JPWO2020190927A5 - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2020190927A5 JPWO2020190927A5 JP2021556467A JP2021556467A JPWO2020190927A5 JP WO2020190927 A5 JPWO2020190927 A5 JP WO2020190927A5 JP 2021556467 A JP2021556467 A JP 2021556467A JP 2021556467 A JP2021556467 A JP 2021556467A JP WO2020190927 A5 JPWO2020190927 A5 JP WO2020190927A5
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell population
- tau
- reporter
- repeat domain
- agglutination
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 161
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 claims description 130
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 claims description 130
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 119
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 108
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 100
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 58
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 claims description 32
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 claims description 32
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 28
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 28
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 23
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 18
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims description 17
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 claims description 15
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 9
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 8
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 6
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100032606 Heat shock factor protein 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 101000867525 Homo sapiens Heat shock factor protein 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 6
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 6
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 claims description 6
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 4
- 101000891579 Homo sapiens Microtubule-associated protein tau Proteins 0.000 claims description 3
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 102000057063 human MAPT Human genes 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 claims description 3
- 108010045123 Blasticidin-S deaminase Proteins 0.000 claims description 2
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 claims description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 2
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 claims 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 claims 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Description
９つの標的遺伝子（標的遺伝子７～１５）を表す１３個のｓｇＲＮＡは、Ａｇｇ［－］と比較してＡｇｇ［＋］でより鋭い枯渇パターンを有すると同定された。図２３を参照されたい。標的遺伝子７～１５の検証を図２４Ａ～２４Ｂに示す。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性をスクリーニングする方法であって、
（ａ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することであって、各細胞集団が、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含み、
前記凝集陽性細胞集団において、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在し、
前記凝集陰性細胞集団において、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在しない、提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらす、導入することと、
（ｃ）各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
前記凝集陰性細胞集団ではないが前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇、または前記凝集陰性細胞集団に対して、前記凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより劇的な枯渇パターンが、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であることを示す、方法。
（項目２）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２１を含み、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
各ガイドＲＮＡが、構成的エクソンを標的とする、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
各ガイドＲＮＡが、５’構成的エクソンを標的とする、項目７に記載の方法。
（項目９）
各ガイドＲＮＡが、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性をスクリーニングする方法であって、
（ａ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することであって、各細胞集団が、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含み、
前記凝集陽性細胞集団において、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在し、
前記凝集陰性細胞集団において、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在しない、提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記キメラＣａｓタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらす、導入することと、
（ｃ）各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
前記凝集陰性細胞集団ではないが前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇、または前記凝集陰性細胞集団に対して、前記凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより劇的な枯渇パターンが、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の活性化が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であることを示す、方法。
（項目１１）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む、項目１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む、項目１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目１０～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目１０～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
各ガイドＲＮＡが、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、項目１０～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号３３に示される配列を含み、
任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一ガイドＲＮＡであり、前記第１のループが、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、前記第２のループが、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である、項目１０～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、配列番号１１を含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じである、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光タンパク質である、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記第１のレポーターが、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、前記第２のレポーターが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記細胞が、真核細胞である、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記細胞の大部分が前記固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、１００個以上の遺伝子、１０００個以上の遺伝子、または１００００個以上の遺伝子を標的とする、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記ライブラリが、ゲノムワイドライブラリである、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
複数の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
少なくとも３個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
約３～約６個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、ウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入される、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々が、別個のウイルスベクター内にある、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、レンチウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入される、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４４）
前記細胞集団が、約０．３未満の感染多重度で感染する、項目４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記複数の固有のガイドＲＮＡが、選択マーカーとともに前記細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、前記選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目４６）
前記選択マーカーが、薬物に対する耐性を付与し、任意に、前記選択マーカーが、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
ステップ（ｂ）において前記複数の固有のガイドＲＮＡが導入される前記細胞集団が各々、固有のガイドＲＮＡあたり約５００個を超える細胞を含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
ステップ（ｃ）の前記時間経過が、約１週間超である、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
ステップ（ｃ）の前記時間経過が、約２週間超である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
ステップ（ｃ）の前記時間経過が、約１０～約１５の細胞倍加を含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
ステップ（ｃ）の前記複数の時点が、少なくとも３つの時点を含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
ステップ（ｃ）の前記複数の時点が、約４つの時点または約６つの時点を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
ステップ（ｃ）の各時点の間が約１日超である、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目５５）
ステップ（ｃ）の各時点の間が約２日超である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
ステップ（ｃ）の各時点の間が約３～約４日である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、前記凝集陰性細胞集団に対して、前記凝集陽性細胞集団において前記時間経過にわたってより劇的な枯渇パターンを有する場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
各時点での前記ガイドＲＮＡの存在量が以前の時点での前記ガイドＲＮＡの存在量以下である場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされる、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目６０）
前記第２の時点の後の各時点での前記ガイドＲＮＡの存在量が２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされる、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目６１）
前記遺伝子を標的とする前記ライブラリ内の前記ガイドＲＮＡの約３０％超が、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目６２）
遺伝子が、以下の状況：
（１）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする１つのガイドＲＮＡが存在し、前記１つのガイドＲＮＡが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
（２）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする２つのガイドＲＮＡが存在し、前記２つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
（３）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする３つのガイドＲＮＡが存在し、前記３つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
（４）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする４つのガイドＲＮＡが存在し、前記４つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
（５）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする５つのガイドＲＮＡが存在し、前記５つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、および
（６）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする６つのガイドＲＮＡが存在し、前記６つのガイドＲＮＡの少なくとも３つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、のうちのいずれか１つにおいて、ステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記方法が、少なくとも３つの異なる実験で少なくとも３回繰り返され、遺伝子が、前記少なくとも３つの異なる実験の約５０％超でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる場合、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目６４）
ステップ（ｃ）の前記時間経過が、約２週間超であり、
ステップ（ｃ）の前記複数の時点が、約６つの時点を含み、
ステップ（ｃ）の各時点の間が約３～約４日であり、
前記第２の時点の後の各時点での前記ガイドＲＮＡの存在量が２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされ、
前記遺伝子を標的とする前記ライブラリ内の前記ガイドＲＮＡの約３０％超が、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目６５）
Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む、１つ以上の細胞集団。
（項目６６）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目６５に記載の細胞集団。
（項目６７）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目６６に記載の細胞集団。
（項目６８）
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２１を含み、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目６７に記載の細胞集団。
（項目６９）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞において安定して発現される、項目６５～６８のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目７０）
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞においてゲノム的に組み込まれる、項目６５～６９のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目７１）
１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む、１つ以上の細胞集団。
（項目７２）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目７１に記載の細胞集団。
（項目７３）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、項目７２に記載の細胞集団。
（項目７４）
前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む、項目７１～７３のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目７５）
前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む、項目７１～７４のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目７６）
前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目７１～７５のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目７７）
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目７１～７６のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目７８）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞において安定して発現される、項目７１～７７のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目７９）
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞においてゲノム的に組み込まれる、項目７１～７８のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目８０）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、項目６５～７９のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目８１）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、項目６５～８０のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目８２）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、項目８１に記載の細胞集団。
（項目８３）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、項目６５～８２のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目８４）
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、配列番号１１を含む、項目６５～８３のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目８５）
前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じである、項目６５～８４のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目８６）
前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む、項目６５～８５のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目８７）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光タンパク質である、項目６５～８６のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目８８）
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、項目８７に記載の細胞集団。
（項目８９）
前記第１のレポーターが、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、前記第２のレポーターが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、項目８８に記載の細胞集団。
（項目９０）
前記細胞が、真核細胞である、項目６５～８９のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目９１）
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目９０に記載の細胞集団。
（項目９２）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目９１に記載の細胞集団。
（項目９３）
前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、項目９２に記載の細胞集団。
（項目９４）
前記細胞が、インビトロである、項目６５～９３のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目９５）
前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在していない、項目６５～９４のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目９６）
前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在する、項目６５～９５のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目９７）
項目６５～９６のいずれか一項に記載の細胞集団および培養培地を含む、インビトロ培養物。
Thirteen sgRNAs representing nine target genes (target genes 7-15) were identified with sharper depletion patterns in Agg[+] compared to Agg[-]. Please refer to FIG. Validation of target genes 7-15 is shown in Figures 24A-24B.
In certain embodiments, for example, the following items are provided.
(Item 1)
A method of screening for genetic vulnerabilities associated with tau aggregation, comprising:
(a) providing an aggregation-positive cell population and an aggregation-negative cell population, each cell population linked to a Cas protein, a first tau repeat domain linked to a first reporter, and a second reporter; a second tau repeat domain with
In the aggregation-positive cell population, the first tau repeat domain linked to the first reporter and the second tau repeat domain linked to the second reporter stably exist in an aggregated state. ,
In the aggregation-negative cell population, the first tau repeat domain linked to the first reporter and the second tau repeat domain linked to the second reporter do not stably exist in an aggregated state. , providing
(b) introducing into each cell population a library comprising a plurality of unique guide RNAs targeting a plurality of genes, wherein said plurality of unique guide RNAs form complexes with said Cas protein; introducing, wherein the Cas protein cleaves the plurality of genes resulting in a knockout of gene function;
(c) determining the abundance of each of the plurality of unique guide RNAs at multiple time points over time in each cell population;
depletion of guide RNA in the aggregation-positive cell population but not the aggregation-negative cell population, or a more dramatic pattern of guide RNA depletion over time in the aggregation-positive cell population relative to the aggregation-negative cell population, wherein the A method wherein the gene targeted by the guide RNA exhibits synthetic lethality with tau protein aggregates, indicating a genetic vulnerability associated with tau aggregation.
(Item 2)
The method of item 1, wherein the Cas protein is a Cas9 protein.
(Item 3)
3. The method of item 2, wherein the Cas protein is Streptococcus pyogenes Cas9.
(Item 4)
4. The method of item 3, wherein said Cas protein comprises SEQ ID NO:21, optionally wherein said Cas protein is encoded by a coding sequence comprising the sequence shown in SEQ ID NO:22.
(Item 5)
said Cas protein, said first tau repeat domain linked to said first reporter, and said second tau repeat domain linked to said second reporter are stably expressed in said cell population , a method as described in any of the preceding items.
(Item 6)
Nucleic acids encoding the Cas protein, the first tau repeat domain linked to the first reporter, and the second tau repeat domain linked to the second reporter are genomic in the cell population A method according to any preceding item, wherein the method is incorporated in
(Item 7)
A method according to any preceding item, wherein each guide RNA targets a constitutive exon.
(Item 8)
8. The method of item 7, wherein each guide RNA targets the 5' constitutive exon.
(Item 9)
A method according to any of the preceding items, wherein each guide RNA targets the first exon, the second exon or the third exon.
(Item 10)
A method of screening for genetic vulnerabilities associated with tau aggregation, comprising:
(a) providing agglutination-positive and agglutination-negative cell populations, each cell population comprising a nuclease-inactive Cas protein fused to one or more transcriptional activation domains; a chimeric adapter protein comprising an adapter protein fused to the above transcription activation domain, a first tau repeat domain linked to a first reporter, a second tau repeat domain linked to a second reporter, including
In the aggregation-positive cell population, the first tau repeat domain linked to the first reporter and the second tau repeat domain linked to the second reporter stably exist in an aggregated state. ,
In the aggregation-negative cell population, the first tau repeat domain linked to the first reporter and the second tau repeat domain linked to the second reporter do not stably exist in an aggregated state. , providing
(b) introducing into each cell population a library comprising a plurality of unique guide RNAs targeting a plurality of genes, wherein said plurality of unique guide RNAs are linked to said chimeric Cas protein and said chimeric adapter protein; introducing, forming a complex, said complex activating transcription of said plurality of genes, resulting in increased gene expression;
(c) determining the abundance of each of the plurality of unique guide RNAs at multiple time points over time in each cell population;
depletion of guide RNA in the aggregation-positive cell population but not the aggregation-negative cell population, or a more dramatic pattern of guide RNA depletion over time in the aggregation-positive cell population relative to the aggregation-negative cell population, wherein the A method wherein activation of said gene targeted by a guide RNA exhibits synthetic lethality with tau protein aggregates, indicating a genetic vulnerability associated with tau aggregation.
(Item 11)
11. The method of item 10, wherein the Cas protein is a Cas9 protein.
(Item 12)
12. The method of item 11, wherein the Cas protein is Streptococcus pyogenes Cas9.
(Item 13)
said chimeric Cas protein comprises said nuclease-inactive Cas protein fused to a VP64 transcriptional activation domain; A method according to any one of items 10-12, comprising a signal and said VP64 transcriptional activator domain.
(Item 14)
wherein said adapter protein is MS2 coat protein, said one or more transcriptional activation domains in said chimeric adapter protein comprises a p65 transcriptional activation domain and an HSF1 transcriptional activation domain, optionally said chimeric adapter protein is , comprising, from N-terminus to C-terminus, said MS2 coat protein, a nuclear localization signal, said p65 transcriptional activation domain, and said HSF1 transcriptional activation domain.
(Item 15)
15. The method of any one of items 10-14, wherein said chimeric Cas protein comprises SEQ ID NO:36, optionally wherein said chimeric Cas protein is encoded by a coding sequence comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:38. .
(Item 16)
16. The method of any one of items 10-15, wherein said chimeric adapter protein comprises SEQ ID NO:37, optionally wherein said chimeric adapter protein is encoded by a coding sequence comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:39. .
(Item 17)
The chimeric Cas protein, the chimeric adapter protein, the first tau repeat domain linked to the first reporter, and the second tau repeat domain linked to the second reporter are in the cell population 17. The method of any one of items 10-16, which is stably expressed.
(Item 18)
a nucleic acid encoding the chimeric Cas protein, the chimeric adapter protein, the first tau repeat domain linked to the first reporter, and the second tau repeat domain linked to the second reporter, 18. The method of any one of items 10-17, wherein the method is genomically integrated in said cell population.
(Item 19)
19. A method according to any one of items 10-18, wherein each guide RNA targets a guide RNA target sequence within 200 bp upstream of the transcription start site.
(Item 20)
each guide RNA comprises one or more adapter binding elements to which said chimeric adapter protein can specifically bind; optionally each guide RNA can be specifically bound by said chimeric adapter protein2 optionally, a first adapter binding element is in the first loop of each of said one or more guide RNAs, and a second adapter binding element is in said one or more guide RNAs. within each second loop of the RNA, optionally wherein said adapter binding element comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 33;
Optionally, each of the one or more guide RNAs is a single guide RNA comprising a CRISPR RNA (crRNA) portion fused to a transactivating CRISPR RNA (tracrRNA) portion, wherein said first loop comprises SEQ ID NO: 17 and said second loop is stem loop 2 corresponding to residues 53-56 of SEQ ID NO: 17. the method of.
(Item 21)
A method according to any of the preceding items, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain are human tau repeat domains.
(Item 22)
A method according to any of the preceding items, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain comprise aggregation-promoting mutations.
(Item 23)
23. The method of item 22, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain comprises a tau P301S mutation.
(Item 24)
A method according to any of the preceding items, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain comprises a tau4 repeat domain.
(Item 25)
The method of any of the preceding items, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain comprises SEQ ID NO:11.
(Item 26)
A method according to any of the preceding items, wherein said first tau repeat domain and said second tau repeat domain are the same.
(Item 27)
The method of any of the preceding items, wherein said first tau repeat domain and said second tau repeat domain are the same and each comprises a tau4 repeat domain comprising a tau P301S mutation.
(Item 28)
A method according to any of the preceding items, wherein said first reporter and said second reporter are fluorescent proteins.
(Item 29)
29. The method of item 28, wherein said first reporter and said second reporter are a fluorescence resonance energy transfer (FRET) pair.
(Item 30)
30. The method of item 29, wherein the first reporter is cyan fluorescent protein (CFP) and the second reporter is yellow fluorescent protein (YFP).
(Item 31)
A method according to any of the preceding items, wherein said cells are eukaryotic cells.
(Item 32)
32. The method of item 31, wherein said cells are mammalian cells.
(Item 33)
33. The method of item 32, wherein the cells are human cells.
(Item 34)
34. The method of item 33, wherein said cells are HEK293T cells.
(Item 35)
A method according to any of the preceding items, wherein said plurality of unique guide RNAs are introduced at a concentration selected such that the majority of said cells receive only one of said unique guide RNAs.
(Item 36)
The method of any of the preceding items, wherein the plurality of unique guide RNAs target 100 or more genes, 1000 or more genes, or 10000 or more genes.
(Item 37)
A method according to any preceding item, wherein said library is a genome-wide library.
(Item 38)
A method according to any of the preceding items, wherein a plurality of target sequences are targeted on average in each of said targeted plurality of genes.
(Item 39)
39. The method of item 38, wherein at least 3 target sequences are targeted on average in each of said plurality of targeted genes.
(Item 40)
40. The method of item 39, wherein about 3 to about 6 target sequences are targeted on average in each of said plurality of targeted genes.
(Item 41)
A method according to any of the preceding items, wherein said plurality of unique guide RNAs are introduced into said cell population by viral transduction.
(Item 42)
42. The method of item 41, wherein each of said plurality of unique guide RNAs is in a separate viral vector.
(Item 43)
43. Method according to item 41 or 42, wherein said plurality of unique guide RNAs are introduced into said cell population by lentiviral transduction.
(Item 44)
44. The method of any one of items 41-43, wherein said cell population is infected at a multiplicity of infection of less than about 0.3.
(Item 45)
The method of any of the preceding items, wherein said plurality of unique guide RNAs are introduced into said cell population with a selectable marker, and step (b) further comprises selecting cells containing said selectable marker.
(Item 46)
46. The method of item 45, wherein said selectable marker confers resistance to a drug, optionally said selectable marker confers resistance to puromycin or zeocin.
(Item 47)
47. The method of item 46, wherein said selectable marker is selected from neomycin phosphotransferase, hygromycin B phosphotransferase, puromycin-N-acetyltransferase, and blasticidin S deaminase.
(Item 48)
The method of any of the preceding items, wherein each of said cell populations into which said plurality of unique guide RNAs are introduced in step (b) comprises greater than about 500 cells per unique guide RNA.
(Item 49)
A method according to any of the preceding items, wherein the time course of step (c) is greater than about one week.
(Item 50)
50. The method of item 49, wherein the time course of step (c) is greater than about two weeks.
(Item 51)
The method of any preceding item, wherein the time course of step (c) comprises from about 10 to about 15 cell doublings.
(Item 52)
A method according to any of the preceding items, wherein said plurality of time points of step (c) comprises at least three time points.
(Item 53)
53. The method of item 52, wherein the plurality of time points of step (c) comprises about 4 time points or about 6 time points.
(Item 54)
The method of any of the preceding items, wherein there is more than about 1 day between each time point in step (c).
(Item 55)
55. The method of item 54, wherein there is more than about 2 days between each time point in step (c).
(Item 56)
56. The method of item 55, wherein between each time point in step (c) is about 3 to about 4 days.
(Item 57)
If the guide RNA targeting said gene is depleted in said aggregation-positive cell population but not in said aggregation-negative cell population, then the gene is killed synthetically with tau protein aggregates in step (c). A method according to any of the preceding items, which is considered to exhibit sexuality.
(Item 58)
If the guide RNA targeting said gene has a more dramatic pattern of depletion over said time course in said aggregation-positive cell population relative to said aggregation-negative cell population, then said gene is associated with tau protein aggregates in step (c). 58. The method of item 57, which is considered to exhibit combined lethality with
(Item 59)
Any of the preceding items, wherein guide RNA is considered depleted in step (c) if the abundance of said guide RNA at each time point is less than or equal to the abundance of said guide RNA at a previous time point. the method of.
(Item 60)
guide RNA is considered depleted in step (c) if the abundance of said guide RNA at each time point after said second time point is less than or equal to the abundance at time points two time points before said second time point, A method according to any of the items.
(Item 61)
If more than about 30% of the guide RNAs in the library targeting the gene are depleted in the aggregation-positive cell population, but not in the aggregation-negative cell population, then the gene is depleted in step (c ) is considered to exhibit synthetic lethality with tau protein aggregates.
(Item 62)
The gene is in the following situations:
(1) there is one guide RNA that targets the gene in the library, and the one guide RNA is depleted in the aggregation-positive cell population, but depleted in the aggregation-negative cell population; do not have,
(2) there are two guide RNAs targeting the gene in the library, wherein at least one of the two guide RNAs is depleted in the aggregation-positive cell population, but in the aggregation-negative cell population; not exhausted,
(3) there are three guide RNAs that target the gene in the library, and at least one of the three guide RNAs is depleted in the aggregation-positive cell population, but in the aggregation-negative cell population; not exhausted,
(4) there are four guide RNAs targeting the gene in the library, and at least two of the four guide RNAs are depleted in the aggregation-positive cell population, but in the aggregation-negative cell population; not exhausted,
(5) there are five guide RNAs targeting the gene in the library, and at least two of the five guide RNAs are depleted in the aggregation-positive cell population, but in the aggregation-negative cell population; not exhausted, and
(6) there are 6 guide RNAs in the library that target the gene, and at least 3 of the 6 guide RNAs are depleted in the aggregation-positive cell population, but in the aggregation-negative cell population; 62. The method of item 61, wherein the method is considered to exhibit synthetic lethality with tau protein aggregates in step (c) in any one of the non-depleting.
(Item 63)
If the method is repeated at least 3 times in at least 3 different experiments and the gene is deemed to exhibit synthetic lethality with tau protein aggregates in greater than about 50% of said at least 3 different experiments, tau protein aggregation A method according to any of the preceding items which is considered to exhibit synthetic lethality with aggregates.
(Item 64)
said time course of step (c) is greater than about two weeks;
said plurality of time points of step (c) comprises about six time points;
about 3 to about 4 days between each time point in step (c);
guide RNA is considered depleted in step (c) if the abundance of the guide RNA at each time point after the second time point is less than or equal to the abundance at the two time points before;
If more than about 30% of the guide RNAs in the library targeting the gene are depleted in the aggregation-positive cell population, but not in the aggregation-negative cell population, then the gene is depleted in step (c ) is considered to exhibit synthetic lethality with tau protein aggregates.
(Item 65)
One or more cell populations comprising a Cas protein, a first tau repeat domain linked to a first reporter, and a second tau repeat domain linked to a second reporter.
(Item 66)
66. The cell population of item 65, wherein said Cas protein is a Cas9 protein.
(Item 67)
67. The cell population of item 66, wherein said Cas protein is Streptococcus pyogenes Cas9.
(Item 68)
68. The cell population of item 67, wherein said Cas protein comprises SEQ ID NO:21, optionally wherein said Cas protein is encoded by a coding sequence comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:22.
(Item 69)
said Cas protein, said first tau repeat domain linked to said first reporter, and said second tau repeat domain linked to said second reporter are stably expressed in said cell; A cell population according to any one of items 65-68.
(Item 70)
a nucleic acid encoding the Cas protein, the first tau repeat domain linked to the first reporter, and the second tau repeat domain linked to the second reporter, genetically in the cell 70. A cell population according to any one of items 65-69, which is incorporated.
(Item 71)
a chimeric Cas protein comprising a nuclease-inactive Cas protein fused to one or more transcriptional activation domains; a chimeric adapter protein comprising an adapter protein fused to one or more transcriptional activation domains; and a second tau repeat domain linked to a second reporter.
(Item 72)
72. The cell population of item 71, wherein said Cas protein is a Cas9 protein.
(Item 73)
73. The cell population of item 72, wherein said Cas protein is Streptococcus pyogenes Cas9.
(Item 74)
said chimeric Cas protein comprises said nuclease-inactive Cas protein fused to a VP64 transcriptional activation domain; 74. The cell population of any one of items 71-73, comprising a signal and said VP64 transcriptional activator domain.
(Item 75)
wherein said adapter protein is MS2 coat protein, said one or more transcriptional activation domains in said chimeric adapter protein comprises a p65 transcriptional activation domain and an HSF1 transcriptional activation domain, optionally said chimeric adapter protein is , N-terminal to C-terminal, said MS2 coat protein, a nuclear localization signal, said p65 transcriptional activation domain, and said HSF1 transcriptional activation domain. .
(Item 76)
76. The cell of any one of items 71-75, wherein said chimeric Cas protein comprises SEQ ID NO:36, optionally wherein said chimeric Cas protein is encoded by a coding sequence comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:38. group.
(Item 77)
77. The cell of any one of items 71-76, wherein said chimeric adapter protein comprises SEQ ID NO:37, optionally wherein said chimeric adapter protein is encoded by a coding sequence comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:39. group.
(Item 78)
said chimeric Cas protein, said chimeric adapter protein, said first tau repeat domain linked to said first reporter, and said second tau repeat domain linked to said second reporter are stable in said cell 78. The cell population of any one of items 71-77, wherein the cell population is expressed as
(Item 79)
a nucleic acid encoding the chimeric Cas protein, the chimeric adapter protein, the first tau repeat domain linked to the first reporter, and the second tau repeat domain linked to the second reporter, 79. The cell population of any one of items 71-78, which is genomically integrated in said cells.
(Item 80)
80. The cell population of any one of items 65-79, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain are human tau repeat domains.
(Item 81)
81. The cell population of any one of items 65-80, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain comprise aggregation-promoting mutations.
(Item 82)
82. The cell population of item 81, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain comprises a tau P301S mutation.
(Item 83)
83. The cell population of any one of items 65-82, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain comprises a tau4 repeat domain.
(Item 84)
84. The cell population of any one of items 65-83, wherein said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain comprises SEQ ID NO:11.
(Item 85)
85. The cell population of any one of items 65-84, wherein said first tau repeat domain and said second tau repeat domain are the same.
(Item 86)
86. The cell population of any one of items 65-85, wherein said first tau repeat domain and said second tau repeat domain are the same and each comprises a tau4 repeat domain comprising a tau P301S mutation. .
(Item 87)
87. The cell population of any one of items 65-86, wherein said first reporter and said second reporter are fluorescent proteins.
(Item 88)
88. The cell population of item 87, wherein said first reporter and said second reporter are a fluorescence resonance energy transfer (FRET) pair.
(Item 89)
89. The cell population of item 88, wherein said first reporter is cyan fluorescent protein (CFP) and said second reporter is yellow fluorescent protein (YFP).
(Item 90)
90. The cell population of any one of items 65-89, wherein said cells are eukaryotic cells.
(Item 91)
91. The cell population of item 90, wherein said cells are mammalian cells.
(Item 92)
92. The cell population of item 91, wherein said cells are human cells.
(Item 93)
93. The cell population of item 92, wherein said cells are HEK293T cells.
(Item 94)
94. The cell population of any one of items 65-93, wherein said cells are in vitro.
(Item 95)
wherein said first tau repeat domain linked to said first reporter and said second tau repeat domain linked to said second reporter are not stably present in an aggregated state, items 65-94 The cell population according to any one of .
(Item 96)
Any of items 65 to 95, wherein said first tau repeat domain linked to said first reporter and said second tau repeat domain linked to said second reporter are stably present in an aggregated state. or the cell population according to item 1.
(Item 97)
An in vitro culture comprising a cell population according to any one of items 65-96 and a culture medium.
Claims (27)
（ａ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することであって、各細胞集団が、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含み、
前記細胞が、哺乳動物細胞であり、
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光タンパク質であり、前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり、
前記凝集陽性細胞集団が、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインの凝集体を含み、
前記凝集陰性細胞集団が、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインの凝集体を含まない、提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらす、導入することと、
（ｃ）各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
前記複数の時点が、少なくとも３つの時点を含み、各時点の間が約１日超であり、
前記凝集陰性細胞集団ではないが前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇、または前記凝集陰性細胞集団に対して、前記凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより速い速度の枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であることを示す、方法。 A method of screening for genetic vulnerability associated with tau aggregation, the method comprising:
(a) providing an agglutination-positive cell population and an agglutination-negative cell population, each cell population having a Cas protein, a first tau repeat domain linked to a first reporter, and a second reporter linked to the Cas protein; comprising a second tau repeat domain,
the cell is a mammalian cell,
the first reporter and the second reporter are fluorescent proteins, the first reporter and the second reporter are a fluorescence resonance energy transfer (FRET) pair,
the agglutination-positive cell population comprises an aggregate of the first tau repeat domain linked to the first reporter and the second tau repeat domain linked to the second reporter,
The agglutination-negative cell population does not contain aggregates of the first tau repeat domain linked to the first reporter and the second tau repeat domain linked to the second reporter. and,
(b) introducing into each cell population a library containing a plurality of unique guide RNAs targeting a plurality of genes, the plurality of unique guide RNAs forming a complex with the Cas protein; introducing the Cas protein to cleave the plurality of genes resulting in knockout of gene function;
(c) determining the abundance of each of the plurality of unique guide RNAs at multiple time points over time in each cell population;
the plurality of time points includes at least three time points, each time point being more than about 1 day apart;
depletion of guide RNA in said agglutination-positive cell population but not said agglutination-negative cell population, or a faster rate of depletion of guide RNA over time in said agglutination-positive cell population relative to said agglutination-negative cell population; A method wherein said gene targeted by RNA exhibits synthetic lethality with tau protein aggregates and is a genetic vulnerability associated with tau aggregation.
前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、請求項１または２に記載の方法。 The Cas protein, the first tau repeat domain linked to the first reporter, and the second tau repeat domain linked to the second reporter are stably expressed in the cell population. , or a nucleic acid encoding the Cas protein, the first tau repeat domain linked to the first reporter, and the second tau repeat domain linked to the second reporter in the cell population. 3. The method of claim 1 or 2, wherein the method is genomically integrated.
各ガイドＲＮＡが、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 Each guide RNA targets a constitutive exon, optionally each guide RNA targets a 5' constitutive exon, or each guide RNA targets a first exon, a second exon, or a third exon. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the method targets an exon.
（ａ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することであって、各細胞集団が、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含み、
前記細胞が、哺乳動物細胞であり、
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光タンパク質であり、前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり、
前記凝集陽性細胞集団が、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインの凝集体を含み、
前記凝集陰性細胞集団が、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインの凝集体を含まない、提供することと、
（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記キメラＣａｓタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらす、導入することと、
（ｃ）各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
前記複数の時点が、少なくとも３つの時点を含み、各時点の間が約１日超であり、
前記凝集陰性細胞集団ではないが前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇、または前記凝集陰性細胞集団に対して、前記凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより速い速度の枯渇が、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の活性化が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であることを示す、方法。 A method of screening for genetic vulnerability associated with tau aggregation, the method comprising:
(a) providing an agglutination-positive cell population and an agglutination-negative cell population, each cell population comprising a chimeric Cas protein comprising a nuclease-inactive Cas protein fused to one or more transcriptional activation domains; A chimeric adapter protein comprising an adapter protein fused to the above transcriptional activation domain, a first tau repeat domain linked to a first reporter, a second tau repeat domain linked to a second reporter, including;
the cell is a mammalian cell,
the first reporter and the second reporter are fluorescent proteins, the first reporter and the second reporter are a fluorescence resonance energy transfer (FRET) pair,
the agglutination-positive cell population comprises an aggregate of the first tau repeat domain linked to the first reporter and the second tau repeat domain linked to the second reporter,
The agglutination-negative cell population does not contain aggregates of the first tau repeat domain linked to the first reporter and the second tau repeat domain linked to the second reporter. and,
(b) introducing into each cell population a library containing a plurality of unique guide RNAs targeting a plurality of genes, wherein the plurality of unique guide RNAs interact with the chimeric Cas protein and the chimeric adapter protein; forming a complex, the complex activating transcription of the plurality of genes, resulting in increased gene expression;
(c) determining the abundance of each of the plurality of unique guide RNAs at multiple time points over time in each cell population;
the plurality of time points includes at least three time points, each time point being more than about 1 day apart;
depletion of guide RNA in said agglutination-positive cell population but not said agglutination-negative cell population, or a faster rate of depletion of guide RNA over time in said agglutination-positive cell population relative to said agglutination-negative cell population; A method in which activation of said genes targeted by RNA exhibits synthetic lethality with tau protein aggregates, indicating a genetic vulnerability associated with tau aggregation.
前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされ、
前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項５に記載の方法。 The Cas protein is a Cas9 protein, optionally the Cas protein is Streptococcus pyogenes Cas9,
The chimeric Cas protein comprises the nuclease-inactive Cas protein fused to a VP64 transcriptional activation domain, and optionally, the chimeric Cas protein comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the nuclease-inactive Cas protein, nuclear localization. signal, and said VP64 transcriptional activator domain, optionally said chimeric Cas protein comprises SEQ ID NO: 36, optionally said chimeric Cas protein encoded by a coding sequence comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 38. is,
The adapter protein is an MS2 coat protein, the one or more transcriptional activation domains in the chimeric adapter protein include a p65 transcriptional activation domain and a HSF1 transcriptional activation domain, and optionally, the chimeric adapter protein , from N-terminus to C-terminus, the MS2 coat protein, the nuclear localization signal, the p65 transcriptional activation domain, and the HSF1 transcriptional activation domain, optionally, the chimeric adapter protein comprises SEQ ID NO: 37. 6. The method of claim 5, wherein the chimeric adapter protein is encoded by a coding sequence comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 39.
前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、請求項５または６に記載の方法。 the chimeric Cas protein, the chimeric adapter protein, the first tau repeat domain linked to the first reporter, and the second tau repeat domain linked to the second reporter in the cell population. stably expressed, or the chimeric Cas protein, the chimeric adapter protein, the first tau repeat domain linked to the first reporter, and the second tau linked to the second reporter. 7. The method of claim 5 or 6, wherein the nucleic acid encoding the repeat domain is genomically integrated in the cell population.
各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号３３に示される配列を含み、
任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一ガイドＲＮＡであり、前記第１のループが、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、前記第２のループが、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。 each guide RNA targets a guide RNA target sequence within 200 bp upstream of the transcription start site;
Each guide RNA comprises one or more adapter binding elements to which said chimeric adapter protein can specifically bind, and optionally each guide RNA comprises one or more adapter binding elements to which said chimeric adapter protein can specifically bind. an adapter-binding element, optionally a first adapter-binding element within a first loop of each of said one or more guide RNAs, and a second adapter-binding element within a first loop of each of said one or more guide RNAs. in the second loop of each of the RNAs, optionally said adapter binding element comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 33;
Optionally, each of the one or more guide RNAs is a single guide RNA comprising a CRISPR RNA (crRNA) portion fused to a transactivating CRISPR RNA (tracrRNA) portion, and wherein said first loop comprises SEQ ID NO: 17. is a tetraloop corresponding to residues 13 to 16 of SEQ ID NO: 17, and the second loop is a stem loop 2 corresponding to residues 53 to 56 of SEQ ID NO: 17. Method described.
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含み、任意に、前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、かつ／または
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、かつ／または
前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、配列番号１１を含む、かつ／または
前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。 the first tau repeat domain and/or the second tau repeat domain are human tau repeat domains, and/or the first tau repeat domain and/or the second tau repeat domain promote aggregation. optionally, said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain comprises a tau P301S mutation, and/or said first tau repeat domain and/or said second tau repeat domain the repeat domain comprises a tau 4 repeat domain, and/or the first tau repeat domain and/or the second tau repeat domain comprises SEQ ID NO: 11, and/or the first tau repeat domain and The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the second tau repeat domains are the same.
前記ライブラリが、ゲノムワイドライブラリである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。 Any of claims 1 to 13, wherein the plurality of unique guide RNAs target 100 or more genes, 1000 or more genes, or 10,000 or more genes, or the library is a genome-wide library. The method described in paragraph (1).
任意に、少なくとも３個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化され、
任意に、約３～約６個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。 a plurality of target sequences are targeted on average in each of the plurality of targeted genes;
Optionally, at least three target sequences are targeted on average in each of said plurality of targeted genes;
15. The method of any one of claims 1-14, optionally, on average about 3 to about 6 target sequences are targeted in each of said plurality of targeted genes.
任意に、前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々が、別個のウイルスベクター内にあり、
任意に、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、レンチウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入され、
任意に、前記細胞集団が、約０．３未満の感染多重度で感染する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。 the plurality of unique guide RNAs are introduced into the cell population by viral transduction;
Optionally, each of said plurality of unique guide RNAs is in a separate viral vector;
Optionally, said plurality of unique guide RNAs are introduced into said cell population by lentiviral transduction;
16. The method of any one of claims 1-15, optionally wherein said cell population is infected with a multiplicity of infection of less than about 0.3.
任意に、前記選択マーカーが、薬物に対する耐性を付与し、任意に、前記選択マーカーが、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与し、
任意に、前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。 the plurality of unique guide RNAs are introduced into the cell population along with a selection marker, step (b) further comprising selecting cells containing the selection marker;
Optionally, the selectable marker confers resistance to a drug; optionally, the selectable marker confers resistance to puromycin or zeocin;
Optionally, the selectable marker is selected from neomycin phosphotransferase, hygromycin B phosphotransferase, puromycin-N-acetyltransferase, and blasticidin S deaminase. Method.
任意に、ステップ（ｃ）の各時点の間が約３～約４日である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。 There is more than about 2 days between each point in step (c) ;
22. A method according to any one of claims 1 to 21, optionally with about 3 to about 4 days between each point in step (c).
任意に、前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、前記凝集陰性細胞集団に対して、前記凝集陽性細胞集団において前記時間経過にわたってより速い速度の枯渇を有する場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。 If the guide RNA targeting said gene is depleted in said aggregation-positive cell population but not in said agglutination-negative cell population, the gene is synthesized with tau protein aggregates in step (c). It is considered to exhibit gender,
Optionally, if the guide RNA targeting said gene has a faster rate of depletion over said time course in said agglutination-positive cell population relative to said agglutination-negative cell population, the gene is targeted to tau protein in step (c). 23. A method according to any one of claims 1 to 22, which is considered to exhibit synthetic lethality with aggregates.
前記第２の時点の後の各時点での前記ガイドＲＮＡの存在量が２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。 guide RNA is considered depleted in step (c) if the abundance of said guide RNA at each time point is less than or equal to the abundance of said guide RNA at a previous time point; or 24. Guide RNA is considered to be depleted in step (c) if the abundance of said guide RNA at each subsequent time point is less than or equal to the abundance at two previous time points. The method described in paragraph (1).
任意に、前記遺伝子が、以下の状況：
（１）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする１つのガイドＲＮＡが存在し、前記１つのガイドＲＮＡが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
（２）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする２つのガイドＲＮＡが存在し、前記２つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
（３）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする３つのガイドＲＮＡが存在し、前記３つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
（４）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする４つのガイドＲＮＡが存在し、前記４つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
（５）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする５つのガイドＲＮＡが存在し、前記５つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、および
（６）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする６つのガイドＲＮＡが存在し、前記６つのガイドＲＮＡの少なくとも３つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、のうちのいずれか１つにおいて、ステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。 If more than about 30% of the guide RNA in the library that targets the gene is depleted in the agglutination-positive cell population but not in the agglutination-negative cell population, the gene is ) is considered to be synthetically lethal with tau protein aggregates,
Optionally, said gene is in the following circumstances:
(1) One guide RNA that targets the gene is present in the library, and the one guide RNA is depleted in the agglutination-positive cell population but not in the agglutination-negative cell population. do not have,
(2) Two guide RNAs targeting the gene are present in the library, and at least one of the two guide RNAs is depleted in the agglutination-positive cell population, but in the agglutination-negative cell population. not depleted,
(3) There are three guide RNAs targeting the gene in the library, and at least one of the three guide RNAs is depleted in the agglutination-positive cell population, but in the agglutination-negative cell population. not depleted,
(4) There are four guide RNAs targeting the gene in the library, and at least two of the four guide RNAs are depleted in the agglutination-positive cell population, but in the agglutination-negative cell population. not depleted,
(5) There are five guide RNAs targeting the gene in the library, and at least two of the five guide RNAs are depleted in the agglutination-positive cell population, but in the agglutination-negative cell population. (6) there are six guide RNAs targeting said gene in said library, and at least three of said six guide RNAs are depleted in said aggregation-positive cell population; Any one of claims 1 to 24, which is considered to exhibit synthetic lethality with tau protein aggregates in step (c), in any one of which is not depleted in the agglutination-negative cell population. The method described in.
ステップ（ｃ）の前記複数の時点が、約６つの時点を含み、
ステップ（ｃ）の各時点の間が約３～約４日であり、
前記第２の時点の後の各時点での前記ガイドＲＮＡの存在量が２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされ、
前記遺伝子を標的とする前記ライブラリ内の前記ガイドＲＮＡの約３０％超が、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。 the time course of step (c) is greater than about two weeks;
the plurality of time points of step (c) includes about six time points;
there are about 3 to about 4 days between each point in step (c);
If the abundance of the guide RNA at each time point after the second time point is less than or equal to the abundance at two previous time points, the guide RNA is considered to be depleted in step (c);
If more than about 30% of the guide RNA in the library that targets the gene is depleted in the agglutination-positive cell population but not in the agglutination-negative cell population, the gene is ) is considered to exhibit synthetic lethality with tau protein aggregates.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962820101P | 2019-03-18 | 2019-03-18 | |
| US62/820,101 | 2019-03-18 | ||
| PCT/US2020/023121 WO2020190927A1 (en) | 2019-03-18 | 2020-03-17 | Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022526297A JP2022526297A (en) | 2022-05-24 |
| JPWO2020190927A5 true JPWO2020190927A5 (en) | 2023-09-27 |
| JP7389135B2 JP7389135B2 (en) | 2023-11-29 |
Family
ID=70285886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021556467A Active JP7389135B2 (en) | 2019-03-18 | 2020-03-17 | CRISPR/CAS dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11781131B2 (en) |
| EP (1) | EP3769090B1 (en) |
| JP (1) | JP7389135B2 (en) |
| CN (1) | CN113711046B (en) |
| AU (1) | AU2020241856B2 (en) |
| CA (1) | CA3127814C (en) |
| ES (1) | ES2969026T3 (en) |
| IL (1) | IL286359B2 (en) |
| SG (1) | SG11202108090XA (en) |
| WO (1) | WO2020190927A1 (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113711046B (en) | 2019-03-18 | 2023-08-29 | 瑞泽恩制药公司 | CRISPR/Cas shedding screening platform for revealing gene vulnerability related to Tau aggregation |
| US11845931B2 (en) | 2019-03-18 | 2023-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | CRISPR/Cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation |
| WO2020252340A1 (en) | 2019-06-14 | 2020-12-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Models of tauopathy |
| CN114426982B (en) * | 2022-02-22 | 2024-03-22 | 上海交通大学 | Method for reprogramming cell metabolism and application thereof |
Family Cites Families (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001271553A1 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-08 | Genetastix Corporation | High throughput generation and screening of fully human antibody repertoire in yeast |
| CN101333555B (en) * | 2007-12-25 | 2012-03-21 | 浙江大学 | Novel horizontal screening system construct by recipient cell G protein coupling and applications |
| JP2011517838A (en) | 2008-04-11 | 2011-06-16 | ユーティーシー パワー コーポレイション | Bipolar plate and fuel cell with manifold sump |
| CN103025344B (en) | 2010-05-17 | 2016-06-29 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | Novel DNA-associated proteins and application thereof |
| US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
| WO2013141680A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
| ES2636902T3 (en) | 2012-05-25 | 2017-10-10 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed transcription modulation |
| MX359555B (en) | 2012-07-03 | 2018-10-02 | Univ Washington | Antibodies to tau. |
| WO2014033644A2 (en) | 2012-08-28 | 2014-03-06 | Novartis Ag | Methods of nuclease-based genetic engineering |
| SG10201809566SA (en) | 2012-10-23 | 2018-11-29 | Toolgen Inc | Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof |
| WO2014089104A1 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Washington University | Method for detection of aggregates in biological samples |
| CN105142669B (en) | 2012-12-06 | 2018-07-03 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | Genomic modification and regulation and control based on CRISPR |
| EP2931899A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof |
| EP3144390B1 (en) | 2012-12-12 | 2020-03-18 | The Broad Institute, Inc. | Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation |
| CN105658796B (en) | 2012-12-12 | 2021-10-26 | 布罗德研究所有限公司 | CRISPR-CAS component systems, methods, and compositions for sequence manipulation |
| AU2013359199C1 (en) | 2012-12-12 | 2021-06-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| EP4282970A3 (en) | 2012-12-17 | 2024-01-17 | President and Fellows of Harvard College | Rna-guided human genome engineering |
| WO2014131833A1 (en) | 2013-02-27 | 2014-09-04 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases |
| CA2907198C (en) | 2013-03-15 | 2019-12-10 | The General Hospital Corporation | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing |
| CN115261411A (en) | 2013-04-04 | 2022-11-01 | 哈佛学院校长同事会 | Therapeutic uses of genome editing with CRISPR/Cas systems |
| US9267135B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-02-23 | President And Fellows Of Harvard College | RNA-guided transcriptional regulation |
| EP3725885A1 (en) | 2013-06-17 | 2020-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof |
| WO2015048577A2 (en) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Editas Medicine, Inc. | Crispr-related methods and compositions |
| WO2015065964A1 (en) | 2013-10-28 | 2015-05-07 | The Broad Institute Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof |
| EP3104870A4 (en) | 2014-02-14 | 2017-09-13 | Ipierian, Inc. | Tau peptides, anti-tau antibodies, and methods of use thereof |
| US20150376586A1 (en) | 2014-06-25 | 2015-12-31 | Caribou Biosciences, Inc. | RNA Modification to Engineer Cas9 Activity |
| CA2954791A1 (en) | 2014-07-14 | 2016-01-21 | The Regents Of The University Of California | Crispr/cas transcriptional modulation |
| WO2016049258A2 (en) | 2014-09-25 | 2016-03-31 | The Broad Institute Inc. | Functional screening with optimized functional crispr-cas systems |
| WO2016106236A1 (en) | 2014-12-23 | 2016-06-30 | The Broad Institute Inc. | Rna-targeting system |
| US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
| EP3325018A4 (en) | 2015-07-22 | 2019-04-24 | Duke University | High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies |
| DK3386550T3 (en) | 2015-12-07 | 2021-04-26 | Arc Bio Llc | Methods for preparing and using guide nucleic acids |
| US20190136231A1 (en) | 2016-03-30 | 2019-05-09 | Intellia Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components |
| WO2017172764A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | The Regents Of The University Of California | Modified cell line and method of determining tauopathies |
| CN118185874A (en) * | 2016-04-04 | 2024-06-14 | 苏黎世联邦理工学院 | Recombinant mammalian B cell |
| JP7217710B2 (en) | 2017-01-04 | 2023-02-03 | ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット | Antibodies specific for hyperphosphorylated tau for the treatment of eye diseases |
| GB201708998D0 (en) | 2017-06-06 | 2017-07-19 | Univ Leuven Kath | Methods for identifying activators and suppressors |
| US20200202981A1 (en) | 2017-07-07 | 2020-06-25 | The Broad Institute, Inc. | Methods for designing guide sequences for guided nucleases |
| CA3067872A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof |
| BR112020001996A2 (en) * | 2017-07-31 | 2020-08-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | non-human animal, and methods for testing and for optimizing the ability of a crispr / cas nuclease to excise a genomic nucleic acid in vivo, to test the crispr / cas-induced recombination of a genomic acid with an exogenous donor nucleic acid in vivo and to optimize the ability of crispr / cas to induce recombination of a genomic nucleic acid with an exogenous donor nucleic acid in vivo. |
| KR20240038811A (en) | 2018-03-19 | 2024-03-25 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems |
| CN113711046B (en) | 2019-03-18 | 2023-08-29 | 瑞泽恩制药公司 | CRISPR/Cas shedding screening platform for revealing gene vulnerability related to Tau aggregation |
| US11845931B2 (en) | 2019-03-18 | 2023-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | CRISPR/Cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation |
| KR20210145170A (en) | 2019-03-18 | 2021-12-01 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | Methods and systems for CRISPR selection |
| WO2020252340A1 (en) | 2019-06-14 | 2020-12-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Models of tauopathy |
-
2020
- 2020-03-17 CN CN202080028975.9A patent/CN113711046B/en active Active
- 2020-03-17 SG SG11202108090XA patent/SG11202108090XA/en unknown
- 2020-03-17 IL IL286359A patent/IL286359B2/en unknown
- 2020-03-17 WO PCT/US2020/023121 patent/WO2020190927A1/en unknown
- 2020-03-17 ES ES20718947T patent/ES2969026T3/en active Active
- 2020-03-17 US US16/821,384 patent/US11781131B2/en active Active
- 2020-03-17 CA CA3127814A patent/CA3127814C/en active Active
- 2020-03-17 AU AU2020241856A patent/AU2020241856B2/en active Active
- 2020-03-17 EP EP20718947.3A patent/EP3769090B1/en active Active
- 2020-03-17 JP JP2021556467A patent/JP7389135B2/en active Active
-
2023
- 2023-08-31 US US18/459,091 patent/US20230416728A1/en active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Elliott et al. | Molecular biology of RNA | |
| US11155795B2 (en) | CRISPR-Cas systems, crystal structure and uses thereof | |
| EP3320092B1 (en) | Engineered crispr-cas9 compositions and methods of use | |
| US11236327B2 (en) | Cell sorting | |
| US10465187B2 (en) | Integrated system for programmable DNA methylation | |
| Jing et al. | Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast and its repurposing for precise RNA editing | |
| JP2022127638A (en) | Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems | |
| SenGupta et al. | A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. | |
| Fournier et al. | The nucleolar snRNAs: catching up with the spliceosomal snRNAs | |
| AU2024201441A1 (en) | RNA-guided human genome engineering | |
| JP2021100410A (en) | Crystalline structure of crisprcpf1 | |
| CA3012607A1 (en) | Crispr enzymes and systems | |
| Krizek | AINTEGUMENTA utilizes a mode of DNA recognition distinct from that used by proteins containing a single AP2 domain | |
| Jády et al. | Human intron-encoded Alu RNAs are processed and packaged into Wdr79-associated nucleoplasmic box H/ACA RNPs | |
| Weidenfeld et al. | Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci | |
| CN104004098B (en) | A kind of carrier compositions and application that utilizes Wnt signal activated state in BiFC indicator cells | |
| Hesslein et al. | Exploration of the conserved A+ C wobble pair within the ribosomal peptidyl transferase center using affinity purified mutant ribosomes | |
| Saito et al. | Targeted Protein Depletion Using the Auxin‐Inducible Degron 2 (AID2) System | |
| JPWO2020190927A5 (en) | ||
| Burgos-Rivera et al. | An Arabidopsis tissue-specific RNAi method for studying genes essential to mitosis | |
| Clepet et al. | Improved full‐length cDNA production based on RNA tagging by T4 DNA ligase | |
| RU2021129022A (en) | CRISPR/CAS PLATFORM FOR EXCLUSIVE SCREENING TO IDENTIFY GENETIC VULNERABILITIES ASSOCIATED WITH TAU PROTEIN AGGREGATION | |
| JPWO2020190932A5 (en) | ||
| RU2024112968A (en) | CRISPR/CAS SCREENING PLATFORM FOR IDENTIFYING GENETIC MODIFIERS OF TAU PROTEIN SEEDING OR AGGREGATION | |
| Wilce et al. | RNA‐binding proteins that target the androgen receptor mRNA |