KR0125779B1

KR0125779B1 - 뉴클레오시드 화합물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR0125779B1
Application number: KR1019930026496A
Authority: KR
Inventors: 백우현; 신원섭; 이재승; 채희상
Original assignee: 김승호; 보령제약주식회사
Priority date: 1993-12-04
Filing date: 1993-12-04
Publication date: 1997-12-19
Also published as: EP0657465A3; KR950018033A; DE69420364D1; CN1040116C; EP0657465A2; US5739120A; JPH07316182A; CN1111639A; CA2137176C; EP0657465B1

Abstract

본 발명은 항 바이러스성 약제로 유효한 다음 일반식(Ⅰ)의 신규한 뉴클레오시드 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공한다.

(상기 식에서, R¹은 탄소수가 6 내지 22개인 포화 또는 불포화 알킬기이고, R²는 탄소수가 12 내지 20개인 포하 또는 불포화 알킬기를 나타내며, R³및 R⁴는 수소원자 또는 히드록시기이고, B는 하기 일반식(a)로 표시되는 염기중의 하나이며,

여기서, R⁵는 수소원자, 할로겐원자 또는 히드록시, 아미노, 메르캅토, 탄소수가 1 내지 4개인 알킬 아미노기이고, R⁶은 수소원자, 할로겐원자 또는 아미노기이며, W는 질소원자 또는 C-R⁸이고, 여기서 R⁸은 수소원자, 할로겐원자 또는 아미노, 탄소수가 1 내지 4개인 알킬기이다.)

본 발명의 뉴클레오시드 화합물은 대사에 의한 불활성화가 적고 유리한 막투과 특성을 가져, 뛰어난 항 바이러스 효과를 나타낸다.

Description

뉴클레오시드 화합물 및 이의 제조방법

제1도는 제1형 단순포진 바이러스로 감염시킨 후에 본 발명에 의한 ara-ADP-DL-PTBA를 정맥투여한 경우, 시일경과에 따른 마우스의 생존률을 나타낸 그래프이고,

제2도는 제1형 단순포진 바이러스로 감염시킨 후에 본 발명에 의한 ara-ADP-DL-PTBA를 경구투여한 경우, 시일경과에 따른 마우스의 생존률을 나타낸 그래프이며,

제3도는 제1형 단순포진 바이러스로 감염시킨 후에 본 발명에 의한 ara-ADP-DL-PTBA를 정맥투여한 경우, 시일경과에 따른 마우스의 체중변화를 나타낸 그래프이고,

제4도는 제1형 단순포진 바이러스로 감염시킨 후에 본 발명에 의한 ara-ADP-DL-PTBA를 경구투여한 경우, 시일경과에 따른 마우스의 체중변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 항 바이러스성 약제로 유효한 다음 일반식(Ⅰ)의 신규한 뉴클레오시드 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염 및 이들 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

(상기 식에서, R¹은 탄소수가 6 내지 22개인 포화 또는 불포화 알킬기이고, R²는 탄소수가 12 내지 20개인 포화 또는 불포화 알킬기를 나타내며, R³및 R⁴는 수소원자 또는 히드록시기이고, B는 하기 일반식(a)로 표시되는 염기중의 어느 하나이며,

상기 일반식(Ⅰ)중 인지질 부분은 D, L 그리고 DL형의 광학 이성질체일 수 있다. 본 발명에 있어서, 일반식(Ⅰ)로 표시되는 신규한 화합물은 1-S-알킬인지질과 뉴클레오시드와의 복합체이다.

뉴클레오시드와 인지질간의 복합체를 합성함으로써 표적이 있는 바이러스 감염세포 혹은 암세포 내로 뉴클레오시드의 송달 효율을 높이고 약리 효과를 강화하려는 시도들이 종래에도 있었다.

예컨대 뉴클레오시드-5'-모노포스포모르폴리데이트와 1, 2-디아실 글리세로-3-포스페이트가 반응하여 생성되는 디아실 글리세로-뉴클레오시드 복합체가 발표된 바 있다[Journal of Medical Chemistry 25, 1322(1982), Biochemical and Biophysical Research Communication 85, 715(1978) 및 Biochimica et Biophysiea Acta 69, 604(1980)]. 또한 본 출원인의 연구소에서는 인지질 중에서, 그 자체가 항암 및 면역 조절작용을 갖고 있어 뉴클레오시드와 복합체를 형성할 경우 우수한 상승적 혹은 상가적 효과를 기대할 수 있는 물질들을 연구조사한 결과, 1-O-알킬 인지질이 그에 적당한 화합물임을 알아내고 이로부터 신규한 1-O-알킬-2-O-아실 글리세로-3-포스페이트와 뉴클레오시드와의 복합체를 합성하여 이미 특허받은 바 있다(대한민국 특허 제25634호 ; 공고 제88-93호).

그러나 한편으로, 이러한 기존 약물에 대해서 특정군의 환자의 부작용 발현 가능성을 배제할 수 없고, 또한 적용질병의 특성상 복합처방이 보편적이므로 그에 대한 대체악품의 개발이 요구되었는 바, 본 발명자들은 그러한 목적하에, 특히 항 바이러스 효과가 뛰어난 물질 개발에 촛점을 두고 연구를 계속한 결과 새로운 1-S-알킬 인지질-뉴클레오시드 복합체를 합성하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적을 특유하고 유익한 물리화학적 성질을 갖는 항 바이러스제를 개발하는데 있으며 이러한 목적은 상기 일반식(Ⅰ)의 1-S-알킬 인지질과 뉴클레오시드와의 복합체를 제공함으로써 달성된다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 의한 일반식(Ⅰ)의 화합물은 다음의 반응도식에 나타낸 바와 같이 두가지 방법에 의하여 제조될 수 있다.

제1방법에 의하면(반응도식 1) 뉴클레오시드(Ⅱ)를 모르폴리데이트(Ⅲ) 또는 P¹-뉴클레오시드-5'-P²-디페닐 피로포스페이트(Ⅳ)로 만들어 1-S-알킬-2-O-아실-1-티오글리세롤-3-포스페이트(Ⅴ)와 반응시킴으로써 일반식(Ⅰ)의 복합체가 제조된다. 제2방법에 의하면(반응도식 2) 인지질(Ⅴ)을 그의 모르폴리데이트(Ⅵ) 또는 P¹-글리세롤-5'-P²-디페닐피로포스페이트(Ⅶ)로 만들어 뉴클레오시드(Ⅱ)와 반응시킴으로써 일반식(Ⅰ)의 복합체가 제조된다.

다음 반응도식 중의 R¹, R², R³, R⁴및 B는 앞에서 정의한 바와 같고, DCC, TBDMSC 및 TBAF는 각각 N, N'-디시클로헥실카르보이마이드, 3차-부틸디메틸실릴클로라이드 및 4차-부틸암모늄 플로라이드의 약자이다.

(반응도식 1)

(반응도식 2)

이상과 같은 방법으로 제조될 수 있는 본 발명에 의한 뉴클레오시드 화합물을 생체에 투여하면, 감염된 세포 내에서 이 화합물이 효소에 의해 분해되어 그로부터 주요 활성부분인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 방출되어 항 바이러스 효과를 나타낸다. 뉴클레오티드가 방출될 경우에는 뉴클레오시드 키나제가 결핍된 내성 세포에서도 효과가 나타난다. 뉴클레오시드외에 인지질 자체도, 혈소판 응집, 과민증, 염증에 관여할 뿐만 아니라 각종 순환기 장해 및 알레르기성 질환의 예방제 내지 치료제로 사용되고, 항신생물제로서 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있으므로, 전체적으로 볼때 뉴클레오시드의 효력과 합하여져 상가 내지 상승 효과를 기대할 수 있다.

본 발명에 의한 일반식(Ⅰ)의 화합물이 원래의 복합체 형태로 남아 있는 동안에는 그 염기 부분의 -NH₂기가 데아미나아제에 의해 제거되는 것이 방지되므로 단순한 뉴클레오시드의 경우보다 더 많은 양의 뉴클레오시드(복합체 형태)가 활성을 유지한 채로 표적세포에 도달될 수 있다. 복합체중 인지질 부분에 의하여 리포좀이 형성될 수 있으므로 이러한 효과는 더 강화될 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 화합물은 뉴클레오시드가 인지질에 결합되어 있는 구조이므로 지방 친화성이 증가되어 막투과에 있어 유리한 특성을 가지게 되며 인지질을 인식하는 결합부위가 세포 존재한다면 세포 특이적 화합물로서의 부가적 효과도 나타낼 수 있다.

일반식(Ⅰ)의 화합물을 염으로 하면 물에 대한 용해도가 증가하여 주사제와 같은 액상 제제로 제조하기가 용이해진다.

본 발명의 화합물 및 이들의 염은 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 담체와 함께 약학적 제제 형태로 제제화되어 사용될 수 있다. 제제의 유형은 통상의 약학적 제제 형태 즉, 주사제, 유화제, 현탁제, 캡슐제, 과립제, 분말제, 정제 및 환제 등이 된다. 동 제제는 통상의 부형제, 분산제, 안정제, 보존제, 습윤제 또는 유화제와 같은 보조제, 착색제, 완충제, 충전제 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 1-S-알킬 인지질과 뉴클레오시드의 복합체 및 그 염은 대사에 의한 불활성화가 적고 유리한 막투과 특성을 가지므로 단순한 뉴클레오시드 화합물에 비하여 현저히 뛰어난 항 바이러스 효과를 나타낸다.

본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 더욱 용이하게 하기 위하여 제공되는 것일뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

라세믹(이하 'rac')-1-S-옥타데실-1-티오글리세롤의 제조

3-메르캅토-1, 2-프로판디올 13.63ｇ(126밀리몰)을 메탄올 70ml에 용해시키고, 여기에 헥산 140ml에 녹인 스티릴브로마이드 27.67g(83밀리몰)을 가한 후, 교반하면서 1N KOH-CH₃OH 216ml를 실온에서 1시간 동안 적가하고, 다시 24시간 동안 교반하였다. 10℃까지 냉각시키고 2시간 동안 교반한 후 감압 여과하고 메탄올과 물로 세척하여 목적물 27g을 얻었다(수율 : 90% ; 융점 : 75∼77℃). 이 물질을 분석한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR(200MHz, CDC1₃)

δ 0.80-0.95(3H, t, CH₃), 1.05-1.95(32H, m, 16CH₂), 2.45-2.85(4H, m, CH₂SCH₂), 3.42-3.90(3H, m, 2-CH, 3-CH₂)

[실시예 2]

rac-1-S-옥타데실-3-O-(3차-부틸디메틸실릴)-1-티오글리세롤의 제조

실시예(1)의 수득물 18g(50밀리몰)과 3차-부틸디메틸실릴클로라이드 9.04g(60밀리몰) 및 이미다졸 8.17g(120밀리몰)을 N, N-디메틸포름아미드 100ml에 가한 후 실온에서 28시간 교반하였다. 40℃에서 감압 농축하여 용매를 제거하고, 잔류물에 에테르 100ml와 물 100ml를 가해 층분리한 후, 유기층을 황산나트륨으로 건조시킨 다음 여과하고 감압 농축하여 오일상태의 목적물 22.28g을 얻었다(수율 : 94%).

[실시예 3]

rac-1-S-옥타데실-2-O-팔미토일-3-O-(3차-부틸디메틸실릴)-1-티오글리세롤의 제조

실시예(2)의 수득물 21g(44.2밀리몰)과 피리딘 4.65g(58.8밀리몰)을 톨루엔 112ml에 가하여 얻어진 혼합물에, 팔미토일클로라이드 14.59g(53.1밀리몰)을 실온에서 1시간 동안 적가한 후 실온에서 20시간 교반하였다.반응혼합물에 에테르 56ml와 물 56ml를 가해 층분리하고 유기층을 0.5N 황산 28ml, 중탄산나트륨 포화용액 28ml, 물 28ml의 순서로 세척한 후 황산나트륨으로 건조하고 감압 농축하여 목적물 30.28g을 얻었다(수율 : 96%). 이 물질을 분선한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR(200MHz, CDC1₃)

δ 0.10(6H, S, (CH₃)₂Si), 0.70-1.00(15H, m, 2CH₃, (CH₃)₃C), 1.10-1.90(58H, m, 29CH₂), 2.22-2.80(6H, m, CH₂SCH₂, CH₂CO), 3.76-3.94(2H, d, 3-CH₂), 4.90-5.10(1H, q, 2-CH)

[실시예 4]

rac-1-S-옥타데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤의 제조

실시예(3)의 수득물 28g(39.3밀리몰)과 아세트산 5.67ml, 테트라하이드로푸란 84ml의 혼합물을 10분간 교반한 후, 15∼18℃에서 1M 테트라부틸암모늄플루오라이드-테트라하이드로푸란 58.9ml를 1시간 동안 적가한 다음, 실온에서 20시간 교반하였다. 교반된 혼합물을 30℃에서 감압 농축하여 용매를 제거한 다음 잔류물에 아세토니트릴 70ml와 95% 에탄올 70ml를 가하고, 40℃로 가온한 후 다시 실온까지 서냉하고 이어서 0℃로 냉각하였다. 냉각물을 2시간 교반한 후 감압 여과하여 백색 침전물을 얻었다. 건조된 백색 침전물을 95% 에탄올 700ml에 가하여 5분간 가열, 환류시키고 이어 하룻밤을 교반하여 실온까지 서냉시킨 다음, 20℃ㅇ에서 다시 5시간 교반한 후 감압 여과하였다. 여액을 취하여 용매의 절반가량이 제거될때까지 감압 농축한 다음 0℃로 냉각하여 3시간 동안 교반한 후 감압 여과하여 목적물 12.46g을 얻었다(수율 : 53% ; 융점 : 42∼45℃). 이 물질을 분석한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR(200MHz, CDC1₃)

δ 0.80-0.95(6H, t, 2CH₃), 1.10-1.90(58H, m, 29CH₂), 2.26-2.44(2H, t, CH₂CO), 2.50-2.64(2H, t, SCH₂), 2.68-2.82(2H, d, 1-CH₂), 3.76-3.94(2H, d, 3-CH₂), 4.90-5.10(1H, q, 2-CH)

[실시예 5]

rac-1-S-옥타데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤-3-포스페이트의 제조

포스포릴 클로라이드 3.97g(25.9밀리몰)을 헥산 9.6ml에 가하여 얻어진 혼합물을 0℃로 냉각하였다. 여기에 헥산 9.6ml에 녹인 트리에틸아민 2.62g(25.9밀리몰)을 20분간 적가하고 0℃에서 20분 동안 교반한 다음, 톨루엔 96ml에 녹인 실시예(4)의 수득물 10.68g(17.8밀리몰)을 0∼5℃에서 1시간 동안 적가한 후 20∼25℃에서 5시간 더 교반하였다. 그 결과의 반응혼합물에 물 9.6ml를 가하고 1시간 교반한 다음, 에테르 192ml와 물 48ml를 가해 층분리하고 유기층을 황산나트륨으로 건조한 후 30℃에서 감압 농축하여 용매를 제거하였다. 얻어진 잔류물에 192ml의 아세톤을 가해, 실온에서 30분, 0℃에서 2시간 교반한 후 감압 여과하여 목적물 7.38g을 얻었다(수율 : 61% ; 융점 : 64∼66℃). 이 물질을 분석한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR(200MHz, CDC1₃)

δ 0.80-0.95(6H, t, 2CH₃), 1.10-1.90(58H, m, 29CH₂), 2.26-2.44(2H, t, CH₂CO), 2.50-2.64(2H, t, SCH₂), 2.68-2.82(2H, d, 1-CH₂), 4.04-4.55(2H, m, 3-CH₂), 5.04-5.22(1H, m, 2-CH)

[실시예 6]

rac-1-S-헥사데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤-3-포스페이트의 제조

스티릴 브로마이드 대신 세틸브로마이드를 사용하여, 실시예(1)에서 실시예(5)까지의 공정과 동일한 방법으로 제조한 결과 목적물을 56%의 수율로 얻었다(융점 : 68∼71℃). 이 물질을 분석한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR(200MHz, CDC1₃)

δ 0.80-0.95(6H, t, 2CH₃), 1.10-1.90(54H, m, 27CH₂), 2.26-2.44(2H, t, CH₂CO), 2.50-2.64(2H, t, SCH₂), 2.68-2.82(2H, d, 1-CH₂), 4.04-4.55(2H, m, 3-CH₂), 5.04-5.22(1H, m, 2-CH)

[실시예 7]

9-β-D-아라비노푸라노실아데닌-5'-모노포스페이트＜ara-AMP＞의 제조

아세토니트릴 50ml에 포스포릴클로라이드 16ml(172밀리몰)와 피리딘 15.6ml(193밀리몰)를 가하여 얻어진 혼합물을 0℃로 냉각하였다. 여기에 물 2ml를 적가하여 0℃에서 40분간 교반한 후, 비다라빈(이하 'ara-A') 10.68g(40밀리몰)을 더 가하고 0∼5℃에서 6시간 동안 교반하였다. 그 결과 얻어진 반응액을 빙수 900ml에 가한 후 농암모니아수로 전체용액의 pH를 7.0으로 조절하였다. 용액을 감압 농축하여 얻어진 잔류물을 물 900ml에 넣어 용해시킨 후 AG1-X8(포메이트) 컬럼(5×50㎝)에 흡착시키고 물 2,000ml와 0.5N 포름산 5,000ml로 용리시켜 분액하여 처음의 1 내지 3,000ml의 포름산 분액을 모았다. 모아진 분액을 30℃ 이하에서 백색 결정이 석출될때까지 감압 농축시키고 0℃로 냉각하여 다시 2시간 동안 교반한 다음 감압 여과하고 아세톤으로 세척한 결과 목적물 12.22g을 얻었다(수율 : 88% ; 융점 : 187∼189℃).

[실시예 8]

9-β-D-아라비노푸라노실아데닌-5'-디포스페이트-rac-1-S-옥타데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤＜ara-ADP-DL-PTBA＞의 제조

물 70ml와 3차-부탄올 70ml에 모르폴린 2.09ml(24밀리몰)와 상기 실시예(7)의 수득물인 ara-AMP 2.08g(6밀리몰)을 가하고 50∼55℃로 가온한 후 3차-부탄올 100ml에 녹인 N, N'-디시클로헥실카르보디이미드 4.95g(24밀리몰)을 적가하였다. 그 결과 생성된 혼합물을 8시간 동안 환류시킨뒤 실온에서 하룻밤을 교반하고 침전물을 여과하여 제거한 다음 여액을 감압 농축하여 50ml가 남도록 하였다. 농축된 현탁액을 에테르 150ml로 2회 추출한 후 수층을 취해서 감압 농축하였다. 그 결과의 잔류물에 에테르를 가하여 하룻밤을 교반한 다음 감압 여과하여 건조시킨 결과 3.95g의 9-β-D-아라비노푸라노실아데닌-5'-모노포스포로모르폴리데이트-4-포르폴린-N, N'-디시클로헥실 카르복스아미디늄염을 얻었다(수율 : 93%).

이 화합물 2.78g(3.9밀리몰)과, 피리딘으로 공비증발하여 건조시킨 실시예(5)의 수득물인 rac-1-S-옥타데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤-3-포스페이트 2.67g(3.9밀리몰)을 무수피리딘 250ml에 용해시킨 후 6일간 실온에서 교반하여 반응시켰다. 반응계를 감압 농축하여 피리딘을 1차 제거한 후 남은 미량의 피리딘은 톨루엔과 공비증발시켜 제거하였다.

빙초산 30ml와 클로로포름-메탄올-물(2 : 3 : 1)의 혼합용매 300ml에 그 결과의 잔류물을 넣어 용해시키고 실온에서 2시간 교반한 후 클로로포름 500ml를 더 가하였다. 유기용매층을 분리하여 감압 농축시키고 이로부터 미량의 빙초산을 제거하기 위하여 톨루엔 15ml와 4회 공비증발시켰다. 잔류물을 클로로포름-메탄올-물(2 : 3 : 1) 200ml에 용해시킨 후 DE-52(아세테이트) 셀룰로스컬럼(5×60㎝)에 흡착시키고 이어서 0∼0.15M NH₄OAc 선형 구배를 함유한 용매 클로로포름-메탄올-물(2 : 3 : 1) 5,000ml로 용리시켜 분액하였다. 1,800ml 내지 2,900ml의 분액을 모아 백색 결정이 석출될 때까지 감압 농축시킨 다음 0℃로 냉각하여 3시간 동안 교반한 후 감압 여과하고 물로 세척하였다. 결정을 나트륨염으로 전환시키기 위해 클로로포름-메탄올-물(2 : 3 : 1)의 혼합용매에 녹인 다음 암버라이트 CG-50(Na⁺)컬럼(5×60㎝)을 통과시키고 용리액을 모아 감압 농축하였다. 그 잔류물을 아세톤과 클로로포름으로 결정화하여 여과하고 오산화인(P₂O₅)의 존재하에 진공건조한 결과 목적물 1.72g을 얻었다(수율 : 42% ; 융점 : 197∼200℃). 이 물질을 분석한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR(200MHz, CDC1₃-CD₃OD-D₂O=2 : 3 : 1)

β 0.80-0.95(6H, t, 2CH₃), 1.10-1.90(58H, m, 29CH₂), 2.25-2.45(2H, t, CH₂CO), 2.50-2.60(2H, t, SCH₂), 2.75-2.90(2H,d, 1-CH₂), 4.02-4.65(7H, m, 3-CH₂, H-2', H-3', H-4', H-5'), 5.07-5.15(1H, m, 2-CH), 6.35-6.45(1H, d, H-1'), 8.20(1H, S, 아데닌 H-2), 8.50(1H, S, 아데닌 H-8)

원소분석 : C₄₇H₈₅N₅O_{1 2}P₂SNa₂

이론치(%) : C ; 53.65, H ; 8.14, N ; 6.65, S ; 3.05

실험치(%) : C ; 52.82, H ; 9.05, N ; 6.48, S ; 2.86

[실시예 9]

9-β-D-아라비노푸라노실아데닌-5'-디포스페이트-rac-1-S-헥사데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤＜ara-ADP-DL-PTCA＞의 제조

rac-1-S-옥타데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤-3-포스페이트 대신에 rac-1-S-헥사데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤-3-포스페이트를 사용하고 실시예(8)과 동일한 방법으로 제조한 결과 48%의 수율로 목적물을 얻었다(융점 : 201∼206℃). 이 물질을 분석한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR(200MHz, CDC1₃-CD₃OD-D₂O=2 : 3 : 1)

β 0.80-0.95(6H, t, 2CH₃), 1.10-1.90(54H, m, 27CH₂), 2.25-2.45(2H, t, CH₂CO), 2.50-2.60(2H, t, SCH₂), 2.75-2.90(2H, d, 1-CH₂), 4.02-4.65(7H, m, 3-CH₂, H-2', H-3', H-4', H-5'), 5.07-5.15(1H, m, 2-CH), 6.35-6.45(1H, d, H-1'), 8.20(1H, S, 아데닌 H-2), 8.50(1H, S, 아데닌 H-8)

원소분석 : C₄₅H₈₁N₅O₁ ₂P₂SNa₂

이론치(%) : C ; 52.77, H ; 7.97, N ; 6.84, S ; 3.13

실험치(%) : C ; 52.64, H ; 8.13, N ; 6.57, S ; 2.92

[실시예 10]

rac-1-S-옥타데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤-3-포스페이트 4.07g(6밀리몰)과 모르폴린 2.44ml(28밀리몰) 및 3차-부탄올 70ml의 환류 혼합액에, N, N'-디시클로헥실카보디이미드(DCC) 5.77g(28밀리몰)을 3차-부탄올 100ml에 녹인 용액을 적가하고 환류 조건하에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응액을 실온에서 하룻밤 교반한 후, 물 30ml를 가하고 다시 3시간 동안 교반하여 과량의 DCC를 분해시켰다. 백색 결정을 여과 제거하고 여과액을 감압 농축한 후 에테르로 추출하였다. 이 추출액을 감압 농축하고 그 잔류물을 톨루엔으로 3회 공비증류해서 건조시켰다. 이어서 ara-AMP 2.71g(7.8밀리몰)과 트리옥틸아민 6.82ml(15.6밀리몰)을 가하고 피리딘으로 4회 공비증류하여 건조시킨 후 피리딘 300ml에 용해시켜 실온에서 8일간 교반 반응시켰다. 감압 농축하여 피리딘을 제거하고 잔존하는 미량의 피리딘은 톨루엔으로 3회 공비증류하여 제거하였다. 잔류물을 빙초산 45ml와 클로로포름-메탄올-물(2 : 3 : 1)의 혼합용매 450ml에 용해시키고 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 클로로포름 750ml를 가하였다.

유기용매층을 분리하여 감압 농축하고 그로부터 미량의 빙초산을 제거하기 위해서 톨루엔 15ml와 4회 공비증류하였다. 잔류물을 클로로포름-메탄올-물(2 : 3 : 1)의 혼합용매 200ml에 녹여 DE-52(아세테이트)셀룰로스 컬럼(3×60㎝)에 흡착시킨 다음, 0∼0.15M NH₄OAc 선형 구배를 함유한 클로로포름-메탄올-물(2 : 3 : 1)의 혼합용매를 사용하여 실시예(8)과 동일한 방법으로 용리 분액하고 분리한 결과 목적물 2.15g을 얻었다(수율 : 34%). 이것의 분석 데이타는 상기 실시예(8)과 동일하다.

[실시예 11]

ara-AMP 1.74g(5밀리몰)과 트리옥틸아민 2.19ml(5밀리몰)를 메탄올 50ml에 가하고 가온하여 녹인 후, 감압 농축하여 용매를 제거하였다. 미량의 수분을 제거하기 위하여 N, N-디메틸 포름아미드에 그 결과의 잔류물을 녹인 후 감압 농축하였다. 건조된 ara-AMP-트리-O-옥틸암모늄염을 디옥산 60ml와 N, N-디메틸포름아미드 30ml에 녹인 다음 디페닐클로로포스페이트 1.5ml(7.2밀리몰)와 트리부틸아민 2.25ml(9.4밀리몰)를 가하고 실온에서 6시간을 반응시킨 후 감압 농축하였다. 잔류물인 P¹-(9-β-D-아라비노푸라노실아데닌-5'-일)-P²-디페닐 피로포스페이트에 디옥산 12ml를 가한 후 감압 증류하여 수분을 제거하고 다시 디옥산 6ml에 용해시켰다. 이 용액과, 피리딘 10ml에 용해시킨 rac-1-S-헥사데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤-3-포스페이트 2.71g(4.2밀리몰)을 혼합하여 실온에서 5일간 반응시킨 후 감압 농축하여 용매를 제거하였다. 이것을 클로로포름-메탄올-물(2 : 3 : 1) 600ml에 용해시켜 DE-52(아세테이트)셀룰로스컬럼(3.5×60㎝)에 흡착시킨 후 실시예(8)과 동일한 방법으로 용리 분액한 결과 목적물 1.53g을 얻었다(수율 : 36%). 이것의 분석 데이타는 상기 실시예(9)와 동일하다.

활성실험

본 발명에 의한 1-S-알킬 인지질과 뉴클레오시드와의 복합체를 실제 생체에 투여할 경우 어떠한 항 바이러스 효과를 나타내는가 알아보기 위해서 제1형 단순포진 바이러스(herpes simplex vims type-1)에 감염된 마우스에 동 물질을 투여한 후 일정기간 동안 투여군에서의 체중증감 및 생존률을 관찰하였다.

BALB/C 마우스(♀, 4주령)의 복강에 제1형 단순포진 바이러스, 미야마주를 2,000 PFU/마우스의 용량으로 투여하여 동 마우스를 감염시켰다. 감염된 마우스에, 감염 직후부터 4일간 시험약물을 투여하면서, 2주동안 각 투여군 및 대조군에서의 체중증감 및 생존률을 관찰하였다. 투여 경로로는 정맥(꼬리정맥) 및 경구 투여 경로를 선택하였고 각각의 경우 시험약물은 다음과 같이 제조하였다.

·정맥내 투여 : 전자천평으로 정밀하게 평량한 시험약물을 생리식염수에 현탁한 후 20분간 초음파에 노출시켜(Ultrasonication) 완전히 용해시켰다. 이 용액을 0.22μm 멤브레인 필터를 이용해서 여과 감균한 후 사용하였다. 약물의 투여량은 10㎎/㎏과 50㎎/㎏이 되도록 하였다. 컨트롤군에는 생리식염수를 투여하였다.

·경구 투여 : 전자천평으로 정밀하게 평량한 시험약물을 0.5% 카르복시메틸 셀룰로오스(이하 'CMC') 용액에 가해 현탁화하였다. 투여량은 50㎎/㎏과 250㎎/㎏이 되도록 하였다. 양성대조약물로서 ara-A(Vidarabine) 125㎎/㎏을 사용하였고 컨트롤군에는 0.5% CMC를 투여하였다.

제1도 및 제2도는 바이러스 감염후 생존률을 나타낸 그래프이고(종축은 생존률, 횡축은 바이러스 감염일로부터의 일수), 제3도 및 제4도는 감염에 따른 체중의 변화를 나타낸 그래프이다(종축은 체중의 변화, 횡축은 바이러스 감염일로부터의 일수).

먼저 체중 변화에 관한 결과를 살펴보면, 정맥내 투여시 생리식염수를 투여한 컨트롤군은 5일째 이후 급격한 체중감소를 나타내었고 6일째에는 전멸하였다. ara-ADP-DL-PTBA 투여군도 감염후 5일째부터 체중이 감소하기는 하였으나 그 감소 경향은 생리식염수 투여군 보다 완만하였고, 특히 50㎎/㎏ 투여군에 있어서 현저히 완만하였다(제3도). 50㎎/㎏ 투여군에서는 사망개체의 출현률도 완만하였다(제1도). 경구 투여시, 0.5% CMC 투여군은 감염후 5일째부터 급격한 체중감소를 나타내고 12일째에는 전멸하였다. ara-ADP-DL-PTBA 투여군도 감염후 5일째부터 체중감소를 보이기는 하였으나 ara-ADP-DL-PTBA 250㎎/㎏ 투여군은 0.5% CMC 투여군에 비해 완만한 체중감소를 보였다. ara-ADP-DL-PTBA 50㎎/㎏ 투여군의 체중감소는 통계오차를 감안해 볼때 0.5% CMC 투여군과 거의 유사하게 나타났다. 양성 대조약물인 ara-A 투여군에서의 체중감소가 ara-ADP-DL-PTBA 투여군이나 0.5% CMC 투여군의 경우보다 더 완만하게 나타났다.

생존률에 관한 결과에 있어서, 생리식염수 투여군 보다는 ara-ADP-DL-PTBA 50㎎/㎏ 정맥내 부여군에서, 0.5% CMC 투여군 보다는 ara-ADP-DL-PTBA 250㎎/㎏ 경구 투여군에서 사망 개체의 출현이 완만하였음을 보여준다(제1도 및 제2도). 이와 관련하여 약제 투여군과 각각의 대조군과의 사이에 생존 기간의 길이를 전 기간을 통해서 비교하기 위해서 통계 처리 프로그램을 이용하여 Log-Rank 검정을 실시하여 그 결과를 다음의 표 1에 타나내었다.

[표 1] 통계프로그램 SAS(Statistical Analysis System)을 이용한 약제투여군과 각각의 컨트롤군 사이의 생존기간 검정, Log-Rank 검정.

그 결과를 보면 정맥내 투여시 ara-ADP-DL-PTBA의 10㎎/㎏ 투여군과 50㎎/㎏ 투여군 모두에서 위험률 5% 이하로 유의성 있는 생존기간의 연장이 있었음을 알 수 있다. 이로부터 ara-ADP-DL-PTBA는 정맥주사에 의하여 제1형 단순포진 바이러스 감염에 효과를 발휘할 수 있는 항 바이러스 약물임을 확인할 수 있다.

경구 투여의 양성 대조 약물로 사용한 ara-A는 위험률 5% 이하로 유의성 있는 생존기간의 연장을 보이는데 반해, ara-ADP-DL-PTBA의 경구 투여군은 생존기간의 연장 경향만 보였을 뿐 위험률 5% 이하의 유의성을 보이지는 않았다. 경구 투여시에는 소화관에서의 분해 및 불활성화, 간대사 등의 영향으로 ara-ADP-DL-PTBA의 BA(Bioavailability)가 낮기 때문인 것으로 해석되는 바, 이는 투여량의 조절 및 제형의 개선으로 극복될 수 있다.

Claims

하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 뉴클레오시드 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.

(상기 식에서, R¹은 탄소수가 6 내지 22개인 포화 또는 불포화 알킬기이고, R²는 탄소수가 12 내지 20개인 포화 또는 불포화 알킬기를 나타내며, R³및 R⁴는 수소원자 또는 히드록시기이고, B는 하기 일반식(a)로 표시되는 염기중의 하나이며,

여기서, R⁵는 수소원자, 할로겐원자 또는 히드록시, 아미노, 메르캅토, 탄소수가 1 내지 4개인 알킬 아미노기이고, R⁶은 수소원자, 할로겐원자, 또는 아미노기이며, W는 질소원자 또는 C-R⁸이고, 여기서 R⁸은 수소원자, 할로겐원자 또는 아미노, 탄소수가 1 내지 4개인 알킬기이다.)
제1항에 있어서, R¹이 탄소수가 12 내지 20개인 포화 또는 불포화 알킬기인 것을 특징으로 하는 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
제1항 내지 제2항중의 어느 한항에 있어서, 일반식(Ⅰ)의 화합물의 염이 나트륨염인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서, 일반식(Ⅰ)의 화합물이 9-β-D-아라비노푸라노실아데닌-5'-디포스페이트-rac-1-S-옥타데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤, 9-β-D-아라비노푸라노실아데닌-5'-디포스페이트-rac-1-S-헥사데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤, 9-β-D-아라비노푸라노실아데닌-5'-디포스페이트-rac-1-S-테트라데실-2-O-팔미토일-1-티오글리세롤 또는 약학적으로 허용되는 이들의 염인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항 내지 제4항중의 어느 한항에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염이 항 바이러스제로 사용되는 방법.
제1항 내지 제4항중의 어느 한항에 따른 화합물과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, 주사제 및 캡슐제 형태로 제제화되어 있는 약제학적 조성물.