hutchinson, C.A. etal., J. Biol. Chem. 253:6551(1978)]과 레이진 등의 방법[Razin, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4268(1978)]을 토대로 한다. 부위특정돌연변이의 상세한 설명에 대해서는 참고문헌을 참조한다[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, New York, chapter 15].Variations of site-specific mutations have been developed to optimize the behavior of the process. In most cases these modifications are the original method of Hutchinson et al. [Hutchinson, C.A. et al., J. Biol. Chem. 253: 6551 (1978) and the methods of Razin et al. [Razin, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4268 (1978). For a detailed description of site-specific mutations, see references (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, New York, chapter 15).

보다 더 많은수의 돌연변이를 생성하기 위해 고안된 돌연변이생성의 방법은 포화 돌연변이생성이다. 이 방법도 또한 올리고누클레오티드를 매개체로 한다. 이 방법에서 모든 가능한 점 돌연변이(누클레오티드 치환)는 단백질의 주어진 영역을 코드화하는 DNA내의 하나 또는 그 이상의 위치에서 만들어진다. 이들 돌연변이는 영역을 코드화하는 DNA의 천연절편대신 유전자내에 삽입되는 올리고누클레오티드의 단일혼합물을 합성함으로써 만들어진다. 합성의 각 단계에서, 3개의 비야생형 누클레오티드가 야생형 누클레오티드를 따라 올리고누클레오티드 안으로 통합된다. 비 야생형 누클레오티드는 예정된 백분율만큼 통합되어, 서열의 모든 가능한 변화가 예상했던 빈도로 생성된다. 이런 방법으로, 모든 가능한 누클레오티드 치환은 유전자의 규정된 영역내에서 이루어지고, 그 결과 규정된 영역의 아미노산이 무작위적으로 변화하는 많은 돌연변이 단백질이 생성된다[Oliphant, A.R. et al., Meth. Enzymol. 155:568(1987)].The method of mutagenesis designed to generate even more mutations is saturation mutagenesis. This method also mediates oligonucleotides. In this method all possible point mutations (nucleotide substitutions) are made at one or more positions in the DNA encoding a given region of the protein. These mutations are made by synthesizing a single mixture of oligonucleotides that are inserted into the gene instead of the native fragment of the DNA encoding the region. At each stage of the synthesis, three non-wild nucleotides are integrated along the wild type nucleotide into the oligonucleotide. Non-wild-type nucleotides are integrated by a predetermined percentage, so that all possible changes in sequence are generated at the expected frequency. In this way, all possible nucleotide substitutions are made within a defined region of the gene, resulting in many mutant proteins with random changes in amino acids in the defined region [Oliphant, A.R. et al., Meth. Enzymol. 155: 568 (1987).

포화 돌연변이생성같은 무작위 돌연변이생성법은, 돌연변이가 유용한 정보 또는 기능적인 돌연변이체를 산출해야만 하는 당위성을 예측하지 못하는 것을 보충하기 위해 고안된다. 이 방법은, 관련 단백질 도메인의 모든 또는 대다수의 가능한 변이체를 생성함에의해 아미노산의 적절한 배열이 무작위하게 생성된 돌연변이체중의 하나로서 생성되는 것 같은 원리를 토대로 한다. 그러나, 돌연변이의 완전히 무작위한 조합에 대해서는, 생성된 돌연변이수는 의미심장하게 선택하는 능력을 능가할 수 있다. 실제로, 생성된 무작위 돌연변이수는 소망하는 돌연변이를 산출할 수 있을 정도로 충분히 크고, 그러나 선택 시스템의 용량이 초과되지 않도록 충분히 작아야 한다. 이것은 대부분의 단백질의 주어진 크기 및 복잡성에 대해 언제나 가능하지는 않다.Random mutagenesis, such as saturation mutagenesis, is designed to compensate for the fact that mutations do not predict the justification that they must yield useful information or functional mutants. This method is based on the principle that by generating all or the majority of possible variants of the relevant protein domain, an appropriate arrangement of amino acids is generated as one of the randomly generated mutants. However, for a completely random combination of mutations, the number of mutations produced may surpass the ability to meaningfully select. In practice, the random number of mutations produced is large enough to yield the desired mutations, but should be small enough so that the capacity of the selection system is not exceeded. This is not always possible for a given size and complexity of most proteins.

[발명의 요약][Summary of invention]

본 발명은 신규한 또는 개선된 단백질(또는 폴리펩티드)의 생성을 위한 돌연변이생성법 및, 이 방법에 의해 생성된 돌연변이 단백질 및 특이한 돌연변이 단백질의 라이브러리에 관련한다. 돌연변이생성의 표적이 되는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 천연, 합성 또는 유전공학적으로 제조된 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 변이체(예컨대 돌연변이체)일 수 있다. 한 구체예에서, 방법은 예정된 아미노산을, 단백질의 아미노산 서열의 예정된 영역(또는 여러개의 상이한 영역)의 각각 및 모든 위치에 도입시키는 것을 포함한다. 영역의 하나 또는 그 이상의 위치에, 및 총괄적으로 영역의 모든 위치에 예정된 아미노산을 가지고 있는 돌연변이 단백질을 함유하는 단백질 라이브러리가 생성된다. 이 방법은 워크-쓰루우(walk-through) 돌연변이생성이라 불리는데, 왜냐하면, 실제로, 하나의 예정된 아미노산이 단백질의 규정된 영역을 두루통하여 위치에서 위치로 치환되기 때문이다. 이것은 단백질의 구조 또는 기능에서 차지하는 특이한 아미노산의 역할의 체계적인 평가를 가능하게 한다.The present invention relates to mutagenesis for the production of new or improved proteins (or polypeptides) and libraries of mutant proteins and specific mutant proteins produced by the methods. The protein, peptide or polypeptide targeted by mutagenesis may be a protein, peptide or polypeptide or variant (eg a mutant) produced naturally, synthetically or genetically. In one embodiment, the method comprises introducing a predetermined amino acid at each and every position of a predetermined region (or several different regions) of the amino acid sequence of the protein. A protein library is created that contains mutant proteins having predetermined amino acids at one or more positions in the region and collectively at all positions in the region. This method is called walk-through mutagenesis because in practice, one predetermined amino acid is substituted from position to position throughout a defined region of the protein. This allows for a systematic assessment of the role of specific amino acids in the structure or function of proteins.

돌연변이 단백질의 라이브러리는, 예정된 아미노산을 함유하는 영역에 대한 아미노산 서열의 모든 소망하는 변이를 코드화하는 올리고누클레오티드의 단일 혼합물을 합성함으로써 생성될 수 있다. 이 올리고누클레오티드의 혼합물은 합성의 각각의 축합단계에서 돌연변이시키고자 하는 서열(예컨대 야생형 서열)의 누클레오티드와 예정된 아미노산의 코돈에 필요한 누클레오티드 2가지를 모두 통합시킴으로써 합성된다. 돌연변이시키고자 하는 서열의 누클레오티드가 예정된 아미노산에 대한 누클레오티드와 동일할때 추가의 누클레오티드는 첨가되지 않는다. 그 결과의 혼합물에서, 예정된 아미노산에 대한 최소한 하나의 코돈을 함유하고 있는 올리고누클레오티드가 약 12.5% 내디 100%의 구성성분을 형성한다. 또한, 올리고누클레오티드의 혼합물은 서열의 모든 위치에 대한 위치가 없는 범위에서 예정된 아미노산을 함유하고 있는 아미노산 서열의 통계학상의(어떤 경우에는 가우스의)분포를 코드화한다.Libraries of mutant proteins can be generated by synthesizing a single mixture of oligonucleotides encoding all desired variations of amino acid sequences for regions containing predetermined amino acids. This mixture of oligonucleotides is synthesized by integrating both the nucleotide of the sequence to be mutated (such as the wild-type sequence) and the nucleotide required for the codon of the predetermined amino acid at each condensation step of the synthesis. No additional nucleotide is added when the nucleotide of the sequence to be mutated is identical to the nucleotide for the intended amino acid. In the resulting mixture, oligonucleotides containing at least one codon for a given amino acid form about 12.5% to 100% of the component. In addition, mixtures of oligonucleotides encode a statistical (in some cases Gaussian) distribution of amino acid sequences that contain a predetermined amino acid in a range free of positions for all positions in the sequence.

올리고노클레오티드의 혼합물은 영역을 코드화하는 DNA 대신에 돌연변이시키고자 하는 단백질(예컨대 야생형 단백질)을 코드화하는 유전자안에 삽입된다. 재조합 돌연변이 유전자는 소망하는 특성을 가지는 단백질에 대하여 스크린될 수 있는 돌연변이 단백질의 발현라이브러리를 제공하기 위해 적당한 발현 벡터에 클론된다. 이 올리고누클레오티드-중재 과정에 의해 생성된 돌연변이 단백질의 라이브러리는, 포화 돌연변이생성법에 의하여 생성된 라이브러리보다 더 많은 비율의, 비정보적인 돌연변이체에 대한 정보제공 돌연변이체(규정된 영역에 예정된 아미노산을 함유하는 것들)를 함유한다. 예컨대 바람직한 라이브러리는 영역내의 각각의 및 모든 위치에 본질적으로 약 12.5% 내지 100%의 빈도로 예정된 아미노산을 가지고 있는 돌연변이체로 구성된다.A mixture of oligonucleotides is inserted into the gene encoding the protein to be mutated (eg wild type protein) instead of the DNA encoding the region. Recombinant mutant genes are cloned into an appropriate expression vector to provide an expression library of mutant proteins that can be screened for proteins with desired properties. The library of mutant proteins produced by this oligonucleotide-mediated process contains more proportions of informational mutants (contains amino acids predetermined in a defined region) than non-informative mutants than libraries produced by saturation mutagenesis. Things). For example, a preferred library consists of mutants having predetermined amino acids at frequencies of essentially about 12.5% to 100% at each and all positions within a region.

이 돌연변이생성법은 스크리닝에 실제 사용할 수 있는 크기인 돌연변이 단백질의 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 단백질구조 및 기능에서 특정 아미노산의 역할을 연구하는데 및, 신규한 또는 개선된 단백질 및 폴리펩티드, 예컨대 효소, 항체, 항체의 결합단편 또는 유사체, 단일사슬 항체 및 촉매적 항체의 개발에 사용될 수 있다.This mutagenesis can be used to generate a library of mutant proteins that is of a size that can be used in practice for screening. This method can be used to study the role of specific amino acids in protein structure and function and to develop new or improved proteins and polypeptides such as enzymes, antibodies, binding fragments or analogs of antibodies, single chain antibodies and catalytic antibodies. have.

[도면의 간단한 설명][Brief Description of Drawings]

제1도는 경쇄(L)의 CDR2(His) 및 중쇄(H)의 CDR1(Asp) 및 CDR3(Ser)에 대해 수행된, 면역글로불린 MCPC 603의 Fv 영역의 워크-쓰루우 돌연변이생성의 개략도이다.1 is a schematic of walk-through mutagenesis of the Fv region of immunoglobulin MCPC 603, performed on CDR2 (His) of light chain (L) and CDR1 (Asp) and CDR3 (Ser) of heavy chain (H).

제2도는 효소 활성부위의 워크-쓰루우 돌연변이생성의 개략도이다; 활성부위의 3개의 아미노산영역은 각각 및 모든 위치에서 세린-프로테아제 촉매적 트라이애드(triad)의 아미노산으로 치환된다.2 is a schematic of walk-through mutagenesis of an enzyme site; The three amino acid regions of the active site are substituted with amino acids of the serine-protease catalytic triad, respectively and at all positions.

제3도는 MCPC 603의 중쇄의 CDR1(제3a도)및 CDR3(제3b도), 및 경쇄의 CDR2(제3c도)의 워크-쓰루우 돌연변이생성에 대한 축중 올리고누클레오티드의 디자인을 도시한다.Figure 3 depicts the design of degenerate oligonucleotides for walk-through mutagenesis of CDR1 (Figure 3a) and CDR3 (Figure 3b) of the heavy chain of MCPC 603, and CDR2 (Figure 3c) of the light chain.

제4도는 돌연변이생성의 윈도우(Window)의 디자인과, MCPC 603의 중쇄의 CDR3의 돌연변이에 대한 축중 올리고누클레오티드 서열(제4a도) 및 경쇄의 CDR2의 돌연변이에 대한 축중 올리고누클레오티드 서열(제4b도)을 도시한다.4 shows the design of the window of mutagenesis, the degenerate oligonucleotide sequence for mutation of CDR3 of the heavy chain of MCPC 603 (FIG. 4A) and the degenerate oligonucleotide sequence for mutation of CDR2 of the light chain (FIG. 4B). To show.

제5a도 및 5b도는 돌연변이생성의 윈도우의 디자인과, MCPC 603의 중쇄의 CDR2의 His를 이용한 2개의 상이한 워크-쓰루우 돌연변이생성 과정에 대한 축중 올리고누클레오티드의 서열을 도시한다.5A and 5B show the design of the mutagenesis window and the sequence of degenerate oligonucleotides for two different walk-through mutagenesis processes using His of CDR2 of the heavy chain of MCPC 603.

제6도는 MCPC 603의 중쇄의 CDR2의 워크-쓰루우 돌연변이생성에 대한 축중 올리고누클레오티드의 디자인 및 서열을 예시한다.6 illustrates the design and sequence of degenerate oligonucleotides for walk-through mutagenesis of CDR2 of the heavy chain of MCPC 603.

제7도는 촉매적 부위에서 3개의 연속 아미노산 잔기로 구성되는, HIV 프로테아제에서의 돌연변이생성의 윈도우를 예시한다. Asp, Ser 및 His가 포함된 영역의 3회 워크-쓰루우 돌연변이생성에 대한 축중 올리고누클레오티드의 디자인 및 서열이 도시된다.7 illustrates a window of mutagenesis in HIV proteases, consisting of three consecutive amino acid residues at the catalytic site. The design and sequence of degenerate oligonucleotides for three walk-through mutagenesis of the regions containing Asp, Ser and His are shown.

제8도는 MCPC 603의 5CDR의 워크-쓰루우 돌연변이생성에 대한 축중 올리고누클레오티드의 디자인 및 서열을 예시한다. 경쇄의 CDR1(제8a도) 및 CDR3(제8b도) 및, 중쇄의 CDR1(제8c도), CDR2(제8d도) 및 CDR3(제8e도)의 워크-쓰루우 돌연변이생성에 대한 축중 올리고누클레오티드가 도시된다.Figure 8 illustrates the design and sequence of degenerate oligonucleotides for walk-through mutagenesis of 5CDR of MCPC 603. Degenerate oligos for walk-through mutagenesis of CDR1 (Figure 8a) and CDR3 (Figure 8b) of the light chain and CDR1 (Figure 8c), CDR2 (Figure 8d) and CDR3 (Figure 8e) of the heavy chain Nucleotides are shown.

[발명의 상세한 설명]Detailed description of the invention

단백질의 연구로 특정아미노산이 단백질의 구조 및 기능에 결정적인 역할을 한다는 것이 드러났다. 예를 들어, 효소의 촉매사건에 단지 몇 개의 아미노산이 참여하는 것으로 여겨진다. 세린 프로테아제는 실제로 모든 유기체에 존재하는 효소군으로, 세린, 히스티딘 및 아스파르트산의 조합된 존재를 특징으로 하는 구조적으로 유사한 촉매작용부의를 나타냈다. 상기 세 아미노산은 아마도 다른 결정기와 함께, 기질의 전이상태를 안정화시키는 촉매작용 트라이애드를 형성한다. 이 촉매작용 트라이애드의 기능적 역할은, 세린, 프로테아제의 부위특정 돌연변이생성에 의한 세린, 히스티딘 및 아스파르트산의 개별적인 및 다중치환에 의하여 확인되고, 촉매 작용시 이들 아미노산 잔기들 사이의 상호작용의 중요성은 현재 잘 알려져있다. 이들 동일한 3개의 아미노산은 또한 특정 리파아제의 효소적 메카니즘에 포함된다. 마찬가지로, 대다수의 다른 타입의 효소들은 그것들의 촉매작용부위의 독특한 형태 및 촉매작용사건의 1차적 원인이 되는 부위에서의 특정종류의 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 한다[Enzyme Structure and Mechanism, 1985, A. Fersht, Freeman Ed., New York 참조].Studies of proteins have revealed that specific amino acids play a crucial role in the structure and function of proteins. For example, only a few amino acids are believed to be involved in the catalysis of enzymes. Serine proteases are actually a group of enzymes present in all organisms, exhibiting structurally similar catalysis characterized by the combined presence of serine, histidine and aspartic acid. These three amino acids, together with other determinants, form a catalytic triad that stabilizes the transition state of the substrate. The functional role of this catalyzed triad is confirmed by the individual and polysubstitution of serine, histidine and aspartic acid by site-specific mutagenesis of serine, protease, and the importance of the interaction between these amino acid residues in catalysis Currently well known These same three amino acids are also included in the enzymatic mechanism of certain lipases. Likewise, most other types of enzymes are characterized by the unique shape of their catalysis site and the presence of certain kinds of amino acid residues at sites that are the primary cause of catalysis events [Enzyme Structure and Mechanism, 1985, A]. See Fersht, Freeman Ed., New York.

특정 아미노산이 촉매의 메카니즘에 결정적인 것이 분명하긴 하지만, 아미노산이 촉매작용부위같은 기능부위를 생성하기위해서 어떤 위치(또는 위치들)를 차지해야만 하는지 예측하기란, 불가능하지 않더라도 어렵다. 불행하게도, 단백질의 아미노산 측쇄의 복잡한 공간구조 및 효소의 촉매작용 포켓(pocket)에서 상이한 측쇄들의 상호관계는 그러한 예측을 허용하기에는 불충분하게 이해되어 있다. 상기에서 지적한 바와 같이, 선택적(부위 특정) 돌연변이생성 및 포화 돌연변이생성은, 복잡한 단백질의 수많은 가능한 변이의 견지에서 볼때 단백질 구조 및 기능연구에 대해 그 활용성이 제한된다.While it is clear that certain amino acids are crucial to the mechanism of the catalyst, it is difficult, if not impossible, to predict which position (or positions) an amino acid must occupy to produce a functional site, such as a catalytic site. Unfortunately, the complex spatial structure of the amino acid side chains of the protein and the interrelationships of the different side chains in the catalysis pocket of the enzyme are insufficiently understood to allow such prediction. As noted above, selective (site specific) mutagenesis and saturation mutagenesis have limited utility for protein structure and function studies in view of the numerous possible variations of complex proteins.

본 발명의 방법은 단백질의 구조 또는 기능에 대한 및 유용한 단백질을 생성하기 위한 특정 아미노산의 중요성, 및 단백질의 규정된 영역 내에서의 그러한 아미노산의 위치를 평가하기 위한 체계적이고 실제적인 접근법을 제공한다. 그 방법은 특정한 예정된 아미노산이 특정구조 또는 기능에 대해 중요하다는 가정으로 시작한다. 이 가정은 단순한 생각을 토대로 한다. 보다 정확하게 설명하자면, 이 가정은 다른 단백질들의 연구로부터 아미노산에 대해 알려져 있는 것이 무엇인가를 토대로한다. 예를 들어, 아미노산은 촉매, 결합 또는 다른 기능에서도 역할을 가지는 것일 수 있다.The methods of the present invention provide a systematic and practical approach for assessing the importance of specific amino acids for the structure or function of proteins and for producing useful proteins, and the location of such amino acids within defined regions of the protein. The method begins with the assumption that certain predetermined amino acids are important for a particular structure or function. This assumption is based on simple ideas. To be more precise, this assumption is based on what is known about amino acids from the study of other proteins. For example, an amino acid may be one that also plays a role in catalysts, bonds, or other functions.

예정된 아미노산을 선택하면, 연구하고자 하는 단백질의 돌연변이체의 라이브러리가, 그 예정된 아미노산을 단백질영역의 각각의 및 모든 위치에 통합시킴으로써 생성된다. 제1도 및 2도에 개략적으로 도시된 바와 같이, 아미노산은 영역의 모든(또는 본질적으로 모든) 위치에서 치환되거나 또는 워크-쓰루우한다.When a predetermined amino acid is selected, a library of mutants of the protein to be studied is generated by integrating the predetermined amino acid at each and every position of the protein region. As schematically shown in FIGS. 1 and 2, amino acids are substituted or walk-through at all (or essentially all) positions of the region.

돌연변이 단백질의 라이브러리는 영역의 각각의 및 모든 위치에서 예정된 아미노산을 가지고 있는 개별적인 단백질들을 함유한다. 단백질 라이브러리는 포화 돌연변이 같은 완전히 무작위적인 돌연변이에 의해 생성될 수 있는 라이브러리에 비교하여, 영역에 예정된 아미노산을 함유하는 돌연변이체를(그렇지 않은 돌연변이에 대하여), 더 높은 비율로 가질 것이다. 그러므로, 소망하는 타입의 돌연변이체들은 라이브러리에서 농축된다. 이러한 사실은 여전히 스크린될 수 있는 크기의 라이브러리를 산출하면서도 워크-쓰루우 방법에 의해 돌연변이될 수 있는 단백질의 더 많고 더 큰 영역을 제공하기 때문에 중요하다. 나아가, 만약 초기의 가정이 정확하고, 아미노산이 단백질의 구조 또는 기능에 중요하다면, 라이브러리는 무작위 돌연변이에 의해 생성된 라이브러리보다 더 높은비율의 정보 제공 돌연변이체들을 가질것이다.The library of mutant proteins contains individual proteins with predetermined amino acids at each and every position of the region. A protein library will have a higher proportion of mutants (for those that do not) that contain a predetermined amino acid in a region compared to a library that can be produced by a completely random mutation, such as a saturation mutation. Therefore, the desired type of mutants are enriched in the library. This fact is important because it yields a library of a size that can be screened while still providing a larger and larger area of protein that can be mutated by the walk-through method. Furthermore, if the initial assumptions are correct and amino acids are important for the structure or function of the protein, the library will have a higher proportion of informational mutants than the library produced by random mutations.

다른 구체예에서, 예정된 아미노산은 미리규정된 영역 또는 영역들내에서 각각의 특정의 선택된 위치 안에 도입된다. 특정의 선택된 위치들은 구조적 제한으로 인하여 보다 더 유망한 것으로 알려져 있거나 또는 그렇게 여겨진다. 돌연변이시키고자 하는 분자 및/또는 소망하는 구조의 구조적 정보 또는 모델화를 토대로하여, 상기와 같은 생각은 돌연변이생성을 위한 영역 또는 영역들내에 있는 위치들의 하위세트를 선택하는데 사용될 수 있다. 그로써, 영역내에서 돌연변이되는 아미노산들은 인접할 필요는 없다. 영역내에서 특정의 선택된 위치들을 통하여 아미노산이 이동하는 것은 생성되는 변이체의 수를 최소화시킬수 있다.In other embodiments, the predetermined amino acid is introduced into each particular selected position within a predefined region or regions. Certain selected locations are known or believed to be more promising due to structural limitations. Based on the structural information or modeling of the molecule and / or desired structure to be mutated, this idea can be used to select a region or subset of positions within the regions for mutagenesis. As such, the amino acids that are mutated within the region need not be contiguous. Movement of amino acids through certain selected positions within the region can minimize the number of variants produced.

라이브러리의 크기는 돌연변이되는 영역내에서 영역 및 아미노산의 길이 및 수에 따라 달라질 것이다. 바람직하게 라이브러리는 10¹⁰미만의 돌연변이체, 보다 바람직하게는 10⁹미만의 돌연변이체를 포함하도록 디자인될 것이다.The size of the library will vary depending on the length and number of regions and amino acids in the region to be mutated. Preferably the library will be designed to contain less than 10 ¹⁰ mutants, more preferably less than 10 ⁹ mutants.

바람직한 구체예에서 돌연변이 단백질의 라이브러리는, 단백질의 규정된 영역에 대한 아미노산 서열들의 선택된 치환을 코드화하는 올리고누클레오티드들의 혼합물(축중 올리고누클레오티드)을 합성함으로써 생성된다. 편리하게도, 올리고누클레오티드의 혼합물은 1회 합성으로 생성될 수 있다. 이것은 올리고누클레오티드내에 있는 각 위치에, 야생형 단백질(또는 돌연변이시키고자 하는 다른 단백질)의 합성에 필요한 누클레오티드와, 예정된 아미노산의 코돈에 필요한 단일한 적절한 누클레오티드를 통합시킴으로써 이루어진다(이것은 각각의 돌연변이된 DNA 위치에 대하여, 포화에 대해 3개의 추가의 누클레오티드가 첨가되는 것과는 반대로, 단지 하나의 추가의 누클레오티드만이 첨가된다는 점에서, 포화 돌연변이생성에서 생성된 올리고누클레오티드들과는 다르다). 2개의 누클레오티드는 전형적으로, 그러나 비필수적으로, 반응에 대해 거의 동일농도로 사용되어 원하는 위치에서 서열안으로 어느하나가 통합되는 기회는 균등하다. 야생형 서열의 누클레오티드와 예정된 아미노산의 코돈에 대한 누클레오티드가 동일한 경우, 누클레오티드가 추가로 통합되지는 않는다.In a preferred embodiment a library of mutant proteins is generated by synthesizing a mixture of oligonucleotides (degenerate oligonucleotides) that encode selected substitutions of amino acid sequences for defined regions of the protein. Conveniently, mixtures of oligonucleotides can be produced in a single synthesis. This is accomplished by integrating the nucleotides necessary for the synthesis of the wild-type protein (or other protein to be mutated) with a single appropriate nucleotide required for the codon of the predetermined amino acid at each position in the oligonucleotide (this is at each mutated DNA position In contrast to the addition of three additional nucleotides for saturation, the oligonucleotides produced in saturation mutagenesis differ in that only one additional nucleotide is added). The two nucleotides are typically, but non-essentially, used at about the same concentration for the reaction so that the opportunity to integrate either into the sequence at the desired location is even. If the nucleotide of the wild-type sequence is identical to the nucleotide for a codon of a predetermined amino acid, the nucleotide is not further integrated.

예정된 아미노산에 대한 코돈을 제공하기 위해 돌연변이되는 누클레오티드의 수에 따라, 올리고누클레오티드의 혼합물은 제한된수의 새로운 코돈을 생성할 것이다. 예를 들어, 만약 단지 하나의 누클레오티드가 돌연변이되면, 그 결과의 DNA 혼합물은 원래의 코돈 또는 예정된 아미노산의 코돈중 어느 하나를 코드화할 것이다. 이 경우, 결과의 혼합물의 모든 올리고누클레오티드의 50%가 그 위치에서 예정된 아미노산에 대한 코돈을 함유할 것이다. 만약 어떤 조합으로 2개의 누클레오티드가 돌연변이되면(첫번째와 두번째, 첫번째와 세번째 또는 두번째와 세번째), 4개의 상이한 코돈이 가능하며 최소한 하나는 25%빈도로 예정된 아미노산을 코드화할 것이다. 만약 모든 3개의 염기가 돌연변이되면, 혼합물은 8개의 상이한 코돈을 생성할 것이며, 그중 하나가 예정된 아미노산을 코드화할 것이다. 그러므로 코돈은 그 위치에서 12.5%의 최소 빈도로 나타날 것이다. 그런, 8개의 코돈중에서 추가로 하나가 동일한 아미노산을 코드할 수도 있고 / 또는 정지 코돈을 코드할 수도 있으며, 따라서 예정된 아미노산의 빈도는 12.5%보다 더 클 수도 있는 것 같다.Depending on the number of nucleotides that are mutated to provide a codon for a given amino acid, a mixture of oligonucleotides will produce a limited number of new codons. For example, if only one nucleotide is mutated, the resulting DNA mixture will encode either the original codon or the codon of the predetermined amino acid. In this case, 50% of all oligonucleotides of the resulting mixture will contain codons for the amino acids scheduled at that position. If any combination of two nucleotides is mutated (first and second, first and third or second and third), four different codons are possible and at least one will encode a predetermined amino acid at 25% frequency. If all three bases are mutated, the mixture will produce eight different codons, one of which will encode the intended amino acid. Codons will therefore appear at a minimum frequency of 12.5% at that location. However, one of the eight codons may additionally code for the same amino acid and / or code for a stop codon, so that the frequency of the scheduled amino acid may be greater than 12.5%.

이 방법에 의하여, 예정된 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 서열들을 고비율로 가지고 있는 올리고누클레오티드의 혼합물이 생성된다. 합성의 다른 제한이 상기비율을 증가시키기 위해 부과될 수 있다(예정된 아미노산에 대한 코돈을 최소한 하나 함유하지 않는 혼합물중의 올리고누클레오티드의 수를 감소시킴으로써 행함). 예를 들어, 완전한 코돈(3개의 누클레오티드)이 예정된 아미노산에 대한 코돈이 되기 위해 치환되어야만 하는 경우, 치환용 누클레오티드만이 도입될 수 있다(그러므로, 예정된 아미노산에 대한 코돈은 그 위치에서 100% 빈도로 나타난다).This method produces a mixture of oligonucleotides having a high proportion of sequences containing codons for a predetermined amino acid. Other restrictions of the synthesis may be imposed to increase the ratio (by reducing the number of oligonucleotides in the mixture that do not contain at least one codon for the expected amino acid). For example, if a complete codon (three nucleotides) has to be substituted to become a codon for a given amino acid, only a replacement nucleotide can be introduced (and therefore the codon for the predetermined amino acid is 100% frequency at that position). appear).

야생형 누클레오티드와 예비선택된 아미노산을 코드하는 누클레오티드의 비율은, 어느 한 위치 또는 모든 위치에서 조정되어 코드화된 아미노산의 비율에 영향을 미칠 수 있다.The ratio of the nucleotide encoding the wild type nucleotide to the preselected amino acid can be adjusted at either or all positions to affect the proportion of the encoded amino acid.

이 과정에 의해 생성된 단백질 라이브러리에서, 규정된 영역에서 예정된 아미노산의 최소한 하나의 잔기를 가지는 돌연변이체의 비율은 라이브러리의 모든 돌연변이체의 약 12.5% 내지 100%범위이다(대략 동일비율의 야생형 염기와 예비 선택된 아미노산 염기가 합성에 사용되는 것으로 가정한다). 전형적으로, 비율은 약 25% 내지 50%이다.In the protein library produced by this process, the proportion of mutants having at least one residue of a predetermined amino acid in a defined region ranges from about 12.5% to 100% of all mutants in the library (approximately equal proportions of wild type bases). It is assumed that the preselected amino acid base is used for synthesis). Typically, the ratio is about 25% to 50%.

단백질 돌연변이체의 라이브러리들은 2ⁿ과 같거나 2ⁿ보다 작은수를 함유할 것이다. 여기에서 n은 단백질영역을 코드화하는 DNA내에서 돌연변이된 누클레오티드의 수를 나타낸다. 각 코돈에 대하여 단지 제한된 수 (하나, 둘 또는 셋)의 변화가 있을 수 있으므로, 단백질 돌연변이체의 수는 2m 내지 8^m의 범위일 것이다. 이때에 m은 영역내에서 돌연변이된 아미노산의 수이다. 이것은 포화 돌연변이 생성에 의하여 생성된 19^m개의 돌연변이체와 비교할때 돌연변이체수의 극적인 감소를 나타낸다. 예를 들어, 7개의 아미노산으로된 아미노산영역에 대하여, (한 아미노산의)워크 쓰루우 돌연변이생성에 의해 생성된 돌연변이체의 수는, 영역의 포화 돌연변이생성에 의해 생성될 수 있는 돌연변이체수의 0.000014% 내지 0.24% 부분을 차지할 것이다. 즉 매우 상당한 감소가 이루어 진다.Libraries of protein mutants will be equal to 2 ^n, or contain a number less than 2 ^n. Where n represents the number of nucleotides mutated in the DNA encoding the protein region. Since there may be only a limited number (one, two or three) of changes for each codon, the number of protein mutants will range from 2 m to 8 ^m . Where m is the number of amino acids mutated in the region. This represents a dramatic decrease in the number of mutants compared to the 19 ^m mutants produced by saturation mutagenesis. For example, for an amino acid region of seven amino acids, the number of mutants generated by walk through mutagenesis (of one amino acid) is 0.000014% of the number of mutants that can be produced by saturation mutagenesis of the region. To 0.24%. That is a very significant reduction.

본 발명 방법에 의해 생성된 라이브러리의 추가의 유익한 특징은, 예정된 아미노산을 함유하는 단백질이 아미노산 서열에서 아미노산의 잔기의 수에 대하여 통계학상의 분포에 일치한다는 것이다. 따라서, 서열들은 예정된 아미노산이 영역 내의 어떤 위치에서도 나타나지 않는 서열들로부터, 영역내의 모든 위치에서 예정된 아미노산이 나타나는 서열들로 변한다. 그러므로, 아미노산을 단백질의 영역안에 체계적으로 삽입하기 위한 수단을 제공하는 것에 더불어, 이 방법은 특정 아미노산을 가지고 있는 단백질의 영역을 풍부하게 하는 방법을 제공한다. 이러한 풍부화는 아미노산이 원인이 되는 활성 또는 완전히 새로운 활성의 증가를 유도할 수 있다.A further advantageous feature of the library produced by the method of the present invention is that the protein containing the predetermined amino acid is consistent with the statistical distribution with respect to the number of residues of the amino acid in the amino acid sequence. Thus, the sequences change from sequences in which the predetermined amino acid does not appear at any position in the region, to sequences in which the predetermined amino acid appears at all positions in the region. Therefore, in addition to providing a means for systematically inserting amino acids into the region of a protein, this method provides a way to enrich the region of a protein with a particular amino acid. This enrichment can lead to an increase in the activity attributed to amino acids or an entirely new activity.

라이브러리의 생성에 대한 올리고누클레오티드의 혼합물은 DNA 합성에 대해 공지되어 있는 방법에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 바람직한 방법은 고체상 베타-시아노에틸 포스포라미디트 화학의 사용을 포함한다(미국특허 제 4,725,677호 참조). 편리를 목적으로, 누클레오티드 합성원(synthon)의 10개의 시약 용기(DNA 합성에 대한 시약), 4개의 합성원(A, T, C 및 G)중의 하나를 함유하는 4개의 용기 및 2개의 합성원의 혼합물(A+T, A+C, A+G, T+C, T+G 및 C+G)을 함유하는 6개의 용기를 포함하는, 자동 DNA 합성용 기기가 사용될 수 있다.Mixtures of oligonucleotides for the production of libraries can be readily identified by methods known for DNA synthesis. Preferred methods include the use of solid phase beta-cyanoethyl phosphoramidite chemistry (see US Pat. No. 4,725,677). For convenience, 10 reagent vessels of nucleotide synthesis (reagents for DNA synthesis), 4 vessels containing one of four synthesis sources (A, T, C, and G) and two synthesis sources A device for automated DNA synthesis can be used, comprising six vessels containing a mixture of (A + T, A + C, A + G, T + C, T + G and C + G).

야생형 누클레오티드 서열은, 올리고누클레오티드의 혼합물을 단순화시키고 코드화된 아미노산의 수를 최소화하기 위하여 합성중에 조정될 수 있다. 예를 들어, 만약 야생형 아미노산이 트레오닌이면(ACT), 예비선택된 아미노산은 아르기닌이고(AGA 또는 AGG), 아르기닌을 코드화하기 위해서는 2개의 염기 변화가 필요하며, 3개의 아미노산이 생성된다(예컨대, AGA Arg;AGT, Ser;ACA, ACT, Thr). 야생형 누클레오티드 서열은 ACA 또는 ACG로 변화시킴으로써, 아르기닌을 코드화하기 위해서는 단지 단일한 염기 변화만이 필요할 것이다. 그러므로, 만약 야생형 트레오닌을 코드화하기 위해 ACT 대신에 ACG가 선택되었다면, 아르기닌을 얻기 위해 단지 가운데 염기만이 G로 변화될 필요가 있고, 그 위치에서 아르기닌과 트레오닌만이 생성될 것이다. 예비선택된 아미노산의 동일성과 특정 코돈에 따라, 야생형 코돈의 어떠한 위치에서의 유사한 조정이 생성된 변이체의 수를 감소시킬 수 있다.Wild-type nucleotide sequences can be adjusted during synthesis to simplify the mixture of oligonucleotides and to minimize the number of encoded amino acids. For example, if the wild type amino acid is threonine (ACT), the preselected amino acid is arginine (AGA or AGG), and two base changes are required to encode arginine, and three amino acids are generated (eg, AGA Arg). ; AGT, Ser; ACA, ACT, Thr). By changing the wild type nucleotide sequence to ACA or ACG, only a single base change will be required to encode arginine. Therefore, if ACG was chosen instead of ACT to encode wild type threonine, only the middle base would need to be changed to G to obtain arginine, and only arginine and threonine would be produced at that position. Depending on the identity of the preselected amino acid and the particular codon, similar adjustments at any position of the wild type codon can reduce the number of variants generated.

올리고누클레오티드의 혼합물은 돌연변이 단백질은 코드화하는 재조합 돌연변이 유전자를 생성하기 위하여, 영역의 아미노산 서열을 코드화하는 누클레오티드 서열대신에 돌연변이될 단백질의 클론된 유전자안에 삽입된다. 이것을 용이하게 하기 위해, 올리고누클레오티드의 혼합물은 제한 효소에 대한 플랭킹 인지부위들을 함유하도록 만들어질 수 있다[미합중국특허 제4,888,286호 참조]. 인지부위는 영역을 코드화하는 DNA에 인접한 유전자에 도입되거나 천연적으로 존재하는 인지부위에 상응하도록 고안된다. 이중 스트란드 형태로 전환된 후, 올리고누클레오티드들은 스트란드기법에 의해 유전자안에 결찰된다. 적절한 벡터에 의하여, 유전자들이 돌연변이 단백질의 발현에 적당한 숙주세포에 도입된다[Huse, W.D. et al., Science 246:1275 (1989); Viera, J. et al., Meth. Enzymol. 153:3(1987)참조].A mixture of oligonucleotides is inserted into the cloned gene of the protein to be mutated instead of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the region, to produce a recombinant mutant gene encoding the mutant protein. To facilitate this, a mixture of oligonucleotides can be made to contain flanking recognition sites for restriction enzymes (see US Pat. No. 4,888,286). Cognitive sites are designed to correspond to naturally occurring cognitive sites or introduced into genes adjacent to the DNA encoding the region. After conversion to the double stranded form, oligonucleotides are ligated into the gene by the strand technique. By appropriate vectors, genes are introduced into host cells suitable for expression of the mutant protein [Huse, W.D. et al., Science 246: 1275 (1989); Viera, J. et al., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987).

실제로, 축중 올리고누클레오티드는 상해기술분야에 잘 알려져있는 기법들을 사용하여, 어떠한 적당한 방법에 의하여 유전자안에 도입될 수 있다. 돌연변이시키고자 하는 단백질의 아미노산 서열이 공지이거나 DNA 서열이 공지인 경우에, 유전자 합성이 가능한 접근법이다[예컨대 Alvarado-Urbina, G. et al., Biochem, Cell. Biol. 64:548-555(1986);Jones et al., Nature 321:522(1986)참조]. 예를 들면, 전형적으로 약 20-60누클레오티드 길이의 부분적으로 중복하는 올리고누클레오티드가 디자인될 수 있다. 내부올리고누클레오티드(B에서 G 및 I에서 O)는 T4 폴리누클레오티드 키나아제를 사용하여 인산화되어 5' 인산기를 제공한다. 각각의 올리고누클레오티드는 그것들의 상보하는 파트너에 아닐링되어 추가의 아닐링에 유용한 단일스트란드가 연장된 이중스트란드 DNA 분자를 제공할 수 있다. 그러면 아닐링된 쌍은 함께 혼합되어 결찰됨으로써 전체길이를 가지는 이중스트란드 분자가 형성될 수 있다 :Indeed, degenerate oligonucleotides can be introduced into the gene by any suitable method, using techniques well known in the art of injury. If the amino acid sequence of the protein to be mutated is known or the DNA sequence is known, gene synthesis is an approach that is possible [eg Alvarado-Urbina, G. et al., Biochem, Cell. Biol. 64: 548-555 (1986); Jones et al., Nature 321: 522 (1986). For example, partially overlapping oligonucleotides, typically about 20-60 nucleotides in length, can be designed. Internal oligonucleotides (G in B and O in I) are phosphorylated using T4 polynucleotide kinase to provide 5 ′ phosphate groups. Each oligonucleotide can be annealed to their complementary partner to provide a single stranded, extended stranded DNA molecule useful for further annealing. The annealed pairs can then be mixed together and ligated to form double stranded molecules of full length:

편리한 제한부위가, 적당한 벡터안으로의 클로닝을 위해 합성유전자의 단부근처에 디자인될 수 있다. 전체길이의 분자들은 제한 효소들로 절단되어 겔 정제되고, 전기용출된 후 적당한 벡터에 결찰될 수 있다. 편리한 제한부위는 또한 돌연변이 유발카세트의 도입을 용이하게 하기 위하여 합성유전자의 서열안에 통합될 수도 있다.Convenient restriction sites can be designed near the ends of the synthetic gene for cloning into suitable vectors. Full-length molecules can be cleaved with restriction enzymes, gel purified, electroeluted and then ligated into the appropriate vector. Convenient restriction sites may also be incorporated into the sequence of the synthetic gene to facilitate the introduction of the mutagenesis cassette.

전체길의의 이중스트란드 유전자를 나타내는 올리고누클레오티드를 합성하기 위한 대용방안으로서, 3'끝에서 부분적으로 중복하는(즉, 상보하는 3'끝을 가지고 있는)올리고누클레오티드가 틈이 있는 구조에 조립된 후 DNA 중합효소의 클레노우 단편 및 3인산 데옥시누클레오티드로 틈이 채워져서 전체길이의 이중스트란드 유전자가 만들어질 수 있다. 전형적으로, 중복하는 올리고누클레오티드는 길이가 40-90누클레오티드이다. 연장된 올리고누클레오티드는 T4리가아제를 사용하여 결찰된다. 편리한 제한부위가 클로닝목적을 위해 단부에 및/또는 내부에 도입될 수 있다. 적절한 제한효소 또는 효소들로 소화된 후, 유전자 단편은 겔정제되고 적당한 벡터안에 결찰된다. 또는 달리, 유전자 단편이 블런트 끝으로 처리된 후 적절한 벡터안에 결찰되기도 한다.An alternative for synthesizing oligonucleotides representing full-length double stranded genes, wherein the oligonucleotides partially overlapping at the 3 'end (ie, having complementary 3' ends) are assembled in a structure with gaps The gaps can then be filled with cleno fragments of DNA polymerase and deoxynucleotides phosphate to produce full-length double stranded genes. Typically, overlapping oligonucleotides are 40-90 nucleotides in length. Extended oligonucleotides are ligated using T4 ligase. Convenient restrictions may be introduced at the end and / or inside for cloning purposes. After digestion with the appropriate restriction enzyme or enzymes, the gene fragment is gel purified and ligated in the appropriate vector. Alternatively, the gene fragment may be ligated into an appropriate vector after being processed with blunt ends.

이들 접근법에서, 만약 편리한 제한부위(천연 또는 유전공학적인)가 유전자 조립후에 활용가능하다면, 축중 올리고누클레오티드는 카세트의 클로닝에 의하여 적절한 벡터안으로 계속해서 도입될 수 있다. 또는 달리, 축중 올리고누클레오티드는 유전자 조립단계에서 통합될 수 있다. 예를 들어 유전자의 2개의 스트란드가 모두 화학적으로 전체가 합성된 경우, 중복하는 및 상보하는 축중 올리고누클레오티드가 생성될 수 있다. 상보하는 쌍은 각각 상대방과 아닐링될 것이다. 이런 접근법의 실예는 실시예 1에서 설명된다.In these approaches, if convenient restriction sites (natural or genetically engineered) are available after gene assembly, degenerate oligonucleotides can continue to be introduced into the appropriate vector by cloning the cassette. Alternatively, degenerate oligonucleotides may be integrated in the gene assembly step. For example, if both strands of a gene are chemically synthesized in their entirety, overlapping and complementary degenerate oligonucleotides may be produced. Complementary pairs will each be annealed with the other. An example of this approach is described in Example 1.

부분적으로 중복하는 올리고가 유전자조립에 사용되는 경우, 1세트의 축중 올리고누클레오티드가 올리고중 하나의 올리고대신에 직접 통합될 수 있다. 적절한 상보스트란드는 다른 스트란드로부터의 부분적으로 상보하는 올리고로부터, 예컨대 DNA 중합효소의 클레노우 단편으로 효소적으로 연장시킴에서 의한 연장반응중에 합성된다. 합성단계에서 축중 올리고누클레오티드를 통합시키는 것은 또한 유전자의 1도메인 이상이 돌연변이되는 경우에 클로닝을 단순화시킨다.When partially overlapping oligos are used for gene assembly, one set of degenerate oligonucleotides can be integrated directly into one oligo instead of one. Suitable complementary strands are synthesized during extension reactions from partially complementary oligos from other strands, such as by enzymatic extension of a cleno fragment of DNA polymerase. Integrating degenerate oligonucleotides in the synthesis step also simplifies cloning in the event that more than one domain of the gene is mutated.

다른 접근법에서, 관심의 유전자는 단일스트란드의 플라스미드상에 존재한다. 예를 들면, 유전자는 M13 파지벡터 또는, 헬퍼파지를 이용하여 단일스트란드 분자의 증식을 허용하는 필라멘트상 파지의 복제기원을 가지고 있는 벡터에 클론될 수 있다. 단일 스트란드 주형은 축증 프로브세트와 아닐링될 수 있다.프로브는 연장되고 결찰됨으로써, 적절한 숙주에 도입될 수 있는 분자집단에 각각의 변화된 스트란드를 통합시킨다[Sayers, J.R. et al., Nucleic Acids Res. 16: 791-802(1988)]. 이 접근법은 다중도메인이 돌연변이생성을 위해 선택되는 경우 다중클로닝단계들을 피할 수 있다.In another approach, the gene of interest is on a single strand of plasmid. For example, the gene can be cloned into an M13 phage vector or a vector having a replication origin of filamentous phage that allows for the propagation of single stranded molecules using helper phage. Single stranded templates can be annealed with augmented probesets. Probes are extended and ligation to integrate each altered strand into a group of molecules that can be introduced into the appropriate host [Sayers, J.R. et al., Nucleic Acids Res. 16: 791-802 (1988). This approach can avoid multiple cloning steps if multiple domains are selected for mutagenesis.

중합효소 연쇄반응(PCR)방법론이 또한 유전자안에 축중 올리고누클레오티드를 통합하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 축중 올리고누클레오티드 자체는 연장용 프라이머로서 사용될 수 있다.Polymerase chain reaction (PCR) methodology can also be used to integrate degenerate oligonucleotides in genes. For example, degenerate oligonucleotides themselves can be used as primers for extension.

이 구체예에서, A와 B는 돌연변이유발 카세트 또는 윈도우를 코드화하는 축중 올리고누클레오티드의 집단이다. 윈도우는 상호상보한다(올리고의 지그-재그 부분은 축중부분을 나타낸다). A와 B는 또한 증폭을 위하여 3'상의 주형에 상보하는 야생형 서열을 함유하고, 그로써 윈도우를 통합시키는 단편을 생성할 수 있는, 증폭을 위한 프라이머들이다. C와 D는 돌연변이 유발 윈도우가 통합되어 있는 것들을 포함하여, 관심의 완전한 유전자 또는 영역을 증폭시킬 수 있는 올리고누클레오티드이다[Steffan, N.H. et al., Gene 77:51-59(1989)]. A와 B로부터 프라임된 연장 생성물은 그것들의 상보하는 윈도우를 통하여 혼성화할 수 있고, C와 D를 프라이머로서 사용하여 전체길이의 분자를 생성하기 위한 주형을 제공한다. C와 D는 클로닝을 위한 편리한 부위를 함유하도록 디자인될 수 있다. 그런 다음 증폭된 단편이 클론될 수 있다.In this embodiment, A and B are populations of degenerate oligonucleotides encoding mutagenesis cassettes or windows. The windows complement each other (the zig-zag portion of the lift represents the shaft portion). A and B are also primers for amplification, which contain a wild type sequence complementary to the template on 3 'for amplification, thereby producing fragments that incorporate a window. C and D are oligonucleotides capable of amplifying a complete gene or region of interest, including those with integrated mutagenesis windows [Steffan, N.H. et al., Gene 77: 51-59 (1989). The extension products primed from A and B can hybridize through their complementary windows and provide templates for generating full length molecules using C and D as primers. C and D can be designed to contain convenient sites for cloning. The amplified fragment can then be cloned.

상기 기법들 또는 다른 적당한 기법들중 어느 하나에 의해 생성된 돌연변이체들의 라이브러리는, 소망하는 구조 또는 활성의 돌연변이체를 확인하기 위해 스크린 될 수 있다. 스크리닝은 어떠한 적절한 수단에 의해 행해질 수 있다. 예를 들어, 촉매활성은 기질 전환에 대한 적당한 측정에 의해 확인될 수 있고, 결합활성은 표준 면역측정 및/또는 친화성 크로마토그래피에 의해 평가될 수 있다.The library of mutants generated by any of the above or other suitable techniques can be screened to identify mutants of the desired structure or activity. Screening can be done by any suitable means. For example, catalytic activity can be identified by appropriate measurements of substrate conversion and binding activity can be assessed by standard immunoassay and / or affinity chromatography.

본 발명의 방법은 단백질, 단백질 하위단위체 또는 폴리펩티드의 어떠한 영역들 돌연변이시키는데 사용될 수 있다. 지금까지의 설명은 단백질에 대해 초점이 맞추어졌으나, 본 발명방법은 또한 폴리펩티드와 다중-하위단위체 단백질에도 적용됨이 이해되어야 한다. 본 발명방법에 의해 돌연변이된 영역들은 연속일 수도 또는 불연속일 수도 있으며, 길이는 대체로 약 3 내지 약 30아미노산, 전형적으로는 5 내지 20아미노산일 것이다.The methods of the invention can be used to mutate any region of a protein, protein subunit or polypeptide. While the description so far has focused on proteins, it should be understood that the methods of the present invention also apply to polypeptides and multi-subunit proteins. The regions mutated by the method of the invention may be continuous or discontinuous, and will generally be about 3 to about 30 amino acids, typically 5 to 20 amino acids.

통상적으로, 연구되는 영역은 결합 또는 촉매작용 도메인과 같은 단백질의 기능 도메인일 것이다. 예를 들어, 영역은 면역글로불린의 초가변 영역(상보성 결정영역 또는 CDR), 효소의 촉매작용부의 또는 결합도메인일 수 있다.Typically, the region studied will be the functional domain of the protein, such as a binding or catalysis domain. For example, the region may be a hypervariable region (complementarity determining region or CDR) of an immunoglobulin, a catalytic domain or binding domain of an enzyme.

언급한 바와 같이, 워크 쓰루우 돌연변이생성에 대해 선택된 아미노산은, 일반적으로 관심의 구조 또는 기능에 포함되는 것으로 알려져 있는 또는 여겨지는 것들로부터 선택된다. 20개의 자연발생 아미노산은 단지 아미노산 측쇄만이 상이하다. 각 측쇄는 각각의 아미노산을 독특하게 만드는 화학적 성질의 원인이 된다[Principles of Protein Structure, 1988, by G.E. Schulz and R. M. Schirner, Springer-Verlag 참조].As mentioned, the amino acids selected for walk-through mutagenesis are generally selected from those known or believed to be included in the structure or function of interest. The 20 naturally occurring amino acids differ only in the amino acid side chains. Each side chain is responsible for the chemical properties that make each amino acid unique. [Principles of Protein Structure, 1988, by G.E. Schulz and R. M. Schirner, Springer-Verlag].

측쇄의 화학적 성질로부터, 단지 선택된수의 천연 아미노산이 우선적으로 촉매작용 사건에 참여하는 것으로 여겨진다. 이들 아미노산은 Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, 및 Cys 같은 극성 및 중성 아미노산의 그룹, 하전된 아미노산, Asp와 Gly, Lys 및 Arg, 및 특히 아미노산 His의 그룹에 속한다.From the side chain chemistry, it is believed that only a selected number of natural amino acids preferentially participate in catalysis events. These amino acids belong to a group of polar and neutral amino acids such as Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, and Cys, charged amino acids, Asp and Gly, Lys and Arg, and especially the group His.

전형적인 극성 및 중성측쇄는 Cys, Ser, Thr, Asn, Gln 및 Tyr의 측쇄들이다. Gly는 또한 이 그룹의 경계에 있는 것으로 여겨진다. Ser와 Thr은 수소결합 형성에 중요한 역할을 한다. Thr은 베타탄소에서 추가의 비대칭을 가지므로 입체 이성질체의 단지 하나만이 사용된다. 산 아미드 Gln과 Asn은 또한 수소결합을 형성하며, 아미노기는 수소공여체로서 작용하고, 가르보닐기는 수용체로서 작용한다. Gln은 Asn보다 하나 더 많은 CH₂기를 가지며, 이것은 극성기를 보다 가요성으로 만들고 주쇄와의 상호반응을 감소시킨다. Tyr은 높은 pH값에서 분리될 수 있는 매우 극성인 히드록실기(페놀성 OH)를 가진다. Tyr은 다소 하전된 측쇄와 같은 양상을 나타내며, 그것의 수소결합은 더 강력하다.Typical polar and neutral side chains are the side chains of Cys, Ser, Thr, Asn, Gln and Tyr. Gly is also believed to be at the border of this group. Ser and Thr play an important role in hydrogen bond formation. Thr has additional asymmetry in the beta carbon, so only one of the stereoisomers is used. The acid amides Gln and Asn also form hydrogen bonds, the amino groups act as hydrogen donors and the garbonyl groups act as acceptors. Gln has one more CH ₂ group than Asn, which makes the polar group more flexible and reduces its interaction with the main chain. Tyr has a very polar hydroxyl group (phenolic OH) that can be separated at high pH values. Tyr exhibits a somewhat charged side chain-like pattern, and its hydrogen bond is stronger.

중성의 극성산은 단백질분자의 내부뿐만 아니라 표면에서도 발견된다. 내부 잔기로서, 중성의 극성산은 통상 상호간에 또는 폴리펩티드 골격과 수소결합을 형성한다. Cys는 이황화가교를 형성할 수 있다.Neutral polar acids are found on the surface as well as inside the protein molecules. As internal residues, neutral polar acids typically form hydrogen bonds with each other or with the polypeptide backbone. Cys can form disulfide bridges.

히스티딘(His)은 pK값이 6.0인 헤테로고리형 방향족 측쇄를 갖는다. 생리적 pH범위에서 His의 이미다졸고리는 용액으로부터 수소이온을 받은 후 하전될 수도 있고 하전되지 않을 수도 있다. 이런 2가지 상태가 쉽게 활용가능하기 때문에 His은 화학반응을 촉매하기에 아주 적당하다. 이것은 효소의 대부분의 활성중심부에서 발견된다.Histidine (His) has a heterocyclic aromatic side chain having a pK value of 6.0. His imidazole ring in the physiological pH range may or may not be charged after receiving hydrogen ions from the solution. Because these two states are readily available, His is well suited to catalyze chemical reactions. It is found in most active centers of enzymes.

Asp와 Glu는 생리적 pH에서 마이너스로 하전된다. 이것들의 짧은 측쇄로 인하여 Asp의 카르복실기는 주쇄에 비하여 더 단단하다. 이것은 많은 촉매작용부위에서 카르복실기가 Asp에 의해서는 제공되지만 Glu에 의해서는 제공되지 않는 이유가 될 수 있다. 하전된 산은 대개 단백질의 표면에서 발견된다.Asp and Glu are negatively charged at physiological pH. Due to their short side chains, the carboxyl group of Asp is harder than the main chain. This may be the reason why in many catalysis sites the carboxyl groups are provided by Asp but not by Glu. Charged acids are usually found on the surface of the protein.

또한, Lys과 Arg도 표면에서 발견된다. 이것들은 길고 가요성의 측쇄를 가지고 있다. 이것들은 주변용액에서 움직이므로 단백질 소구체의 용해도를 증가시킨다. 여러가지 경우에, Lys와 Arg은 내부 염가교형성에 참여하거나 또는 촉매작용을 보조한다. 단백질 표면에서의 노출로 인하여, Lys은 측쇄를 변형시키거나 또는 Lys 잔기의 카르보닐 끝에서 펩티드사슬을 절단하는 효소에 의해 더욱 자주 공격받는 잔기이다.Lys and Arg are also found on the surface. These have long, flexible side chains. These move in the surrounding solution, increasing the solubility of the protein globules. In many cases, Lys and Arg participate in or help catalyze internal salt bridging. Due to exposure at the protein surface, Lys is a residue that is more frequently attacked by enzymes that modify the side chain or cleave the peptide chain at the carbonyl end of the Lys residue.

촉매적으로 중요한 아미노산을 영역에 도입시키는 목적에 대하여, 본 발명은 바람직하게도 예정된 아미노산이 다음군의 아미노산: Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys, 및 Arg중의 하나인 돌연변이생성에 관련된다. 그러나, 결합을 변경시키거나 새로운 결합 친화성을 만드는 목적에 대해서는 20개의 자연발생 아미노산중 어느것이라도 선택될 수 있다.For the purpose of introducing catalytically important amino acids into the region, the present invention preferably provides that a predetermined amino acid is one of the following groups of amino acids: Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys, and Arg. One is involved in mutagenesis. However, any of twenty naturally occurring amino acids can be selected for the purpose of altering binding or making new binding affinity.

중요하게도, 단백질의 여러개의 상이한 영역들 또는 도메인이 동시에 돌연변이될 수 있다. 동일 또는 상이한 아미노산은 워크-쓰루우된 각각의 영역일 수 있다. 이것은 단백질의 접힘시에 효소의 촉매활성부위 또는 항체의 결합부위 같은 작용부위를 만들기 위하여 결합된 영역과 같은 구조적으로 관련된 영역에서 아미노산 치환의 평가를 가능하게 한다. 이 방법은 변형된 또는 완전히 새로운 촉매작용부위들을 만들기 위한 방법을 제공한다. 제1도에 도시된 바와 같이, 항원 결합부위의 독특한 모양(Fv 영역)을 만드는, 면역글로불린의 6개의 초가변영역들은 V_H또는 V_L사슬내에서 동시에 또는 별도로 돌연변이될 수 있어서, 이 부위에서 선택된 아미노산의 3차원적인 상호관계를 연구할 수 있다.Importantly, several different regions or domains of a protein can be mutated simultaneously. The same or different amino acids may be each region walk-through. This allows the evaluation of amino acid substitutions in structurally related regions, such as those bound to make a site of action such as a catalytically active site of an enzyme or a binding site of an antibody upon folding of a protein. This method provides a method for making modified or entirely new catalytic sites. As shown in FIG. 1, the six hypervariable regions of immunoglobulins, which create a unique shape of the antigen binding site (Fv region), can be mutated simultaneously or separately in the V _H or V _L chains, thereby Three-dimensional correlations of selected amino acids can be studied.

본 발명이 방법은 단백질의 매우 상이한 유형의 디자인에 대한 새로운 가능성을 제시한다. 방법은 단백질의 기존의 구조 또는 기능을 개선시키는데 사용 될 수 있다. 예를 들어, 효소의 촉매작용 도메인 안으로 추가의 촉매적으로 중요한 아미노산의 도입은 동일한기질에 대한 촉매적활성을 증가시킬 수 있다. 또는 달리, 완전히 새로운 구조, 특이성 또는 활성이 단백질안에 도입될 수 있다. 효소활성의 새로운 합성도 또한 이루어질 수 있다. 새로운구조가 본 발명 방법에 의하여 단지 관련된 영역만을 돌연변이시킴으로써 기존 단백질의 천연 골격(scaffold) 상에 만들어질 수 있다.The method of the present invention opens up new possibilities for the design of very different types of proteins. The method can be used to improve the existing structure or function of a protein. For example, the introduction of additional catalytically important amino acids into the catalytic domain of the enzyme can increase the catalytic activity on the same substrate. Alternatively, entirely new structures, specificities or activities can be introduced into the protein. New syntheses of enzymatic activity can also be made. New structures can be made on the natural scaffold of existing proteins by mutating only relevant regions by the method of the invention.

본 발명의 방법은 특히 항체분자의 변형에 유용하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항체분자 또는 항체는 전길이의 항체, Fv 분자, 또는 다른 항체 단편, 그것의 개별적인 사슬 또는 단편(예컨대 Fv의 단일사슬), 단일사슬항체, 및 혼성 항체와 같은 항체 또는 그것의 부분을 말한다. 변경은 항체의 가변영역에서 및/ 또는 뼈대(framework)(불변)영역에서 이루어질 수 있다. 가변영역의 변형은 보다 나은 항원결합 특성과 촉매적 특성을 가지는 항체를 생성할 수 있다. 뼈대영역의 변형은 예컨대 상업적제조시에 유용할 용해도 또는 안정성과 같은 화학-물리적 특성의 개선을 유도할 수 있다. 전형적으로, 돌연변이생성의 표적은 면역글로불린 분자의 Fv영역이 될 것이다-이 구조는 하나는 중쇄(V_H)로부터, 다른 하나는 경쇄(V_L)로부터 유래되는 2개의 사슬의 가변영역으로 구성되는 항원-결합 활성의 원인이 된다.The method of the invention is particularly useful for modification of antibody molecules. As used herein, an antibody molecule or antibody may be an antibody, such as a full-length antibody, an Fv molecule, or other antibody fragment, individual chains or fragments thereof (such as a single chain of Fv), a single chain antibody, and a hybrid antibody or Says part of it. The alteration may be in the variable region of the antibody and / or in the framework (constant) region. Modification of the variable region can produce antibodies with better antigen binding and catalytic properties. Modifications of the skeletal region can lead to improvements in chemical-physical properties such as solubility or stability, which would be useful, for example, in commercial manufacturing. Typically, the target of mutagenesis will be the Fv region of an immunoglobulin molecule—this structure consists of two chain variable regions, one derived from heavy chain (V _H ) and the other from light chain (V _L ). Causes antigen-binding activity.

본 발명의 방법은 촉매작용 단백질, 특히 촉매작용 항체의 디자인에 적당하다. 현재, 촉매작용 항체는 표준체세포 융합기법의 적용에 의해 제조될 수 있다. 이 방법에서, 동물은 전이상태에 결합하고 반응을 촉매하는 항체의 제조를 유도하기 위하여 바람직한 기질의 전이상태를 모방하는 항원으로 면역된다. 항체생성세포는 동물로부터 수확되고 불멸화 세포와 융합되어 하이브리드 세포가 생성된다. 그런 다음 이들 하이브리드 세포는 반응을 촉매하는 항체의 분비에 대해 스크린된다. 이 방법은 전이상태의 기질의 유사체의 활용도에 좌우된다. 이 방법은 그러한 유사체가 대부분의 경우 확인 또는 합성이 어려울것으로 보이므로 제한될 수 있다.The method of the invention is suitable for the design of catalyzed proteins, in particular catalyzed antibodies. Currently, catalyzed antibodies can be prepared by the application of standard somatic cell fusion techniques. In this method, the animal is immunized with an antigen that mimics the transition state of the desired substrate to induce the preparation of an antibody that binds to the transition state and catalyzes the reaction. Antibody producing cells are harvested from animals and fused with immortalized cells to produce hybrid cells. These hybrid cells are then screened for the secretion of antibodies that catalyze the reaction. This method depends on the utilization of analogs of the substrate in transition. This method may be limited because such analogues are likely to be difficult to identify or synthesize in most cases.

본 발명의 방법은 전이상태유사체에 대한 필요성이 제거된 상이한 접근법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하여 항체는 적당한 아미노산을 면역글로불린의 결합부위(Fv 영역)에 도입시킴으로써 촉매작용을 할 수 있다. 항원-결합부위(Fv)영역은 6개의 초가변(CDR)루프로 구성되는데, 3개는 면역글로불린 중쇄(H)로부터, 나머지 3개는 경쇄(L)로부터 유도되며, 이것들은 각 하위단위체내에서 베타 스트란드를 연결시킨다. CDR 루프의 아미노산 잔기들은 거의 전체가 각각의 특이적인 단일클론성 항체의 결합특성에 기여한다. 예를 들어, 세린 프로테아제뒤에 모델화된 촉매작용 트라이애드는 항체의 Fv영역의 초가변 절편에서 만들어질 수 있으며, 단백질가수분해 활성에 대해 스크린될 수 있다.The method of the present invention provides a different approach that eliminates the need for transition state analogs. By the method of the present invention, the antibody can be catalyzed by introducing an appropriate amino acid into the binding site (Fv region) of the immunoglobulin. The antigen-binding site (Fv) region consists of six hypervariable (CDR) loops, three from immunoglobulin heavy chains (H) and three from light chains (L). In the beta strands. Nearly all of the amino acid residues in the CDR loop contribute to the binding properties of each specific monoclonal antibody. For example, catalyzed triads modeled behind serine proteases can be made in hypervariable segments of the Fv region of an antibody and screened for proteolytic activity.

본 발명의 방법은 산화환원효소, 트란스페라아제, 가수분해효소, 용해효소, 이소메라아제 및 리가아제를 포함하여 많은 상이한 효소 또는 촉매작용 항체제조에 사용될 수 있다. 이들 부류중에서 특히 중요한 것은 개서된 프로테아제, 카르보히드라아제, 리파아제, 디옥시게나아제 및 페록시다아제의 제조일 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있는 상기 및 다른 효소들은 건강보호, 미용, 식품, 음료, 세제, 환경(예컨대 폐수처리), 농업, 무두질, 섬유, 및 다른 화학적처리에서 효소적 전환에 대하여 상업적으로 중요하게 적용된다. 이것들은 거기에 제한되는 것은 아니지만, 진단 및 치료적용, 지방, 탄수화물, 및 단백질의 전환, 유기 공해 물질의 분해 및 화학물질의 합성을 포함한다. 예를 들어, 섬유소용해 활성, 또는 감염에 필요한 바이러스 구조, 예컨대 바이러스 코트 단백질에 대한 활성을 가지고 있는 치료적으로 효과적인 프로테아제들이 공학적으로 제조될 수 있었다. 그러한 프로테아제는 유용한 항-혈전제 또는 예컨대 AIDS, 리노바이러스, 인플루엔자 또는 간염같은 바이러스에 대한 항-바이러스제일 수 있다. 옥시게나아제(예컨대 디옥시게나아제)의 경우에, 방향족 고리 및 다른 이중결합의 산화를 위해 보조인자를 필요로하는 효소들의 부류, 바이오펄핑(viopulping)처리에의 산업적 이용, 생물학적 물질의 연료 또는 다른 화학물질로의 전환, 폐수오염물질의 전환, 석탁의 생물학적 처리, 및 유해한 유기 화합물들의 탈독소화가 모두 신규한 단백질의 가능한 적용분야이다.The method of the present invention can be used to prepare many different enzymes or catalyzed antibodies, including oxidoreductases, transferases, hydrolases, solubilizing enzymes, isomerases and ligases. Of particular importance among these classes would be the preparation of rewritten proteases, carbohydrases, lipases, deoxygenases and peroxidases. These and other enzymes that may be prepared by the methods of the invention are commercially available for enzymatic conversion in health care, beauty, food, beverages, detergents, environment (such as wastewater treatment), agriculture, tanning, fiber, and other chemical treatments. Importantly. These include, but are not limited to, diagnostic and therapeutic applications, conversion of fats, carbohydrates, and proteins, degradation of organic pollutants, and synthesis of chemicals. For example, therapeutically effective proteases that have fibrinolytic activity, or activity against viral structures required for infection, such as viral coat proteins, can be engineered. Such proteases may be useful anti-thrombotic agents or anti-viral agents for viruses such as AIDS, rhinoviruses, influenza or hepatitis. In the case of oxygenases (such as deoxygenases), a class of enzymes that require cofactors for the oxidation of aromatic rings and other double bonds, industrial use in biopulping treatments, fuels of biological substances or other Conversion to chemicals, conversion of wastewater pollutants, biological treatment of turbidity, and detoxification of harmful organic compounds are all possible applications of the novel proteins.

이들 활성에 대한 측정은, 세포가 성장에 바람직한 활성을 필요로 하는 경우에 계획될 수 있다. 예를 들어, 독성화합물을 분해하는 활성에 대한 스크리닝에서, 치명적수준의 독성화합물의 영양플레이트안으로의 통합은 독성화합물을 분해하는 활성을 발현하는 세포만의 성장을 가능하게 할 것이다[Wasserfallen, A., Rekik, M., and Harayama, S., Biotechnology 9: 296-298(1991)]. 또는 달리, 비독성 기질을 사용하는 효소에 대한 스크리닝에서는, 기질을 단독의 탄소원 또는 다른 적절한 영양분의 단독공급원으로서 사용하는 것이 가능하다. 이 경우에 또한 효소활성을 발현하는 세포만이 플레이트상에서 성장할 것이다. 이들 방법에서, 기질 또는 기질의 생성물(다른 활성에 의해 세포외적으로 전환된)이 세포에 의해 흡수될 수 있다면, 효소활성이 분비될 필요는 없다. 또한, 작용시 활성의 가시적인 표시를 유도하는 배지안에 기질을 통합시킴으로써 신규한 기능에 대해 직접 시험할 수도 있다.Measurement of these activities can be planned if the cells require the desired activity for growth. For example, in screening for activities that degrade toxic compounds, incorporation of lethal levels of toxic compounds into the nutrient plate will allow the growth of only cells expressing the activities that degrade toxic compounds [Wasserfallen, A. , Rekik, M., and Harayama, S., Biotechnology 9: 296-298 (1991). Alternatively, in screening for enzymes using non-toxic substrates, it is possible to use the substrate as the sole carbon source or as the sole source of other suitable nutrients. In this case also only cells that express enzymatic activity will grow on the plate. In these methods, if the substrate or product of the substrate (extracellularly converted by other activities) can be taken up by the cells, the enzyme activity does not need to be secreted. In addition, new functions can also be tested directly by incorporating a substrate in a medium that induces a visual indication of activity upon action.

[워크-쓰루우 돌연변이생성의 예시][Example of Walk-Through Mutation]

[모델 I][Model I]

본 발명을 추가로 예시하기 위하여, 단일클론성 항체 MCPC 603의 세 개의 초가변영역 또는 상보성 결정영역들(CDR)의 워크-쓰루우 돌연변이생성을 설명한다. 중쇄(VH)의 CDR1과 CDR3 및 경쇄영역(VL)의 CDR2 도메인 워크-쓰루우 돌연변이생성에 대해 선택되었다. 이 구체예에 대하여, 선택된 아미노산은 세린 프로테아제의 촉매작용 트라이애드의 3개의 잔기, 즉, Asp, His 및 Ser이다. Asp은 VH CDR1에 대해, Ser은 VH CDR3에 대해, 그리고 His은 VL CDR2에 대해 선택되었다.To further illustrate the invention, walk-through mutagenesis of three hypervariable or complementarity determining regions (CDRs) of monoclonal antibody MCPC 603 is described. CDR1 and CDR3 of the heavy chain (VH) and CDR2 domain walk-through mutagenesis of the light chain region (VL) were selected. For this embodiment, the selected amino acids are three residues of the catalyzed triad of the serine protease, namely Asp, His and Ser. Asp was selected for VH CDR1, Ser for VH CDR3 and His for VL CDR2.

MCPC 603은 포스포릴콜린에 결합하는 단일클론성 항체이다. 이 면역글로불린은 단백질 및 이것의 결합영역이 구조적으로 특성확인이 잘되어있기 때문에 결합 및 촉매작용의 연구에 대한 좋은 모델로서 인지된다. MCPC 603 항체에 대한 CDR은 확인되었다. 중쇄에서, CDR1은 아미노산 31-35를 차지하고, CDR2는 50-69를, 그리고 CDR3은 101-111을 차지한다. 경쇄에서, CDR1의 아미노산은 24-40이고, CDR2는 55-62의 아미노산에 걸쳐있으며, CDR3 은 아미노산 95-103에 걸쳐있다. 도면에서 아미노산 번호는 원래의 MCPC 603 분자의 아미노산 번호에 해당한다.MCPC 603 is a monoclonal antibody that binds phosphorylcholine. This immunoglobulin is recognized as a good model for the study of binding and catalysis because the protein and its binding region are well characterized structurally. CDRs for the MCPC 603 antibody were identified. In the heavy chain, CDR1 occupies amino acids 31-35, CDR2 occupies 50-69, and CDR3 occupies 101-111. In the light chain, amino acids of CDR1 are 24-40, CDR2 spans 55-62 amino acids, and CDR3 spans amino acids 95-103. Amino acid numbers in the figures correspond to amino acid numbers of the original MCPC 603 molecule.

면역글로불린 가변영역에 상응하는 cDNA는 cDNA 라이브러리 제조과정없이 직접 클론되고 서열화될 수 있다. 면역글로불린 가변영역 유전자양옆에 보존된 서열이 있기 때문에, 중합효소 연쇄반응(PCR)이, 부합하는 5' 및 3' 프라이머를 사용하여 소수의 하이브리도마 세포로부터 경쇄 및 중쇄유전자 둘다를 증폭, 클론 및 서열화할 수 있다[Chiang, Y.L. et al., Biotechniques 7:360(1989)]. 나아가, CDR 영역의 양 옆에 있는 아미노산을 코드하는 DNA는 부위특정돌연변이에 의해 돌연변이되어 추가의 카세트 돌연변이생성에 유용한 제한 효소인지부위가 생성될 수 있다(미국특허 제4,888,286호 참조). 축중 올리고누클레오티드의 삽입을 용이하게 하기 위하여, 동일한 제한효소들에 대한 플랭킹 인지부위들을 함유하도록 혼합물이 합성된다. 축중 혼합물은 먼저 효소적 방법에 의하여 2중스트란드의 DNA로 전환된 후 [Oliphant, A. R. et al., Gene 44:177(1986)]. 자연발생(야생형) 아미노산 서열을 코드화하는 CDR 누클레오티드 서열 대신에 돌연변이시키고자 하는 영역의 유전자안에 삽입될 수 있다.CDNAs corresponding to immunoglobulin variable regions can be directly cloned and sequenced without cDNA library preparation. Because there are conserved sequences on both sides of the immunoglobulin variable region genes, polymerase chain reaction (PCR) amplifies and clones both light and heavy chain genes from a small number of hybridoma cells using matching 5 'and 3' primers. And can be sequenced [Chiang, YL et al., Biotechniques 7: 360 (1989). Furthermore, DNA encoding amino acids on either side of the CDR regions can be mutated by site-specific mutations to generate restriction enzyme recognition sites useful for further cassette mutagenesis (see US Pat. No. 4,888,286). To facilitate insertion of degenerate oligonucleotides, the mixture is synthesized to contain flanking recognition sites for the same restriction enzymes. The degenerate mixture is first converted to double stranded DNA by enzymatic methods (Oliphant, A. R. et al., Gene 44: 177 (1986)). Instead of the CDR nucleotide sequence encoding the naturally occurring (wild type) amino acid sequence, it may be inserted into the gene of the region to be mutated.

또는 달리, 상술된 다른 접근법중 하나, 예컨대 유전자 합성 접근법이 소망하는 영역에서의 변이체를 코드화하는 플라스미드의 라이브러리를 만드는데 사용될 수 있다. MCPC 603 VH와 VL 영역의 공개된 아미노산 서열은 DNA 서열로 전환될 수 있다[Rudikoff, S. and Potter, M., Biochemistry 13: 4033 (1974)]. MCPC 603의 야생형 DNA 서열의 또한 공개되었음을 주지하여야 한다[Pluckthun, A. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Vol. LII: 105-112(1987)]. 제한 부위들은 축중 올리고누클레오티드의 도입을 용이하게 하기위하여 서열안에 통합될 수 있고 또는 축중 서열들이 유전자 주립단계에서 도입될 수도 있다.Alternatively, one of the other approaches described above, such as a gene synthesis approach, can be used to make a library of plasmids encoding variants in the desired region. The published amino acid sequences of the MCPC 603 VH and VL regions can be converted to DNA sequences (Rudikoff, S. and Potter, M., Biochemistry 13: 4033 (1974)). It should be noted that the wild type DNA sequence of MCPC 603 has also been published [Pluckthun, A. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Vol. LII: 105-112 (1987)]. Restriction sites may be incorporated into the sequence to facilitate the introduction of degenerate oligonucleotides or the degenerate sequences may be introduced at the genetic esteem stage.

MCPC 603의 CDR에서 워크-쓰루우 돌연변이생성을 위한 올리고누클레오티드의 디자인이 제3도에 도시된다. 각 경우에, 돌연변이될 위치들 또는 윈도우가 도시된다. 표적구조물 안으로의 삽입을 용이하게 하기 위하여 합성된 올리고누클레오티드가 도시된 윈도부보다 더 클 수 있다는 것이 이해 되어야 한다. VH CDR1에 상응하는 올리고누클레오티드들의 혼합물이 디자인되는데, 이때에 야생형 서열의 각 아미노산은 Asp에 의해 치환된다(제3a도). 2개의 코돈이 asp를 특정한다(GAC 와 GAT). CDR1의 첫번째 코돈은 치환을 필요로하지 않는다. 두번째 코돈(TTC, Phe)은 Asp에 대한 코돈으로 전환되기 위해 첫번째 위치에서의 치환(T에서 G로) 및 2번째 위치에서의 치환(T에서 A로)을 필요로 한다. 세번째 코돈(TAC, Tyr)은 단지 첫 번째 위치에서만의 치환(T에서 G로)을 필요로 한다. 네번째 코돈(ATG, Met)은 3가지 치환, 즉, A에서 G로의 첫번째 치환, T에서 A로의 2번째 치환 및 G에서 T로의 세 번째 치환을 필요로 한다. 다섯번째 코돈(GAG, Glu)은 세번째 위치에서의 치환(G에서 T로)만을 필요로 한다. 그 결과의 올리고누클레오티드의 혼합물은 아래와 같이 표시된다.The design of oligonucleotides for walk-through mutagenesis in the CDRs of MCPC 603 is shown in FIG. 3. In each case, the positions or windows to be mutated are shown. It should be understood that the oligonucleotide synthesized may be larger than the depicted window portion to facilitate insertion into the target structure. A mixture of oligonucleotides corresponding to VH CDR1 is designed, wherein each amino acid of the wild-type sequence is substituted by Asp (Figure 3a). Two codons specify asp (GAC and GAT). The first codon of CDR1 does not require substitution. The second codon (TTC, Phe) requires a substitution at the first position (T to G) and a substitution at the second position (T to A) to convert to a codon for Asp. The third codon (TAC, Tyr) only requires substitution at the first position (T to G). The fourth codon (ATG, Met) requires three substitutions: the first substitution from A to G, the second substitution from T to A, and the third substitution from G to T. The fifth codon (GAG, Glu) only requires substitution at the third position (G to T). The resulting mixture of oligonucleotides is shown below.

이것은 2⁷=128개의 상이한 올리고누클레오티드 서열의 혼합물을 나타낸다.This represents a mixture of 2 ⁷ = 128 different oligonucleotide sequences.

유전자 코드로부터, 각 위치에서 원래의 아미노산을 치환할 모든 아미노산을 추론하는 것이 가능하다. 이 경우에, 첫번째 아미노산은 언제나 Asp 일것이고(100%), 두번째는 Phe(25%) Asp(25%), Tyr(25%) 또는 Val(25%)일 것이며, 세번째 아미노산은 Tyr(50%) 또는 Asp(50%)일 것이고, 네번째는 Met(12.5%), Asp(12.5%), Val(25%), Glu(12.5%), Asn(12.5%), Ile(12.5%) 또는 Lys(12.5%)일 것이며, 다섯번째 코돈은 Glu(50%)이거나 또는 Asp(50%)일 것이다. 112개의 상이한 단백질 서열(1x4x2x7x2=112)을 코드할 총 128개의 올리고누클레오티드가 생성된다. 생성된 112개의 상이한 아미노산 서열들은 야생형 서열(위치 31에서 Asp 잔기를 가지는), 및 모든 가능한 치환에서 위치 32-35에 1 내지 4개의 Asp 잔기를 함유한다는 점에서 야생형 서열과는 상이한 서열들일 것이다(제3a도). 또한, Asp 치환이 포함되거나 포함되지 않는 일부의 서열들은 위치 32, 34 또는 둘 다에서 야생형이나 Asp가 아닌 아미노산을 함유할 것이다. 이들 아미노산은 야생형 아미노산과 예비선택된 아미노산을 코드화하는 누클레오티드의 치환에 의해 도입된다. 예를들어 제3a도에서, 위치 32에 있는 티로신(Tyr)과 발린(Val)은 야생형 페닐알라닌(Phe)과 예비선택된 Asp 잔기에 더불어 생성된다.From the genetic code, it is possible to deduce all amino acids that will replace the original amino acid at each position. In this case, the first amino acid will always be Asp (100%), the second will be Phe (25%) Asp (25%), Tyr (25%) or Val (25%), and the third amino acid will be Tyr (50%). ) Or Asp (50%), and the fourth is Met (12.5%), Asp (12.5%), Val (25%), Glu (12.5%), Asn (12.5%), Ile (12.5%) or Lys ( 12.5%) and the fifth codon will be Glu (50%) or Asp (50%). A total of 128 oligonucleotides are generated that will encode 112 different protein sequences (1 × 4 × 2 × 7 × 2 = 112). The resulting 112 different amino acid sequences will be different from the wild type sequence in that they contain 1 to 4 Asp residues at positions 32-35 at the wild type sequence (having Asp residues at position 31) and all possible substitutions ( 3a). In addition, some sequences with or without Asp substitutions will contain amino acids other than wild type or Asp at positions 32, 34, or both. These amino acids are introduced by substitution of nucleotides encoding wild type amino acids and preselected amino acids. For example, in FIG. 3a, tyrosine (Tyr) and valine (Val) at position 32 are produced along with wild type phenylalanine (Phe) and preselected Asp residues.

MCPC 603의 VH 영역의 CDR3은 제3b도에 도시된 바와같이 11개의 아미노산으로 구성된다. 올리고누클레오티드의 혼합물은 CDR1에 대해 상술된 바와같이, 야생형 서열의 각각의 비-세린 아미노산이 세린(Ser)으로 대체되도록 디자인된다. 6개의 코돈(TCX 및 AGC, AGT)이 Ser을 특정한다. 야생형 서열 전체에 필요한 치환수는 12이다. 그 결과로서, 생성된 올리고누클레오티드 혼합물은, 이 경우 4096 단백질 서열들을 코드할 2¹²=4096개의 상이한 올리고누클레오티드를 함유한다. 이들 서열들은 모두 어떠한 조합으로든 하나이상의 세린을 포함하는 변이체뿐만 아니라 다른 위치(101-104, 106-111)의 어느 하나에 단일한 세린 잔기를 함유할 것이다(세린 105에 더불어)(제3b도 참조).CDR3 of the VH region of MCPC 603 is composed of 11 amino acids as shown in FIG. 3b. The mixture of oligonucleotides is designed such that each non-serine amino acid of the wild-type sequence is replaced with serine, as described above for CDR1. Six codons (TCX and AGC, AGT) specify Ser. The substitutions required throughout the wild type sequence are 12. As a result, the resulting oligonucleotide mixture contains, in this case, 2 ¹² = 4096 different oligonucleotides that will encode 4096 protein sequences. These sequences will all contain a single serine residue (in addition to serine 105) at any of the other positions 101-104, 106-111, as well as variants comprising one or more serines in any combination (see also 3b). ).

MCPC 603의 VL 영역의 CDR2는 8개의 아미노산을 함유한다(56-63). 이들 아미노산중 7개(56-62)는 제3c도에 도시된 바와같이 워크-쓰루우 돌연변이생성에 대해 선택되었다. 올리고누클레오티드의 혼합물은 야생형 서열의 각 아미노산이 히스티딘(His)으로 대체되도록 고안된다. 2개의 코돈(CAT와 CAC)이 His을 특정한다. 야생형 DNA 서열 전체에 필요한 치환수는 총 13이다. 그러므로, 생성된 올리고누클레오티드 혼합물은 8192개의 상이한 펩티드 서열을 특정하는 2¹³=8192개의 올리고누클레오티드를 함유한다(제3c도 참조).CDR2 of the VL region of MCPC 603 contains 8 amino acids (56-63). Seven of these amino acids (56-62) were selected for walk-through mutagenesis as shown in Figure 3c. Mixtures of oligonucleotides are designed such that each amino acid of the wild-type sequence is replaced with histidine (His). Two codons (CAT and CAC) specify His. The number of substitutions required for the entire wild-type DNA sequence is 13 in total. Therefore, the resulting oligonucleotide mixture contains 2 ¹³ = 8192 oligonucleotides specifying 8192 different peptide sequences (see also 3c).

이 돌연변이 생성법의 결과로서, 세가지 올리고누클레오티드 혼합물의 합성 및 사용에 의하여, 112 x 4096 x 8192 = 3.76 x 10⁹개의 상이한 단백질 서열을 함유하는 Fv 서열의 라이브러리가 생성될 수 있다. 이들 서열의 상당부분은 초가변 영역내에서 세린 프로테아제의 전형적인 아미노산 트라이애드인 His, Ser, Asp을 코드화할 것이다.As a result of this mutagenesis, by synthesis and use of three oligonucleotide mixtures, a library of Fv sequences containing 112 x 4096 x 8192 = 3.76 x 10 ⁹ different protein sequences can be produced. Many of these sequences will encode His, Ser, Asp, typical amino acid triads of serine proteases in hypervariable regions.

올리고누클레오티드의 축중 혼합물의 합성은, 반응챔버에 한 누클레오티드를 전달하거나, 또는 반응챔버에 전달되기 전에 동일비율로 혼합된 2개의 누클레오티드의 혼합물을 전달하도록 프로그램된 자동 DNA 합성기에서 편리하게 이루어질 수 있다. 대용 합성과정은 시약 용기에서의 2개의 상이한 누클레오티드의 사전혼합을 포함할 것이다. 개개의 염기를 함유하고 있는 4개의 시약용기와 4개의 염기중에서 가능한 2개의 염기의 혼합물을 모두 함유하고 있는 6개의 시약용기로 구성된 총 10개의 시약 용기가, 상기 돌연변이생성법에 대해 올리고누클레오티드의 모든 혼합물을 합성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음의 10개의 챔버를 함유하도록 DNA 합성기가 디자인될 수 있다:Synthesis of the degenerate mixture of oligonucleotides can be conveniently made in an automated DNA synthesizer programmed to deliver one nucleotide to the reaction chamber or to deliver a mixture of two nucleotides mixed in equal proportions before being delivered to the reaction chamber. The surrogate synthesis will involve premixing two different nucleotides in the reagent vessel. A total of 10 reagent vessels consisting of four reagent vessels containing individual bases and six reagent vessels containing a mixture of two possible bases out of four bases, for all of the mixtures of oligonucleotides for this mutagenesis method. Can be used to synthesize. For example, a DNA synthesizer can be designed to contain the following ten chambers:

상기 배열로 서열의 어떠한 위치에서도 2개의 누클레오티드의 조합에 의하여 모든 누클레오티드가 대체될 수 있다In this arrangement all nucleotides can be replaced by a combination of two nucleotides at any position in the sequence.

하기의 축중 올리고누클레오티드의 소망하는 혼합물을 합성하기 위하여 반응의 다음순서가 필요하다:The following sequence of reactions is required to synthesize the desired mixtures of the following degenerate oligonucleotides:

상기 과정에 대한 대안으로서, 만약 올리고누클레오티드 합성기의 라인에서 개개의 염기의 혼합이 가능하다면, 합성기는 2개 또는 그 이상의 저장소로부터 순수한 염기를 끌어내어 누클레오티드의 소망하는 부분을 생성하도록 프로그램될 수 있다.As an alternative to the above process, if it is possible to mix individual bases in a line of oligonucleotide synthesizers, the synthesizer can be programmed to draw the pure bases from two or more reservoirs to produce the desired portion of the nucleotides.

합성 올리고누클레오티드의 각각의 혼합물은 각각의 MCPC 603 가변 영역에 대한 유전자안에 삽입될 수 있다. 올리고누클레오티드는 효소적 기법에 의해 이중스트란드 사슬로 전환된 후 [예컨대 Oliphant, A. R. et al., 1986, 상기 동일, 참조], 돌연변이될 단백질을 코드하는 유전자를 함유하고 있는 제한된 플라스미드안에 결찰될 수 있다.Each mixture of synthetic oligonucleotides can be inserted into the gene for each MCPC 603 variable region. Oligonucleotides can be ligated in a restricted plasmid containing the gene encoding the protein to be mutated after conversion to a double stranded chain by enzymatic techniques (eg Oliphant, AR et al., 1986, supra). have.

상술된 또는 다른 적당한 과정들에 의해 제조된 돌연변이된 MCPC 603 유전자들은 플러크툰(Pluckthun)과 스케라(Skerra)에 의해 설명된 것과 같은 편리한 대장균 발현시스템에서 발현될 수 있다. [Pluckthun, A. and Skerra, A., Meth. Enzyomol 178: 476-515 (1989) ; Skerra, A. et al., Biotechnology 9 : 273-278(1991)]. 돌연변이 단백질은 엠. 베터와 에이. 호르비츠에 의해 설명된 바와 같이 [M. Better and A. Horwitz, Meth. Enzymol. 178: 476(1989)], 박테리아의 원형질에서 및/또는 배지에서 분비를 위해 발현될 수 있다.The mutated MCPC 603 genes prepared by the above-described or other suitable procedures can be expressed in a convenient E. coli expression system such as those described by Pluckthun and Skerra. Pluckthun, A. and Skerra, A., Meth. Enzyomol 178: 476-515 (1989); Skerra, A. et al., Biotechnology 9: 273-278 (1991). Mutant protein is M. Better and A. As described by Horwitz, [M. Better and A. Horwitz, Meth. Enzymol. 178: 476 (1989)], and can be expressed for secretion in the plasma of bacteria and / or in the medium.

본 발명의 방법에 의해 제조된 상기 및 다른 Fv 변이체, 또는 항체 변이체들은 또한 효모같은 다른 미생물, 또는 골수종 세포또는 하이브리도마 세포같은 포유동물 세포에서도 제조될 수 있다. Fv 변이체들은 개개의 VH 및 VL 단편으로서, 단일 사슬로서 [Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)참조], 더 큰 분자, 예컨대 Fab의 일부로서, 또는 완전한 항체분자로서 제조될 수 있다.These and other Fv variants, or antibody variants, prepared by the methods of the invention can also be prepared in other microorganisms, such as yeast, or in mammalian cells, such as myeloma cells or hybridoma cells. Fv variants are individual VH and VL fragments, as single chains [Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)], as part of larger molecules such as Fabs, or as complete antibody molecules.

바람직한 구체예에서, VH와 VL을 코드화하는 단일 도메인들은 예컨대 ompA, phoA 또는 pelB 신호 서열과 같은 시노 서열을 코드화하는 서열의 3' 끝에 각각 부착될 수 있다.[Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)]. 이들 유전자 융합은 2시스트론성 구조물에서 조립되므로, 이것들은 단일벡터로부터 발현되고, 그것들이 다시 접혀지게 될 대장균의 세포주변공간안으로 분비되어 활성형태로 회수될 수 있다[Skerra, A. et al., Biotechnology 9:273-278(1991)]. 돌연변이 VH 유전자는 야생형 VL 과 동시에 발현되어 Fv 변이체를 생성하거나, 또는 상술한 바와같이 돌연변이된 VL과 동시에 발현되어 단백질 돌연변이체의 수 및 구조적 다양성을 더욱 증가시킬 수 있다.In a preferred embodiment, single domains encoding VH and VL can be attached to the 3 'end of the sequence encoding a cyno sequence, such as for example ompA, phoA or pelB signal sequences, respectively. [Lei, SP et al., J. Bacteriol. 169: 4379 (1987). Since these gene fusions are assembled in two-cistronic constructs, they are expressed from a single vector and can be secreted into the cell periphery of E. coli, where they will be folded back and recovered in active form [Skerra, A. et al. , Biotechnology 9: 273-278 (1991). Mutant VH genes can be expressed simultaneously with wild-type VL to produce Fv variants, or co-expressed with mutated VL as described above to further increase the number and structural diversity of protein mutants.

단백질분해 기능의 획득을 위한 이들 변이체의 스크리닝은 HIV 프로테아제 변이체제 대해 하기에 기술하는 바와같은 측정법(실시예 4 참조)에서 이루어질 수 있다. 또한, Asp-His-Ser의 촉매작용 트라이애드가 특정 리파아제의 메카니즘에도 관여하기 때문에, 리파아제 기능을 가지는 변이체가 또한 생성될 수 있음을 주지하여야 한다.Screening of these variants for the acquisition of proteolytic function can be made in assays as described below for HIV protease variants (see Example 4). It should also be noted that since the catalyzed triad of Asp-His-Ser is also involved in the mechanism of certain lipases, variants with lipase function may also be produced.

[모델 II][Model II]

MCPC 603 Fv 구조에서 세린 프로테아제를 생성하기 위해 디지인된 2번째 모델에서 VH CDR1에 대해서는 Asp이 선택되고, VH CDR3에 대해서는 His이 선택되며 VL CDR2에 대해서는 Ser이 선택된다. 이 경우에, 모델 I로부터의 VH CDR1 Asp 워크-쓰루우에 대해 디자인된 축중 올리고누클레오티드가 재사용될 수 있으며, 이것은 워크-쓰루우 카세트(제3a도)의 상호교환가능성을 예시한다.Asp is selected for VH CDR1, His is selected for VH CDR3, and Ser is selected for VL CDR2 in the second model designed to generate serine proteases in the MCPC 603 Fv structure. In this case, degenerate oligonucleotides designed for the VH CDR1 Asp walk-through from Model I can be reused, which illustrates the interchangeability of the walk-through cassette (Figure 3a).

VH CDR3의 His 워크-쓰루우에 대해서, 히스티딘 코돈을 특정하기위해 필요한 누클레오티드들이 VH 영역의 위치 101-111에 도입된다. 제4a도는 이 워크-쓰루우 과정을 예시한다. 이 실시예 및 다른 실시예에서 생성된 His의 백분율은 대략 동일한 비율의 야생형 또는 His 누클레오티드가 도입되는 경우에 대해 계산된다는 것이 주지되어야 한다. 이들 비율은 다양한 아미노산이 생성되는 빈도에 영향을 미치도록 조정될 수 있다.For His walk-through of VH CDR3, the nucleotides necessary to specify histidine codons are introduced at positions 101-111 of the VH region. Figure 4a illustrates this walk-through process. It should be noted that the percentage of His produced in this and other examples is calculated for the case where approximately equal proportions of wild type or His nucleotides are introduced. These ratios can be adjusted to affect the frequency with which various amino acids are produced.

제4b도는 각 위치(55-62)에서 VL CDR2의 Ser 워크-쓰루우를 예시한다. 여기에서, 위치 58과 62에 있는 서열은 세린이 야생형 서열에 존재하기 때문에 변하지 않는다. 비록 4개의 상이한 누클레오티드 서열들이 생성되긴 하지만, 위치 61에서는 단지 3개의 상이한 단백질 서열들이 제조될 수 있음이 주지되어야 한다. 이런 결과는 TAA가 정지 코돈을 코드한다는 사실에 의거한다.4B illustrates the Ser walk-through of the VL CDR2 at each location 55-62. Here, the sequences at positions 58 and 62 do not change because the serine is in the wild type sequence. Although four different nucleotide sequences are generated, it should be noted that at position 61 only three different protein sequences can be prepared. This result is based on the fact that the TAA codes a stop codon.

이 경우에 방법의 적용은 112 x 196,608 x 96 = 2.11 x 10⁹개의 상이한 단백질 서열을 함유하는 Fv 서열들의 라이브러리의 제조를 가능하게 한다. 한편, 상당 비율의 상기 서열들은 초가변영역에서 촉매작용을 나타내는 Asp-His-Ser 트라이애드를 코드화할 것이다.Application of the method in this case allows the preparation of a library of Fv sequences containing 112 x 196,608 x 96 = 2.11 x 10 ⁹ different protein sequences. On the other hand, a significant proportion of these sequences will encode Asp-His-Ser triads that exhibit catalysis in hypervariable regions.

일단 많은 영역에 대한 일련의 카세트가 디자인되면, 이 시리즈는 모든 치환에 사용될 수 있음이 주지되어야 한다. 예를들어, CDR에 대한 축중 올리고누클레오티드들이 디자인 될 수 있으며, 이것들은 상이한 구조물(예컨대 단일 VL 또는 VH 사슬, Fv분자, 단일 사슬 항체들, 전크기의 항체들 또는 혼성 항체들)에서뿐만 아니라, 소망하는 영역 및 사슬의 어떠한 조합에서도 함께 사용될 수 있다.It should be noted that once a series of cassettes for many regions is designed, this series can be used for all substitutions. For example, degenerate oligonucleotides for CDRs can be designed, which are desired as well as in different constructs (eg, single VL or VH chains, Fv molecules, single chain antibodies, full size antibodies or hybrid antibodies). Can be used together in any combination of domains and chains.

[모델 III][Model III]

세린 프로테아제의 디자인에 대한 다른 접근법에서, Fv분자의 단지 중쇄만이 사용된다. 단일 도메인 항체로서 알려져있고 양호한 항원 결합 친화성을 가지고 있는 단량체성 VH 도메인이 제조되었다[Ward, E. S. et al., Nature 341: 544-546(1989)]. 그로써 단일 VH 사슬은 워크-쓰루우 돌연변이 생성에 대한 골격을 제공할 수 있다. 이 모델에 대하여, VH CDR1에 대해서는 Asp가(제3a도), VHCDR2에 대해서도 His가, 그리고 VH CDR3에 대해서는 Ser이(제3b도) 선택되었다. 한편, 모델 I 에서 설명된 축중 누클레오티드 서열중 2개가 재사용될 수 있다(제3a도 및 3b도). 제 5a도는 VH CDR2 부분에서의 His 워크-쓰루우를 도시한다.In another approach to the design of serine proteases, only heavy chains of Fv molecules are used. Monomeric VH domains, known as single domain antibodies and having good antigen binding affinity have been prepared (Ward, E. S. et al., Nature 341: 544-546 (1989)). Thus a single VH chain can provide a framework for walk-through mutagenesis. For this model, Asp was selected for VH CDR1 (Fig. 3a), His was chosen for VHCDR2, and Ser (Fig. 3b) for VH CDR3. On the other hand, two of the degenerate nucleotide sequences described in Model I can be reused (Figures 3a and 3b). 5A depicts His walk-through in the VH CDR2 moiety.

제3a도, 3b도 및 5a도에 도시된 윈도우와 이들 윈도우에 상보하는 축중 올리고누클레오티드를 포함하는 올리고누클레오티드가 만들어졌다. 나아가, 축중 올리고누클레오티드 및 그것들의 상보물에 더불어, 상보하는 올리고누클레오티드를 사용하여 전길이의 이중 스트란드 VH 유전자 변이체가 조립될 수 있다. 조립된 유전자 변이체들은 벡터 pRB 500에 클론되었다(실시예 2). 벡터 pRB 500은 분비를 위한 pel B 리더 서열을 함유한다. 이들 실험은 실시예 1에서 설명된다.Oligonucleotides were made comprising the windows shown in FIGS. 3A, 3B, and 5A and degenerate oligonucleotides complementary to these windows. In addition to degenerate oligonucleotides and their complements, full-length double stranded VH gene variants can be assembled using complementary oligonucleotides. Assembled gene variants were cloned into vector pRB 500 (Example 2). Vector pRB 500 contains a pel B leader sequence for secretion. These experiments are described in Example 1.

설명된 바와같은 이들 올리고누클레오티드들의 합성 및 VH 유전자안으로의 통합은, 모든 가능한 조합에서, 이론적으로 112 x 2²⁵x 4096 = 1.54 x 10¹³개의 상이한 펩티드 서열을 생성할 수 있다. VH CDR2에서 표적화된 영역의 길이로 인하여, 대다수의 변이체가 생성된다. 그러나, 대부분의 변이체들은 예비 선택된 아미노산을 가질 것이다.The synthesis and integration of these oligonucleotides into the VH gene as described may theoretically produce 112 x 2 ²⁵ x 4096 = 1.54 x 10 ¹³ different peptide sequences. Due to the length of the targeted region in VH CDR2, the majority of variants are produced. However, most variants will have preselected amino acids.

제5a도에 도시된 VH CDR2 윈도우를 사용하는 것에 대한 대안으로서, VH CDR2의 상이한 부분을 포함하는 다른 윈도우가 디자인되었다(제5b도). 이 윈도우에서, 영역내의 특정 위치들이 선택되어(추가의 설명에 대해서는 하기 모델VI참조), 예비선택된 아미노 산으로서 His를 사용하여 워크-쓰로우 돌연변이 된다. 만약 제5b도에 도시된 바와같이 디자인된 올리고 누클레오티드가 제5a도의 올리고누클레오티드 대신에 사용된다면, 112 x 128 x 4096 = 5.87 x 10⁷개의 상이한 펩티드 서열이 생성될 수 있다.As an alternative to using the VH CDR2 window shown in Figure 5a, another window was designed that includes different portions of the VH CDR2 (Figure 5b). In this window, specific positions within the region are selected (see Model VI below for further explanation) and are walk-through mutated using His as the preselected amino acid. If oligonucleotides designed as shown in FIG. 5B are used instead of oligonucleotides in FIG. 5A, 112 x 128 x 4096 = 5.87 x 10 ⁷ different peptide sequences can be generated.

[모델 IV][Model IV]

Fv 분자의 중쇄를 사용하는 다른 구체예에서, 윈도우의 다른 조합이 사용된다. CDR1에 대해 이미 설명된 Asp 윈도우(제3b도; 모델 I, III) 및 CDR3에 대해 전술된 His 윈도우(제4a도; 모델 II)가, 세린이 아미노산 50-60으로부터의 VH CDR2의 아미노 말단부분에서 워크-쓰루우된 새로운 윈도우와 함께 사용된다. 이 워크-쓰루우 돌연변이 생성은 제6도에 예시된다.In other embodiments using heavy chains of Fv molecules, other combinations of windows are used. The Asp window (Figure 3b; Models I and III) already described for CDR1 and His Window (Figure 4a; Model II) described above for CDR3 are the amino terminus of the VH CDR2 serine from amino acids 50-60 Used with walk-through new windows. This walk-through mutagenesis is illustrated in FIG.

이들 올리고누클레오티드의 합성 및 모든 가능한 조합에서의 VH 유전자 안으로의 통합은 112 x 4096 x 196,608 = 9.02 x 10¹⁰개의 상이한 펩티드 서열을 생성할 수 있다.Synthesis of these oligonucleotides and integration into the VH gene in all possible combinations can yield 112 x 4096 x 196,608 = 9.02 x 10 ¹⁰ different peptide sequences.

[모델 V][Model V]

다른 구체예에서, 기존의 촉매 활성을 가지고 있는 단백질이 변경되어 촉매의 상이한 메카니즘이 생성된다. 이 방법에서, 효소의 특이성 및/ 또는 활성이 또한 변경될 수 있다. HIV 프로테아제가 돌연변이생성을 위한 효소로서 선택되었다. HIV 프로테아제는 아스파르트산 프로테아제로, 활성 부위에 보존된 Asp-Thr(Ser)-Gly 서열을 함유하는 아스파르트산 프로테아제의 전형적인 Asp-Thr-Gly 서열을 갖는다[Toh et al., EMBO J. 4: 1267-1272(1985)]. 워크-쓰루우 돌연변이생성에 대해서, 돌연변이 생성에 대한 표적으로서 프로테아제의 Asp-Thr-Gly 서열이 선택되었다. 워크-쓰루우 돌연변이생성은 3개의 예비선택된 아미노산, Asp, His 및 Ser 을 이용하여 3회 반복되었다. 이 접근 법은 세린 프로테아제로의 아스파르트산 프로테아제의 전화 및 촉매 메카니즘의 변경을 결과하도록 고안된 것이다. 또한, 변경될 활성, 특이성, 또는 촉매 메카니즘을 가지는 HIV 아스파르트산 프로테아제의 돌연변이들이 기대된다.In other embodiments, proteins having existing catalytic activity are altered to produce different mechanisms of catalyst. In this method, the specificity and / or activity of the enzyme can also be altered. HIV protease was selected as the enzyme for mutagenesis. The HIV protease is an aspartic acid protease and has the typical Asp-Thr-Gly sequence of aspartic protease containing the Asp-Thr (Ser) -Gly sequence conserved at the active site [Toh et al., EMBO J. 4: 1267. -1272 (1985). For walk-through mutagenesis, the Asp-Thr-Gly sequence of the protease was selected as a target for mutagenesis. Walk-through mutagenesis was repeated three times using three preselected amino acids, Asp, His and Ser. This approach is designed to result in the conversion of aspartic acid proteases to serine proteases and alteration of the catalytic mechanism. In addition, mutations of HIV aspartic acid proteases are expected with altered activity, specificity, or catalytic mechanisms.

제7도는 변경될 세 개의 잔기 또는 윈도우를 도시하며, Asp, His 및 Ser을 이용한 3회의 연속적인 워크-쓰루우 과정을 예시한다. Asp 잔기인 첫번째 위치에서, His 및 Ser 만이 도입된다. 나머지 2개의 위치에서는 Asp, His 및 Ser 이 각각 도입된다. 제2코돈의 제2위치 및 제3코돈의 제2위치에서, His 워크-쓰루우에 필요한 A는 Asp 워크-쓰루우에서 이미 도입되었음이 주지되어야 한다(제7도). 324개의 상이한 서열 및 코드화된 아미노산을 포함하는 혼합된 프로브의 서열이 또한 제7도에 도시된다. 이 돌연변이 생성 프로토콜은 활성부위 윈도우에서 324개의 상이한 펩티드 서열을 생성할 것이다.FIG. 7 shows three residues or windows to be altered and illustrates three consecutive walk-through procedures with Asp, His and Ser. In the first position, which is an Asp residue, only His and Ser are introduced. In the other two positions Asp, His and Ser are introduced respectively. It should be noted that at the second position of the second codon and the second position of the third codon, the A required for His walk-through has already been introduced in the Asp walk-through (FIG. 7). The sequence of a mixed probe comprising 324 different sequences and encoded amino acids is also shown in FIG. This mutagenesis protocol will generate 324 different peptide sequences in the active site window.

HIV 프로테아제의 돌연변이생성 및 발현을 위해서, 플라스미드 pRB 505가 실시예 2에서 설명되는 바와같이 제조되었다. 이 플라스미드는 유도가능한 tac 프로모터[de Boer, H. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21(1983)]로 부터 HIV 프로테아제의 발현을 직접 지시할 것이다. pRB 505에서, 프로테아제 유전자 서열은 프레임내에서 펙트산염 리아제의 pelB 리더 서열을 코드화하는 서열의 3' 끝에 융합되어, 그 결과 프로테아제가 대장균의 세포주변공간에 준비 될 수 있다. 구조물은 리더 서열이 절단되고 프로테아제의 자연발생 N-말단 서열이 생성되도록 디자인된다. HIV 프로테아제의 분비는 돌연변이생성에 의해 생성된 변이체 측정 및 정제를 용이하게 해줄 것이다.For mutagenesis and expression of HIV proteases, plasmid pRB 505 was prepared as described in Example 2. This plasmid is derived from the inducible tac promoter [de Boer, H. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21 (1983) will direct the expression of HIV protease. In pRB 505, the protease gene sequence is fused in the frame to the 3 'end of the sequence encoding the pelB leader sequence of the pectate lyase, so that the protease can be prepared in the cell periphery of E. coli. The construct is designed such that the leader sequence is cleaved and the naturally occurring N-terminal sequence of the protease is generated. The secretion of HIV proteases will facilitate the measurement and purification of variants produced by mutagenesis.

제7도에 도시된 혼합 프로브의 상보물이 합성되었고, 부분적으로 상보하는 올리고누클레오티드가 또한 합성되었다. 이들 올리고누클레오티드는, 활성부위 윈도우 양 옆에 편리한 XhoI(CTCGAG) 및 BstEII(GGTNACC) 제한 부위들(하기 그림에서 밑줄친 부분)을 가지는 이중 스트란트 서열의 제조가 허용되도록 디자인된다(활성부위 윈도우의 코딩 서열의 상보물이 합성되었음을 주지되어야 한다. 그로써 하기 제시된 활성부위 윈도우(5'-ACC AGT GTC-3')에 대한 야생형에 대한 누클레오티드 서열은 Asp-Thr-Gly을 코드하는 5'-GAC ACT GGT-3'의 상보물이다.)The complement of the mixed probe shown in FIG. 7 was synthesized, and partially complementary oligonucleotides were also synthesized. These oligonucleotides are designed to allow the preparation of double strand sequences with convenient XhoI (CTCGAG) and BstEII (GGTNACC) restriction sites (underlined in the figure below) on either side of the active site window (active site window). It should be noted that the complement of the coding sequence of is synthesized, whereby the nucleotide sequence for the wild type for the active site window (5'-ACC AGT GTC-3 ') shown below is 5'-GAC encoding Asp-Thr-Gly. It is the complement of ACT GGT-3 '.)

올리고누클레오티드는 아닐링되었고 DNA 중합효소의 클레노우 단편을 사용하는 반응에서 연장되었다. 짧은 상보 올리고누클레오티드의 연장으로 변이체 올리고누클레오티드들의 각각의 상보물이 생성된다. 반응혼합물은 BstEII와 XhoI으로 소화되고 그 생성물들은 8% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리되었다. 전기용출에 의하여 겔로부터 106bp의 밴드가 회수되었고, 활성부위 윈도우 단편을 함유하는 이 밴드가 pRB505의 BstEII와 XhoI 부위 사이에 클론 되었으며, 결찰된 플라스미드가 TGI/pACYC177 lacI 균주에 도입되었다. 그 결과의 형질전환제들은 LB amp 플레이트상에 플레이트되었고, 약 1000개의 콜로니를 생산하였다.Oligonucleotides were annealed and extended in reactions using cleno fragments of DNA polymerase. Extension of the short complementary oligonucleotides results in the complement of each of the variant oligonucleotides. The reaction mixture was digested with BstEII and XhoI and the products separated on an 8% polyacrylamide gel. A band of 106 bp was recovered from the gel by electroelution, this band containing the active site window fragment was cloned between the BstEII and XhoI sites of pRB505, and the ligated plasmid was introduced into the TGI / pACYC177 lacI strain. The resulting transformants were plated on LB amp plates and produced about 1000 colonies.

콜로니들은 실시예 4에서 설명되는 포로테아제 스크리닝 측정법을 사용하여 스크린되었다. 실시예 4에서 설명되는 바와같이, 프로테아제 기질로서 분유(3%) 또는 헤모글로빈중 어느 하나와, 발현의 유도를 위해 2mM IP TG를 함유하는 있는 영양 아가 플레이트상에 복제 플레이팅함으로써, 항암피실린 콜로니들은 단백질분해활성에 대해 스크리닝되었다. 이 측정에서, 만약 콜로니가 프레이트에서 기질(예컨대 분유)의 분해를 유도하는 단백질 분해 활성을 나타낸다면, 투명하게 되는 조운이 플레이트의 불투명한 바탕에 대해 나타난다. 야생형 HIV 프로테아제는 이 측정에서 (그것의 기질 특이성으로 인하여)활성을 나타내지 않으므로, 원래의 활성과 신규한 활성이 구별될 수 있다. 예비 데이터는 신규한 활성을 가지는 형질전화체들이 전술된 과정에 의해 생성될 수 있음을 나타낸다.Colonies were screened using the porotease screening assay described in Example 4. As described in Example 4, anti-ampicillin colonies were cloned by either plate milk (3%) or hemoglobin as a protease substrate and replicated on a nutritive agar plate containing 2 mM IP TG for induction of expression. Screened for proteolytic activity. In this measurement, if colonies exhibit proteolytic activity leading to degradation of substrates (such as milk powder) in the plate, a clearing tone appears against the opaque background of the plate. The wild type HIV protease does not show activity (due to its substrate specificity) in this assay, so original activity and new activity can be distinguished. Preliminary data indicate that transgenes with novel activity can be produced by the process described above.

생성된 신규한 변이체들은, 프로테아제 억제제를 이용한 차등 억제에 의한 작용의 상이한 메카니즘을 얻기위해 추가로 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 세린 프로테아제는 PMSF(페닐메틸술포닐 플루오라이드), DFP(디이소 프로필포스포플루오리데이트), TLCK(L-1-클로로-3-(-9-토실아미드)-7-아미노-2-헵타논 히드로클로라이드)에 의해 억제된다. 플레이트상에 할로겐 함유물을 생성하는 형질전환체들은 액체 배지에서 성장될 수 있으며, 배양물로부터의 추출물은 적절한 억제제의 존재하에 측정될 수 있다. 그러한 억제제의 부재시의 활성과 비교되는 세린 프로테아제 억제제의 존재하의 감소된 활성은 세린 프로테아제 촉매작용 메카니즘으로 변이체들이 작용한다는 것을 나타낼 것이다. 워크-쓰루우 돌연변이생성 과정에 의해 생성된 변이체들은 변경된 활성, 변경된 특이성, 세린 프로테아제 메카니즘 또는 이들 특징들의 조합을 가지는 변이는 들일 것이다. 이들 변이치들은 공지 기법을 사용하여 추가로 특성확인 될 수 있다.The resulting novel variants can be further screened to obtain different mechanisms of action by differential inhibition with protease inhibitors. For example, serine proteases include PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), DFP (diisopropylphosphofluoride), TLCK (L-1-chloro-3-(-9-tosylamide) -7-amino -2-heptanone hydrochloride). Transformants that produce halogen inclusions on the plate can be grown in liquid medium and extracts from the culture can be measured in the presence of appropriate inhibitors. Reduced activity in the presence of a serine protease inhibitor compared to the activity in the absence of such inhibitors will indicate that the variants function with a serine protease catalysis mechanism. Variants generated by the walk-through mutagenesis process will be variants with altered activity, altered specificity, serine protease mechanism, or a combination of these features. These variations can be further characterized using known techniques.

[모델 VI][Model VI]

이 구체예에서는, MCPC 603 Fv 분자의 6개의 CDR 중 5개의 워크-쓰루우 돌연변이생성이 수행되며, 이때에 Asp, His 및 Ser이 예비선택된 아미노산이다. 이 모델에서, 워크-쓰루우 돌연변이생성은 주어진 영역 또는 도메인내의 상이한 아미노산으로 2회 내지 3회 수행된다. 예를들어 Ser과 His은 연속적으로 VL CDR1에 대해 워크-쓰루우되고(제8a도), Asp과 Ser은 연속적으로 VL CDR3에 대해 워크-쓰루우된다(제8b도). VL CDR2는 구조적 연구결과 이 영역이 MCPC 603의 결합부위에 거의 기여하지 않는 것으로 나타났기 때문에 돌연변이생성이 표적이 되지 않았다.In this embodiment, five walk-through mutagenesis of the six CDRs of the MCPC 603 Fv molecule is performed, wherein Asp, His and Ser are preselected amino acids. In this model, walk-through mutagenesis is performed 2-3 times with different amino acids in a given region or domain. For example, Ser and His are sequentially walk-through for VL CDR1 (Figure 8a), and Asp and Ser are sequentially walk-through for VL CDR3 (Figure 8b). VL CDR2 was not targeted for mutagenesis because structural studies showed that this region contributes little to the binding site of MCPC 603.

Fv의 VH 사슬의 CDR1에서, Asp와 His이 워크쓰루우되었다(제8c도). Ser은 하나의 염기 변화만으로 CDR1의 2위치에 도입될 수 있다(제8c도, 위치 32 와 33). VH CDR2에서 His 과 Ser이 사용된 예비선택된 아미노산이고(제8d도), VH CDR3 에서는 Asp, His 및 Ser이 각각 CDR3의 아미노말단에 있는 5 위치에서 워크 쓰루우된다(제8e도).In CDR1 of the VH chain of Fv, Asp and His were walkthrough (Figure 8c). Ser can be introduced at position 2 of CDR1 with only one base change (Figure 8c, positions 32 and 33). In VH CDR2 His and Ser are preselected amino acids used (Figure 8d), and in VH CDR3 Asp, His and Ser are walk through at position 5 at the amino terminus of CDR3 (Figure 8e).

나아가, 이 구체예에서는 주어진 영역의 모든 아미노산은 비록 이것들이 야생형 잔기로서 예비선택된 아미노산을 함유하지 않더라도 돌연변이되지는 않는다. 예를들어 제8d도에서 위치 50, 52, 56, 58 및 60만이 돌연변이된다. 마찬가지로 제8a도 내지 8d도에서 영역내의 하나 또는 그 이상의 잔기들이 돌연변이 되지 않음을 알 수 있다. 영역내의 비인접 잔기들의 돌연변이 생성은, 영역내의 특정 잔기들이 소망하는 기능에 참여하지 않을 것이라는 것이 공지이든 추측이든 바람직할 수 있다. 또한, 변이체들의 수는 최소화될 수 있다.Furthermore, in this embodiment all of the amino acids of a given region are not mutated even if they do not contain preselected amino acids as wild type residues. For example, only positions 50, 52, 56, 58, and 60 are mutated in FIG. 8d. Similarly in Figures 8a-8d it can be seen that one or more residues in the region are not mutated. Mutational generation of nonadjacent residues in a region may be preferred, whether known or inferred, that certain residues in the region will not participate in the desired function. In addition, the number of variants can be minimized.

예를들어, 세린 프로테아제의 경우에, 디자인 인자는 예비선택된 아미노산들간의 거리이다. 촉매작용 트라이애드를 형성하기 위해, 잔기들은 상호간에 수소결합될 수 있어야 한다. 이러한 생각은 생성된 변이체들에 공간적인 속박을 부여한다. 그러므로 CDR 내에 있는 특정 위치들만이 촉매작용 트라이애드의 아미노산들이 적절한 상호작용을 하는 것을 가능하게 할 수 있다. 그로써, 분자 모델링 또는 다른 구조적 정보가 변이체들을 기능상 풍부화시키기 위하여 사용될 수 있다.For example, in the case of serine proteases, the design factor is the distance between the preselected amino acids. To form a catalysis triad, the residues must be able to hydrogen bond with each other. This idea gives spatial constraints to the generated variants. Therefore, only certain positions within the CDRs can enable the amino acids of the catalysis triad to interact properly. As such, molecular modeling or other structural information can be used to functionally enrich the variants.

이런 경우에, 돌연변이될 잔기들의 범위뿐만이 아니라 Asp, His 및 Ser간의 수소결합을 허용하기에 충분히 가까울 수 있는 영역 내에서의 잔기들의 확인에 공지된 구조정보가 사용되었다. 로버츠등은 CDR의 부분들 사이의 밀접한 접촉영역을 확인하였다[Roberts, V.A. et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87 : 6654-6658(1990)]. 이런 정보는 MCPC 603의 X-선 구조로부터의 데이터와 함께, 돌연변이 생성에 대해 표적이된 CDR 중의 밀접한 접촉이 기대되는 부분을 선택하는데 사용되었다.In this case, not only the range of residues to be mutated but also the structural information known for the identification of residues within the region that may be close enough to allow hydrogen bonding between Asp, His and Ser. Roberts et al. Identified close contact areas between parts of the CDRs [Roberts, V.A. et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87: 6654-6658 (1990). This information, along with data from the X-ray structure of MCPC 603, was used to select the portion of the CDR that was targeted for mutagenesis to be expected.

만약 돌연변이 생성이 예시된 바와같이 수행되고, 영역들이 무작위하게 조합된다면, 17,280 x 27,648 x 432 x 2304 x 7776 = 5.2 x 10¹⁸개의 상이한 펩티드 서열이 생성될 수 있다.If mutagenesis is performed as illustrated and the regions are randomly combined, 17,280 x 27,648 x 432 x 2304 x 7776 = 5.2 x 10 ¹⁸ different peptide sequences can be generated.

[모델 VII][Model VII]

상술된 각각의 구체예에서, 돌연변이 생성은 촉매적으로 활성인 잔기들의 클러스터가 만들어지도록 디자인된다. 모델 VII의 구체예에서는, 돌연변이 생성은 신규한 결합기능이 생성되도록 디자인된다. 이 구체예에서, 보조인자(예컨대 Fe+++)의 결합 또는 착화에 관련되는 잔기들은 MCPC 603의 경우에 분자의 영역들안에 도입된다. 많은 효소들이 보조인자로서 금속이온을 사용하므로 그러한 효소들을 공학적으로 처리하는 제1단계로서 그러한 결합부위들을 생성하는 것이 바람직하다.In each of the embodiments described above, mutagenesis is designed such that clusters of catalytically active residues are made. In an embodiment of model VII, mutagenesis is designed such that novel binding functions are produced. In this embodiment, the residues involved in the binding or complexing of the cofactor (eg Fe +++) are introduced in the regions of the molecule in the case of MCPC 603. Since many enzymes use metal ions as cofactors, it is desirable to create such binding sites as the first step in engineering such enzymes.

이 구체예에서는 2개의 히스티딘과 2개의 티로신 잔기들이 MCPC 603의 CDR에 도입된다. 산화화원 효소류의 하나이고, 카타콜(catachol)에서 이중 결합의 산화성 절단을 촉매하는 디옥시게나아제는 그것의 활성부위들에 결합되어 있는 철을 함유한다. 분광학적 분석 및 X-선 결정학은, 디옥시게나아제의 활성부위에 있는 철 이온이 2개의 티로신 및 2개의 히스티딘 잔기들에 의해 결합되어 있음을 보여준다.In this embodiment two histidine and two tyrosine residues are introduced into the CDRs of MCPC 603. Deoxygenase, which is one of the oxidizing enzymes and catalyzes the oxidative cleavage of double bonds in catachol, contains iron bound to its active sites. Spectroscopic analysis and X-ray crystallography show that iron ions in the active site of the deoxygenase are bound by two tyrosine and two histidine residues.

MCPC 603에 대해 디자인된 히스티딘 원도우(예컨대 제3c도, VL CDR2; 제4a도, VH CDR3; 및 제5a도, VH CDR2)는 히스티딘 잔기들을 MCPC 603의 하나 또는 그 이상의 도메인에 도입시키는데 사용될 수 있다. 또는 추가의 윈도우 디자인될 수 있다. 마찬가지로, MCPC 603의 하나 또는 그 이상의 CDR은 티론신을 이용한 워크-쓰루우 돌연변이에 대한 표적이 될 수 있다. 이들 카세트를 이용하여 매우 다양한 조합으로 및 상이한 영역들에 2개의 히스티딘 잔기와 2개의 티론신 잔기를 가지고 있는 변이체들이 제조될 수 있다.Histidine windows designed for MCPC 603 (eg, FIG. 3c, VL CDR2; FIG. 4a, VH CDR3; and 5a, VH CDR2) can be used to introduce histidine residues into one or more domains of MCPC 603. . Or additional windows can be designed. Likewise, one or more CDRs of MCPC 603 may be targets for walk-through mutations using tyrosine. These cassettes can be used to produce variants having two histidine residues and two tyrosine residues in a wide variety of combinations and in different regions.

이들 변이체들은 금속결합의 획득에 대해 스크린될 수 있다. 예를들어, 콜로니들의 푸울이 성장되고 세포주변 분획물이 제조될 수 있다. 주어진 푸울의 세포주변 분획에 있는 단백질들은 적절한 방사성 금속이온(예컨대⁵⁵Fe)으로 표시되고, 금속결합 변이체의 존재는 고감도의 겔 여과에 의해 측정될 수 있다. 겔 여과로부터의 단백질 분획내의 방사성의 존재는 금속결합의 척도이다. 콜로니푸울은 작은단위로 나우어져서 돌연변이체가 분리될때까지 상기 방법이 반복된다.These variants can be screened for the acquisition of metal bonds. For example, pools of colonies can be grown and periphery fractions prepared. Proteins in the periphery fraction of a given pool are represented by appropriate radioactive metal ions (eg, ⁵⁵ Fe), and the presence of metal binding variants can be measured by high sensitivity gel filtration. The presence of radioactivity in the protein fraction from gel filtration is a measure of metal binding. The colony pool is divided into small units and the method is repeated until the mutant is isolated.

또는 달리, 니트로셀룰로오스 필터 측정법 사용될 수 있다. 돌연변이체 단백질을 분비하고, 배지안에 그 단백질들을 누출시키는 것이 허용되는 균주의 콜로니들은 니트로셀룰로오스 필터상에 성장될 수 있다. 콜로니들로 부터 흘러 나오는 돌연변이 단백질은 니트로셀룰로오스에 결합될수 있고, 금속결합 단백질은 방사성 표지된 금속이온들로 프로브함으로써 확인될 수 있다.Alternatively, nitrocellulose filter assays can be used. Colonies of strains that are capable of secreting mutant proteins and leaking them into the medium can be grown on nitrocellulose filters. Mutant proteins flowing out of colonies can be bound to nitrocellulose, and metal binding proteins can be identified by probes with radiolabeled metal ions.

VL 사슬에서 금속결합의 발생을 촉매작용 VH 사슬의 금속협박 부위를 제공할 것이다. 이들 성분사슬로부터 Fv의 생성은 다른 사슬에서의 보조인자 결합에 의해 한 사슬에 의해 중재된 촉매작용을 증가시킬 것이다.The generation of metal bonds in the VL chain will provide a metal threat site of the catalyzed VH chain. The production of Fv from these component chains will increase the catalysis mediated by one chain by cofactor binding in the other chain.

본 발명은 다음의 실시예에서 추가로 설명한다.The invention is further illustrated in the following examples.

[실시예 1]Example 1

[VH 변이체의 제조][Production of VH Variants]

[올리고누클레오티드 합성]Oligonucleotide Synthesis

β-시아노에틸 포스포라미디트와 중합체 지지체(DPG) 컬럼을 어플라이드 바이오시스템즈, 인코포레이티드(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)로부터 구매하였다. 무수 아세토니트릴은 부르딕 앤드 잭슨(Burdick and Jackson)(Part no. 015-4)으로부터 구매하였다. 올리고누클레오티드는 어플라이드 바이오시스템즈 모델 392상에서 제조업자에 의해 제공된 프로그램을 사용하여 합성하였다.[Sinha, N.D., et al., Nucleic Acids Res., 12 : 4539(1984)]. 합성의 완료시에 올리고누클레오티드를 지지체로부터 유리시켰고, 보호 시아노에틸 그룹들은 농축 NH₄OH에서의 인큐베이션에 의해 제거하였다. 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동한 후 올리고를 겔로 부터 절출시키고, 전기용출 시킨후, C18 칼럼상에서 정제시키고 동결건조 시킨후, 적절한 완충액에 최종농도가 1μg/㎖이 되도록 용해시켰다.β-cyanoethyl phosphoramidite and polymer support (DPG) columns were purchased from Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif. Anhydrous acetonitrile was purchased from Burdick and Jackson (Part no. 015-4). Oligonucleotides were synthesized using the program provided by the manufacturer on Applied Biosystems Model 392 (Sinha, ND, et al., Nucleic Acids Res., 12: 4539 (1984)). At the completion of the synthesis oligonucleotide was released from the support and protective cyanoethyl groups were removed by incubation in concentrated NH ₄ OH. After electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel, the oligos were excised from the gel, electroeluted, purified on a C18 column, lyophilized and dissolved in an appropriate buffer to a final concentration of 1 μg / ml.

[올리고누클레오티드][Oligonucleotide]

모델 III에서 설명된 VH 변이체를 제조하기 위하여, 길이범위가 30-54 염기인 다음의 올리고누클레오티드와 그것들의 상보물(또한 도시됨)을 설명한 바와같이 디자인 및 합성하였다. 코돈 활용은 가장 빈번하게 사용된 대장균 코돈을 반영하기 위하여 조정하였다.To prepare the VH variants described in Model III, the following oligonucleotides in the range 30-54 bases and their complements (also shown) were designed and synthesized as described. Codon utilization was adjusted to reflect the most frequently used E. coli codon.

[유전자 조립][Gene assembly]

올리고누클레오티드의 이들쌍은 하기 도시된 바와같이 VH 유전자안에 조립될 수 있다:These pairs of oligonucleotides can be assembled in the VH gene as shown below:

쌍 D/d, F/f, 및 I/i는 각각 제3a도, 제5a도, 및 제3도에 도시된 윈도우들을 포함하는 축중 및 상보 올리고누클레오티드이다. 다른 올리고누클레오티드의 디자인은 플럭크툰 등에 의해 설명된 것과 유사하였고, 일련의 제한 부위들(추가의 조작에 유용한 EcoRⅠ, NcoⅠ, BanHⅠ, SauⅠ, XmaⅠ, XhoⅠ, NheⅠ, AccⅠ, HaeⅡ, SpeⅠ, ClaⅠ, PstⅠ, NsiⅠ, BssHⅡ, KpnⅠ, 및 HindⅢ(Pluckthun, A. et al., Cold Spring Harbar Symp. Quant. Biol., Vol. LⅡ, 105-112(1987)참조))의 도입을 포함하였다. 유전자 조립[Alvarado-Urbina, G. et al., Biochem. Cell Biol. 64 : 548-555(1986)]에 대해서, 18개의 올리고누클레오티드(B-Ⅰ. b-i)를 T₄폴리누클레이티드 키나아제를 사용하여 인산화시켰다. 10개의 쌍보쌍 각각을 별도로 아닐링시켰다. 그런다음 아닐된 쌍을 T4DNA 리가아제를 사용하여 함께 결찰시켰다. 생성물을 아래에 대략적으로 나타낸다 :Pairs D / d, F / f, and I / i are degenerate and complementary oligonucleotides comprising the windows shown in FIGS. 3A, 5A, and 3, respectively. The design of the other oligonucleotides was similar to that described by Fluktun et al., And a series of restriction sites (ecoRI, NcoI, BanHI, SauI, XmaI, XhoI, NheI, AccI, HaeII, SpeI, ClaI, PstI, useful for further manipulation) , NsiI, BssHII, KpnI, and HindIII (see Pluckthun, A. et al., Cold Spring Harbar Symp. Quant. Biol., Vol. LII, 105-112 (1987)). Gene assembly [Alvarado-Urbina, G. et al., Biochem. Cell Biol. 64: 548-555 (1986)], 18 oligonucleotides (B-I. Bi) were phosphorylated using T ₄ polynucleotide kinase. Each of the ten paired pairs was separately annealed. The unpaired pairs were then ligated together using T4DNA ligase. The product is shown approximately below:

클로닝을 위한 제한부위들을 함유하도록 합성유전자를 디자인하였다. 결찰후 완전히 조립된 분자들을 NcoⅠ과 HindⅢ로 절단시키고, 겔 정제한 후, 벡터 pRB500(실시예 2참조)의 NcoⅠ과 HindⅢ 부위에 삽입시켰다. LB amp 플레이트 상에서 바탕수 이상의 약 1500개의 형질전환체를 얻었다. 그 결과의 구조물은 peiB 신호 펩티드에 프레임내 융합된 VH 유전자 변이체들을 함유하여야 한다.The synthetic gene was designed to contain restriction sites for cloning. After ligation, the fully assembled molecules were cleaved with NcoI and HindIII, gel purified, and inserted into the NcoI and HindIII sites of the vector pRB500 (see Example 2). Over 1500 transformants were obtained on LB amp plates. The resulting construct should contain VH gene variants fused in-frame to the peiB signal peptide.

[실시예 2]Example 2

[pRB505의 제조][Production of pRB505]

[pRB500의 제조][Manufacture of pRB500]

peiB 신호서열[Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. 169 : 4379(1987)]을 코드하는 2개의 상보하는 올리고누클레오티드를 화학적으로 합성하였다. NcoⅠ과 PstⅠ부위에 상보하는 5' 및 3' 돌출부를 가지도록 고안된 올리고누클레오티드를 혼성화시켜서 벡터 pKK233.2(Pharmacia)의 Pst I과 NcoⅠ부위에 클론시켰다. 올리고누클레오티드들은 아래에 제시한다 :peiB signal sequence [Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)], two complementary oligonucleotides were chemically synthesized. Oligonucleotides designed to have 5 'and 3' overhangs complementing the NcoI and PstI sites were hybridized and cloned into the Pst I and NcoI sites of vector pKK233.2 (Pharmacia). Oligonucleotides are shown below:

그 결과의 플라스미드인 pRB500은 pelB 서열의 ATG 출발코돈 윗쪽에 유도가능한 tac 프로모터를 가지고 있다. pelB 리더를 코드하는 서열의 3'끝에는 독특한 NcoⅠ부위(밑줄로 표시함)가 있고, 그 안에는 분비될 생성물, 예컨대 HIV 프로테아제 또는 항체 VH 또는 VL 영역을 코드화하는 유전자가 삽입될 수 있다(단편의 5' 돌출부에 결찰된 NcoⅠ부위는 재생되지 않는다).The resulting plasmid, pRB500, has an inducible tac promoter on top of the ATG start codon of the pelB sequence. At the 3 'end of the sequence encoding the pelB leader, there is a unique NcoI site (underlined), into which a product to be secreted, such as an HIV protease or a gene encoding an antibody VH or VL region, can be inserted (Snippet 5). NcoI sites ligated into the protuberances are not regenerated).

[pRB503의 제조][Production of pRB503]

pUC18.HIV(Beckman, catalog # 267438)로부터 HIV 프로테아제 유전자를 얻었다. 유전자는 상기 플라스미드로부터 HindⅢ-EcoRⅠ또는 HindⅢ-BamHI 단편으로서 절출시켰다. 그런, HIV 프로테아제의 HindⅢ 부위는 플라스미스 pR500에 존재하는 pelB 리더서열에 프레임내로 직접 클론할 수는 없다. 그러므로 이중스트란드 올리고누클레오티드 링커를, HIV 프로테아제 코딩서열의 아미노말단 메티오닌이 pRB505의 pelB 리더 펩티드의 코딩서열에 프레임내 결합될 수 있도록 디자인하였다. 다음 서열을 합성하였다.The HIV protease gene was obtained from pUC18.HIV (Beckman, catalog # 267438). The gene was excised from the plasmid as HindIII-EcoRI or HindIII-BamHI fragment. However, the HindIII site of the HIV protease cannot be directly cloned in-frame into the pelB leader sequence present in plasmid pR500. Therefore, the double stranded oligonucleotide linker was designed so that the amino terminal methionine of the HIV protease coding sequence could be bound in-frame to the coding sequence of the pelB leader peptide of pRB505. The following sequence was synthesized.

이 링커는 5'-HindⅢ 돌출부 및 3'-DraⅢ 돌출부를 가진다. 올리고누클레오티드를 pUC18.HIV의 독특한 HindⅢ와 DraⅢ 부위안에 클론시켰다. 그 결과의 플라스미드를 pRB503으로 부른다. 링커는 HIV 프로테아제의 개시 메티오닌에서 벡터안에 NcoⅠ부위를 도입시키며 pUC18.HIV에서 발견되는 것과 같은 서열을 재구성시킨다.This linker has a 5'-HindIII protrusion and a 3'-DraIII protrusion. Oligonucleotides were cloned into the unique HindIII and DraIII sites of pUC18.HIV. The resulting plasmid is called pRB503. The linker introduces the NcoI site into the vector at the initiating methionine of the HIV protease and reconstructs the sequence as found in pUC18.HIV.

[pRB505의 제조][Production of pRB505]

pRB503으로부터 HIV 프로테아제 유전자를 NcoⅠ-EcoRⅠ단편으로서 분리하여 pRB500의 독특한 NcoⅠ과 EcoRⅠ부위에 클론시켰다. 최종 구조물에서, HIV 프로테아제를 pelB 리더서열에 프레임내 융합시키고, 유도성 tac 프로모터에 의해 발현을 유도한다. 리더 펩티다아제는 HIV 서열의 Ala와 Pro(상기 잔기 2와 3)사이의 융합단백질을 절단함으로써, 야생형 HIV 프로테아제에서와 같이 N-말단 프롤린을 생성시킬 것으로 기대된다.The HIV protease gene was isolated from pRB503 as a NcoI-EcoRI fragment and cloned into the unique NcoI and EcoRI sites of pRB500. In the final construct, HIV protease is fused in-frame to the pelB leader sequence and expression is induced by the inducible tac promoter. The leader peptidase is expected to cleave the fusion protein between Ala and Pro (residues 2 and 3 above) of the HIV sequence, producing N-terminal proline as in the wild type HIV protease.

[실시예 3]Example 3

[HIV 프로테아제 활성부위의 워크-쓰루우 돌연변이 생성][Generation of Walk-Through Mutation of HIV Protease Activation Site]

HIV 프로테아제의 Asp-Thr-Gly 활성부위 잔기들에 걸쳐있는 축중 올리고누클레오티드를 디자인하여 합성하였다. 이 올리고누클레오티드는 제7도에 도시된 서열에 상보하는 서열을 가진다.Degenerate oligonucleotides spanning the Asp-Thr-Gly active site residues of the HIV protease were designed and synthesized. This oligonucleotide has a sequence complementary to the sequence shown in FIG.

상기 서열에 부분적으로 상보하는 제2 올리고누클레오티드를 합성하여, 상기 축중 올리고누클레오티드의 이중 스트란트 형태로의 전환이 허용되도록 하였다. 상보하는 올리고누클레오티드는 다음의 서열을 가지고 있다:A second oligonucleotide partially complementary to the sequence was synthesized to allow conversion of the degenerate oligonucleotide to the double stranded form. The complementary oligonucleotides have the following sequence:

축중 올리고누클레오티드와 상보하는 올리고누클레오티드를 아닐링시켰다.Oligonucleotides complementary to degenerate oligonucleotides were annealed.

DNA 중합효소의 클레노우 단편을 사용하여 올리고머를 연장시켰다[Oliphat, A.R. and Struhl, K., Methods Enzymol, 155: 568-582(1987)]. 그결과의 혼합물을 BstEⅡ와 XhoⅠ으로 절단하고, 8% 폴리아크릴아미드겔 상에서 분리하였다. 활성부위 윈도우를 함유하고 있는 106bp 밴드를, 겔 슬라이스로부터 전기용출에 의하여 분리하고 페놀: 클로로포름으로 추출한 다음 에탄올로 침전시켰다.Clenow fragments of DNA polymerase were used to extend the oligomers [Oliphat, A.R. and Struhl, K., Methods Enzymol, 155: 568-582 (1987). The resulting mixture was cut into BstEII and XhoI and separated on 8% polyacrylamide gels. The 106 bp band containing the active site window was separated from the gel slices by electroelution, extracted with phenol: chloroform and precipitated with ethanol.

벡터 pRB505를 BstEⅡ와 XhoⅠ으로 절단한 후, 소의 장내 알칼리성 포스파타아제로 처리하여 재결찰을 방지하였다. 벡터밴드를 저융점 아가로오스겔로 부터 정제하였다. 정제된 BstEⅡ-XhoⅠ활성부위 윈도우(100 나노그램)를 pRB505(500 나노그램)의 BstEⅡ와 XhoⅠ부위에 클론시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 TG1/pACYC177 lacI⁹균주를 형질전환시키고, 항암피실린 형질전환체를 LB amp 플레이트(LB에 50㎍의 암피실린이 포함됨; Miller, H.H.,(1972), In : Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor, NY), p. 433)에서 선택하였다. 이 과정에 의해 약 1000개의 형질 전환체를 얻었다. 이들 형질전환체중 여러개를, 하기의 실시예 4에서 설명되는 프로테아제 플레이트 측정법을 사용하여 신규활성에 대하여 시험하였다.The vector pRB505 was digested with BstEII and XhoI and then treated with bovine intestinal alkaline phosphatase to prevent re-ligation. Vector bands were purified from low melting agarose gels. The purified BstEII-XhoI active site window (100 nanograms) was cloned into the BstEII and XhoI sites of pRB505 (500 nanograms). The ligation mixture was used to transform the TG1 / pACYC177 lacI ⁹ strain, and the anti-ampicillin transformants were transformed into LB amp plates (LB contained 50 μg of ampicillin; Miller, HH, (1972), In: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY), p. 433). About 1000 transformants were obtained by this procedure. Several of these transformants were tested for novel activity using the protease plate assay described in Example 4 below.

[실시예 4]Example 4

[프로테아제 활성 플레이트 측정][Protease Activity Plate Measurement]

[플레이트 측정의 감도][Sensitivity of plate measurement]

측정될 활성이 단백질 분해 활성인 경우에, 기질-함유 영양 플레이트를, 프로테아제를 분비하는 콜로니를 스크링하기위해 사용할 수 있다. 변성된 헤모글로빈과 같은 프로테아제 기질은 영양 플레이트에 혼입시킬 수 있다[Schumacher, G.F.B. and Schill, W.B., Anal. Biochem., 48 : 9-26(1972);Benyon and Bond, Proteolytic Enzymes, 1989(IRL Press, Oxford)p. 50]. 프로테아제를 분비할 수 있는 박테리아 콜로니들이 이들 플레이트상에서 성장할 때, 콜로니는 투명한 조운에 둘러싸이게 되고, 이것은 배지에 존재하는 단백질 기질이 소화되었음을 나타낸다.If the activity to be measured is proteolytic activity, a substrate-containing nutrient plate can be used to screen the colonies secreting the protease. Protease substrates such as denatured hemoglobin can be incorporated into nutrient plates [Schumacher, G.F.B. and Schill, W. B., Anal. Biochem., 48: 9-26 (1972); Benyon and Bond, Proteolytic Enzymes, 1989 (IRL Press, Oxford) p. 50]. When bacterial colonies capable of secreting proteases grow on these plates, the colonies are surrounded by a clear navy, indicating that the protein substrate present in the medium has been digested.

프로테아제는 이 측정법에 의해 검출될 여러 가지 표준을 만족시켜야한다. 먼저, 프로테아제는 이것이 기질과 상호작용 할 수 있는 배지안에 분비되어야 한다. 둘째, 프로테아제는 기질의 여러 가지 펩티드 결합을 절단하여서, 그 결과의 생성물이 가용성이고, 투명한 조운이 나탄야 한다. 셋째, 세포는 측정의 역치가 이상에서 검출될 수 있을 충분한 프로테아제 활성을 분비하여야 한다. 프로테아제의 특이적 활성이 감소됨에 따라, 측정에서 검출에 필요한 역치량은 증가할 것이다.Proteases must satisfy several standards to be detected by this assay. First, the protease must be secreted in a medium where it can interact with the substrate. Second, the protease cleaves the various peptide bonds of the substrate, so that the resulting product is soluble and has a clear coarseness. Third, the cells must secrete enough protease activity so that the threshold of measurement can be detected above. As the specific activity of the protease decreases, the threshold required for detection in the measurement will increase.

하나 또는 그이상의 프로테아제 기질을 사용할 수 있다. 예를들어, 헤모글로빈(0.05-0.1%), 카세인(0.2%) 또는 분유(3%)를 적절한 영양 플레이트안에 혼입시킬 수 있다. 콜로니들은 복제-플레이팅 또는 다른 적당한 방법에 의하여, 매니폴드(manifold)를 사용 및 접종하여 마스터 플레이트로부터 프로테아제 기질을 함유하고 있는 하나 또는 그 이상의 측정 플레이트상에 옮길 수 있다. 이것을 37℃에서(또는 적절한 온도에서)성장시킨후, 기질을 소화 시킬 수 있는 프로테아제를 분비하는 콜로니 주위에서 투명하게 되는 조윤을 관찰할 수 있다.One or more protease substrates can be used. For example, hemoglobin (0.05-0.1%), casein (0.2%) or milk powder (3%) can be incorporated into a suitable nutrition plate. Colonies can be transferred from master plates onto one or more measurement plates containing protease substrates by cloning-plating or other suitable method. After growing at 37 ° C. (or at appropriate temperatures), one can observe the swelling becoming transparent around the colonies secreting proteases that can digest the substrate.

상이한 특이성 및 반응 메카니즘을 가지는 4가지의 프로테아제들을 시험하여 플레이트 측정에서 검출가능한 활성의 범위를 측정하였다. 효소들은 엘라스타아제, 서브틸리신, 트립신, 및 키모트립신을 포함하였다. 제조업자에 의해 특이한 활성(엘라스타아제, 81U/mg 분말; 서브틸리신, 7.8U/mg 분말; 트립신, 8600U/mg 분말; 키모트립신, 53U/mg 분말)을 측정하였다. 각 효소, 엘라스타아제, 서브틸리신, 트립신, 및 키모트립신의 희석액을 제조하여 5㎕의 일정액을 3개의 상이한 측정 플레이트의 각각에 있는 별도의 웰에 피펫팅하였다.Four proteases with different specificities and reaction mechanisms were tested to determine the range of detectable activity in plate measurements. Enzymes included elastase, subtilisin, trypsin, and chymotrypsin. Specific activity (elastase, 81 U / mg powder; subtilisin, 7.8 U / mg powder; trypsin, 8600 U / mg powder; chymotrypsin, 53 U / mg powder) was measured by the manufacturer. Dilutions of each enzyme, elastase, subtilisin, trypsin, and chymotrypsin were prepared and 5 μl of constant solution was pipetted into separate wells in each of three different measurement plates.

1% 디프코 박토 아가 매트릭스(플레이트당 10㎖)중의 카세인, 분유분말, 또는 헤모글로빈을 50mM Tris, pH7.5, 10mM CaCl₂완충액중에 함유하는 플레이트를 제조하였다. 카세인 프레이트(0.2%)상에, 시험된 가장낮은 양에서 (0.75ng 단백질)의 네가지의 모든 효소들은 사용된 조건하에서 검출가능한 투명한 조운을 제공하였다. 분유분말을 함유하고 있는(3%) 플레이트 상에서, 엘라스타아제와 트립신은 3ng의 단백질에서 검출가능하였고, 키모트립신은 1.5ng의 단백질에서 검출가능하였으며, 서브틸리신은 스폿트된 단백질의 25ng 수준에서 검출가능하였다. 헤모글로빈 플레이트상에서, 0.05와 0.1퍼센트 범위의 헤모글로빈의 농도에서 1.5ng 엘라스타아제, 트립신 및 키모트립신은 검출가능한 투명한 조운을 제공하였다. 헤모글로빈 플레이트상에서, 사용된 조건하에서, 서브틸리신은 6ng 이하의 단백질에서 가시적인 투명조운을 산출하지 않았다.Plates containing casein, powdered milk, or hemoglobin in a 1% Difco Bacterium agar matrix (10 ml per plate) in 50 mM Tris, pH7.5, 10 mM CaCl ₂ buffer were prepared. On casein plate (0.2%), all four enzymes in the lowest amount tested (0.75 ng protein) provided a clear contrast detectable under the conditions used. On plates containing milk powder (3%), elastase and trypsin were detectable in 3 ng of protein, chymotrypsin was detectable in 1.5 ng of protein, and subtilisin at 25 ng level of spotted protein. It was detectable. On hemoglobin plates, 1.5 ng elastase, trypsin and chymotrypsin at concentrations of hemoglobin in the range of 0.05 and 0.1 percent gave clear detectable contrast. On hemoglobin plates, under the conditions used, subtilisin did not yield visible clear clouds in up to 6 ng of protein.

[HIV 프로테아제의 변이체의 측정][Measurement of Variants of HIV Protease]

실시예 3에서 설명한 과정에 의해 얻어진 대략 1000개의 항암피실린 형질 절환체중에서, 300r개의 콜로니를 프로테아제 플레이트 스크리닝 측정법을 사용하여 스크리닝하였다. 항암피실린 콜로니를, 발현유도를 위해 IPTG(이소프로필 티오갈락토피라노시드)와, 프로테아제 기질로서 분유분말(3%) 또는 헤모글로빈을 함유하고 있는 탑 층(top layer)을 가지고 있는 영양 아가플레이트(암피실린이 첨가된 LB) 상에 복제 플레이팅함으로써 단백질 분해활성에 대해 스크리닝하였다.Of the approximately 1000 anti-ampicillin transformants obtained by the procedure described in Example 3, 300r colonies were screened using protease plate screening assay. Anti-Ampicillin colonies were nutrient agar plates with IPTG (isopropyl thiogalactopyranoside) for expression induction, and a top layer containing milk powder (3%) or hemoglobin as a protease substrate. Screening for proteolytic activity was carried out by replication plating on ampicillin added LB).

프로테아제 기질 원용액을, 60ng의 헤모글로빈 또는 1.8ng의 분말분유를 10㎖의 탈이온수에 현탁히키고 60℃에서 20분동안 인큐베이션함으로써 만들었다. 탑층은 암피실린과 IPTG를 50㎖의 용융된 LB 아가(15g/ℓ)dp 60℃에서, 최종 농도가 각각 50㎍/㎖과 2mM이 되도록 첨가하고, 10㎖의 프로테아제 기질 원용액에 첨가함으로써 만들었다. 10㎖의 탑층을 LB amp 플레이트위에 부어 층을 형성시켰다.Protease substrate stocks were made by suspending 60 ng of hemoglobin or 1.8 ng of powdered milk in 10 mL of deionized water and incubating at 60 ° C. for 20 minutes. The top layer was made by adding Ampicillin and IPTG at 50 mL of molten LB agar (15 g / L) dp 60 ° C. to a final concentration of 50 μg / mL and 2 mM, respectively, and to 10 mL of protease substrate stock solution. 10 ml top layer was poured onto the LB amp plate to form a layer.

플레이트에서 특정기질(예컨대 분유)을 분해하는 충분한 단백질 분해 활성을 분비하는 콜로니들은, 콜로니 주위에 플레이트의 불투명한 바탕과는 구별되는 투명한 조운을 가질 것이다. 형질전환체중 어느것도 헤모글로빈 플레이트상에 투명 조운을 생산하지 못하였지만, 대부분의 형질전환체들은 분유분말 플레이트상에 투명조운을 만들어다. 분유분말플레이트는 37℃에서 약 1.5일동안 인큐베이션된후 냉장되었음이 주지되어야 한다. 비록 37℃에서 인큐베이션을 시작한지 1.5일후에 할로겐함유물이 나타나지는 않았지만, 측정 플레이트상의 90% 이상의 콜로니가 냉장고에서 3일이 지난후에 할로겐 함유물을 나타냈다. 측정 플레이트상에 할로겐 함유물을 생산한 3개의 샘플 콜로니를 2mM의 IPTG를 함유하고 있는 분유분말 플레이트상에 스크린하였다. 3개중 2개가 성장하였다. 이들 2개의 분리물에 대해 동일한 조건(37℃에서 밤새 성장시킨 후 3일동안 냉장시킴)하에서 다시 분명한 투명조운이 관찰되었다. 대조표준으로서, pelB 신호 서열은 코드하지만 HIV 프로테아제는 코드하지 않는 pRB 500을 함유하거나, 또는 야생형 HIV 프로테아제에 융합된 pelB 신호서열을 코드화하는 pRB 505를 함유하는 TGl/pACYC 177 lacI⁹의 형질 전환체들을, 2mM IPTG가 포함된 분유분말플레이트상에 스트리킹하였다. 돌연변이생성으로부터 얻어진 형질전환체들과는 대조적으로, 이들 대조 형질 전환체들은 분유 분말플레이트상에 투명한 조운을 나타내지 않았다. 이런 관찰 결과는 레트로바이러스 프로테아제가 바이러스 표적 단백질에 대해 선택적이라는 선행 결과들과 일치한다[Skalka, A.M., Cell 56: 911-913(1984)]. 이 측정법을 사용하여 워크쓰루우 돌연변이생성 과정에 의해 생성된 신규한 프로테아제 활성은, 변경된 기질 특이성에 의해 야생형 HIV 프로테아제로부터 구별될 수 있다.Colonies that secrete sufficient proteolytic activity to degrade specific substrates (such as milk powder) in the plate will have a clear coarseness around the colony that is distinct from the opaque background of the plate. While none of the transformants produced clear coarseness on hemoglobin plates, most transformants produce clear coarseness on milk powder plates. It should be noted that the powdered milk powder was refrigerated after incubation at 37 ° C. for about 1.5 days. Although no halogen content appeared 1.5 days after incubation at 37 ° C., more than 90% colonies on the measurement plate showed halogen content after 3 days in the refrigerator. Three sample colonies that produced a halogen content on the measurement plate were screened on a powdered milk plate containing 2 mM IPTG. Two of the three grew. Clear clearing was observed again for these two isolates under the same conditions (growing overnight at 37 ° C. and then refrigerated for 3 days). As a control, a transformant of TGl / pACYC 177 lacI ⁹ containing pRB 500 encoding the pelB signal sequence but not the HIV protease or containing pRB 505 encoding the pelB signal sequence fused to the wild type HIV protease Were streaked on a powdered milk powder plate containing 2 mM IPTG. In contrast to the transformants obtained from the mutagenesis, these control transformants did not show clear luck on the powdered milk powder plate. This observation is consistent with previous findings that retroviral proteases are selective for viral target proteins (Skalka, AM, Cell 56: 911-913 (1984)). Novel protease activity produced by the walkthrough mutagenesis process using this assay can be distinguished from wild type HIV protease by altered substrate specificity.

[동등한 실예][Equal example]

당해 기술분야에 숙련된 사람들은 기본적인 실험을 사용하여, 본원에서 설명된 본 발명의 특정구체예와 동일한 많은 예가 있다는 것을 인지하거나 확증할 것이다. 그러나 동등한 예는 다음의 특허청구범위에 의해 포함될 것으로 기대한다.Those skilled in the art will recognize or confirm, using basic experiments, that there are many examples that are identical to the specific embodiments of the invention described herein. However, equivalent examples are expected to be covered by the following claims.

Claims (24)

단백질 돌연변이체의 이형발생 혼합물로 이루어진 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법으로서, 단백질의 1개 이상의 예정된 영역에 있는 각 아미노산들을 단백질의 각 예정 영역에 있는 각각의 모든 선택된 서열 위치들에서 포화없이 1개 이상의 예정된 아미노산 중의 하나로 차례대로 특이적 치환시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.A method of generating a protein library consisting of heterologous mixtures of protein mutants, wherein each amino acid in one or more predetermined regions of a protein is subjected to one or more predetermined sequences without saturation at each and every selected sequence position in each predetermined region of the protein. A method for generating a protein library, characterized in that it comprises the step of specific substitution in turn to one of the amino acids. 제1항에 있어서, 단백질의 1개 이상의 예정된 영역에 있는 각 아미노산들을 단백질의 각 예정 영역에 있는 각각의 모든 선택된 서열 위치들에서 포화없이 2개의 예정된 아미노산중 하나로 차례대로 특이적 치환시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.2. The method of claim 1, comprising the step of specifically replacing each amino acid in at least one predetermined region of the protein with one of two predetermined amino acids without saturation at each of all selected sequence positions in each predetermined region of the protein. Characterized in that the method for generating a protein library. 제1항에 있어서, 단백질의 1개 이상의 예정된 영역에 있는 각 아미노산들을 단백질의 각 예정 영역에 있는 각각의 모든 선택된 서열 위치들에서 포화없이 1개의 예정된 아미노산으로 차례대로 특이적 치환시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.The method of claim 1, comprising the step of specifically replacing each amino acid in at least one predetermined region of the protein with one predetermined amino acid without saturation at each of all selected sequence positions in each predetermined region of the protein. Characterized in that a method of generating a protein library. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, (a) 단백질의 2개 이상의 예정 영역에 1개의 아미노산을 도입시키거나, (b) 상기 예정 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys 또는 Arg이거나, (c) 상기 예정 아미노산 중의 1개 이상을 상기 예정 영역에 함유하고 있는 단백질 돌연변이체의 비율이 예정 영역내의 1개 내지 전체 위치에 상기 예정 아미노산이 함유된 돌연변이체 단백질로 이루어지는 라이브러리 내에서 전체 단백질 돌연변이체의 12.5 내지 100% 범위인 것을 특징으로하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.The method according to any one of claims 1 to 3, wherein (a) one amino acid is introduced into two or more predetermined regions of the protein, or (b) the predetermined amino acids are Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys, or Arg, or (c) the proportion of protein mutants containing one or more of the predetermined amino acids in the predetermined region is such that the predetermined amino acid is present in one to all positions in the predetermined region. A method for generating a protein library, characterized in that it ranges from 12.5 to 100% of the total protein mutant in a library of contained mutant proteins. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 예정 아미노산의 치환이 단백질의 상기 예정 영역 또는 1개 이상의 예정 영역에 있는 각각의 모든 선택된 서열 위치들에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.The protein library according to any one of claims 1 to 3, wherein the substitution of the predetermined amino acid is made at each of all selected sequence positions in the predetermined region or at least one predetermined region of the protein. How to generate. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 예비 선택된 영역이 단백질의 기능적 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.4. The method of claim 1, wherein the preselected region comprises a functional domain of the protein. 5. 제6항에 있어서, (a) 예비선택된 영역이 효소 또는 결합 도메인의 촉매작용 부위 또는 그 주변에 일정 도메인을 포함하거나, (b) 예비선택된 영역이 항체의 초가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.The method of claim 6, wherein (a) the preselected region comprises a domain at or near the catalytic site of the enzyme or binding domain, or (b) the preselected region comprises a hypervariable region of the antibody. , A method of generating a protein library. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 한에 있어서, 단백질 돌연변이체 라이브러리를 스크리닝하여 소망하는 구조 또는 기능을 가진 단백질 돌연변이체를 선택하는 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.The method of any one of claims 1 to 3, wherein the protein mutant library is screened to select a protein mutant having the desired structure or function. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 예정된 아미노산이 Ser, Tyr, His, 또는 Asp인 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.The method of any one of claims 1 to 3, wherein the predetermined amino acid is Ser, Tyr, His, or Asp. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 돌연변이 단백질의 라이브러리.A library of mutant proteins prepared by the method according to any one of claims 1 to 3. 단백질을 코드화하는 유전자의 변이유발 방법으로서, a) 변이시킬 유전자에 의해 코드화된 단백질의 아미노산 서열의 규정된 영역을 선택하는 단계; b) 규정된 영역의 아미노산 위치들에 삽입시킬 1개의 아미노산 잔기를 결정하는 단계; c) 각각의 올리고누클레오티드가 돌연변이시킬 단백질의 합성에 필요한 누클레오티드 또는 예정된 아미노산의 코돈에 필요한 누클레오티드를 규정된 영역의 각각의 서열위치에 함유하고 있고, 상기 기준에 따르는 모든 가능한 올리고누클레오티드 돌연변이체가 함유되어 있는 올리고누클레오티드들의 혼합물을 합성하는 단계; 그리고, d) 상기 올리고누클레오티드를 함유하고 있는 클론된 유전자들의 발현 라이브러리를 생성하는 단계로 이루어지는, 단백질을 코드화하는 유전자의 변이유발 방법.A method of mutagenesis of a gene encoding a protein, comprising: a) selecting a defined region of an amino acid sequence of a protein encoded by a gene to be mutated; b) determining one amino acid residue to insert at the amino acid positions of the defined region; c) each oligonucleotide contains a nucleotide required for the synthesis of the protein to be mutated or a nucleotide required for the codon of a predetermined amino acid at each sequence position of the defined region and contains all possible oligonucleotide mutants in accordance with the above criteria. Synthesizing a mixture of oligonucleotides; And d) generating an expression library of cloned genes containing the oligonucleotides. 제11항에 있어서, (a) 규정 영역이 단백질의 기능적 도메인을 포함하고 있거나, (b) 규정 영역이 항체의 촉매작용 부위 또는 그 주변에 일정 도메인을 포함하거나, (c)규정 영역이 항체의 초가변 영역을 포함하고, 있거나, (d) 상기 예정 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys 또는 Arg인 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.The method of claim 11, wherein (a) the regulatory region comprises a functional domain of the protein, (b) the regulatory region comprises a domain at or near the catalytic site of the antibody, or (c) the regulatory region is A hypervariable region, or (d) the predetermined amino acid is Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys, or Arg. 제11항에 있어서, a) 클론된 유전자들의 상기 라이브러리를 발현시켜서 단백질 돌연변이체를 생성시키는 단계 ; 및 b) 클론된 유전자나 코드화된 단백질의 상기 라이브러리를 스크리닝 하여 원하는 구조 및 기능을 선별하는 단계 중의 한 개 이상의 단계를 더 수행하는 것을 특징으로 하는, 단백질 라이브러리를 발생시키는 방법.The method of claim 11, further comprising: a) expressing said library of cloned genes to generate protein mutants; And b) screening said library of cloned genes or encoded proteins to select one or more of the desired structures and functions. 제11항의 방법에 의해 제조된 클론된 유전자 라이브러리.A cloned gene library prepared by the method of claim 11. 다음 단계들로 이루어지는, 워크-쓰루우 변이유발 방법에 의해 원하는 구조나 기능을 가지는 단백질 돌연변이체를 제조하는 방법 : a) 포화없이 변이시킬 단백질의 아미노산 서열의 규정된 영역(들)을 선택하는 단계; b)상기 규정된 영역의 아미노산 위치들에 삽입시킬 1개 이상의 아미노산 잔기를 결정하는 단계; c) 각각의 올리고누클레오티드가 변이시킬 단백질의 합성에 필요한 누클레오티드 또는 예정된 아미노산의 코돈에 필요한 누클레오티드를 규정된 영역(들)의 각각의 서열위치에 함유하고 있고, 상기 기준에 따르는 모든 가능한 올리고누클레오티드 돌연변이체가 함유되어 있는 올리고누클레오티드들의 혼합물을 합성하는 단계 ; d)상기 올리고누클레오티드를 함유하고 있는 클론된 유전자들의 발현 라이브러리를 생성하는 단계 ; e) 상기 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 구조나 기능을 가진 단백질 돌연변이체를 코드화하는 1개의 클론을 검출하는 단계 ; 그리고 f) 상기 단계(e)에서 검출된 클론에 존재하는 올리고누클레오티드의 존재에 의해 원하는 구조난 기능을 가지는 단백질 돌연변이체를 발현시키는 단계.A method for producing a protein mutant having a desired structure or function by a walk-through mutagenesis method comprising the following steps: a) selecting the defined region (s) of the amino acid sequence of the protein to be mutated without saturation ; b) determining at least one amino acid residue to insert at the amino acid positions of the defined region; c) each oligonucleotide contains a nucleotide required for the synthesis of the protein to be mutated or a nucleotide required for the codon of a predetermined amino acid at each sequence position of the defined region (s) and all possible oligonucleotide mutants conforming to the above criteria are Synthesizing a mixture of contained oligonucleotides; d) generating an expression library of cloned genes containing said oligonucleotides; e) screening the library to detect one clone encoding a protein mutant with the desired structure or function; And f) expressing a protein mutant having a desired structural function by the presence of an oligonucleotide present in the clone detected in step (e). 제15항에 있어서, (a) 1개 이상의 규정된 영역에 대하여 2개의 예정된 아미노산을 선별하여 상기 규정된 영역(들)에 있는 아미노산 위치에 삽입시키거나; (b) 1개 이상의 규정된 영역에 대하여 1개의 예정된 아미노산을 선별하여 상기 규정된 영역(들)에 있는 아미노산 위치에 삽입시키는 것을 특징으로 하는, 단백질 돌연변이체를 제조하는 방법.The method of claim 15, further comprising: (a) selecting two predetermined amino acids for one or more defined regions and inserting them at amino acid positions in said defined region (s); (b) selecting one predetermined amino acid for at least one defined region and inserting it at an amino acid position in said defined region (s). 예정된 아미노산이 집합적으로 단백질의 일정 영역의 모든 위치에 1회 이상 나타나는 단백질 돌연변이체로 이루어지고, 단백질의 일정 영역에 1개 이상의 예정된 아미노산 잔기를 함유하는 돌연변이체가 라이브러리내의 상이한 돌연변이체들의 총 수의 12.5% 내지 100% 범위의 비율로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질 돌연변이체 라이브러리.12.5 of the total number of different mutants in the library, wherein the mutants containing the predetermined amino acids collectively appear one or more times in all positions of a region of the protein, and wherein the mutants containing one or more predetermined amino acid residues in a region of the protein A protein mutant library, characterized in that the ratio ranges from% to 100%. 제17항에 있어서, (a) 단백질 돌연변이체가 통계학상의 분포에 따라 예정된 아미노산을 영역내에서 일시에 1개 내지 모든 위치에 함유하거나, (b) 상기 단백질이 효소이고 상기 영역이 촉매작용 부위 또는 그 주변이거나, (c) 상기 단백질이 항체나 그 일부이고 상기 영역이 항원-결합부위의 초가변영역이거나, (d) 상기 예정 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys 또는 Arg으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.18. The method of claim 17, wherein (a) the protein mutant contains a predetermined amino acid at one to all positions in the region at a time according to a statistical distribution, or (b) the protein is an enzyme and the region is a catalytic site or Or (c) the protein is an antibody or part thereof and the region is a hypervariable region of the antigen-binding site, or (d) the predetermined amino acid is Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, A library characterized in that it is selected from the group consisting of Asp, Lys or Arg. 3개의 예정된 아미노산이 집합적으로 프로테아제의 활성부위 영역의 모든 위치에서 1회 이상 나타나는 단백질 돌연변이체로 이루어진 HIV 프로테아제 돌연변이체의 라이브러리.A library of HIV protease mutants consisting of protein mutants in which three predetermined amino acids collectively appear one or more times in all positions of the active site region of the protease. 제19항에 있어서, 3개의 예정된 아미노산이 Asp, His 및 Ser인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 19, wherein the three predetermined amino acids are Asp, His and Ser. Asp, His 및 Ser이 활성부위 영역에 나타나는 제 20항의 라이브러리의 단백질 돌연변이체.A protein mutant of the library of claim 20, wherein Asp, His, and Ser are present in the active site region. 영역의 각 위치에 예정된 아미노산을 도입하기 위하여 단백질의 선택된 영역을 코드화하는 누클레오티드 서열의 돌연변이 생성을 위해 올리고누클레오티드의 혼합물을 제조하는 방법으로서, 예비선택된 영역에 대한 누클레오티드 서열을 포함하는 올리고누클레오티드의 혼합물을 합성하는 것으로 이루어지며, 각각의 올리고누클레오티드가 선택된 영역의 각각의 서열위치에서, 영역을 아미노산의 합성에 필요한 누클레오티드 또는 예정된 아미노산의 코돈에 필요한 누클레오티드를 함유하며, 그 결과의 혼합물을 각 위치에서 2개의 누클레오티드 중 어느 하나를 함유하는 모든 가능한 변이 올리고누클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.A method for preparing a mixture of oligonucleotides for mutagenesis of a nucleotide sequence encoding a selected region of a protein to introduce a predetermined amino acid at each position of a region, wherein the mixture of oligonucleotides comprising the nucleotide sequence for a preselected region is prepared. Wherein each oligonucleotide contains a nucleotide required for the synthesis of amino acids or a nucleotide required for the codon of a predetermined amino acid, and the resulting mixture contains two at each position And all possible variant oligonucleotides containing any one of the nucleotides. 제22항의 방법으로 제조된 올리고누클레오티드 혼합물로서, 12.5% 내지 100%의 올리고누클레오티드가 1개의 예정 아미노산에 대한 1개 이상의 코돈을 함유한 것을 특징으로 하는 올리고누클레오티드 혼합물.An oligonucleotide mixture prepared by the method of claim 22, wherein 12.5% to 100% oligonucleotide contains one or more codons for one predetermined amino acid. 10개의 시약 용기를 구비하고 있고 이중에 4개의 용기에는 DNA의 4가지 누클레오티드에 대응되는 상이한 4개의 누클레오티드 동조체가 들어 있으며, 나머지 6개의 용기에는 각각 2개의 동조체들로 이루어진 6가지 상이한 혼합물들이 들어있는 것을 특징으로 하는 DNA 합성장치.It has 10 reagent vessels, four of which contain four different nucleotide conjugates corresponding to the four nucleotides of DNA, and the other six vessels contain six different mixtures of two conjugates each. DNA synthesis apparatus characterized in that there is.