KR0135708B1 - Novel mab against human blood apolipoprotein b-100 and - Google Patents
Novel mab against human blood apolipoprotein b-100 andInfo
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Abstract
본 발명은 인간 혈중 아포지단백질 B-100을 인식하는 신규 단일클론 항체, 이들을 생산하는 재조합 하이브리도마 세포주 및 단일클론 항체를 이용한 혈장 아포지단백질 B-100의 농도를 측정하는 방법을 제공한다.The present invention provides a novel monoclonal antibody that recognizes apolipoprotein B-100 in human blood, a recombinant hybridoma cell line producing them, and a method for measuring the concentration of plasma apolipoprotein B-100 using monoclonal antibodies.
Description
제1도는 융합반응 전 아포지단백질 B-100으로 면역주사한 생쥐에서 채취한 혈액 샘플을 효소 면역 분석법(ELISA)으로 분석한 결과.Figure 1 shows the results of analysis of blood samples taken from mice immunized with apolipoprotein B-100 before fusion reaction by enzyme immunoassay (ELISA).
제2도의 A는 HAT 선택배지에서 재조합 하이브리도마 세포주의 배양 1일 후의 현미경 사진.FIG. 2A is a micrograph of one day after culture of a recombinant hybridoma cell line in a HAT selective medium. FIG.
제2도의 B는 HAT 선택배지에서 재조합 하이브리도마 세포주의 배양결과 형성된 콜로니의 현미경 사진.FIG. 2B is a micrograph of colonies formed as a result of culturing recombinant hybridoma cell lines in HAT selective medium.
제3도의 A는 본 발명의 단일클론 항체의 특이도를 분석하기 위하여 혈장 단백질을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동시킨 결과.3A shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis of plasma proteins to analyze the specificity of monoclonal antibodies of the present invention.
제3도의 B는 제3도 A의 젤을 본 발명의 단일클론 항체 MabB9을 사용하여 웨스턴 블럿팅(Western blotting) 분석한 결과.Figure 3 B is Western blotting analysis of the gel of Figure 3 A using the monoclonal antibody MabB9 of the present invention.
제3도의 C는 제3도 A의 젤을 본 발명의 단일클론 항체 MabB23을 사용하여 웨스턴 블럿팅 분석한 결과.FIG. 3C shows Western blotting analysis of the gel of FIG. 3A using the monoclonal antibody MabB23 of the present invention.
제4도는 효소 면역 분석법을 이용하여 본 발명의 단일클론 항체 MabB9 및 MabB23의 H-사슬과 L-사슬을 이소타이핑(isotyping)한 결과.4 is isotyping the H-chain and L-chain of the monoclonal antibodies MabB9 and MabB23 of the present invention using an enzyme immunoassay.
제5도는 아포지단백질 B-100의 농도를 분석하기 위한 본 발명의 단일클론 항체 MabB9 및 MabB23 항체의 적정곡선(titration curve).5 is a titration curve of the monoclonal antibodies MabB9 and MabB23 antibodies of the present invention for analyzing the concentration of apolipoprotein B-100.
제6도는 아포지단백질 B-100의 농도를 분석하기 위한 본 발명의 단일클론 항체 MabB9 및 MabB23 항체의 표준곡선(standard curve).6 is a standard curve of the monoclonal antibodies MabB9 and MabB23 antibodies of the present invention for analyzing the concentration of apolipoprotein B-100.
본 발명은 신규한 단일클론 항체, 이를 생산하기 위한 하이브리도마 세포주 및 이들의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to novel monoclonal antibodies, hybridoma cell lines and their use for producing them.
좀더 구체적으로, 본 발명은 혈액내 지질대사에 관여하는 혈장 지단백질중 콜레스테롤과 중성지방을 체내 필요한 조직으로 운반하는 역할을 주로 수행하는 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein, LDL)중의 단백질 부분, 즉 아포지단백질(apolipoprotein) B-100에 대한 신규 단일클론 항체, 이를 생산하기 위한 하이브리도마 세포주 및 인간 혈중 아포지단백질 B-100의 농도를 측정하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.More specifically, the present invention relates to a protein portion of a low-density lipoprotein (LDL), ie, apolipoprotein, which mainly carries cholesterol and triglycerides in plasma lipoproteins involved in lipid metabolism in the blood. A novel monoclonal antibody against apolipoprotein B-100, a hybridoma cell line for producing it and its use for measuring the concentration of apolipoprotein B-100 in human blood.
혈액중에 있는 지방질(중성 지방, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르, 인산 지방질)은 아포지단백질과 함께 지단백질(lipoprotein)이라는 복합체를 형성하여 운반된다. 지단백질은 그 중심부에 비극성의 지방질인 중성지방(트리아실 글리세롤, TG), 콜레스테롤 에스테르 등을 갖고 있으며 그 표면은 극성 지방질인 인산 지방질, 콜레스테롤 등이 둘러싸고 있으며, 그 위는 표면 성분으로서 수중의 아포지단백질로 된 피막이 있어서 전체적으로 수용성의 임자를 형성한다.Lipids in the blood (triglycerides, cholesterol and cholesterol esters, phosphate fats) are transported together with apolipoproteins to form a complex called lipoproteins. Lipoproteins contain triglycerides (triacyl glycerol, TG) and cholesterol esters, which are non-polar lipids, in the center of which are surrounded by polar lipids such as phosphate and cholesterol. There is a film of which forms a water-soluble mold as a whole.
아포지단백질은 혈장으로부터 얻은 지단백질을 유기용매로 처리함으로써 지방질이 제거된 단백질이며 지금가지 면역학적 및 화학적인 특징이 서로 다른 10여종이 알려져 있다. 아포지단백질의 생체내 기능은 세표간 지방질의 운반 내지 재분배, 지방질 대사에 관여하는 효소의 활성, 지단백질의 수용성 구조 유지, 지단백질 수용체에 대한 표적 단백질로서의 역할 등 지방질 대사에 있어서 중요한 핵심 기능을 하고 있다.Apolipoproteins are proteins that have been freed from fat by treating lipoproteins obtained from plasma with organic solvents. About 10 kinds of apolipoproteins are known from different immunological and chemical characteristics. The in vivo function of apolipoproteins plays an important key role in lipid metabolism, including the transport and redistribution of lipids between lipids, the activity of enzymes involved in lipid metabolism, the maintenance of water-soluble structures of lipoproteins, and their role as target proteins for lipoprotein receptors.
그 동안 혈중 아포지단백질의 측정을 위한 많은 면역학적 방법들, 예를 들면 방사상 면역 확산 분석법(radial immunodiffusion, 전기 면역 분석법(electroimmuoassay, 방사성 동위원서 면역 분석법 (radioimmunoassay), 효소 면역 분석법(enzyme-linked immnosorbentassay : ELISA), 면역 침전 분석법(immunoturbidimety) 등이 보고 되었다(Labeur C., Shepherd J., and Rosseneu, M., Clin. Chem. 36, 591-597(1990)).In the meantime, many immunological methods for the measurement of apolipoproteins in the blood, such as radial immunodiffusion, electroimmuoassay, radioimmunoassay, and enzyme-linked immnosorbentassay: ELISA), immunoturbidimety (Labeur C., Shepherd J., and Rosseneu, M., Clin. Chem. 36, 591-597 (1990)).
혈장 지단백질들중의 여러 아포지단백질중, 특히 저밀도 지단백질(LDL)중의 아포지단백질 B-100는 최근 동맥경화 및 심장관상동맥 질환 등의 순환기 질환의 진단과 관련하여 종래의 콜레스테롤 분석(저밀도 지단백질-콜레스테롤)보다 더 신빙성 있는 양(+)의 자표로서 알려져 있다(Brustolin D. ed al., Clin. Chem. 37, 742-747(1991) : Dona V. et al., Giorn. It. Chim. 12, 205-214(1987)).Among the various apolipoproteins in plasma lipoproteins, especially low-density lipoprotein (LDL), apolipoprotein B-100 has recently been analyzed by conventional cholesterol analysis (low density lipoprotein-cholesterol) in connection with the diagnosis of circulatory diseases such as atherosclerosis and coronary artery disease. It is known as a more reliable positive magnetic field (Brustolin D. ed al., Clin. Chem. 37, 742-747 (1991): Dona V. et al., Giorn. It. Chim. 12, 205 -214 (1987)).
따라서, 아포지단백질 B-100의 혈중 농도를 측정함으로써 순환기 질환을 용이하고 정확하게 진단할 수 있으며 이를 위해서는 아포지단백질 B-100에 특이적인 단일클론 항체의 개발이 필수적이다.Therefore, circulatory disease can be diagnosed easily and accurately by measuring blood concentration of apolipoprotein B-100. For this purpose, it is essential to develop monoclonal antibodies specific for apolipoprotein B-100.
이에 본 발명은 인간 혈중 아포지단백질 B-100에 대해 특이적으로 반응하는, H-사슬이 IgG2b이고 L-사슬이 κ인 구조의 단일클론 항체 MaBb9 및 H-사슬이 IgG2b이고 L-사슬이 λ인 구조의 단일클론 항체 MaBb23을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a monoclonal antibody MaBb9 having a structure of H-chain IgG2b and L-chain κ, which specifically reacts against apolipoprotein B-100 in human blood, wherein the H-chain is IgG2b and the L-chain is λ. It provides a monoclonal antibody MaBb23 of structure.
또한 본 발명은 상기 단일클론 항체을 생산하기 위한 하이브리도마 세포주 H-MaBb9(KCTC 0104 BP) 및 H-MaBb23(KCTC 0105BP)를 이용하여 상기 단일클론 항체를 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing the monoclonal antibody using the hybridoma cell lines H-MaBb9 (KCTC 0104 BP) and H-MaBb23 (KCTC 0105BP) for producing the monoclonal antibody.
또한 본 발명은 상기 단일클론 항체를 이용하여 혈장 아포지단백질 B-100를 포함하는 지단백질의 농도를 측정하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for measuring the concentration of lipoproteins including plasma apolipoprotein B-100 using the monoclonal antibody.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
인간 혈액으로부터 단일클론 항체의 생산을 위한 면역 주사에 사용할 아포지단백질 항원을 기존의 방법(참고문헌 : Methods Enzym, 128, Section ⅡⅢ)인 KBr 밀도 크로마토그라피 등의 방법으로 순수 분리한다. 분리한 아포지단백질 B-100을 동량의 보조약(Freund's complete adjuvant) 및 죽은 살로넬라 균체와 잘 혼합하여 생쥐 Balb/c 암컷에 복강주사하고 20일 후 돌량의 아포지단백질 B-100을 보조약(Freund's incomplete adjuvant)과 혼합하여 추가 주사한다. 그 후 생쥐에서 채취한 실험혈청이 아포지단백질 B-100에 우수한 양성반응을 보일 때까지 PBS 완충액(f10mM sodium phosphate, 150mM NaCl, pH 7.2)에 녹인 아포지단백질 B-100을 10일 간격으로 추가 주사한다. 마지막 주사는 정맥주사로 실시하고 마지막 주사 후 3일째에 쥐를 개복하여 체장을 꺼내어 마쇄한다. 마세한 췌장 세포를 공지방법(Galfre G. et al., Nature 266, 500-552(1977))에 따라 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 존재하에서 체장 세포수의 1/10 만큼의 생쥐 골수종(myeloma) 세포(Sp2/0)와 융합 반응시킨 후 HAT(Hypoxanthin, Aminopterine, Thymidine) 선택 배지에서 일주일 동안 배양한다. 생성된 군체를 96-공미적정판에 제한 희석방법에 의하여 희석 배양시키고 효소 면역 분석법에 따라 항원을 피복한 미적정판에서 항체를 분석함으로써 최종적으로 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별한다.Apolipoprotein antigens to be used for immunoinjection for the production of monoclonal antibodies from human blood are isolated purely by methods such as KBr density chromatography, a conventional method (Methods Enzym, 128, Section IIIII). The isolated apolipoprotein B-100 was well mixed with Freund's complete adjuvant and dead Salonella cells and intraperitoneally injected into mouse Balb / c females. After 20 days, the apolipoprotein B-100 was supplemented with Freund's complete adjuvant. inject additionally by mixing with incomplete adjuvant). Afterwards, a further injection of apolipoprotein B-100 dissolved in PBS buffer (f10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.2) is carried out every 10 days until the experimental serum from mice is positively tested for apolipoprotein B-100. . The final injection is administered intravenously, and on the third day after the last injection, the rat is opened and the body length is taken out and comminuted. Massed pancreatic cells were treated with mouse myeloma by 1/10 of the cell count in the presence of 50% polyethylene glycol (PEG) according to known methods (Galfre G. et al., Nature 266, 500-552 (1977)). After fusion reaction with the cells (Sp2 / 0), incubate for one week in HAT (Hypoxanthin, Aminopterine, Thymidine) selection medium. The resulting colonies are diluted and cultured in 96-collective plates by limiting dilution and the antibodies are analyzed in antigen-coated titers according to enzyme immunoassay to finally select hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies.
상기의 선별한 세포주를 적당한 배지에서 배양시키고 얻어진 배양액을 항원-결합 컬럽(antigen-immobilized column) 또는 프로테인-A(Protein-a) 컬럼에 통과시켜 아포지단백질 B-100에 대한 단일클론 항체 MaBb9 및 MaBb23을 정제하여 사용한다.The selected cell lines were cultured in a suitable medium, and the obtained culture was passed through an antigen-immobilized column or Protein-a column to monoclonal antibodies MaBb9 and MaBb23 against apolipoprotein B-100. Purify and use.
단일클론 항체를 사용하여 혈중 아포지단백질 B-100의 농도를 분석하기 위한 쇼소-결합 면역 분석법(ELISA)은 다음과 같이 실시한다.The Shoso-linked immunoassay (ELISA) to analyze the concentration of apolipoprotein B-100 in blood using monoclonal antibodies is carried out as follows.
96-공 미적정판(microtiter plate) 또는 적당한 고체면에 아포지단백질 B-100, 저밀도지단백질(LDL) 또는 화학 합성이나 유전자 재조합 기술에 의해 생산된 아포지단백질 분자의 에피토프 부분 또는 이들의 조합물을 적당량 넣고, 4℃ 내지 적당한 온도에서 하루 동안 반응시켜 흡착 피복시한다.Place an appropriate amount of epitope portion of apolipoprotein B-100, low density lipoprotein (LDL), or apolipoprotein molecule produced by chemical synthesis or genetic recombination, or a combination thereof on a 96-microtiter plate or a suitable solid surface The reaction is carried out at 4 ° C. to a suitable temperature for one day to cover the adsorption.
측정하고자 하는 시료를 약 200배 내지 적당한 비율로 희석시켜 단일클론 항체 MaBb9 또는 MaBb23(1차 항체)의 함께 상기의 분석판에 넣고 상온 내지 37℃ 적당한 온도에서 하루 동안 반응시키고 세척한 다음, 효소 면역 분석법(ELISA)에 따라 효소가 결합된 2차 항체 및 효소의 기질을 분석판에 첨가하여 발색시키고, ELISA 판독기로 흡광도를 읽어 시료 속의 아포지단백질의 농도를 결정한다. 2차 항체로서는 과산화 효소 또는 알칼리성 인산 분해효소(alkaline phosphatase)와 결합한 항체를 사용하며, 이때 효소와 결합한 2차 항체 대신에 1차 항체를 상기 효소와 결합시켜 바로 사용함으로써 2차 항체를 사용하지 않고 그 분석 단계를 줄일 수도 있다.Dilute the sample to be measured at about 200-fold to an appropriate ratio, add the monoclonal antibody MaBb9 or MaBb23 (primary antibody) to the assay plate, and react and wash at room temperature to 37 ° C. for a day. According to the assay (ELISA), the enzyme-bound secondary antibody and enzyme substrate are added to the assay plate and developed. The absorbance is read with an ELISA reader to determine the concentration of apolipoprotein in the sample. As a secondary antibody, an antibody combined with a peroxidase or alkaline phosphatase is used.In this case, a secondary antibody is used directly by combining the primary antibody with the enzyme instead of a secondary antibody bound to the enzyme, thereby not using a secondary antibody. The analysis step can be reduced.
본 발명의 효소-결합 면역 분석법은 순환기 질환의 진단과 관련하여 인간 혈중 아포지단백질 B-100의 농도를 측정하는 진단 카드의 생산에 이용될 수 있으며, 동맥 경화, 심장 관상동맥 질환 및 중풍등의 조기 진단을 통한 예방 및 조기 치료에 유용하게 응용될 수 있다.The enzyme-linked immunoassay of the present invention can be used for the production of a diagnostic card for measuring the concentration of apolipoprotein B-100 in human blood in connection with the diagnosis of circulatory diseases, and can be used for the early treatment of atherosclerosis, coronary heart disease and stroke. It can be usefully applied for prevention and early treatment through diagnosis.
첨부된 도면을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.The accompanying drawings will be described in detail as follows.
제1도는 융합반응 전 아포지단백질 B-100으로 면역주사한 생쥐에서 채취한 혈액 샘플을 효소 면역분석법(ELISA)으로 분석한 결과를 나타낸다. 항혈청은 매 10배씩 희석하여(각 번호별 희석율 : 1, 101: 2, 102: 3, 103: 4, 104: 5, 105: 6, 1061) 사용하였으며, N은 면역주사하기 전 채취한 생쥐의 혈액을 사용한 음(-)의 대조군이다.Figure 1 shows the results of analysis of blood samples taken from mice immunized with apolipoprotein B-100 before fusion reaction by enzyme immunoassay (ELISA). Antiserum was diluted every 10 times (dilution rate for each number: 1, 10 1 : 2, 10 2 : 3, 10 3 : 4, 10 4 : 5, 10 5 : 6, 10 61 ), and N was immunized. It is a negative control using the blood of mice collected before the following.
제2도의 A는 HAT 선택배지에서 재조합 하이브리도마 세포주의 배양 1일 후의 현미경 사진이다. 아포지단백질 B-100으로 면역주사한 생쥐의 췌장세포와 골수종 세포주 Sp2/0와의 융합반응 후 HAT(hypoxanthin, aminopterine, thymidine) 선택배지에서 배양한 다음 배양 1일 후 100배 배율에서 관찰한 현미경 사진으로서, 비교적 크고 둥근 모양을 가진 림프구 세포들이 식이세포(macrophage)와 융합되지 않은 릴포사이트 및 죽은 세포잔유물물들의 배경 속에서 보이고 있다.A of FIG. 2 is a micrograph 1 day after culture of a recombinant hybridoma cell line in HAT selective medium. After fusion reaction between pancreatic cells and myeloma cell line Sp2 / 0 of mice immunized with apolipoprotein B-100, the cells were cultured in HAT (hypoxanthin, aminopterine, thymidine) selective medium and observed at 100-fold magnification after 1 day of culture. In contrast, relatively large, round-shaped lymphocytes are shown in the background of reelfossite and dead cell remnants that are not fused with macrophage.
제2도의 B는 HAT 선택배지에서 재조합 하이브리도마 세포주의 배양 결과 형성된 콜로니의 현미경 사진이다.B of FIG. 2 is a micrograph of colonies formed as a result of culturing recombinant hybridoma cell lines in HAT selective medium.
제3도의 A는 본 발명의 단일클론 항체의 특이도를 분석하기 위하여 혈장 단백질을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동시킨 결과를 나타낸다. 1,2는 단백질 분자량 표준물이고, 3은 총 인간 혈장, 4는 저밀도 지단백질(LDL), 5는 고밀도 지단백질(HDL)이고, 6은 지단백질-결여 혈청(LPDS)이다.A of FIG. 3 shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis of plasma proteins to analyze the specificity of monoclonal antibodies of the present invention. 1,2 is protein molecular weight standard, 3 is total human plasma, 4 is low density lipoprotein (LDL), 5 is high density lipoprotein (HDL) and 6 is lipoprotein-deficient serum (LPDS).
제3도의 B는 제3도 A의 젤을 본 발명의 단일클론 항체 MabB9을 사용하여 웨스턴 블럿팅(Western blotting) 분석한 결과를 나타낸다. 1은 이난 혈청, 2는 저밀도 지단백질(LDL), 3은 고밀도 지단백질(HDL), 4는 지단백질-결여 혈청(LPDS)이다.B of FIG. 3 shows the result of Western blotting analysis of the gel of FIG. 3 A using the monoclonal antibody MabB9 of the present invention. 1 is inferior serum, 2 is low density lipoprotein (LDL), 3 is high density lipoprotein (HDL), 4 is lipoprotein-deficient serum (LPDS).
제3도의 C는 제3도 A의 젤을 본 발명의 단일클론 항체 MabB23을 사용하여 웨스턴 블럿팅 분석한 결과를 나타낸다. 1은 인간 혈청, 2는 저밀도 지단백질(LDL), 3은 고밀도 지단백질(HDL), 4는 지단백질-결여 혈청(LPDS)이다. 2에서 보이는 여러 개의 밴드들은 고분자량을 가진 아포지단백질 B-100을 정기영동젤에 과적(overloading)하여 걸어 주었거나 또는 아포지단백질 B-100의 일부 분해에 기인하는 것이며 맨 췻 밴드가 1에서의 저밀도 지단백질중의 아포지단백질 B-100에 해당한다.Figure C shows the results of Western blotting analysis of the gel of Figure 3 A using the monoclonal antibody MabB23 of the present invention. 1 is human serum, 2 is low density lipoprotein (LDL), 3 is high density lipoprotein (HDL), 4 is lipoprotein-deficient serum (LPDS). The multiple bands shown in Figure 2 are due to overloading high molecular weight apolipoprotein B-100 onto the electrophoretic gel or due to partial degradation of the apolipoprotein B-100 and the low band at 1 Corresponds to Apolipoprotein B-100 in lipoprotein.
제4도는 효소 면역 분석법을 이용하여 본 발명의 단일클론 항체 MabB9 및 MabB23의 H-사슬과 L-사슬을 이소타이핑(isotyping)한 결과를 나타낸다. 효소 면역 분석은 항원-의존적 방법(가로줄 A에서 D까지) 및 항원-비의존적 방법은 총 지단백질 복합물(가로줄 A와 B) 또는 순수분리한 아포지단백질 B-100(가로줄 C와 D)을 미적정판에 전처리 피복하여 사용하였다. 단일클론 항체로서는 MaBb9(가로줄 A, C와 E), 또는 MaBb23(가로줄 B, D와 F)을 생산하는 하이브리도마 세포주의 배양액을 사용하였으며, 세로줄의 각 문자는 다음과 같이 생쥐 항체의 각 이소타임(isotype)에 특이한 토끼 항혈청을 사용한 결과를 나타낸다. N, 정규의 토끼 혈청, G1∼K, 토끼에서 분리한 생쥐 항체의 각 타입, 즉 IgG1(G1), IgG2a(G2a), IgG2b(G2b), IgG3(G3), IgM(M), IgA(A), 람다 L-사슬(λ) 또는 카파 L-사슬(K), 세로줄 P는 생쥐의 모든 항체 타입에 반응하는 토끼에서 분리한 항혈청으로서 (+)의 대조군이다(가로줄 E와 F의 경우에 해당).Figure 4 shows the results of isotyping the H-chain and L-chain of the monoclonal antibodies MabB9 and MabB23 of the present invention using an enzyme immunoassay. Enzyme-immunoassays were antigen-dependent (horizontal lines A to D) and antigen-independent methods were either total lipoprotein complexes (horizontal lines A and B) or purely isolated apolipoprotein B-100 (horizontal lines C and D). Pretreatment coating was used. As a monoclonal antibody, culture medium of a hybridoma cell line producing MaBb9 (line A, C and E) or MaBb23 (line B, D and F) was used. Results are shown using rabbit antiserum specific to isotype. N, normal rabbit serum, G1 to K, each type of mouse antibody isolated from rabbit, ie IgG1 (G1), IgG2a (G2a), IgG2b (G2b), IgG3 (G3), IgM (M), IgA (A ), Lambda L-chain (λ) or kappa L-chain (K), vertical P is antiserum isolated from rabbits responding to all antibody types in mice (+) for control (horizontal lines E and F) ).
제5도는 아포지단백질 B-100의 농도를 분석하기 위한 본 발명의 단일클론 항체 MabB9 및 MabB23 항체의 적정곡선(titration curve)을 나타낸다. 단일클론 항체 생성 배양액을 횡축에 표시한 바와 같이 희석하여 사용하였으며 화살표는 최대 결합의 50%에 해당하는 항체 사용 적정농도를 나타낸다.5 shows the titration curves of the monoclonal antibodies MabB9 and MabB23 antibodies of the present invention for analyzing the concentration of apolipoprotein B-100. Monoclonal antibody-producing cultures were used diluted as indicated on the horizontal axis, and arrows indicate the titers of antibody use corresponding to 50% of the maximum binding.
제6도는 아포지단백질 B-100의 농도를 분석하기 위한 본 발명의 단일클론 항체 MabB9 및 MabB23 항체의 표준곡선(standard curve)을 나타낸 것이다.Figure 6 shows the standard curve of the monoclonal antibodies MabB9 and MabB23 antibodies of the present invention for analyzing the concentration of apolipoprotein B-100.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
하기 실시예들은 본 발명을 설명할 목적으로 예시된 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.The following examples are illustrated for the purpose of illustrating the invention and are not intended to limit the scope of the invention.
실시예 1 : 하이브리도마 세포주 제조Example 1 Preparation of Hybridoma Cell Line
인간 혈액으로부터 단일클론 항체의 생산을 위한 면역주사에 사용할 아포지단백질 항원을 기존의 방법(참고문헌 : Methods Enzym, 128, Section Ⅱ Ⅲ)에 일정 밀도의 KBr 용액에서의 순차적 원심분리방법(15℃, 45,000rpm, Beckman Ti70, 각 24시간)으로 밀도구매 1.03＜d＜1.05의 저밀도 저단백질을 분리하고, 유기 용매(50%, 이소프로판올)하의 지방분 제거 및 전기영동에 의한 젤 회수 분리 방법 등으로 순수 분리하였다. 분리한 아포지단백질 B-100 20㎍을 동량의 보조약(Freund's complete adjuvant) 및 죽은 살로넬라 균체와 잘 혼합하여 생쥐 Balb/c 암컷에 복강주사하고 20일 후 동량의 아포지단백질 B-100을 추가 주사하였다. 그 후 생쥐에서 체취한 실험혈청이 아포지단백질 B-100에 우수한 양성반응을 보일 때까지 PBS 완충액(10mM sodium phosphate, 150mM Nacl pH 7.2)에 녹인 아포지단백질 B-100 20㎍을 10일 간격으로 추가 주사하였다. 마지막 주사는 정맥주사로 실시하고 마지막 주사 후 3일째에 쥐를 개복하여 췌장을 꺼내어 마쇄하였다. 마쇄한 췌장 세포를 공지 방법(Galfre G. et al., Nature 266, 550-552(1977))에 따라 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 존재하에서 췌장세포수의 1/10 만큼의 생쥐 골수종(myeloma) 세포(Sp2/0)와 융합 반응시킨 후 HAT(hypoxanthin, aminopterine, thymidine) 선택배지(Gibco 31062-037)에서 일주일 동안 배양하였다. 융합반응 전 면역주사된 생쥐의 눈에서 샘플 혈청을 채취하여 효소 면역 분석방법(Elsia)으로 혈청 중 항체 생성을 확인한 결과 제1도와 같이 생쥐의 혈청 중에 인간 혈장 아포지단백질 B-100에 대한 항체가 잘 생성되었음을 확인하였다. 융합반응 후, 사용한 미적정판의 270개의 모든 배양공에서 세포 성장을 관찰할 수 있었고, 이 중 융합 반응의 되지 않은 세포들을 HAT 선택배지를 가하여 그 성장을 저해시켰다(제2도 A 참조). 배양액에 대하여 아포지단백질 B-100에 대한 항체의 생성을 효소 면역법으로 분석하고 양성 반응을 보이는 배양공의 세포들을 새 적정판에 옮겨 제한 희석(limiting dilution)으로 연대 배양시켜 제2도의 B와 같은 12개의 안정한 하이브리도마 세포주를 얻었고, 이 중 IgG-형의 단일클론 항체 MaBb9와 MaBb23을 생성하는 2개의 하이브리도마 세포주 H-MaBb9와 H-MaBb23을 선별하고 이들 세포주를 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소 유전자은행에 1994년 3월 23일자로 기탁번호 KCTC 0104 BP 및 KCTC 0105 PB로 각각 기탁하였다.Sequential centrifugation of apolipoprotein antigen to be used for immunization for the production of monoclonal antibody from human blood in a KBr solution of constant density (15 ° C., Method Enzym, 128, Section II III). 45,000 rpm, Beckman Ti70 (24 hours each) to separate low-density low-proteins with a density purchase of 1.03 <d <1.05, and to remove pure water under organic solvent (50%, isopropanol) and gel recovery by electrophoresis. It was. 20 μg of isolated apolipoprotein B-100 was mixed with Freund's complete adjuvant and dead Salonella cells intraperitoneally to mouse Balb / c females and injected with the same amount of apolipoprotein B-100 20 days later. It was. Subsequently, an additional injection of 20 μg of apolipoprotein B-100 dissolved in PBS buffer (10 mM sodium phosphate, 150 mM Nacl pH 7.2) was performed every 10 days until experimental serum from mice was positively tested for apolipoprotein B-100. It was. The final injection was administered intravenously, three days after the last injection, the rats were opened and the pancreas was taken out and comminuted. Crushed pancreatic cells were mouse myeloma (1/10 of the number of pancreatic cells in the presence of 50% polyethylene glycol (PEG) according to known methods (Galfre G. et al., Nature 266, 550-552 (1977)). After fusion reaction with cells (Sp2 / 0), the cells were cultured in HAT (hypoxanthin, aminopterine, thymidine) selection medium (Gibco 31062-037) for one week. Sample serum was collected from the eyes of the immunized mice prior to the fusion reaction and the antibody production in the serum was confirmed by enzyme immunoassay (Elsia). As shown in FIG. 1, the antibody against human plasma apolipoprotein B-100 was well expressed in the serum of the mouse. It was confirmed that it was generated. After the fusion reaction, cell growth was observed in all 270 culture holes of the untreated plate used, among which cells not in the fusion reaction were added to HAT selective medium to inhibit the growth (see FIG. 2A). The production of antibodies against apolipoprotein B-100 in the culture solution was analyzed by enzyme immunoassay, and the cells of the positively-reacted cultured cells were transferred to a new titration plate and cultivated by limiting dilution to obtain the same antibody as in B of FIG. Two stable hybridoma cell lines were obtained, of which two hybridoma cell lines H-MaBb9 and H-MaBb23, which produce IgG-type monoclonal antibodies MaBb9 and MaBb23, were selected and these cell lines were genetically engineered by the Korea Institute of Science and Technology. It was deposited with the Institute Gene Bank on March 23, 1994 under accession numbers KCTC 0104 BP and KCTC 0105 PB, respectively.
실시예 2 : 단일클론 항체의 특이도 분석Example 2 Specificity Analysis of Monoclonal Antibodies
단일클론 항체 MaBb9와 MaBb23의 항원-결합 특이도를 결정하기 위하여 다음과 같이 웨스턴 블럿팅을 실시하였다. 즉 약 0.5㎍의 혈장 단백질들을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 4 내지 5%의 구배로 폴리아크릴아미도 젤에서 전기영동하고, 젤상에서 분리된 단백질을 토우빈의 방법(Towbin et al., Proc, Natl, Acad, Sci, USA 76, 4350-4354(1979))에 따라 니트로셀룰로오스막(Millipore사 제품, 구멍 크기 0.45㎛)에 옮겼다. 이 필터를 0.5% 트윈(Tween) 20이 포함 된 PBS 완충액에 첨가하여 반응시킨 다음, 필터를 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS 완충액으로 15분씩 2회 세척하였다. 이 필터에 2차 항체(양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표시된 염소의 항-생쥐 면역 글로블린 G)를 넣어 반응시키고 다시 상기의 PBS 완충액으로 세척하였다. 끝으로, 기질로서 과산화수소와 ο-페닐렌디아민을 가하여 필터를 발색시켰다. 그 결과, 제3도 B 및 C에서 보는 바와 같이 단일클론 항체 MaBb9와 MaBb23은 인간 혈장 단백질중 아포지단백질 B-100에 특이적으로 결합하고 고밀도 지단백질(HDL)이나 지단백질-결여 혈청(LPDS)중의 다른 단백질들과는 결합하지 않는 우수한 특이성을 보여주었다.Western blotting was performed to determine the antigen-binding specificity of the monoclonal antibodies MaBb9 and MaBb23. That is, about 0.5 μg of plasma proteins were electrophoresed in polyacrylamido gels with a gradient of 4 to 5% in the presence of SDS according to the method of Laemmli, Nature 227, 680 (1970), isolated on gels. Was transferred to a nitrocellulose membrane (Millipore, pore size 0.45 μm) according to Tobin's method (Towbin et al., Proc, Natl, Acad, Sci, USA 76, 4350-4354 (1979)). The filter was added to PBS buffer containing 0.5% Tween 20 and allowed to react, and then the filter was washed twice with 15 minutes PBS buffer containing 0.05% Tween 20. A secondary antibody (goat's anti-mouse immunoglobulin G labeled with horseradish peroxidase) was added to the filter and reacted with the PBS buffer. Finally, the filter was developed by adding hydrogen peroxide and ο-phenylenediamine as a substrate. As a result, the monoclonal antibodies MaBb9 and MaBb23 specifically bind to apolipoprotein B-100 in human plasma proteins as shown in FIGS. 3B and C and other proteins in high density lipoprotein (HDL) or lipoprotein-deficient serum (LPDS). It showed excellent specificity that did not bind to proteins.
실시예 3 : 단일클론 항체의 이소타입(isotype) 분석Example 3 Isotype Analysis of Monoclonal Antibodies
단일클론 항체 MaBb9와 MaBb23의 항체분자중 H-사슬 및 L-사슬 이소타입형(isotype)을 조사하기 위하여 각 형들에 특이한 2차 항체들을 이용하여 항원-의존적인 방법(제4도 및 표 1) 또는 항원-비의존적인 방법(제4도 및 표 2)으로 효소 면역 분석법을 실시하였다. 그 결과, 단일클론 항체 MaBb9는 H-사슬로서 IgG2b형을, L-사슬로서 κ를 가지며, 단일클론 항체 MaBb23은 H-사슬로서 IgG2b형을, L-사슬로서 λ를 가지고 있음이 판명되었다.Antigen-dependent methods using secondary antibodies specific to each type to investigate H-chain and L-chain isotypes among antibody molecules of the monoclonal antibodies MaBb9 and MaBb23 (Figure 4 and Table 1). Or enzymatic immunoassays in an antigen-independent manner (FIG. 4 and Table 2). As a result, it was found that monoclonal antibody MaBb9 has IgG2b type as H-chain, κ as L-chain, and monoclonal antibody MaBb23 has IgG2b type as H-chain and λ as L-chain.
[표1] 항원-의존적 효소 면역법을 이용한 단일클론 항체의 이소타입 분석 결과Table 1 Results of isotype analysis of monoclonal antibodies using antigen-dependent enzyme immunoassay
총 지단백질 복합물(0.5㎍/100㎕)을 피목한 미적정판에 단일클론 항체 MaBb9 또는 MaBb23을 넣고 토끼에서 분리한 생쥐 항체의 각 이소타입에 특이한 항혈청들 중의 하나를 넣어 효소 면역 방법(ELISA)에 따라 양고추냉이 과산화효소가 결합된, 염소에서 분리한 항-토끼 면역글로블린을 사용하여 분석을 수행한 후 그 발색된 정도를 650nm에서의 흡광도 측정치로 표시하였다. 1 정규의 토끼 혈청, 2 내지 9 토끼에서 분리한 항-생쥐 IgG1(2), IgG2a(3), IgG2b(4), IgG3(5), IgM(6), IgA(7), 람다 L-사슬(8) 또는 카파 L-사슬(9)에 대한 항혈청.Put the monoclonal antibody MaBb9 or MaBb23 into an unqualified plate of total lipoprotein complex (0.5 μg / 100 μl) and add one of the antisera specific to each isotype of mouse antibody isolated from rabbits according to the enzyme immunoassay (ELISA). Analysis was carried out using anti-rabbit immunoglobulins isolated from goats, with horseradish peroxidase bound, and their color development was expressed as absorbance measurements at 650 nm. 1 normal rabbit serum, anti-mouse IgG1 (2), IgG2a (3), IgG2b (4), IgG3 (5), IgM (6), IgA (7), lambda L-chains isolated from 2-9 rabbits (8) or antiserum against kappa L-chain (9).
[표2] 항원-의존적 효소 면역법을 이용한 단일클론 항체의 이소타입 분석 결과Table 2 Results of isotype analysis of monoclonal antibodies using antigen-dependent enzyme immunoassay
토끼에서 분리한 생쥐 항체의 이소타입에 특이한 항혈청들 중의 하나를 미적정판에 피복하고 여기에 단일클론 항체 MaBb9 또는 MaBb23을 넣은 효소 면역 방법(ELISA)에 따라 양고추냉이 과산화효소가 결합된, 염소에서 분리한 항-토끼 면역글로블린을 사용하여 분석을 수행한 후 그 발색된 정도를 650nm에서의 흡광도 측정치로 표시하였다. 1 정규의 토끼 혈청, 2 내지 9 토끼에서 분리한 항-생쥐 IgG1(2), IgG2a(3), IgG2b(4), IgG3(5), IgM(6), IgA(7), 람다 L-사슬(8) 또는 카파 L-사슬(9)에 대한 항혈청, 10 (+)의 대조군 혈청.In goats coated with horseradish peroxidase in accordance with an enzyme immunoassay (ELISA), which was coated with an unanticipated plate of one of the antisera specific for isotypes of mouse antibodies isolated from rabbits and which contained the monoclonal antibody MaBb9 or MaBb23. Analysis was performed using the isolated anti-rabbit immunoglobulin and the degree of development was expressed as absorbance measurements at 650 nm. 1 normal rabbit serum, anti-mouse IgG1 (2), IgG2a (3), IgG2b (4), IgG3 (5), IgM (6), IgA (7), lambda L-chains isolated from 2-9 rabbits (8) or antiserum against kappa L-chain (9), 10 (+) control serum.
실시예 4 : 혈중 아포지단백질 B-100농도 측정Example 4 Determination of Blood Apolipoprotein B-100 Concentration
단일클론 항체 MaBb9 또는 MaBb23을 혈중 아포지단백질 B-100 농도 측정에 이용하기 위한 다음과 같은 경쟁적 효소 면역 분석 방법을 실시하였다. 즉 96-공 미적공판에 0.5㎕의 LDL-아포지단백질 B 표준물이 포함된 PBS 완충액 100㎍를 넣어 4℃에서 하룻밤 흡착시키고, 0.05% 우형 혈청 알부민(BSA) 및 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS 완충액으로 흡착되지 않은 지단백질을 세척해 냈다. 그 다음 비특이적 결합을 막기 위하여 1% 우형 혈청 알부민과 2%(탈지 분유(Carnation Co.))가 포함된 PBS 완충액을 넣어 상온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주어 반응시킨 후 다시 상기 PBS 완충액으로 세척시키고, 여기에 여러 농도의 아포지단백질 B-100을 함유한 용액 50㎕를 PBS 완충액에 희석한 단일클론 항체 배양액(1차 항체) 50㎕와 함께 넣어 4℃에서 밤새 부드럽게 흔들어 주며 반응시킨다. 다음, 0.05% 우형 혈청 알부민(BSA)과 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS 완충액으로 흡착되지 않고 남은 지단백질을 세척해 낸 후 양고추냉이 과산화효소를 결합시킨 2차 항체(염소의 항-토끼 IgG)를 첨가하거나, 또는 상기의 1차 항체로서 이들 효소와 결합시킨 것을 사용하여 발색시키고 ELISA 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.The following competitive enzyme immunoassay method was used to use the monoclonal antibody MaBb9 or MaBb23 for the measurement of blood apolipoprotein B-100 concentration. 100 μg of PBS buffer containing 0.5 μl of LDL-apolipoprotein B standard was adsorbed overnight at 4 ° C., followed by PBS containing 0.05% bovine serum albumin (BSA) and 0.05% Tween 20. The lipoproteins that were not adsorbed with the buffer were washed away. Then, in order to prevent nonspecific binding, PBS buffer containing 1% bovine serum albumin and 2% (Carnation Co.) was gently shaken at room temperature for 1 hour, and then washed again with the PBS buffer. Here, 50 µl of a solution containing various concentrations of apolipoprotein B-100 was added together with 50 µl of monoclonal antibody culture (primary antibody) diluted in PBS buffer and reacted gently at 4 ° C. overnight. Secondary antibody (goat anti-rabbit IgG) conjugated with horseradish peroxidase after washing out the remaining lipoproteins that were not adsorbed with PBS buffer containing 0.05% bovine serum albumin (BSA) and 0.05% Tween 20 Was developed using the above antibody or bound to these enzymes as the primary antibody, and the absorbance was measured at 450 nm with an ELISA reader.
아포지단백질 B-100에 대한 단일클론 항체 MaBb9 또는 MaBb23은 제5도에서 알 수 있는 바와 같이 600배 정도로 희석하여 사용하는 것이 적당하였다.The monoclonal antibody MaBb9 or MaBb23 against apolipoprotein B-100 was suitably diluted to about 600-fold as can be seen in FIG.
또한 본 면역분석법에 적당한 아포지단백질 B-100의 농도 범위를 결정하기 위하여 450nm에서의 흡광도 및 아포지단백질 B-100의 농도함수의 표준 곡선을 그려 본 결과, 제6도에서 알 수 있는 바와 같이 그 범위는 0.125-80㎕/ml로 나타났으며 본 발명의 단일클론 항체 MaBb9 및 MaBb23이 임상적으로 아포지단백질 B-100의 농도 측정에 유용함을 증명하여 준다.In addition, in order to determine the concentration range of the apolipoprotein B-100 suitable for the immunoassay, the standard curves of absorbance at 450 nm and the concentration function of the apolipoprotein B-100 were drawn. As shown in FIG. Was found to be 0.125-80 μl / ml, demonstrating that the monoclonal antibodies MaBb9 and MaBb23 of the present invention are clinically useful for measuring the concentration of Apolipoprotein B-100.
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