KR0131077B1

KR0131077B1 - 항바이러스 배합물

Info

Publication number: KR0131077B1
Application number: KR1019890001620A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 강게미 제이.; 호크켑펠 하인쯔-쿠르트
Original assignee: 로트 베른하르트 엠., 발덱 베르너; 노바르티스 아게
Priority date: 1988-02-13
Filing date: 1989-02-13
Publication date: 1998-04-17
Also published as: DE68912155T2; JP2781191B2; ZA891053B; NZ227944A; US5137720A; AU623876B2; PH26919A; EP0329609B1; JPH021410A; KR890012670A; GB8803365D0; ATE99953T1; IL89248A0; IE890435L; IE63493B1; DK62089A; EP0329609A3; AU2894389A; CA1336578C; DK62089D0

Abstract

내용없음.

Description

항바이러스 배합물

본 발명은 특정한 유형의 α-인터페론중에서 선택된 인터페론 및 뮤라밀펩타이드를 함유하는, 특정한 유형의 바이러스에 의해 유발된 질환 또는 종양으로 고생하는 사람 또는 동물체의 치료방법에 사용하기 위한 약제학적 배합제제(조성물)에 관한 것이다.

본 발명은 특히 성분 A로서 사람 인터페론-α-D- 및 -α-B 유전자 단편에서 기원한 하이브리드 α-인터페론과 성분 B로서 뮤라밀펩타이드 또는 하나 이상의 염-형성 그룹을 갖는 뮤라밀펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 약제학적 배합제제에 관한 것이다.

성분 A로서 사용되는 사람 인터페론 -α-D 및 -α-B 유전자 단편으로부터 기원한 α-인터페론은 재조합 사람 α-인터페론 B/D 하이브리드, 특히 유럽 특허원 제205 404호에 기술된 바와 같은 하이브리드 α-인터페론, 예를 들어, B₁B₂B₃D₄, B₁B₂D₃B₄, B₁D₂B₃D₄,B₁D₂D₃B₄, B₁D₂D₃D₄로 지명된 인터페론, 또는 바람직하게는 B₁D₂B₃B₄로 지명된 인터페론이다.

상기 α-인터페론은 또한 미합중국 특허 제4,414,150호의 제3도와 관련하여 컬럼 3에 기술된 BD로 지명되는 백혈구 인터페론 하이브리드이다. 상기 미국 특허는 상술된 유럽 특허원 제205 404호에서 언급되고 논의되었다. 상기 인터페론 하이브러드 BD는 하이브리드 B₁B₂D₃D₄와 거의 동일하다. 성분 A로서 사용된 하이브리드 α-인터페론은 바람직하게는 약 166개의 아미노산을 가지며, 바람직하게는, 사람 림프아세포(lymphoblastoid) 또는 백혈구 인터페론 -α-B 및 -α-D의 4개의 단편으로 구성된다. 단편 B₁은 인터페론 -α-B의 1내지 60번 아미노산으로 구성되고, 단편 B₂는 인터페론 -α-B의 61 내지 92번 아미노산으로 구성되며 단편 B₃및 B₄는 각각 인터페론-α-B의 93 내지 150번 아미노산과 151 내지 166번 아미노산으로 구성된다. 유사하게 단편 D₁,D₂, D₃및D₄는 각각 인터페론 α-D의 1내지 60번 아미노산, 61 내지 92번 아미노산, 93 내지 150번 아미노산 및 151 내지 166번 아미노산으로 구성된다. 단편 B₁으로 시작되는 하이브리드 인터페론이 바람직하다. 따라서, 성분 A는 특히 총 166개의 아미노산을 갖는 하이브리드 α-인터페론이고 사람의 림프아세포 또는 백혈구 인터페론-α-B 또는 -α-D의 아미노산 서열과 아미노산의 조성 및 수가 상응하는 4개의 아서열, 즉 인터페론 -α-B의 1 내지 60번 아미노산, 인터페론-α-B 또는 -α-D의 61 내지 92번 아미노산, 인터페론-α-B 또는 -α-D의 93 내지 150번 아미노산 및 인터페론-α-B 또는 -α-D의 151 내지 166번 아미노산으로 구성되며, 각각의 하이브리드는 인터페론-α-B 및 인터페론-α-D의 아서열중 하나이상을 갖는다.

하이브리드 α-인터페론 폴리펩타이드 B₁B₂B₃D₄의 서열은 하기와 같다 :

하이브리드 α-인터페론 폴리펩타이드 B₁B₂D₃B₄의 서열은 하기와 같다 :

하이브리드 α-인터페론 B₁D₂B₃D₄의 서열은 하기와 같다 :

하이브리드 α-인터페론 B₁D₂D₃B₄의 서열은 하기와 같다 :

하이브리드 α-인터페론 폴리펩타이드 B₁D₂D₃D₄의 서열은 하기와 같다 :

하이브리드 α-인터페론 폴리펩타이드 B₁D₂B₃B₄의 서열은 하기와 같다 :

뮤라밀펩타이드는 예를 들어 영국 특허 제1 570 625호 및 제1 571 133호 뿐만 아니라 공고번호 제2 343 482호의 프랑스 공화국 특허원에 기술된, 뮤라밀디펩타이드 또는 뮤라밀트리펩타이드이거나, 바람직하게는 예를 들어 유럽 특허 제25 495호 및 제102 319호에 기술된 포스파티딜 잔기에 의해 치환된 뮤라밀펩타이드이다. 바람직한 뮤라밀디펩타이드는 N-아세틸-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 및 N-아세틸-데메틸뮤라밀-L-알리닐-D-이소글루타민이다. 바람직한 포스파티딜-뮤라밀펩타이드는 다음 구조식의 N-아세틸-뮤라밀-L-알리닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아미드(약어 : MTP-PE)이다 :

뮤라밀펩타이드내에서 염형성 그룹은 특히 산성그룹, 예를 들어 카복시 그룹 또는 인산 그룹이거나 염기성 그룹, 예를 들어 아미노 그룹이다. 산성 그룹을 갖는 뮤라밀펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염은 예를 들어, 알칼리 금속염(예 : 칼륨 또는, 바람직하게는 나트륨염) 또는 알칼리 토금속염(예 : 칼슘염)이거나 암모니아 또는 적합한 유기아민(예 : 트리에틸아민)과의 염이다. 염기성 그룹을 갖는 뮤라밀펩타이드의 염은 적합한 무기 또는 유기산, 예를 들어 트리플루오로아세트산과의 산부가염이다.

배합제제는 동일한 경로로 동시에 투여해야 하는 방식으로 활성성분 A 및 B를 함유할 수 있거나 상이한 시간에 및/또는 상이한 경로로 투여하기 위해 활성성분을 독립적으로 함유할 수 있다(부분적 키트).

본 발명에 따라 놀라웁게도 성분 A 및 B는 한성분이 다른 성분의 활성을 증가시키도록 하는 방식(상승 효과)으로 함께 작용함이 밝혀졌다.

본 발명에 따른 배합제제는 예를 들어 B₁₆-BL₆-흑색종 모델 및 루이스(Lewis) 폐 암종에서 실험적으로 증명될 수 있는 바와 같이, 특정 종양, 특히 폐의 종양인 경우 온혈동물에서 전이의 형성을 감소 또는 억제 시키는데 사용될 수 있고, 특히 리포좀내로 투여하는 것이 유리하다. 상기 배합제제는 또한 사람을 포함하는 온혈동물에서 바이러스에 의해 유발된 질환, 특히 이후에 상세히 명시된 바이러스에 의해 유발된 질환의 예방과 특히 치료에 사용할 수 있다[참조 : J.L. Melnick, Prog. med Virol. 26, 214-232(1980) 및 28, 208-221(1982)] : 파코나비리대(Picornaviridae), 믹소바이러스(Myxovirus) 및 가장 특히 헤르페스비리대(Herpesviridae). 믹소바이러스는 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형과 파라인플루엔자 바이러스이다. 헤르페스비리대는 바람직하게는 알파헤르페스비리대, 특히 심플렉스 바이러스로서, 예를 들어 사람 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 및 2형 뿐만 아니라, 특히, 사람 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)와 같은 베타헤르페스비리대이다.

뮤라밀펩타이드와 배합하여 온혈동물에게 투여되는 상술한 α-인터페론중 어느 하나의 1일 투여량은 체중 kg당 약 10⁴내지 약 10⁷단위, 특히 체중 kg당 약 10⁵내지 약 10⁶단위이고, 예를 들면 5×10⁶단위/kg, 또는 약 10㎍/kg이다. 인터페론의 양은 중량면에서 뿐만아니라 항바이러스성 활성과 같은 이들의 생물학적 활성의 측면에서 나타낼 수 있으며 단위로 표현된다. 항 바이러스 역가는 소(MDBK) 및 사람(WISH) 세포상에 챌린지 바이러스(challenge virus)로서 소수포성구내염 바이러스(VSV)를 사용하여 문헌[참조 : S. Rubinstein et al. J. Virol. 37, 775(1981)]의 방법에 따라 세포변성효가의 감소에 의해 측정한다[참조 : A. Meister et al., J. gen. Virol. 67(1968), 1633 to 1643, 특히 page 1634].

상기 α-인터페론중 어느 하나와 배합하여 온혈동물에게 투여되는 상술한 뮤라밀펩타이드중 어느 하나의 1일 투여량은 약 0.005mg/kg 내지 약 5mg/kg, 특히 약 0.01mg/kg 내지 1mg/kg, 바람직하게는 약 0.1mg/kg이다.

투여량은 체중에 따라 선형방식으로 증가하지는 않는다. 따라서 체중이 약 70kg인 온혈동물(예 : 사람)의 투여량은 상기 뮤라밀펩타이드 및 상기 인터페론 약 0.2mg 내지 약 20mg, 바람직하게는 약 1 내지 10mg이다.

상승효과가 존재하는 경우 상기 인터페론 대 뮤라밀펩타이드의 중량비는 바람직하게는 약 1 : 0.4 내지 약 1 : 400, 특히 약 1 : 1 내지 약 1 : 100, 예를 들어 1 : 10 내지 1 : 40이다.

온혈동물에서 바이러스에 의한 감염을 치료하거나 대식 세포를 활성화시키기 위한 약제학적 배합제제는 성분 A로서 하이브리드 α-인터페론 폴리펩타이드 B₁D₂B₃B₄와 성분 B로서 N-아세틸-뮤라밀-L-알리닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아미드의 약제학적으로 허용되는 염의 배합물(여기에서 A대 B의 중량비는 1 : 1 내지 1 : 100이다)을 항바이러스 유효량 또는 대식세포 활성량으로 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 항바이러스 유효량, 또는 전이 형성 방지량의, 사람 인터페론-α-D 및 -α-B 유전자 단편으로부터 기원한 구조물인 하이브리드 α-인터페론과 뮤라밀펩타이드(여기서, A 대 B의 중량비는 1 : 0.4 내지 1 : 400이다)를 온혈동물에게 투여함을 포함하여, 바이러스에 의해 유발된 질환 또는 종양으로 고통 받는, 사람을 포함하는 온혈동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.

활성성분은 상이한 경로와 상이한 시간 또는, 바람직하게는 동일한 경로 및 동시에 투여할 수 있다. 투여경로는 특히 치료될 질환에 따라 다르며, 특히 정맥내와 같은 비경구투여이거나 질내, 직장내 또는 비강내를 포함한 국소투여이다. 경우에 따라, 질환이 개선될때까지 활성성분을 반복적으로 투여할 수 있다. 통상 1회 투여는 부적합하다.

투여의 특별한 유형 및 투여량은 담당의사가 환자의 특성, 질환 및 질환상태를 고려하여 선택할 것이다.

성분 A로서 하이브리드 α-인터페론 폴리펩타이드 B₁D₂B₃B₄와 성분 B로서 N-아세틸-뮤라밀-L-알리닐-D-이소글루타미닐-L-랄라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아미드의 약제학적으로 허용되는 염과의 배합물(여기에서 A 대 B의 중량비는 1 : 1 내지 1 : 100이다) 항바이러스 유효량 및 대식세포 활성량을 온혈동물에게 투여함을 포함하여 온혈동물에서 대식세포를 활성화 시키거나 헤르페스비리대에 의해 유발된 감염을 치료하는 방법이 바람직하다.

본 발명에 따른 제제내에 존재하는 약제학적으로 허용되는 담체 물질은 리포좀 또는 다른, 보다 통상의 약제학적으로 허용되는, 무기 또는 유기, 고체 또는 액체 담체를 함유할 수 있다.

몇몇 경우, 예를들어 폐로 활성성분의 전달이 필요한 경우, 뮤라밀펩타이드 성분 또는 인터페론이나 두 성분 모두를 리포좀내에 봉입시키는 것이 유리하다.

리포좀은 여러가지 문헌에 기술되어 있다. 이들의 구조 및 용도는 활발히 진행되고 있는 연구의 주제이다. 이들의 쉘(shell) 구조에 따라, 단층라멜라 리포좀(unilamellar liposome) 또는 다층라멜라 소포(ULV) 및 다층라멜라 21포좀(multilamellar liposome) 또는 다층라멜라 소포(MLV)로 구별된다. 몇몇 문헌에서, 소포라는 용어는 엄밀히 단층라멜라 리포좀에 적용된다. ULV는 지질, 특히 인지질의 하나의 이중막으로 구성되는 구형 쉘을 가지며, MLV는 양파-쉘 유형으로 배열된 몇개의 이중 막으로 구성되는 구형 쉘을 갖는다. 구형 쉘은 포스파디딜 콜린, 포스파디딜에탄올아민 또는 포스파티드산과 같은 인지질 및 임의의 콜레스테롤과 같은 중성지질로 구성된다. 이러한 쉘은 수상 및 약리학적 활성물질을 함유하는 내부 용적을 둘러싸고 있다.

친유성의 정도와 온도 또는 농도와 같은 다른 요건에 따라, 봉입된 화합물은 밀페된 수상 및/또는 이중막중에 존재한다.

리포좀에 근거하는 약제학적 투여 시스템은 문헌[참조 : G. Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. II, Incorporation Drugs, Proteins and Genetic Material, CRC Press 1984]에 기술되어 있다. 이러한 시스템은 생물학적으로 활성인 물질이 식작용에 의해 조직내로, 특히 세망-내피계의 조직내로 도입될 수 있다는 장점을 가진다. 예를들어, 항생제가 식작용에 의해 감염된 조직내로 도입되어 감염시킨 미생물의 제거 또는 파괴를 향상시키는 전달 기작은 공지되어 있다. 엔도시토시스(endocytosis)도 또한 염증 중심부위의 치료에 도움을 주는 기작이다. 리포좀내에 봉입된 류마티스 약제는 바람직하게는 건강한 조직과 비교하여 감염된 조직내로 바람직하게 도입된다. 또한, 통상적으로 암치료 약물로서 공지된 세포증식 억제제(cytostatic agent)는 세망-내피계의 특정한 기관(간, 비장 또는 골수)으로 도입될 수 있다. 추가로, 폐의 모세관내로의 여과 및 이동하는 단구에 의한 연속적인 전달로 인해, 생물학적 활성물질, 예를들어 면역조절 특성을 갖는 화합물은 폐포의 대식세포내에 농축될 수 있다. 이로인해 전이성 폐 종양에 있어서의 작용이 증가되고 동시에 독성이 감소된다.

본 발명의 목적을 위해서는 포스파티딜-콜린 및 포스파디딜세린으로 구성된 리포좀이 바람직하게 사용되며, 특히 이들은 합성된(1-팔미토일-2-올레오일-3-sn-포스파티딜)콜린 및 합성된(1,2-디올레오일-3-sn-포스파티딜)-L-세린의 약제학적으로 허용되는 염, 예를들어 나트륨염이, 특히 7 : 3의 몰비로 구성되어 있다.

리포좀의 제조방법은, 예를들어, 유럽 특허원 제178 624호에 기술되어 있다. 봉입되는 활성성분 A 또는 B가 호지성인 경우, 인지질과 상기 활성성분의 균질 혼합물을 수성 상중에 분산시킨다. 봉입될 활성성분 A 또는 B가 수용성인 경우 인지질의 균질 혼합물을 상기 활성 성분 A 또는 B를 함유하는 수성 상중에 분산시킨다. 경우에 따라, 수성 분산액을 pH 약 7.0 내지 7.8 사이에서 완충시키고 농축시킨다. 리포좀은 또한 수성상으로부터 분리될 수 있다.

인지질의 균질 혼합물은 인지질의 박막(film) 또는 동결건조물을 형성시킴으로써 제조한다. 박막은 인지질을 유기용매중에 용해시키고 용매를 제거시켜 제조한다.

적합한 용매는, 예를들어, 비치환되거나 치환된, 예를들어 할로겐화된, 지방족 또는 지환족 탄화수소(예 : n-헥산, 사이클로헥산, 메틸렌클로라이드 또는 클로로포름), 알코올(예 : 메탄올 또는 에탄올), 저급 알칸카복실산에스테르 또는 아미드(예 : 아세트산 에틸에스테르 또는 디메틸포름아미드) 또는 에테르(예 : 디에틸에테르, 테트라하이드로푸란 또는 디옥산)이거나, 이들 용매의 혼합물이다.

이어서 유기용매를 진공, 바람직하게는 고진공에 적용시키거나, 불활성가스, 예를들어 질소로 취입함으로써 제거한다. 동결건조물은 미합중국 특허 명세서 제4,311,712호에 기술된 방법에 따라 유기용매중의 인지질의 용액을 통상의 방법으로 동결건조시킴으로써 형성시킨다. 적합한 용매는 동결건조 공정의 온도에서 인지질과 함께 고체형으로 존재하고 융점이 0℃ 이상인 용매이며, 예를들어 빙초산, 벤젠 또는 디옥산, 특히 3급-부탄올을 들 수 있다.

균질혼합물은 또한 클로로포름과 같은 저비점의 유기용매중의 인지질의 용액을 분무-건조하여 제조할 수 있다. 이러한 방법에 의해 분말을 수득한다.

균질 혼합물중 포스파티딜세린 성분 대 포스파티딜콜린 성분의 비는 약 10 대 90 내지 50 대 50몰%이다. 비가 30 대 70몰%인 것이 바람직하다. 봉입된 활성물질(α-인터페론과 베합된 뮤라밀 디펩타이드)의 양을 인지질 총량으로 나눈 대략의 몰비는 약 0.0001 내지 0.1 대 1.0, 바람직하게는 0.005 내지 0.01 대 1.0이다. 이는 약 100배 몰과량의 인지질을 사용하는 것이 바람직하다는 것을 의미한다.

분산은 수성상을 교반(격렬한 진탕-볼덱스 혼합기 또는 고속 교반)시킴으로써 수행된다. 소형, 대형, 단층 라멜라 또는 다층 라멜라 리포좀의 혼합물은 외부 에너지의 공급없이 고속에서 자발적으로 형성된다. 수성분산액 총 중량에 대하여 균질 혼합물 약 0.1 내지 40중량%, 바람직하게는 2 내지 20중량%를 수성상중에 분산시킬 수 있다. 바람직하게는 이러한 분산액은 분산액 ml당 지질 약 1㎛ol에 이르기까지 더 희석시킨다. 이러한 농도의 리포좀 분산액은 지질 ㎛ol당 수성상 약 2.5㎕를 포획한다.

본 발명에 따른 리포좀 형태의 약제학적 조성물의 제조방법은 또한 리포좀을 제조하기 위한 당분야에서 공지된 다른 방법, 예를들어 초음파를 사용한 초음파분해, 침출법 또는 역상 증발에 의해 수행될 수 있다.

분산단계는 60℃ 이하의 온도, 바람직하게는 실온에서 수행된다. 봉입된 물질의 감온성을 고려할때, 분산은 냉각하 및, 임의로, 질소 또는 아르곤 대기와 같은 불활성 가스 대기하에서 수행된다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제조에 사용할 수 있는 인지질(I)과 (II)의 혼합물은, 수성상중에 분산된 후에, 약 37℃ 미만의 상 전이온도(액체-겔형)를 갖는다. 리포좀 분산액은 가열하지 않고 제조할 수 있다.

수득된 리포좀은, 만니트 또는 락토우즈와 같은 안정화제를 첨가한후 수성상 중에서 수주 또는 수개월까지 안정하게 저장할 수 있다.

형성된 리포좀의 크기는 특히 활성성분 및 지질 성분의 구조, 수성 분산액중 성분의 혼합비 및 이들 성분의 농도에 따라 다르다, 따라서, 예를들어 지질 성분의 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써, 고농도의 소형 또는 대형 리포좀을 갖는 수성상을 생성시킬 수 있다.

대형 리포좀으로부터 소형 리포좀을 분리하는 방법은 통상의 분리방법, 예를 들어 한외원심분리기내에서 대형리포좀의 침전, 겔 여과 또는 직세공 여과기(straight-pored filter)를 통한 압출에 의해 수행된다. 예를들어, 5000 내지 40000xg의 중력장과 동등한 관성력을 발생하는 회전장내에서 5 내지 30분동안 원심분리하는 경우, 대형 리포좀은 침전되는 반면 소형 리포좀은 분산된 상태로 존재하므로 경사분리할 수 있다. 원심분리기를 반복하여 수행한 후, 소형 리포좀으로부터 대형 리포좀을 완전히 분리한다.

예를들어 대형 다층라멜라 리포좀과 같은, 직경이 6.0×10^-8m 초과인 수성상중의 리포좀은 담체로서, 예를들어 세파로우즈(Sepharose) 또는 세파크릴(Sephacryl)을 사용하여, 겔여과시켜 분리제거할 수 있다.

직세공 여과기, 예를들어 공극 직경이 약 1.0×10^-7내지 1.0×10^-9m인 뉴클레오포어(Nuclepore

) 또는 폴리카보네이트 유형의 막여과기를 통하여 약 0.1 내지 1.5바의 압력 및 약 20ml/h의 여과 속도에서 압출시켜, 특히 균일한 크기의 리포좀 분산액을 수득할 수 있다.

수성상중에서 리포좀의 형성 및 이의 함량은 여러가지 물리적 분석방법, 예를들어 전자현미경을 이용한 냉동-파쇄 샘플 및 박편의 현미경 기술, X-선 회절, 동적 광 산란, 분석용 한외원심분리를 이용한 여액의 질량측정 및, 특히 핵자기 공명 스펙트럼(¹H,¹³C³¹P)을 사용한 분광법을 사용함으로써 공지된 방법 자체로 검출할 수 있다.

리포좀 제제용으로 사용되는 인지질은 공지되어 있다. 이들중 일부는 시판되고 있다(Avanti, Fluka, Serva). (1,2-디-올레오일-3-sn-포스파티딜)-(L)-세린의 제조 및 유사 지질의 제조는 문헌[참조 : Browning J. 및 Seelig J., Chem. and Phys. of Lipids 24(1979) 103-118]에 기술되어 있다.

pH 7.0 내지 7.8의 완충용액은 바람직하게는 이수소화인산염/수소화인산염(KH₂PO₂/Na₂HPO₄)의 평형에 근거한 멸균 인산염 완충용액이다. 이 완충용액의 제조는 문헌[참조 : Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Springer Verlag, vol. 1, pg. 357-359]에 기술되어 있다. 특히 pH 7.2의 멸균된, 등장의 칼슘-비함유 완충용액(Dulbecco) 또는 핸크스 밸런스 염용액(Hank's Balanced Salt Solution; M.A. Bioproducts, Walkersville Md. USA)을 사용한다.

비경구 투여용으로는, 리포좀을 액체 담체로서 제공되는, 예를들어 멸균된, 칼슘-비함유, 등장성 염수 또는 글루코우즈 용액과 같은 멸균 수용액중에 분산시키고, pH 7.0 내지 7.8, 바람직하게는 7.2 내지 7.4로 완충시킨다.

국소 투여용으로는, pH 7.0 내지 7.8, 바람직하게는 7.2 내지 7.4로 완충된, 리포좀-함유 수성 분산액을 통상의 고체담체, 예를들어 증점제(예 : 하이드록시프로필셀룰로즈)와 적합한 방부제, 항산화제 또는 향료와 혼합하여 피부 또는 점막에 적용하기 위한 로션 또는 겔의 형태로 사용한다.

보다 통상적인 비경구 제제는 특히 정맥내, 근육내, 복강내, 비강내, 경피 또는 피하와 같은 여러가지 방법에서 효과적인 주사가능한 유액이다. 이러한 유액은 예를들면 활성성분 단독 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 동결건조된 제제로부터 사용직전에 제조될 수 있는 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 약제학적 제제는 멸균될 수 있고/있거나 보조제, 예를들어, 방부제, 안정화제, 습윤제 및/또는 유화제, 가용화제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유한다. 경우에 따라, 약리학적으로 중요한 물질을 함유할 수 있는, 본 발명의 약제학적 제제는 통상의 동결건조 방법의 해동에 의해 공지된 방법 자체로 제조되며, 활성성분을 약 0.1% 내지 20%, 특히 약1% 내지 약 10%, 및 동결건조물의 경우 100%이하까지 함유한다.

더욱 통상적인 국소 제제는 본 분야의 숙련가에게 공지되고 예를들어 유럽 특허 제102 319호에 기술된 통상의 담체물질을 함유하는 좌제, 크림제, 연고제, 페이스트제, 겔제, 립스틱제, 점적제, 분무제, 발포제 또는 팅크제이다.

하기 실시예로 발명을 설명한다. 온도는 ℃로 주어진다.

약어

CEF : 병아리 배 섬유아세포

HBSS : 핸크스 밸런스 조절 염용액

HSV-1 : 헤스페스 심플렉스 바이러스 제1형

MEM : 이글스 최소 필수 배지

MTP-PE : N-아세틸 뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1,2-디-팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아미드-나트륨염

OOPS : 합성(1,2-디-올레오일-3-sn-포스파티딜)-L-세린-나트륨염

PBS : 인산염 완충 염수

POPC : 합성(1-팔미토일-2-올레오일-3-sn-포스파티딜)-콜린

RPMI : 로즈웰 파크 메모리알 인스티튜트(Rosewell Park Memorial Institute ; Buffalo, New York, U.S.A)

[실시예 1(세포독성)]

A. 재료 및 방법

동물

체중이 150 내지 200g인 특정한 병원균이 없는 백색 래트(TiF : RAIf)를 사용한다. 동물은 사용전에 외래 인자의 존재에 대해 통상적으로 스크리닝한다.

세포배양

대식세포-매개된 세포독성은 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 입수할 수 있는 동유전자형의 MADB-200 선압 타겟 세포에 대해 평가한다. 이들 세포를 10%의 태 송아지 혈청이 보충된 MEM내에서 단층 배양물로 유지한다. 배양물을 5% 이산화탄소를 포함하는 가습대기내에서 37℃로 유지시킨다. 배양물을 마이코플라즈마의 존재에 대해 통상적으로 시험한다.

래트 폐포 대식세포의 수집 및 배양

폐포의 대식 세포(AM)는 기관 세척에 의해 수집한다[참조 : Brownbill and Schumann, Cancer Immunol. Immunother. 20, 11-17, 1985]. 세척액으로부터 회수한 세포를 400xg에서 10분동안 원심분리하고 혈청-비함유 배지중에 현탁시키며, 96-웰 마이크로테스트(Microtest) II 플라스틱 조직 배양 접시에 웰당 5×10⁴세포를 플레이팅한다. 60분동안 배양한후, 세포를 HBSS로 세척하여 비흡착성 세포를 제거하고 세포화학적 기준에 의해 측정되는 대식세포를 수득한다.

래트 폐포 대식세포의 시험관내 활성

래트 폐포 대식세포의 정제된 배양물을 37℃에서 1시간동안 0.2ml의 대조 배지, 재조합_αB₁D₂B₃B₄, MTP-PE, 또는_αB₁D₂B₃B₄와 MTP-PE의 배합물과 함께 배양한다. 처리된 세포에, 5×10³MADB-200종양 세포를 가하고 37℃에서 72시간동안 배양시킨다. 이렇게 하면 50,000개의 대식세포가 5000개의 종양세포와 함께 배양된다.

폐포 대식세포-매개된 세포독성의 시험관내 검정

잔여의 MADB-200 종양세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하는 비색검정을 사용하여 대식세포의 세포독성을 측정한다[참조 : Brownbill and Schumann, Cancer Immunol. Immunother. 20, 11-17, 1985]. 요약하면, 배양후에, 웰을 HBSS을 사용하여 세척하고 잔여의 세포를 포르말린으로 고정하며 크리스탈 바이올렛을 사용하여 염색한다. 염색후에 각 웰을 철저히 세척하고, 세포를 알코올로 탈색시킨 다음, 추출물을 비색계로 판독한다. 폐포 대식세포의 세포독성 활성율(%)은 하기와 같이 계산된다 :

B. 결과

래프 폐포 대식세포의 활성화에 대한 MTP-PE 및 재조합_αB₁D₂B₃B₄인터페론의 배합효과

[실시예 2(헤르페스 폐렴)]

A. 재료 및 방법

동물

생후 3 내지 4주된 암컷 C3H/OLA 마우스를 Harlan Breeding Laboratories (England)로부터 수득한다. 마우스를 선적하기 전에 센다이 바이러스 및 다른 외래 인자의 존재에 대해 스크리닝한다. 모든 마우스는 도착후 사용되기 전에 수일 동안 보호한다.

시약

RPMI 1640 배지(모든 필수 성장인자를 함유하는 조직 배양 배지), MEM, HBSS, 및 태 송아지 혈청을 Grand Island Biological(GIBCO, New York, New York)사로부터 수득한다. 재조합_αB₁D₂B₃B₄인터페론은 0.1mg(=1.5×10⁷단위/ml)을 함유한다. 리포좀-봉입된 MTP-PE(동결건조됨)는 POPC/OOPS이 7 : 3의 몰비로 구성된 합성 인지질 250mg중 1mg을 함유한다. 재조합 래트 γ 인터페론은 동결건조된 형태로서 primate center TNO(Holland)로부터 입수한다. 사람_αB₁D₂B₃D₄인터페론은 많은 상이한 동물종상의 인터페론 수용체에 결합하여 생물학적 반응을 유발시킬 수 있다. 모든 시약에는 리물루스 변형세포 용해물 검정(Limulus amebocyte lysate assay; 감도 한계 : 0.125ng/ml)에 의한 측정시 내독소가 없었다.

바이러스 및 세포 배양

헤르페스 심플렉스 제1형(HSV-1) 바이러스의 VR3 균주를 바이러스의 작업 스톡(stock)을 수득하기 위해 베로 세포(vero cell)내에 계대 접종한다. 본 연구에 사용된 바이러스는 베로 세포상에서 검정한 경우 플라크 형성 단위 역가가 7.5×10⁷이고, 생후 3주된 C3H/OLA 마우스의 비강내로 투여한 경우(0.05ml) LD₅₀은 1000이었다. 최초배지(10% 태 송아지 혈청을 함유하는 MEM) 피복물에 0.5% 한천을 사용한 2일간의 플라크 검정을 이용한다. 생존하는 세포를 뉴트럴 레드로 염색하여 플라크를 계수한다. 몇몇 경우에는, 감염된 마우스로부터 무균적으로 폐를 적출시켜, 오염된 혈액을 세척한 다음, 다운스 균질화기(Dounce Homogenizer)로 균질화시킨다. RPMI 중에서 10% 균질물을 제조하고 1000xg에서 15분동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한다. 이들 샘플을 상술한 플라크 검정을 이용하여 감염성 바이러스의 존재에 대해 검정할때까지 -80℃에서 보관한다.

헤르페스 폐염 모델

HSV-1 바이러스의 VR3 균주에 의한 비강내 감염의 병리학이 문헌[참조 : Nachtigal et al., Am. J. Pathol. 115(1984) and Gangemi et al. J. Infect. Dis. 15 5(1987), 510-517]에 기술되어 있다. 생후 4주 경과한 마우스의 비강내로 접종하면 감염후 10 내지 12일내에 죽는다. 죽은 동물 또는 질병의 말기 단계 동안에 죽는 동물을 현미경으로 관찰한 결과 광범위한 간질성 폐렴이 나타났다. 폐 병변은 호중구, 단구 및 림프구를 함유하는 세포의 염증 삼출물에 의해 특징지워진다. 폐렴 이외에도, 감염된 마우스에서는 항상 부신괴사가 발견된다. 부신괴사 병변은 감염후 시간경과에 따라 확대되지만 염증 반응은 거의 나타나지 않는다. 헤르페스바이러스에 대한 폴리클로날 항체로 면역염색한 결과 폐 및 부신선을 따라 흩어진 바이러스 항원의 침전이 나타났다. 두 기관은 비강내의 경로로 감염되었을때 바이러스의 복제가 일어나는 주요 부위인 것으로 나타났다. 폐의 HSV-1 역가는 감염 48시간후 습윤 조직 그람당 최대 10⁶플라크 형성 단위로 증가하였다.

리포좀-봉입된 MTP-PE 및_αB₁D₂B₃B₄인터페론의 제조

멸균된 3급-부탄올 586mg, N-아세틸뮤라밀-L-알리닐-D-이소글루타미닐 L-알라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아미드-나트륨염 1mg, 문헌[참조 : Browning J. and Seeling J., Chem. and Physics of Lipids 24(1979) 103-118]에 따라 제조된 95% 순도의 나트륨(1,2-디올레오일-3-sn-포스파티딜)-(L)-세린 75mg 및 95% 순도의 (1-팔미토일-2-올레오일-3-sn-포스파티딜)-콜린(Avanti, Polar Lipids) 175mg을 환저 플라스크에 용해시킨다. 용액을 Acrodisc

(2.0×10^-7m)상에서 멸균-여과시키고, 멸균 앰플에 담아, -45℃에서 냉동시킨다. 앰플은 25℃의 온도에 이를때까지 진공 건조시키고, 아르곤 대기하에서 밀봉한다.

α 인터페론을 칼슘 및 마그네슘이 함유되지 않은 PBS중에 희석시키고, MTP- PE 1mg을 함유하는 동결건조된 합성 지질(POPC/OOPS의 몰비는 7 : 3이다) 250mg을 재구성하기 위해 2.5ml을 사용한다. 이 혼합물을 볼텍스 혼합기로 2분동안 격렬하게 진탕시키고 재볼텍싱 및 다른 PBS 2.5ml을 가하기에 앞서 30분동안 정치시킨다. 이러한 재구성 공정후에 약 20%의 인터페론이 리포좀에 결합한다는 것이 I¹²⁵로 표지된 α 인터페론을 사용할때 밝혀졌다. 이러한 방법으로 제조된 리포좀은 단지 MTP-PE만을 함유하는 리포좀과 물리적 성질이 동일하고 설치류에 정맥내 투여한후 동일한 체내 분포 양태를 따르는 것으로 나타났다. MTP-PE와 인터페론이 리포좀에 도입되었을때 봉입되지 않은 형에 비해서 약 2 내지 3배 이상의 MTP-PE와 인터페론이 폐에 도달했다. MTP-PE 리포좀에 대한 α 인터페론의 연합은 40℃에서 저장했을때 8시간에 걸쳐 안정한 것으로 나타났다.

과정

마우스의 정맥내로 PBS중에 현탁된 위약 리포좀, PBS중의 유리-인터페론 B₁D₂B₃B₄, 리포좀으로 봉입된 MTP-PE 또는 리포좀으로 봉입된 MTP-PE와 인터페론 B₁D₂B₃B₄의 배합물 각 0.2ml를 접종한다. 치료한지 약 2내지 3시간후에 HBSS중에 1 : 10으로 희석되고 0.2%의 소 혈청 알부민을 함유하는 0.05ml의 바이러스 스톡을 비강내로 챌린지시킨다.

감염 48시간후에 감염된 마우스로부터 폐를 적출시켜 10%의 균질물을 제조한다. 다음 이 균질물을 베로 세포의 단층 상에서 플라크 검정한다. 나타낸 바이러스 역가는 6-웰(32mm) 플라스틱 조직 배양 플레이트의 2개의 웰내 플라크 수에 근거한다. 폐의 무게는 10%의 현탁액으로 균질화하기전에 측정한다. 치료 그룹당 3개의 폐를 분석한다. 표준 편차값은 3개의 폐로부터 2개 샘플에서의 다양성을 나타낸다.

이 실험에 사용된 α 인터페론의 투여량은 단백질 1㎍과 등량이다; 따라서, MTP-PE의 중량비는 40 : 1이다.

B. 결과

하기의 표에 나타낸 바와 같이, 리포좀-봉입된 MTP-PE와 α 인터페론이 투여된 마우스 폐내의 바이러스 복제는 두 제제중 어느 하나만이 투여된 경우보다 상당히 낮다.

리포좀으로 봉입된_αB₁D₂B₃B₄인터페론과 MTP-PE가 투여된 마우스 폐내의 바이러스 역가

[실시예 3]

A. 재료 및 방법

동물

200 내지 300그램의 피르브라이트(Pribright) 계통의 알비노 기니아 피그 암컷을 사용하여 음부 헤르페스에 걸린 동물 바이러스 모델을 확립한다.

바이러스 및 세포배양

ATCC(VR540)으로부터 수득한 헤르페스 심플렉스 바이러스 2/MS형을 사람의 태아 폐 섬유 아세포(HEL; FLOW 2002)의 단층내에서 증식 및 유지시킨다. 감염된 세포의 85 내지 90%가 파괴될때까지 35℃에서 배양한다(48 내지 72시간).

배지 및 세포를 동결 및 해동시켜 바이러스를 수거한다; 이 현탁액을 1000 r.p.m.에서 10분동안 원심분리하고 0.5ml의 상등액을 저온튜브(Cryotubes : NUNC)에 옮겨 -180℃에서 저장한다.

기니아 피그의 음부 헤르페스

감염

체중 200 내지 300그램의 피르브라이트 계통의 알비노 기니아 피그 암컷의 질입구를 겸자로 부드럽게 개방시킨후 질내로 감염시킨다. 이후에, 5×5×4mm 크기의 섬유소포 조각(SEVAC, Prague)에 HEL중의 배양물로부터 HSV 2/MS 약 10⁴PFU를 함유하는 0.05ml을 주입한다. 이 조각을 질내로 도입한다(1 내지 2회). 동물은 제4형 마크롤론 우리(type 4 Macrolon cage)에 4 내지 5그룹으로 유지시킨다.

치료

약 90%의 동물에 3 내지 6범위의 국소 증후학 득점(하기 참조)이 나타나는 시간인 감염 3일후에, 이들 동물들을 제제당 10 내지 15마리의 그룹과 치료하지 않는 대조군으로 무작위로 나눈다. 치료는 감염 72시간후에 시작하여 5일간 매일 2회씩 투여한다. 0.1ml을 질내에 0.1ml을 질외에 적용시킨다.

증후군의 평가

3일이 경과한 후, 국부 증후군을 주당 3회 평가한다. 치료의 치료학적 효과를 평가하기 위해 적용되는 기준은 개개의 동물에서 명백한 감염 표시의 감퇴속도 및 정도이다. 국부적 증후군의 정도 및 중증도는 하기의 점수 체계에 따라 기록된다.

A. 충혈

음문 및 질의 일부에 제한된 약간의 충혈 1

음문 및 질전체에 영향을 미치는 명백한 충혈 2

음문 및 질전체에 영향을 미치는 심각한 충혈 3

B. 부종

음문 및 질의 일부에 제한된 약간의 부종 1

음문 및 질 전체에 영향을 미치는 명백한 부종 2

음문-질 및 회음에 영향을 미치는 심각하고 광범위한 부종 3

C. 수포 발생, 궤양 형성(음문질염)

1 내지 2개의 사분원에 불연속적 수포 1

1 내지 2개의 사분원에 융합적 수포 또는 3 내지 4개의 사분원에 수포, 궤양 형성 2

사분원 모두에 융합적 수포, 궤양 형성 3

최대 점수(A-C) 9

궤양 형성은 주로 감염후 14일 이후에 관찰되었다.

치료 효과의 평가

a) 3일째에 국소 증후군 회복과 비교하여 7 내지 14일 사이에 국소 증후군의 회복이 66% 이상인 동물의 수

b) 20 내지 21일 사이에 완전히 회복된 동물의 수

c) 3 내지 21일 사이의 회복 경로(평균 점수)

치료 및 비치료된 그룹간의 차이는 X²-시험 방법에 의해 조사할 수 있으며(분할표), 유의 수준(α)은 0.01이다.

이 모델은 2개의 문헌[참조 :

et al. Archiv ges. Virusforsch. 44, 15 3 -155(1974) and Lukas et al., Arch. Virol. 49, 1-11(1975) Springer Verlag]에 상세히 기술되어 있다.

과정

하기의 표에 나타낸 수의, 피르브라이트 계통의 알비노 기니아 피그(150 내지 180g 체중)를 문헌[참조B.

et al., Arch. ges. Virusforsch. 44, 153-155(1 974)]에 기술된 것같이 HEL(사람의 태아 폐)세포중에서 배양한 약 10⁴PFU(플라크-형성 단위)의 헤르페스 심플렉스 바이러스 제2형을 질내 감염시킨다.

감염 72시간 후에 하기중 하나를 포함하는 0.2ml의 겔로 5일간 하루 2회 질내 치료한다 : i) 1.5×10⁶단위/kg의 α 인터페론 B₁D₂B₃B₄; ii) 1mg/kg의 리포좀-봉입된 MTP-PE; iii)(i)과 (ii)의 혼합물. 위약 치료를 받는 기니아 피그에게는 활성 성분이 없는 겔이 주어진다. 이 겔은 하기의 조성을 가진다 :

2.25%의 나트륨 카복시메틸셀룰로오즈(Hercules, USA); 10%의 글리세린; 2차 증류수를 사용하여 100%로 제조.

비치료된 동물의 증후군은 문헌[참조 : B. Lukas et al., Arch. virol. 49, 1-11 (1975)]에 기술되어 있다.

B. 결과

하기의 표는 음부 헤르페스에 걸린 기니아 피그를 치료하기 위해 α 인터페론 B₁D₂B₃D₄단독 또는 배합하여 사용한 실험으로부터 얻어진 데이타를 요약한 것이다. 실험 1 및 2에 나타난 것같이 α 인터페론 B₁D₂B₃B₄및 MTP-PE의 치료 효과(병변평균득점에 의해 측정)는 두가지 약물 모두를 배합했을때 상승했다. 사용되는 α 인터페론 B₁D₂B₃B₄의 투여량은 10㎍/kg이며, MTP-PE의 투여량은 1000㎍/kg이다. 따라서, MTP-PE : 인터페론의 비율은 실시예 2에 사용된 비와 비교할때 100 : 1이다.

HSV-2/MS로 질내 감염시킨 기니아피그에서α-인터페론 B₁D₂B₃B₄및 MTP-PE 단독의 국소효과 및 이들 배합물의 국소효과 병변평균점수±표준오차

Claims

항바이러스 유효량 또는 대식세포 활성량의, 성분 A로서의 하이브리드α-인터페론 폴리펩타이드 B₁D₂B₃B₄와 성분 B로서의 N-아세틸-뮤라밀-L-알리닐-D-이소글루타미닐-L-알라인-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아미드의 약제학적으로 허용되는 염의 배합물을, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는, 온혈동물에서 바이러스에 의해 유발된 감염을 치료하거나 대식 세포를 활성화시키기 위한 약제학적 배합제제.
제1항에 있어서, A 대 B의 중량비가 1 : 1 내지 1 : 100인 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 성분 B가 N-아세틸-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아미드의 나트륨염인 제제.
제3항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 합성 포스파티딜콜린과 합성 포스파티딜세린의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 제조된 리포좀을 포함하는 제제.