KR0171629B1 - 증폭 생성물에 대한 빠른 분석 - Google Patents

증폭 생성물에 대한 빠른 분석 Download PDF

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Abstract

하기 단계로 구성되는, 폴리머라제 연쇄 반응 또는 다른 프라이머 유도 반응의 증폭 생성물에서 관심있는 핵산 서열을 검출하는 방법 : (a) 폴리머라제 연쇄 반응 혼합물 또는 다른 프라이머 유도 반응 혼합물 내로 (i) 그의 3' 말단에서 또는 (ii) 그의 3' 및 5' 말단에서 전기화학발광할 수 있는 화합물로 표식된 관심있는 상기 핵산 서열에 상보적인 적어도 하나의 핵산 서열을 혼입하고; (b) 폴리머라제 연쇄 반응 또는 다른 프라이머 유도 반응을 수행하고; 및 (c) 표식된 증폭 생성물의 전기화학발광을 측정한다.

Description

[발명의 명칭]
증폭 생성물에 대한 빠른 분석
[발명의 분야]
본 발명은 증폭된 핵산 서열의 검출 또는 정량에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 빠른, 일-단계, 동종 분석으로 폴리머라제 연쇄 반응의 증폭 생성물에서 관심있는 핵산 분석물의 검출 또는 정량에 관한 것이다.
몇몇 간행물은 본 출원에서 괄호내 아라비아 숫자로 언급했다. 이들 참고문헌의 상세한 인용은 상세한 설명 끝부분에 특허청구범위에 바로 앞서 기재한다. 이들 참고문헌은 본 발명이 관여하는 최신 기술을 설명한다.
[발명의 배경]
질병 상태 및 감염원을 찾아내기 위한 핵산 혼성 방법의 사용은 빠르게 변하고 있는 기술이다(1). 이들 방법은 임상 실험실에서 허가받을 목적으로, 단순한 비방사성 포맷을 많이 채택하여 왔다(2,3). 이들 분석은 원하는 민감도를 얻기 위해 화학 발광 또는 효소 라벨, 또는 이들의 조합물을 사용한다(4). PCR에 의해 제공되는 빠른 샘플 제조는 빠르고 단순한 분석을 전개시킬 가능성을 제공한다.
[핵산 증폭 방법들]
데옥시리보핵산(DNA)과 같은 핵산이 자가-복제(self-replication) 동안 자기 자신의 주형으로서 역할할 수 있음은 잘 알려져 있다. 두가닥 또는 이중 핵산이 그 성분인 한 가닥으로 분리될 수 있는 것 또한 잘 알려져 있다. 이들 특성은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 시험관내 핵산 서열의 변형 및 증폭을 허용토록 개발되었다.
PCR은 반대편 가닥과 혼성되고 관심있는 목표 폴리뉴클레오티드 서열상의 부분에 접하도록 고안된 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는, 시험관내, 핵산 서열의 효소-기재 복제이다. 반복성 주기 동안 핵산은, 통상적으로 열 변성에 의해 가닥 분리되고, 프라이머가 한가닥 주형과 혼성되고 (열 순환이 사용된다면 어닐링으로서), 그리고 DNA 폴리머라제(DNA 프라이머 확장에 대한 DNA 주형) 또는 역전사효소(DNA 프라이머 확장에 대한 리보핵산 또는 RNA 주형, 또는 DNA 프라이머 확장에 대한 DNA 주형)와 같은 효소가 주형상의 프라이머를 확장시킨다. 새로 합성된 가닥을 포함하여, 두가닥(플러스 및 마이너스) 모두 가닥 분리 단계에 의해 각각 양쪽 프라이머 확장을 위한 주형으로서 유용하게 만들어진다. 두개의 프라이머를 가진, 그 결과 각 순환마다 플러스 및 마이너스 사슬이 복제되기 때문에, 각 순환마다 주형내 핵산 복사수(플러스 및 마이너스 가닥 모두)가 지수적으로 증가한다(그러므로 용어 연쇄 반응이 사용됨). 결과 핵산 이중사슬이 사용된 특이 프라이머의 말단에 상응하는 종결부를 가질 것이다. PCR에 의해 시험관 내에서 핵산 서열을 증폭하고 검출하고 또는 그렇지 않으면 변형하는 것이 가능하다.
PCR을 위한 프라이머의 제조는 증폭되어야 할 또는 검출되어야 할 핵산 가닥(플러스 및 마이너스 주형 모두)의 말단서열이 알려져 있을 것을 요구한다(5). 서열정보는 관심있는 핵산 말단의 직접 서열화에 의해, 또는 폴리펩티드 말단의 서열화에 의해 유도될 수 있으며 상응하는 복제 올리고뉴클레오티드 프라이머를 생산한다. 최적 프라이머 크기는 전형적으로 길이로 약 20-30 염기이나 작용가능한 프라이머는 특이 환경에서 더 작거나 클 수 있다. 공지된 바와 같이, 프라이머 크기가 감소함에 따라 프라이머가 관심있는 서열상의 계획되지 않은 위치에 혼성될 가능성이 증가한다. 계획되지 않은 혼성은 바라는 생성물 증폭의 중단 및 보다 작은 크기 또는 바라지 않는 프라이머 삽입물을 가진 생성물의 생성을 유도할 수 있다. 그러므로, PCR을 위한 두개의 최적 프라이머의 선택은 실행할 때마다 관심있는 서열과의 계획되지 않은 혼성을 피할 것을 요구한다.
계획되지 않은 혼성을 피하기 위한 프라이머 서열의 합리적 선택은 잘 공지되어 있다. 연산방식(algorithms)이 공지되어 있으며, 이로써 숙련공은 제안된 프라이머 서열을 (알려진)전체 주형 서열과 분석 혼합물내 존재하는 것으로 알려진 어떤 다른 서열에 비교할 수 있다.
관심있는 핵산 서열의 반대편 가닥 말단 부분을 결정하고 이에 혼성될 수 있는 2개의 프라이머를 제조할 필요성은 유니버셜 프라이머에 의해 피해질 수 있을 것이다. 존재하는 모든 DNA 서열은 유니버셜 프라이머 결합 위치를 수용하고 유니버셜 프라이머에 의해 증폭될 것이다.
PCR 증폭은 폴리뉴클레오티드 서열 라이브러리(library)로부터 새로운 유전자 서열을 분리하기 위해 사용되고 있다. 새로운 유전자는 또한 새로운 유전자 서열 부분을 혼입하는 충분히 상보적인 프로브(probe)에 의해 분리되어질 수 있으나, 이러한 프로브 분리 방법은 PCR에 의해 제공되는 민감도를 결여한다.
PCR에 기초한 선행 기술 분석에서, 5' 말단에서 라벨링된 핵산 프로브는 관심있는 핵산 분석물과 혼성하기 위해 사용되어 왔다. 이들 프로브는 종종 이들의 표지되지 않은 3' 말단에서 폴리머라제 연쇄 반응으로 들어가므로 의사(擬似) 결과를 초래하게 된다. 선행 기술 분석은 또한 이종, 즉, 분리 분석이다. 그렇기 때문에 그들은 시간 소비적이고 수반된 많은 세척 단계는 분석 샘플의 오염 가능성이 생기게 한다.
[라벨링된 핵산 서열의 검출]
많은 방법 및 시스템이 생화학적 및 생물학적 기질내 관심있는 핵산 분석물의 검출 및 정량을 위해 개발되고 있다. 전형적으로 관심있는 핵산 분석물의 존재는 관심있는 분석물에 결합된 프로브에 부착된 관찰가능한 라벨 의 존재 또는 부재에 의해 지시된다. 특히 관심은 광화학적, 화학적 및 전기 화학적 방법을 통해 발광하도록 만들어질 수 있는 라벨들이다.
광발광(photoluminescence)은 물질이 전자선을 흡수할 때 물질이 발광하도록 유도되는 법이다. 형광 및 인광은 광발광의 종류이다. 화학 발광(chemiluminescent) 방법은 에너지의 화학적 전이에 의해 발광종의 창출을 일으킨다. 전기화학 발광(electrochemiluminescence)은 전기화학적으로 발광종의 창출을 일으킨다.
전기화학 발광(ECL) 분석 기술은 화학 발광 기술상의 진보이다. 그들은 관심있는 분석물의 존재 및 농도에 대해 민감하고 정확한 측정을 제공한다. 상기 기술에서, 항온처리된 샘플은 발광을 개시하기 위해 전압계 작동 전극에 노출된다. 적절한 화학적 환경에서, 상기 전기화학발광은 특정시간에 특정방식으로 작동전극상에 가한 전압에 의해 개시된다. 라벨에 의해 생성된 빛을 측정하는데, 이는 분석물의 존재 또는 양을 가리킨다. 상기 ECL 기술의 완전한 설명을 위해, PCT 공고 출원번호 US 85/01253(WO 86/02734), PCT 공고 출원번호 US 87/00987(WO 87/06706) 및 PCT 공고 출원번호 US 88/03947(WO 89/04302)를 참조한다. 상기 출원의 개시는 참고로 통합되었다.
분석과정동안 분리 단계와 함께 및 없이 전기화학발광 분석을 수행하는 것 및 정확하고 민감한 측정이 가능토록 분석물의 다른 농도에서 시그널 변조를 최대화하는 것이 가능하다.
PCT 공고 출원 번호 US 89/04919(WO 90/05301)는 불활성 마이크로미립 물질이 분석 시스템의 결합 반응물 중 하나에 특이하게 결합되는 발광현상에 근거하여 민감하고 특이한 결합 분석 방법을 설명한다. 분석은 이종(하나 또는 그 이상의 분리 단계) 분석 포맷으로 수행되고 가장 유익하게는 동종(비분리) 분석 포맷으로 사용될 수 있다.
발광은 특이 결합 상대와 결합하였던 또는 결합하지 않았던간에, 전압계 작동 전극에 라벨 화합물을 노출시킴으로써 유도된 전기화학 발광(ECL)으로부터 발생한다. ECL 반응성 혼합물은 빛을 발생시키기 위해 특정시간에 특정방식으로 작동 전극에 가한 전압에 의해 빛을 방출하도록 조절가능하게 개시된다.
미합중국 특허 출원 제 267,509 호 및 미합중국 특허 출원 제 266,914 호는 바람직한 분석 조성물에 관한 것이다. 이들 출원의 개시는 참고로 통합된다.
미합중국 특허 출원 제 267,234 호, 미합중국 특허 제 5,061,445 호 및 미합중국 특허 출원 제 744,890 호는 ECL-기재 분석의 실행을 위한 바람직한 장치를 설명한다. 미합중국 특허 출원 일련번호 제 652.427 호는 ECL-기재 분석을 실행하기 위한 바람직한 방법 및 장치를 설명한다. 여기서 또한 참고로 통합된, 이들 모든 출원의 개시는 조사 및 임상 세팅에서 수행되는 다양한 분석에서 분석물의 극히 적은 양의 정량 및 검출을 허용한다.
[발명의 목적]
폴리머라제 연쇄 반응 또는 다른 프라이머 유도 증폭으로 증폭된 핵산에 대한 분석을 빠르게 수행하기 위한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 주요목적 이다.
폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭된 관심있는 핵산에 대한 민감하고 믿을만한 동종 분석을 빠르게 수행하기 위한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 관련된 목적이다.
선행 기술 분석과 관련된 샘플 오염 및 세척 단계를 피하는 분석을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.
5' 프로브의 사용과 관련된 의사 결정 및 문제를 피하는 분석을 제공하는 것이 본 발명의 부가적이고 관련된 목적이다.
[발명의 요약]
통상적 분석에서 사용되는 많은 세척 단계 및 프로브의 첨가에 의해 소비되는 시간 및 오염을 피하는 증폭된 DNA에 대한 빠른 미분리 분석에 의해 이들 목적은 달성된다.
올리고뉴클레오티드 프라이머는 결합 모이어티 또는 검출가능한 라벨에 결합되고 올리고뉴클레오티드 프로브는 결합 모이어티 또는 검출가능한 라벨로 3' 또는 3' 및 5' 말단에서 라벨링되어, 그 결과 결합 모이어티 및 검출가능한 라벨 둘다가 프라이머 및 프로브 혼합물 내에 존재한다. 이러한 프로브 및 프라이머의 혼합물은 PCR 또는 다른 프라이머 유도 반응 혼합물 내로 도입되고, 그 결과 혼합물은 개질된 프라이머의 첨가시에 반응을 위해 완전하다. 3' 또는 3'5' 라벨링된 포지자는 PCR 산물 내로 혼입되지 않으므로 5' 라벨링된 프라이머와는 달리 혼성에 대한 그들의 특이성을 유지한다. 이들 PCR/혼성으로부터의 샘플은 그리고나서 스트렙타비딘 비드의 현탁액 내로 샘플링되고 직접 ECL 분석기 내에 위치한다. 이러한 빠른 샘플 조작은 전형적 혼성분석에 수반되는 세척 단계를 피한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 빠른 일단계 분석에 대한 분석 포맷이다.
제2도는 HIV1 gag에 대한 분석, 빠른 일단계 분석이다.
제3도는 낭포성 섬유 유전자(cystic fibrosis gene)에 대한 분석, 빠른 일단계 분석이다.
제4도는 합성 낭포성 섬유 유전자에 대한 그의 특이성을 증명하는 분석이다.
제5도는 정상 인간 샘플내 낭포성 섬유 유전자에 대한 분석이다.
제6도는 노오쓰 캐롤라이나(North Carolina) 대학으로부터의 인간 샘플내 낭포성 섬유 유전자에 대한 분석이다.
[발명의 상세한 설명]
[정의]
발명을 보다 명확히 이해하기 위해, 일부 용어를 하기와 같이 정의한다:
뉴클레오티드는 4개의 염기중 하나: 아데닌(adenine), 시토신(cytosine), 구아닌(guanine), 및 티민(thymine) (DNA) 또는 우라실(uracil) (RNA), + 당 (DNA에 대해서는 데옥시리보스, RNA에 대해서는 리보스), +포스페이트이다. DNA 중합 반응을 위한 단량체를 제공하기 위해, 전형적으로 4개의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 모두가 필요하다. 본원에서 정의된 뉴클레오티드는 주형상에서의 폴리머라제의 작용을 개선하기 위해 사용되는 5-메틸-dCTP 및 7-데자-dGTP(7-deaza-dGTP)와 같은 개질된 염기도 또한 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 뉴클레오티드는 증폭된 서열의 선택적 결합에 제공하기 위해, 증폭하는 동안 프라이머 내로 또는 프라이머 확장 산물 내로 직접 혼입될 수 있는 아미노-7-dUTP(Clontech, Palo Alto, California) 및 바이오틴-21-UTP 및 디곡시제닌(digoxigenin)(Indiana, Indianapolis, Boehringer Mannheim 으로부터의 디곡시제닌-11-UTP) 및 바이오틴에 연결된 염기도 또한 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 적어도 두개의 뉴클레오티드로 형성된 서열이다. 폴리뉴클레오티드는 긴 올리고뉴클레오티드이고 RNA 또는 DNA일 수 있다. 용어 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 보다 작은 핵산 사슬을 정의하기 위해 당업계에서 사용되고 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 DNA 또는 RNA 염색체 또는 이의 단편을 포함하여, 보다 긴 핵산 사슬을 정의하기 위해 당업계에서 사용된, 본원에서의 이런 용어 사용은 특별히 언급하지 않는 한 크기를 제한 혹은 기술하려는 것은 아니다.
용어 핵산은 상기 언급한 바와 같은 개질된 염기를 가지거나 갖지 않은 DNA 또는 RNA 염색체 또는 이의 단편을 포함하는, 임의 길이의 폴리 뉴클레오티드를 말한다.
서열(즉, 서열, 유전자 서열, 폴리뉴클레오티드 서열, 핵산 서열)은 5' 에서 3' 방향으로 읽혀 내려가는 폴리뉴클레오티드 가닥내 존재하는 실제 열거된 염기(리보스 또는 데옥시리보스)를 말한다.
첫번째 뉴클레오티드 서열에 대한 상보체는 첫번째 서열과 왓슨-크릭 혼성(Watson-Crick hybridization)에 의해 짝지워질 염기로 이루어진 두번째 서열인 것으로 잘 알려져 있다. 즉, 데옥시 리보핵산(DNA) 서열 5'-ATGC 3'에 대한 상보체는 5'-GCAT 3'로 잘 알려져 있다. 이중 또는 두가닥 DNA의 경우, 두가닥의 각각은 다른 것에 대해 상보적으로 또한 상보적인 짝으로 설명된다. 용어 상보체 및 반상보체도 또한 사용될 수 있다. RNA로의 전사가 진행되는 이중 DNA 가닥을 구별키 위해, 전사가닥은 일반적으로 플러스로 서술되고 그의 상보체는 마이너스로 서술되고(또는 + 및 -), 또는 전사 가닥은 센스 가닥(sense strand)으로 그의 상보체는 안티센스(antisense)로 서술된다. 상보적인 모든 염기 쌍을 가진 다른 것에 각각 혼성된 두개의 가닥은 각각 서로 100% 상보적이다. 5%의 비상보적인 염기를 가진, 각각 다른 것과 혼성되는 두 가닥은 95% 상보적이다(또는 두가닥이 95% 상보성을 가진다).
폴리뉴클레오티드 서열사이의 유사성(Homology) 은 각각이 서열사이의 서열 유사성의 점도를 말한다. 서열이 동일한 두 가닥은 100% 서열 유사성을 가진다. 서열의 5%가 다른 두 가닥은 95% 서열 유사성을 가진다. 서열 5%가 다른 두 가닥은 95% 서열 유사성을 가진다. 가닥 A 및 B 사이의 유사성의 정도가 클수록 B의 상보체와 A사이의 상보성이 커진다.
프로브(probe)는 관심있는 목표 핵산 서열에 상보적인 서열을 갖는 한가닥 또는 두가닥 핵산이고, 또한 프로브-목표 이중사슬의 측정을 가능케하는 몇가지 부가적인 특성을 가진다. 숙련공은 만일 프로브 및/또는 목표가 두가닥이면, 두 가닥 핵산은 혼성이 일어나기 전에 가닥 분리가 일어나야만 한다는 것을 이해할 것이다.
프로브는 부착된 태그(tag) 또는 라벨(label)에 의해 검출될 수 있도록 된다. 프로브에 연결된 태그나 라벨은, 원칙적으로, 형광 또는 발광 태그, 동위원소의(즉, 방사성 동위원소 또는 자기 공명) 라벨, 염색 라벨, 효소 라벨, 항체에 의해 검출가능한 항원 결정자(antigenic determinant), 또는 스트렙타비딘으로 피복된 비드와 같은 또다른 결합 모이어티가 프로브에 특이적으로 결합할 수 있게끔하는 바이오틴과 같은 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 라벨링된 또는 태그 붙은 프로브-목표 이중 사슬이 형성될 때, 이 이중사슬은 태그 또는 라벨의 특징적인 특성에 의해 검출될 수 있다. 라벨 모이어티를 지닌 프로브는 라벨에 의한 검출을 가능케하는 혼성 및 이중 사슬 형성을 통해 라벨링된 모이어티를 갖는 목표물에 의해 포획된다.
프라이머는 관심있는 서열 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 비교적 짧은 단편이다(관심있는 서열은 더 긴 핵산 서열내 하위단편일 수 있다). 프라이머는 결과적으로 생기는 확장 산물의 5'-말단을 나타낸다. 주형 가닥 상 위의 관심있는 서열에 대해 이의 3'-말단에서 상보적인 프라이머는, 주형에 대한 혼성시 폴리머라제가 이러한 3'-말단에서 작용하도록 한다. 프라이머도 또한 결합 모이어티 또는 검출가능한 라벨로 그의 5' 말단에서 개질될 수 있다.
가닥분리는 두가닥 또는 이중 핵산이 두 개의 상보적인 한가닥 폴리뉴클레오티드로 전환하는 것을 말한다. 분리 방법은 효소 매개 분리(예컨대, 효소 헬리케이즈(helicase)에 의해 (5)), 물리적-화학적 분리(pH, 이온 농도, 등등) 및 열 변성으로도 알려져있는 열 분리를 포함하는 공지된 기술을 사용한다. 열 변성(또한 멜팅(melting)으로 언급됨)은 두가닥 폴리뉴클레오티드(완전히 또 부분적으로 이중사슬)를 폴리뉴클레오티드를 보유하는 용액의 온도를 상승시킴으로써 적어도 두개의 한가닥 폴리뉴클레오티드로 분리하는 것이다.
혼성은 상보적인 한 가닥 핵산으로부터 두 가닥 또는 이중 핵산의 형성을 말한다. 혼성은 DNA-DNA, DNA-RNA 또는 RNA-RNA를 형성하기 위한 충분히 상보적인 한 가닥 DNA 및/또는 RNA사이에서 일어난다.
RNA의 시험관내 증폭은 DNA 폴리머라제에 의해 촉매된다. 많은 종류의 DNA 폴리머라제가 당업계에 공지되어 있다. 그들은 일반적으로 프라이머가 어닐링된 한 가닥 주형을 사용하여 두가닥 DNA 서열의 합성을 촉매하는 공통된 특성을 공유한다. 대부분의 유기체로부터 추출된 DNA폴리머라제는 핵산의 열변성을 위해 요구되는 온도에서는 불활성이 된다. 즉, 각 열 주기 시작시 효소의 교체 또는 열 불활성화를 방지할 수 있는 인자의 첨가가, 만일 열에 민감한 효소가 사용된다면 필요하다. 본 발명 뿐만 아니라 시험관 내 PCR에 바람직한 DNA 폴리머라제는 고온에서 살아가는 유기체로부터 유도되고 그러므로 열 내성이 있고, 즉 그러므로 이중 DNA를 변성시키는 온도에서 적절한 촉매 활성을 유지하는 것들이다.
DNA 폴리머라제에 의해 촉매되는 반응은 당업계에 공지되어 있고 본원에서는 DNA 폴리머라제 반응으로 언급된다. 반응은 일부 또는 모든 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 프라이머 (바람직하게는, 과량의 물 내에서) 및 원형 가닥 분리를 위한 수단이 필요하다. 가닥 분리는 바람직하게 어닐링(annealing)과 변성 온도 사이의 열 주기에 의해 달성된다. 역전사효소는 DNA에서 DNA로의 복제 뿐만 아니라 RNA에서 DNA 복제를 모두 매개하는 것으로 공지되어 있다. 그러므로 현재 공지된 꽤 많은 효소가 연쇄반응을 촉매할 것이다.
전기화학 발광(ECL) 라벨은 전기화학적으로 작용시에 발광종이 되도록 만들어질 수 있는 것들이다. 상기 ECL 라벨은 바드(Bard) 일동 및 마세이(Massey) 일동에 의해 PCT 공고 출원에 서술되어 있다(PCT US 85/02153, WO 86/02734 및 PCT US 87/00987, WO 87/06706).
용어 검출 및 정량은 측정으로도 언급되고, 정량이 기준 조성물 및 보정물의 제조를 요구함은 물론이다.
ECL 장치 ECL 분석기는 전기화학 발광을 근거로한 분석을 수행하기 위한 임의의 기구이다.
[상세한 설명]
증폭된 핵산 서열에 대한 개선된 빠른 비-분리 분석은 3' 또는 3'5' 전기화학발광 라벨을 가진 올리고뉴클레오티드를 사용하여 개발되었다. 3' 또는 3'5' 라벨을 가진 올리고뉴클레오티드는 PCR 또는 다른 프라이머 유도 반응에서 프라이머로서 작용할 수 없다. 그들은 과량의 증폭된 핵산에 대한 혼성을 위해 이용가능한 증폭 방법의 말렵에까지 남아있게 된다.
이 프로브 시스템을 이용하는 분석은, 프로브가 써모사이클러(thermocycler) 프로그램 내에서 혼성할 수 있기 때문에 빠르다. 결합 현상을 검출하기 위해 ECL 기술을 사용함으로써 외부 세척 또는 다른 조작에 대한 필요를 피한다. 물론, 세척단계는 임의로 사용될 수 있다. 이들 분석 포맷은 첨가물을 분리 첨가를 해야하고 오염 문제를 각오해야 할 필요성을 제거한다. 주로 PCR 반응과 관련하여 하기에 서술하였지만, 발명은 임의의 프라이머 유도 반응에서도 사용될 수 있다.
이전에 기술된 PCR 프로토콜(6, 7)의 사용에 기초하여 HIV1 gag 유전자 및 인간 낭포성 섬유 유전자의 검출을 위한 분석이 하기에 서술된다. 또한 낭포성 섬유증 상태를 시험한 15명 환자 샘플의 연구도 서술된다. 사용된 샘플은 5 정상인, 508 삭제에 대해 5 이형접합(heterogeneous)인 및 508 삭제에 대해 5 동종접합(homogeneous)인 것이다.
바람직한 실시양태에서 발명은 하기 단계로 구성되는, 폴리머라제 연쇄반응 또는 다른 프라이머 유도 증폭 반응의 생성물에서 관심있는 핵산 서열을 검출하는 방법으로 이루어진다: (a) 폴리머라제 연쇄반응 또는 다른 프라이머 유도 반응 혼합물 내로 전기화학 발광할 수 있고 관심있는 핵산 서열에 상보적인 하기 일반식을 가진 적어도 하나의 라벨링된 핵산 서열을 혼입하고:
여기서 M은 루테늄, 오스뮴 또는 레늄이고 R1, R2, R3, R4, R5및 R6는 동일하거나 다르고 각각 H, 1-4 탄소원자의 알킬 또는 링커기이고, NA는 이의 3'말단에서 비피리딜기 중 하나에 또는 이의 3' 및 5' 말단에서 두개의 비피리딜기에 연결된 상기 핵산서열이고, n은 1 또는 2 이다;
(b) 폴리머라제 또는 다른 프라이머 유도 반응을 수행하고;
(c) 상기 라벨링된 증폭 생성물의 전기화학발광을 측정한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 많은 수의 3' 라벨링된 핵산 서열이 프라이머 유도 반응 내에 혼입된다.
[실시예]
[방법론(Methodology)]
응용 바이오시스템 380B DNA 합성기(Applied Biosystems 380B DNA synthesizer) 상에서 올리고뉴클레오티드를 합성하고 클론테크(Clontech)로부터 아미노 변형제를 사용하여 5' 또는 3' 아미노기로 관능화하였다(10). HIVI gag 유전자 PCR 분석에 대해 특이한 올리고뉴클레오티드는 SK 38 프라이머 (ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT) SK 39 프라이머 (TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC) 및 이전에 기술된 것과 같은 SK 19 프로브 (ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC)이다(6). tag-NHS를 사용하여 프로브 SK 19의 3' 및 5' 양쪽말단에 라벨링하였다. 낭포성 섬유 유전자의 경우, 올리고뉴클레오티드는 프라이밍을 위해 CFF(GACTTCACTTCTAATGATGA) 및 CFR(CTCTTCTAGTTGGCATGCT)이다. 프로브는 정상 세포에 대해 CFN2 (GAAACACCAAAGATGATATT)이고 508 삭제에 대해 CFD2 (AACACC-AATGATATTTTCTTT) 이다. 이들을 Ru(bpy)3 2+의 N-히드록시 숙신이미드 에스테르로 아미노기를 통해 3' 및 3'5'부위에서 라벨링하였다(8, 9, 11). 프라이머 SK 39 및 CFF는 각각 라벨링되지 않은 SK 38 및 CFR 을 가진 증폭 반응 내에서 5' 바이오틴화된 프라이머이다. 비-특이 올리고뉴클레오티드 람다 1(GAAASTGTGCTGACCGGACATGAAAATGAG)도 또한 합성하고 바탕 시그널에 대한 조절로서 사용되기 위해 3'-말단에서 라벨링하였다. 올리고뉴클레오티드는 0.3m NaCl 내 Biogel P6 컬럼 크로마토그래피에 의한 라벨링을 위해 제조되고 제외된 올리고뉴클레오티드 피크의 침전이 따른다. 전형적으로, 0.1 μ몰의 올리고뉴클레오티드는 pH 7.4, 80% 디메틸 설폭시드/오스페이트 완충 염수 내에서 0.5 μ몰의 ORIGEN 라벨과 반응한다. 올리고뉴클레오티드의 바이오틴화는, 라벨링을 위해 50% 디메틸 설폭시드 내 바이오틴 X-NHS(Clontech)를 사용하는 것을 제외하곤 본질적으로 상기와 같이 수행된다. 라벨링된 올리고뉴클레오티드는 에탄올로 침전되고 혼입되지 않은 라벨을 제거하기 위해 세척된다. 시스템의 특이성을 시험하기 위해 사용된 합성 낭포성 섬유 서열은 하기와 같다. 정상 서열, CF 정상; GACTTCACTTCTAATGATGATAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAA-TATAGATACAGAAGCGAGCATGCCAACTAGAAGAG; 및 돌연변이 서열 CF D508; GACTTCACTTCTAATGATGATAAAGAAA ATATCATTG-GTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGAGCATGCCAACTAGAAGAG.
HIV1 gag 유전자에 대한 PCR은 75ng(7.5pmol)의 바이오틴화된 SK39 및 75ng(7.5pmol)의 SK38 및 1.25ng의 SKl9를 함유하는 25㎕ 반응 부피를 사용하여 본질적으로 (6)에 서술된 바와 같이 수행된다. 펄킨 엘머 써모사이클러(Perkin Elmer Thermocycler) 상에서 사용되는 열주기는 하기와 같다; 95℃ 1분, 60℃ 1분, 회전수는 40이다. 이는 60℃ 30분 주기가 뒤따른다.
낭포성 섬유 유전자 또는 합성 유전자를 위한 폴리머라제 연쇄 반응은 75ng(7.5pmol)의 CFR 및 75ng(7.5pmol)의 바이오틴화된 CFF 및 3' 또는 3'5'말단에서 라벨링된 5ng의 CFN2 또는 CFD2를 함유하는 25㎕ 반응 부피를 사용하여 본질적으로 (7)에 서술된 바와 같이 수행한다. 낭포성 섬유 분석을 위한 주기 조건은 94℃ 1분, 55℃ 2분, 72℃ 2분의 30 주기이다. 이는 98℃ 5분, 65℃ 30분의 주기가 뒤따른다. 합성 유전자는 단일 복제 유전자에 대한 정상적인 인간 DNA내 농도, 즉 DNA ㎕ 당 3×105를 모사한 농도에서 사용됐다. 연어 정자 DNA는 이들 합성 유전자 증폭 반응에서 비특이 DNA로서 사용되었다.
PCR/혼성 주기 후에, ECL 분석기 상의 240 ㎕ ECL 분석 완충용액 내 15㎕ 의 2.8㎛ 스트렙타비딘으로 피복된 자기 비드(Dynal, Great Neck, N. Y.)를 2㎕ 샘플에 첨가하고 15분 동안 항온 처리하고, ECL 분석하였다. 낭포성 섬유 분석의 경우에는, 30% 포름아미드/오리진(ORIGEN) 분석 완충용액 240㎕ 를 샘플에 첨가하였다.
[실시예 1]
[빠른 일 단계 분석에 대한 분석 포맷]
바이오틴화된 프라이머 및 라벨링되지 않은 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 진행하였다. PCR 열주기는 정상적으로 40주기 동안 진행된다. 열주기 말렵에 혼성을 위해 연장된 항온처리를 하였다. 그리고나서, 마지막 항온 처리 주기 말렵에 샘플을 비드에 결합시키기 위해 준비하고, 샘플을 취하여 ECL 분석기상에서 상온에서 결합을 위해 비드에 첨가하였다(15분). 그리고나서, 전기화학발광을 분석하였다. 분석 포맷은 제1도에 도시되어 있다.
[실시예 2]
[HIV1 gag에 대한 분석, 빠른 일 단계 분석]
SK19 3'5' 라벨링된 프로브를 포함하는 HIV1 gag 특이 프라이머로 35주기 동안 PCR을 진행하였다. 양성 HIV1 DNA 샘플은 펄킨 엘머 세튜스킷트(Perkin Elmer Cetus Kit)에서 제공되는 표준의 희석물이었다. PCR 샘플 2㎕을 스트렙타비딘 비드에 첨가하고 15분 동안 진탕시키면서 항온처리한 후 ECL 분석기를 사용하여 전기화학 발광을 분석하였다.
결과는 제2도에 도시되어 있다. 제2도는 HIV1 gag 유전자의 빠른 분석을 위한 단순화된 PCR 분석을 나타낸다. 이 능력은 부분적으로 ECL 시스템 및 ECL-기재 분석 포맷에 기인한다. 본 ECL 시스템은 구체적으로 (i) PCR의 가혹한 처리에 버틸 수 있는 안정한 라벨, (ii) ECL의 특성 때문에 외부세척에 대한 필요가 제거되는 분석 양식 (iii) 방사성에 뒤지지 않는 분석물의 검출에 대한 민감도를 제공한다.
HIV1 gag 연구에 대한 결과는, 거의 노력 없이도 복사수의 검출이 12.5 복사까지 내려감을 나타내었다. 빠른 스크리닝 시스템에 대한 이 방법론의 유용성은 분명하며 개선된 열 주기 성능과 함께, 보다 낮은 복사수의 검출을 허용케한다.
[실시예 3]
[낭포성 섬유 유전자에 대한 분석, 빠른 일 단계 분석]
본 발명의 분석은 낭포성 섬유 유전자내 508 코돈(codon) 삭제에 대한 경우처럼 정상 유전자와 비교하여 거의 돌연변이체가 없는 유전자를 판별하기 위해 사용된다. 분석은 정상적인 피험자의 태반 세포주로부터의 인간 DNA와 합성 유전자를 사용하여 시험되었다.
3'5'라벨링된 CFN2를 포함하는 낭포성 섬유 특이 프라이머로 30 주기 동안 PCR을 진행했다. DNA 샘플은 인간 세포주(헬라(HeLa), 8)로부터 단리된 DNA의 희석물이었다. PCR 샘플 2㎕를 스트렙타비딘 비드에 첨가하고 15분간 진탕시키면서 항온처리한 후 ECL 분석기를 사용하여 전기화학발광에 대해 분석하였다.
분석 결과는 제3도에 도시되어 있다. 낭포성 섬유 유전자에 대한 분석의 성공 및 기대했던대로 1ng 이하의 인간 DNA내 유전자의 검출이 가능하도록 하는 시스템의 민감도가 증명된다.
[실시예 4]
[그 특이성을 증명하는 합성 낭포성 섬유 유전자에 대한 분석]
낭포성 섬유 유전자에 대한 본 발명의 특이성을 조사하기 위해 각각 정상 유전자 서열 및 508 삭제를 포함하는 돌연변이체 유전자 서열을 포함하는 두 합성 서열을 생성하였다. 이들 유전자 표본을, 증폭되어야 할 낭포성 섬유 서열의 특성에 관해서 의심없이 혼성 반응의 특이성을 결정하기 위해 인간 DNA에서 밝혀진 농도로 희석하였다.
3' 라벨링된 프로브 CFN2 및 CFD2를 포함하는 낭포성 섬유 특이 프라이머로 30 주기 동안 PCR을 진행하였다. DNA 샘플은 연어 정자 DNA로 만들어지는 합성 DNA의 희석물이었다. PCR 샘플 2㎕를 15㎍의 스트렙타비딘 비드에 첨가하고 15분 동안 진탕시키면서 항온처리한 후 ECL 분석기를 사용하여 전기화학 발광에 대해 분석했다.
제4도에 도시된 결과는 정상 또는 돌연변이 유전자를 특이적으로 검출하는 분석 활성을 보인다. 이 빠른 분석 포맷은 재빠른 검출과 밀접히 상관된 서열의 구별을 가능케한다.
[실시예 5]
[정상 인간 샘플내 낭포성 섬유 유전자에 대한 분석]
3'5' 라벨링된 프로브 CFN2 및 CFD2를 포함하는 낭포성 섬유 특이 프라이머로 30주기 동안 PCR을 진행했다. DNA 샘플은 개인 융모막(Sigma Ltd)로부터 단리된 인간 DNA의 개인 샘플이다. PCR 샘플 2㎕를 15ng의 스트렙타비딘 비드에 첨가하고 15분 동안 진탕시키면서 항온처리한 후 ECL 분석기를 사용하여 전기화학발광에 대해 분석했다.
[실시예 6]
[노오쓰 캐롤라이나(North Carolina) 대학으로부터의 인간 샘플내 낭포성 섬유 유전자에 대한 분석]
실시예 6 으로부터의 자료는 노오쓰 캐롤라이나로부터의 인간 DNA 샘플 한 세트를 분석함으로써 확증되었는데, 여기에서 각 샘플이 이전 방법(7)과 비교하여 본 발명의 방법을 사용하여 정확하게 분석되었다. 자료는 변덕스러운 PCR 및 샘플 DNA 농도 다양성에 기인하여 넓은 범위의 시그널을 보이나, 바탕의 일관성에 의해 CFN2 프로브로 얻은 시그널에 의한 정상 유전자의 존재 및 CFD2 프로브로의 돌연변이체 유전자의 존재를 기록할 수 있다. 이들 연구에서 샘플 15는 가장 낮은 시그널을 제공하나 여전히 상당하게 비-특이 프로브 시그널보다 위이다. 자료는 제6도에 도시되어 있다.
3' 라벨링된 프로브 CFN2, CFD2 및 비 특이 프로브(람다1)을 포함하는 낭포성 섬유 특이 프라이머로 30 주기 동안 PCR을 진행하였다. DNA 샘플은 0.5 내지 2.5㎍/㎕의 인간 DNA의 개인 샘플이었고, 이들 각각의 1㎕ 는 PCR에서 사용되었다. PCR 샘플 2㎕을 15㎍의 스트렙타비딘에 첨가하고 15분 동안 진탕시키면서 항온처리한 후 ECL분석기를 사용하여 전기화학발광에 대해 분석했다.

Claims (5)

  1. 하기 단계로 구성되는, 폴리머라제 연쇄반응 또는 다른 프라이머 유도 반응의 증폭 생성물에서 관심있는 핵산 서열을 검출하는 방법: (a) 폴리머라제 연쇄 반응 혼합물 또는 다른 프라이머 유도 반응 혼합물 내로 (i) 3' 말단에서 또는 (ii) 3' 및 5' 말단에서 전기화학 발광할 수 있는 화합물로 라벨링된, 관심있는 핵산 서열에 상보적인 하나 이상의 핵산 서열을 혼입하고, (b) 폴리머라제 연쇄 반응 또는 다른 프라이머 유도 반응을 수행한 다음; (c) 라벨링된 증폭 생성물의 전기화학 발광을 측정한다.
  2. 제1항에 있어서, 다수의 3' 라벨링된 핵산 서열이 프라이머 유도 반응 내에 혼입되는 방법.
  3. 하기 단계로 구성되는, 폴리머라제 연쇄 반응 또는 다른 프라이머 유도 반응의 증폭 생성물에서 관심있는 핵산 서열을 검출하는 방법: (a) 폴리머라제 연쇄 반응 혼합물 또는 다른 프라이머 유도 반응 혼합물 내로 (i) 3' 말단에서 또는 (ii) 3' 및 5' 말단에서 하기식의 전기 화학-발광할 수 있는 화합물로 라벨링된, 관심있는 핵산 서열에 상보적인 하나 이상의 핵산 서열을 혼입하고:
    (여기서 M은 Ru, Os 및 Re 으로 구성되는 군으로부터 선택되고, L1, L2및 L3는 동일하거나 다르며 각각은
    이며, 여기서 R1및 R2는 동일하거나 다르며 각각은 H, 1-4개 탄소원자의 알킬기 또는 상기 핵산에 대한 링커이다); (b) 폴리머라제 연쇄 반응 또는 다른 프라이머 유도 반응을 수행한 다음; (c) 라벨링된 증폭 생성물의 전기화학발광을 측정한다.
  4. 하기 단계로 구성되는 폴리머라제 연쇄 반응 또는 다른 프라이머 유도 반응의 증폭 생성물에서 관심있는 핵산 서열을 검출하는 방법: (a) 폴리머라제 연쇄 반응 혼합물 또는 다른 프라이머 유도 반응 혼합물 내로 (i) 3' 말단에서 또는 (ii) 3' 및 5' 말단에서 전기화학 발광할 수 있는 화합물로 라벨링된, 관심있는 핵산 서열에 상보적인 하나 이상의 핵산 서열을 혼입하고; (b) 폴리머라제 연쇄 반응 또는 다른 프라이머 유도 반응을 수행하고; (C) 라벨링된 증폭 생성물을 농축 및 세척한 다음; (d) 라벨링된 증폭 생성물의 전기화학발광을 측정한다.
  5. 하기 단계로 구성되는, 프라이머 유도 반응의 증폭 생성물에서 관심있는 핵산 서열을 검출하는 방법: (a) 프라이머 유도 반응 혼합물 내로, 3' 말단에서 라벨링된 화합물로 라벨링된, 관심있는 핵산 서열에 상보적인 하나 이상의 핵산 서열을 혼입하고; (b) 프라이머 유도 반응을 수행한 다음; (c) 라벨링된 증폭 생성물을 측정한다.
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