JPWO2020214609A5

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Publication number: JPWO2020214609A5
Application number: JP2021560849A
Authority: JP
Publication date: 2023-04-21

Claims

（ａ）ジストロフィンのイントロン４４を標的とする第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、または前記第１のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記第１のｇＲＮＡは配列番号２のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする、
（ｂ）ジストロフィンのイントロン５５を標的とする第２のｇＲＮＡ分子、または前記第２のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、ここで、第２のｇＲＮＡは配列番号３のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする、
（ｃ）Ｃａｓ９タンパク質、または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
（ｄ）１つまたは複数のＣａｓ９ｇＲＮＡ足場、または前記１つまたは複数のＣａｓ９ｇＲＮＡ足場をコードするヌクレオチド配列
を含む組成物をコードする１種または複数種のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって、前記１種または複数種のベクターは少なくとも１種の両方向性プロモーターを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。 (a) a first guide RNA (gRNA) molecule targeting intron 44 of dystrophin, or a nucleotide sequence encoding said first gRNA, wherein said first gRNA is the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 or its targeting 5'truncations;
(b) a second gRNA molecule targeting intron 55 of dystrophin, or a nucleotide sequence encoding said second gRNA, wherein said second gRNA comprises the polynucleotide of SEQ ID NO: 3 or a 5' truncation thereof; target ,
(c) a Cas9 protein , or a nucleotide sequence encoding said Cas9 protein , and (d) one or more Cas9 gRNA scaffolds , or a nucleotide sequence encoding said one or more Cas9 gRNA scaffolds.
A CRISPR-Cas system comprising one or more vectors encoding a composition comprising : said one or more vectors comprising at least one bidirectional promoter .

（ａ）ジストロフィンのイントロン４４を標的とする第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、または前記第１のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、(a) a first guide RNA (gRNA) molecule targeting intron 44 of dystrophin, or a nucleotide sequence encoding said first gRNA;
（ｂ）ジストロフィンのイントロン５５を標的とする第２のｇＲＮＡ分子、または前記第２のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、(b) a second gRNA molecule targeting intron 55 of dystrophin, or a nucleotide sequence encoding said second gRNA;
（ｃ）Ｃａｓ９タンパク質、または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および(c) a Cas9 protein, or a nucleotide sequence encoding said Cas9 protein, and
（ｄ）１つまたは複数のＣａｓ９ｇＲＮＡ足場、または前記１つまたは複数のＣａｓ９ｇＲＮＡ足場をコードするヌクレオチド配列(d) one or more Cas9 gRNA scaffolds or a nucleotide sequence encoding said one or more Cas9 gRNA scaffolds;
をコードする単一のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって、前記単一のベクターは少なくとも１種の両方向性プロモーターを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。wherein the single vector comprises at least one bidirectional promoter.

単一のベクターを含む、請求項１に記載の系。 2. The system of claim 1, comprising a single vector.

２種以上のベクターを含み、前記２種以上のベクターが、第１のベクターおよび第２のベクターを含む、請求項１に記載の系。 2. The system of claim 1, comprising two or more vectors, said two or more vectors comprising a first vector and a second vector.

（ａ）第１のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子をコードし、
（ｂ）第２のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をコードする、
請求項４に記載の系。 (a) a first vector encodes a first gRNA molecule and a second gRNA molecule;
(b) the second vector encodes a Cas9 protein;
A system according to claim 4 .

（ａ）第１のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子をコードし、
（ｂ）第２のベクターが、第２のｇＲＮＡ分子をコードする、
請求項４に記載の系。 (a) a first vector encodes a first gRNA molecule;
(b) the second vector encodes a second gRNA molecule;
A system according to claim 4 .

第１のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする、請求項６に記載の系。 7. The system of claim 6 , wherein the first vector further encodes a Cas9 protein.

第２のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする、請求項６に記載の系。 7. The system of Claim 6 , wherein the second vector further encodes a Cas9 protein.

第２のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする、請求項７に記載の系。8. The system of Claim 7, wherein the second vector further encodes a Cas9 protein.

Ｃａｓ９タンパク質の発現が、構成的プロモーターまたは筋肉特異的プロモーターによって駆動される、請求項１に記載の系。 2. The system of claim 1 , wherein Cas9 protein expression is driven by a constitutive promoter or a muscle-specific promoter.

筋肉特異的プロモーターが、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＣＫ８プロモーターまたはＳｐｃ５１２プロモーターを含む、請求項１０に記載の系。 11. The system of claim 10 , wherein the muscle-specific promoter comprises MHCK7 promoter, CK8 promoter or Spc512 promoter.

単一のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９タンパク質をコードする、請求項３に記載の系。 4. The system of claim 3 , wherein a single vector encodes the first gRNA molecule, the second gRNA molecule and the Cas9 protein.

両方向性プロモーターが、
第１のｇＲＮＡ分子および／または第２のｇＲＮＡ分子の発現を駆動する第１のプロモーターと、
Ｃａｓ９タンパク質の発現を駆動する第２のプロモーターと
を含む、請求項１に記載の系。 bi-directional promoters
a first promoter driving expression of the first gRNA molecule and/or the second gRNA molecule;
and a second promoter driving expression of the Cas9 protein.

第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする、請求項２に記載の系。 3. The system of claim 2 , wherein the first gRNA targets the polynucleotide of SEQ ID NO:2 or a 5' truncation thereof.

第２のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする、請求項２に記載の系。 3. The system of claim 2, wherein the second gRNA targets the polynucleotide of SEQ ID NO:3 or a 5' truncation thereof.

Ｃａｓ９タンパク質が、ＳｐＣａｓ９タンパク質、ＳａＣａｓ９タンパク質またはＳｔ１Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の系。 2. The system of claim 1 , wherein the Cas9 protein is SpCas9 protein, SaCas9 protein or St1Cas9 protein.

Ｃａｓ９ｇＲＮＡ足場が、ＳａＣａｓ９ｇＲＮＡ足場である、請求項１に記載の系。 2. The system of claim 1 , wherein the Cas9 gRNA scaffold is a SaCas9 gRNA scaffold.

ＳａＣａｓ９ｇＲＮＡ足場が、配列番号４のポリヌクレオチドを含むか、または配列番号４のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１７に記載の系。 18. The system of claim 17 , wherein the SaCas9 gRNA scaffold comprises or is encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO:4.

Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号１１のポリヌクレオチドによってコードされるＳａＣａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の系。 2. The system of claim 1 , wherein the Cas9 protein is the SaCas9 protein encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO:11.

少なくとも１種のベクターが、配列番号１～１３および２４から選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の系。 2. The system of claim 1 , wherein at least one vector comprises at least one polynucleotide selected from SEQ ID NOs: 1-13 and 24.

少なくとも１種のベクターが、配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の系。 2. The system of claim 1 , wherein at least one vector comprises the polynucleotide sequence of SEQ ID NO:24.

少なくとも１種のベクターが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２９および配列番号３０から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の系。 at least one vector comprises SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:29 and SEQ ID NO: 30 .

少なくとも１種のベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載の系。 2. The system of claim 1 , wherein at least one vector is a viral vector.

ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２３に記載の系。 24. The system of claim 23 , wherein the viral vector is an adeno-associated virus (AAV) vector.

ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３またはＡＡＶｒｈ．７４である、請求項２４に記載の系。 AAV vectors are AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 or AAVrh. 25. The system of claim 24 , which is 74.

少なくとも１種のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される遍在性プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む、請求項１に記載の系。 10. The claim, wherein at least one vector comprises a ubiquitous or tissue-specific promoter operably linked to the polynucleotide sequence encoding the first gRNA molecule, the second gRNA molecule and/or the Cas9 protein. The system according to 1 .

組織特異的プロモーターが筋肉特異的プロモーターである、請求項２６に記載の系。 27. The system of Claim 26 , wherein the tissue-specific promoter is a muscle-specific promoter.

請求項１～２７のいずれか１項に記載の系を含む細胞。 A cell comprising the system of any one of claims 1-27 .

請求項１～２７のいずれか１項に記載の系を含むキット。 A kit comprising a system according to any one of claims 1-27 .

細胞における突然変異ジストロフィン遺伝子をインビトロで補正する方法であって、請求項１～２７のいずれか１項に記載の系を前記細胞に投与することを含む方法。 A method of correcting a mutated dystrophin gene in a cell in vitro , comprising administering to said cell a system according to any one of claims 1-27 .

対象における突然変異ジストロフィン遺伝子のゲノム編集に使用するための、請求項１～２７のいずれか１項に記載の系であって、前記対象に投与される系。 28. The system of any one of claims 1-27 for use in genome editing of a mutated dystrophin gene in a subject , wherein the system is administered to said subject.

筋肉内、静脈内またはそれらの組み合わせで、対象に投与される、請求項３１に記載の系。32. The system of claim 31, wherein the system is administered to the subject intramuscularly, intravenously, or a combination thereof.

突然変異ジストロフィン遺伝子を有する対象の処置に使用するための、請求項１～２７のいずれか１項に記載の系であって、前記対象に投与される系。 28. The system of any one of claims 1-27 for use in treating a subject having a mutated dystrophin gene , wherein the system is administered to said subject.

筋肉内、静脈内またはそれらの組み合わせで、対象に投与される、請求項３３に記載の系。 34. The system of claim 33 , wherein the system is administered to the subject intramuscularly , intravenously, or a combination thereof.