JPWO2020111279A1

JPWO2020111279A1 - カルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ

Info

Publication number: JPWO2020111279A1
Application number: JP2020557889A
Authority: JP
Inventors: 泰照浦野; 真子神谷; 優五栗木
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2021-10-14
Also published as: WO2020111279A1; US20220017940A1

Abstract

【解決課題】
新規のカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブを提供すること。
【解決手段】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。

Description

本発明は、新規なカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブに関する。

カルボキシペプチダーゼ（Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ＣＰ）は、ペプチド鎖のＣ末端側のアミノ酸残基を認識・切断する酵素群の総称であり、種々の疾患への関与が報告されているほか、細胞分化などの重要な生体機能に関わることが知られている。

これまでに開発・報告されているカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブとしては、ローダミンのスピロ環化平衡の制御を利用したカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブ（非特許文献１）がある。この蛍光プローブは、世界で初めてのカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブであり、カルボキシペプチダーゼＢの活性を検出することにより、動物モデルにおいて膵液漏出の検出に成功しており有用なプローブであるが、反応点を２点有するため、感度・定量に乏しく生細胞における活性の検出が難しいという問題がある。

また、アゾホルミル基の特徴的な反応性を利用したカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブも開発されており（特願２０１８−０３７７９１）、この蛍光プローブは、カルボキシペプチダーゼとの反応点が１点であり、３００倍以上の蛍光上昇を達成しており、また、がんバイオマーカーとして確立しているＰＳＭＡの活性を検出可能である等の利点がある。しかしながら、この蛍光プローブは、合成するのが煩雑であり、また、細胞内還元酵素によりアゾ基が還元される場合があるなどの問題点があった。

Kuriki, Kamiya, Urano et al. JACS, 2018, 140, 1767

本発明は、新規のカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブを提供することを目的とする。特に、本発明は、１箇所の反応点で大きな蛍光強度変化を示し、生きた細胞におけるカルボキシペプチダーゼ活性を高感度に可視化することが可能なカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブを提供することを目的とする。

本発明者らは、核酸モノリン酸化体を細胞内に導入するためのプロドラッグ技術であるProTide化学に着目し、この技術を応用して、１箇所の反応点で大きな蛍光強度変化を示すことが可能なカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブを開発するため鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。

（式中、
Ｒ^１は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｔは、アミノ酸残基又はアミノ酸誘導体の残基を表し；
Ｓは、Ｃ末端アミノ酸残基を表し；

は、蛍光団を表し、
前記蛍光団は、−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｒ^１）−Ｔ−Ｓの部位が脱離することにより、吸収・蛍光波長が大きく変化する、あるいは消光状態から蛍光状態に変化する蛍光団である。）
［２］［１］に記載の化合物又はその塩を含むカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブ。
［３］［２］に記載の蛍光プローブを含む、カルボキシペプチダーゼ検出用キット。
［４］カルボキシペプチダーゼの活性を検出する方法であって、
（ａ）［１］に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でカルボキシペプチダーゼと反応することにより発せられる蛍光を測定する工程
を含む方法。
［５］蛍光イメージング手段を用いて蛍光応答を可視化することを特徴とする、［４］に記載の検出方法。
を提供するものである。

本発明により、１箇所の反応点で大きな蛍光強度変化を示し、生きた細胞におけるカルボキシペプチダーゼ活性を高感度に可視化することが可能なカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブを提供することが可能である。また、本発明のプローブにより、ｅｘｖｉｖｏにおいてもカルボキシペプチダーゼ活性の検出が可能である。
本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブは、外科手術において微小がん部位を高感度に可視化・検出するシステムなどの構築を図るのに有用である。
また、本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブは、乳がんのイメージングにも有効に用いることが可能である。

本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブの分子設計を表す。化合物ＡとＣＰＡとの酵素アッセイの結果を示す。化合物ＢとＣＰＢとの酵素アッセイの結果を示す。化合物ＣとＣＰＢとの酵素アッセイの結果を示す。ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲとの酵素アッセイの結果を示す。ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを用いたＭＤＣＫ細胞中でのＣＰＭ活性のライブイメージングの結果を示す。１０μＭのＭＧＴＡの存在下又は不存在下において、２０μＭのＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲで培養したＭＤＣＫ細胞の培地のＵＰＬＣ分析の結果を示す。４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＡＥとＰＳＭＡを用いた酵素アッセイの結果を示す。４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＧＥとＰＳＭＡを用いた酵素アッセイの結果を示す。ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを用いた乳がん患者由来の検体４例についての蛍光イメージングの結果を示す。

本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。

本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。

本発明の１つの態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。

本発明者らは、核酸モノリン酸化体を細胞内に導入するためのプロドラッグ技術であるProTide化学に着目し、この技術を応用してカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブを開発した。細胞内におけるProTideの活性化メカニズムは長年検討されており、現在では以下の過程を経て目的の核酸誘導体のモノリン酸化体が放出されると考えられている。即ち、（１）Cathepsin A、カルボキシエステラーゼなどの細胞内エステラーゼによるエステルの加水分解、（２）生じたカルボキシレートのリンへの求核攻撃による分子内環化反応とそれに伴うアリールオキシ基の脱離、（３）分子内環化により生成した五員環構造の加水分解、（４）phosphoramidaseタイプの酵素による代謝、の４段階を経て目的のヌクレオチドが放出されるというメカニズムである。

本発明では、この活性化における第一段階と第二段階に着目した。即ちProTideは細胞内エステラーゼをトリガーとしてカルボキシレートを生成し、分子内環化反応によってフェノール誘導体を放出するが、このトリガーをカルボキシペプチダーゼへと変更し、分子内環化反応によって蛍光団が放出されるようプローブを設計することでカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブを開発した（図１参照)。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^１は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。Ｒ^１としては、好ましくは、炭素数１〜６のアルキル基であり、特に好ましくは、ｔ−ブチル基、イソプロピル基である。Ｒ^１として、ｔ−ブチル基等のこれら立体障害の大きい基をリン原子上に導入することにより、非酵素的な加水分解、例えば水分子のリン酸基への求核攻撃等を抑制することができる。

一般式（Ｉ）において、Ｔは−ＮＨ−ＣＲＲ’−Ｃ（＝Ｏ）−構造を有する部位であり、一般的なα−アミノ酸残基（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、システイン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、プロリン）や、その誘導体（Ｎ−メチルロイシン、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノ酪酸、オルニチン、α−ヒドロキシロイシン等）の残基が挙げられる。アミノ酸残基、その誘導体とも、Ｌ体アミノ酸及びＤ体アミノ酸の残基のいずれであってもよい。
アミノ酸残基として、好ましくは、グリシン、アラニンである。

本発明の１つの側面において、Ｔは以下の式（１）で表される。

式（１）において、Ｒ^２は、水素、メチル基等の、天然アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、システイン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、プロリン）の側鎖を構成する基を表す。また、Ｒ^２には、天然アミノ酸の側鎖を構成する基以外の基、例えば、種々の置換基を有するアルキル基なども含まれる。
式（１）のＮＨがＰと結合する。

一般式（Ｉ）において、Ｓは、Ｃ末端アミノ酸残基を表す。Ｓのアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、システイン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、プロリンの残基から選択される。また、ＳのＣ末端アミノ酸残基の種類はカルボキシペプチダーゼの種類に応じて選択され、例えば、フェニルアラニン、アルギニン、グルタミン酸である。
Ｓのアミノ酸残基としては、Ｌ体アミノ酸、Ｄ体アミノ酸の残基のいずれであってもよい。

本発明の１つの側面において、Ｓは、以下の式（２）で表される、

式（２）において、Ｒ^３は、水素、メチル基等の、天然アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、システイン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、プロリン）の側鎖を構成する基を表す。

一般式（Ｉ）において、

は、蛍光団を表す。

本発明に用いることができる蛍光団は、本発明の化合物又はその塩がカルボキシペプチダーゼと反応すると、吸収・蛍光波長が大きく変化する、あるいは消光状態から蛍光状態に変化する蛍光団である。具体的には、本発明における蛍光団は、カルボキシペプチダーゼによる酵素反応によって、−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｒ^１）−Ｔ−Ｓ部位が脱離することで、吸収波長が大きく変化する、蛍光発光波長が大きく変化する、あるいは消光状態から蛍光状態に変化する蛍光団であり、このような特性を有する蛍光団であれば特に限定されずに使用することができる。
このような蛍光団としては、以下の式（３）〜（５）で表される吸収・蛍光波長変化型の蛍光団、式（６）で表される蛍光強度変化型の蛍光団が挙げられる。

本発明の１つの側面において、一般式（Ｉ）の蛍光団は以下の式（３）で表される吸収・蛍光波長変化型の蛍光団である。

式（３）において、Ｒ_１は、水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示す。
また、式（３）において、Ｒ₂は、水素、カルボキシル基又はエステル基（−ＣＯＯＲ：Ｒは、炭素数１〜６のアルキル基を表す）を示す。
式（３）において、＊は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｒ^１）−Ｔ−Ｓと結合する部位を表す

本発明の１つの側面において、式（３）で表される蛍光団の非限定的な１つの例は以下の式で表される４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）である。

本発明の１つの側面において、一般式（Ｉ）の蛍光団は以下の式（４）で表される吸収・蛍光波長変化型の蛍光団である。

式（４）において、Ｒ_１は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシル基又はカルボキシル基を表す。

式（４）において、Ｒ_２は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。一価の置換基としては、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシル基、カルボキシル基等が挙げられる。
ｍは、０〜４の整数である。ｍが２以上の場合は、各々のＲ_２は同じであっても異なっていてもよい。

式（４）において、Ｙは、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。

式（４）において、Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ_３及びＲ_４がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ_３及びＲ_４が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ_３又はＲ_４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ_３又はＲ_４がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。

式（４）において、Ｘは、酸素原子又はＮＲ（Ｒは、水素原子又は炭素数１〜６の置換または無置換のアルキル基を表し、例えば、フッ化アルキル基（例えば、−ＣＨ_２−ＣＦ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＦ_３）が挙げられる。）である。

式（４）において、＊は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｒ^１）−Ｔ−Ｓと結合する部位を表す。

また、本発明の１つの側面において、一般式（Ｉ）の蛍光団は以下の式（５）で表される吸収・蛍光波長変化型の蛍光団である。

式（５）において、Ｒ_１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。一価の置換基としては、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシル基又はカルボキシル基等が挙げられる。

ｍは、０〜４の整数である。ｍが２以上の場合は、各々のＲ_２は同じであっても異なっていてもよい。
本発明の１つの好ましい側面において、ｍは０である。

式（５）において、Ｒ_２及びＲ_３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ_２及びＲ_３がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ_２又はＲ_３が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ_２及びＲ_３がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましい。Ｒ_２及びＲ_３がハロゲン原子である場合は、Ｒ_２及びＲ_３がともにフッ素原子であるか、塩素原子である場合がより好ましい。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ_２及びＲ_３は水素原子である。

式（５）において、Ｒ_４及びＲ_５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し、Ｒ_２及びＲ_３について説明したものと同様である。Ｒ_４及びＲ_５が共に水素原子であることが好ましい。

式（５）において、Ｒ_６は、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＯＨ又はＯＲ’’から選択される。Ｒ、Ｒ’は、それぞれ独立に、炭素数１〜５個のアルキル基、又は炭素数１〜５個のフッ化アルキル基を示す。また、Ｒ’’は、炭素数１〜５個のアルキル基を示す。ここで、アルキル基としては、メチル基、エチル基が好ましい。また、フッ化アルキル基としては、−ＣＨ_２−ＣＦ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＦ_３が好ましい。

式（５）において、Ｒ_７及びＲ_８は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ_７及びＲ_８は、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ_７及びＲ_８がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ_７及びＲ_８が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などの置換基が１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ_７又はＲ_８が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ_７又はＲ_８がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。

また、後述するＹが酸素原子の場合は、Ｒ_７及びＲ_８は存在しない。
また、後述するＹがリン原子の場合は、Ｒ_７、Ｒ_８のいずれか一方は、＝Ｏである。

式（５）において、Ｘは、酸素原子又はＮＲaを表す。ここで、Ｒａは、水素原子又は炭素数１〜５個のアルキル基を表す。

Ｙは、酸素原子、珪素原子、炭素原子又はリン原子を示す。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｙは酸素原子である。

ｎは、１〜３の整数であり、好ましくは、ｎは１である。

式（５）において、＊は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｒ^１）−Ｔ−Ｓと結合する部位を表す。

また、本発明の１つの側面において、一般式（Ｉ）の蛍光団は以下の式（６）で表される蛍光強度変化型の蛍光団である。

式（６）において、Ｒ_１は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシル基又はカルボキシル基を表す。

式（６）において、Ｒ_２は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。一価の置換基としては、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシル基、カルボキシル基等が挙げられる。
ｍは、０〜４の整数である。ｍが２以上の場合は、各々のＲ_２は同じであっても異なっていてもよい。
本発明の１つの好ましい側面において、ｍは０である。

式（６）において、Ｙは、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。

式（６）において、Ｘは、酸素原子又はＮＲ（Ｒは、水素原子又は炭素数１〜６の置換または無置換のアルキル基を表し、例えば、フッ化アルキル基（例えば、−ＣＨ_２−ＣＦ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＦ_３）が挙げられる。）である。

式（６）において、＊は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｒ^１）−Ｔ−Ｓと結合する部位を表す。

本発明の１つの態様は、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩である。

一般式（ＩＩ）におけるＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及び

は、一般式（Ｉ）で説明したのと同様である。

本発明の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。

本発明の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。

本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物を製造することができる。

本発明の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される本発明の化合物は、カルボキシペプチダーゼ活性を検出する蛍光プローブとして有用である。
即ち、本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、細胞内のカルボキシペプチダーゼ活性を検出する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でカルボキシペプチダーゼと反応することにより発せられる蛍光を測定する工程を含む方法、である。
一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、カルボキシペプチダーゼのない環境において実質的に無蛍光であるか、弱い蛍光のみを有するが、カルボキシペプチダーゼのある環境において強い蛍光を発する特徴を有する。

本発明の方法は、さらに蛍光イメージング手段を用いて蛍光応答を観測することを含むことができる。蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、カルボキシペプチダーゼを瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。なお、場合によって、紫外可視吸光スペクトルの変化（例えば、特定の吸収波長における吸光度の変化）によって上記測定対象試料と蛍光プローブの反応を検出することも可能である。

本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。

本発明の蛍光プローブが検出することができるカルボキシペプチダーゼとしては、種々のカルボキシペプチダーゼ、例えば、カルボキシペプチダーゼＡ，カルボキシペプチダーゼＢ，カルボキシペプチダーゼＭ, Prostate specific membrane antigen (PSMA)等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

上記工程（ａ）における測定対象である細胞の試料は、カルボキシペプチダーゼを発現している細胞であることができるが、かかる細胞がカルボキシペプチダーゼを発現しているがん細胞やがん組織である場合には、本発明の検出方法によって、がん細胞やがん組織を検出又は可視化することができる。すなわち、本発明の蛍光プローブ、当該蛍光プローブを含む組成物、及び本発明の検出方法は、がんの診断に用いることもできる。

本明細書において、「がん組織」の用語はがん細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は臓器の一部又は全体を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。がん組織としてはカルボキシペプチダーゼを高発現している組織が好ましい。また、本明細書において「診断」の用語は任意の生体部位においてがん組織の存在を肉眼的又は顕微鏡下に確認することを含めて最も広義に解釈する必要がある。
本発明の検出方法の１つの好ましい側面においては、上記工程（ａ）における測定対象である細胞の試料は、がん細胞であり、好ましくは乳がん細胞である。

本発明の検出方法においては、上記蛍光プローブを含むカルボキシペプチダーゼ検出用キットを用いることが好ましい。当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。

また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

［原料］
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）から購入した。さらに精製することなく使用した。

［測定機器］
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、JEOL JNM-LA400［¹H 400 MHz, ¹³C 100 MHz］もしくはＢｒｕｋｅｒＮＭＲＡＶＡＮＣＥＩＩＩ４００分光計［31P（162ＭＨｚ）］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、JEOL JMS-T100LC AccuToF (ESI)で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ−ＯＤＳ−３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯＰＵ−２０８０Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅＣｏ．、Ｌｔｄ．）およびMD-2015検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０Ｎ（球状、中性、６３〜２１０μｍ；関東化学株式会社製）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、ＳｈｉｍａｄｚｕＵＶ−１８００分光光度計で得た。
蛍光スペクトルは、F-7100 (日立)で取得した。

［合成実施例１］
蛍光団として青色蛍光を有する４−ＭＵ、一般式（Ｉ）におけるＴとしてアラニン残基、Ｒ^１としてエトキシ基、Ｓとしてフェニルアラニン残基およびアルギニン残基を夫々有する化合物Ａ、Ｂの合成を行った。尚、化合物ＡとＢをはじめとして本分子設計においてはジアステレオマーが存在するが、それらの単離は行わず混合物を用いて評価を行った。
合成は、以下のスキーム１により、エチルジクロロホスフェート（１）に対して４−ＭＵ、別途調整したジペプチド（２、３）を順次縮合させ、その後の酸性条件での保護基の除去を行うことで目的化合物を得た。

スキーム１

(a) 1) HATU, DIEA, DMF, 2) Piperidine, DMF, y. 85 % in 2 steps. (b) 1) 1) HATU, DIEA, DMF, 2) Piperidine, DMF, y. 71 % in 2 steps. (c) 4-MU, TEA, THF, (d) 1) H-Ala-Phe-OtBu, TEA, THF, 2) TFA, MeCN, y. 8.4 % in 3 steps, diastereomer mixture (e) 1) H-Ala-Arg(Pbf)-OtBu, TEA, THF, 2) TFA, MeCN, y. 17 % in 3 steps, diastereomer mixture

化合物２の合成

Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（６２２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ塩酸塩（５１５ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０３２μＬ、５．９２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、ＨＡＴＵ（８３７ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を加えて室温にて一晩攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド８ｍＬに溶解し、ピペリジン２ｍＬを加えて室温にて一晩攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２→２／１）、化合物２（４９８ｍｇ、８５％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1.25 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.41 (s, 9H), 3.21-2.99 (m, 2H), 3.46 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 4.82-4.64 (m, 1H), 7.19-7.13 (m, 2H), 7.36-7.19 (m, 3H), 7.65 (d, J = 7.8 Hz, 1H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 21.7, 28.0, 38.3, 50.8, 53.1, 82.2, 126.9, 128.3, 129.6, 136.4, 170.9, 175.3
HRMS (ESI⁺): calcd for [M+H]⁺, 293.18652 ; found, 293.18572 (-0.89 mmu)

化合物３の合成

Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（５９５ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯｔＢｕ塩酸塩（９９２ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９８６μＬ、５．７３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１５ｍＬに溶解し、ＨＡＴＵ（７９９ｍｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を加えて室温にて１時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド８ｍＬに溶解し、ピペリジン２ｍＬを加えて室温にて９０分攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（ジクロロメタン→ジクロロメタン／メタノール＝９５／５）、化合物３（７４５ｍｇ、７１％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 1.25 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.45 (s, 6H), 1.49-1.61 (m, 2H), 1.61-1.72 (m, 1H), 1.72-1.96 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 2.57 (s, 3H), 2.99 (s, 2H), 3.07-3.25 (m, 2H), 3.45 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.23 (dd, J = 5.0 , 8.2 Hz, 1H)
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 11.2, 17.1, 18.3, 20.3, 25.6, 26.9, 27.4, 28.6, 40.2, 42.6, 49.9, 52.7, 81.6, 86.3, 117.1, 124.7, 132.1, 133.1, 138.0, 156.7, 158.5, 171.2, 177.1
HRMS (ESI⁺): calcd for [M+H]⁺, 554.30123 ; found, 554.30128 (0.05 mmu)

化合物Ａの合成

エチルホスホロジクロリダート（２１μＬ、０．１７１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１．５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下、−７８°Ｃにて１０分攪拌した。テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した４−メチルウンベリフェロン（３１ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４７μＬ、０．３４２ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、室温まで昇温し、アルゴン雰囲気下で２時間攪拌した。反応溶液を再び−７８°Ｃにて１０分間攪拌した後、テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した化合物２（１００ｍｇ、０．３４２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９４μＬ、０．６８４ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、室温まで昇温し、アルゴン雰囲気下で一晩攪拌した。水を加えて反応を停止した後、ジクロロメタン、酢酸エチルを用いて水層を抽出し、有機層を合わせたものを、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣をアセトニトリル１ｍＬに溶解させた後、トリフルオロ酢酸３ｍＬを加えて２時間室温で攪拌した。溶媒を減圧除去して得た残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＡ（Ｈ_２Ｏ０．１％ＴＦＡ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＢ（ＣＨ_３ＣＮ８０％、Ｈ_２Ｏ２０％、０．１％ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））で精製して目的化合物（７．２ｍｇ、８．４％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.26-1.03 (m, 6H), 2.41 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 2.95-2.76 (m, 1H), 3.14-2.95 (m, 1H), 3.84-3.65 (m, 1H), 4.11-3.84 (m, 2H), 4.53-4.30 (m, 1H), 5.90-5.66 (m, 1H), 6.34 (s, 1H), 7.32-7.03 (m, 7H), 7.73 (dd, J = 11.9, 8.7 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 7.8 Hz, 1H)
¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 16.4 (d, J = 6.7 Hz), 16.5 (d, J = 6.7 Hz), 18.7, 21.1, 21.2, 21.3, 37.2, 50.8 (d, J = 4.8 Hz), 53.7, 53.8, 63.0 (d, J = 4.8 Hz), 63.1 (d, J = 5.7 Hz), 108.3 (d, J = 5.7 Hz), 108.5 (d, J = 4.8 Hz), 113.6, 116.8 (containing 2 peaks), 117.0 (d, J = 4.8 Hz), 117.2 (d, J = 5.7 Hz), 126.9, 127.0, 127.2, 128.6, 128.7, 129.6, 137.8, 153.5, 153.9 (d, J = 5.8 Hz), 154.0 (d, J = 6.7 Hz), 154.2, 154.3, 160.2, 173.2 (containing 2 peaks)
³¹P NMR (162 MHz, DMSO-d6): δ 3.55, 3.89
HRMS (ESI⁺): calcd for [M+H]⁺, 503.15833 ; found, 503.15702 (-1.31 mmu)
The UPLC (eluent; A/B = 95/5 to 5/95 in 4 min) chromatogram after purification is shown. Absorbance at 310 nm was detected. Eluent A (H2O containing 0.1 % formic acid) and eluent B (80 % acetonitrile and 20 % H2O containing 0.1 % formic acid) were used for UPLC analysis.

化合物Ｂの合成

エチルホスホロジクロリダート（２１μＬ、０．１７１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１．５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下、−７８°Ｃにて１０分攪拌した。テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した４−メチルウンベリフェロン（３１ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４７μＬ、０．３４２ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、室温まで昇温し、アルゴン雰囲気下で２時間攪拌した。反応溶液を再び−７８°Ｃにて１０分間攪拌した後、テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した化合物３（１８９ｍｇ、０．３４１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９４μＬ、０．６８４ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、室温まで昇温し、アルゴン雰囲気下で一晩攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタン、酢酸エチルを用いて水層を抽出し、有機層を合わせたものを、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル→酢酸エチル／メタノール＝９７／３）にて一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣にトリフルオロ酢酸３ｍＬを加えて１時間室温で攪拌した。溶媒を減圧除去して得た残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＡ（Ｈ_２Ｏ０．１％ＴＦＡ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＢ（ＣＨ_３ＣＮ８０％、Ｈ_２Ｏ２０％、０．１％ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））で一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＣ（Ｈ_２Ｏｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１００ｍＭｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＤ（８０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅａｎｄ２０％Ｈ_２Ｏｃｏｎｔａｉｎｇ１００ｍＭｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）（Ｃ／Ｄ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））で一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣を再度ＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＡ（Ｈ_２Ｏ０．１％ＴＦＡ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＢ（ＣＨ_３ＣＮ８０％、Ｈ_２Ｏ２０％、０．１％ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））で生成し、目的化合物（１８ｍｇ、１７％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6+D₂O): δ 1.09-1.24 (m, 6H), 1.32-1.47 (m, 2H), 1.47-1.62 (m, 1H), 1.62-1.78 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.92-3.12 (m, 2H), 3.71-3.82 (m, 1H), 4.07-4.22 (m, 1H), 6.29 (s, 1H), 7.06-7.25 (m, 2H), 7.40-7.57 (m, 1H), 7.64-7.81 (m, 1H), 8.09 (d, J = 7.8 Hz, 1H)
¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 16.4, 16.5 (containing 2 peaks), 18.7, 21.2, 21.3, 25.5, 25.6, 28.8, 40.8, 50.7 (containing 2 peaks), 52.0, 63.1 (containing 2 peaks), 63.2, 108.3 (d, J = 4.8 Hz), 108.5 (d, J = 4.8 Hz), 113.6, 116.8, 116.9, 117.1 (d, J = 5.8 Hz), 117.3 (d, J = 5.8 Hz), 127.1, 127.2, 153.6, 154.0 (d, J = 6.7 Hz), 154.2, 154.3, 157.2, 160.3, 173.4, 173.5 (containing 2 peaks), 173.7 (containing 2 peaks)
³¹P NMR (162 MHz, DMSO-d6): δ 3.62, 4.00
HRMS (ESI⁺): calcd for [M+H]⁺, 512.19102 ; found, 512.19088 (-0.15 mmu)
The UPLC (eluent; A/B = 95/5 to 5/95 in 4 min) chromatogram after purification is shown. Absorbance at 310 nm was detected. Eluent A (H₂O containing 0.1 % formic acid) and eluent B (80 % acetonitrile and 20 % H₂O containing 0.1 % formic acid) were used for UPLC analysis.

［実施例１］
合成した化合物Ａ、Ｂを用いた酵素アッセイを行った。結果として、化合物Ａ及びＢはそれぞれの標的酵素であるカルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）とインキュベーションすることで蛍光が上昇し、その蛍光上昇はそれぞれの阻害剤である（Ｓ）−ｂｅｎｚｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃａｃｉｄおよびＭＧＴＡの添加によって抑制された。また、化合物Ａの酵素アッセイにおいてはｐｒｏＣＰＡの活性化のためにトリプシンが共存しているためトリプシンのみを添加した条件も検討したが、顕著な蛍光上昇は見られなかった。一方で、わずかではあるか酵素非存在下においても徐々に蛍光が上昇してきており、本プローブは非酵素的な分解反応を受けることが明らかとなった（図２、図３）。
図２の（ａ）は、化合物ＡとＣＰＡの反応スキームを示す。図２の（ｂ）では、ＰＢＳ（−）中１０μＭの化合物Ａを、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含む１００μＭ阻害剤（（Ｓ）−ベンジルコハク酸）の存在下または非存在下で、１．５μｇトリプシンによって活性化した５ｎｇＣＰＡと３７℃でインキュベートした。Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５／４６０ｎｍ。ｎ＝４。（図２中、Ｔｒｙはトリプシンを、ＳＢＳＡは（Ｓ）−ベンジルコハク酸を表す。）
図３の（ａ）は、化合物ＢとＣＰＢの反応スキームを示す。図３の（ｂ）では、ＰＢＳ（−）中１０μＭの化合物Ｂを、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含む１００μＭ阻害剤（ＭＧＴＡ）の存在下または非存在下で５ｎｇＣＰＢと３７℃でインキュベートした。Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５／４６０ｎｍ。ｎ＝４。

上記の結果は、ProTide chemistyを利用した本分子設計が新たなカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブとして機能することを示すものである。一方、双方のプローブにおいて非酵素的な分解反応が見られ、実用的なプローブの開発のためには水溶液中での安定性を向上させる必要があることが明らかとなった。

プローブの非酵素的な分解反応の機構としては、溶媒水分子のリン原子への求核攻撃による加水分解が考えられる。これを防ぐためのプローブの改良として、リン原子上の置換基を嵩高いものへと変更することで立体障害による安定性の向上を検討した。

［合成実施例２］
次に、リン原子上の置換基として新たにｔＢｕ基を導入し、一般式（Ｉ）のＳのアミノ酸としてアルギニンを有する化合物Ｃの合成を以下のスキームにより行った。

スキーム２

(a) 1) 4-MU, TEA, THF, 2) H-Ala-Arg(Pbf)-OtBu, TEA, THF, 3) TFA, MeCN, 14 % in 3 steps (diastereomer mixture).

化合物Ｃの合成

ｔｅｒｔ−ブチルホスホン酸ジクロリド（３０ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下、−７８°Ｃにて１０分攪拌した。テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した４−メチルウンベリフェロン（３１ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４７μＬ、０．３４２ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、室温まで昇温し、アルゴン雰囲気下で３時間攪拌した。反応溶液を再び−７８°Ｃにて１０分間攪拌した後、テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した化合物３（１８９ｍｇ、０．３４１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９４μＬ、０．６８４ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、室温まで昇温し、アルゴン雰囲気下で一晩攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタン、酢酸エチルを用いて水層を抽出し、有機層を合わせたものを、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル→酢酸エチル／メタノール＝９７／３）にて一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣をアセトニトリル２ｍＬに溶解し、トリフルオロ酢酸８ｍＬを加えて１時間室温で攪拌した。溶媒を減圧除去して得た残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＡ（Ｈ_２Ｏ０．１％ＴＦＡ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＢ（ＣＨ_３ＣＮ８０％、Ｈ_２Ｏ２０％、０．１％ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））で精製し、化合物Ｃ（１５ｍｇ、１４％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 1.15 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 1.24-1.38 (m, 10H), 1.51-1.78 (m, 3H), 1.78-1.98 (m, 1H), 2.40-2.56 (m, 3H), 3.06-3.24 (m, 2H), 3.91-4.11 (m, 1H), 4.25 (q, J = 4.4 Hz, 0.37H), 4.39 (q, J = 4.6 Hz, 0.63H), 6.30 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.12-7.22 (m, 0.37H), 7.22-7.29 (m, 1.63H), 7.76 (d, J = 8.7 Hz, 0.37H), 7.80 (d, J = 8.2 Hz, 0.63H) (diastereomer mixture, dr = 63 : 37 judged from ¹H NMR)
¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 18.7, 21.6 (d, J = 5.8 Hz), 22.0 (d, J = 2.9 Hz), 24.7, 24.8, 25.5, 25.6, 28.7, 32.8 (d, J = 132.2 Hz), 32.9 (d, J = 132.2 Hz), 40.8, 50.3, 50.5, 51.9, 52.0, 108.8 (d, J = 4.8 Hz), 109.3 (d, J = 3.7 Hz), 113.4, 113.5, 116.5, 116.6, 117.7 (d, J = 3.8 Hz), 118.3 (d, J = 3.8 Hz), 126.8 (containing 2 peaks), 153.6, 153.7, 154.0, 154.1, 154.2, 154.3, 154.4, 157.3, 160.3, 160.4, 173.6, 173.7, 174.0 (d, J = 1.6 Hz), 174.1 (d, J = 4.8 Hz),
³¹P NMR (162 MHz, DMSO-d6): δ 39.5, 40.3
HRMS (ESI⁺): calcd for [M+H]⁺, 524.22741 ; found, 524.22696 (-0.45 mmu)
The UPLC (eluent; A/B = 95/5 to 5/95 in 4 min) chromatogram after purification is shown. Absorbance at 310 nm was detected. Eluent A (H₂O containing 0.1 % formic acid) and eluent B (80 % acetonitrile and 20 % H₂O containing 0.1 % formic acid) were used for UPLC analysis.

［実施例２］
合成した化合物ＣとＣＰＢを用いて酵素アッセイを行った。結果として化合物ＣはＣＰＢの基質となり蛍光上昇を示した一方、化合物Ｂと比較すると酵素非存在下では蛍光の上昇が見られず、生理的条件であるｐＨ７．４において安定であることが明らかとなった（図４）。
図４の（ａ）は、化合物ＣとＣＰＢの反応スキームを示す。図４の（ｂ）では、ＰＢＳ（−）中１０μＭの化合物Ｃを、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含む５ｎｇＣＰＢの存在下または非存在下、３７℃でインキュベートした。Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５／４６０ｎｍ。ｎ＝４。図４の（ｃ）は、化合物Ａと化合物Ｃの安定性の比較を示す。ＰＢＳ（−）中１０μＭの化合物Ａまたは化合物Ｃを、ＣＰＢの非存在下で、３７℃でインキュベートした。Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５／４６０ｎｍ。ｎ＝４。

これらの結果からＰｒｏＴｉｄｅを基に設計した本分子設計において、リン原子上の置換基としてｔ−Ｂｕ基を有する誘導体は生理的条件であるｐＨ７．４において安定であり、かつカルボキシペプチダーゼとの反応によって蛍光増大を引き起こすことが可能であった。本分子におけるリンカー部位をｔＳｏｕｌ（ｔＢｕＳｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｌｉｎｋｅｒ）と命名すると、化合物Ｃである４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲはＣＰＢ活性を検出する青色プローブであると言える。
一方、生細胞や臨床検体におけるカルボキシペプチダーゼのライブイメージングを行う上では、細胞毒性・自家蛍光の観点から蛍光波長を長波長化させることが望ましい。そこで次に、蛍光団として緑色蛍光を有し、フェノール性水酸基の保護・脱保護反応を、スピロ環化平衡の変化を介して蛍光のＯＦＦ／ＯＮに繋げられることが報告されているＨＭＲｅｆを有する新たなプローブＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲの合成を以下のスキームにより行った。尚、ＨＭＲｅｆは文献（D. Asanuma, M. Sakabe, M. Kamiya, K. Yamamoto, J. Hiratake, M. Ogawa, N. Kosaka, P.L. Choyke, T. Nagano, H. Kobayashi, Y. Urano, Nat. Commun., 2015, 6, 6463.）に従って合成した。

スキーム３

(a) 1) HMRef, TEA, THF, 2) H-Ala-Arg(Pbf)-OtBu, TEA, THF, 3) TFA, MeCN, 1.7 % in 3 steps (diastereomer mixture).

［合成実施例３］
ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲの合成

ｔｅｒｔ−ブチルホスホン酸ジクロリド（３０ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下、−７８°Ｃにて１０分攪拌した。テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解したＨＭＲｅｆ（６８ｍｇ、０．１７０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４７μＬ、０．３４２ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した後、３５°Ｃまで昇温し、アルゴン雰囲気下で４時間攪拌した。反応溶液を再び−７８°Ｃにて１０分間攪拌した後、テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した化合物３（１８８ｍｇ、０．３３４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９４μＬ、０．６８４ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、６０°Ｃまで昇温し、アルゴン雰囲気下で一晩攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した後、酢酸エチルを用いて水層を抽出した。有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、溶媒を減圧除去した後、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン→ジクロロメタン／メタノール＝９３／７）にて一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣にトリフルオロ酢酸２ｍＬを加えて２時間室温で攪拌した。減圧除去によって溶媒を除き、ＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＡ（Ｈ_２Ｏ０．１％ＴＦＡ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＢ（ＣＨ_３ＣＮ８０％、Ｈ_２Ｏ２０％、０．１％ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））で一部精製し、目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＣ（Ｈ_２Ｏｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１００ｍＭｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＤ（８０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅａｎｄ２０％Ｈ_２Ｏｃｏｎｔａｉｎｇ１００ｍＭｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）（Ｃ／Ｄ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））で一部精製し、目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＥ（Ｈ_２Ｏ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＦ（８０％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅａｎｄ２０％Ｈ_２Ｏ）（Ｅ／Ｆ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））により精製し、目的化合物ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲ（２．２ｍｇ、１．７％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 1.07 (dd, J = 7.3, 9.1 Hz, 1H), 1.19-1.33 (m, 11H), 1.33-1.87 (m, 4H), 2.79-2.95 (m, 1.3H), 3.08-3.18 (m, 0.7H), 3.82 (q, J = 9.1 Hz, 2H), 3.88-3.99 (m, 1H), 4.07-4.22 (m, 1H), 5.21-5.29 (m, 2H), 6.44 (dd, J = 2.3, 8.7 Hz, 1H), 6.48-6.55 (m, 1H), 6.66-6.73 (m, 1H), 6.78 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.84-6.94 (m, 2H), 7.05-7.13 (m, 1H), 7.21-7.31 (m, 1H), 7.33-7.44 (m, 2H) (diastereomer mixture)
HRMS (ESI⁺): calcd for [M]⁺, 747.28829 ; found, 747.28597 (-2.33 mmu)
The UPLC (eluent; C/D = 95/5 to 5/95 in 4 min) chromatogram after purification is shown. Absorbance at 254 nm was detected. Eluent C (H₂O containing 10 mM ammonium formate) and eluent D (80 % acetonitrile and 20 % H₂O containing 10 mM ammonium formate) were used for UPLC analysis.

［実施例３］
次に、ＣＰＢとの反応性およびｐＨ７．４の緩衝液中での安定性の検討を行った。結果として、ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲはＣＰＢとの反応によって３３２０倍もの蛍光増大を引き起こす一方、酵素非存在下では少なくとも１時間程度は安定であることが明らかとなった。その結果を図５に示す。
図５の（ａ）は、ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲとＣＰＢの反応スキームを示す。図５の（ｂ）は、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含む３０μｇＣＰＢとインキュベートしたＰＢＳ（−）中の１μＭＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲの蛍光増加を示す。２５℃でインキュベートした。励起波長は４９８ｎｍであった。図５の（ｃ）は、ＰＢＳ（−）中の１μＭＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲの２５℃で５０分間の吸収変化を示す。

また、酵素反応速度パラメータの算出を行った。尚、これまでの検討ではＣＰＢとの反応を行ってきたが、ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲはＣＰＢ同様塩基性アミノ酸を基質して好むカルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）の基質となることも明らかとなったため、双方の酵素に関してパラメータの算出を行った。今回のプローブはバックグラウンドシグナルが十分に抑えられているため、高濃度のプローブを用いても蛍光法により初速度の算出が可能であると判断し、測定を行った。

全ての実験は、共溶媒としてＤＭＳＯを含有する全容量２０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中３７℃で行った。５ｎｇのＣＰＢ又はＣＰＭを添加した。酵素反応初速度をプレートリーダーを用いて５３５ｎｍでの蛍光変化から計算した（ｎ＝３）。励起波長は４８５ｎｍであった。

ＣＰＢとの反応性を第一世代プローブであるｄｉＣｌＨＭＲＢＣ−ＣＯＮＨ−Ａｒｇと比較すると、ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲではｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍの値が１オーダー程度上昇しており、酵素との反応性の上昇が見られた。これらの結果から、酵素との反応性およびＳ／Ｎの向上によりプローブの高感度化が達成できたと判断し、ｄｉＣｌＨＭＲＢＣ−ＣＯＮＨ−Ａｒｇでは達成できなかった生細胞におけるカルボキシペプチダーゼ活性のライブイメージングを行うこととした。

［実施例４］
生細胞におけるカルボキシペプチダーゼ活性のライブイメージング
上記で合成したＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを用いて、生細胞におけるカルボキシペプチダーゼ活性のライブイメージングを行った。具体的には、ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを基質とすることが明らかとなったＣＰＭを発現するＭＤＣＫ細胞にプローブを添加することで蛍光の上昇が見られるか否かを検討した。尚、ＣＰＭはＣＰＢとは異なり活性型として細胞膜上に発現することが報告されているため、トリプシンなどの添加は不要である。
その結果、ＭＤＣＫ細胞からの経時的な蛍光上昇が観測された一方、その蛍光上昇は阻害剤であるＭＧＴＡの添加によって完全に抑制されることが明らかとなった（図６）。
ここで、図６の（ａ）、（ｂ）は、１０μＭＭＧＴＡの存在下（ａ）又は非存在（ｂ）での、ＨＢＳＳに１０μＭＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを含むＭＤＣＫ細胞の蛍光画像を示す。Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８／５００−５５０ｎｍレーザー出力５％、ＰＭＴ６００Ｖ。１０μＭＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を焦点面の補正のために共インキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ信号のイメージングでは、Ｅｘ／Ｅｍ＝４０５／４３０−４６０ｎｍ。レーザー出力３％、ＰＭＴ１０００Ｖ、ＳＰ８。
また、２０μＭのＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを２０時間インキュベーションした後の外液を回収しＵＰＬＣで分析したところ、確かにＨＭＲｅｆが生成していることが確かめられた（図７）。
ここで、図７は、１０μＭＭＧＴＡの存在下または非存在下で２０μＭＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲとインキュベートしたＭＤＣＫ細胞の培地のＵＰＬＣ分析の結果を示す。ＭＤＣＫ細胞を、１０μＭＭＧＴＡの存在下または非存在下、３７°Ｃで２０時間、ＨＢＳＳ中の２０μＭＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲとインキュベートした。溶出は、Ｃ／Ｄ＝９５／５〜５／９５の線形勾配で４分で行い、２５４ｎｍで検出した。
これらの結果は、生細胞におけるＣＰＭ活性のライブイメージングに成功した世界で初めての例である。

［実施例５］
ＰＳＭＡ活性検出蛍光プローブの開発
これまでに開発してきたｔＳｏｕｌを用いて、前立腺がんのバイオマーカーとして確立しているＰｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｍｂｒａｎｅａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）活性検出蛍光プローブの開発を行った。ＰＳＭＡはＣ末端のグルタミン酸を切断する活性を有することが報告されている。そこで、蛍光団として青色蛍光を有する４−ＭＵ、一般式（Ｉ）におけるＴとしてアラニン残基、Ｒ^１としてｔＢｕ基、Ｓとしてグルタミン酸残基を有する４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＡＥの合成を行った。

スキーム４

(a) 1) HATU, DIEA, DMF, 2) Piperidine, DMF, y. 85 % in 2 steps. (b) 1) 4-MU, TEA, THF, 2) H-Ala-Glu(OtBu)-OtBu, TEA, THF, 2) TFA, MeCN, y. 14 % in 3 steps, diastereomer mixture.

化合物５の合成

Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（９９４ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ塩酸塩（８８６ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５４８μＬ、９．２９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、ＨＡＴＵ（１２５４ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を加えて室温にて３時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより一部精製し（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）、目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド８ｍＬに溶解し、ピペリジン２ｍＬを加えて室温にて９０分攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（ジクロロメタン→ジクロロメタン／メタノール＝９７／３）、化合物５（８４１ｍｇ、８５％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 1.28 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.47 (s, 9H), 1.76-1.98 (m, 1H), 1.99-2.20 (m, 1H), 2.32 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.44 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 5.3, 8.9 Hz, 1H),
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 20.3, 26.7, 26.9, 27.0, 31.2, 49.9, 52.2, 80.5, 81.7, 171.1, 172.3, 177.2
HRMS (ESI⁺): calcd for [M+H]⁺, 331.22330 ; found, 331.22158 (-1.72 mmu)

４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＡＥの合成

ｔｅｒｔ−ブチルホスホン酸ジクロリド（３０ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下、−７８°Ｃにて１０分攪拌した。テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した４−メチルウンベリフェロン（３０ｍｇ、０．１７０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４８μＬ、０．３４９ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、室温まで昇温し、アルゴン雰囲気下で１時間攪拌した。反応溶液を再び−７８°Ｃにて１０分間攪拌した後、テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した化合物５（１１３ｍｇ、０．３４２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９６μＬ、０．６９８ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、室温まで昇温し、アルゴン雰囲気下で一晩攪拌した。６０°Ｃまで昇温してさらに３時間攪拌した後、飽和食塩水を加えて反応を停止した後、酢酸エチルを用いて水層を抽出し、有機層を合わせたものを、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝６５／３５→９０／１０）にて一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣をアセトニトリル２ｍＬに溶解し、トリフルオロ酢酸４ｍＬを加えて１時間室温で攪拌した。溶媒を減圧除去して得た残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＡ（Ｈ_２Ｏ０．１％ＴＦＡ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＢ（ＣＨ_３ＣＮ８０％、Ｈ_２Ｏ２０％、０．１％ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））で精製し、化合物Ｃ（１２ｍｇ、１４％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 1.04-1.40 (m, 12H), 1.60-1.79 (m, 0.48H), 1.79-2.05 (m, 1H), 2.06-2.25 (m, 1.52H), 2.30-2.37 (m, 1H), 2.40-2.53 (m, 3H), 3.87-4.08 (m, 1H), 4.22 (q, J = 4.6 Hz, 0.48H), 4.38 (q, J = 4.7 Hz, 0.52H), 6.25 (d, J = 1.4 Hz, 0.48H), 6.27 (d, J = 1.4 Hz, 0.52H), 7.12-7.31 (m, 2H), 7.66-7.85 (m, 1H) (diastereomer mixture, dr = 13 : 12 judged from ¹H NMR)
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 17.3, 17.4, 19.9 (d, J = 6.8 Hz), 20.5 (d, J = 3.8 Hz), 23.3 (d, J = 6.7 Hz), 26.5, 29.6, 32.4 (d, J = 132.3 Hz), 32.5 (d, J = 132.2 Hz), 50.4, 51.5 (containing 2 peaks), 108.9 (d, J = 4.8 Hz), 109.0 (d, J = 4.8 Hz), 113.0, 113.1, 116.9, 117.0, 117.4 (d, J = 3.8 Hz), 117.6 (d, J = 4.8 Hz), 126.1, 126.2, 153.5 (d, J = 3.7 Hz), 153.6 (d, J = 3.8 Hz), 153.7, 154.2 (containing 2 peaks), 161.3, 161.4, 172.9, 173.1, 174.5, 174.6 (containing 2 peaks), 174.7, 174.8
³¹P NMR (162 MHz, CD₃OD): δ 41.1, 41.6
HRMS (ESI⁺): calcd for [M+H]⁺, 497.16889 ; found, 467.16732 (-1.57 mmu)
The UPLC (eluent; A/B = 95/5 to 5/95 in 4 min) chromatogram after purification is shown. Absorbance at 310 nm was detected. Eluent A (H2O containing 0.1 % formic acid) and eluent B (80 % acetonitrile and 20 % H2O containing 0.1 % formic acid) were used for UPLC analysis.

合成した４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＡＥとＰＳＭＡを用いて酵素アッセイを行った。結果、期待に反して蛍光上昇は観測されず、４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＡＥは基質として認識されないことが明らかとなった（図８）。
ここで、ＴＢＳバッファー中の１０μＭ４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＡＥを、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含む１０μＭ阻害剤（２−ＰＭＰＡ）の存在下または非存在下で２２ｎｇＰＳＭＡと３７℃でインキュベートした。Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５／４６０ｎｍ。ｎ＝３。

［実施例６］
この結果を基に、プローブの改良を行った。ＰＳＭＡの酵素認識にはＣ末端のグルタミン酸だけでなく、隣接するアミノ酸残基も重要であることが示唆されている。そこで一般式（Ｉ）におけるＴを異なるアミノ酸に変えた誘導体の合成を行うこととした。ＰＳＭＡの酵素ポケットが比較的小さいことを考慮して、分子サイズの小さな蛍光団として青色蛍光を有する４−ＭＵ、一般式（Ｉ）におけるＴとしてグリシン残基、Ｒ^１としてｔＢｕ基、Ｓとしてグルタミン酸残基を有する４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＧＥの合成を行った。

スキーム５

(a) 1) HATU, DIEA, DMF, 2) Piperidine, DMF, y. 61 % in 2 steps. (b) 1) 4-MU, TEA, THF, 2) H-Ala-Glu(OtBu)-OtBu, TEA, THF, 2) TFA, MeCN, y. 14 % in 3 steps, diastereomer mixture.

化合物６の合成

Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（５９４ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ塩酸塩（５９１ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０３２μＬ、６．００ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍＬに溶解し、ＨＡＴＵ（１０３２ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を加えて室温にて９０分攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより一部精製し（酢酸エチル／ヘキサン＝３／７→１／１）、目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド８ｍＬに溶解し、ピペリジン２ｍＬを加えて室温にて２時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（酢酸エチル→酢酸エチル／メタノール＝９０１０）、化合物６（３８５ｍｇ、６１％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1.44 (s, 9H), 1.48 (s, 9H), 1.82-2.04 (m, 1H), 2.05-2.21 (m, 1H), 2.21-2.39 (m, 2H), 3.37 (s, 2H), 4.44-4.62 (m, 1H), 7.69 (d, J = 8.2 Hz, 1H)
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 26.8, 26.9, 27.0, 31.1, 43.6, 52.2, 80.5, 81.8, 171.2, 172.2, 174.1
HRMS (ESI⁺): calcd for [M+Na]⁺, 339.18959 ; found, 339.18576 (-3.83 mmu)

４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＧＥの合成

ｔｅｒｔ−ブチルホスホン酸ジクロリド（３０ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下、−７８°Ｃにて１０分攪拌した。テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した４−メチルウンベリフェロン（３０ｍｇ、０．１７０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４８μＬ、０．３４９ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、３５°Ｃまで昇温し、アルゴン雰囲気下で２時間攪拌した。反応溶液を再び−７８°Ｃにて１０分間攪拌した後、テトラヒドロフラン１ｍＬに溶解した化合物６（１０８ｍｇ、０．３４１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９６μＬ、０．６９８ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した後、６０°Ｃまで昇温しアルゴン雰囲気下で一晩攪拌した。飽和食塩水を加えて反応を停止した後、酢酸エチルを用いて水層を抽出した。有機層を合わせたものを飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１→酢酸エチル）にて一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣をアセトニトリル２ｍＬに溶解し、トリフルオロ酢酸６ｍＬを加えて２時間室温で攪拌した。溶媒を減圧除去して得た残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔＡ（Ｈ_２Ｏ０．１％ＴＦＡ）ａｎｄｅｌｕｅｎｔＢ（ＣＨ_３ＣＮ８０％、Ｈ_２Ｏ２０％、０．１％ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝８０／２０ｔｏ０／１００ｉｎ３０ｍｉｎ））で精製し、化合物Ｃ（１８ｍｇ、２２％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1.32 (d, J = 17.4 Hz, 9H), 1.60-1.92 (m, 1H), 1.95-2.16 (m, 1H), 2.16-2.38 (m, 2H), 2.38-2.57 (m, 3H), 3.57-3.82 (m, 2H), 4.30-4.49 (m, 1H), 6.21-6.36 (m, 1H), 7.17-7.37 (m, 2H), 7.69-7.87 (m, 1H) (diastereomer mixture)
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 17.3, 23.4, 26.7, 26.9, 29.5, 29.6, 32.8 (d, J = 130.3 Hz), 43.9 (d, J = 4.8 Hz), 51.2, 51.5, 108.8 (d, J = 4.8 Hz), 109.9 (d, J = 4.8 Hz), 113.1, 113.2, 117.0, 117.2, 117.4 (d, J = 4.8 Hz), 117.5 (d, J = 4.8 Hz), 126.3, 126.4, 153.3 (d, J = 10.5 Hz), 153.5 (d, J = 10.5 Hz), 154.3 (containing 2 peaks), 161.4 (containing 2 peaks), 171.3 (containing 2 peaks), 172.9 (containing 2 peaks), 174.7 (containing 2 peaks)
³¹P NMR (162 MHz, CD₃OD): δ 42.5, 42.8
HRMS (ESI⁺): calcd for [M+Na]⁺, 505.13519 ; found, 505.13393 (-1.25 mmu)
The UPLC (eluent; A/B = 95/5 to 5/95 in 4 min) chromatogram after purification is shown. Absorbance at 310 nm was detected. Eluent A (H₂O containing 0.1 % formic acid) and eluent B (80 % acetonitrile and 20 % H₂O containing 0.1 % formic acid) were used for UPLC analysis.

合成した４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＧＥとＰＳＭＡを用いて酵素アッセイを行った。結果として、ＰＳＭＡ存在下で蛍光上昇が観測され、その蛍光上昇は阻害剤である２−ＰＭＰＡの添加によって抑制された。この結果より、４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＧＥはＰＳＭＡ活性検出蛍光プローブとして機能することが明らかとなった。このことはカルボキシペプチダーゼによる切断を受けるＣ末端のアミノ酸のみならず、隣接するアミノ酸の構造もフレキシブルに選択できる本分子設計の強みを表していると言える（図９）。
ここで、図９の（ａ）は、４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＧＥとＰＳＭＡの反応スキームを示す。図９の（ｂ）では、ＴＢＳバッファー中の１０μＭ４ＭＵ−ｔＳｏｕｌ−ＧＥを、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含む１０μＭ阻害剤（２−ＰＭＰＡ）の存在下または非存在下で２２ｎｇＰＳＭＡと３７℃でインキュベートした。Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５／４６０ｎｍ。ｎ＝３。

［実施例７］
ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを用いた乳がんイメージング
上記の実施例３〜４の検討でＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲはｉｎｖｉｔｒｏにおいてＣＰＢおよびＣＰＭと反応すること、またＭＤＣＫ細胞のＣＰＭ活性をライブイメージング可能であることが明らかとなった。これらの結果を基に、ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲをがん患者由来の臨床検体に適応することでがんイメージングが可能であるか否かを検討することとした。
生体内には表２にまとめるように、塩基性アミノ酸を基質として好むカルボキシペプチダーゼが複数種存在し、いくつかはがんとの関わりが報告されている。ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲがこれらの基質となるのかは現状わかっていないが、ＣＰＢ、ＣＰＭ以外のサブタイプとも反応することは十分に期待できる。そこで、これらサブタイプのうちＣＰＤ、ＣＰＥ（変異体）、ＣＰＮの関連が報告されている乳がんに対するイメージングを試みることとした。これらのカルボキシペプチダーゼはＣＰＭと同様活性体として存在しているため、トリプシンなどの添加は不要である。

乳がん患者由来の検体４例（ＩＤＣ：浸潤性乳管癌３例、ＤＣＩＳ：非浸潤性乳管癌１例）に対し、腫瘍部と正常部に対してＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを散布し蛍光イメージングを以下の手順により行った（図１０）。
ＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを終濃度５０μＭになるようにＰＢＳに溶解し（１％ＤＭＳＯを含む）、１００μＭＭＧＴＡ存在下・非存在下で乳がん患者からの臨床検体に適用した。蛍光像は、ｉｎｖｉｖｏイメージング蛍光装置Ｍａｅｓｔｒｏ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）で取得し、励起光フィルターとして４５５ｎｍ（４３５−４８０ｎｍ）バンドパスフィルター、蛍光フィルターとして４９０ｎｍロングパスフィルターを使用した。
尚、上昇が見られた場合にそれが塩基性カルボキシペプチダーゼ活性由来であるか否かを検討するため、同時に阻害剤ＭＧＴＡを添加した群も検討した。ＭＧＴＡは塩基性アミノ酸を好むカルボキシペプチダーゼを幅広く阻害することが知られている。

結果として腫瘍組織から正常組織と比して顕著な蛍光上昇が観測され、その蛍光上昇はＭＧＴＡの添加によって抑制された。６０分後の蛍光強度から算出されたＴ／Ｎは２．３９−１０．６６であり、たしかに腫瘍部から強い蛍光が観測された。また阻害剤の存在下によって蛍光上昇が抑制されたため、蛍光上昇の大部分はカルボキシペプチダーゼ活性によるものであると解釈して問題ないと考えられる。
以上の結果より、開発したプローブＨＭＲｅｆ−ｔＳｏｕｌ−ＡＲを用いることにより乳がんのイメージングが可能であり、その蛍光上昇は乳がん組織におけるカルボキシペプチダーゼ活性の亢進によるものであることが示された。

これまで乳がんにおける塩基性カルボキシペプチダーゼの関与は報告されていたものの、それらの結果はライセート化したサンプル中の活性評価や免疫染色の結果を基にしたものであり、組織の形態を保った状態において実際にその活性が亢進していることは本発明によって初めて確認された。これは侵襲性の低いライブイメージングを行うことで初めて得られた知見であると言え、本プローブの有用性を示すものであると言える。

Claims

以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。

（式中、
Ｒ^１は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｔは、アミノ酸残基又はアミノ酸誘導体の残基を表し；
Ｓは、Ｃ末端アミノ酸残基を表し；

は、蛍光団を表し、
前記蛍光団は、−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｒ^１）−Ｔ−Ｓの部位が脱離することにより、吸収・蛍光波長が大きく変化する、あるいは消光状態から蛍光状態に変化する蛍光団である。）
請求項１に記載の化合物又はその塩を含むカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブ。
請求項２に記載の蛍光プローブを含む、カルボキシペプチダーゼ検出用キット。
カルボキシペプチダーゼの活性を検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でカルボキシペプチダーゼと反応することにより発せられる蛍光を測定する工程
を含む方法。
蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を可視化することを特徴とする、請求項４に記載の検出方法。