KR0136447B1 - 폴리오젤루스 속 [Polyozellus multiplex] 균주가 생산하는 신규 항암 활성물질 폴리오젤린 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 버섯류에 속하는 까치버섯(Polyozellus multiplex)에서 추출한 하기 구조식(I)의 신규한 항암 활성물질 폴리오젤린(polyozellin) 및 그의 제조 방법을 제공한다.

Description

폴리오젤루스 속 [Polyozellus multiplex] 균주가 생산하는 신규 항암 활성물질 폴리오젤린 및 그 제조 방법.

제 1도는 폴리오젤린의 자외선 흡수 스펙트럼을 도시한 것이고,

제 2도는 폴리오젤린의 적외선 흡수 스펙트럼을 도시한 것이고,

제 3도는 폴리오젤린의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 도시한 것이고,

제 4도는 폴리오젤린의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 도시한 것이다.

본 발명은 신규 항암활성 물질 및 그의 제조 방법에 관한 것으로 좀더 구체적으로는 담자균류에 속하는 까치버섯(Polyozellus multiplex)에서 추출한 새로운 항암 활성물질 폴리오젤린(polyozellin)물질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

까치버섯은 민주름버섯목 굴뚝버섯과 까치버섯속(Aphylloporalles Teleporaceae polyozellus)에 속하는 균류의 일종(농촌진흥청 발행, 한국버섯도감 223면, 1987 참조)으로 늦여름 또는 초가을무렵 소나무 및 전나무 등의 침엽수나 가문비나무 등의 활엽수 아래의 부식토에서 채취할 수 있으며 강원도 지방에서는 오래전부터 민간 전래의 약용버섯 및 건강식품으로 상용되어 왔다.

본 발명자들은 우리나라에서 자생하고 있는 버섯류로부터 새로운 생리활성 물질을 탐색하던 중 민간 전래의 약용버섯인 까치버섯으로부터 신규 항암 활성물질을 발견하고 그 물질의 화학적 구조 및 이화학적 성질을 규명한 후 그 약리활성을 확인하고 이를 폴리오젤린이라 명명하였다.

본 발명의 폴리오젤린 물질은 이전에는 그 구조 및 이화학적 성질이 밝혀진 바가 없는 신규물질로서 노화 방지 및 치매 치료제로 이용가능한 지질 과산화 저해 활성 및 프롤릴엔도펩티다제 효소 저해활성뿐 만 아니라 종양, 특히 유방암, 폐암, 대장암, 피부암, 중추신경계 암, 전립선암 세포 등의 다양한 암 세포주에 대해 강한 항암활성을 나타내는 물질임이 본 발명자에 의해 최초로 밝혀졌다.

까치버섯의 생물학적 특성은 다음과 같다.

서식지 : 강원도 오대산 지역 자생

자실체 : 높이 10내지 20㎝ 및 폭 10내지 30㎝ 크기의 잎새버섯 모양 : 청흑색 내지 남흑색을 띰;

대 : 크기 3내지 5㎝, 두께 1내지 2㎝ : 소분지로 갈라짐 : 각 분지의 선단에 물결 표면의 갖을 형성하며 전체적으로 주걱 또는 부채모양을 이룸 : 갖의 표면은 남흑색이나 이면은 회백색 또는 회청색을 띠며 방사상의 얕은 주름이 있음 : 표피 상층의 말단 세포는 42.9 내지 119.3×2.9 내지 3.7㎛크기의 길고 유연한 원통형이며 격막에 협구가 있음 :

포자 : 5.6 내지 6.9×4.6 내지 5.6㎛ 크기의 백색 타원형 내지 구형 : 포자의 표면은 돌기 또는 각진 돌기 형태를 띰 :

담자기(basidia) : 50.2 내지 76.3 × 6.0 내지 7.7㎛ 크기의 4극성 : 기부에는 협구가 있음 :

재배 : 까치버섯은 외생균근(Ectomycorrhizae)의 일종으로 인공배양이 불가능한 균근균(菌根菌)이기 때문에 직접 채취하여야 함.

본 발명은 상기한 바와 같은 다양한 암 세포주에 대한 항암활성을 가지는 안정한 비독성의 천연 항암물질 및 그의 정제방법을 제공함을 목적으로 한다.

따라서, 본 발명은 하기 구조식(1)의 폴리오젤린 물질 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

또한 본 발명은 까치버섯을 용매로 추출시킴을 포함하는, 상기 구조식(1)의 폴리오젤린 물질의 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 유효성분으로 상기 구조식(1)의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

신규 폴리오젤린 물질의 제조방법은 하기와 같다.

까치버섯 자실체를 메탄올 용액으로 추출한 후 추출액을 농축하고 벤젠용액으로 재차 추출한다. 활성물질이 모인 물층을 클로로포름으로 약3회 추출후 다시 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란, 아세톤, 디옥산, 아세토니트릴 등의 용액으로 추출, 감압 농축한후 소량의 0.5N 암모니아수를 가하여 중성 내지 알칼리성 활성 분획을 얻는다. 이 분획을 재차 진공 농축한 다음 소량의 메탄올을 첨가한 후 원심분리하고 침전되는 메탄올 가용성 불순물을 제거함으로써 순수한 폴리오젤린 물질을 얻는다.

얻어진 폴리오젤린 물질을 1% 아세트산을 포함하는 65% 메탄올을 용매로 한 ODS(octadodesyl) 역상 컬럼상에서 고속 액체 크로마토그래피시켜 순도를 확인한다.

본 발명에 따른 활성 물질은 흰쥐(Sprague­Dawley, 수컷)의 간으로부터 분리한 마이크로좀의 지질 과산화에 의해 생성된 말론디알데하이드(malondialdehyde)의 양을 측정함으로써 항산화 활성물질을 정제한다[Hogeboom, G. H., Fractionation of cell Components of Animal Tissues, Method of Enzymology, Vol. 116­19. (1955)] 정제된 폴리오젤린의 물질의 이화학적 성질은 하기와 같다.

1. 물질의 성상 : 녹색 분말

2. 분자량 : 438

3. 분자식 : C₂₂H₁₄O₁₀

4. 질량 분석(M+H⁺) : 439m/z

5. 융점 : 245℃

6. 자외선 흡수 스펙트럼(UV λ^MeOHmax nm) : 메탄올 용액중에서 측정한 자외선 흡수 스펙트럼은 제1도에 도시하였다.

7. 적외선 스펙트럼(IR λ^KBrmax ㎝^－1) : KBr 법으로 측정한 적외선 흡수 스펙트럼은 제2도에 도시하였다.

8. 핵자기 공명 (NMR) 흡수 스펙트럼 : DMSO:클로로포름(1:4)을 용매로 하고 테트라메틸실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 탄소 핵자기 공명(1₃C­NMR) 스펙트럼 및 수소 핵자기 공명(₁H－NMR) 스펙트럼은 제3도 및 제4도에 도시하였다.

9. 용해성

해 : DMSO, 피라딘, 에틸 아세테이트

약간용해 : 에틸렌글리콜, 메탄올, 에탄올

불용해 : 클로로포름, 벤젠, 헥산, 물

10. 박층 크로마토그래피(TLC)의 RF 치 :

흡착제 : 실리카 TLC. 머크사 5554

전개용매 : 클로포름 : 메탄올 : 아세트산 (13 : 1 : 0.5)

RF＝0.18

에틸 아세테이트 : 메탄올 : 아세트산

(25 : 1 : 0.2) RF＝0.66

벤젠 : 메탄올 : 아세트산 (1 : 2 : 0.2) RF＝0.54

11. 화학구조 :

본 발명의 폴리오젤린 물질은 상기한 바와 같이 생물학적 성질을 가지는 까치버섯뿐만 아니라 다른 종류의 유사 버섯류 및 균류에서도 발견될 수 있으며, 따라서 본 발명의 폴리오젤린 제조방법은 특히 까치버섯을 이용하는 방법에만 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 상기 구조식을 가지는 폴리오젤린뿐만 아니라 그의 약학적으로 허용가능한 염도 포함한다.

본 발명의 폴리오젤린 물질은 많은 비독성 무기 염기 및 비독성 유기 산과 반응하여 약학적으로 허용가능한 염을 형성한다.

약학적으로 허용가능한 염은 화합물에 존재하는 작용그룹을 생체내 또는 통상적인 조작법에 의하여 절단되어 원하는 화합물을 형성할 수 있도록 변형시키거나 또는 산 또는 알칼리 염으로 만들어 변형시킨 개시된 화합물의 유도체를 의미한다. 그 예로는 특히 이들에 한정되는 것은 아니지만 아민과 같은 염기성 잔기의 유기 또는 무기 산 염 : 카복실산과 같은 잔기의 알칼리 또는 유기 염 : 알콜 및 아민의 아세테이트, 포르메이트 및 벤조에이트 유도체 등을 들 수 있다.

약학적으로 허용가능한 산 부가염을 형성하는 데 흔히 사용되는 산은 염산, 브롬산, 요오드산, 황산 인산등과 같은 무기산 및 p­톨루엔­설폰산, 메탄설폰산, p­브로모­페닐­설폰산, 탄산, 숙신산, 시트르산, 벤조산, 아세트산과 같은 유기산 등을 들 수 있다.

본 발명 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 물 또는 유기 용매 또는 이들의 혼합물중에서 화학양론적 양의 적당한 염기와 본 발명 화합물의 유리 산 또는 염기 형을 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다.

본 발명의 폴리오젤린 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 항암제 조성물을 제조할 수 있다. 항암제 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며 통상적인 방법에 의해 경구투여용 제제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화 수 있다.

본 발명의 폴리오젤린을 유효성분으로 함유하는 항암제는 목적하는 바에 따라 피하 투여, 정맥내 투여, 경피 투여, 비강 흡입, 주입 펌프, 위장관 투여 등의 방법으로 비경구 투여하거나, 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중1㎏당 0.1내지 0.5㎎의 양을 1내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 예시의 수단이며 어떠한 의미에서도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 폴리오젤린 물질의 제조

까치버섯(Polyozellus multiplex) 약 1kg을 풍건시킨 후 2내지 3㎝크기로 잘게 절단하고 약 3ℓ의 메탄올을 첨가하여 하룻밤동안 침출시켜 황성물질을 추출하였다. 추출된 용매를 회수하고 잔사를 약 3ℓ의 메탄올을 사용하여 6회 더 추출하여 추출액을 모은 후 감압농축하여 메탄올을 제거하였다. 농축된 활성분획에 1.5ℓ의 물을 가하여 재분산시킨 후 이를 다시 동량의 벤젠으로 3회 반복 추출하여 벤젠층을 제거하고 수층을 모아 이를 다시 1.5ℓ의 클로로포름으로 3회 반복 추출한 후 클로로포름층을 제거하였다. 활성 분획인 물층을 1.5ℓ의 에틸아세테이트로 다시 추출한 후 에틸 아세테이트층을 감압하에 농축 건조시켜 1.63㎏의 조추출물을 얻었다.

조 추출물을 다시 약 100㎖의 에틸 아세테이트 및 메탄올로 순차적으로 처리하여 불순물을 제거한후 활성 물질을 완전히 건조시킨 다음 알칼리 조건에서 다시 100㎖의 에틸 아세테이트로 8회 추출하였다. 활성물질의 분획층인 에틸 아세테이트층을 완전히 건조시켜 약 847㎎의 녹색 분말을 얻었다. 여기에 300㎖의 메탄올을 가한 후 3000rpm에서 5분동안 원심분리하여 침전되는 메탄올 가용성 불순물을 제거하고 감압하에 농축시켜 순수한 폴리오젤린 성분 554㎎을 얻었다.

1% 아세트산을 포함하는 65% 메탄올을 용매로 사용한 ODS역상 컬럼을 이용하여 고속 액체 크로마토그라피(HPLC) 분석을 실시하여 최종 목적 물질의 순도를 확인하였다(분석 결과 체류시간 9.5 분대에서 단일피크가 나타남).

실시예 2. 폴리오젤린 물질의 유방암 세포주에 대한 항암활성

상기 실시예 1에서 얻어진 폴리오젤린 물질의 인체 유방암 세포주 [hman breast tumor cel line, MCF­7 : 미국 국립 암연구소로부터 입수]에 대한 항암활성을 에스알비법(SRB Methods, Monks, A. et al., J. Natl, Cancer Inst., 83 : 757, 1991)에 의해 평가하였다. 그 결과는 하기 표1에 도시하였으며 표에서 알수 있는 바와 같이 인체 유방암세포주 MCF­7에 대한 항암활성의 유효농도(ED₅₀)는 15.8ppm이었다.

표1. 폴리오젤린 물질의 유방암 세포주에 대한 항암 활성

농도(ppm)항암활성(%)

25.019.7±6.0

2.576.8±2.4

0.2599.7±2.5

0.02598.6±4.2

0.002599.2±4.2

유효농도(ED50)15.8ppm

실시예 3. 폴리오젤린 물질의 각 암 세포주에 대한 항암 활성

각 암 세포주에 대한 항암활성을 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였으며 그 결과를 하기 표2에 도시하였다.

표2.

암세포주유효농도(ED50)

신장암 세포주(human renal4.9ppm

tumor cel line, U0­31)

중추신경계 암 세포주(human central nervous system tumor cell

line, SNB­19)0.5ppm

피부암 세포주(human skin tumor cell line, CRL 1579)

.2.3ppm

백혈병암 세포주(human leukemia tumor cell line, MOLT­4F)

.1.1ppm

인체 폐암 세포주(human lung tumor cell line, NCI­H522)

.0.2ppm

대장암 세포주(human colon tumor cell line, KM­12)

.0.3ppm

상기 각 세포주는 한국 과학기술연구원 유전공학 연구소로부터 입수하였다.

실시예 4. 폴리오젤린 물질의 지질 과산화 저해활성

폴리오젤린 물질의 지질 과산화 저해활성은 비효소적 측정방법인 Fe++/아스코르베이트법(Fe++/ascorbate Methods, Ohkawa, H. et all., Anal, Biochem, 95, 351 (1979))에 따라 평가하였다. 즉 생후 6개월된 흰쥐(male sprague­Dawley)의 간으로부터 마이크로좀을 분리한 후 마이크로좀의 불포화 지방산이 Fe++/아스코르베이트에 의해 산화되어 생성되는 말론디알데하이드의 양을 티비에이(TBA : thiobarbituric acid)와 반응시킨 후 530nm에서 흡강도를 측정함으로써 항산화 활성을 평가하였다. 결과는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 상대적 저해율을 백분율(%)로 나타냈다. 그 결과는 하기 표 3에 도시하였다. 표 3에서 알수 있는 바와 같이 폴리오젤린항산화활성 유효농도(ED50)는 1.96ppm이었다.

표3 폴리오젤린 물질의 항산화활성

농도(ppm)항산화활성(%)

0.52.2

1.08.3

2.052

4.090

8.098

유해농도(ED₅₀)1.96ppm

실시예 5. 폴리오젤린 물질의 폴롤릴엔도펩티다제 저해활성

폴리오젤린 물질의 프롤릴엔도펩티다제 저해활성은 후라보박테리아(Flavobacterium)로부터 얻어진 효소를 사용하여 평가 하였다(Yamakawa, N. et. al., Chem. Pharm. Bull. 34 : 256­263, 1986). 즉 후라보박테리아 메닌고센티쿰(Flavobacterium meningosepticum) 으로부터 정제된 프롤릴 엔도펩티다제에 카보벤질옥시글리실­L­프롤릴­파라­니트로아닐라이드를 가질로 하여 반응시킨 후 생성되는 파라­니트로아닐린의 양을 410nm에서의 흡광도로 측정함으로써 프롤릴엔도펩티다제 저해활성을 평가하였다. 활성은 처리되지 않은 대조군과 비교한 상대적인 저해율을 백분율(%)로 나타냈다. 그 결과는 하기 표4에 도시하였으며, 표 4에서 알수 있는 바와 같이 폴리오젤린의 프롤릴엔도펩티다제 저해활성의 유해농도(ED₅₀)는 10.6ppm 이었다.

표4. 폴리오젤린 물질의 프롤릴엔도펩티다제 저해활성

농도(ppm)프롤릴엔도펩티다제 저해활성(%)

123

225

435

846

1657

3259

6473

유효농도(ED₅₀)10.6ppm

실시예 6. 폴리오젤린 물질의 급성 독성

생후 6주된 ICR계 마우스 5 마리에 각각 폴리오젤린 물질을 500㎎/㎏농도로 경구 투여하고 14일간 관찰한 결과 5마리 모두 아무런 이상이 발견되지 않았다. 부검후 장기의 이상 유무를 관찰하였으나 아무런 이상도 발견하지 못하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 폴리오젤린 물질의 LD₅₀값은 500㎎/㎏ 이상이었다.

Claims (4)

1. 하기 구조식(I)의 항암활성물질 폴리오젤린(polyozelline) 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염 :
2. 까치버섯(Ployozellus multiplex)을 디메틸설폭시드(DMSO), 피라딘, 에틸아세테이트, 에틸렌글리콜, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용매로 추출하는 단계를 포함하는, 제1항의 구조식(I)의 폴리오젤린 제조 방법.
3. 제2항에 있어서,

   1) 까치 버섯을 풍건 및 절단하는 단계 :

   2) 절단된 까치버섯을 메탄올로 추출한 후 감압농축하여 메탄올을 제거하는 단계 ;

   3) 농축물을 물에 재분산시킨 후 벤젠으로 추출하고 벤젠 층을 제거하는 단계 ;

   4) 수층을 클로로포름으로 추출한 후 클로로포름층으로 제거하는 단계;

   5) 수층을 에틸 아세테이트로 추출한 후 에틸아세테이트 층을 감압농축하는 단계 :

   6) 농축액에 암모니아수를 첨가하여 중성 또는 알칼리성으로 만든 후 에틸 아세테이트로 추출하는 단계 ; 및

   7) 에틸아세테이트 층을 감압농축한 후 여기에 메탄올을 첨가하고 원심분리하여 상층액 얻는 단계를 포함하는, 제조방법.
4. 유효성분으로서 제1항의 구조식 (I)의 폴리오젤린 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암제 조성물.