KR0131014B1 - Anti-inflammatory factor, method of isolation and use - Google Patents

Anti-inflammatory factor, method of isolation and use

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KR0131014B1
KR0131014B1 KR1019890702252A KR890702252A KR0131014B1 KR 0131014 B1 KR0131014 B1 KR 0131014B1 KR 1019890702252 A KR1019890702252 A KR 1019890702252A KR 890702252 A KR890702252 A KR 890702252A KR 0131014 B1 KR0131014 B1 KR 0131014B1
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알. 벡크 리이
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Abstract

An anti-inflammatory factor can be isolated from milk collected from a milk-producing animal. The factor may be isolated from milk is produced by a milk-producing animal maintained in a hyperimmunized state.

Description

[발명의 명칭][Name of invention]

항염증인자, 그의 분리방법 및 이용Anti-inflammatory factor, its isolation method and use

[도면의 간단한 설명][Brief Description of Drawings]

본 발명 및 많은 부수적인 이점에 대한 보다 완전한 이해는 발명이 첨부되는 도면과 관련하여 고찰될 때 다음의 상세한 설명을 참고로 더욱 잘 이해됨에 따라 쉽게 얻어질 것이다.A more complete understanding of the invention and many of its attendant advantages will be readily obtained as the invention is better understood with reference to the following detailed description when considered in conjunction with the accompanying drawings.

제1도는 바람직한 방법의 단계 2에서, DEAE-셀룰로스 컬럼상에서의 이온-교환 크로마토그래피에 의한 MAIF의 분리.1 shows the separation of MAIF by ion-exchange chromatography on a DEAE-cellulose column in step 2 of the preferred method.

제2도는 바람직한 방법의 단계 3에서, 세파덱스 G-10 분자 시이브 컬럼상에서의 DEAE-셀룰로스 크로마토그래피(제1도)로부터의 MAIF 피이크(두번째)의 분별.2 is the fractionation of MAIF peak (second) from DEAE-cellulose chromatography (FIG. 1) on a Sephadex G-10 molecular sieve column in step 3 of the preferred method.

[발명의 상세한 설명]Detailed description of the invention

본 출원은 1982년 6월 3일 출원되고 현재 포기된 U.S.일련번호 384,625의 부분계속출원인 1987년 1월 9일 출원의 U.S.일련번호 001,848의 부분 계속출원이다; 전자는 1983년 10월 27일 출원된 U.S.일련번호 546,162와 1983년 2월 1일 출원되고 현재 포기된 U.S.일련번호 576,001의 계속출원인 1986년 9월 17일 출원의 U.S.일련번호 910,297로 분할되어 있다.This application is a partial continuing application of U.S. Serial No. 001,848, filed Jan. 9, 1987, filed June 3, 1982 and partially abandoned. The former is divided into U.S. Serial No. 546,162, filed Oct. 27, 1983, and U.S. Serial No. 910,297, filed Sep. 17, 1986, which is an ongoing application of U.S. Serial No. 576,001, filed Feb. 1, 1983 and now abandoned.

[발명의 배경][Background of invention]

[발명의 분야][Field of Invention]

본 발명은 항염증인자(AF), 실질적으로 순수한 형태의 제조방법, 및 염증치료에의 그의 이용방법에 관한 것이다FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to anti-inflammatory factors (AF), methods of making substantially pure forms, and methods of their use in the treatment of inflammation.

[배경기술의 설명]Description of Background Art

도어랜드 의학 사전에 정의된 바와 같이, 염증은 유해제제 및 손상된 조직을 파괴, 희석 또는 제거하는 작용을 하는, 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유도된 국소 보호 반응이다. 그것은 미소혈관계의 천공, 혈액요소의 세포조직사이의 공간으로의 누출, 및 염증을 일으킨 조직으로의 백혈구의 이동을 특징으로 한다. 육안으로 보이는 수준에서는, 이것은 통상 흉반, 부종, 민감증(통각 과민증), 및 고통의 친숙한 임상적 신호에 의해 이루어진다. 이 복합반응이 이루어지는 동안, 히스타민, 5-히드록시트립트아민, 다양한 화학주성인자, 브래디키닌, 류코트리엔, 및 프로스타글란딘 같은 화학조절제가 국소적으로 방출된다. 식세포가 그 부분으로 이동하며, 세포 리소좀 막이 파열될 것이며 그로써 용해 효소가 방출된다. 이런 모든 사건이 염증 반응에 기여할 것이다.As defined by Doorland Medical Dictionary, inflammation is a topical protective response induced by injury or destruction of tissue, which acts to destroy, dilute or remove the noxious agent and damaged tissue. It is characterized by perforation of the microvascular system, leakage of blood elements into the spaces between cellular tissues, and migration of white blood cells to inflamed tissue. At the visually visible level, this is usually accomplished by familiar clinical signs of thorax, edema, sensitivity (pain sensitivity), and pain. During this complex reaction, chemoregulators such as histamine, 5-hydroxytrytamine, various chemotactic factors, bradykinin, leukotriene, and prostaglandins are topically released. Phagocytes migrate to that part, and the cellular lysosomal membrane will rupture, releasing lytic enzymes. All these events will contribute to the inflammatory response.

류머티양 관절염에 걸린 환자의 염증은 아마도 항원(감마 글로불린)과 항체(류머티양 인자) 및 백혈구를 유인하는 화학주성인자의 국소 방출을 유발하는 보체의 조합을 포함한다. 백혈구는 항원-항체와 보체의 복합체에 대해 식작용을 나타내고, 또한 그것들의 리소좀에 함유된 많은 효소를 방출한다. 그러면 이들 리소좀 효소들은 연골 및 다른 조직의 상해를 유발하고 이것은 나아가 염증의 정도를 진행시킨다. 세포-중재 면역반응이 또한 포함될 수 있다. 이 과정중에 또한 프로스타글란딘이 방출된다.Inflammation in patients with rheumatoid arthritis presumably includes a combination of antigen (gamma globulin) and complement (causing a local release of chemotactic factors that attract antibodies and rheumatoid factor) and leukocytes. White blood cells exhibit phagocytosis of the complex of antigen-antibody and complement and also release many of the enzymes contained in their lysosomes. These lysosomal enzymes then cause damage to cartilage and other tissues, which further advances the degree of inflammation. Cell-mediated immune responses may also be included. Prostaglandins are also released during this process.

염증에서 생성되는 것으로 보이는 프로스타글란딘은 흉반을 초래하고, 국소혈류를 증가시킨다. 프로스타글란딘의 2가지 중요한 혈관 효과-장기 지연 혈관확장작용 및 노르에피네프린 및 안지오텐신 같은 물질의 혈관수축효과와 역작용을 하는 능력은, 일반적으로 염증의 다른 조절제와 공유되지 않는다.Prostaglandins that appear to be produced in inflammation cause thorax and increase local blood flow. The two important vascular effects of prostaglandins-long-term delayed vasodilation and the ability to counteract the vasoconstrictive effects of substances such as norepinephrine and angiotensin, are generally not shared with other modulators of inflammation.

많은 염증 조절제가 후모세관 및 소맥수집의 혈관 투과도(누출)를 증가시킨다. 또한, 백혈구의 염증부위로의 이동은 염증반응의 중요한 측면이다. 프로스타글란딘이 화학주성 반응에 직접 포함되는 것 같지 않은 반면, 아라키돈산 대사의 또다른 생성물인 류코트리엔이 매우 잠재성이 높은 화학주성 물질이다.Many inflammatory modulators increase vascular permeability (leakage) in postcapillary and wheat collection. In addition, the migration of leukocytes to the inflammatory site is an important aspect of the inflammatory response. While prostaglandins do not seem to be directly involved in the chemotaxis reaction, leukotriene, another product of arachidonic acid metabolism, is a highly chemotactic substance.

항염증반응은 상기 규정된 바와 같은 염증을 특징으로 하는 어떠한 반응이다.An anti-inflammatory response is any response characterized by inflammation as defined above.

염증반응이 상이한 질병 및 상해와 관련되는 많은 육체적 불편, 즉, 고통과 기능의 손실을 초래한다는 것은 의학분야에 숙련된 사람들에게는 잘 알려진 것이다. 따라서, 염증 반응을 중화시키는 효과를 나타내는 약리학적 제제를 투여하는 것이 통상적인 의학적 관행이다. 이런 성질을 가지는 제제는 항염증제로서 분류된다. 항염증제는 광범위한 장해의 치료에 사용되며, 동일 약제가 때로 상이한 질병을 치료하기 위해 사용된다. 항염증제를 이용한 치료는 질병이 아니라, 증상, 즉, 염증에 대해 가장 자주 사용된다.It is well known to those skilled in the medical arts that inflammatory reactions result in many physical discomforts associated with different diseases and injuries, namely pain and loss of function. Therefore, it is common medical practice to administer pharmacological agents that have the effect of neutralizing the inflammatory response. Agents with this property are classified as anti-inflammatory agents. Anti-inflammatory agents are used to treat a wide range of disorders, and the same agents are sometimes used to treat different diseases. Treatment with anti-inflammatory agents is most often used for symptoms, i.e. inflammation.

항염증제, 진통제 및 해열제는 때로 화학적으로는 무관하지만, 그래도 특정 치료작용 및 부작용을 공유하는 화합물들의 이종 군이다. 코르티코스테로이드가 항염증 반응의 치료를 위한 화합물 중 가장 광범위하게 사용되는 종류를 나타낸다. 단백질분해 효소는 항염증 효과를 가지는 것으로 주장되는 화합물의 또다른 종류를 나타낸다.Anti-inflammatory, analgesic and antipyretic agents are a heterogeneous group of compounds that are sometimes chemically irrelevant but still share certain therapeutic actions and side effects. Corticosteroids represent the most widely used class of compounds for the treatment of anti-inflammatory responses. Proteolytic enzymes represent another class of compounds that are claimed to have anti-inflammatory effects.

부신피질이 스테로이드를 생성 및 분비하는 것을 직접 또는 간접으로 유도하는 호르몬은 항염증 화합물의 또 다른 종류를 나타낸다. 많은 비-호르몬성 항염증제가 기재되어 있다.Hormones that directly or indirectly induce the adrenal cortex to produce and secrete steroids represent another class of anti-inflammatory compounds. Many non-hormonal anti-inflammatory agents have been described.

이들 중에서, 가장 광범위하게 사용되는 것은 살리실산 염이다. 아세틸 살리실산, 또는 아스피린이 가장 광범위하게 처방되는 진통-해열 및 항염증제이다.Of these, the most widely used are salicylic acid salts. Acetyl salicylic acid, or aspirin, is the most widely prescribed analgesic-antipyretic and anti-inflammatory agent.

스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증제의 실례는 Physician's Desk Reference, 1987(pp 207,208. 그러한 제제의 색인,참조)에 나열되어 있다.Examples of steroidal and non-steroidal anti-inflammatory agents are listed in Physician's Desk Reference, 1987 (pp 207,208. Index of such formulations, see).

천연 및 합성 코르티코스테로이드 제제는 혈압상승, 염 및 물 보유, 및 칼륨 및 칼슘 배설의 증가를 포함한 많은 심각한 부작용을 유발한다.Natural and synthetic corticosteroid preparations cause many serious side effects, including elevated blood pressure, salt and water retention, and increased potassium and calcium excretion.

더욱이, 코르티코스테로이드는 감염의 신호를 차단하고 감염성 미생물의 보급을 증강시킬 수 있다. 이들 호르몬은 임신중의 부인에게 사용하기에는 안전하지 못한 것으로 생각되며, 장기간의 코르티코스테로이드치료는 위 과민증 및/ 또는 소화성 궤양과 관련되어 왔다.Moreover, corticosteroids can block the signal of infection and enhance the spread of infectious microorganisms. These hormones are not considered safe for use by pregnant women, and long-term corticosteroid treatment has been associated with gastric hypersensitivity and / or peptic ulcers.

이들 화합물로의 치료는 또한 보다 많은양의 인슐린을 필요로 하는 당뇨증을 악화시킬 수 있으며, 정신이상 장해를 초래할 수 있다. 내인성 코르티코스테로이드의 생성을 간접적으로 증가시키는 호르몬성 항염증제는 동일한 정도의 유해한 부작용을 갖는다.Treatment with these compounds can also exacerbate diabetes, which requires a greater amount of insulin, and can lead to psychotic disorders. Hormonal anti-inflammatory drugs that indirectly increase the production of endogenous corticosteroids have the same harmful side effects.

비-호르몬성 항염증제는 고용량에서 광범위한 바람직하지 못한 부작용을 수반하는, 독성일 수 있는 합성생화학적 화합물이다. 예를들어, 살리실산염은 이 화합물 종류에 의한 중독을 특징으로 하는 위험한 산-염기 평형 방해에 기여한다. 살리실산염은 호흡을 직접 및 간접적으로 자극한다. 독성량의 살리실산염은 혈관운동 강하에 이차적인 순환성 쇼크뿐만 아니라 중추 호흡 마비를 초래한다. 살리실산염의 섭취는 상복부의 고통, 구역질, 및 구토를 유발할 수 있다. 살리실산염-유도 위출혈은 잘 알려져 있다.Non-hormonal anti-inflammatory agents are synthetic biochemical compounds that can be toxic, involving a wide range of undesirable side effects at high doses. For example, salicylates contribute to dangerous acid-base equilibrium disturbances characterized by poisoning by this class of compounds. Salicylate stimulates breathing directly and indirectly. Toxic salicylates cause central respiratory palsy as well as secondary cyclic shock to vasomotor depression. Ingestion of salicylates can cause pain, nausea, and vomiting of the upper abdomen. Salicylate-induced gastric bleeding is well known.

살리실산염은 간 상해를 초래할 수 있고, 응고 시간의 지연을 유도할 수 있다. 그러므로, 심각한 간 손상, 저프로트롬빈혈증, 비타민 K 결핍증, 또는 혈우병 환자에게는 실리실산염에 의한 혈소판 지혈의 저해가 혈우병을 유발할 수 있으므로, 아스피린 사용을 금해야 한다. 살리실산염 중독은 흔히 있는 일이고, 심각한 살리실산염 중독의 10,000경우 이상이 년간 미합중국에서 발생하며, 그들 중 약간은 치명적인 것이 되고, 많은 경우 어린이에게서 일어난다.Salicylates can lead to liver injury and lead to a delay in the coagulation time. Therefore, the use of aspirin should be avoided in patients with severe liver damage, hypoprothrombinemia, vitamin K deficiency, or hemophilia, as inhibition of platelet hemostasis by sillylate may cause hemophilia. Salicylate poisoning is a common occurrence, with more than 10,000 cases of severe salicylate poisoning occurring in the United States for a year, some of which become fatal and in many cases children.

굳맨과 길맨의 The Pharmacological Basis of Therapeutics, 제7판, 1985, 참조. 따라서, 현재 대다수의 항염증제가 활용되고 있음에도 불구하고, 부작용 및 역반응이 없는 안전하고 효과적인 항염증 생성물이 여전히 요구된다.See Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th edition, 1985. Thus, despite the current use of the majority of anti-inflammatory agents, there is still a need for safe and effective anti-inflammatory products without side effects and adverse reactions.

예를들어, 우유에서 유도되는 것과 같은 천연 식품이 항염증 효과를 가지는 것으로 얻어질 수 있다면, 그것은 쉽게 투여가능하고 쉽게 활용가능한 안전한 치료 조성물이 될 것이다.For example, if a natural food such as derived from milk could be obtained with an anti-inflammatory effect, it would be a safe therapeutic composition that is easily administrable and readily available.

선행 기술 분야에는 다양한 치료효과를 가지는 우유를 제조하는 것이 공지되어 있다. 예를들어, 벡크(Beck)는 충치 저해 효과를 가지는, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항체를 함유하고 있는 우유를 개시한 바 있다(미국 특허 제4,324,782호). 그 우유는 소를 스트렙토코커스 뮤탄스 항원으로 2단계로 면역시킴으로써 얻어지며, 그것으로부터 치료용 우유가 얻어진다.It is known in the art to produce milk having various therapeutic effects. For example, Beck discloses milk containing antibodies against Streptococcus mutans, which have caries inhibitory effects (US Pat. No. 4,324,782). The milk is obtained by immunizing cattle in two steps with Streptococcus mutans antigen, from which therapeutic milk is obtained.

스톨(Stolle)등은 동물의 흡연과 관련된 혈관 장해 또는 폐 장해 치료방법을 개시하였으며, 그 방법은 초면역 상태로 유지되고 있는 소로부터 취한 우유를 동물에게 투여하는 것으로 이루어진다(미국 특허 제4,636,384호).Stolle et al. Have disclosed a method for treating vascular or lung disorders associated with smoking in an animal, the method comprising administering to the animal milk taken from a cow that is in a superimmune state (US Pat. No. 4,636,384). .

벡크는 항염증 인자 생성 상태로 유지된 소로부터 수집한 우유의 항염증적으로 유효한 양을 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는, 동물의 염증치료방법을 개시하였다(미국 특허 제4,284,623호). 하인바흐(Heinbach, 미국 특허 제3,128,230호)는 소를 항원 혼합물로 접종시킴에 의한 알파, 베타, 및 감마 성분의 글로불린을 함유하고 있는 우유를 기재한 바 있다. 피터슨 등(미국 특허 제3,376,198호), 홀름(미국출원(공개) 일련번호 제628,987호), 투나 등 (영국 특허 제1,211,876호)및 비오케마 에스. 에이.(영국 특허 제1,442,283호)도 또한 항체-함유 우유를 기재하였었다.Beck discloses a method for treating inflammation in an animal, comprising administering to the animal an anti-inflammatory amount of milk collected from a cow maintained in anti-inflammatory factor production (US Pat. No. 4,284,623). Heinbach (US Pat. No. 3,128,230) described milk containing globulins of alpha, beta, and gamma components by inoculating cattle with antigen mixtures. Peterson et al. (US Pat. No. 3,376,198), Holm (US Application No. 628,987), Tuna et al. (UK Pat. No. 1,211,876) and Biokema S. A. (UK Patent No. 1,442,283) also described antibody-containing milk.

그러나 상기 언급한 참고문헌중 어느것도 소정의 치료 효과를 나타내는 치료용 우유의 성분 또는 성분들의 정체를 개시한 것은 없다. 예컨대, 벡크의 미국 특허 제4,284,623호에서 치료수단으로서 사용된 우유제품은 유동성 전체우유, 지방이 없는 유동성 유장이거나, 또는 전체 우유 분말로 이루어진다.However, none of the references cited above discloses the identity of the ingredients or ingredients of the therapeutic milk which exhibits the desired therapeutic effect. For example, the milk product used as a treatment in Beck's US Pat. No. 4,284,623 is a liquid whole milk, a fluid whey without fat, or consists of whole milk powder.

이들 우유 제품의 각각이 비록 항염증성질을 가지고는 있지만, 실제로 치료상의 유익함을 제공하는 인자 또는 인자들은 아직까지 분리 또는 확인되지 않았다.Although each of these milk products has anti-inflammatory properties, the factors or factors that actually provide therapeutic benefit have not yet been isolated or identified.

[발명의 개요][Overview of invention]

본 발명은 분리 및 정제된 항염증 우유생성물이 동물의 항염증 장해를 치료하는데 가장 유용할 것이라는 본 발명자들의 고찰을 토대로 한다.The present invention is based on the inventors' view that isolated and purified anti-inflammatory milk products will be most useful for treating anti-inflammatory disorders in animals.

이것을 염두에 두고, 본 발명자들은 이하 우유 항염증 인자(MAIF)라 부르는, 초면역 소과 동물의 우유로부터의 항염증 인자를 분리하여 부분적으로 정제하고 특성을 확인하였다.With this in mind, the inventors have isolated, partially purified and characterized the anti-inflammatory factors from the milk of superimmune bovine animals, hereinafter referred to as milk anti-inflammatory factors (MAIF).

진일보한 연구는 이 우유 생성물이 염증의 임상적 증상을 방지 또는 완하시켰음을 입증하였다. 따라서, 본 발명은 사전에 특정 다가 항원에 대하여 초면역된 우유-생산 동물의 우유로부터 분리된 항염증 인자가, 상기 분리 및 정제된 항염증 인자가 항염증 효과를 나타내기에 충분한 양생법하에 일정량으로 투여되는 경우, 염증상태에 대하여 효과적이라는 발견이다. 이 발견은 특히, 다가항원 백신 자체가 MAIF를 함유하지 않는다는 사실의 견지에서 놀랄만한 것이다.Further studies have demonstrated that this milk product prevented or alleviated the clinical symptoms of inflammation. Accordingly, the present invention provides that an anti-inflammatory factor isolated from milk of a milk-producing animal previously immunized to a specific multivalent antigen is administered in an amount under curing regimen sufficient for the isolated and purified anti-inflammatory factor to exhibit an anti-inflammatory effect. If so, it is found to be effective against inflammatory conditions. This finding is particularly surprising in view of the fact that the multivalent antigen vaccine itself does not contain MAIF.

초면역된 소과 동물의 우유로부터의 활성인자의 분리는 MAIF가 정상 소과 동물의 우유에 소량 존재한다는 예기치 않았던 발견을 유도하였다. 이 발견은 정상 소과 동물의 우유중의 MAIF의 농도가 우유에 식별 가능한 항염증 성질을 부여하기에는 너무 낮다는 사실에 의하여 가리워져 왔었다. 그러나, 정상 우유의 MAIF는 본 발명의 분리방법에 의하여 농축될 수 있고, 그런 다음 염증 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.Isolation of activators from the milk of superimmunized bovine animals led to the unexpected discovery that MAIF was present in small amounts in normal bovine milk. This finding has been masked by the fact that the concentration of MAIF in milk of normal bovine animals is too low to impart identifiable anti-inflammatory properties to milk. However, MAIF of normal milk can be concentrated by the isolation method of the present invention and then effectively used to treat inflammation.

[바람직한 구체예의 상세한 설명][Detailed Description of Preferred Embodiments]

본 발명은 MAIF의 분리 및 정제와 항염증 장해를 치료할 목적의 상기 MAIF의 동물에의 투여를 포함한다.The present invention includes isolation and purification of MAIF and administration of said MAIF to an animal for the purpose of treating anti-inflammatory disorders.

용어 우유 항염증 인자(MAIF)는 초면역 우유 또는 정상 우유로부터 얻어진 인자를 의미한다. 용어 실질적으로 순수한 MAIF는, 본 발명의 목적에 대해서는, 고분자량 물질(10,000달톤)의 제거 및 이온교환 크로마토그래피에 의해 저분자량이고 음성-전하인 종을 분리한 후, HPLC 크로마토그래피 상에서 단일한 주된 대칭 피이크로서 용출되는 항염증인자를 의미한다. 정상 우유 및 초면역 우유 두 가지 모두 MAIF를 얻기 위해 본원에 기재된 방법에 의하여 가공처리될 수 있다.The term milk anti-inflammatory factor (MAIF) refers to a factor obtained from superimmune milk or normal milk. The term substantially pure MAIF is, for the purposes of the present invention, the separation of low molecular weight and negatively-charged species by removal of high molecular weight material (10,000 Daltons) and ion exchange chromatography, followed by a single principal on HPLC chromatography. An anti-inflammatory factor that elutes as a symmetrical peak. Both normal milk and superimmune milk can be processed by the methods described herein to obtain MAIF.

용어 초면역 우유는, 본발명의 목적에 대해서는, 초면역 상태로 유지된 우유-생산 동물로부터 얻어진 우유를 말하며, 초면역에 대한 상세한 설명은 아래에서 보다 상세하게 기재하기로 한다.The term superimmune milk, for the purposes of the present invention, refers to milk obtained from a milk-producing animal maintained in a superimmune state, the details of which are described in more detail below.

용어 탈지유는 본 발명의 목적에 대해서, 크림이 제거된 우유를 의미한다.The term skim milk, for the purposes of the present invention, means milk with cream removed.

용어 유장은 본 발명의 목적에 대해서, 크림과 카제인성 물질이 제거된 우유를 의미한다.The term whey refers to milk for which the cream and casein substance have been removed for the purposes of the present invention.

용어 정상우유는 본 발명의 목적에 대해서, 종래수단 및 낙농관행에 의해 우유-생산 동물로부터 얻어지는 우유를 의미한다.The term normal milk, for the purposes of the present invention, means milk obtained from a milk-producing animal by conventional means and dairy practices.

용어 우유-생산 동물은 본 발명의 목적에 대해서, 상업적으로 적합한 양의 우유를 생산하는 포유동물을 의미하며, 바람직하게는 소, 양 및 염소이고, 보다 바람직한 것은 보스(Bos)(소과)속의 낙농소, 특히, 홀스타인같은, 고수율의 우유를 제공하는 품종이다.The term milk-producing animal means, for the purposes of the present invention, a mammal producing a commercially suitable amount of milk, preferably cows, sheep and goats, more preferably dairy in the Bos (Bovine) family. Cows, especially Holstein, provide high yields of milk.

용어 박테리아 항원은 본 발명의 목적에 대해서, 가열-사멸된 박테리아 세포의 동결건조된 제제를 의미한다.The term bacterial antigen means, for the purposes of the present invention, a lyophilized preparation of heat-killed bacterial cells.

용어 미소캡슐 형태는 본 발명의 목적에 대해서, 우유-생산 동물에 투여하기 위한 박테리아 항원을 하나 또는 그 이상 캡슐화하는 중합미소입자를 의미한다.The term microcapsule form means, for the purposes of the present invention, polymerized microparticles which encapsulate one or more bacterial antigens for administration to a milk-producing animal.

용어 염증은 본 발명의 목적에 대해서, 유해 제제 및 상해된 조직 두가지를 모두 파괴, 희석 또는 제거하는, 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유도된 국소 보호 반응을 의미하며, 그것은 급성형태의 고통, 열, 적열, 종창, 및 기능 손실이라는 고전적인 순서를 특징으로 하고, 조직학적으로는 소동맥, 모세혈관, 및 투과도 및 혈류속도가 증가된 소맥의 확장을 포함하는 사건들의 복합적인 연속, 혈장 단백질을 포함하는 유동액의 삼출, 및 백혈구의 염증 병소로의 이동을 포함한다.The term inflammation means, for the purposes of the present invention, a topical protective response induced by injury or destruction of tissues that destroys, dilutes or eliminates both harmful agents and injured tissues, which means acute forms of pain, heat, Characterized by the classical sequence of redness, swelling, and loss of function, histologically comprising a complex sequence of events, including plasma arteries, capillaries, and the expansion of wheat with increased permeability and blood flow rate. Effusion of fluid, and migration of leukocytes to inflammatory lesions.

용어 치료는 본 발명의 목적에 대해서, 장해의 증상 및/또는 장해의 병원성 원인이 호전 또는 완전히 제거되는 것을 의미한다.The term treatment means for the purposes of the present invention that the symptoms of the disorder and / or the pathogenic cause of the disorder are improved or eliminated completely.

용어 투여는 본 발명의 목적에 대해서, 예컨대 경구, 비내, 비경구(정맥내, 근육내, 또는 피하), 또는 직장투여와 같이, 환자에게 물질을 사용하여 치료하는 어떠한 방법을 의미한다.The term administration refers to any method of treatment with a substance for the purposes of the present invention, such as oral, nasal, parenteral (intravenous, intramuscular, or subcutaneous), or rectal administration.

용어 동물은 본 발명의 목적에 대해서, 사람, 농장 동물, 가축 또는 동물원의 동물들을 포함하여 염증이 일어날 수 있는 어떠한 살아있는 동물을 의미한다.The term animal means, for the purposes of the present invention, any living animal in which inflammation can occur, including humans, farm animals, livestock, or animals of a zoo.

본 발명의 분리 및 정제된 우유 생성물에 의해 치료될 수 있는 염증상태의 실례로는 급성 및 하위급성 활액낭염, 급성 비-특이적 건염, 전신 낭창 홍반, 전신 피부근염, 급성 류마티성 심장염, 천포창, 수포성 피부염, 포진모양의 염증, 중증의 홍반, 다형 박리성 피부염, 간경변, 계절성 반복성 비염, 기관지 천식, 전위 피부염, 혈청병, 각막염, 눈의 홍채염, 확산 유레이티스(diffuse ureitis), 맥락막염, 눈의 신경염, 교감성 안염, 유육종증 증상, 뢰플러 증후군, 베릴륨중독증, 용혈성 빈혈, 유선염, 유양돌기염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 건선성 관절염, 유착 척추염, 급성 통풍성 관절염, 및 대상 포진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상태들이 있다. 나아가, 분리 및 정제된 우유 생성물은 잠재적으로 염증성 제제에 노출되는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.Examples of inflammatory conditions that can be treated by the isolated and purified milk products of the present invention include acute and subacute bursitis, acute non-specific tendinitis, systemic lupus erythema, systemic dermatitis, acute rheumatic heartitis, pemphigus , Bullous dermatitis, herpes-like inflammation, severe erythema, polymorphic dermatitis, liver cirrhosis, seasonal recurrent rhinitis, bronchial asthma, dislocation dermatitis, serum disease, keratitis, eye iris, diffuse ureitis, choroiditis, Neuritis of the eye, sympathetic ophthalmopathy, sarcoidosis symptoms, Loepl syndrome, beryllium poisoning, hemolytic anemia, mastitis, mastoiditis, contact dermatitis, allergic conjunctivitis, psoriatic arthritis, adherent spondylitis, acute gouty arthritis, and herpes zoster There are states selected from the group. Furthermore, isolated and purified milk products can be used to treat individuals who are potentially exposed to inflammatory agents.

본 발명은 부분적으로는, 소과의 동물같은 우유-생산 동물이 초면역이라는 특정 상태에 처하게 될때, 동물이 초정상수준의 매우 유익한 MAIF를 가지는 우유를 생산할 것이며, 그 MAIF는 사람 및 다른 동물에서 염증 증상을 억제할 뿐만 아니라, 수용체내의 염증성 제제의 존재의 사전 예방제가 된다는 발견을 토대로 한다.The present invention is, in part, when a milk-producing animal, such as a bovine animal, is placed in a particular state of superimmunity, the animal will produce milk with a supernormal level of very beneficial MAIF, which is in humans and other animals. It is based on the finding that it not only suppresses the symptoms of inflammation but also is a prophylactic agent for the presence of inflammatory agents in the receptor.

용어 초정상수준은 초면역되지 않은 동물의 우유에서 발견되는 과잉수준을 말한다.The term supernormal level refers to excess levels found in milk of non-immunized animals.

면역 민감성 단독의 유도는, 소가 소질병에 대한 정상면역감작중에 및 환경에의 정상적인 노출중에 다양한 항원에 대하여 민감해진다 하더라도 정상적인 소의 우유는 이런 초정상 수준을 함유하지 않는다는 사실에 의해 알 수 있는 바, 우유의 MAIF의 초정상수준의 발현을 유발하기에는 불충분하다. 특정한 초면역 상태에서만 우유가 소정의 초정상 수준을 가진다.Induction of immune sensitivity alone is indicated by the fact that normal cow's milk does not contain these ultranormal levels, even if the cow becomes sensitive to various antigens during normal immune sensitization to small disease and during normal exposure to the environment. Insufficiently, the milk is inadequate to induce the expression of MAF levels in milk. Only in certain hyperimmune states does the milk have a certain supernormal level.

이런 특별한 상황은 초기면역감작을 실시하고, 이어서 충분히 고용량의 특정 항원으로 주기적인 추가면역을 시행하므로써 이루어질 수 있다.This particular situation can be achieved by conducting an initial immunosensitization followed by periodic additional immunization with a sufficiently high dose of the specific antigen.

추가면역의 바람직한 용량은 소과 동물의 1차 면역감작을 유발하기에 필요한 용량의 50%이거나 또는 50% 이상이어야 한다. 그에따라, 소가 정상적으로는 면역상태라 불릴수 있을 때라도, 역치 추가면역 용량은 그 성질이 우유에 나타나지 않는 양보다 낮다. 필수적인 초면역 상태를 이루기 위해서는, 첫번째 연속되는 추가면역 투여후에 초면역 우유를 시험하는 것이 필수적이다. 만약 우유에 유익한 인자가 존재하지 않는다면, 고용량의 추가의 추가면역이 그 성질이 우유에 나타날때까지 투여된다.Preferred doses of additional immunity should be at least 50% or at least 50% of the dose necessary to induce primary immune sensitization in bovine animals. Thus, even when a cow can normally be called an immune state, the threshold additional immune dose is lower than the amount whose properties do not appear in milk. To achieve the necessary superimmune status, it is essential to test the superimmune milk after the first subsequent booster immunization. If no beneficial factors are present in milk, a high dose of additional additional immunity is administered until its properties appear in milk.

초정상수준의 MAIF를 함유하는 초면역 우유의 제조방법은 1987년 7월 2일에 출원되고 공동 계류중에 있는 미국 일련번호 제069,139호와, 1983년 2월 1일 출원된 미국 특허출원 일련번호 제576,001호의 계속인 1986년 9월 17일에 출원되고 공동 계류중에 있는 미국 일련번호 제910,297호(이들은 모두 참고로 본원에 삽입됨)에 개시되어 있다.Methods for preparing superimmune milk containing MAIF at an ultra normal level are described in US Serial No. 069,139, filed on July 2, 1987 and co-pending, and US Patent Application Serial No. 1, filed February 1, 1983. US Serial No. 910,297, filed September 17, 1986, which is a continuation of 576,001, all of which are incorporated herein by reference.

요약하면, 초정상수준의 MAIF를 함유하고 있는 초면역 우유를 제조하는 한가지 방법은 다음 단계로 이루어진다 :In summary, one method of making superimmune milk containing ultra normal levels of MAIF consists of the following steps:

(1) 항원 선택 단계; (2) 소과 동물의 1차 면역감작단계; (3) 민감성 유도를 확인하기 위한 혈청 시험 단계; (4) 적절한 용량의 추가면역으로 초면역시키는 단계; 임의로, (5) 항염증성질에 대하여 우유를 시험하는 단계; (6) 초면역 소과 동물로부터 우유를 수집하는 단계; 그리고 (7) 우유를 가공처리하여 MAIF를 분리하는 단계.(1) antigen selection step; (2) primary immunosensitization of bovine animals; (3) serum test steps to confirm sensitivity induction; (4) superimmunizing with an appropriate dose of additional immunity; Optionally, (5) testing milk for anti-inflammatory properties; (6) collecting milk from the superimmune bovine animal; And (7) processing milk to separate MAIF.

단계 1 : 어느 한 항원 또는 항원들의 조합이라도 사용할 수 있다. 항원은 박테리아, 바이러스, 원생동물, 진균, 세포, 또는 우유-생산 동물의 면역계가 반응을 보일 어떠한 다른 물질일 수 있다. 이 단계에서 결정적인 것은 항원(들)이 우유-생산동물에서 면역 및 초면역 상태를 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 우유의 MAIF를 정상수준 이상으로 생성할 수 있어야 한다는 것이다. 어떠한 항원이라도 정상이상 수준의 MAIF를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 백신은 아래 실시예 1A에 상세하게 기재되는, 시리즈 100백신으로서 언급되는 다가 박테리아 항원의 혼합물이다.Step 1: Any antigen or combination of antigens may be used. The antigen can be a bacterium, virus, protozoa, fungus, cell, or any other substance to which the immune system of a milk-producing animal will respond. What is crucial at this stage is that the antigen (s) must not only induce immune and hyperimmune states in milk-producing animals, but also be able to produce MAIF in milk above normal levels. Any antigen can be used to produce MAIF above normal levels. One preferred vaccine is a mixture of multivalent bacterial antigens referred to as series 100 vaccines, described in detail in Example 1A below.

단계 2 : 항원(들)은 증강을 유발하는 어떠한 방법으로도 투여될 수 있다 .한가지 방법에서, 1×106내지 1×1020, 바람직하게는 108내지 1010, 가장 바람직하게는 2×108의 가열-사멸된 박테리아로부터 유도된 항원으로 이루어진 백신이 근육내 주사에 의해 투여된다. 그러나, 정맥내 주사, 복강내 주사, 직장 좌제, 또는 경구 투여같은 다른 방법도 사용될 수 있다.Step 2: The antigen (s) can be administered by any method that induces augmentation. In one method, 1 × 10 6 to 1 × 10 20 , preferably 10 8 to 10 10 , most preferably 2 × A vaccine consisting of 10 8 antigens derived from heat-killed bacteria is administered by intramuscular injection. However, other methods may also be used, such as intravenous injection, intraperitoneal injection, rectal suppository, or oral administration.

단계 3 : 우유-생산 동물이 항원에 민감하게 되는지의 여부를 측정할 필요가 있다. 민감성을 시험하는 많은 방법이 면역학의 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다(Methods in Immunology and Immunochemistry, William, C.A., and Chase, W.M., Academic Press, New York, 제1-5권(1975)). 바람직한 방법은 항원으로서 다중 박테리아 종을 포함하고 있는 다가 백신을 사용하여 백신의 도전 전 및 후에 동물의 혈청중의 응집항체의 존재에 대하여 시험하는 것이다. 백신을 이용한 면역감작 후의 우유 항체의 출현은 민감성을 가리킨다; 이 때에 단계 4로 진행하는 것이 가능하다.Step 3: It is necessary to determine whether the milk-producing animal is sensitive to antigen. Many methods for testing sensitivity are known to those skilled in the art of immunology (Methods in Immunology and Immunochemistry, William, C.A., and Chase, W.M., Academic Press, New York, Vol. 1-5 (1975)). A preferred method is to test for the presence of aggregated antibodies in the serum of animals before and after challenge of the vaccine using a multivalent vaccine containing multiple bacterial species as antigen. The appearance of milk antibodies after immunosensitization with vaccines indicates sensitivity; At this time, it is possible to proceed to step 4.

단계 4 : 이 단계는 감응된 동물에서 초면역상태의 유도 및 유지를 포함한다. 이 단계는 1차 증강을 이루기 위하여 사용한 것과 동일한 다가 백신을 고정된 시간 간격으로 반복 추가면역 투여하므로써 이루어진다. 2주의 추가면역 간격이 다가 박테리아 항원에 가장 적합하다. 그러나, 동물이 초면역 상태에서 항원에 대하여 면역 내성의 상태로 계대되지 않는 것을 확실히 할 필요가 있다.Stage 4: This stage involves the induction and maintenance of superimmunity in the sensitized animal. This step is achieved by repeating additional immune challenge at fixed time intervals with the same multivalent vaccine used to achieve the first enhancement. The two-week additional immunity interval is most suitable for multivalent bacterial antigens. However, it is necessary to ensure that the animal is not passaged in a state of immune resistance to the antigen in the superimmune state.

바람직한 구체예에서, 소과 동물의 초면역 감작은 아래의 실시예 1B에서 상세하게 기재되는 것처럼 제조된, 미소캡슐화된 백신의 단일 투여에 의해 이루어질 수 있다. 초면역감작의 제어된 방출형태의 이점은 항원에 대한 일정한 노출이 초면역상태로 동물이 유지되는 것을 확실하게 해준다는 것이다.In a preferred embodiment, superimmune sensitization of bovine animals can be achieved by single administration of microencapsulated vaccines, prepared as described in detail in Example 1B below. An advantage of the controlled release form of hyperimmune sensitization is that constant exposure to the antigen ensures that the animal remains in the superimmune state.

다른 구체예에서, 상이한 면역감작과정, 예컨대 미소캡슐화된 및 액체항원의 동시투여, 또는 1차 면역감작을 위한 근육내 주사, 및 경구투여 또는 미소캡슐화 수단에 의한 비경구 투여에 의한 추가면역 투여를 조합하는 것이 또한 가능하다. 1차 및 초면역감작의 많은 상이한 조합이 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다.In another embodiment, additional immunological processes such as co-administration of microencapsulated and liquid antigens, or intramuscular injection for primary immunosensitization, and parenteral administration by parenteral administration by oral or microencapsulation means, may be employed. It is also possible to combine. Many different combinations of primary and hyperimmune sensitization are known to those skilled in the art.

단계 5 : 항염증 활성수준에 대하여 우유를 시험하는 것이 필요하다. 이것은 초면역 우유 또는 염증시에 유도된 생성물의 어느 하나의 효과를 시험하는 어떠한 연구 기법에 의하여 이루어질 수 있다. 쥐 발의 화학 약품-유도 염증은 항염증제에 대한 표준 측정이다.Step 5: It is necessary to test milk for anti-inflammatory activity level. This can be done by any research technique that tests the effects of either the superimmune milk or the product induced upon inflammation. Chemical-induced inflammation of the rat paws is the standard measure for anti-inflammatory agents.

단계 6 : 이 단계는 우유의 수집 및 가공처리를 포함한다. 우유는 종래 방법에 의하여 수집될 수 있다. MAIF를 분리하기 위한 가공처리법은 아래에서 설명한다.Step 6: This step involves the collection and processing of the milk. Milk can be collected by conventional methods. Processing for separating MAIF is described below.

MAIF를 분리, 정제 및 시험하는 가장 간단한 방법은 다음 단계들로 이루어진다 :The simplest way to isolate, purify and test MAIF consists of the following steps:

1. 초면역우유를 탈지하여 탈지유를 제조하는 단계;1. Degreasing superimmunized milk to produce skim milk;

2. 탈지유로부터 카제인을 제거하여 유장을 제조하는 단계;2. removing casein from skim milk to prepare whey;

3. 유장으로부터 한외여과에 의하여 약 10,000달톤보다 큰 분자량을 가지는 고분자를 제거하는 단계;3. removing polymers having a molecular weight greater than about 10,000 Daltons by ultrafiltration from whey;

4. 이온교환수지 컬럼을 사용하여 단계 3으로부터의 생성물을 분별하여 분자량이 약 10,000달톤보다 적은 음성-전하 MAIF종을 분리하는 단계;4. fractionating the product from step 3 using an ion exchange resin column to separate negative-charge MAIF species having a molecular weight of less than about 10,000 Daltons;

5. 분자 시이브 크로마토그래피에 의하여 단계 4로부터 음성-전하종을 분리하는 단계; 그리고5. separating negative-charged species from step 4 by molecular sieve chromatography; And

6. 단계 5로부터의 MAIF의 생물학적 측정단계.6. Biological measurement of MAIF from step 5.

우유인자의 항염증작용은 카라기난 용액을 쥐의 발에 주사하므로써 유발되는 부종에 대해 시험된다.The anti-inflammatory action of milk factor is tested for edema caused by injection of carrageenan solution into the rat's foot.

쥐의 발 시험은 항염증제에 대한 표준동물시험이다(Winter, C.A., Risley, G.A., Nuss, A.W., Carrageenin-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs,Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3 : 544(1967)). 각종 다른 시험도 사용될 수 있다[Wetnick, A.S., and Sabin, C., The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats, Jap. J. Pharm. 22 : 741(1972)]. 그러나, 쥐의 발 시험이 활용가능한 가장 간단하고 직접적인 시험으로 모든 항염증제에 대해 만족할만한 것으로 밝혀졌다.The rat's foot test is a standard animal test for anti-inflammatory agents (Winter, CA, Risley, GA, Nuss, AW, Carrageenin-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs, Proc. Soc. Biol.Med. 3: 544 (1967)). Various other tests may also be used [Wetnick, A.S., and Sabin, C., The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats, Jap. J. Pharm. 22: 741 (1972). However, the rat's foot test was found to be satisfactory for all anti-inflammatory agents with the simplest and most straightforward test available.

이 시험은 쥐의 발시험을 설명하는 정도로 본원에 참고로 삽입된 미국 특허 제4,284, 623호(Beck)에 상세하게 기재되어 있다. 간단히 말하면, 이 시험은 소량의 카라기난을 성인 백색 쥐의 다리끝부분에 주사하는것을 포함한다. 이것은 염증반응을 유도하는 것으로 알려진다. 그 결과의 팽창도는 정량될 수 있다. AF를 함유하고 있는 샘플이 적당한 경로에 의하여, 바람직하게는 복강내 주사에 의하여 쥐에 투여되고, 염증 진행의 봉쇄 또는 호전은 용적측정 또는 중량측정 방법의 어느하나에 의해 정량된다.This test is described in detail in US Pat. Nos. 4,284, 623 (Beck), incorporated herein by reference to the extent that the rat's foot test is described. In short, this test involves the injection of a small amount of carrageenan into the leg tip of an adult white rat. It is known to induce an inflammatory response. The resulting degree of expansion can be quantified. Samples containing AF are administered to the rat by a suitable route, preferably by intraperitoneal injection, and the blockade or improvement of inflammatory progression is quantified by either volumetric or gravimetric methods.

요약하면, 우유의 탈지, 카제인 제거, 10,000달톤이상의 고분자 제거, 및 이온교환 및 분자 시이브 크로마토그래피의 수행이라는 방법에 의하여 초면역된 우유로부터 항염증인자를 분리할 수 있다. 항염증인자의 적절한 제제의 생물학적 활성은 본원에 기재된 바와 같은 쥐에 대한 용량-반응 실험을 하므로써 시험될 수 있다.In summary, anti-inflammatory factors can be separated from superimmunized milk by methods such as degreasing milk, removing casein, removing polymers of 10,000 daltons or more, and performing ion exchange and molecular sieve chromatography. The biological activity of the appropriate formulation of the anti-inflammatory factor can be tested by conducting dose-response experiments in mice as described herein.

본 발명은 부분적으로는 MAIF가 분리 및 정제될 수 있고, 사람 및 동물에서 다양한 염증 진행을 치료하는데 효과적이라는 뜻밖의 발견을 토대로 한다. 바람직한 구체예에서, MAIF는 우유-생산 동물을 박테리아 항원백신에 대하여 초면역시킴으로써 제조된다. 동물을 초면역시키기 위하여 사용된 백신은 항염증활성을 가지고 있지 않다. 그러므로, 혼합된 박테리아 항원 백신에 대해 면역된 동물로부터 얻어지는 분리 및 정제된 인자로 치료하는 것이 염증진행과정을 완화 또는 제거하는데 효과적이라는 것은 놀라운 것이다.The present invention is based in part on the unexpected finding that MAIF can be isolated and purified and is effective in treating various inflammatory processes in humans and animals. In a preferred embodiment, MAIF is prepared by superimmunizing milk-producing animals against bacterial antigen vaccines. The vaccine used to superimmunize animals does not have anti-inflammatory activity. Therefore, it is surprising that treatment with isolated and purified factors obtained from animals immunized against mixed bacterial antigen vaccines is effective in alleviating or eliminating the inflammatory process.

이제까지 본 발명을 일반적인 관점에서 기재하였고, 본원에 단지 설명을 목적으로 제공되고, 다른 특별한 언급이 없는한 제한하는 것으로 의도되지 않은 특정 구체예를 참고로 본 발명을 더욱 설명하기로 한다.The present invention has been described above in a general sense, and the present invention will be further described with reference to specific embodiments which are provided herein for illustrative purposes only and are not intended to be limiting unless otherwise specified.

[우유의 제조][Production of Milk]

[실시예 1A]Example 1A

S-100 백신의 제조Preparation of the S-100 Vaccine

아메리칸 타입 컬춰 콜랙션으로부터 얻어지는 바와 같은 아래의 표 1에 제시된 박테리아의 스펙트럼을 함유하고 있는 박테리아 배양액을 15ml의 배지로 재구성하여 밤새 37℃에서 배양하였다. 일단 양호한 성장이 이루어지면, 대략 1/2의 박테리아 현탁액을 사용하여 1리터의 브로스를 접종하고, 37℃에서 그 접종액을 배양하였다. 나머지 현탁액은 멸균 글리콜 튜브에 옮겨서 -20℃에서 6달까지 보관하였다.The bacterial culture containing the spectrum of bacteria shown in Table 1 below as obtained from the American type culture collection was reconstituted in 15 ml of medium and incubated at 37 ° C. overnight. Once good growth was achieved, approximately one liter of broth was inoculated using approximately 1/2 bacterial suspension and the inoculum was incubated at 37 ° C. The remaining suspension was transferred to sterile glycol tubes and stored for 6 months at -20 ° C.

양호한 성장을 배양액에서 볼 수 있게 된 후, 현탁액을 20분동안 원심분리하여 배지를 제거하므로써 박테리아 세포를 수득하였다. 얻어진 박테리아 펠릿을 멸균 식염수 용액에 재현탁하고 박테리아 샘플을 3회 원심분리하여 세포로부터 배지를 세척해내었다. 3회의 멸균 식염수 세척 후, 원심분리상에서 얻어진 박테리아 펠릿을 소량의 이차 증류수에 재현탁시켰다.After good growth was seen in the culture, bacterial cells were obtained by centrifuging the suspension for 20 minutes to remove the medium. The obtained bacterial pellet was resuspended in sterile saline solution and the bacterial samples were centrifuged three times to wash out the medium from the cells. After three sterile saline washes, the bacterial pellet obtained on centrifugation was resuspended in a small amount of secondary distilled water.

배지가 없는 박테리아 현탁액을 80℃ 수조의 유리 플라스크에 밤새 놓아둠으로써 열-사멸시켰다. 브로스 배양액의 생육성을 소량의 열-사멸된 박테리아를 사용하여 시험하였다. 브로스를 열-사멸된 박테리아로 접종하고 37℃에서 5일동안 배양한후, 매일 성장을 체크하였다. 이것은 박테리아를 백신에 사용하기 위해서는 죽어야 하기 때문이다.Bacterial suspensions without medium were heat-killed by placing them in glass flasks in 80 ° C. overnight. The viability of the broth culture was tested using a small amount of heat-killed bacteria. Broths were inoculated with heat-killed bacteria and incubated at 37 ° C. for 5 days, followed by daily growth checks. This is because the bacteria must die in order to be used in the vaccine.

열-사멸된 박테리아를 건조할때까지 동결건조시켰다. 그런다음 건조한 박테리아를 2.2×108박테리아 세포/ml 식염수(660nm에서 광학밀도는 1.0이다)의 농도로 멸균 식염수 용액과 혼합하였다.Heat-killed bacteria were lyophilized until dry. The dry bacteria were then mixed with sterile saline solution at a concentration of 2.2 × 10 8 bacterial cells / ml saline (the optical density is 1.0 at 660 nm).

Figure kpo00001
Figure kpo00001

소에게 매일 다가 액체 백신샘을 5ml씩 주사하였다. 주사된 소에 대한 항체(IgG) 역가 수준을 다가 항원에 대한 소과 동물의 항체에 대한 효소-결합 면역측정법을 사용하여 주기적으로 측정하였다.The cows were injected daily with 5 ml of liquid vaccine. Antibody (IgG) titer levels against injected cows were measured periodically using enzyme-linked immunoassays against antibodies of bovine animals against multivalent antigens.

[실시예 1B]Example 1B

열-사멸된 박테리아를 상술된 방식으로 제조하였다. 얻어진 다가 항원 샘플(S-100)을 종래의 상-분리 방법에 의해 미소캡슐하여 다가 항원-함유 미소입자 생성물을 제조하였다.Heat-killed bacteria were prepared in the manner described above. The obtained polyvalent antigen sample (S-100) was microencapsulated by a conventional phase-separation method to prepare a multivalent antigen-containing microparticle product.

일반적으로, 항원-함유형 매트릭스 물질은 생물학적 적합성의 물질, 바람직하게는 생분해가능한 또는 생물학적으로 서서히 파괴될 수 있는 물질, 바람직하게는 폴리락트산, 폴리글리콜산의 중합체, 락트산과 글리콜산의 공중합체, 폴리캅토락톤, 코폴리옥살산염, 콜라겐 같은 단백질, 글리세롤의 지방산 에스테르, 및 셀룰로스 에스테르로부터 형성한다.In general, antigen-containing matrix materials are biocompatible materials, preferably biodegradable or biologically degradable materials, preferably polylactic acid, polymers of polyglycolic acid, copolymers of lactic acid and glycolic acid, Polycaptolactone, copolyoxalate, proteins such as collagen, fatty acid esters of glycerol, and cellulose esters.

이들 중합체는 당해 기술 분야에 공지이며, 예컨대 U.S. 3,773,919; U.S. 3,887,699; U.S. 4,118,470; U.S. 4,076,798(이들은 모두 참고로 삽입됨)에 기재되어 있다. 사용한 중합체 매트릭스 물질은 생분해가능한 락티드-글리콜리드 공중합체였다.These polymers are known in the art and are described, for example, in U.S. 3,773,919; U.S. 3,887,699; U.S. 4,118,470; U.S. 4,076,798, all of which are incorporated by reference. The polymer matrix material used was a biodegradable lactide-glycolide copolymer.

열-사멸된 박테리아 항원은 그러한 매트릭스 물질안에, 바람직하게는 1-500미크론 사이의 직경, 바림직하게는 10-250미크론 사이의 직경을 가지는 미소구로서 캡슐화된다. 캡슐화 공정은 종래의 것이며 상분리 방법, 경계면 반응, 및 물리적 방법을 포함한다. 매트릭스와 선별된 항원의 많은 농축물의 많은 조합이, 숙주 몸체에 박테리아 항원의 미소입자로부터의 방출을 최적 속도로 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 조합은 부적절한 실험없이 당해 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 측정될 수 있다.Heat-killed bacterial antigens are encapsulated in such matrix materials, preferably as microspheres having a diameter between 1-500 microns, preferably between 10-250 microns. Encapsulation processes are conventional and include phase separation methods, interface reactions, and physical methods. Many combinations of many concentrates of the matrix and selected antigens can be used to provide the host body with the optimal rate of release of bacterial antigens from the microparticles. These combinations can be measured by those skilled in the art without inappropriate experimentation.

실시예의 미소입자는 직경이 250미크론 이하였다. 그런다음 다가 항원을 22%(16.5mg) 함유하고 있는 대략 750mg의 미소입자를 약 3cc의 비히클(물중에 1중량%의 트윈 20과 2중량%의 카르복시메틸 셀룰로스)에 현탁시켰다.The microparticles of the examples were less than 250 microns in diameter. Approximately 750 mg of the microparticles containing 22% (16.5 mg) of the polyvalent antigen were then suspended in about 3 cc of vehicle (1 wt% Tween 20 and 2 wt% carboxymethyl cellulose in water).

작은 그룹의 소를 보다큰 떼의 소들로부터 선택하였다. 무작위 선택된 이들 소중 5마리를 대조표준으로서 선택하였다. 4마리의 소에 다가 항원을 함유하고 있는 미소입자를 근육내 주사하였다. 미소 입자 샘플은 2.0mRad의 감마선으로 살균하였다. 항체(IgG) 역가수준은 접종된 소와, 및 대조 소로부터 얻어지는 우유 샘플로부터 주기적으로 측정하였다.Small groups of cows were selected from larger herds. Five of these randomly selected cattle were selected as controls. Four cows were injected intramuscularly with microparticles containing multivalent antigens. The microparticle sample was sterilized with a gamma ray of 2.0 mRad. Antibody (IgG) titer levels were determined periodically from inoculated cows and milk samples obtained from control cows.

[실시예 2]Example 2

초면역된 우유로부터의 MAIF 인자의 분리Isolation of MAIF Factors from Superimmunized Milk

단계 1 : 우유 여과액 제조Step 1: preparing milk filtrate

초면역된 소로부터 취한 20리터의 신선한 우유를 크림분리기(DeLaval Model 102)를 통과시켜 지방을 제거하였다.Twenty liters of fresh milk taken from superimmunized cattle was passed through a cream separator (DeLaval Model 102) to remove fat.

그 결과의 16리터의 탈지유를 한외여과시켜 중공섬유 디아필트레이션/농축기(Amicon DL-10L)를 사용하여 고분자량 종(10,000달톤 이상)을 제거하였다. 농축기에는 2개의 10,000달톤 분자량 커트-오프 카트리지(Amicon H5P10-43)가 구비되어 있다. 탈지유를 펌프 속도가 80이고 입압(inlet pressure)과 출압(outlet pressure)이 각각 30psi와 25psi인 계량기상에서 처리하였다.The resulting 16 liters of skim milk was ultrafiltered to remove high molecular weight species (more than 10,000 Daltons) using a hollow fiber diafiltration / concentrator (Amicon DL-10L). The concentrator is equipped with two 10,000 Dalton molecular weight cut-off cartridges (Amicon H 5 P 10-43 ). Skim milk was treated on a meter with a pump speed of 80 and an inlet pressure and outlet pressure of 30 psi and 25 psi, respectively.

시간당 4리터의 유속으로 카트리지에서 나오는 여과액(＜10,000달톤) 12리터를 보관 및 앞으로의 정제를 위하여 동결 또는 동결건조시켰다.Twelve liters of filtrate (<10,000 Daltons) from the cartridge at a flow rate of 4 liters per hour were frozen or lyophilized for storage and future purification.

단계 2 : 이온-교환 크로마토그래피Step 2: Ion-Exchange Chromatography

여과액중의 우유 항염증인자, MAIF를 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 의하여 분리하였다.The milk anti-inflammatory factor, MAIF, in the filtrate was first separated by anion exchange chromatography column.

이 과정에서는 5×10cm 유리 컬럼에 팩킹하기 위해 멸균 2차 증류수, pH 7.0으로 평형화시켜 놓은 DEAE-세파로스 CL-6B겔(Pharmacia)을 사용하였다.In this procedure, a DEAE-Sepharose CL-6B gel (Pharmacia) equilibrated with sterile secondary distilled water, pH 7.0, was used for packing in a 5 × 10 cm glass column.

1리터의 여과액(＜10,000)을 컬럼에 적용하여 멸균 2차 증류수, pH 7.0으로, 시간당 160ml의 유속으로 용출시켰다. 10밀리리터의 분획을 수집하여 광학밀도가 인쇄되어 나오는 기록기(Pharmacia REC-482)가 연결된 LKB 유비코드 4700 흡광계에서 280nm에서 모니터하였다.One liter of filtrate (<10,000) was applied to the column and eluted with sterile secondary distilled water, pH 7.0, at a flow rate of 160 ml per hour. Ten milliliters of fractions were collected and monitored at 280 nm on an LKB Ubicode 4700 Absorber connected with an optical density printed recorder (Pharmacia REC-482).

양성 및 중성 전하를 가지는 MAIF 이외의 물질은 DEAE-세파로스겔에 결합하지 않았다. 그것들은 통과시켜 흘려버리는 피이크(제1피이크)에서 용출된다. 음성전하를 가지고 있는 MAIF는 겔에 보유된다.Materials other than MAIF with positive and neutral charge did not bind to DEAE-Sepharose gel. They are eluted from the peak (the first peak) flowing through. MAIF with negative charge is retained in the gel.

MAIF를 방출시키기 위하여, 멸균 생리식염수, pH 7.0을 사용하여 단계 구배로 컬럼을 용리하였다. 전형적인 프로필을 제1도에 도시한다. 개개의 분획의 생물학적 측정은 제2피이크가 MAIF를 함유하는 것으로 나타났다. 제2피이크 및 그 양옆을 함유하는 분획을 다음 정제에 사용하였다. 회수 연구는 8.8그램의 건조 분말이 이 방법에 의해 얻어졌음을 보여준다.To release MAIF, the column was eluted with a step gradient using sterile physiological saline, pH 7.0. A typical profile is shown in FIG. Biological measurements of the individual fractions showed that the second peak contained MAIF. The second peak and the fractions containing both sides were used for the next purification. Recovery studies show that 8.8 grams of dry powder was obtained by this method.

단계 3 : 겔 여과 크로마토그래피Step 3: Gel Filtration Chromatography

단계 2로부터 얻어진 제2피이크는 MAIF 및 다른 음성전하 분자를 함유하므로 추가의 정제단계가 필요하였다. 추가의 정제를 완수하기 위하여, 겔 여과 컬럼을 사용하여 분자량을 토대로 다양한 성분을 분리하는 것이 편리하다.The second peak obtained from step 2 contained MAIF and other negatively charged molecules and thus required further purification steps. In order to complete further purification, it is convenient to separate various components based on molecular weight using a gel filtration column.

이 방법에서는, 세파텍스 G-10 수지(Pharmacia)를 2.5×80cm 유리컬럼에 팩킹하고 멸균 2차 증류수, pH 7.0으로 평형화하였다. 단계 2로부터의 제2분획 2g을 멸균 2차 증류수에 재용해하여 컬럼의 맨위에 적용하였다. 컬럼을 시간당 30ml의 유속으로 용리하였다. 분획(3.3ml)을 수집하고, 연결된 기록기(Pharmacia REC-482)상에서 인쇄되어 나오는 광학 밀도로 254nm 및 280nm(Pharmacia Duo Optical Unit)에서 모니터하였다.In this method, Sephatex G-10 resin (Pharmacia) was packed in a 2.5 × 80 cm glass column and equilibrated with sterile secondary distilled water, pH 7.0. 2 g of the second fraction from step 2 were redissolved in sterile secondary distilled water and applied to the top of the column. The column was eluted at a flow rate of 30 ml per hour. Fractions (3.3 ml) were collected and monitored at 254 nm and 280 nm (Pharmacia Duo Optical Unit) with optical density printed on a connected recorder (Pharmacia REC-482).

전형적으로, 제2도에 도시된 바와 같이 용출 프로필에는 3개의 피이크가 있다. 제1 및 제2피이크가 MAIF 활성을 함유하였다. 제1피이크는 활성 MAIF를 함유하는 G-10 컬럼상에서 형성되는 응집체이다. 제2피이크는 MAIF의 비응집 형태를 함유한다. 응집형태(피이크 1) 및 비응집 형태(피이크 2) 두가지 모두 쥐 생물학적 측정에서 생물학적으로 활성이다.Typically, there are three peaks in the dissolution profile as shown in FIG. The first and second peaks contained MAIF activity. The first peak is an aggregate formed on a G-10 column containing active MAIF. The second peak contains a non-aggregated form of MAIF. Both aggregated (peak 1) and non-aggregated forms (peak 2) are biologically active in rat biological measurements.

[우유 항 염증인자의 특성확인][Confirmation of Milk Anti-inflammatory Factors]

상술한 방법에 의해 제조된 MAIF의 비응집 형태의 분자량은 10,000달톤 이하인 것으로 나타났다. 이것은 유장으로부터 MAIF의 분리하는 제1단계가, 10,000달톤 이상의 분자량 종의 통과는 허용하지 않는 막을 사용하여 한외여과하므로써 이루어진 사실로부터 추론하였다.The molecular weight of the non-agglomerated form of MAIF prepared by the method described above was found to be 10,000 Daltons or less. This was inferred from the fact that the first step of separating MAIF from whey was made by ultrafiltration using a membrane that does not allow passage of molecular weight species of 10,000 Daltons or more.

MAIF는 음성전하를 갖는다. 이것은 DEAE 셀룰로스 이온교환컬럼에 우유 한외여과물을 적용하므로써 측정하였다. MAIF는 물을 사용해서는 컬럼으로부터 용출되지 않았다. 용출 배지를 염화나트륨(0.9% pH)으로 변화시킴으로써 여러가지 피이크가 용출되었다(제1도).MAIF has a negative charge. This was measured by applying milk ultrafiltration to DEAE cellulose ion exchange columns. MAIF was not eluted from the column using water. Various peaks were eluted by changing the elution medium to sodium chloride (0.9% pH) (FIG. 1).

중성 및 양성 전하 종은 이온 교환수지에 부착하지 않으며, 음성 전하 종은 염 농도를 증가시킴으로써 용출된다. 10,000달톤 분자량 이하의 투과물이 DEAE 컬럼에 적용될 때는 중성염 및 당은 물을 사용하여 용출된다(피이크 1, 제1도). 완충액이 식염수로 변화되었을때 3개의 분명한 피이크가 용출되었다(피이크 2-4). 제2피이크 및 그 주변은 쥐 측정에서 MAIF 생물학적 활성을 함유하였다. 그러므로, MAIF는 음성전하를 가지는 것으로 결론지을 수 있다.Neutral and positively charged species do not adhere to the ion exchange resin, and negatively charged species are eluted by increasing the salt concentration. Neutral salts and sugars are eluted with water when permeates of 10,000 Daltons or less are applied to the DEAE column (Peak 1, Figure 1). Three distinct peaks were eluted when the buffer was changed to saline (peak 2-4). The second peak and its surrounding contained MAIF biological activity in rat measurements. Therefore, it can be concluded that MAIF has negative charge.

MAIF의 또다른 화학적 특징은 그것이 염제거 과정중에 응집체를 형성한다는 것이다. 이 성질은 10,000달톤 분자량 이하의 투과물이 세파덱스 G-10 컬럼을 통과하고 이차 증류수로 평형화된후 pH 7에서 물로 용출될때 명백해진다(제2도).Another chemical feature of MAIF is that it forms aggregates during the desalination process. This property is evident when permeates up to 10,000 Daltons molecular weight are passed through a Sephadex G-10 column, equilibrated with secondary distilled water and then eluted with water at pH 7 (Figure 2).

3개의 피이크가 G-10 컬럼으로부터 용출된다; 제1피이크는 10,000달톤과 동일한 또는 그것보다 큰 분자량으로 추정되는 보이드 부피를 수반하여 용출되었다. 이것은 10,000달톤보다 큰 분자가 앞서 한외여과에 의하여 이 샘플로부터 제거되었기 때문에 기대하지 않았던 것이다. 제2피이크는 항염증인자에 대해 예견된 위치에서 용출하였다. 제1 및 제2피이크는 두가지가 모두 쥐의 발 측정에서 항염증 생물학적 활성을 나타낸 반면, 제3피이크에는 활성이 없었다. 제1 및 제2피이크가 항염증 생물학적 활성을 가졌음을 발견한 것은 놀라운 일이었다.Three peaks are eluted from the G-10 column; The first peak eluted with a void volume estimated at a molecular weight equal to or greater than 10,000 Daltons. This was not expected because molecules larger than 10,000 daltons were previously removed from this sample by ultrafiltration. Peak 2 eluted at the position predicted for the anti-inflammatory factor. Both the first and second peaks showed anti-inflammatory biological activity in the rat's foot measurements, while the third peak was inactive. It was surprising to discover that the first and second peaks had anti-inflammatory biological activity.

G-10 컬럼의 제1피이크로부터 회수된 물질(단계 3)을 동결건조하여 G-100 컬럼에 적용하였다; 단일 피이크가 보이드 부피를 수반하여 용출하였고, 그것은 100,000달톤 또는 그 이상의 분자량으로 추정된다.Material recovered from the first peak of the G-10 column (step 3) was lyophilized and applied to the G-100 column; A single peak eluted with the void volume, which is estimated to have a molecular weight of 100,000 Daltons or more.

단계 3 G-10 컬럼은 상이한 분자량 종을 분리함과 동시에 염을 제거한다. 그러므로, G-10 컬럼통과 및 그로써 염의 제거가 이루어지는 동안 항염증인자가 고분자량 응집체를 형성한 것으로 결론지을 수 있다. 응집정도는 염농도에 따라 변하였다.Step 3 The G-10 column separates the different molecular weight species while simultaneously removing the salts. Therefore, it can be concluded that the anti-inflammatory factors formed high molecular weight aggregates during the passage of the G-10 column and thus the salt removal. The degree of aggregation changed with salt concentration.

응집성질은 항염증인자의 존재에 의한 항염증 생물학적 활성을 가지는 상이한 분자량 종의 광범위 스펙트럼이 형성될 수 있다는 가능성을 시사한다. 이 성질의 발견은 최종 생성물의 응집정도에 의존하는 상이한 생화학적 성질의 광범위 스펙트럼을 가지는 우유 항염증인자의 제조가능성을 시사한다.Cohesiveness suggests the possibility that a broad spectrum of different molecular weight species can be formed with anti-inflammatory biological activity due to the presence of anti-inflammatory factors. The discovery of this property suggests the feasibility of milk anti-inflammatory factors having a broad spectrum of different biochemical properties depending on the degree of aggregation of the final product.

예를 들어, 더 길거나 더 짧은 생물학적 반감기를 가지는 제형이 더 크거나 더 작은 분자량 응집체를 사용하므로써, 가공처리중에 염농도에 의해 제어되는 분자량 분배를 수반하여 제조될 수 있다.For example, formulations with longer or shorter biological half-lives can be prepared with molecular weight distribution controlled by salt concentration during processing, using larger or smaller molecular weight aggregates.

본원에 기재된 컬럼 크로마토그래피 방법으로 생물학적 활성을 가지는 가장 작은 분자량종이 얻어지게 되었다(즉, 단계 3 G-10 컬럼으로부터의 피이크 2). 이 관찰은 또한 응집체를 형성하기 위한 다른 방법을 사용하는 것을 시사한다. 예를들어, 물로 희석하는 것은 응집이 일어나는 것을 유발한다. 염, 특히 칼슘과 결합하는 화학적 제제는 응집체의 형성을 유발할 수 있다. 이 발견을 취하므로써, 응집체를 형성하고 MAIF를 분리하는 다른 방법도 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 명백할 것이다.The column chromatography method described herein resulted in the smallest molecular weight species with biological activity (ie, peak 2 from a step 3 G-10 column). This observation also suggests using other methods to form aggregates. Dilution with water, for example, causes aggregation to occur. Chemical agents that bind salts, especially calcium, can cause the formation of aggregates. By taking this finding, other methods of forming aggregates and isolating MAIF will be apparent to those skilled in the art.

[실시예 3]Example 3

생물학적 활성 측정Biological activity measurement

MAIF의 항염증 작용을 쥐의 다리끝부분에 카라기난용액을 주사하므로써 유발된 부종에 대하여 시험하였다. MAIF의 동결건조된 샘플을 적절한 비히클에 용해시켜 실험용 쥐에 복강내 투여하였다. 그런다음 카라기난을 1% 식염수 용액 0.1ml의 양으로 쥐의 2개의 뒷다리 끝부분에 투여하였다. 주사전과 주사후 2.5시간 후의 다리끝부분을 두께 게이지를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 표2 및 3에 예시한다.The anti-inflammatory action of MAIF was tested for edema caused by injection of carrageenan solution into the leg tip of rats. Lyophilized samples of MAIF were dissolved in the appropriate vehicle and administered intraperitoneally to the experimental rats. Carrageenan was then administered to the tips of the two hind limbs of mice in an amount of 0.1 ml of 1% saline solution. Leg tips before and 2.5 hours after injection were measured using a thickness gauge. The results are shown in Tables 2 and 3.

대조표준 및 초면역 우유로부터의 MAIF의 비응집체(G-10 컬럼으로부터의 피이크 2)는 1mg과 0.25mg사이의 용량에서 쥐 발 염증을 보다 경감시켰다(표 2). 초면역 우유 및 정상 우유는 두가지가 모두 활성을 나타냈다; 그러나, 초면역 우유가 보다 강력하였다. 이것으로부터 MAIF가 초면역 소의 우유에 보다 큰 농도로 존재한다고 결론지을 수 있다.Non-aggregates of MAIF from control and superimmune milk (peak 2 from G-10 column) alleviated rat foot inflammation at doses between 1 mg and 0.25 mg (Table 2). Superimmune milk and normal milk were both active; However, superimmune milk was more potent. From this it can be concluded that MAIF is present in higher concentrations in the milk of superimmune cattle.

DEAE 컬럼으로부터의 제2피이크는 초면역 우유 또는 정상 우유로부터 분리될 때 활성을 나타냈다. 활성은 초면역 우유에 실질적으로 더 많다(표 3).The second peak from the DEAE column showed activity when isolated from superimmune milk or normal milk. Activity is substantially higher in superimmune milk (Table 3).

MAIF의 응집형태인, G-10 컬럼으로부터의 제1피이크는 쥐의 발 시험에서 활성을 나타냈다(표 2). 그러나, 응집형태는 동일 중량을 토대로 하였을때 비응집 형태만큼 강력하지 않다.The first peak from the G-10 column, agglomerated form of MAIF, showed activity in the mouse's foot test (Table 2). However, agglomerated forms are not as strong as non-aggregated forms based on the same weight.

이들 연구로부터 MAIF 인자가 우유에 자연적으로 발생한다고 결론지을 수 있다. 소의 초면역감작은 우유중의 MAIF 농도가 더 높아지게 유도한다. MAIF는 다양한 방법에 의해 우유로부터 분리될 수 있는 작고, 음성 저하를 띈 분자이다. MAIF 인자는 우유에 자연적으로는 발생하지 않지만 가공처리중에 형성되는 고분자량 응집체를 형성할 수 있다.From these studies it can be concluded that the MAIF factor occurs naturally in milk. Bovine superimmune sensitization leads to higher levels of MAIF in milk. MAIF is a small, negatively degraded molecule that can be separated from milk by a variety of methods. The MAIF factor does not occur naturally in milk but can form high molecular weight aggregates formed during processing.

Figure kpo00002
Figure kpo00002

Figure kpo00003
Figure kpo00003

[항염증인자의 화학적 분석][Chemical Analysis of Anti-inflammatory Factors]

항염증인자 샘플을 화학적으로 분석하였다. MAIF는 X-선 회절연구에 의하여 측정된 바 결정구조는 아니다. MAIF 제제의 요소분석 결과는 탄수화물 조성물에 부합한다. C, H, O 비율은 약간의 카르비놀기가 카르복실로 산화되어 있는 중합체 또는 올리고머 물질과 일치하였다. 염화이온을 초과하는 약간 과량의 칼슘 당량이 부분적으로는 카르복실산염으로서 설명될 수 있다. 나머지는 나트륨 또는 칼륨염일 수 있다. 그러나, 용융행동, 또는 비-용융 행동까지도 염 형태 및/또는 고분자량 조성물임을 시사하였다. 현재 상태의 순수한 물질은 외관상으로는 칼슘 및 콜로라이드의 염, 아마도 CaCl2의 가변량을 포함한다.Anti-inflammatory factor samples were analyzed chemically. MAIF is not a crystal structure as measured by X-ray diffraction studies. The results of urea analysis of the MAIF formulation correspond to the carbohydrate composition. The C, H, O ratios matched the polymer or oligomeric material in which some carbinol groups were oxidized to carboxyl. A slight excess of calcium equivalent in excess of chloride ions can be explained in part as carboxylates. The remainder may be sodium or potassium salts. However, even melt or non-melt behavior suggested that the salt form and / or the high molecular weight composition. Pure substances in their present state include apparently varying amounts of salts of calcium and collide, possibly CaCl 2 .

어떤 제제도 그의 조성물중의 어떠한 펩티드 성분을 방해하는 질소의 충분한 양을 함유하지 않았다. 유사하게, 질소의 부재는 아미노당 및 주성분(들)으로서 다양한 복합지질같은 다른 질소-함유물질의 존재를 불가능하게 할 수 있다.Neither formulation contained a sufficient amount of nitrogen to interfere with any peptide component in its composition. Similarly, the absence of nitrogen may render the presence of other nitrogen-containing substances such as aminosugars and various complex lipids as main component (s).

열분해 질량 스펙트럼은 상당한 흔적량의 18-탄소 지방산을 나타냈다. N 및 P의 흔적량과 함께 취해지는 이런 사실은 인자중의 복합 지질의 존재를 시사한다.Pyrolysis mass spectra showed significant traces of 18-carbon fatty acids. This fact, taken with trace amounts of N and P, suggests the presence of complex lipids in the factor.

회절 분광기 조사는 카르비놀 및 카르복실산염 기능성과 일치하는 흡수를 나타냈다. 자외선, 가시광선 및 형광 분광기 조사는 회절분석에 의해 가리키는 바를 넘어서는 발색단의 유의량이 없는 것으로 드러났다.Diffraction spectroscopic investigations showed absorption consistent with carbinol and carboxylate functionality. Ultraviolet, visible and fluorescence spectroscopic irradiation revealed no significant amount of chromophore beyond that indicated by diffraction analysis.

화학적 시험은 카르보닐 기능(알데히드 또는 케톤)이 하위단위 연쇄와 관련되는 올리고머 탄수화물과 양립한다. 올리고머 탄수화물은 또한 약간의 측쇄의 카르복실레이트로의 산화를 함유한다.Chemical tests are compatible with oligomeric carbohydrates where the carbonyl function (aldehyde or ketone) is associated with subunit chains. Oligomeric carbohydrates also contain some side chain oxidation to carboxylates.

MAIF 제제는 실질적으로 순수하지만 완전하지는 않다.MAIF formulations are substantially pure but not complete.

본 발명을 일반적으로 기재하였다. 많은 변형 및 수정이 발명의 사상 또는 범주에 영향을 미치지 않으면서 발명에 첨가될 수 있음이 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 쉽게 이해될 것이다.The present invention has been described generally. It will be readily understood by those skilled in the art that many variations and modifications may be added to the invention without affecting the spirit or scope of the invention.

Claims (29)

(i) 우유-생산 동물의 우유로부터 지방을 제거하여 탈지유를 제조하는 단계; (ii) 상기 탈지유로부터 카제인을 제거하여 유장을 제조하는 단계; (iii) 상기 유장으로부터 약 10,000달톤 이상의 분자량을 가지는 고분자를 제거하는 단계; (iv) 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 전 단계로부터 저분자량 생성물을 분별하는 단계; (v) 분자 시이브 크로마토그래피에 의하여 전단계로부터 항염증인자를 더욱 정제하는 단계; (vi) 그리고 상기 항염증인자를 수집하는 단계로 이루어지는 방법에 의하여 제조된, 실질적으로 순수한 형태의 항염증인자.(i) removing the fat from the milk of the milk-producing animal to produce skim milk; (ii) removing casein from the skim milk to prepare whey; (iii) removing the polymer having a molecular weight of about 10,000 Daltons or more from the whey; (iv) fractionating the low molecular weight product from the previous step by ion exchange chromatography; (v) further purifying anti-inflammatory factors from previous steps by molecular sieve chromatography; (vi) and an anti-inflammatory factor in substantially pure form, prepared by the method comprising the steps of collecting said anti-inflammatory factor. 제1항에 있어서, 상기 우유-생산 동물이 소과의 동물인 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 1, wherein the milk-producing animal is a bovine animal. 제1항에 있어서, 상기 우유-생산 동물이 양같은 동물인 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 1, wherein said milk-producing animal is a sheep-like animal. 제1항에 있어서, 상기 우유-생산 동물이 초면역 상태인 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 1, wherein said milk-producing animal is in a superimmune state. 제4항에 있어서, 상기 초면역 상태가 다음을 포함하는 박테리아 항원의 다가 혼합물의 투여에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 항염증인자 : 스타필로코커스 아우레우스; 스타필로코커스 에피더미디스; 스트랩토코커스 피오게네스, A.타입 1; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 3; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 5; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 8; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 12; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 14; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 18; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 22; 에어로박터 에어로게네스; 대장균; 슈도모나스 아에루기노사; 클레브시엘라 뉴모니아에; 살모넬라 타이피뮤리움; 헤모필루스 인플루엔자; 스트렙토코커스 미티스, 프로테우스 불가리스; 쉬겔라 디센테리아에; 디플로코커스 뉴모니아에; 프로프리오니박터 악세네스, 악티노마이세스(혐기성); 스트렙토코커스 뮤탄스; 스트렙토코커스 신구이스; 스트렙토코커스 살리바리우스; 또는 스트렙토코커스 아갈락티아에.5. The anti-inflammatory factor of claim 4, wherein said superimmune condition is induced by administration of a multivalent mixture of bacterial antigens comprising: Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Straptococcus piogenes, A. type 1; Streptococcus piogenes, A. type 3; Streptococcus piogenes, A. type 5; Streptococcus piogenes, A. type 8; Streptococcus piogenes, A. type 12; Streptococcus piogenes, A. type 14; Streptococcus piogenes, A. type 18; Streptococcus piogenes, A. type 22; Aerobacter aerogenes; Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa; To Klebsiella pneumoniae; Salmonella typhimurium; Haemophilus influenza; Streptococcus mitis, Proteus vulgaris; Shigella descenteria; Diplococcus pneumoniae; Proprionibacter axenes, actinomyces (anaerobic); Streptococcus mutans; Streptococcus sinus; Streptococcus salivarius; Or Streptococcus agalactia. 제5항에 있어서, 상기 다가 박테리아 항원이 상기 동물에 경구 투여되는 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 5, wherein the multivalent bacterial antigen is administered orally to the animal. 제5항에 있어서, 상기 다가 백신이 비경구 투여되는 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 5, wherein the multivalent vaccine is administered parenterally. 제1항에 있어서, 약 10,000달톤 이상의 분자량의 상기 고분자가 상기 유장의 한외여과에 의하여 약 10,000달톤의 분자를 보유하는 분자 시이브막을 통하여 제거되는 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 1, wherein the polymer having a molecular weight of about 10,000 Daltons or more is removed by a molecular sieve membrane containing about 10,000 Daltons of molecules by ultrafiltration of the whey. 제1항에 있어서, 약 10,000달톤 이상의 분자량의 상기 고분자가 분자 시이브 크로마토그래피에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor of claim 1 wherein said polymer having a molecular weight of at least about 10,000 Daltons is removed by molecular sieve chromatography. 제1항에 있어서, 상기의 인자 0과 약 10,000달톤 사이의 상대적인 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor of claim 1 wherein said agent has a relative molecular weight between said factor 0 and about 10,000 daltons. (i) 우유-생산 동물의 우유로부터 지방을 제거하여 탈지유를 제조하는 단계; (ii) 상기 탈지유로부터 카제인을 제거하여 유장을 제조하는 단계; (iii) 상기 유장으로부터 약 10,000달톤 이상의 분자량을 가지는 고분자를 제거하는 단계; (iv) 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 전 단계로부터 저분자량 생성물을 분별하는 단계; (v) 분자 시이브 크로마토그래피에 의하여 전단계로부터 항염증인자를 더욱 정제하는 단계; 그리고 (vi) 상기 항염증인자를 수집하는 단계로 이루어지는 우유로부터 실질적으로 순수한 항염증인자를 분리하는 방법.(i) removing the fat from the milk of the milk-producing animal to produce skim milk; (ii) removing casein from the skim milk to prepare whey; (iii) removing the polymer having a molecular weight of about 10,000 Daltons or more from the whey; (iv) fractionating the low molecular weight product from the previous step by ion exchange chromatography; (v) further purifying anti-inflammatory factors from previous steps by molecular sieve chromatography; And (vi) separating the substantially pure anti-inflammatory factor from milk, which comprises collecting said anti-inflammatory factor. 제11항에 있어서, 상기 우유-생산 동물이 초면역 상태인 것을 특징으로 하는 방법.12. The method of claim 11, wherein said milk-producing animal is in a superimmune state. 제12항에 있어서, 상기 초면역 상태가 스타필로코커스 아우레우스; 스타필로코커스 에피더미디스; 스트랩토코커스 피오게네스, A.타입 1; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 3; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 5; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 8; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 12; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 14; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 18; 스트렙토코커스 피오게네스, A.타입 22; 에어로박터 에어로게네스; 대장균; 슈도모나스 아에루기노사; 클레브시엘라 뉴모니아에; 살모넬라 타이피뮤리움; 헤모필루스 인플루엔자; 스트렙토코커스 미티스, 프로테우스 불가리스; 쉬겔라 디센테리아에; 디플로코커스 뉴모니아에; 프로프리오니박터 악세네스, 악티노마이세스(혐기성); 스트렙토코커스 뮤탄스; 스트렙토코커스 신구이스; 스트렙토코커스 살리바리우스; 또는 스트렙토코커스 아갈락티아에를 포함하는 박테리아 항원의 혼합물을 투여하므로써 유발되는 것을 특징으로 하는 방법.13. The method of claim 12, wherein said hyperimmune state is Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Straptococcus piogenes, A. type 1; Streptococcus piogenes, A. type 3; Streptococcus piogenes, A. type 5; Streptococcus piogenes, A. type 8; Streptococcus piogenes, A. type 12; Streptococcus piogenes, A. type 14; Streptococcus piogenes, A. type 18; Streptococcus piogenes, A. type 22; Aerobacter aerogenes; Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa; To Klebsiella pneumoniae; Salmonella typhimurium; Haemophilus influenza; Streptococcus mitis, Proteus vulgaris; Shigella descenteria; Diplococcus pneumoniae; Proprionibacter axenes, actinomyces (anaerobic); Streptococcus mutans; Streptococcus sinus; Streptococcus salivarius; Or by administering a mixture of bacterial antigens comprising Streptococcus agalactiae. 제13항에 있어서, 상기 다가 박테리아 항원이 상기 동물에 경구 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13, wherein said multivalent bacterial antigen is administered orally to said animal. 제13항에 있어서, 상기 다가 백신이 비경구 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13, wherein said multivalent vaccine is administered parenterally. 제11항에 있어서, 약 10,000달톤 이상의 분자량의 상기 고분자의 제거가 약 10,000달톤 이상의 분자를 보유하는 분자 시이브막을 통한 한외여과를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 11, wherein the removal of the polymer having a molecular weight of at least about 10,000 Daltons comprises ultrafiltration through a molecular sieve membrane containing at least about 10,000 Daltons of molecules. 제11항에 있어서, 약 10,000달톤 이상의 상기 고분자가 분자 시이브 크로마토그래피에 의하여 제거되는 것을 특징으로 하는 방법The method of claim 11, wherein at least about 10,000 Daltons of said polymer is removed by molecular sieve chromatography. 올리고머 탄수화물을 포함하는, 우유로부터의 실질적으로 순수한 항염증인자.A substantially pure anti-inflammatory factor from milk, comprising oligomeric carbohydrates. 제18항에 있어서, 상기 탄수화물의 카르보닐 기능이 하위단위연쇄에 관련되는 것을 특징으로 하는 항염증인자.19. The anti-inflammatory factor according to claim 18, wherein the carbonyl function of the carbohydrate is related to the subunit chain. 제18항에 있어서, 상기 탄수화물이 측쇄의 카르복실산 이온으로의 산화를 함유하는 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 18, wherein the carbohydrate contains oxidation of side chains to carboxylic acid ions. 제18항에 있어서, 상기 탄수화물이 칼슘 이온과 복합되어 있는 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 18, wherein the carbohydrate is complexed with calcium ions. 제18항에 있어서, 상기 탄수화물이 지방족 산과 복합되어 있는 것을 특징으로 하는 항염증인자.19. The anti-inflammatory factor according to claim 18, wherein the carbohydrate is complexed with an aliphatic acid. 제18항에 있어서, 상기 탄수화물이 질소함유 화합물과 결합되는 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 18, wherein the carbohydrate is combined with a nitrogen-containing compound. 제18항에 있어서, 상기 탄수화물이 인 화합물과 결합되는 것을 특징으로 하는 항염증인자.The anti-inflammatory factor according to claim 18, wherein the carbohydrate is combined with a phosphorus compound. 제18항에 있어서, 상기 탄수화물이 복합 지질과 결합되는 것을 특징으로 하는 항염증인자.19. The anti-inflammatory factor of claim 18 wherein the carbohydrate is combined with a complex lipid. 제18항에 있어서, 상기 탄수화물에는 본질적으로 황화합물이 없는 것을 특징으로 하는 항염증인자.19. The anti-inflammatory factor of claim 18 wherein the carbohydrate is essentially free of sulfur compounds. 제1항의 항염증인자의 항염증 발휘 유효량을 상기 동물에 투여하는 것으로 이루어지는 동물의 염증 치료방법.A method for treating inflammation in an animal, comprising administering an anti-inflammatory effective amount of the anti-inflammatory factor of claim 1 to the animal. 제18항의 항염증인자의 항염증 발휘 유효량을 상기 동물에 투여하는 것으로 이루어지는 동물의 염증 치료방법.A method for treating inflammation in an animal, comprising administering an anti-inflammatory effective amount of the anti-inflammatory factor of claim 18 to the animal. 제27항에 있어서, 상기 염증이 급성 및 하위급성 활액낭염, 급성 비-특이적 건염, 전신 낭창 홍반, 전신 피부근염, 급성 류마티성 심장염, 천포창, 수포성 피부염, 포진모양의 염증, 중증의 홍반, 다형 박리성 피부염, 간경변, 계절성 반복성 비염, 기관지 천식, 전위 피부염, 혈청병, 각막염, 눈의 홍채염, 확산 유레이티스, 맥락막염, 눈의 신경염, 교감성 안염, 유육종증 증상, 뢰플러 증후군, 베릴륨중독증, 용혈성 빈혈, 및 유선염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 상태에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하는 방법.28. The method of claim 27, wherein the inflammation is acute and subacute bursitis, acute non-specific tendinitis, systemic lupus erythema, systemic dermatitis, acute rheumatic heartitis, cystic ulcer, bullous dermatitis, herpes-like inflammation, severe Erythema, polymorphic exfoliative dermatitis, cirrhosis, seasonal recurrent rhinitis, bronchial asthma, dislocation dermatitis, serum disease, keratitis, iris of the eye, diffuse euresis, choroiditis, neuritis of the eye, sympathetic ophthalmitis, sarcoidosis symptoms, Loepl syndrome, beryllium poisoning , Hemolytic anemia, and mastitis.
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