KR0168038B1 - 증진된 식물내 발현을 위한 합성 B.t. 유전자의 제조방법 및 그 유전자 - Google Patents

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증진된 식물내 발현을 위한 합성 B.t. 유전자의 제조방법 및 그 유전자

제1a, 1b 및 1c도는 합성 Btt 유전자의 누클레오티드 서열이다. 다른 경우로, p544Pst-Met5에서 발견되는 천연 서열은 그 위에 표시되어 있다. 합성 서열은 잔기 2의 트레오닌을 알라닌으로 치환하고 잔기 596의 종결부위를 로이신으로 치환한 다음 C-말단에 13개의 아미노산을 첨가하여(밑줄로 나타냄) 아미노산을 변경시킨 것이다.

제2도는 합성 Btt 유전자의 구성과정을 도시한 개략도이다. A 내지 M까지의 분절은 DNA 분절들을 특이 효소적으로 조합시켜 원하는 유전자를 제공하도록 하는 독특한 접합 부위를 갖는 DNA 이중체를 형성하기 위해 서로 아닐링시키고 결합시킨 올리고누클레오티드 단편을 나타낸다.

제3a 및 3b도는 합성 Btt 유전자의 구성에서 올리고누클레오티드 분절의 조합과정을 도시한 개략도이다. 각 분절(A 내지 M)은 다른 크기의 누클레오티드로 되어 있으며 원하는 DNA 분절을 형성하기 위해 아닐링시키고 결합시킨다.

[본 발명의 분야]

본 발명은 박테리아 분자 생물학 분야에 관한 것이며, 특히 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 재조합 기술에 의한 유전공학에 관한 것이다. 본원은 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 변이체 테네브리오니스(tenebrionis)(Btt)에서 수득한 변이된 결정 단백질 유전자의 화학합성 및 이 합성 살충 유전자의 선택 발현에 관하여 기술하고 있다. 또한 클로닝시킨 합성 유전자를 숙주 미생물내로 전이시켜서 이 미생물이 증진된 발현 수준으로 곤충에 독성을 갖는 단백질을 생성할 수 있음도 기술하고 있다. 본 발명은 농업 경영학적으로 가치가 있는 바람직한 발현수준의 새로운 독소를 수득할 수 있는 박테리아 및 식물의 유전공학을 용이하게 한다.

[본 발명의 배경]

비 투린지엔시스(Bt)는 포자형성 과정 동안 농업에 중요한, 여러 해충에 매우 유독하다고 밝혀진 단백질성의 결정성 함유물을 생성해내는 능력이 있어 독특하다. 다른 Bt 균주의 결정 단백질은 비교적 숙주 범위가 좁아서 매우 선택적인 생물학적 살충제로서 상업적으로 사용된다. Bt의 여러가지 균주는 인시류 및 쌍시류에 유독하다. 최근 Bt 의 두 아종(또는 변이체)의 갑충류에 병원성이라고 발표되었다. 두 아종은 변이체 테네브리오니스(tenebrionis){krieg 등의 (1983) Z. Angew. Entomol. 96:500-508 참조} 및 변이체 산 디에고(san diego){Herrnstadt 등의 (1986) Biotechnol. 4:305-308 참조}이다.

두 균주 모두는 평평하고 직사각형인 결정 함유물을 생성하며 64-68 kDa의 주요 결정 성분을 가진다{Herrnstadt 등의. 상기 문헌 참조; Bernhard의 (1986) FEMS Microbiol. Lett. 33:262-265 참조}.

Bt의 여러가지 아종에서 수득한 독소 유전자를 클로닝시켜 이 재조합 클론이 인시류 및 쌍시류 유충에 유독하다는 것을 발견하였다. 또하 인시류에 활성인 두 독소 유전자를 분리하여 발현시켰다. Hernnstadt 등(상기 문헌 참조)은 Bt 변이체 산 디에고 DNA의 5.8kb의 BamHI 단편을 클로닝시켰다.

E. Coli에서 발현되는 단백질은 피. 루테올라(P. luteola)(느릅나무잎 딱정벌레)에 유독하며 약 83kDa의 분자량을 가진다. 변이체 산 디에고 유전자에서 수득한 이 83kDa의 독소 생성물은 Bt 변이체 산 디에고 세포에서 분리한 64kDa의 결정 단백질 보다 크다. 이는 Bt 변이체 산 디에고 결정 단백질이 결정으로 형성되기 전에 E. Coli에 의해서가 아니라 Bt 변이체 산 디에고에 의해 생성되는 보다 큰 전구분자로 합성될 수 있다는 것을 제시해 준다.

1987년 10월 13일자 제출한 미국 특허 출원 제108,285호{Sekar 등의 (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:7036-7040 참조}는 Btt에서 결정 단백질 유전자를 분리하고 누클레오티드 서열을 결정하는 것에 관해 기술하고 있다. 이 결정 단백질 유전자는 5.9kb의 BamHI 단편(pNSBF544)에 포함되어 있다. pNSBF544로부터 3kb의 HindIII를 포함하는 서브클론을 구성하였다. 이 HindIII 단편은 약 73kDa의 644개의 아미노산 폴리펩티드를 암호하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 이 두 서브클론의 추출물은 콜로라도 감자 딱정벌레[레프티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata), 갑충류]의 유충에 독성을 나타냈다. 변이체 테네브리오니스의 결정 단백질에 대한 항 혈청과 교차반응하는 73kDa 및 65kDa의 펩티드를 E. Coli에서 발현시켜 생성하였다. 포자형성 변이체 테네브리오니스 세포는 pNSBP544의 ORF로부터의 예측 생성물과 상응하는 73kDa의 면역반응성 펩티드를 포함한다. 그러나, 일차로 분리한 결정체는 65kDa의 성분을 포함한다. 결정 단백질 유전자를 N-말단 부위에서 단축시킬 때, 가장 많이 수득된 단백질은 65kDa 펩티드였다. 삭제 유도체, p544Pst-Met5는 5.9kb의 BamHI 단편의 N-말단에서부터 46개의 아미노산 잔기를 제거하여 효소적으로 유도하였다. N-말단을 삭제한 유도체, p544Pst-Met5를 발현시키면 거의 독점적으로 65kDa의 단백질이 생성되었다. 최근, McPherson 등의 (1988) Biotechnology 6:62-66 문헌은 Btt 유전자가 동일한 리딩 프레임내에 완전한 길이의 단백질과 N-말단 절두형 모두를 생성하는 두가지 기능의 번역 개시 코돈을 포함한다는 것을 설명하고 있다.

Bt의 여러가지 균주로부터 수득한 키메라(chimera) 독소 유전자를 식물에서 발현시켰다. 아그로박테리움(Agrobacterium) TR-DNA의 2' 프로모터의 조절하에서 변이체 베를리네르(berliner) 1715로부터 수득한 4개의 변이 Bt2 유전자를 담배 식물내로 전이시켰다{Vaeck 등의 (1987) Nature 328:33-37 참조}. 절두 유전자를 형질전환(transgenic) 식물에서 발현시켰을 때 살충제 수준의 독소가 생성되었다. 그러나, 형질전환 식물내의 정상상태 mRNA 수준이 너무 낮아서 노던 블롯 분석법으로 확실히 검출할 수 없으므로 리보누클레아제 보호 실험을 이용하여 정량분석하였다. 식물내에서 가장 높은 수준의 단백질을 생성하는 Bt mRNA 수준은 폴리(A)⁺mRNA의 약 0.0001%에 상응하였다.

Vaeck 등의 (1987) 상기 문헌의 보고서에서는 Bt2의 완전한 암호 서열을 포함하는 키메라 유전자의 발현을 절두된 Bt2 유전자를 포함하는 발현과 비교하였다. 부가적으로, 몇몇 T-DNA 구성물이 식물에서 선택가능한 표식물로서 키메라 NPTII 유전자를 함유하는 반면, 다른 구성물은 Bt2와 NPTII 유전자의 단편 사이에 번역 융합을 가져왔다. 절두된 Bt2 유전자나 융합 구성물을 형질전환 식물에서 발현시키면 살충제 수준의 독소가 생성되었다. 온실에서 성장한 식물은 독소로서 전체 가용성 단백질의 약 0.02%, 또는 신선한 잎 조직의 g당 3㎍의 독소를 생성하였고 5배 더 낮은 수준에서도 6일간의 영양검사 이내에 100% 소멸되었다. 그러나, 발현을 지시하기 위해 동일한 프로모터를 사용했다는 사실에도 불구하고, 자연 그대로의 Bt2 암호화 서열을 사용하여서는 상당한 살충작용을 수득할 수 없다. 형질전환 식물 잎에서 자연 그대로의 Bt2 단백질과 RNA 수득량은 절두된 Bt2 폴리펩티드나 융합 단백질의 수득량 보다 10 내지 50배나 낮았다.

Barton 등의 (1987) Plant Physiol. 85:1103-1109 문헌은 35S 프로모터, 비루스(TMV) 리더 서열, Bt HD-1 4.5kb 유전자(645개의 아미노산 단백질 다음에 두 개의 프롤린 잔기를 암호함) 및 노팔린 신타아제(nos) 폴리(A)⁺서열을 포함하는 계에서의 Bt 단백질의 발현에 관해 설명하고 있다. 이러한 조건하에서 47pg/20㎍ RNA 및 12ng/mg 식물 단백질까지의 수준으로 Bt mRNA가 발현됨을 관찰하였다. 식물 조직에서 Bt 단백질의 이와 같은 양은 이틀 내에 100% 소멸되었다. 이러한 수준의 발현은 아직 낮은 수준의 mRNA(2.5×10^-4%) 및 단백질(1.2×10^-3%)을 나타냈다.

NPTII에 융합된, Bt2 단백질의 길이가 길어진 N-말단 단편을 포함하는 여러가지 혼성 단백질을 Hofte 등의(1988) FEBS Lett. 226:364-370 문헌에 의해 E. Coli에서 생성하였다. Bt2의 첫번째 607개의 아미노산을 포함하는 융합 단백질은 살충성을 보인 반면 이 최소한의 N-말단 단편을 포함하지 않는 융합 단백질은 독성을 지니지 않았다. NPTII 활성도의 양상은 살충작용에 영향을 미치지 않지만 Bt2 폴리펩티드의 입체형태는 융합된 NPTII 단백질의 효소·활성도에 중요한 영향을 미친다고 생각되었다. 이 연구는 Bt2 폴리펩티드의 구형 3차 구조가 절두된 폴리펩티드에서는 방해된다는 것을 제안하였다.

수많은 연구들을 통해 효모{Neill 등의 (1987) Gene 55:303-317; Rothstein 등의 (1987) Gene 55:353-356; Coraggio 등의 (1986) EMBO J. 5:459-465참조} 및 E. coli{Fuzakawa 등의 (1987) FEBS Lett. 224; 125-127; Vies 등의 (1986) EMBO J. 5; 2439-2444; Gatenby 등의 (1987) Eur. J. Biochem. 168; 277-231 참조}에서 식물 유전자를 발현시키고자 시도하였다. 효모의 경우는 밀의 α-글리아딘 {Neill 등의 (1987) 상기 문헌 참조}, α-아밀라제 {Rothstein 등의 (1987) 상기 문헌 참조} 유전자 및 옥수수 제인 유전자 {Coraggio 등의 (1986) 상기 문헌 참조}가 낮은 수준으로 발현된다고 알려졌다. Neil 등은 효모에서 α-글리아딘이 낮은 수준으로 발현되는 것은 Phe, Leu, Ser, Gly, Tyr 및 특히 Glu에 대한 α-글리아딘 코돈이 풍부한 효모 이소악셉터(isoacceptor) tRNA와 잘 상관되지 않으므로, 코돈 사용의 편향에 기인할지도 모름을 제안하였다. 그러나, E. Coli 에서는 콩의 글리시닌 A2{Fuzakawa 등의 (1987) 상기 문헌 참조}와 밀의 RuBPC SSU{Vics 등의 (1986) 상기 문헌; Gatenby 등의 (1987) 상기 문헌 참조}가 적당히 발현된다.

식물의 tRNA 집단의 구성에 대해서는 잘 알려진 것이 많지 않다.

Viotti 등의 (1978) Biochim. Biophys. Acta 517: 125-132 문헌은 옥수수의 내배젖을 활발히 합성하는 제인, 글루타민, 로이신 및 알라닌이 풍부한 저장 단백질이 옥수수 배아의 tRNA 보다 이들 세 개의 아미노산에 대한 수용 활성도가 더 높은 수준임을 특징으로 한다는 것을 보고하였다. 이는 특히 식물 조직의 tRNA 집단을 제인과 같은 높은 수준으로 발현되는 단백질을 최적으로 번역하기 위해 순응시킬 수 있음을 나타낸다. 공지된 바로는, 발현수준에 대한 영향을 조사할 식물에서 단백질 번역의 가능한 효과를 결정하는, 높은 수준으로 발현되는 식물 유전자내 암호 편향을 아무도 실험적으로 변경시키지 못했다.

[본 발명의 요약]

본 발명의 일반적인 목적은 병충해에 대한 식물 보호 방법을 제공하는 것이다. 본원에서 기술한 발명은 천연 Bt 유전자 보다 높은 수준으로 식물내 발현되도록 합성 Bt 유전자를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 생산된 합성 Bt 유전자에 관한 것이다.

이 합성 유전자는 Bt의 천연 살충 단백질과 기능적으로 동등한 살충 단백질을 암호한다. 식물에서 높은 수준으로 발현되도록 본원에서 규정한 바와 같이 합성 유전자를 고안하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 합성 유전자는 Bt의 살충 유전자와 적어도 약 85%가 상동이다.

본 발명의 특별한 목적은, 예를 들어 제1a, 1b 및 1c도에 나타난 바와 같이 기능적으로 동등한 1 내지 1792까지의 누클레오티드 서열 또는 1 내지 1833까지의 누클레오티드 서열을 갖는, Btt로부터의 살충 단백질을 암호하는 합성 구조 유전자 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

식물에서의 발현을 증진시키기 위한 본 발명의 합성 Btt 유전자의 고안에 있어서, 높은 수준으로 발현되는 식물 유전자의 선호 코돈을 함유하고, 식물에서 실제로 발견되는 누클레오티드 염기 조성에서의 A+T 함량을 획득하고, 또한 바람직하게 식물의 개시 서열을 형성하고, 불안정화, 부적합한 폴리아데닐화, RNA의 분해 및 종결을 야기시키는 서열을 제거하며 이차 구조 헤어핀과 RNA 접합부위를 구성하는 서열을 기피하도록 천연 Btt 구조 유전자의 RNA 서열을 변형시킨다. 합성 유전자에 있어 주어진 아미노산을 지정하기 위해 사용하는 코돈은, 높은 수준으로 발현된 식물 유전자에서 아미노산을 지정하기 위해 사용되는 코돈 사용 분포 빈도와 관련하여 선택한다. 본 분야의 기술자들이 평가한 바와 같이 합성 유전자에 사용하는 코돈 사용 분포 빈도가 발현 수준을 결정한다.

따라서, 합성 유전자의 코돈 사용 분포 빈도가, 높은 수준으로 발현된 식물 유전자의 코돈 사용 분포 빈도의 25% 이상 초과되지 않음이 바람직하며, 약 10%이상 초과되지 않음이 더욱 바람직하도록 합성 유전자를 고안하였다. 또한, 세번째 동의성 염기의 G+C 함량 백분율도 고려한다(단자엽 식물강은 이 위치에서 G+C를 선호하는 반면 쌍자엽 식물강은 그렇지 않다). 또한 XCG 누클레오티드가 적어도 쌍자엽 식물에서는 선호 코돈인 반면 XTA 코돈은 단자엽 및 쌍자엽 식물 모두에서 기피됨이 알려졌다. 또한 본 발명의 합성 유전자는 바람직하게 본 발명의 상세한 설명에서 정의한 바와 같은 선택 숙주 식물의 CG 및 TA 이중자 기피 지수(doublet avoidance index)와 아주 비슷한 CG 및 TA 이중자 기피 지수를 갖는다. 이들 지수가 숙주의 지수에서 약 10-15% 이상 초과되지 않음이 더욱 바람직하다.

본 발명 Bt 유전자의 조합은 본 분야에서 공지된 표준 기술을 사용하여 수행한다. 특이 형태의 식물에서 발현이 증진되도록 고안한 Btt 구조 유전자는 화학적으로 합성시킨 올리고누클레오티드 이중 분절로부터 DNA 벡터내에 효소적으로 조합시킨다. 그리고 나서 합성 Bt 유전자를 식물 숙주 세포내로 도입시키고 본 기술분야에서 공지된 방법으로 발현시킨다. 식물내 합성 Bt 유전자의 발현으로 생성된 살충 단백질은 동일한 곤충에 독성을 지니는 면에 있어서 천연 Bt 결정 단백질과 동일한 기능을 갖는다.

다음의 정의는 본 명세서 및 특허청구의 범위에서 다음의 용어를 사용한 의도 및 범위를 하기 위해 규정한 것이다.

발현은 암호된 단백질을 생성하기 위한 구조 유전자의 전사 및 번역을 말한다. 본 발명의 합성 Bt 유전자는 상응 천연 Bt 유전자 보다 식물에서 더 높은 수준으로 발현되도록 고안한 것이다.

본 분야의 숙련자들에 의해 평가된 바와 같이, 구조 유전자의 발현 수준은 사용한 조절 DNA 서열(프로모터, 폴리아데닐화 부위, 인헨서 등) 및 구조 유전자를 발현시키는 숙주 세포에 의해 영향을 받는다. 합성 Bt 유전자의 발현과 천연 Bt 유전자의 발현은 동일한 숙주 세포내 유사 조절 서열을 사용하여 비교한다. 또한 그와 같은 비교에 유전자 발현을 평가할 유사한 방법을 사용하는 것은 자명한 일이다.

프로모터는 전사의 개시를 지시하는 구조 유전자의 5' 말단에 있는 누클레오티드 서열을 말한다. 프로모터는 그 하류 유전자를 발현시키기 위해 항상 충분한 것은 아니지만 필요하다. 원핵 세포에서 프로모터는 RNA 폴리머라제와 다른 개시 및 활성 인자에 결합부위를 제공하여 전사시킨다. 비록 유전자가 프로모터의 상류에 위치할 때는 프로모터의 활성도가 발현 수준을 낮춘다고 알려져 있지만, 일반적으로 프로모터 서열이 전사 수준을 조절한다. 따라서 이종 프로모터/구조 유전자 결합체의 구성에 있어서, 유전자의 발현이 프로모터 서열에 의해 조절되도록 프로모터의 조절하에 구조 유전자를 위치시킨다. 프로모터는 구조 유전자의 상류에 위치시킴이 바람직하되 프로모터와 유전자 사이의 거리에 가까운 전사 시작 부위에서 좀 떨어지게 위치시킨다. 이 거리는 자연상태 이내에서 조절한다. 본 분야에 공지된 바와 같이, 프로모터의 기능이 손실되지 않도록 이 거리를 약간 변경시킬 수 있다.

유전자는 단백질 합성에 관련된 완전한 DNA 부분을 말한다. 유전자는 5' 말단의 번역 시작 코돈(일반적으로 ATG)으로부터 시작하여 3' 말단의 정지 코돈(TAG, TGA 또는 TAA)까지 연장되는 구조 부분이나 암호부분을 포함한다. 또한 유전자는 일반적으로 구조 유전자의 5'이나 상류에 위치한 프로모터 부위를 포함하는데, 이 프로모터가 구조 유전자의 발현을 개시하고 조절한다. 또한 3' 말단 및 폴리 (A)⁺부가 서열도 이 유전자에 포함된다.

구조 유전자는 단백질, 폴리펩티드 또는 그 부분을 암호하는 DNA 분절을 포함하고, 전사를 개시하는 5' 서열을 제외한 유전자 부분을 말한다. 구조 유전자는 세포내에서 전형적으로 발견되지만 그 세포위치에서 전형적으로 발견되지 않는 경우 그것을 이종 유전자라 한다. 이종 유전자는 본 분야에서 공지된 모든 기원으로부터 전체 또는 부분을 유도할 수 있으며, 이는 박테리아 게놈이나 에피좀, 친핵, 핵 또는 플라스미드 DNA, cDNA, 비루스성 DNA 또는 화학적으로 합성한 DNA를 포함한다. 구조 유전자는 암호화 부위 또는 생물학적 활성도나 발현 생성물의 화학 구조, 발현속도나 발현조절 방법에 영향을 미칠 수 있는 비번역부위 중 하나에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 그러한 변형은 하나 이상의 누클레오티드의 돌연변이, 삽입, 삭제 및 치환을 포함하나 여기에 제한되는 것은 아니다. 구조 유전자는 단절되지 않은 암호화 서열로 구성될 수 있거나 적당한 접합부로 경계된 하나 이상의 인트론을 함유할 수 있다. 구조 유전자는 자연 발생적이거나 합성된 대다수의 기원에서 유도한 분절로 구성할 수 있다. 또한 구조 유전자는 융합 단백질을 암호화 할 수도 있다.

합성 유전자는 구조 유전자의 전체 또는 보다 큰 부분의 암호화 부위를 화학적으로 합성한 구조 유전자의 DNA 서열을 말한다. 본원에서 예시한 바와 같이 올리고누클레오티드 구성 블록을 본 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 합성하고, 이어서 효소적으로 조합시켜 완전한 유전자를 구성하는 유전자 분절을 형성시키기 위해 결합시키고 아닐링시킨다. 본 분야의 숙련자에게 공지된 바와 같이, 본 명세서에서 기술한 합성 유전자와 기능적으로, 구조적으로 동등한 유전자를 본 분야에서 사용한 부위 특이 돌연변이나 다른 관련된 방법으로 제조할 수 있다.

형질전환은 기능 유전자를 운반하는 DNA 분절을 아직 그 유전자를 포함하지 않은 미생물내로 안정하게 도입시키는 것을 말한다.

식물 조직은 식물의 분화 조직 및 미분화 조직 즉, 뿌리, 어린싹, 잎, 꽃가루, 씨, 종양조직 및 단일 세포, 원형질체, 배아와 유합조직(callus tissue)과 같은 배지 내의 여러가지 형태의 세포를 포함하나 여기에 제한되는 것은 아니다. 식물 조직은 다리끝 안(in planta)이나 기관 내의, 조직 또는 세포 배양물일 수 있다.

본원에서 사용한 식물 세포는 다리끝 안에 있는 식물 세포 및 배지 내의 식물 세포와 원형질체를 포함한다.

상동성은 누클레오티드나 아미노산 서열과 동등하거나 거의 동일한 것을 말한다. 본 분야에 알려진 바와 같이, 최종 폴리펩티드 서열에서 아미노산 치환이 야기되지 않고 코돈의 세번째 염기나 동요염기에 누클레오티드가 잘못 대응될 수 있다. 또한, 유전자 서열의 특정 부위에서 보다 작은 누클레오티드 변형(예로, 치환, 삽입 또는 삭제)은 그러한 변형이 결과적으로 최종 생성물의 기능성을 변경시키지 않는 아미노산 서열의 변화를 초래할 경우는 언제든지 용인되고 중요하지 않게 여길 수 있다. 유전자 서열의 전체 또는 부분을 화학적으로 합성한 복제본을 유전자 기능의 손실없이 천연 유전자의 상응 부위와 대체시킬 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 본 분야에서 공지된 엄격한(stringent) 조건 하에서 핵산의 교차 혼성화 시험을 이용하여 특이 DNA 서열의 상동체를 확인할 수 있다{Hames 및 Higgens (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press. Oxford, Uk 참조}. 상동성의 정도는 종종 비교 서열간의 동일성 백분율로 측정한다.

기능적으로 동등하다는 것은 기능이 동일하거나 거의 동일함을 말한다.

천연 Bt 단백질과 같이 곤충 종류 중의 적어도 하나에 유독한 합성 유전자 생성물은 천연 Bt 단백질과 기능적으로 동등하다고 여겨진다.

본원에서 예시한 바와 같이, 천연 Btt 유전자와 합성 Btt 유전자 모두는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며 갑충류에 독성을 지닌 65 kDa의 살충 단백질을 암호한다. 본 발명의 합성 Bt 유전자는 천연 Bt 유전자와 기능적으로 동등하지 않다고 여겨지는데, 이것은 그 유전자가 식물에서 천연 Bt 유전자 보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있기 때문이다.

선호 코돈 사용 빈도는 주어진 아미노산을 지정하는 누클레오티드 코돈 사용시 특이 숙주 세포에서 나타나는 선호성을 말한다.

유전자에서 특정 코돈의 사용 빈도를 결정하기 위해 유전자 내 그 코돈의 발생수를 동일한 아미노산을 지정하는 유전자 내 모든 코돈의 전체 발생수로 나눈다. 예를 들어, 표 1은 Bt 유전자의 코돈 사용 빈도를 나타낸 것인데, 이것은 그 서열을 공공연히 사용할 수 있는 4개의 Bt 유전자를 분석하여 획득하였다. 유사하게, 숙주 세포에서 나타난 선호 코돈 사용 빈도는 숙주 세포에서 발현된 다수의 유전자 내 선호 코돈 사용 빈도를 평균하여 계산할 수 있다. 이 분석은 숙주 세포에 의해 높은 수준으로 발현되는 유전자로 제한하는 것이 바람직하다. 예로, 표 1은 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물에 의해 나타난 높은 수준으로 발현되는 유전자의 코돈 사용 빈도를 나타낸 것이다. 쌍자엽 식물의 코돈 사용은 표 1에 제시한 유전자 은행(Genback)에서 수득한 154개의 높은 수준으로 발현되는 암호화 서열을 사용하여 계산하였다. 단자엽 식물의 코돈 사용은 표 1 및 실시예 1에 나타나 있는 유전자 은행에서 수득한 53개의 단자엽 식물의 핵 유전자를 암호하는 서열을 사용하여 계산하였다.

숙주 세포내 발현을 증진시키기 위한 유전자를 합성할 때, 코돈 사용 빈도가 숙주 세포의 선호 코돈 사용 빈도와 근접하도록 유전자를 고안하는 것이 바람직하다.

합성 유전자에 대한 선호 코돈 사용 빈도와 숙주 세포에 의해 사용된 코돈 사용 빈도와의 백분율 편차는 먼저 단일 코돈 사용 빈도와 숙주 세포의 코돈 사용 빈도와의 백분율 편차를 결정한 후 전체 코돈에 걸쳐 평균 편차를 구하여 계산한다. 본원에서 정의한 바와 같은 이 계산은 독특한 코돈(예로 ATG 및 TGG)을 포함한다. 합성 Btt 유전자의 선호 코돈 사용 빈도는 표 1에 나타나 있다. 합성 유전자내 발현에 대한 코돈 GTA'의 선호 사용 빈도(0.10)는 쌍자엽 식물의 선호 사용 빈도(0.12)와 0.02/0.12=0.167 또는 16.7% 정도 편차가 있다. Btt 합성 유전자의 코돈 사용 빈도와 쌍자엽 식물의 코돈 사용 빈도와의 전체 아미노산 코돈에 대한 평균 편차는 7.8%이다. 일반적으로 합성 유전자의 코돈 사용과 숙주 세포의 코돈 사용과의 전체 평균 편차는 다음 방정식을 사용하여 계산한다.

여기서 X_n은 숙주 세포내 코돈 n의 사용 빈도이고, Y_n은 합성 유전자내 코돈 n의 사용 빈도이다. 여기서 n은 아미노산을 지정하는 개개의 코돈을 나타내고, Z는 코돈의 전체 수이며 61개가 바람직하다. 전체 아미노산의 코돈 사용 빈도의 전체 편차는 약 25% 보다 적은 것이 바람직하고, 약 10% 보다 적은 것이 더욱 바람직하다.

무엇으로부터 유도한 이란(화학적 및/또는 생물학적) 기원으로부터 가져온, 수득한, 받은, 추적한, 복제한, 유래한 것을 말한다.

유도체는 원 기원을 화학적 또는 생물학적 조작(치환, 부가, 삽입, 삭제, 추출, 분리, 돌연변이 및 복제를 포함하나 이에 제한되지 않음)하여 생성할 수 있다.

DNA 서열과 관련하여, 화학적으로 합성한다는 것은 누클레오티드 성분을 시험관 내에서 구성시키는 것을 말한다. DNA를 잘 확인되어 있는 방법{Caruthers. M. (1983) Methodology of DNA and RNA Sequencing, Weissman (ed.), Praeger Publlishers, New York, Chapter 1}을 이용하여 수동으로 화학합성하거나, 상업적으로 유용한 많은 기계 중의 하나를 사용하여 자동으로 화학합성할 수 있다.

본원에 사용한 높은 수준으로 발현되도록 고안한다는 용어는 고안 유전자에 의해 생성되는 특전 mRNA의 전사량이 노던 블롯으로 정량하기에 충분한 수준으로 발현되는 것을 말한다. 따라서 이 용어는 폴리(A)⁺mRNA의 약 0.001% 이상에 상응하도록 발현된 특정 mRNA의 수준을 나타낸다. 오늘날까지 천연 Bt 유전자는 특정 mRNA의 생성량이 노던 블롯 기술을 사용하여 측정하기에 불충분한 수준으로 전사되었다. 그러나 본 발명에서 높은 수준으로 발현되도록 고안한 합성 Bt 유전자의 전사는 생성된 측정 mRNA 전사물을 정량할 수 있을 뿐 아니라 살충제의 생물학적 분석으로 측정되는 번역 생성물의 발현을 증진시킨다.

결정 단백질이나 결정 살충 단백질 또는 결정 독소는 Bt 균주에서 형성된 파라포자(paraspore) 결정의 주요 단백질 성분을 말한다. 이 단백질 성분은 다른 종류의 곤충에 선택적인 병원성을 나타낸다. 파라포자 결정에서 분리한 주요 단백질 분자의 크기는 그것을 유도시킨 Bt 균주에 따라 다르다. 약 132,65 및 28kDa의 분자량을 갖는 결정 단백질이 알려져 왔다. 약 132kDa의 단백질은 약 65kDa의 단백질 독소를 형성하기 위해 분열되는 전(前) 독소이다.

결정 단백질 유전자는 유전자를 유도하는 Bt 균주에 따라, 완전한 길이의 전독소 형태 또는 독소 형태 중 하나로 살충 단백질을 암호화는 DNA 서열을 말한다.

본 발명의 출원인은 Bt 결정 단백질의 mRNA가 식물내에서 발현되는 것은 보통 노던 블롯으로 검출할 수 없는 수준이고, Bt 결정 단백질의 발현 수준이 낮은 것은 mRNA 발현 수준이 낮은 것에 상응한다는 것을 연구하였다. 잠재적인 생물학적 조절 방법으로 이들 유전자를 개발하기 위하여 식물 세포내에서 Bt 유전자의 발현 수준을 증진시키고 식물내의 Bt mRNA의 안정성을 효과적으로 활용하는 것이 바람직하다. 이것은 Bt mRNA를 더 높은 수준으로 집적시키고 식물 세포내의 살충 단백질의 양을 증가시킨다. 이것은 Bt 단백질에 상대적으로 내성을 지닌 곤충을 조절하는데 필수적이다.

따라서 본 발명은 유전자 전이 식물내의 바람직한 재조합 살충 단백질의 발현 수준을 안정한 mRNA 전사물의 발현을 증가시켜 증진시킬 수 있다는 것을 인식하는 것에 기초로 한다. 더구나 이들 안정한 RNA 전사물의 검출을 역으로 번역 생성물(단백질)의 발현을 측정하기 위해 사용할 수도 있다. 본 발명은 식물내의 살충 단백질 RNA가 낮은 수준으로 발현되는 문제 및 Bt로부터의 결정 살충 단백질을 암호하는 개선된 합성 유전자의 사용을 통해 낮은 수준의 단백질 발현 문제를 해결하는 방법을 제공한다.

식물내의 Bt 유전자 발현을 증진시키려는 시도는 유전자형, 유전자 길이, 프로모터의 선택, 식물 비루스의 비번역 RNA 리더의 부가, 인트론 서열의 부가 및 개시 ATG 코돈을 둘러싼 누클레오티드의 변형과 같은 매개 변수를 평가하는 비교 연구에 중점을 두어왔다. 오늘날까지 이들 매개 변수의 변화는 식물내의 Bt 단백질 발현을 현저하게 증진시키지 못했다. 놀랍게도 출원인은 식물내에서 원하는 수준으로 Bt 단백질을 발현시키기 위해서는 유전자의 암호화 부위를 변형시키는 것이 효과적이라는 사실을 발견했다. 구조-기능의 관계는 바람직한 누클레오티드의 변경을 포함하는 합성 DNA 이중체로 제한 단편을 치환하는 부위 특이 돌연변이를 사용하여 연구할 수 있다{Lo 등의 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:285-2289 참조}. 그러나, 최근 재조합 DNA 기술이 향상되어 바람직한 기능으로 특별히 고안한 완전 유전자를 화학적으로 합성하는 것이 가능하게 되었다. 따라서, Btt 암호화 부위를 화학적으로 합성하고, 식물내에서 이것의 발현을 증진시키는 것과 같은 방법으로 변형하였다.

또한, 유전자 합성은 적절히 위치한 많은 제한 엔도누클레아제 부위를 유전자 내로 삽입하여 유전자의 다음 돌연변이가 용이하도록 유전자를 고안하는 기회를 제공한다.

본 발명은 곤충에 유독한 결정 단백질에 대한 합성 Bt 유전자를 제공한다. 본원에서 예시한 바와 같이 이 단백질은 갑충류에 유독하다. 식물내에서 이 살충 단백질의 발현을 증진시킬 목적으로, 본 발명은 Btt 구조 유전자와 상동하고 본원에 예시한 것처럼 p544Pst-Met5 내의 Btt 구조 유전자에 약 85% 가량 상동성을 지닌 DNA 분절을 제공한다. 이 실시 형태에서 Btt 살충 단백질을 암호하는 구조 유전자는 암호화 부위를 화학적으로 합성하여 수득한다. 화학적으로 합성한 유전자를 본 실시 형태에서 사용하는데, 이는 교차 발현 수준을 증진시키기 위해 필요한 누클레오티드 서열의 변형을 조절하기에 가장 쉽고 유효하기 때문이다.

오늘날, 일반적으로 화학 합성은 바람직한 변형 유전자를 수득하기 위한 바람직한 방법이다. 그러나, 오늘날까지 식물 단백질 유전자는 화학적으로 합성되지도 않았고 박테리아 단백질의 어떤 합성 유전자도 식물에서 발현되지 않았다. 본 발명에서 유전자를 합성하기 위해 채택한 연구법은 암호화 부위에 해당하는 증진된 누클레오티드 서열을 고안하고 화학적으로 합성한 올리고누클레오티드 분절로부터 유전자를 조합시키는 것으로 구성된다. 유전자를 고안하는데 있어서, 갑충류에 독성을 갖는 64kDa의 폴리펩티드를 암호하고 바람직하게는 Btt 서브클론, p544Pst-Met5에서 수득한 천연 유전자의 암호화 부위에 대해 식물에서 합성 유전자의 발현을 증진시키는 변형의 가능성을 자세히 조사한다. 예로 번역 효과를 최대로 하기 위해 숙주 세포의 단백질을 가장 높은 수준으로 발현시키기에 바람직한 코돈을 사용한다.

한 종류의 유전자내 코돈 선택 편향성은 그 유전자가 암호하는 단백질의 발현 수준에 관련된다는 것을 나타낸다. 암호 편향성은 E. Coli 및 효모의 가장 높은 수준으로 발현되는 단백질에서 극심하다. 이들 미생물에서는 풍부한 이소악셉팅 tRNA 종과 선호하는 동의코돈 사이에 분명한 정상관이 있다고 알려졌다. 효모내에서 높은 수준으로 발현되는 단백질의 한 군에서는 61개의 유용한 코돈 중 오직 25개가 아미노산의 96% 이상을 암호한다{Bennetzen 및 Hall의 (1982) J. Biol. Chem, 257:3026-3031 참조}.

이들 25개의 코돈은 서열결정한 모든 효모 유전자에서 선호되지만, 그 선호의 정도는 유전자 발현 수준에 따라 다양하다. 최근, Hoekema 및 그의 동료들의 (1987) Mol. Cell, Biol. 7:2914-2924 문헌은 이들 25개의 선호 코돈을 높은 수준으로 발현시킨 효모 유전자 PGK1의 5' 말단에 있는 소수 코돈으로 치환하면 단백질과 mRNA 둘 다의 수준이 감소된다고 밝혔다. 그들은 높은 수준으로 발현되는 유전자 내의 편향된 코돈 선택이 번역을 증진시키고 효모내의 mRNA 안정성을 유지하는데 필요하다는 결론을 내렸다. 코돈의 편향 정도가 효모 및 다른 계 내에서 이종 유전자를 높은 수준으로 발현시키도록 조작할 때 고려해야 할 중요한 요소임은 의심할 바 없다.

점 돌연변이 및 삭제 분석에서 수득한 실험적 증명으로 진핵 세포 유전자 내의 특이 서열이 전사 과정후 RNA이 불안정화, 번역 종결, 인트론 접합등과 연관되어 있다는 것이 지적되었다. 이들을 본 발명의 합성 유전자에 사용하는 것이 바람직하다. 식물내 발현을 위한 박테리아 유전자를 고안하는데 있어서, 유전자 발현의 효율을 간섭하는 서열을 제거한다.

합성 유전자를 고안하는데 있어서, 숙주 세포에서 본래 높은 수준으로 발현되는 단백질에 대한 유전자에서 보통 발견되는 A+T 함량이 반영되도록 합성 유전자의 DNA 염기 조성에서의 A+T 함량을 변경하여 암호화 부위의 누클레오티드 서열을 변형시킨다. 합성 유전자의 A+T 함량은 실제로 높은 수준으로 발현되는 단백질을 암호하는 상기 유전자의 양과 실제로 같음이 바람직하다. 높은 수준으로 발현되는 식물 단백질을 암호하는 유전자의 A+T 함량은 약 55%이다, 합성 유전자는 이 값에 가깝고, RNA가 불안정화되어 단백질 발현 수준이 낮아질 정도로 충분히 높지 않은 A+T 함량을 갖는 것이 바람직하다. A+T 함량이 단지 60%일 때 더욱 바람직하고 약 55%일 때 가장 바람직하다. 또한, 식물내의 최종 발현을 위해, 합성 유전자의 누클레오티드 서열을 암호화 부위의 5' 말단에 식물의 개시 서열이 형성되도록 변형시키는 것이 바람직하다. 또한, 합성 유전자가 구성되는 동안 올리고누클레오티드 분절을 효과적으로 조합시킬 수 있고 이후의 누클레오티드 변형을 용이하게 하는 전략적 위치에 독특한 제한 위치를 두는 것을 확실하게 하는데 특별한 주위를 기울인다. 천연 Bt 유전자의 암호화 부위를 변형시킨 결과처럼, 바람직한 합성 유전자는 천연 Bt 구조 유전자에서 관찰한 것과 비교할 때 식물내에서 증진된 수준으로 발현된다.

특별한 실시 형태에서, 본 발명의 합성 유전자는 갑충류에 유독한 Btt 단백질을 암호한다. 바람직하게 독성 폴리펩티드는 길이가 약 598개의 아미노산이고, Btt 폴리펩티드에 적어도 75% 이상의 상동성을 가지며, 본원에서 예시한 바와 같이 잔기 2위치에서 트레오닌을 알라닌으로 치환한 것을 제외하고는 p544Pst-Met5에 의해 암호되는 단백질과 근본적으로 동일하다. 이 아미노산 치환은 암호화 서열의 +4 위치에 구아닌을 도입시키는데 필요하기 때문에 발생한다.

본 발명의 합성 유전자를 고안하는데 있어서, 갑충류에 독성을 지닌 65kDa의 폴리펩티드를 암호하는 Btt 서브클론, p544Pst-Met5의 암호화 부위를 식물내에서 합성 유전자의 발현이 증진되는 결과를 가져오도록 변형시킬 수 있는지 자세히 조사한다. 예를 들어, 바람직한 실시 형태에서, 합성 살충 단백질은 담배, 토마토, 목화와 같은 쌍자엽 식물에서 잘 발현되므로 이러한 조건하에서 높은 수준으로 발현되는 쌍자엽 단백질이 우선적으로 사용하는 유리한 코돈이 삽입되도록 합성 유전자를 고안한다. 단자엽 식물에서 살충 단백질의 증진된 발현이 필요한 경우, 표 1에 나타난 바와 같이 높은 수준으로 발현되는 단자엽 식물 단백질이 선택하는 코돈을 합성 유전자 고안에 사용한다.

일반적으로 생물분류학군에 속하는 유전자는 이들 유전자의 기능에 상관없이 코돈 선택에 있어 유사성을 나타낸다. 따라서 생물분류학군에 의한 유전 암호의 전체 사용은 서열결정된 전체 유전자의 코돈 빈도를 계산하여 수득할 수 있다. 본 발명에서는 208개의 식물 유전자를 분석하여 종-특이 코돈 선택에 관하여 보고한다. 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물의 좀 더 넓은 생물분류학군이 다른 유형의 동의코돈 선호에 의해 특정지워지는 지를 결정하기 위해 이들을 각각 분석한다. 208개의 식물 유전자는 코돈 분석에서 넓은 범위의 기능을 가지는 단백질을 포함하고 그들은 6개의 단자엽 식물종 및 36개의 쌍자엽 식물종을 나타낸다. 이들 단백질은 다양한 발현 수준으로 다른 식물 조직내에 존재한다.

본 발명은 동의코돈의 상대적 사용이 단자엽 및 쌍자엽 식물간에 차이가 있다는 것을 나타낸다. 일반적으로 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물의 코돈 사용 유형에 있어서 가장 중요한 차이점은 세번째 변성 염기의 G+C 백분율 함량이다. 단자엽 식물에서는 18개의 아미노산 중 16개가 이 위치에서 G+C를 선호화는 반면 쌍자엽 식물에서는 18개의 아미노산 중 7개만이 G+C를 선호한다.

Thr, Pro, Ala 및 Ser을 암호하는 G로 끝나는 코돈은 그들이 코돈 위치 Ⅱ에 C를 포함하기 때문에 단자엽 및 쌍자엽 식물 모두에서 사용되지 않는다. CG 디누클레오티드는 아마도 메틸화와 관련된 조절로 인해 식물{Boudraa(1987) Genot, Sel. Evol. 19:143-154 참조} 및 다른 진핵 세포{Grantham 등의 (1985) Bull. Inst. Pasteur 83:95-148 참조}에서는 거의 사용하지 않는다. 쌍자엽 식물에서 XCG가 언제나 최소의 선호 코돈인 반면, 단자엽 식물에서는 그렇지 않다. 이중자(doublet) TA도 대부분의 진핵 세포에서 코돈 위치 Ⅱ 및 Ⅲ에 이용되지 않는데 이는 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물에서도 마찬가지이다.

Grantham 및 그의 동료들의 (1986) Oxford Surveys in Evol. Biol. 3:48-81 문헌은 코돈 위치 Ⅱ 및 Ⅲ에서 CG 및 TA 이중자 기피 정도를 정량하는 두 개의 코돈 선택 지수를 개발하였다. XCG/XCC는 염기 Ⅱ로서 C를 갖는, C-종결 삼중자(triplet)에 대한 G-종결 삼중자의 비율인 반면, XTA/XTT는 제2염기로서 T를 갖는, T-종결 삼중자에 대한 A-종결 삼중자의 비율이다. 이 지수는 본 페이지(표 2)의 식물 데이터를 계산한 것으로 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물종이 이들 디누클레오티드의 사용에 있어서 다르다는 결론을 지지한다.

RuBPC SSU = 리불로스 1.5 비스포스페이트 작은 소단위체

CAB = 클로로필 a/b 결합 단백질

또한 콩 및 옥수수 두 종에 대한 종 특이성 코돈 사용 유형을 측정하였다(나타나 있지 않음). 옥수수의 코돈 사용 유형은 일반적으로 단자엽 식물의 유형과 비슷한데, 이는 이들 서열이 유용한 단자엽 식물 서열의 반 이상을 나타내기 때문이다. 옥수수 부표본의 코돈 유형은 코돈 위치 Ⅱ에서 G+C에 대한 선호에 있어서 훨씬 더 두드러지게 편향된다. 한편 콩의 코돈 사용 유형은 비록 이것이 전체 쌍자엽 식물 표본 중 훨씬 적은 부분을 나타내지만 거의 일반적인 쌍자엽 식물 유형과 동일하다.

리불로스 1,5 비스포스페이트 작은 소단위체(RuBPC SSU) 및 클로로필 a/b 결합 단백질(CAB)과 같은 높은 수준으로 발현되는 유전자의 암호화 전략이 일반적으로 식물 유전자의 암호화 전략보다 더 편향되어 있는지를 결정하기 위하여, 이들 유전자의 아부분(각각 19 및 17 서열)에 대한 코돈 사용 유형을 측정한다(나타나 있지 않음). RuBPC SSU와 CAB를 풀로 만든 표본은 더 많은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물의 표본(표 2) 보다 XCG 및 XTA 코돈을 훨씬 더 기피함을 특징으로 한다. 비록 이들 부표본 유전자의 대부분 기원(17/19 및 15/17)이 쌍자엽 식물이지만 그들의 코돈 유형은 변형 염기 Ⅲ에 G+C를 사용하는 점에서 단자엽 식물의 것과 유사하다.

높은 수준으로 발현되는 유전자에 대한 합동 데이터의 이용은 코돈 선택에 있어서 종 특이성 유형의 확인을 모호하게 한다. 따라서, RuBPC SSU 및 CAB에 대한 각각의 유전자 코돈 선택을 표로 만들었다.

RuBPC SSU 및 CAB에 대한 옥수수와 밀 유전자의 선호 코돈은 일반적으로 쌍자엽 식물종의 코돈 보다 더 제한된다. 이는 Matsuoka 등의 (1987) J. Biochem. 102:673-676 문헌에서 옥수수 RuBPC SSU 유전자의 극단적 코돈 편향 뿐만 아니라 옥수수 앞에서 CAB 및 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제와 같은 높은 수준으로 발현되는 두 개의 다른 유전자에 대해 제시한 바와 일치한다. 비록 알콜 탈수소효소, 제인의 22kDa의 소단위체, 자당 합성효소 및 ATP/ADP에 전이효소와 같은 잎 단백질이 아닌 단백질로는 이들 코돈 편향을 단정지을 수는 없지만, 이들 유전자는 거의 코돈 위치 Ⅲ에서 A+T의 사용을 기피한다. 밀의 SSU 및 CAB 유전자는 비슷한 유형의 코돈을 선호하기 때문에, 이는 잎에서 높은 수준으로 발현되는 유전자에 대한 일반적인 쌍자엽 식물의 유형을 나타낼 수 있다. 개구리밥 속의 CAB 유전자의 클라미도모나스의 RuBPC SSU 유전자는 코돈 위치 Ⅲ에서 G+C에 대한 유사한 극단적 선호를 공유한다. 그러나, 쌍자엽 식물의 CAB 유전자에서는 A+T 변성 염기는 몇몇 동의코돈(예로, Ala에 대한 GCT, Leu에 대한 CTT, Gly에 대한 CGA 및 GGT)에 의해 선호된다. 일반적으로, G+C 선호는 단자엽 식물 보다 쌍자엽 식물에서 RuBPC SSU와 CAB 유전자 둘 다에 대해 덜 단정적이다.

또한 식물내의 발현을 위한 합성 유전자의 고안에 있어서, 유전자의 발현효율을 간섭하는 서열의 제거를 시도하였다. 식물 폴리아데닐화 시그널, 예를 들어 AATAAA, 폴리머라제 Ⅱ 종결 서열, 예를 들어 CANAGTNNAA, UCUUCGG 헤어핀 및 식물의 칸센서스 접합 부위와 같은 서열이 특히 강조되고, 만약 존재한다면 천연 Btt 암호화 서열도 잠재적으로 유해한 서열을 제거하기 위해 변형시킨다.

또한 Btt 암호화 부위의 누클레오티드 서열을 변형시켜 DNA 염기 조성물내의 A+T 함량을 감소시키는 것이 바람직하다. Btt 암호화 부위는 64%의 A+T 함량을 가지며, 이것은 전형적인 식물 암호화 부위에서 나타나는 것 보다 약 10% 많은 것이다. A+T가 풍부한 부위는 식물의 유전자 전이 부위 및 식물 조절 부위의 특징을 나타내므로 A+T 함량을 감소시킨다. 합성 Btt 유전자는 보통 식물에서 나타나는 값을 유지하는, 55%의 A+T 함량을 가진다.

Btt 암호화 서열의 네번째 누클레오티드 위치에서의 단일 변형(아데닌 대신 구아닌을 삽입)은 발현 최적시에 식물의 개시 서열{Taylor 등의 (1987) Mol. Gen. Genet. 210:572-577 참조}로서의 기능과 일치하는 서열을 형성하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명을 예시화함에 있어서 최초의 전사를 안정화시키기 위한 시도로서 합성 유전자의 암호화 부위에 39개의 누클레오티드(13개의 코돈)을 가한다. 그러나, 39개의 누클레오티드를 포함하는 본 연장 폴리펩티드의 부재 하에서는 동일하게 안정된 전사물이 수득된다.

발현이 증진되는 합성 Bt 유전자를 구성하도록 천연 Bt 유전자의 상기 수정이 행해져야 한다. 예를 들어, 합성 유전자를 발현 수준을 증진시키는 목적 이외에 다른 목적을 위하여 합성할 수 있다. 이와 같은 조건하에서, 천연 Bt 유전자의 본래 서열은 합성 유전자를 구성하기 위해 사용하는, 전체는 아니지만 하나 이상의 분절에 상응하는 DNA 부위내에 보존될 수 있다. 유전자의 원하는 목적에 따라, 변형은 천연 Bt 서열의 상응 부위에 의해 합성 유전자를 구성하는데 사용하는, 전부는 아니지만 하나 또는 그 이상의 올리고누클레오티드 분절의 치환을 포함한다.

유전자 합성 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 바와 같이 {Mandecki 등의 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci, 83:3543-3547;Feretti 등의 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, 83:599-603}, 합성될 DNA 서열을 과도한 과정을 거치지 않고 편리하게 합성할 수 있는 분절의 길이로 분할한다. 본원에서 예시한 바와 같이, Btt 유전자를 합성하기 위하여 암호화 부위를 13개의 분절(A-M)로 분할한다. 각 분절은 코히시브 말단에 독특한 제한 서열을 갖는다. 예를 들어, 분절 A는 228개 염기쌍 길이이고, 각각 약 75개의 염기를 포함하는 여섯 개의 올리고누클레오티드 단편으로 구성된다. 단일가닥 올리고누클레오티드를 어닐링하고 결합하여 DNA 분절을 형성한다. 상보적 올리고누클레오티드 분절의 코히시브 돌출말단 길이는 네 개 내지 다섯 개의 잔기이다. 유전자 합성을 위한 전략으로 올리고누클레오티드 단편과 DNA 분절을 결합시키기에 바람직한 부위는 유전자 내에 생성되는 제한부위와는 다르다.

구체적인 실시 형태에 있어서, 각 DNA 분절을 DNA 증폭용 plC-20 벡터내로 클로닝시킨다. 이 단계에서 각 단편의 누클레오티드 서열은 주형으로서 재조합 파지 DNA와 프라이머로서 선택한 합성 올리고누클레오티드를 사용하여 디데옥시 방법으로 결정된다.

본원에서 예시하고 제2도 및 제3a, 3b도에서 개략적으로 도시한 바와 같이 개개의 각 분절(예를 들어, 분절 M)은 클로닝 벡터로부터의 측면 제한부위를 절단하여, 분절 A를 포함하는 벡터내로 접합시킨다. 종종, 효능을 증가시키기 위해 단일 분절 대신 쌍을 이룬 분절로 분절을 접합시킨다. 따라서, 전체 유전자는 분절 A를 포함하는 본래 플라스미드 내에서 구성된다. 전체 유전자의 누클레오티드 서열은 제1a, 1b 및 1c도에 나타난 서열과 정확히 일치하였다.

바람직한 실시 형태에 있어서, 합성 Btt 유전자는 천연 Btt 구조 유전자로 관찰한 바와 비교할 때 식물에서 보다 증진된 수준으로 발현된다. 합성 구조 유전자는 식물내의 기능적 프로모터와 결합하되, 그 구조 유전자와 프로모터 부위는 프로모터 부위가 활성화되어 세포내에서 구조 유전자를 발현시켜 기능 유전자를 형성할 수 있도록, 서로 관련된 위치와 배향으로 존재한다. 프로모터 부위는 박테리아 및 식물의 프로모터 부위를 포함하나 그것으로 제한되지는 않는다. 프로모터 부위/구조 유전자 결합체를 발현시키기 위해, 이 결합체를 운반하는 DNA 분절을 세포에 함유시킨다. 식물 프로모터 부위를 함유하는 결합체는 식물 세포에 포함시키고, 차례로 그것을 식물이나 종자에 포함시킬 수도 있다. 박테리아 프로모터 부위를 함유하는 결합체는 박테리아, 예를 들어 Bt 또는 E. Coli에 포함시킨다. 본 분야의 숙련자들은 박테리아 보다는 미생물 형태에서의 발현이 다소의 환경에서 바람직할 수 있으며, 본 명세서에서 실험을 거치지 않고서도 실행가능함을 이해할 것이다.

프로모터 조절하의 합성 구조 유전자를 운반하는 재조합 DNA 분자는 본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있는 어떠한 방법으로도 식물 조직내로 도입될 수 있다. 식물종이나 식물 조직의 특이적 형태를 제공하는데 사용하는 기술은 공지된 성공적인 기술을 사용한다. 식물 세포내로 외인성 유전자를 안전하게 삽입하는 방법과 변형된 세포 조작을 위한 새로운 방법이 개발됨으로써, 숙련된 기술자들은 이러한 공지된 방법중에서 선택하여 바람직한 결과를 수득할 수 있을 것이다. 식물 조작내로 재조합 DNA를 도입시키는 방법으로 직접 DNA 흡수{Paszkowski J. 등의 (1984) EMBO J. 3:2717 참조}, 일렉트로포레이션(electroporation){Fromm, M 등의 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:5824 참조}, 현미주사법{Crossway, A. 등의 (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179 참조} 또는 아그로박테리움 투메파시엔스{Agrobacterium tumefaciens}로부터 식물 조직으로 T-DNA 형질전환의 근본적인 한계는 없다. 보고되어 있는 T-DNA 매개 전이 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아그로박테리움의 천연 숙주 범위에 대한 T-DNA 매개의 성공적인 형질전환으로는 단자엽 식물{Hooykass-Van Slogteren, C. 등의 (1984) Nature 311:763 참조}, 나자식물{Dandekar, A 등의 (1987) Biotechnology 5:587 참조} 및 조류(Ausich, R., 유럽 특허 출원 제108,580호 참조)가 있다. 대표적인 T-DNA 벡터계가 기술된 참고문헌은 다음과 같다: An, G. 등의 (1985) EMBO J. 4:277; Herrera-Esterlla, L. 등의 (1983) Nature 303:209; Herrera-Esterlla, L. 등의 (1985) in Plant Genetic Engineering, New York: Cambridge University Press, P. 63. 식물 조직내로 일단 도입시키면, 구조 유전자의 발현은 본 분야에서 공지된 모든 방법으로 분석할 수 있으며, 그 발현은 전사된 mRNA 또는 합성된 단백질로 측정할 수 있다. 식물 조직의 시험과 내 배양과, 다수의 경우 완전한 식물로의 재생에 관한 기술은 공지된 바 있다. 도입시킨 발현 복합체를 상업상 유용한 경작물에 전이시키는 방법은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있다.

본원에서 기술한 본 발명의 바람직한 실시 형태 중 하나는 식물에서 발현가능한 프로모터 조절하의 합성 살충 구조 유전자를 식물 세포내에 발현시키는 것을 포함한다. 즉, 살충 구조 유전자를 식물에서 발현가능한 프로모터 조절하의 T-DNA 내로 삽입시킨 다음 공지된 방법을 사용하여 삽입물을 함유하는 T-DNA를 식물 세포내로 도입시킴을 포함한다. 식물에서 발현가능한 프로모터 조절하의 합성 살충 구조 유전자를 발현시킨 식물 세포를 수득하면, 본 분야에 공지된 기술을 이용하여 식물 조직 및 완전한 식물을 재생시킬 수 있다. 그리고 나서 재생된 식물을 통상적인 방법으로 증식시키고 도입된 유전자를 통상적인 식물 번식 기술을 이용하여 다른 균주 및 경작물로 전이시킬 수 있다.

살충 단백질에 대한 합성 구조 유전자의 삽입 및 발현은 보통 해충으로부터 경작물을 보호하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 다른 용도로 다른 식물 중에 도입된 다른 살충 구조 유전자의 특성을 이용함은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 용이할 것이다. 원칙상 본 발명은 외인성 DNA(바람직하게는 T-DNA)를 도입시킬 수 있고 상기 DNA가 안전하게 복제되어 보존될 수 있는 식물종 내로 모든 합성 살충 구조 유전자를 도입시키는데 사용한다. 일반적으로, 이들 분류군에는 나자식물 및 해바라기(국화과), 담배(가짓과), 자주개자리, 콩 및 다른 콩과 식물(콩과), 목화(아욱과)와 같은 쌍자엽 식물, 및 단자엽 식물 뿐만 아니라 대부분의 식물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 살충 단백질의 수준이 증가된 조직을 포함하는 식물은 곤충에 덜 민감한 형태로 조절될 수 있으므로, Bt의 살충효과를 제공한다. 또한 본 발명은 획일적이지 않은 작용 및 구입 가격의 경우를 제외하고는 식물 조직내로 살충 단백질을 삽입시킴으로써 본 분야의 살충제를 공급하여 본 살충제 용도에 대한 장점을 제공한다. 또한, 본 발명은 작은 유충이 살충 단백질에 대부분 민감하며 본 단백질은 항상 존재하여 사전의 유충 침입으로 인한 농작물 손실을 최소화하므로 이와 같은 제제의 적용시 시간조절에 대한 주의를 요하지 않는다.

본 발명은 본 분야에서 공지된 다양한 기술 및 수단을 포함한다. 본 발명은 다음과 같은 변수들, Bt 균주로부터 살충 단백질의 선택, 선호 코돈 사용에서의 변형 정도, RNA에 대해 불안정할 것이라고 여겨지는 서열이나 전사를 너무 이르게 종결하는 서열의 조작, 누클레오티드 변형을 허용하는 합성 유전자 고안물 내부에 제한 부위의 삽입, 합성 구조 유전자의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인트론이나 인헨서 서열의 부가, 프로모터 부위, 프로모터 부위/구조 유전자 결합체가 발현되는 숙주 등에 의존한다. 새로운 살충 단백질 및 독성 폴리펩티드를 발견함에 따라, 증진된 교차-발현(해당 숙주내에서 외인성 구조 유전자의 발현)에 관여하는 서열이 밝혀지며, 통상의 숙련된 기술자들은 농경법상 가치를 지닌 바람직한 단백질에 대한 개량된 합성 유전자를 생성하도록 이들 요소 가운데 선택하는 것이 가능할 것이다. 본 발명의 기본적인 양상은 본 단백질이 식물 내에서 증진된 수준으로 발현되도록 고안하되, 살충 독성의 고유한 특성은 유지하며 살충 고유 활성도를 보유하거나 증가시키는 살충 단백질을 암호하는 새로운 유전자를 합성하는 능력이다.

[실시예]

다음 실시예는 본 발명의 실시 형태를 보다 상세히 설명하고가 기술한 것이다. 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니며 본 발명은 특허청구의 범위에 의해 결정된다.

다음 균주는 일리노이스 61604 페오리아 엔. 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 노던 리즈널 리서치 센터 페이턴트 컬쳐 콜렉션에 기탁하였다.

기탁 균주는 본 분야 기술자들의 편의를 위해 제공하는 것으로, 공공상 유용한 프로토콜, 정보 및 재료를 부가하여 본 발명을 실험할 수 있다. 플라스미드 형질전환에 적합한 숙주인 E. Coli MC1061에 관여하는 Casadaban, M. J. 및 Cohen, S. N의 (1980) J. Mol. Biol. 138:179-207 문헌에 기술되어 있다.

[실시예 1 : 합성 살충 결정 단백질 유전자의 고안]

(ⅰ) Btt 유전자의 독성 서브클론의 제조

pNSB544의 구성, 분리 및 특정화에 관하여는 본원에서 참고 문헌으로 인용한 Sekar, V. 등의 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7036-7040과 Sekar, V. 및 Adang, M. J.의 1987년 10월 13일자 미국 특허 출원 제108,285호에 기술되어 있다. pNSB544의 결정 단백질 유전자를 운반하는 3.0kbp의 HindⅢ 단편을 plC-20H{Marsh, J. L. 등의 (1984) Gene 32:481-485 참조}의 HindⅢ 부위내로 삽입시켜, 기탁중인 p544-HindⅢ으로 명명한 플라스미드를 생성한다. E. Coli 내 발현으로, Btt 분리물로부터 수득한 결정 단백질의 특성을 지닌 65KDa의 종 이외에 73KDa의 결정 단백질을 생성한다.

결정 단백질 유전자를 운반하는 5.9kbp의 BamHⅠ 단편을 pNSBP544로부터 제거한 후, BamHⅠ-선형 plC-20H DNA 내로 삽입시킨다. 결과적으로 생성된 플라스미드인 p405/44-7을 BgⅢ로 절단시킨 후 재결합시켜서, 결정 단백질 유전자 3'-말단의 측면에 있는 바실루스 서열을 제거한다. 그 결과 생성되는 플라스미드인 p405/54-12를 PstI으로 절단시킨 후 재결합시켜서, 결정 단백질의 5'-말단의 측면에 있는 바실루스 서열과 결정 단백질 구조 유전자의 약 150bp를 제거한다. 그 결과 생성되는 플라스미드인 p405/81-4를 SphI과 PstI으로 절단시켜 다음 구조를 가지는 합성 링커(linker)와 결합시킨다:

(SD는 샤인-달가노 원핵 세포의 리보좀 결합부위의 위치를 가리킨다). 그 결과 생성되는 플라스미드인 p544Pst-Met5는 아미노-말단의 47개 아미노산 잔기를 삭제한 것을 제외하고는 pNBSP544로 암호된 것과 동일한 단백질을 암호하는 구조 유전자를 포함한다. p544Pst-Met5 내의 Btt 암호화 부위의 누클레오티드 서열은 제1a, 1b 및 1c도에 나타나 있다. 생물검정(Sekar 및 Adang의 미국 특허 출원 제108,285호 및 상기 문헌 참조)에 있어서, pNSBP544와 N-말단 삭제 유도체인 p544Pst-Met5의 Btt 유전자 전체 길이로 암호되는 단백질은 동등한 독성을 나타냈다. 상기의 모든 플라스미드는 벡터의 lacZ 유전자와 같은 배향으로 결정 단백질 유전자를 가진다.

(ⅱ) 선호 코돈 사용의 변형

표 2은 (A) 쌍자엽 식물 단백질, (B) Bt 단백질, (C)는 합성 Btt 유전자, 및 (D) 단자엽 식물 단백질의 코돈 사용 빈도를 나타낸 것이다. 특정 아미노산에 대한 다소의 코돈(에를 들면, 세린에 대한 코돈)이 쌍자엽 식물과 Bt 단백질 둘 다에 의해 대부분 거의 같은 정도로 사용된다 하더라도 코돈 빈도의 분배는 표 2의 컬럼 A와 컬럼 B에 나타난 바와 같이 쌍자엽 식물과 Bt 단백질간에 상당히 다양하다.

쌍자엽 식물 핵 유전자의 154개의 암호화 서열을 코돈 사용표를 만드는데 사용하였다. 유전자 은행으로부터 입수한 쌍자엽 식물의 암호화 서열은 다음과 같다. 유전자 은행 파일명이 지정되지 않은 것은 공지원으로부터 직접 인수한 것임:

유전자 은행으로부터 입수한 53개의 단자엽 식물 암호화 서열(55개는 제외함)은 다음과 같다. 유전자 은행 파일명이 지정되지 않은 것은 공지원으로부터 직접 입수한 것임:

Bt 코돈은 다음 유전자의 암호화 서열을 분석하여 수득하였다: Bt 변이체 쿠르스타키(Kurstaki) HD-73,6.6kb HindⅢ단편{Kronstad 등의 (1983) J. Bacteriol. 154:419-428 참조}; Bt 변이체 쿠르스타키 HD-1,5.3kb 단편{Adang 등의 (1987) in Biotechnology in Invertebrate pathology and Cell Culture, K. Maramorosh(ed.), Academic Press, Inc. New York, PP. 85-99 참조}; Bt 변이체 쿠르스타키 HD-1,4.5kb 단편{Sehnepf 및 Whiteley의 (1985) J. Biol. Chem. 260:6273-6280 참조}; 및 Bt 변이체 데네브리오니스, 3.0 Kb HindⅢ 단편{Sekar 등의 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7036-7040 참조}.

예를 들어, 쌍자엽 식물은 리신에 대해 61%의 빈도를 가지는 AAG 코돈과 39%의 빈도를 가지는 AAA 코돈을 이용한다. 이와는 대조적으로 Bt 단백질에서는 각각 13%와 87%의 빈도를 가지는 리신 코돈 AAG와 AAA가 사용된다. 일반적으로 계에 해로운 코돈은 잘 사용하지 않으며 사용을 기피하거나 적절히 사용해야 한다는 것은 본 분야에 공지된 바이다. 따라서, Btt 결정 단백질을 암호하는 합성 유전자를 고안함에 있어서, 본래 Btt 유전자 내에서 발견된 각각의 아미노산 코돈을 특정 아미노산에 대해 쌍자엽 식물 유전자에 의해 선호되는 코돈이 반영되도록 변경시킨다. 그러나 유전자의 암호화 부위 내의 각각의 아미노산에 대한 코돈의 분배를 골고루 유지시키는데 주의하여야 한다. 예를 들어 알라닌의 경우에 있어서, Bt 단백질 유전자 내에 50% 빈도로 코돈 GCA가 사용되는 경우, 코돈 GCT가 쌍자엽 식물 단백질에서 선호 코돈임을 표 2에서 알 수 있다. 합성 Btt 유전자를 고안함에 있어서, 원래 Bt 유전자 내의 알라닌에 대한 모든 코돈을 GTC로 치환하지 않는 대신, 다소의 알라닌 코돈만 GTC로 치환하고 쌍자엽 식물 단백질에 사용된 알라닌에 대한 코돈의 분배를 고르게 유지시키기 위하여 그 밖의 것들은 다른 알라닌 코돈으로 치환한다. 표 2의 컬럼 C는 이 목적이 성취된 것임을 입증하며, 쌍자엽 식물 단백질(컬럼 A)에서의 코돈 사용 빈도와 합성 Btt 유전자(컬럼 C)에서의 코돈 사용 빈도는 거의 상응한다.

이와 유사한 방법으로, 살충 결정 단백질을 암호하는 합성 유전자를 단자엽 식물에서의 발현을 증진시키기 위해 최적화할 수 있다. 표 2에서, 컬럼 D는 높은 수준으로 발현되는 단자엽 식물 단백질의 코돈 사용 빈도를 나타낸 것이다.

유전 암호의 변성으로 인해 유전자에 포함된 변이체의 일부분만 이 단백질에서 발현된다. 변성 염기 빈도사이의 다양성은 박테리아, 효모 및 포유동물 유전자에 대하여 보고된 계통적 코돈 선호를 고려하면 자연적인 현상은 아니다. 큰 군의 식물 유전자 서열 분석은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물에 의하여 다르게 사용되는 동의코돈을 나타낸다. 또한 이들 유형은 E. Coli. 효모 및 인체에 대해 보고된 것과는 다르다.

일반적으로, 식물의 코돈 사용 유형은 코돈 위치 Ⅲ 내의 G+C 함량에 대한 전체적인 선호로 인하여 인체의 것과 유사하며 단세포 미생물 보다는 진핵 생물과 더 유사하다. 쌍자엽 식물이 18개의 아미노산 중 단지 7개에 있어 가장 많이 사용된 인체 코돈을 선호한다 할지라도, 본 표본 내의 단자엽 식물은 인체 유전자{Grantham 등의 (1986) 상기 문헌 참조} 표본에 대해 보고된 것으로서 18개의 아미노산 중 13개에 대하여 가장 많이 사용된 코돈을 공유한다.

식물 코돈 사용에 관한 논의는 식물 핵 유전자와 엽록체의 코돈 선택 사이의 차이점에 주목하였다. 엽록체는 그들이 단지 30종의 tRAN 만을 암호한다는 점에서 고등 식물과는 크게 다르다. 엽록체는 그들의 tRAN 유전자로 제한받고 있으므로 엽록체로부터 암호된 단백질에 의한 선호 코돈의 사용은 보다 극단적으로 나타난다. 그러나 주어진 아미노산에 대한 이소악셉팅 tRAN의 수준과 엽록체 게놈에 사용된 이 코돈의 빈도 사이가 정상관임이 보고 되었다{Pfitzinger 등의 (1987) Nucl. Acids Res. 15:1377-1386 참조}.

본 식물 유전자 표본 분석으로, 식물내 핵 및 엽록체의 게놈이 명백한 암호 전략을 지니고 있다는 이전의 보고가 확인된다. 본 표본의 단자엽 식물의 코돈 사용은, 18개의 아미노산 가운데 단지 1개의 아미노산에 대해 보통 가장 많이 사용되는 코돈을 공유하는 엽록체 사용과는 구별된다. 본 표본의 쌍자엽 식물은 18개의 아미노산 가운데 단지 4개의 아미노산에 대해 보통 가장 많이 사용되는 코돈을 공유한다. 일반적으로, 엽록체 코돈 프로필은 세번째 염기의 변성에서 A+T의 사용쪽으로 강한 편성을 지닌 단세포 미생물의 것과 매우 유사하다.

단세포 미생물에 있어서, 높은 수준으로 발현되는 유전자는 다소의 경우 선호 코돈이 다르더라도 약하게 발현되는 유전자 보다 작은 소단위의 코돈을 사용한다. 165 E. Coli 유전자의 코돈 사용에 관한 Sharp 및 Li의 (1986) Nucl. Acids Res. 14:7734-7749 문헌은 높은 수준의 발현과 증가된 코돈 편성 사이에 정상관이 있음을 밝히고 있다. Benntzen 및 Hall의 (1982) 상기 문헌에서는 효모에서도 코돈 선택에 있어서 유사한 경향이 있음을 기술하고 있다. 이들 높은 수준으로 발현되는 유전자내의 코돈 사용은 효모와 E. Coli 둘 다에서 이소악셉팅 tRAN의 풍부함과 상관이 있다. 풍부한 이소악셉팅 tRAN에 대한 풍부한 효모 및 E. Coli mRNA 코돈 사용의 적합성이 이들 단백질의 높은 정상상태 수준과 번역 수준을 촉진한다고 제안되어 왔다. 효모나 E. Coli 내의 식물 유전자의 높은 발현 수준에 대한 잠재성은 그들의 코돈 사용에 의해 제한된다는 사실이 강력히 제안되었다. Hoekema 등의 (1987) 상기 문헌은 25개의 가장 선호되는 효모 코돈을 높은 수준으로 발현되는 유전자 PGK1의 5' 말단의 드문 코돈으로 치환하는 것은 mRNA와 단백질을 모두 감소시킨다고 기술하고 있다. 이 결과는 효모 및 다른 계에서 외인성 유전자를 높은 수준으로 발현시키도록 조작할 때 코돈 편성이 강조되어야 함을 나타낸다.

(ⅲ) 잠재적 불안정성을 지닌 Btt 암호화 부위내 서열

Btt 유전자 분석은 A+T 함량이 암호화 부위내 DNA 염기 조성의 64%임을 나타낸다. 이와 같은 A+T의 수준은 전형적인 식물 암호화 부위에서 발견되는 것 보다 약 10% 높다. 대개 높은 수준의 A+T 부위는 유전자간 부위에서 나타난다. 또한 다수의 식물 조절 서열은 AT가 풍부한 것으로 나타난다. 이와 같은 관찰로, Btt 암호화 부위내의 A+T 함량의 증가가 식물에서는 낮은 발현수단으로 나타날 수 있음이 드러났다. 결과적으로, Btt 유전자를 고안함에 있어서, A+T 함량은 식물 단백질에서 나타나는 A+T 수준에 거의 근접하게 감소한다. 표 3에 나타난 바와 같이 A+T 함량은 식물 핵 유전자의 암호화 부위에서 발견되는 수준으로 감소한다. 본 발명의 합성 Btt 유전자는 55%의 A+T 함량을 갖는다.

또한, 천연 Btt 유전자는 Btt RNA에 대해 잠재적으로 불안정한 서열을 선별한다. 원래 Btt 유전자를 확인할 때, 누클레오티드 서열을 변형시켜 이들 서열을 제거한다. 잠재적으로 불안정한 서열군에 포함되는 서열은 다음과 같다:

(a) 식물 폴리아데닐화 시그널{Joshi의 (1987) Nucl. Acids Res. 15:9627-9640에 기술되어 있음}.

진핵 세포에 있어서, 핵 유전자의 일차 전사는 성숙하고 번역가능한 mRNA를 형성하기 위한 프로세싱이 광범위한다(5'-캐핑(capping), 인트론 접합, 폴리아데닐화 단계를 포함함).

고등 식물에 있어서, 폴리아데닐화는 폴리 A 부위를 엔도누클레아제로 절단하고 나서 그 절단된 말단에 몇 가지 A 잔기를 가함을 포함한다. 폴리 A 부위의 선택은 시스형으로 조절된 것이라고 추정된다. 본 출원인은 다른 식물에서 Bt 단백질 및 RNA가 발현되는 동안 이들 발현계로부터 분리된 폴리아데닐화된 mRNA가 전체 길이가 아니라 절두되었거나 분해된 것임을 관찰하였다. 따라서 본 발명은 합성 Btt 유전자의 암호화 부위 내의 잠재성 폴리아데닐화 시그널을 제거하여 RNA의 가능한 불안정화가 최소화됨을 결정하였다. AATAAA, AATGAA, AATAAT, AATATT, GATAAA, GATAAA, 및 AATAAG 모티프를 함유하는 식물 폴리아데닐화 시그널은 서열 가운데 잘못 대응된 것이 0인 것으로 선별할 때 합성 Btt 유전자 내에서 나타나지 않는다.

(b) 폴리머라제 Ⅱ 종결 서열, CANAGTNNAA, 이 서열은 아라비돕시스탈리아나(Arabidopsis thalians)의 U2 snRNA 유전자의 암호화 부위 3' 말단 다음에 나타나며{Vankan 및 Filipowicz의 (1988) EMBO J. 7:791-722참조}, 3' 말단 프로세싱에 대한 전사 종결시 중요한 것으로 여겨진다. 합성 Btt 유전자는 이 종결 서열이 전혀 없다.

(c) 특별히 안정된 RNA 이차 구조에 관하여는 CUUCGG 헤어핀은 다양한 생화학 프로세싱과 관계있다{Tuerk 등의 (1988) Proc. Natl. Acad, Sci. 85:1364-1368 참조}. CUUCGG 헤어핀의 예외적인 안정도는 이들이드문 구조를 가지며 복합체 RNA 구조의 적당한 접힘을 조작화하는데 작용함을 나타낸다. CUUCGG 헤어핀 서열은 Btt 암호화 부위내의 잘못 대응된 것이 0 또는 1로 나타나지 않는다.

(d) Brown 등의 (1986) EMBO J. 5:2749-2758문헌에 기술된 바와 같은, 식물의 칸센서스 접합 부위, 5'=AAG:GTAAGT 및 3'-TTTT(Pu)TTT(Pu)T(Pu)T(Pu)T(Pu)TGCAG:C.

5'과 3' 접합 부위에 대한 칸센서스 서열은 각각 20개 및 30개의 식물 인트론 서열로부터 유도된 것이다. 이와 같은 잠재성 접합 서열이 Bt 유전자에 존재할 것 같지는 않지만, 합성 Btt 유전자에서 식물의 칸센서스 접합 부위와 유사한 서열에 대한 연구를 시작하였다. 5' 접합 부위에서는 가장 가까운 세 개의 대응이 잘못 대응되었다. 이는 두 개가 G;GT를 가지는 12개의 서열을 제공하였다. 위치 1323이 재구성에 필요한 KpnI 부위를 가지므로 단지 위치 948만이 변하였다. 3'-접합부위는 합성 Btt 유전자에서 발견되지 않았다.

따라서 잠재성 RNA-불안정한 서열을 두드러지게 함으로써, RNA 합성 및 프로세싱에 효과적인 공지된 진핵 세포 조절 서열을 제거하도록 합성 Btt 유전자를 고안한다.

[실시예 2]

[변형된 Btt 구조 유전자의 화학 합성]

(i) 합성 전략

Btt로부터 결정 단백질을 암호하는 선형의 이중가닥 DNA 서열을 합성하기 위한 일반적인 과정은 제2도에 개략적으로 요약되어 있다. 최적의 DNA 암호화 서열(제1a, 1b 및 1c도)을 각각 합성할 수 있도록 13개의 분절(분절 A-M)로 나누고, 분리하여 정제하였다. 제2도에 나타나는 바와 같이, 일반적인 전략은 불전 A와 M을 효소적으로 결합시켜 분절 AM을 형성하고 여기에 분절된 BL을 가하여 분절 ABLM을 형성함으로써 시작한다. 그리고 나서 분절 CK를 효소적으로 가하여 분절 ABCKLM을 형성하고 분절 DJ, EI, FGH를 순서대로 가함으로써, 최종적으로 Btt 유전자의 전체적인 암호화 부위를 나타내는 전체 분절 ABCDEFGHIJKLM을 제조한다.

제3a 및 제3b도는 한정된 누클레오티드 서열내에 삽입된 독특한 제한부위를 지닌 유전자를 합성하기 위해 각각의 DNA 분절을 결합시키는데 사용되는 보다 상세한 전략의 개요를 나타낸 것이다. 각각 13개의 분절(A 내지 M)은 이 분절이 전략적으로 성장 DNA 중합체로 접합될 수 있도록 양 말단에 독특한 제한부위를 갖는다. 또한, 독특한 부위는 유전자의 각 말단에 위치하여 한 벡터에서 다른 벡터로 쉽게 전이될 수 있다.

13개의 분절(A 내지 M)은 다양한 크기를 가지는 합성 유전자의 구성에 사용된다. 각각 약 75개의 누클레오티드를 가지는 올리고누클레오티드 쌍은 약 255개의 누클레오티드 쌍을 가지는 보다 큰 분절을 구성하는데 사용된다. 제3a 및 3b도는 각각의 분절 내에 포함된 염기쌍의 수를 나타낸 것이며, 각 분절에 상접하는 독특한 제한부위를 구체화한 것이다. 또한, 적합한 접합 부위에 특히 분절을 삽입시키는 전체 전략도 제3a 및 3b도에 나타나 있다.

(ii) 올리고디옥시누클레오티드의 제조

Btt에 대한 유전자를 포함하는 DNA 서열의 합성에 사용하기 위한 올리고디옥시누클레오티드의 제조는 Matteucci 등의 (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3192 및 Beaucage 등의 (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862문헌에 기술된 일반적인 방법에 따라 실시한다. 모든 올리고누클레오티드는 어플라이드 바이오시스템스 모델 380A DNA 합성기를 사용하여 고체상의 포스포라미다이트트리에스테르 커플링 방법으로 제조한다. 고체 지지체로부터 올리고머의 탈보호 및 절단은 표준 방법에 따라 수행한다. 조(粗) 올리고누클레오티드 혼합물은 MeBride 등의 (1988) Biotechniques 6:362-367 문헌에 기술된 바와 같이 올리고누클레오티드정제 카트리지(OTC, 어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 정제한다.

올리고누클레오티드의 5' 인산화반응은 T4 폴리누클레오티드 키나제를 사용하여 수행한다. 이 반응물은 2㎍의 올리고누클레오티드 및 링커 키나제 완충액{Maniatis (1982) Cloning Manual, Fritsch 및 Sambrook(eds.), 뉴욕 콜드 스프링 하버 콜드 스프링 하버 라보라토리} 내의 18.2 단위의 폴리누클레오티드 키나제(파마시아)를 포함한다. 이 반응물을 37℃에서 1시간 동안 항온시킨다.

올리고누클레오티드를 95℃로 5분간 일차 가열하고 나서 상보쌍이 형성되도록 실온까지 서서히 냉각시켜 아닐링시킨다. 아닐링된 쌍을 65℃로 재가열한 후 용액을 혼합하고 실온까지 서서히 식혀, 사용할 때까지 얼음상에서 유지시킨다. 이 결합된 혼합물을 4%의 누시브(nusieve) 아가로스(FMC) 겔을 통하여 전기이동시킴으로써 정제할 수 있다.

결합된 이중체에 상응하는 밴드를 절단하고, 아가로스로부터 이 DNA를 추출하고 에탄올 침전시킨다.

M 분절 결합에 사용한 방법으로 예시한 바와 같이 결합을 수행한다. M 분절 DNA를 65℃로 25분간 둔 후, 바람직한 벡터에 가하고 이 반응 혼합물을 65℃에서 15분간 항온시킨다. 반응물을 1-1/2 시간 이상 실온으로 서서히 냉각시킨다. 3.5단위의 T4 DNA 리가제 염과 0.5mM에 이르는 ATP를 가한 후 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 항온시키고 나서 밤동안 15℃에서 유지시킨다. 다음날 아침, M 블록 DNA에 결합되지 않은 벡터는 E. coli MC1061을 형질전환시키는데 사용한다. 삽입된 블록을 포함하는 콜로니는 p-로 표지한 올리고누클레오티드 프로브와 함께 콜로니 혼성화하여 확인한다. DNA 분절의 서열은 플라스미드 DNA를 분리하고 Sanger 등의 (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467 문헌의 디데옥시 방법을 사용하여 서열결정하여 확인한다.

(iii) 분절 AM의 합성

세 쌍의 올리고누클레오티드(A1과 그의 상보 가닥 A1c, A2와 A2c 및 A3와 A3c)를 조합시킨 후 분절 A를 제조하기 위하여 상기와 같은 방법으로 결합시킨다.

분절 A의 누클레오티드 서열은 다음과 같다:

표 4에서 굵은 선은 각각의 올리고누클레오티드를 구분짓는다. 단편 A1은 71개의 염기를 포함하며, A1c는 76개의 염기, A2는 75개의 염기, A2c는 76개의 염기, A3는 82개의 염기 및 A3c는 76개의 염기를 각각 포함한다. 전체적으로 분절 A는 228개의 염기쌍으로 구성되며 EcoRI 제한효소 부위와 파괴된 하나의 EcoRI 부위(5') J 사이에 포함된다(분절 A 내의 부가 제한부위가 표시되어 있음).

EcoRI 단일가닥 코히시브 말단은 분절 A를 어닐링시킨 후 EcoRI-절단 클로닝 벡터인 pIC20K에 결합되도록 한다.

분절 M은 다음 세 쌍의 올리고누클레오티드를 포함한다:M1, 80개의 염기, M1C, 86개의 염기, M2, 87개의 염기, M2c, 87개의 염기, M3, 85개의 염기 및 M3c, 79개의 염기. 상기 표준 방법에 따라 각각의 올리고누클레오티드를 어닐링하고 결합시킨다. 분절 M의 전체 누클레오티드 서열은 다음과 같다:

표 5에서 굵은 선은 각각의 올리고누클레오티드를 구분짓는다. 분절 M은 252개의 염기쌍을 포함하며 양쪽 말단에 파괴된 EcoRI 제한부위를 갖는다(분절 M 내에 부가 제한부위가 표시되어 있음). 분절 M을 EcoRI 제한부위에서 벡터내로 삽입시키고 클로닝시킨다.

제3도에 나타난 바와 같이, 분절 M을 플라스미드 내에 포함된 분절 A와 결합시킨다. 분절 M을, 자체 클로닝 벡터로부터의 측면 제한부위를 삭제하고 HindIII 절단에 이어서 BgIII로 성공적으로 절단시켜 분절 A를 포함하는 pIC20K 내로 접합시킨다. 따라서 pIC20K 벡터는 접합 부위에 hindIII 부위를 지닌 분절 M과 결합된 분절 A를 포함한다(제3a 및 3b도 참조). 플라스미드 pIC2K는 ScaI-NdeI DNA 단편을 제거하고 NPTI 암호화 부위를 포함하는 HincII 단편을 삽입함으로써 pIC20R로부터 유도시킨다. 그 결과 생성되는 4.44kb의 플라스미드는 E.coli 상의 카나마이신에 대한 저항성을 제공한다.

[실시예 3]

[박테리아계에서 합성 결정 단백질 유전자의 발현]

합성 Btt 유전자는 pIC20R-kan 벡터 내에 구성시켜 발현되도록 고안한다. pIC20K의 lacZ 단백질의 개시 메티오닌을 사용하여 발현을 진행시킨다. 이러한 방법으로 발현시킨 야생형 Btt 결정 단백질 서열은 완전한 살충 활성도를 갖는다. 또한, 합성 유전자는 개시 메티오닌 코돈에 근접하도록 5' BamH 부위를 포함하고 말단의 TAG 번역 정지 코돈에 3' BgIII 부위를 포함하도록 고안한다. 이로써 pDR540{RusseII 및 Bennett의 (1982) 참조}과 같은 박테리아 발현 벡터내로 살충 결정 단백질 암호화 부위의 클로닝이 촉진된다. 플라스미드 pDR540은 조절된 조건하에서 전체 박테리아 단백질의 10%에 이르는 양의 Btt 결정 단백질을 포함하는 단백질을 생성하도록 하는 TAC 프로모터를 포함한다. 이 프로모터는 E.coli 및 슈도모나스(Pseudomonas)를 포함하는 다수의 그람-음성 박테리아에서 작용한다. 박테리아 내의 합성 유전자로부터 Bt 살충 결정 단백질이 생성됨으로써 이 생성 단백질이 갑충류에 대한 예상 독성을 지니고 있다는 것이 증명된다.

[실시예 4]

[식물내에서 합성 결정 단백질 유전자의 발현]

합성 Btt 결정 단백질 유전자는 발현 카세트(cassette)내로 클로닝이 용이하도록 고안한다. 이들은 합성 유전자의 측면에 있는 BamHI 및 BgIII 제한부위와 양립할 수 있는 부위를 이용한다. 카세트는 T-DNA로부터의 CaMV 35S, CaMV 19S 및 ORF 24 프로모터를 함유하는 식물 프로모터를 이용할 수 있다. 이들 카세트는 식물내의 단백질 발현에 필수적이 인식 시그널을 제공한다. 이들 카세트는 pH575와 같은 마이크로 Ti 플라스미드에 사용된다. 식물 발현 시그널에 의해 지시된 합성 Btt 유전자를 포함하는 pH575와 같은 플라스미드는 식물 게놈 DNA내로 합성 유전자가 도입되도록 위험을 제거한 아그로박테리움 투메파시엔스에서 사용한다. 이러한 계는 담배 식물내의 Bt 변이체 쿠르스타키 결정 단백질 유전자의 발현에 관한 Adang 등의 (1987) 문헌에 이미 기술되어 있다. 이들 담배 식물은 담배의 박각시나비 유충에 독성을 나타냈다.

[실시예 5]

[살충 활성도 분석]

기본적으로 Sekar. V. 등의 상기 문헌에 기술된 방법으로 생물학적 분석을 실시하였다. 독성은 LD으로 평가하였다. 플라스미드를 E. coli JM105에서 성장시켰다{Yanish-Perron, C. 등의 (1965) Gene 33:103-119 참조}. p544Pst-Met5, p544-HindIII 및 pNSBP544에 의해 암호된 결정 단백질 사이에는 몰 성분을 기초로 할 때 그 독성에 있어서 큰 차이는 없었다. 동일 조건하의 식물에서 발현시켰을 때, 합성 유전자에 의해 암호된 단백질을 포함하는 세포는 천연 Btt 유전자에 의해 암호된 단백질을 포함하는 세포 보다 더 독성이 강하였다. 세포 배양주의 면역블롯(웨스턴블롯) 결과 결정 단백질 항원이 많일수록 더 독성임을 나타냈다. 천연 Btt 유전자의 발현에 비해 증진된 합성 Btt 유전자의 발현은 노던 블롯 분석에 의해 합성 Btt 유전자 발현으로부터의 mRNA 전사물을 정량하여 확인하였다.

Claims (30)

1. 다음 단계를 포함하는, 증진된 식물내 발현을 위한 합성 B.t. 유전자의 제조방법:(a) 코돈 사용표를 획득하는 단계, (b) 천연 B.t. 유전자의 코돈 사용 빈도를 상기 코돈 사용표에 나타나 있는 바와 같은 식물의 코돈 사용 빈도와 비교함으로써 천연 B.t. 유전자의 누클레오티드 서열을 분석하는 단계 및 (c) 합성 B.t. 유전자가 상기 코돈 사용표에 나타나 있는 식물의 코돈 사용 빈도와 실질적으로 동등한 코돈 사용 빈도를 갖도록 천연 B.t. 유전자의 서열을 변형시키는 단계.
2. 다음 단계를 포함하는, 증진된 식물내 발현을 위한 합성 B.t. 유전자의 제조방법:(a) 코돈 사용표를 획득하는 단계, (b) 천연 B.t. 유전자의 코돈 사용 빈도를 상기 코돈 사용표에 나타나 있는 바와 같은 식물의 코돈 사용 빈도와 비교함으로써 천연 B.t. 유전자의 누클레오티드 서열을 분석하는 단계 및 (c) 상기 코돈 사용표에 비선호되는 식물 코돈으로서 나타나 있는 천연 B.t. 유전자의 코돈을 상기 코돈표에 가장 선호되는 식물 코돈으로서 나타나 있는 코돈으로 대체함으로써 천연 B.t. 유전자의 서열을 변형시키는 단계.
3. 제1항에 있어서, 상기 변형 단계는 상기 코돈 사용표에 비선호되는 식물 코돈으로서 나타나 있는 천연 B.t. 유전자의 코돈을 상기 코돈표에 가장 선호되는 식물 코돈으로서 나타나 있는 코돈으로 대체하는 것을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 변형 단계는 합성 B.t. 유전자의 암호화 부위가 60%의 A+T 함량을 갖도록 코돈을 대체하는 것을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 변형 단계는 합성 B.t. 유전자의 암호화 부위가 60%의 A+T 함량을 갖도록 코돈을 대체하는 것을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 암호화 부위의 A+T 함량이 약 55%임을 특징으로 하는 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 암호화 부위의 A+T 함량이 약 55%임을 특징으로 하는 제조방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 변형 단계는 상기 합성 유전자를 산출하기 위해 천연 B.t. 유전자의 암호화 서열내 최소한 약 32%의 코돈을 대체하는 것을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제2항에 있어서, 상기 변형 단계는 상기 합성 유전자를 산출하기 위해 천연 B.t. 유전자의 암호화 서열내 최소한 약 32%의 코돈을 대체하는 것을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 합성 유전자를 산출하기 위해 천연 B.t. 유전자의 암호화 서열내 최소한 약 11%의 누클레오티드를 변경시킴을 특징으로 하는 제조방법.
11. 제2항에 있어서, 상기 합성 유전자를 산출하기 위해 천연 B.t. 유전자의 암호화 서열내 최소한 약 11%의 누클레오티드를 변경시킴을 특징으로 하는 제조방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 변형 단계는 천연 B.t. 유전자의 암호화 서열내에 식물 폴리아데닐화 시그널간 부위의 코돈 위치 II 및 III에서 CG를 갖는 코돈의 수를 감소시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
13. 제2항에 있어서, 상기 변형 단계는 천연 B.t. 유전자의 암호화 서열내에 식물 폴리아데닐화 시그널간 부위의 코돈 위치 II 및 III에서 CG를 갖는 코돈의 수를 감소시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 변형 단계는 결과적으로 서열 AATGAA가 천연 B.t. 유전자에서 보다 상기 합성 B.t. 유전자에서 더 적게 발생되게 함을 특징으로 하는 제조방법.
15. 제2항에 있어서, 상기 변형 단계는 결과적으로 서열 AATGAA가 천연 B.t. 유전자에서 보다 상기 합성 B.t. 유전자에서 더 적게 발생되게 함을 특징으로 하는 제조방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 변형 단계는 결과적으로 식물 폴리아데닐화 시그널이 천연 B.t. 유전자에서 보다 상기 합성 B.t. 유전자에서 더 적게 발생되게 함을 특징으로 하는 제조방법.
17. 제2항에 있어서, 상기 변형 단계는 결과적으로 식물 폴리아데닐화 시그널이 천연 B.t. 유전자에서 보다 상기 합성 B.t. 유전자에서 더 적게 발생되게 함을 특징으로 하는 제조방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 변형 단계는 결과적으로 서열 ATTTA가 천연 B.t. 유전자에서 보다 상기 합성 B.t. 유전자에서 더 적게 발생되게 함을 특징으로 하는 제조방법.
19. 제2항에 있어서, 상기 변형 단계는 결과적으로 서열 ATTTA가 천연 B.t. 유전자에서 보다 상기 합성 B.t. 유전자에서 더 적게 발생되게 함을 특징으로 하는 제조방법.
20. 다음 단계를 포함하는 방법으로 제조한, 식물내 발현이 증진되는 합성 B.t. 유전자:(a) 코돈 사용표를 획득하는 단계, (b) 천연 B.t. 유전자의 코돈 사용 빈도를 상기 코돈 사용표에 나타나 있는 바와 같은 식물의 코돈 사용 빈도와 비교함으로써 천연 B.t. 유전자의 누클레오티드 서열을 분석하는 단계, (c) 상기 코돈 사용표에 비선호되는 식물 코돈으로서 나타나 있는 천연 B.t. 유전자의 코돈을 상기 코돈표에 가장 선호되는 식물 코돈으로서 나타나 있는 코돈으로 대체함으로써 천연 B.t. 유전자의 서열을 변형시키는 단계, (d) 상기 합성 B.t. 유전자를 식물 세포내로 도입시키는 단계 및 (e) 상기 합성 B.t. 유전자를 함유하는 자손세포가 생산되도록 하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계.
21. 제20항에 있어서, 상기 배양 단계는 결과적으로 상기 자손세포로부터 식물을 재생시킴을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.
22. 제21항에 있어서, 상기 단계는 상기 합성 B.t. 유전자를 함유하는 세포를 포함하는, 상기 식물의 자손을 배양하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.
23. 제22항에 있어서, 상기 변형 단계는 합성 B.t. 유전자의 암호화 부위가 60%의 A+T 함량을 갖도록 코돈을 대체하는 것을 포함함을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.
24. 제23항에 있어서, 상기 암호화 부위의 A+T 함량이 약 55%임을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.
25. 제22항에 있어서, 상기 변형 단계는 상기 합성 유전자를 산출하기 위해 천연 B.t. 유전자의 암호화 서열내 최소한 약 32%의 코돈을 대체하는 것을 포함함을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.
26. 제22항에 있어서, 상기 합성 유전자를 산출하기 위해 천연 B.t. 유전자의 암호화 서열내 최소한 약 11%의 누클레오티드를 변경시킴을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.
27. 제22항에 있어서, 상기 변형 단계는 천연 B.t. 유전자의 암호화 서열내에 식물 폴리아데닐화 시그널간 부위의 코돈 위치 II 및 III에서 CG를 갖는 코돈의 수를 감소시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.
28. 제22항에 있어서, 상기 변형 단계는 결과적으로 서열 AATGAA가 상기 천연 B.t. 유전자에서 보다 상기 합성 B.t. 유전자에서 더 적게 발생되게 함을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.
29. 제22항에 있어서, 상기 변형 단계는 결과적으로 식물 폴리아데닐화 시그널이 천연 B.t. 유전자에 비해 상기 합성 B.t. 유전자에서 더 적게 발생되게 함을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.
30. 제22항에 있어서, 상기 변형 단계는 결과적으로 서열 ATTTA가 천연 B.t. 유전자에서 보다 상기 합성 B.t. 유전자에서 더 적게 발생되게 함을 특징으로 하는 합성 B.t. 유전자.

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