KR0159990B1 - 고혈압 치료제 조성물 및 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 고혈압 치료제 조성물 및 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법에 관한 것으로, 칼슘통로 차단제, 칼슘보충제, 및/또는 비타민 D를 공동투여함을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물 및 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법에 관한 것이다.

발명자들은, 부갑상선에서 유래하는 세포내 칼슘흡수의 조절과 관련하여 포유동물의 고혈압과 관련된 고혈압성 순환인자를 확인함에 따라 칼슘통로차단제와 칼슘보충제 및/또는 비타민 D를 공통 투여하여 기존의 칼슘통로차단제의 부작용을 줄이고, 상승효과를 얻을 수 있는 신규한 고혈압 치료제 조성물을 제공하게 되었다.

칼슘통로차단제와 칼슘보충제를 포함하는 치료제 조성물을 사용함으로써 보다 적은 양의 칼슘통로 차단제를 사용하여 더 큰 항고혈압 효과를 얻을 수 있으므로 치료효과가 상승되고 부작용이 감소될 뿐만 아니라 칼슘통로차단제 용량을 줄임에 따라 치료비용도 상당히 절감될 수 있는 효과가 있다.

Description

고혈압 치료제 조성물 및 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법

제1도는 실시예 3에 의거한 SHR랫트 혈장에 대한 용출 그래프이다.

제2도는 (a)는 제1도의 SHR랫트 혈장샘플의 역상 HPLC분리 그래프이다.

제2도는 (b)는 WKY랫트 혈장의 HPLC 그래프이다.

제3도는 세포로 칼슘이 유입하는 메카니즘과 그 메카니즘 조절의 개략도이다.

제4도는 SHR, SD, WKY랫트로부터 얻은 혈장을 주입한 SD랫트의 평균동맥압변화를 나타낸 것이다.

제5도는 SHR, SD, WKY랫트로부터 얻은 혈장을 주사한 SD랫트의 평균 동맥압변화를 나타낸 것이다.

제6도는 SD, WKY, SHR랫트의 혈장을 함유하는 크렙스 완충액에서 배양된 랫트꼬리 동맥부위(tail arterial sections)의⁴⁵Ca 흡수를 도시한 것이다.

제7도는 분자 익스크루젼 크로마토그래피(molecular exclusion chromatography)로 분리한 SHR랫트 혈장의 이상분획(anomalous fraction)을 투여한 SD랫트의 평균동맥압 변화를 나타낸 것이다.

제8(a)도는 SHR랫트의 갑상선을 이용한 부갑상선 세포배양으로부터 얻은 배양배지의 역상 HPLC 그래프이다.

제8(b)도는 WKY랫트의 부갑상선 세포배지의 비교그래프이다.

제9(a)도는 14KD 스탠다드(standard)를 사용한 SDS-PAGE 겔 스캔(scan)이다.

제9(b)도는 8시간 배양후에 SD랫트의 부갑상선 추출물에 대한 겔 스캔(scan)이다.

제9(c)도는 8시간 배양후에 SHR랫트의 부갑상선 추출물에 대한 겔 스캔(scan)이다.

제10(a)도는 스프라그-다울리(sprague-Dawley)갑상선 세포(12시간 배양) 배양배지로 행한 SDS-PAGE 겔의 스캔이다.

제10(b)도는 4시간 배양후에 SHR랫트 갑상선세포 배양물 배지의 스캔이다.

제10(c)도는 12시간 배양후에 SHR랫트 갑상선세포 배양물 배지의 스캔이다.

제10(d)도는 14KD 스탠다드를 이용한 겔 스캔이다.

제11도 및 제12도는 표 1에 기재된 데이터의 그래프이다.

제13도는 칼슘흡수를 증가시키는 시스템에 의해 혈관 평활근 수축을 자극하는 방법을 설명한 것이다.

제14도는 칼슘 보충제 단독 투여의 유익효과 및 손상효과를 설명한 것이다.

제15도는 칼슘 길항물질의 유익효과 및 손상효과를 설명한 것이다.

제16도는 복합 요법의 잇점을 설명한 것이다.

제17도는 PHF 혈장과 세포배양 배지의 등전성 포커싱 겔이다.

본 발명은 신규한 고혈압 치료제 조성물 및 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법에 관한 것으로, 칼슘통로 차단제, 칼슘보충제, 및/또는 비타민 D를 공동투여함을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물 및 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법에 관한 것이다.

발명자들은, 부갑상선에서 유래하는 세포내 칼슘흡수의 조절과 관련하여 포유동물의 고혈압과 관련된 고혈압성 순환인자를 확인함에 따라 칼슘통로차단제와 칼슘보충제 및/또는 비타민 D를 공동 투여하여 기존의 칼슘통로차단제의 부작용을 줄이고, 상승효과를 얻을 수 있는 신규한 고혈압 치료제 조성물을 제공하게 되었다.

일반적으로 고혈압은, 수축기 및/또는 확장기 동맥혈압이 140/90mmHg이상으로 상승하는 것으로 정의된다. 고혈압과 관련된 질병으로는 동맥경화증, 고혈압성 신부전증, 뇌졸중, 울혈성심부전 및 심근경색증 등이 있다. 동맥혈압을 낮추기 위한 효과적인 치료방법들이 다수 알려져 있음에도 불구하고, 본태성 고혈압의 병인은 알려지지 않은 상태이다. 일반적으로 고혈압의 병인이 유전에 의한 것으로 생각되어지고 있으나, 상기 약물들이 서로 다른 약리학적인 반응(response)을 유발하도록 작용한다는 사실은 본태성 고혈압에는 다른 일차적인 원인이 있다는 것을 시사해 준다.

하나 또는 그 이상의 순환인자들이 고혈압의 발생 또는 지속에 중요한 역할을 할 수 있다는 다수의 연구들이 제시되었다. [참조 : 라이트(wright)등, 자발적 고혈압성 랫트의 혈액에서 발견된 고혈압성 물질; Life Sci 1984 : 34 : 1521-1528 ; 달(Dahl)등, 고혈압의 액소성전이(humoral transmission): 부생(parabiosis)으로 부터의 입증; Circ Res. 1969 ; 24/25(Suppl. I)21-23 ; 그린버그(Greenberg)등, 자발적 고혈압성 랫트에 있어서 정맥비대의 원인으로서 순환인자의 입증 ; Am. J.

Physiol. 1981 ; 241 ; H421-H430 토비안(Tobian)등, 염고혈압증의 달(Dahl) S랫트에 있어서 순환액소성 승압제 ; Clin. Sci. 1979 ; 57 : 345s-347s ; 지덱크(Zidek)등, 본태성 고혈압의 발병학에 있어서의 액소성 인자 ; Klin Wochenschr. 1985 ; 63(Suppl.Ⅱ) D ; 94-96 ; 히라따(Hirata)등, 고혈압성 달 염감응 랫트 혈청중의 고혈압 생성인자 ; Hypertension 1984 ; 6 : 709-716].

예를 들면 부생 및 교차순환(cross-circulation) 실험에 있어서, 정상혈압의 동물이 고혈압성 동물의 혈액에 노출됨으로써 정상인 동물에서 혈압 상승이 유발된다. 즉, 자발적 고혈압성 랫트(SHR)로부터 얻은 적혈구 관련인자를 정상혈압의 위스타르-교오또(Wistar-Kyoto)(WKY) 랫트에 피하주사하면 고혈압이 유발되는 것을 알 수 있으며, 고혈압성 염감응 달(Dahl) 랫트의 혈청을 정상혈압의 염감응 달랫트에 주입하면 혈압상승이 유발될 수 있다.

또한 고혈압성 랫트 및 고혈압성의 사람 모두에서 순환 인자가 세포내 칼슘을 증가시킨다는 보고서들도 있다. [참조 ; 바노스(Banos)등, 본태성 고혈압 환자의 혈소판에서 칼슘 흡수의 증가와 관련된 두가지 인자 ; Clin. Exp. Hypertens. 1987 ; 9 : 1515-1530 ; 지데크(Zidek)등, 고혈압 환자 혈장이 투과성 인간 호중구에서의 칼슘수송에 미치는 효과 ; clin Sci. 1988 ; 74 ; 53-56 ; 린더(Linder)등, 본태성 고혈압 환자의 순환인자가 정상 혈소판에서의 세포내 유리칼슘에 미치는 효과 ; N. Eng. J. Med. 1987 ; 316 ; 509-513 ; 브루쉬(Brushi)등, 자발적 고혈압성 랫트와 본태성 고혈압 환자의 혈소판에 있어서 세포질 유리칼슘의 증가 ; Clin. Sci. 1985 ; 68 ; 179-184 ; 라이트(Wright)등, 고혈압성을 갖는 자발적 고혈압성 랫트 적혈구 추출물에 의한 대동맥 조직 칼슘 흡수의 자극 ; Can. J. Physiol Pharmacol. 1986 ; 64 : 1515-1520.]

혈관장력은 세포내 칼슘의 농도에 의해 영향을 받기 때문에, 아직까지 실험적으로 증명도지는 않았음에도 불구하고, 혈압을 상승시키는 인자들과 세포질내 칼슘을 증가시키는 인자들이 서로 관련이 있는 것으로 보는 것이 타당하게 여겨진다. 칼슘 조절 호르몬이 여러 형태의 고혈압에 관여함을 제시하는 증거가 있다. [참조 ; 엘. 엠. 레스닉(L.M.Resnick), Am. j. Med. 82(Suppl.1B) 16(1987)]. 부갑상선 호르몬(Parathyroid Hormone ; PTH)은 칼슘조절 호르몬이다. 본태성 고혈압 환자의 30% 이상은, 면역 반응성 부갑상선 호르몬(ir-PTH) 농도가 증가됨이 특징인 부분군(subgroup)에 해당한다. [참조 ; 라라호(Laragh)등, Kidney Int. 34,(Suppl. 35), S162(1988)]. PTH농도의 상승은 SHR 랫트의 경우에서 보고되고 있으며 [참조 ; 맥카론(McCarron)등, Hypertension 3(Suppl. 1), I162(1981))] 부갑상선 기능 항진증(hyperparathyroid) 환자들에게는 종종 고혈압 증세가 나타나는데, 대부분의 경우에 있어서는 부갑상선 절제술에 의해 그 괴로움이 감소될 수 있다. [참조 ; 헬스트롬(Hellstrom)등, Brit. J. Urol. 30, 13(1958)]. 또한 이와 유사한 부갑상선 절제술의 결과가 SHR 랫트의 경우에서도 보고되어 있다. [참조 ; 슐레퍼(Schleiffer)등, Jap. Circ. J. 45, 1272(1981)]. PTH를 외부로부터 투여하는 것은 포유동물 및 다른 척추동물의 혈압을 감소시킴에도 불구하고, 많은 연구자들이 PTH가 본태성 고혈압을 진전시킨다는 것을 발표했다[참조 ; 팡(Pang)등, Gen. Comp. Endocrinol. 41, 135(1980))]. 또한 이러한 PTH의 혈관확장 작용은, 과칼슘혈 효과를 나타내는 부위로부터 분리된 특정부위의 분자와 관련이 있다[참조 ; 팡(Pang)등, Endocrinology, 112, 284(1983)]. 또한 PTH는 L형 칼슘통로[참조 ; 왕(wang)등, 공개를 위해 제출됨)을 통한 혈관 평활근으로의 칼슘유입을 억제하는 것으로 밝혀졌다. [참조 ; 팡(pang)등, Life Sci 42. 1395(1988))]. 이러한 모순은 PTH 농도가 증가되어 있는 고혈압 환자에게서 혈청이온화 칼슘 농도는 감소 되는 것으로 나타난다는 사실에 의해 더욱 극명해진다 [ 참조 ; 레스닉(Resnick)등, New Engl. J. Med. 309. 888(1983) ; 바프너(Hvarfner)등, Acta Med. Scand. 219. 461(1986)]. 혈청 이온화칼슘농도는 일차적으로 PTH가 상승될 경우에 상승되는 것으로 짐작된다.

본태성 고혈압에 부갑상선이 관계하는 것은 명백하지만 혈관계(Vaculature)에 미치는 PTH의 작용에 관한 기준 문헌들은 PTH가 본태성 고혈압의 원인이 되는 역할과는 일치하지 않는다. 본 발명이 완성되었을 때까지 PTH는 단지 부갑상선에 의해 생산되는 것으로 보고된 활성호르몬이었다.

칼슘통로 차단제(calcium channel blockers)는 플렉큰스타인(Fleckenstein)등의 z. Kreislaufforsch. 56. 716(1967)에 의해 보고된 바와 같이 고혈압의 조절방법으로서 확인되었으며, 고혈압의 조절에 통상적으로 사용되었다. 세 종류의 칼슘통로차단제 즉, 베라파밀(Verapamil), 니페디핀(Nifedipine) 및 딜티아젬(Diltiazem)이 현재 미국에서 임상적으로 중요하게 취급되고 있으며 이들 모두는 혈관평활근으로의 칼슘이온 유입을 억제함으로서 항고혈압효과를 얻게 한다. 궁극적인 효과는 혈관 확장이다. 칼슘통로 차단제는 혈관평활근으로의 칼슘 흡수를 제한하기 때문에 유용하지만, RAS계와 같은 몇몇 내분비계를 자극하는 것으로 알려졌다. [코첸(Kotchen)등 Am. j. Cardiol. 62 41G(1998) ; 마쓰마라(Matsumara)등, J. Pharmacol. Exp. Ther. 241. 1000(1978) ; 레스닉(Resnick)등 Fed. Proc. 45 2739(1986)]. 칼슘통로차단제는 과혈관확장, 근벽력작용음성(negative inotrophy), 동결절율(sinus nodal rate)의 과저하, 방실결절 전도장해 및 비혈관 평활근수축과의 간섭 등을 일으킬 수 있으므로 그 이용이 제한될 수 있다. 따라서 소정의 항고 혈압 효과를 얻기 위해서 요구되는 칼슘통로차단제의 양을 최소화하는 복합 요법이 바람직하다.

부갑상선에서 유래한, 이전에는 보고되지 않았던 순환인자의 존재가 본태성 고혈압을 가진 SHR랫트 및 많은 사람들에게서 입증된다. 그 인자는 세포내칼슘 흡수를 조절한는 것으로 보여지고 식이(dietary)칼슘수치의 증가에 의해 억제될 수 있다. 상기 순환인자를 분리하였으며, 그 인자에 대응하여 발생하는 항체를 이용하여 순환인자를 스크리닝하는 방법을 설명하였다. 상기 순환인자는 분자량이 약 3,000∼4,000이다.

생물학적 분석(bioassay) 데이터로부터 사람과 랫트의 순환인자는 실질적으로 유사한 것으로 밝혀졌다. 순환인자는 본태성고혈압을 가진 사람에 있어서 전부는 아니지만 상당히 많은 사람에게 존재한는 것으로 나타나며 특히 저레닌(low-renin) 고혈압과 관련되어 있다. 고혈압 환자에서의 순환인자 확인은 고혈압의 영향을 없애기 위한 치료요법을 계획하고 모니터(monitor)하는데 사용될 수 있다.

또한, 식이칼슘보충제와 칼슘통로차단제를 조합하여 사용하는 것은 고혈압치료에 있어서 효과적인 방법이며, 이 두 물질을 이용하는 복합요법은 이 물질들을 단독으로 사용하였을 때 보다 더욱 효과적이며 확실하다는 것을 알게 되었다.

그 효과는 두 물질을 각각 사용할 때 나타나는 효과의 합보다 훨씬 더 크며 상승작용이 나타난다. 또한 장의 칼슘 흡수를 증가시키는 1α, 25-디하이드록시콜레칼시페롤(1α, 25-(OH)₂D₃)과 같은 효과적인 형태의 비타민 D와 칼슘통로 차단제를 공동 투여하는 것도 효과적인 치료방법이다.

SHR랫트 혈액의 순환인자는 본 발명자들이 보고한 논문 Am. J. Hypertens. 2. 26-31(1989)에서 그 존재가 확인되었다.

이 논문에서 본 발명자들은 SHR랫트의 혈장을 지속주입(infusion) 또는 볼러스 주사(bolus injection)로 정상혈압의 랫트에 주입할 때 WKY 및 SD랫트의 혈압이 증가하는 것을 보고하였다. 또한 시험관내에서의 랫트 미동맥 부위에 의한⁴⁵Ca 흡수는 완충배지에 있어서 SHR 혈장농도가 증가함에 따라 용량 의존적으로 증가되었음을 보고하였다.

이 실험결과들은 세포내에서 혈압의 상승 및 칼슘 흡수의 증가는 모두 그 계에 존재하는 활용가능한 SHR 혈장의 양에 의존한다는 사실을 확실히 보여준다. 이상하게도 위의 두 현상의 초기발현은 지연되고 점진적인데 비하여 노르에피네프린(norepinephrine), 안지오텐신 Ⅱ (angiotensin Ⅱ) 및 바조프레신 (vasopressin)과 같은 기존의 내인성 승압제들은 투여하자마자 혈압을 상승시키는 것으로 관찰되었다. 이 논문에서 관찰된 또 다른 결과에 의하면, SHR혈장의 주입을 정지하고 정상혈압 랫트의 혈장으로 치환하여 주입하였을 때 혈압이 기준선까지 아주 빠르게 강하된다는 것이다. 이러한 강하는 단순한 양적 효과를 미리 배제한 것이다.

관련 실험에서 정상 및 고혈압 피검체로부터 얻은 투석 혈장을 정상혈압의 SD랫트에 주입시 고혈압증을 일으키는 것으로 보여졌다. 이 피검체들의 혈장은 시험관내에서 랫트 미동맥에서의 칼슘 흡수를 증가시켰다.

순환인자의 근원은 알려지지 않았지만 PTH가 고혈압성의 랫트에서 상승되었다는 어떤 보고서가 연구의 목표로서 부갑상선을 제시했다.

SHR랫트의 부갑상선 절제는 혈압을 감소시키는 것으로 밝혀졌으며 부갑상선이 절제된 SHR랫트의 혈장은 정상 혈압랫트의 혈압을 상승시키지 않았다.

반대로 정상혈압의 스프라그-다울리 랫트(SD rats)에 SHR 랫트의 부갑상선을 이식하면, 다른 정상혈압의 랫트에 분리된 혈장을 주입했을 때 나타난 것과 같이 혈압의 상승 및 혈장내에서 인자가 발현되는 결과를 가져왔다. [참조 : 팡(Pang)과 르완츠크(Lewanceuk), Amer. J. Hypertens. 2. 898(1989)]. 이 연구들을 기초로 하여 본 발명자들은 부갑상선이 순환인자의 근원이라고 결론지으며 이물질을 부갑상선 고혈압성 인자(Parathyroid Hypertensive Factor) 또는 PHF라고 명명했다.

위에서 설명된 실험에서 잠재적 복합인자는 수혈된 혈장중에 높은 농도로 존재하는 칼슘 및 다른 저분자량 승압물질의 존재일 수도 있다. 이러한 가능성을 제거하기 위하여 수혈되는 모든 혈장은 분자량 약 1000 이하를 제거하는 막(membrane)을 사용하여 장시간 투석시켰다. 이 과정은 칼슘을 제거하고 400∼500의 분자량 범위를 가진 것으로 보고딘 와바인형 인자(ouabain-like factors)를 포함하는 대부분의 공지된 내인성 승압제를 제거하는데 효과적이다. 또한 모든 공지의 내인성 승압제는 빠르게 작용한다.

혈장으로부터 PHF를 분리하고 확인하기 위해 SHR랫트, WKY랫트 및 SD랫트를 단두하고(decapitated) 채혈한 다음, 수집된 각 타입의 혈장을 헤파린(heparin)으로 처리하여 원심분리했다. 수집된 혈장을 일차 투석(분자량 1000 미만을 제거하는 투석막을 사용)하고 분자량 약 5000미만을 여과할 수 있는 한외여과 시스템으로 여과한 다음, 수집된 여액을 동결 건조하여 농축시켰다. 농축된 투석물을 바이오-겔 P-6)(Bio-Gel P-6)와 같은 분자선별컬럼(molecular sieve column)을 통과시켰다. pH 7.0에서 0.05M NH₄OA_c로 용출시키면서 분획(fractions)을 수집하였다.

파마시아 U.V 검출기(Pharmacia U.V detector)를 사용하여 280㎚에서 분광학적으로 용출을 모니터하였는데, 정상혈압성의 랫트로부터 얻은 샘플에서는 없는 분획이 SHR랫트의 혈장에서 확인되었다. (제1도 참조)

SHR랫트의 이상분획(anomalous fractions)을 수집하여 동결건조에 의해 농축시킨 다음 정상 혈압의 랫트에 주입하였다. 혈압상승이, SHR랫트 혈장의 지연된 초기발현(30∼45분) 특성과 함께 관찰되었다. 정상 혈압 랫트 혈장 표본의 동일한 용출위치에서의 분획은 상기 작용이 나타나지 않았다.

이상 SHR 분획의 활성성분은 분자 익스크루젼(molecular exclusion) 및 액체 크로마토그래피 칼럼과 HPLC를 이용한 크로마토그래피에 의해 약 3,500달톤의 분자량을 갖는 것으로 측정되었다.

활성분획을 더욱 특정화하기 위하여 동결건조하고 0.1% 트리플루오로아세트산 : 아세토니트릴 용매구배를 사용하는 브라운리(Brownlee) RP-P(C-8) 역상 칼럼 HPLC로 280㎚에서 용출을 다시 모니터하면서 분류하였다. 그 결과를 제2(a)도 및 제2(b)도에 도시하였다.

부갑상선을 SHR 랫트로부터 절제하여 행크 배지(Hank's medium)(Gibco)에서 매일 배지를 갈아주며 7일 동안 배양시켰다.

배지의 칼슘을 감소시켜 PHF 생산을 자극할 수 있다. 혈장 샘플의 처리와 유사하게 투석 및 여과한 혼주(混注 pooled)배지를 동결 건조하고 역상 칼럼을 사용한 HPLC로 분류하였다. 제8(a)도는 분리를 도시하는 것이고, 제8(b)도는 WKY랫트의 부갑상선을 사용하였을 때의 결과를 도시한 것이다.

SHR 및 SD랫트로부터 준비된 일차세포 배양물을 위에 설명한 바와 같이 배양하였다. 4시간 간격으로 배지의 샘플들을 분리하여 동결 건조시켰다. 최소량의 증류수로 재현탁시킨 후 그 추출물을 SDS-PAGE겔(15∼18% 아크릴아미드/비스아크릴아미드)상에 점적하고 약 1시간 동안 전개시키고 바이오-래드 미니-프로테인 Ⅱ(Bio-Rad Mini-Protein Ⅱ)으로 전개시켰다. 쿠마시 블루(Coomassie blue), 바람직하게는 온(silver)으로 염색한 후에 겔을 스캐닝(scanning)하였다.

그 결과는 제10도에 도시되었다. SD랫트 세포배지나 약 12시간 전의 SHR 랫트 세포배지에서는 나타나지 않는 독특한 피크(peak)가 SHR랫트 세포의 배지에서 나타났다. 피크 분자량은 약 3,300달톤인 것으로 추정되었다.

관련 실험에서 부갑상선 세포를 위에 설명한 바와 같이 배양하였다. 8시간 후에 그 세포들을 배지로부터 분리하여 50mM 아세트산에서 균질화시킨 다음 Ca. 5,000×g에서 원심분리하여 세포부스러기를 제거하고 10∼18% 아크릴아미드/비스아크릴아미드 겔크로마토그래피를 행하였다. 그 결과는 제9도에 도시되었다.

SHR 부갑상선 배지 또는 혈장으로부터 얻은 PHF의 등전점을, 바이오-래드 미니-등전성 포커싱 시스템(Bio-Rad mini-isoelectric focusing system) 및 pH3-10의 양성전해질 구배를 사용하여 2종류의 겔, 즉 IEF 및 SDS-PAGE상에서 측정하였다. 그 결과를 제17도에 도시하였으며 약 pH 6에서의 통상적인 점적을 나타낸다.

PHF를 생성하는 세포로부터 RNA를 통상의 기술을 사용하여 추출할 수 있다[매니아티스 티(Maniatis, T) 등, Molecular Cloning, A Laboratory Method, 콜드스프링하버 연구소, 콜드스프링하버, 뉴욕(1982)]. 폴리(A) RNA는 올리도(olido)-(dT) 셀룰로오즈 칼럼과 같은 크로마토그래피를 이용하여 분리할 수 있고 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA로 변환시키며 통상의 기술 [예를 들면, 랜드(Land)등, 9 Nucl. Acids Res.,2251(1981)]을 사용하여 이중 나선화(double stranded)할 수 있다. DNA는 유용한 변이 벡터(transformation vector)로 삽입되어 E. coli K12와 같은 적절한 클로닝 숙주(cloning hosts)를 변형시키는데 사용될 수 있다. 숙주로부터 얻어진 증해된(digested) 플라즈미드는 cDNA 라이브러리(library)를 준비하는데 사용되며 표준방법에 의해 합성표지화 표식자로 스크리닝(screening) 된다. [서던(Southern), 98 J. Mol Biol. 503 (1975).] 강력하게 교잡시킨(hybridizing) 프라그먼트(fragment)는 발현벡터를 구성하는데 사용될수 있다. 발현벡터로 변형된 세포들은 PHF를 고수율로 생산하는 생산원으로서 이용될 수 있다.

혈장으로부터, 또는 배양된 세포나 변형된 세포로부터 얻은 정제된 PHF를 사용하면 복합클론항제(polyclonal antibodies) 및 단일클론항체(monoclonalantibodies)가 PHF에 대하여 발생될 수 있으며, 상기 항체들은 PHF를 분석하는데 사용될 수 있다.

바이아몬트(Viamontes)등, J. Immunol. Meth, 94 13-17(1986)의 방법에 의거하여 부갑상선 배양물로부터 얻은 부분적으로 정제된 PHF를 부착한 아미노페놀티올 에테르 디스크를 마우스에 이식함으로써 수컷의 Balb/c 마우스를 면역화하였다. 이 마우스들을 2주 간격으로 프로인트의 불완전보조액(Freund's incomplete adjuvant)의 항원을 접종시키고 항원으로서 혈장으로부터 분리된 PHF를 사용하여 항체역가(titre)를 효소결합 면역흡착분석법(ELISA)으로 평가했다. 검출가능한 양의 복합 클론항체가 한달안에 관찰되었으며 역가는 그 후에 상승되었다.

단일클론항체는 복합클론항체 생성 마우스의 비장으로부터 제조될 수 있다.

소정의 하이브리도마(hybridoma)와 MCA는 란곤(Langone)과 반버나키스(Van Vunakis)의 Methods in Enzymology 121, 1-947(1986) 방법 또는 이분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 변형 방법(modification)을 이용하여 얻을 수 있다.

복합클론항체 및/또는 단일클론항체를 이용한 검출법은 특별히 제한되지 않으며, 방사선 면역분석법(RIA), 효소면역분석법, 효소결합 면역흡착 분석법 및 면역침전물의 형성에 근거한 분석시스템들을 포함한다. 그러한 분석시스템은, 정교한 분석기구가 없을 경우에 의원 또는 진료소에서 사용될 수 있는 진단킷트(Kit)의 형태로 만드는 것이 특히 바람직하다. 상술한 방법들은 채액중의 호르몬 및 다른 면역반응물질을 검출하기 위해 이용되었다. 하나의 예로는 임신의 조기진단을 위해 시판되는 킷트가 있다. 그러므로, PHF는 상술한 방법을 이용하여 정량또는 정성으로 검출이 가능하다.

효소면역 분석의 대표적인 시험킷트는 a) 고상(solid phase)에 결합된 부갑상선 고혈압성 인자에 대한 항체 ; b) 효소로 표시된 제2항체 ; c) 상기 제2항체에 상기 효소 표지를 하기 위한 기질 ; 및 d) 부갑상선 고혈압성 인자의 표준용액을 포함한다.

RIA용의 대표적인 시험킷트는 a) 부갑상선 고혈압성 인자에 대한 항체 ; b) 부갑상선 고혈압성 인자에 대한 제2항체 ; c) 방사표시된 부갑상선 고혈압성 인자의 표준용액 ; d) 표지되지 않은 부갑상선 고혈압성 인자의 표준용액 ; 및 e) 침전시약을 포함한다. 면역 침전분석용의 대표적인 시험킷트는 a) 부갑상선 고혈압성 인자에 대한 항체 ; b) 상기 항체가 부착되는 고상 ; 및 c) 부갑상선 고혈압성 인자의 표준용액을 포함한다.

PHF를 확인함으로써, 식이칼슘이 고혈압환자의 혈압을 종종 효과적으로 저하시키며 또한 같은 환자에 있어서 칼슘통로 차단제 역시 효과적으로 혈압을 저하시킨다고 하는, 이례적으로 보이는 연구 보고들에 대한 설명이 가능하게 되었다.

혈청 칼슘이온이 높으면 높을수록 세포내 칼슘농도 및 혈압이 높아지는 것으로 여겨진다. 현재로는 어떤 특정한 이론에 의한 것은 아니지만, PHF는 제2도에 도시된 바와 같이 칼슘통로를 개방하는 작용을 하지만 높은 수준의 식이칼슘이 PHF의 방출(release)을 억제하는 것으로 보인다. 실제로 본 발명자들은 SHR 랫트에서 칼슘 결핍식이가, 고칼슘식이를 한 SHR랫트의 혈장에서는 나타나지 않는 혈장 PHF의 증가를 일으킨다는 것을 보여주었다. [르완츠크와 팡, Abstract, 4th Annual Meeting of the America Society of Hypertension, 1989].

이러한 가설은 다른 혈관 활성 물질을 이용한 주입연구에 의해 지지된다.

투석된 SHR혈청과 함께 노르에피네프린, 아르기닌 바소프레신(arginine vasopressin ; AVO) 또는 안지오텐신 Ⅱ(A-Ⅱ)을 SD랫트에 주입하면, 평균동맥압(MAP)이 더욱 상승되고 SHR혈장에 대한 고혈압성 반응이 정점에 이르렀을 때 최대로 상승하는 것으로 관찰되었다.

PHF의 존재는, 고레닌형 또는 염불감형 고혈압이 아니라 낮은 저레닌형 또는 염민감형 고혈압의 특성을 갖는 것으로 나타났다. 부갑상선에 있어서 PHF의 세포내 근원은, MAP의 감소를 초래하는 SHR랫트의 부갑상선 절제술로부터 확인되었다. 또한, SD 또는 WKY 랫트에서는 관찰되지 않는 독특한 세포형태가 SHR 랫트의 부갑상선에서 관찰되었다.

상기의 신규한 세포들은 광학 현미경과 전자 현미경 모두로 관찰할 수 있다.

그 세포들은 알데하이드 푸크신(aldehyde fuchsin)또는 아이언 헤마톡실린(iron Hematoxylin)을 이용하여 세포질(cytoplasma)을 보다 짙게 염색함으로써 조밀하고 불규칙한 형상이 핵을 가지고 있음을 확인하였다.

PHF 검출법을 이용함으로써 내과의사가 본태성 고혈압의 특별한 원인을 확인하고 적절한 치료법을 선택하며 모니터하기 위한 진단시험을 용이하게 행할 수 있다.

보충 칼슘에 의해 PHF 뿐만 아니라 레닌의 생성도 억제된다는 것과 보충칼슘의 농도상승이 고혈압을 감소시키는데 효과적이라는 것이 밝혀졌다.

칼슘보충의 효과는, 혈액네 칼슘의 높은 농도가 혈관평활근 조직에 대한 칼슘의 생체이용성(bio-availability)을 증가시켜 항고혈압성 효과를 제한할 수 있다는 사실로 인하여 예측할 수 없다. 또한, 극히 높은 수치의 식이칼슘은 통증을 일으키는 관절에의 칼슘축적과 신장결석을 일으킬 수 있다. 혈청칼슘 농도를 증가시키는 칼슘 보충제는 어떤 것도 사용이 가능하며 광물 또는 굴껍질 유래의 탄산칼슘이 바람직하다. 제제의 예로서는 Os-Ca^R(Marion사 제품) 및 Biocal^R(Miles사 제품)이 대표적이다.

칼슘통로 차단제 및 식이칼슘 보충제를 포함하는 복합요법의 사용은 더 큰 항고혈압 효과를 얻으면서도 보다 적은 양의 칼슘통로 차단제를 사용하여 혈압을저하시킬 수 있다. 칼슘통로 차단제라는 것은 칼슘의 세포내로의 유입을 억제하거나 세포내로부터 칼슘의 이동을 억제하는 약제조성물을 의미한다. [길만(Gilman)등, The Pharmacological Basis of Experimental Therapeutics, 7thed., 맥밀란, 뉴욕, 1985. 816∼821면 참조.] 칼슘통로차단제의 대표적인 예로는 니페디핀(nifedipine)과 같은 디하드로피리딘, 베라파밀(Verapamil)과 같은 벤젠아세토니트릴 및 딜티아젬(diltiazem)과 같은 벤조티아제핀 등이 있다.

결과적으로, 치료효과가 상승되고 부작용이 감소될 뿐만 아니라, 칼슘보충제의 가격이 시판되는 칼슘통로 차단제보다 훨씬 저렴하기 때문에 치료비용도 따라서 상당히 절감될 수 있다.

칼슘보충제의 투여는, 식이에 적절한 칼슘을 포함하고 있을 경우에는 1α, 25-(OH)₂D₃와 같은 효과적인 형태의 비타민 D를 투여하는 것으로, 대신할 수도 있다. 비타민D의 투여는 십이지장 점막에서의 칼슘 흡수를 증가시키기 위한 것이다. 칼슘 및/또는 1α, 25-(OH)₂D₃를 칼슘통로 차단제와 조합하여 투여할 때는 그작용성분들을 각각의 적절한 단위 용량을 포함하는 하나의 캡슐로 만든는 것이 바람직하다. 환자가 단지 한가지 약만을 복용하도록 하는 것이 복용을 용이하게 한다.

칼슘통로 차단제, 칼슘 및/또는 1α, 25-(OH)₂D₃같은 효과적인 형태의 비타민 D를 포함하는 복합요법을 이용하면 칼슘통로차단제의 일일복용량을 통상적으로 요구되는 일일복용량의 반보다 적은 양으로 감소시킬 수 있고, 때때로 칼슘통로차단제의 일일복용량을 칼슘통로차단제 단독 복용에 요구되는 복용량의 1/5까지로도 감소시킬 수 있다. 이러한 복합요법은 안지오텐신 변환효소(ACE) 억제제, β-아드레날린성 길항제, 질산염 및 이뇨제와 같은 고혈압 및 협심증(angina)조절용 약제와 병용할 수 있다.

칼슘통로차단제와 칼슘 및/또는 1α, 25-(OH)₂D₃의 복합요법의 특별한 장점은 치료의 예측가능성에 있다. 니페디핀에 대한 용량-반응곡선은 개객의 환자에 있어서는 예측할 수 없으며, 적절한 복용량을 확인하기 위해선느 상당한 시간이 필요하다. 외부로부터의 칼슘보충의 효과는, 흡수율, 분비율, 부갑상선 호르몬 농도, PHF노도 등의 여러 가지 요인으로 인하여 예측할 수 없다. 그런데 놀랍게도, 칼슘통로차단제와 칼슘보충제의 복합요법은 상승작용이 있을 뿐만 아니라 용량반응의 예측이 가능하다는 것이 밝혀졌다. 따라서 약물의 적정용량을 찾기 위해 필요한 환자진료 기간이 짧아지며, 치료지수(therapeutic index)가 높아지기 때문에 부작용의 가능성은 감소된다.

사용되는 복합약제조성물의 투여량은 개개환자의 필요도에 따라 다르다.

대표적인 체형은 통상적인 투여량의 1/5∼1/2에 해당하는 칼슘통로차단제와 탄산칼슘500㎎ 및/또는 1α, 25-(OH)₂D₃10-25USP 단위 (0.05㎍)를 포함한 캡슐형태이다.

예를 들면, 니페디핀의 통상적인 복용량은 하루 2∼3번씩 10㎎∼20㎎ 인데 본 발명에 의한 복용량은 5∼10㎎이다. 비교되는 베라파밀의 통상적인 복용량은 80∼120㎎이고 딜티아젬의 복용량은 30∼60㎎이다.

PHF의 존재 및 PHF의 분석은, 본태성고혈압의 확인 뿐만 아니라, 일차적인 증상으로서 고혈압을 포함하거나 또는 포함하지 않는 다른 질병의 연구와치료에 적용이 가능하다. 예를 들면, 비인슐린의존형 당뇨병 환자는 대부분 고혈압 환자이다. 반대로, 고혈압 환자는 종종 글루코스 내성이 감소된다. 이 두 상황 모두에서 세포내 유리칼슘의 증가가 관찰되었다.

비만하고 고혈압성이며 비인슐린의존형 당뇨병을 가진 Ob/Ob마우스의 혈장에서 PHF가 검출되었다. 이 마우스들의 PHF는, SHR랫트의 PHF와 같은 부분획(subfraction)의 혈청으로부터 분리되었다.

PHF의 검출은 비인슐린의존형 당뇨병(NIDDM)의 진단에 유용하며 NIDDM에 있어서의 PHF의 역할에 관한 새로운 연구영역을 열 수 있다.

몇가지 형태의 암은 세포질내 유리 칼슘이 증가하는것이 특징이다. [참조 : 오까자끼(Okaxaki)등, Canc. Res., 46(12Pt 1), 6059-6063(1986) ; 립톤(Lipton)과 모리스(Morris), Canc. Chemother. Pharmacol. 18(1), 17-20(1986) ; 치엔(Chien)과 워렌(Warren), Canc. Res., 46(11), 5706-5714 ; 시라카와(Shirakawa)등, Canc. Res., 46(2), 658-661(1986) ; 및 메이어(Meyer), J. Hypertens., 5(Supple. 4), S3-S4(1987)]. 또한 부갑상선의 활성화도 어떤 형태의 암과 연괸되어 있다. [참조 : 팔머(Polmer)등, Am. J. Epidemiol., 127(5), 1031-1040(1998) ; 및 페이그(Feig)와 가쓰만(Gottesman), Cancer, 60(3), 429-432(1987)]. PHF는 부갑상선이 근원이고, PHF는 세포질내 칼슘 농도를 상승시킬수 있다는 실험결과가 있으므로 PHF는 여러 형태의 암에 관련되어 있을 수 있다. 따라서 PHF를 스크리닝하는 것은, 이러한 암의 원인을 이해하는데 뿐만 아니라 검출법 및 치료법을 개발하는데 가치가 있다.

이하 실시예에 의거하여 본 발명을 설명하지만 본 발명은 실시예에 의하여 제한되지 않는다. 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 통상의 지식을 가진 자가 다양한 변형을 할 수 있다.

SHR 랫트에서의 PHF 존재의 입증

SHR, 위스타르-교오또(WKY) 및 스프라그-다울리(SD)계통의 수컷 랫트를 단두하여 채혈한 후 각 계통의 혼주혈액에 헤파린을 가하고 (100 IU/ml) 4℃에서 10분동안 3K×g으로 원심분리했다. 얻어진 혈장을 1,000달톤미만의 분자량 물질을 제거하는 막(membrance)을 이용하여 증류수에 대하여 투석시켰다.

SD랫트에 Na 펜토바르비탈을 주사하여(50㎎/㎏, i.p.) 마취시키고 카테테르(catheters)를 혈장 및 약물의 주입을 위해 경정맥(jugular vein)에 삽입하고 혈압(b.p)의 측정을 위해 경동맥에 각각 삽입하였다.

혈장을 3㎖/㎏/hr의 속도로 주입하거나 1회에 2.5㎖/㎏씩 볼러스로 수차례 투여하였다.

제4도는 SD랫트에 SHR, WKY 및 SD랫트의 혈장을 주입하는 동안의 시간에 대한 평균동맥압이 변화를 도시한 것이다. 105분 후에 SHR 혈장의 주입을 중지하고 SD혈장을 주입한 결과 30분안에 기준 혈압으로 되돌아왔다.

SD랫트에 SHR, WKY 및 SD 혈장을 볼러스 투여한 효과를 제5도에 도시하였다. 시간경과에 따른 혈압의 변화 및 관련효과가 제4도와 유사하였다.

[실시예 2]

칼슘 흡수의 조절

SD랫트 미동맥에 있어서, 칼슘 [⁴⁵Ca] 흡수를 팡(Pang)등의 논문 LIfe Sci., 42, 1935(1988)에서 기술된 저친화성 란탄방지 풀법(low-affinity lanthanumresistant pool method)을 이용하여 시험관내에서 측정하였다. 랫트의 미동맥 조각을 2시간 동안 산소공급된(95% O₂, 5% CO₂) 크렙스-한스레이트 완충액(Krebs Hanseleit buffer)에서 평형화 시켰다. 평형화(epuilibration) 시킨 후에 그 조각들을 0.1 Ci⁴⁵Ca 존재하에서 30% 혈장 크렙스 완충액에서 배양시켰다. 예정된 배양시간 후에 조직을 찬 Ca²⁺- 제거, La³⁺함유용액으로 세척하고 검량한 다음 팡(Pang)의 논문 Life Sci., 42. 1935(1988)에서 기술된 바와 같이 증해하였다. Ca흡수를 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 측정하여 제6도에 도시하였다.

⁴⁵Ca의 흡수는 혈압의 상승곡선 양상을 따르며 용량에 좌우되었다.

[실시예 3]

익스클루션 크로마토그래피에 의한 PHF의 분리

SHR, WKY 및 SD랫트의 혈장을 증류수에서 하룻밤에 걸쳐 투석하고 (분자량 1,000 미만을 제거하는 투석막 사용)아미콘 울트라-필트레이션 셀(Amicon ultra-filtration cell)(분자량 5,000 미만 여과막을 사용)을 사용하여 여과한 다음 Bio-Tel P-6로 채워진 칼럼에서 0.05M 암모늄 아세테이트로 용출하여 크로마토그래프하고 파마시아 U.V.광도계를 이용하여 280㎚에서 용출된 분획을 측정하였다. 6.67㎖의 부분표본(aliquotos)을 수집하였다.

약 3,500달톤의 분자량을 갖는 분획을 SHR혈장에세 관찰되었으나 WKY 또는 SD랫트의 혈장에서는 관찰되지 않았다(제1도). 칼럼을 분류하는데 사용한 분자랑 표식자(market)는 ACTH(m.w. 4541.7), 인슐린 B체인(m.w. 3456), 인슐린 A체인(m.w. 2530) 및 13아미노산 합성펩타이드(m.w. 1464 )이었다.

SHR랫트로부터 얻은 독특한 분획을 동결 건조하여 농축하고 실시예 1에서 설명된 바와 같이 카테테르가 삽입된 SD랫트에 주입하였다. 초기 발현시간 및 강도에있어서 SHR랫트 혈장에 필적하는 혈압의 상승효과를 관찰할 수 있었으며 그 결과를 도 7에 도시하였다.

[실시예 4]

HPLC에 의한 PHF의 정제

실시예 3에서 얻은 독특한 분획을 동결 건조하고, 0.1% 트리플루오르아세트산 ; 아세토니트릴의용매구배를 사용하여 브라운리 RP-P(C-8)역상 칼럼 HPLC상에서 분류하고 280㎚에서 모니터하였다. 생물학적 활성이 하나의 피크에서 발견되었으며 [제2(a)도 참조] WKY랫트로부터 얻은 혈청 샘플에서는 나타나지 않았다[제2(b) 참조].

[실시예 5]

세포배양물로부터의 분리

부갑상선을 SHR과 WKY랫트로부터 절제하여 배지를 매일 갈아주면서 행크 배지에서 배양시켰다. 혼주 배지를 증류수에 대해 투석하고 혈액 혈청을 처리하기 위한 방법과 동일한 방법을 이용하여 여과하였다.

1,000∼5,000 사이의 분자량을 갖는 분획을 동결 건조하고 0.1% 트리플루오르아세트산 ; 아세토니트릴의 구배를 사용하여 부라운리 RP-P(C-8) 역상 컬럼 HPLC 상에서 분류하고 280㎚에서 모니터하였다. SHR의 활성분획이 혈청에서와 같은 위치에서 용출되었지만 WKY랫트 세포의 배지에서는 상응하는 분획이 발견되지 않았다.

제8(a)도는 SHR세포주(cell lines) 배지의 용출 그래프이며 ; 제8(b)도는 WKY랫트의 경우를 도시한 것이다.

[실시예 6]

SDS-PAGE를 이용한 배양배지의 분리

트리스 완충액(Tris buffer)(pH8.3)에서 트리스(pH8.8)를 포함하는 15∼18% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(Bio-Rad) 함유 Mini SDS-PAGE 평판겔(slad gels)에 실시예 5에서 설명된 바와 같이 준비된 SHR 및 SD 랫트 부갑상선 배양물로부터 얻은 세포배양배지를 동결건조하고 물(H₂O)로 재현탁시킨 것을 로딩하였다. 겔을 200V로 약 1시간 동안 전개시켰다(Bio-Rad Mini-Protein Ⅱ). 그 결과를 제10(a)-(d)도에 도시하였다.

[실시예 7]

SDS-PAGE를 이용한 세포추출물의 분리

행크 배지에서 8시간 동안 배양된 SHR 및 SD랫트의 부갑상선 세포를 분리하고 50mM 아세트산으로 균질화시켜 5,000×g으로 원심분리한 다음, 10∼18%아크릴 아미드/비스아크릴아미드 평판겔상에 로딩하여 200V로 1시간 동안 전개시켰다. 그 결과를 제9(a)-(c)도에 도시하였다.

[실시예 8]

등전성 포커싱(Focusing)

칼럼 분획에 대한 분석적 등전성 포커싱이 Bio-Rad MOdel 111 Mini-IEFcell을 사용하여 행하여졌다. 이 기술은 등전점을 기초로 하여 단백질을 분리하는 것인데 그 결과들은 실시예 3에 의해 분리된 칼럼 분획의 순도를 표시한다. 이용된 방법은 Bio-Rad MOdel 111 Mini IEF Cell Instruction Manual(Bio-Rad Labs., 리치몬드, 캘리포니아)에 의해 변형된 것과 같은 리게티(Righetti)에 의한 등전성 포커싱 이론, 방법론과 적용(Isoelectric Focusing Theory, Methodology and Application) (Elsevier Biomedical Press, 암스테르담(1983))에서 기술된 것이다. 양성전해진(pH3-10)을 함유하는 얇은 폴리아크릴 아미드(pH3-10 평판을 지지 필름위에 놓고 SHR혈청 및 부갑상선 세포배양물로부터 얻은 정제된 샘플을 표준샘플과 함께 겔에 적용시킨 후, 겔을 그래파이트 전극에 직접 연결하였다.

단백질을 60∼90분 동안 집중시켰다. 단백질 밴드를 쿠마시블루와 크로세인스칼렛(Crocein scarlet) 모두를 함유하는 착색제로 염색시키고 그 결과를 제17도에 도시하였다. pH6에서의 단백질 밴드는 혈청과 배양배지 모두에서 나타났다.

[실시예 9]

복합 클론항체의 제조

수컷의 Balb/c 마우스들을 부분 정제한 PHF제제(순도 20∼30%)로 면역시켰다. 제제내 PHF를 각각 함유하는 펩타이드 샘플들을 바이아몬드(Viamontes)등 (J.Immum. Metho 94, 13-17, 1986)에 의해 제시된 방법에 따라 아미노페닐 티오에테르(APT)유도 여지 디스크에 디아조 결합으로 결합시켰다. 2중 증류수에 10mg/㎖로 NANO₃가 첨가된 용액 0.3㎖를 1.2N HCL 10㎖에 첨가하였다. NANO₃/HCI용액 0.3㎖를 각각의 6㎜ APT 디스크의 상부에 첨가하고 디스크를 접시에 놓고 쉐이커상에서 4℃, 30분 동안 유지시켰다. 이 디스크를 냉각 증류수 및 02M NaOAc완충액(pH4)으로 세척하고 건조하였다. 그 후 유도 여지 디스크를 프로인드 완전 보조액에 담근 후 복강내(i.p.) 이식하였다. 2주 후 항 PHF의 역가(titer)를 ELISA 법으로 측정하고, 디스크를 프로인드 불완전 보조액에 담근 것을 제외하고는 위에 설명한 것과 동일하게 마우스에 재접종하였다. 일주일 후에 역가를 ELISA법으로 측정하였으며, 마우스를 2주 간격으로 재접종시키고 샘플을 하기의 ELISA법으로 평가했다.

플레이트(Plates)를 트리스 완충액(pH9.0)중 농도 500ng/㎖인 PHF의 100㎕/well로 코팅하고 하룻밤동안 저장한 다음, 인산 완충생리식염수(PBS)-트윈(Tween) 20으로 세척한 후 PBS로 3번 세척하였다. 그 후 플레이트를 0.2% 젤라틴/PBS으로 코팅하고 37℃에서 30분 동안 숙성시킨 다음 PBS-Tween20으로 3번 세척하였다. 위에 설명한 마우스들로부터 얻은 면역혈청을 첨가하고(결과와 과정의 상충을 희석하는 희석물로 1% 젤라틴 PBS-Tween 20의 100㎕/well), 폴레이트를 실온에서 1시간 동안 숙성시킨 다음 PBS-Twee20으로 3번 세척하였다. 1% 젤라틴 PBS-Twee20에냉이(horse radish) 퍼옥시다제(1 : 2,000)가 첨가된 것을 100㎕/well의 양으로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 숙성시킨 다음 플레이트를 PBS-Tween 20으로 세척하였다. 새로 제조된 구연산 10㎖, 0.05M, pH4의 2,2'-아지노비스(3-에틸벤즈티아졸린 설폰산) 100㎕, 20mg/㎖ 농도의 과산화수소용액 40㎕를 100㎕/well의 양으로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 숙성시킨 후에 405nm에서 판독했다(Titer-Tek MUlti Scan). 그 결과는 표 1에 기재하였으며, 제11도와 제12도에 도시하였다.

[실시예 10]

복합약제의 투여(Feeding)

할란 스프라그-다울리로부터 얻은 12주생인 수컷의 SHR계통 랫트들을 12또는 24 그룹으로 나누고 0.2%, 0.4% 및 0.8%의 기본 칼슘을 함유하는 준비된 규정식을 각각 섭취시켰다. 또한 니페디핀이 함유된 먹이 0, 50, 150 및 300mg/kg을 규정식에 포함시켰다. 증류수는 무제한 공급하였다. 8주 동안 섭취를 계속시킨 다음 각 동물의 평균혈압을 측정하였다. 그 데이터는 표 2와 같다.

표 2로부터 니페디핀을 섭취하지 않고 정상의 규정식(0.2% 식이칼슘)을 섭취한 SHR랫트는 176㎜Hg의 평균혈압을 나타냈음을 알 수 있다. 니페디핀으르 가장 많이 섭취(300mg/kg)한 것은 거의 100mmHg의 혈압이 하락되는 결과를 나타낸다.

통상적인 식이 칼슘의 4배 용량을 섭취시켰을 때는 혈압이 조금 하락됨을 보여준다. 식이칼슘과 니페디핀 최대량을 공동투여했을 때의 혈압은 거의 120㎜Hg로 낮아졌으며, 이는 정상혈압 랫트에 비하여 약 56㎜Hg 또는 32% 하락한 것이다.

50 또는 150mg/kg의 니페디핀을 함유한 먹이를 섭취하였을 때는 평균혈압이 20㎜Hg 하락했지만 칼슘을 0.8% 함유하는 규정식을 섭취하면 평균혈압이 거의 40∼60㎜Hg 하락하였다. 니페디핀과 식이 보충칼슘이 조합하여 섭취시켰을 때는 어느 한가지 성분만을 투여한 경우와 비교할 때 상승된 효과를 예측할 수 있었으며 복욕량에 대한 반응이 비례하여 나타났다. 그 데이터는 두 성분 사이의 상승 관계를 나타내고 있다.

[실시예 11]

조성 Ⅰ

칼슘통로차단제와 칼슘보충제를 함유하는 캡슐은 하기 조성에 의하여 통상의 제법으로 제조될 수 있다.

니페디핀 5mg

CaCo₃ 500mg

젤라틴(연질) 1,495mg

[실시예 12]

조성 Ⅱ

칼슘통로차잔제와 1α, 25-(OH)₂D₃를 함유하는 캡슐은 하기 조성에 의하여 통상의 제법으로 제조될 수 있다.

니페디핀 5mg

1α, 25-(OH)₂D₃0.05㎍

젤라틴(연질) 1,745mg

참조 : 50ng/well

** 정상 마우스 혈청

Claims (23)

1. 혈압을 저하시키는 칼슘통로차단제와 칼슘보충제를 공동투여함을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
2. 혈압을 저하시키는 칼슘통로차단제, 칼슘보충제, 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)로 구성됨을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
3. 제1항에 있어서, 칼슘통로차단제가 디하이드로피리딘임을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
4. 제3항에 있어서, 디하이드로피리딘이 니페디핀임을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
5. 제1항에 있어서, 칼슘통로차단제가 벤젠아세토니트릴임을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
6. 제5항에 있어서, 벤젠아세토니트릴이 베라파밀임을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
7. 제1항에 있어서, 칼슘통로차단제가 벤조티아제핀임을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
8. 제7항에 있어서, 벤조티아제핀이 딜티아젬임을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.9. 제1항에 있어서, 칼슘보충제가 탄산칼슘임을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
9. 제1항에 있어서, 칼슘보충제가 탄산칼슘임을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
10. 제2항에 있어서, 칼슘통로 차단제가 디하이드로피리딘인 것을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
11. 제10항에 있어서, 디하이드로피리딘이 니페디핀인 것을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
12. 제2항에 있어서, 칼슘통로 차단제가 벤젠아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
13. 제12항에 있어서, 벤젠아세토니트릴이 베라파밀인 것을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
14. 제2항에 있어서, 칼슘통로 차단제가 벤조티아제핀인 것을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
15. 제14항에 있어서, 벤조티아제핀이 딜티아젬인 것을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
16. 제1항에 있어서, 추가로 비타민D를 투여함을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
17. 제2항에 있어서, 추가로 비타민D를 첨가하는 것을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
18. 혈압을 저하시키는 칼슘통로차단제와 유효량의 비타민D를 공동투여함을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
19. 혈압을 저하시키는 칼슘통로차단제, 유효량의 비타민D, 및 약제학적으로 허용되는 담체로 구성됨을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
20. 제18항에 있어서, 비타민D가 1α, 25-디하이드록시콜레칼시페롤임을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
21. 제19항에 있어서, 비타민D가 1α, 25-디하이드록시콜레칼시페롤임을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.
22. 혈압저하 유효량의 10∼50%의 칼슘통로차단제 및 칼슘보충제를 공동투여함을 특징으로 하는 인체를 제외한 고혈압 포유동물의 치료방법.
23. 혈압저하 유효량의 10∼50%의 칼슘통로차단제, 칼슘보충제 및 약제학적으로 허용되는 담체로 구성됨을 특징으로 하는 고혈압 치료제 조성물.