JPWO2020060400A5

JPWO2020060400A5 -

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Publication number: JPWO2020060400A5
Application number: JP2021514967A
Authority: JP
Publication date: 2022-09-26

Description

実施例６：ｐＶ．ｐＶＩＩのヘテロガス発現は、ＥＶへのＤＮＡの組み込みを向上させる
ＨＥＲ９１１細胞を、血清培地中４つのＴ７５フラスコに播種した。１日後、細胞をマキシプレップしたＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした（８５０μｌ培地＋３４μｌのＦｕＧＥＮＥ＋１７μｇのＤＮＡを１０ｍｌの培地に添加したＦｕＧＥＮＥ６プロトコル）：ｐＵＣ５７．ＣＭＶ．Ｃｒｉｍｓｏｎ＿ＣＭＶ．ｅＧＦＰの２つのフラスコ、及びｐＵＣ５７．ＣＭＶ．Ｃｒｉｍｓｏｎ－ｐＶＩＩ＿ＣＭＶ．ｅＧＦＰ－ｐＶの２つのフラスコ（図６ａ参照）。ＤＮＡプラスミドの合成後、配列決定を質の管理として行った。ｐＶ及びｐＶＩＩの配列は、野生型ＨＡｄＶ－５ゲノム配列から誘導された。蛍光タグ配列（ｅＧＦＰ及びＣｒｉｍｓｏｎ）とｐＶ／ｐＶＩＩとの間に、配列が、可撓性リンカー（ａａｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｇｃ）をコードするフレームに導入された。トランスフェクションの１日後、ｅＧＦＰ及びＣｒｉｍｓｏｎ（赤外線）の両方の蛍光が、顕微鏡検査（ＮｉｋｏｎＷｉｄｅ－ｆｉｅｌｄ顕微鏡）によって、全ての場合において約７０％のトランスフェクション効率で観察された。目的のため、ｅＧＦＰ及びＣｒｉｍｓｏｎは、細胞全体にわたって均質に（予想どおり）観察されたが、ｅＧＦＰ－ｐＶ及びＣｒｉｍｓｏｎ－ｐＶＩＩシグナルはドットとして現れた。全てのフラスコ中の細胞は、細胞生存率におけるストレス／損失のいかなる兆候も示さず、また、ｐＶ／ｐＶＩＩタンパク質の毒性も示さなかった。トランスフェクションの１日後に、細胞を野生型ＨＡｄＶ－５（ＭＯＩ＝細胞当たり５個の感染性ユニット）で２時間感染させた後、培地をＤＭＥＭのみの培地に置き換えた。感染の１日後に、感染の最初の兆候が明らかとなったが、これは、注目すべきことに、Ｃｒｉｍｓｏｎ－ｐＶＩＩ＿．ｅＧＦＰ－ｐＶ含有細胞を有するフラスコにのみ見られる。Ｃｒｉｍｓｏｎ＿ｅＧＦＰ含有細胞を有するフラスコでは、感染性は２日後に明らかとなり、これはＨＡｄＶ－５感染に対して標準的である。感染から３日後に、４つのフラスコからの上清を採取し、標準的なイオジキサノール系処置（上述のように）を使用して、ＥＶを単離した。（ＥＶは、分画４～７であった）。ｑＰＣＲ（上述のとおり）を行って、ＥＶ中のＤＮＡの装填を分析した。このことは、ｐＶ／ｐＶＩＩの異種発現が、ウイルスゲノムＤＮＡの組み込みを更にブーストしたことを明らかに示した（図６ｂ、上図）。更に、ｐＵＣ５７ＤＮＡの組み込みの増加も観察され、これは、ｐＵＣ５７プラスミドの存在のみならず、追加因子も必要とされ、この場合、アデノウイルス感染に関連していた（図６ｂ、下図）。細胞溶解アデノウイルス内のパッケージングモジュールとしてｐＶ／ｐＶＩＩを使用することの重要性について、タンパク質モジュールの発現は、ウイルス収率に悪影響を及ぼさず、ウイルスの収率はわずかに増加した。
本開示に係る態様は以下の態様も含む。
＜１＞
初期遺伝子に変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置される、組換えアデノウイルス核酸。
＜２＞
前記変異が、Ｅ１ａ領域におけるΔ２４変異及び／又はＥ１ｂ領域におけるΔ５５ｋ変異である、＜１＞に記載の組換えアデノウイルス核酸。
＜３＞
前記組換えアデノウイルス核酸が、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターのアデノウイルス核酸である、＜１＞又は＜２＞に記載の組換えアデノウイルス核酸。
＜４＞
異種遺伝子が挿入される、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸。
＜５＞
＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。
＜６＞
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置される、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。
＜７＞
異種遺伝子を更に含む、＜６＞に記載の細胞小胞。
＜８＞
初期遺伝子における変異を含むアデノウイルス核酸を更に含む、＜６＞に記載の細胞小胞。
＜９＞
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置された前記組換えアデノウイルス核酸、並びに前記異種遺伝子、を含む核酸分子、
又は
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置された前記組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子、並びに前記異種遺伝子を含む核酸分子、
を含む、＜７＞に記載の細胞小胞。
＜１０＞
アデノウイルスタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩ、及び
初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子、及び／又は
異種遺伝子
を含む、細胞小胞。
＜１１＞
前記アデノウイルス核酸が、主要カプシドタンパク質のうちの１つ又は２つ以上をもはや産生できなくなるような方法で変異している、＜１＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜１２＞
前記主要カプシドタンパク質をコードする後期遺伝子のうちの１つ又は２つ以上が、ヌクレオチド配列から部分的又は完全に欠失されている、＜１１＞に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜１３＞
後期遺伝子のうちの１つ又は２つ以上が、発現調節因子、好ましくは、ドキシサイクリン制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆシステムの制御下に配置される、＜１＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜１４＞
好ましくは、配列のＣｒｅリコンビナーゼに基づく欠失を確立するためにｌｏｘＰ部位によりアデノウイルスパッケージング（ｐｓｉ）を挟むことによって、前記アデノウイルス核酸を変異させてアデノウイルスカプシドにもはやそれがパッケージングできないようにする、＜１＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜１５＞
異種プロモーターが初期アデノウイルスプロモーターである、＜１＞～＜１４＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜１６＞
前記プロモーターが、タンパク質ＩＸの中間プロモーターである、＜１＞～＜１４＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜１７＞
前記プロモーターが、非アデノウイルス由来の異種プロモーター、好ましくはホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）又はサイトメガロウイルスプロモーターである、＜１＞～＜１４＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜１８＞
タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩが、異種分子、特に治療用タンパク質、イメージング用タンパク質、又は精製を可能にするタンパク質と融合している、＜１＞～＜１７＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜１９＞
前記異種分子が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、磁気分離のための親和性タグ、ＳＮＡＰタグ、ビオチン化配列を含む群から選択される、＜１８＞に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜２０＞
前記異種遺伝子が、プロドラッグ変換酵素、好ましくはチミジンキナーゼ、サイトカイン、好ましくはＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２又はＩＬ－１２、チェックポイント阻害剤、好ましくは、ＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１を標的化するもの、免疫細胞を刺激するアゴニスト抗体又はリガンド、好ましくは４－１ＢＢ、ＯＸ４０又はＣＤ４０を標的化するもの、組換え二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体、好ましくはＢｉＴＥｓ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＳ、Ｃａｓ９－ｇｕｉｄｅＲＮＡ、プロテインキナーゼを阻害するペプチド、及び抗腫瘍免疫応答を刺激するペプチドを含む群から選択される生体分子をコードする、＜４＞～＜１９＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜２１＞
繊維タンパク質に融合したＲＧＤ配列を含む、＜１＞～＜２０＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
＜２２＞
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置される、＜１＞～＜２１＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。
＜２３＞
好ましくはＨＥＲ９１１、ＰＥＲ．Ｃ６又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、＜１＞～＜４＞又は＜１１＞～＜２２＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞。
＜２４＞
製造方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
＜１＞～＜４＞又は＜１１＞～＜２２＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸を前記細胞に導入することと、
を含む、＜２３＞に記載の細胞の製造方法。
＜２５＞
＜１＞～＜４＞又は＜１１＞～＜２２＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸を含む組換えアデノウイルス粒子。
＜２６＞
疾患の治療に使用するための、＜５＞～＜２２＞のいずれか１つに記載の細胞小胞。
＜２７＞
前記疾患が癌である、＜２６＞に記載の使用のための細胞小胞。
＜２８＞
前記疾患が、遺伝障害、特に、脳、肝臓、又は胃腸管の遺伝障害である、＜２６＞に記載の使用のための細胞小胞。
＜２９＞
前記疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病又は関節炎である、＜２６＞に記載の使用のための細胞小胞。
＜３０＞
前記疾患が感染性疾患である、＜２６＞に記載の使用のための細胞小胞。
＜３１＞
＜５＞～＜２２＞のいずれか１つに記載の細胞小胞又は＜２５＞に記載の組換えアデノウイルス粒子、及び医薬担体又は小胞、を含む、治療用組成物。
＜３２＞
組織又は細胞培養物及びオルガノイドのインビトロでのラベリング用の染料としての、＜５＞～＜２２＞のいずれか１つに記載の細胞小胞の使用。
＜３３＞
細胞外小胞の製造方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
＜１＞～＜４＞又は＜１１＞～＜２２＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸を前記細胞に導入することと、
前記細胞外小胞を採取すること、
を含む、製造方法。
＜３４＞
＜１＞～＜２２＞のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞、又は＜３１＞に記載の治療組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患、特に遺伝障害、癌又は加齢疾患の治療方法。
＜３５＞
アデノウイルス核酸の検出のための診断方法であって、
＜２５＞に記載の組換えアデノウイルス粒子又は＜５＞～＜２２＞のいずれか１つに記載の細胞小胞を、それを必要とする対象へ投与すること、
前記対象からの体液を採取すること、
細胞小胞中の前記アデノウイルス核酸を定量化すること
を含む、方法。
＜３６＞
細胞外小胞を調製するための方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置された組換えアデノウイルス核酸を前記細胞内に導入することと、
初期遺伝子及び／又は異種遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を前記細胞内に導入することと、
任意選択的に、前記組換えアデノウイルス核酸を含む前記細胞を細胞ストレスに供することと、
前記細胞外小胞を採取すること、
を含む、方法。
＜３７＞
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーター、好ましくはＨＥＲ９１１、ＰＥＲ．Ｃ６、又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞の制御下に配置される、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞。
＜３８＞
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置され、前記異種プロモーターは、初期アデノウイルスプロモーター又はタンパク質ＩＸの中間プロモーターである、組換えアデノウイルス核酸。
＜３９＞
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置される、組換えアデノウイルス核酸。 Example 6: pV. Heterogeneous expression of pVII enhances DNA integration into EVs HER911 cells were seeded in four T75 flasks in serum medium. One day later, cells were transfected with a maxi-prepped DNA plasmid (FuGENE6 protocol with 850 μl medium + 34 μl FuGENE + 17 μg DNA added to 10 ml medium): pUC57. CMV. Crimson_CMV. Two flasks of eGFP and pUC57. CMV. Crimson-pVII_CMV. Two flasks of eGFP-pV (see Figure 6a). After DNA plasmid synthesis, sequencing was performed as a quality control. The pV and pVII sequences were derived from the wild-type HAdV-5 genomic sequence. Between the fluorescent tag sequences (eGFP and Crimson) and pV/pVII a sequence was introduced in frame encoding a flexible linker (aacggcggagggagc). One day after transfection, both eGFP and Crimson (infrared) fluorescence was observed by microscopy (Nikon Wide-field microscope) with a transfection efficiency of approximately 70% in all cases. For purposes, eGFP and Crimson were observed homogeneously throughout the cell (as expected), whereas eGFP-pV and Crimson-pVII signals appeared as dots. Cells in all flasks did not show any signs of stress/loss in cell viability, nor toxicity of the pV/pVII proteins. One day after transfection, cells were infected with wild-type HAdV-5 (MOI = 5 infectious units per cell) for 2 hours, after which the medium was replaced with DMEM-only medium. One day after infection, the first signs of infection became apparent, notably due to the presence of Crimson-pVII_. Only seen in flasks with eGFP-pV containing cells. In flasks with Crimson_eGFP-containing cells, infectivity was apparent after 2 days, which is normal for HAdV-5 infection. Three days after infection, supernatants from four flasks were harvested and EVs were isolated using standard iodixanol-based procedures (as described above). (EVs were fractions 4-7). qPCR (as described above) was performed to analyze DNA loading in EVs. This clearly showed that heterologous expression of pV/pVII further boosted the integration of viral genomic DNA (Fig. 6b, top panel). Furthermore, increased integration of pUC57 DNA was also observed, which required not only the presence of the pUC57 plasmid, but also additional factors, in this case associated with adenoviral infection (Fig. 6b, lower panel). Regarding the importance of using pV/pVII as the packaging module within the cytolytic adenovirus, expression of the protein module did not adversely affect virus yield and slightly increased virus yield.
Aspects according to the present disclosure also include the following aspects.
<1>
A recombinant adenoviral nucleic acid comprising mutations in the early genes and wherein the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII are placed under the control of a heterologous promoter.
<2>
The recombinant adenoviral nucleic acid according to <1>, wherein the mutation is a Δ24 mutation in the E1a region and/or a Δ55k mutation in the E1b region.
<3>
The recombinant adenoviral nucleic acid of <1> or <2>, wherein the recombinant adenoviral nucleic acid is an adenoviral nucleic acid of a conditionally replicating adenoviral and/or replication-deficient adenoviral vector.
<4>
The recombinant adenoviral nucleic acid according to any one of <1> to <3>, into which a heterologous gene is inserted.
<5>
A cellular vesicle containing the recombinant adenoviral nucleic acid according to any one of <1> to <4>.
<6>
A cellular vesicle containing recombinant adenoviral nucleic acid, wherein the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII are placed under the control of a heterologous promoter.
<7>
The cellular vesicle according to <6>, further comprising a heterologous gene.
<8>
The cellular vesicle according to <6>, further comprising an adenoviral nucleic acid containing a mutation in an early gene.
<9>
a nucleic acid molecule comprising said recombinant adenoviral nucleic acid in which the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter and said heterologous gene;
or
a nucleic acid molecule comprising said recombinant adenoviral nucleic acid in which the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter, and a nucleic acid molecule comprising said heterologous gene;
The cell vesicle according to <7>, comprising
<10>
adenoviral protein V and/or protein VII, and
nucleic acid molecules comprising recombinant adenoviral nucleic acids containing mutations in early genes, and/or
Heterologous gene
cell vesicles, including
<11>
The recombinant adenovirus according to any one of <1> to <10>, wherein the adenoviral nucleic acid is mutated in such a way that it can no longer produce one or more of the major capsid proteins. Viral nucleic acids or cellular vesicles.
<12>
The recombinant adenoviral nucleic acid or cellular vesicle of <11>, wherein one or more of the late genes encoding the major capsid proteins are partially or completely deleted from the nucleotide sequence.
<13>
One or more of the late genes are placed under the control of an expression regulator, preferably a Tet-On or Tet-Off system for doxycycline-controllable gene expression <1>-<10> the recombinant adenoviral nucleic acid or cell vesicle according to any one of the above.
<14>
Preferably, the adenoviral nucleic acid is mutated so that it can no longer be packaged into the adenoviral capsid by flanking the adenoviral packaging (psi) with loxP sites to establish a Cre recombinase-based deletion of the sequence. The recombinant adenoviral nucleic acid or cell vesicle according to any one of <1> to <10>.
<15>
The recombinant adenoviral nucleic acid or cell vesicle according to any one of <1> to <14>, wherein the heterologous promoter is an early adenoviral promoter.
<16>
The recombinant adenoviral nucleic acid or cell vesicle according to any one of <1> to <14>, wherein the promoter is an intermediate promoter of protein IX.
<17>
The recombinant adenoviral nucleic acid or according to any one of <1> to <14>, wherein the promoter is a non-adenovirus-derived heterologous promoter, preferably a phosphoglycerate kinase (PGK) or cytomegalovirus promoter cell vesicles.
<18>
The combination according to any one of <1> to <17>, wherein protein V and/or protein VII is fused to a heterologous molecule, particularly a therapeutic protein, an imaging protein, or a protein that allows purification. Recombinant adenoviral nucleic acid or cellular vesicles.
<19>
The recombinant adenoviral nucleic acid or cell molecule of <18>, wherein the heterologous molecule is selected from the group comprising green fluorescent protein, red fluorescent protein, affinity tag for magnetic separation, SNAP tag, biotinylated sequence. cells.
<20>
said heterologous gene targets a prodrug converting enzyme, preferably a thymidine kinase, a cytokine, preferably GM-CSF, IL-2 or IL-12, a checkpoint inhibitor, preferably CTLA-4 or PD-1 Agonist antibodies or ligands that stimulate immune cells, preferably targeting 4-1BB, OX40 or CD40, Recombinant bispecific T cell engager antibodies, preferably BiTEs, microRNAs, shRNS, Cas9-guideRNA , a peptide that inhibits protein kinase, and a peptide that stimulates an anti-tumor immune response, encoding a biomolecule selected from the group comprising: <4> to <19>. or cell vesicles.
<21>
The recombinant adenoviral nucleic acid or cell vesicle according to any one of <1> to <20>, comprising an RGD sequence fused to a fiber protein.
<22>
A cellular vesicle containing the recombinant adenoviral nucleic acid of any one of <1> to <21>, wherein the gene encoding protein V and the gene encoding protein VII are placed under the control of a heterologous promoter.
<23>
Preferably HER911, PER. A cell containing the recombinant adenoviral nucleic acid of any one of <1> to <4> or <11> to <22>, which is a C6 or HEK293T cell.
<24>
A manufacturing method comprising:
culturing the cells in a medium;
introducing the recombinant adenoviral nucleic acid according to any one of <1> to <4> or <11> to <22> into the cell;
The method for producing the cell according to <23>, comprising
<25>
A recombinant adenoviral particle comprising the recombinant adenoviral nucleic acid according to any one of <1> to <4> or <11> to <22>.
<26>
The cellular vesicle according to any one of <5> to <22>, for use in treating diseases.
<27>
Cell vesicle for use according to <26>, wherein the disease is cancer.
<28>
Cell vesicle for use according to <26>, wherein said disease is a genetic disorder, in particular a genetic disorder of the brain, liver, or gastrointestinal tract.
<29>
Cell vesicle for use according to <26>, wherein the disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease or arthritis.
<30>
Cell vesicle for use according to <26>, wherein the disease is an infectious disease.
<31>
A therapeutic composition comprising the cell vesicle of any one of <5> to <22> or the recombinant adenoviral particle of <25>, and a pharmaceutical carrier or vesicle.
<32>
Use of the cell vesicle according to any one of <5> to <22> as a dye for in vitro labeling of tissue or cell cultures and organoids.
<33>
A method for producing extracellular vesicles,
culturing the cells in a medium;
introducing the recombinant adenoviral nucleic acid according to any one of <1> to <4> or <11> to <22> into the cell;
collecting the extracellular vesicles;
A manufacturing method, including:
<34>
administering the recombinant adenoviral nucleic acid or cell vesicle according to any one of <1> to <22>, or the therapeutic composition according to <31> to a subject in need thereof, Methods of treating diseases, particularly genetic disorders, cancer or age-related diseases.
<35>
A diagnostic method for the detection of adenoviral nucleic acid, comprising:
administering the recombinant adenoviral particles of <25> or the cell vesicles of any one of <5> to <22> to a subject in need thereof;
collecting bodily fluid from the subject;
quantifying said adenoviral nucleic acid in cellular vesicles
A method, including
<36>
A method for preparing extracellular vesicles, comprising:
culturing the cells in a medium;
introducing into said cell a recombinant adenoviral nucleic acid in which the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter;
introducing into said cell a recombinant adenoviral nucleic acid containing a mutation in the early gene and/or the heterologous gene;
optionally, subjecting said cell containing said recombinant adenoviral nucleic acid to cellular stress;
collecting the extracellular vesicles;
A method, including
<37>
The gene coding for protein V and/or the gene coding for protein VII is linked to a heterologous promoter, preferably HER911, PER. C6, or cells containing recombinant adenoviral nucleic acids placed under the control of HEK293T cells.
<38>
A recombinant adenoviral nucleic acid wherein the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter, said heterologous promoter being the early adenoviral promoter or the intermediate promoter of protein IX.
<39>
A recombinant adenoviral nucleic acid in which the gene encoding protein V and the gene encoding protein VII are placed under the control of a heterologous promoter.

Claims

初期遺伝子に変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置され、前記プロモーターがタンパク質ＩＸの中間プロモーターである、組換えアデノウイルス核酸。 The gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII containing a mutation in the early gene is placed under the control of a heterologous promoter , said promoter being an intermediate promoter for protein IX. , recombinant adenoviral nucleic acid.

初期遺伝子に変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置された組換えアデノウイルス核酸であって、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスベクターのアデノウイルス核酸である、組換えアデノウイルス核酸。 A recombinant adenoviral nucleic acid comprising mutations in the early genes and wherein the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter, comprising a conditionally replicating adenovirus and/or replicating A recombinant adenoviral nucleic acid that is the adenoviral nucleic acid of a defective adenoviral vector.

前記変異が、Ｅ１ａ領域におけるΔ２４変異及び／又はＥ１ｂ領域におけるΔ５５ｋ変異である、請求項１又は請求項２に記載の組換えアデノウイルス核酸。 3. The recombinant adenoviral nucleic acid of claim 1 or claim 2 , wherein said mutations are the [Delta]24 mutation in the E1a region and/or the [Delta]55k mutation in the E1b region.

異種遺伝子が挿入される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸。 The recombinant adenoviral nucleic acid of any one of claims 1-3, wherein a heterologous gene is inserted.

請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。 A cellular vesicle comprising a recombinant adenoviral nucleic acid according to any one of claims 1-4.

タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置され、異種遺伝子を更に含む、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。 A cellular vesicle containing recombinant adenoviral nucleic acid, wherein the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter and further comprises a heterologous gene .

初期遺伝子における変異を含むアデノウイルス核酸を更に含む、請求項６に記載の細胞小胞。 7. The cellular vesicle of claim 6, further comprising an adenoviral nucleic acid containing mutations in early genes.

タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置された前記組換えアデノウイルス核酸、及び前記異種遺伝子、を含む核酸分子、
又は
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置された前記組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子、及び前記異種遺伝子を含む核酸分子、
を含む、請求項６に記載の細胞小胞。 a nucleic acid molecule comprising said recombinant adenoviral nucleic acid in which the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter , and said heterologous gene ;
or
a nucleic acid molecule comprising said recombinant adenoviral nucleic acid in which the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter , and a nucleic acid molecule comprising said heterologous gene ;
7. The cell vesicle of claim 6 , comprising:

タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置されたアデノウイルス核酸は、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない、請求項１に記載の組換えアデノウイルス核酸又は請求項６～８のいずれか一項に記載の細胞小胞。 The adenoviral nucleic acid in which the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter does not contain adenoviral nucleic acids other than the gene encoding protein V and/or protein VII. A recombinant adenoviral nucleic acid according to claim 1 or a cellular vesicle according to any one of claims 6-8.

ｉ．タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置された組換えアデノウイルス核酸を含み、前記核酸はタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない組換えアデノウイルス核酸、初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸、及び任意選択的に異種遺伝子を含む、核酸分子
ｉｉ．タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置された組換えアデノウイルス核酸、ここで、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩは異種分子と融合し、前記核酸はタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない
ｉｉｉ．アデノウイルスのタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩ、並びに初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸、ここで、前記タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩは異種分子と融合しており、前記組換えアデノウイルス核酸が、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスベクターのアデノウイルス核酸である
ｉｖ．アデノウイルスのタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩ、ここで前記タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩは異種分子と融合している、又は
ｖ．タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩ、並びに異種遺伝子を含む核酸分子、ここで前記タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩは任意選択的に異種分子と融合している
を含む、細胞小胞。 i. The gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII comprises a recombinant adenoviral nucleic acid placed under the control of a heterologous promoter, said nucleic acid comprising an adenovirus other than the gene encoding protein V and/or protein VII. Nucleic acid molecules comprising recombinant adenoviral nucleic acids free of viral nucleic acids, recombinant adenoviral nucleic acids containing mutations in early genes, and optionally heterologous genes
ii. A recombinant adenoviral nucleic acid in which a gene encoding protein V and/or a gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter, wherein protein V and/or protein VII is fused to a heterologous molecule and said nucleic acid does not contain adenoviral nucleic acids other than the genes encoding protein V and/or protein VII
iii. A recombinant adenoviral nucleic acid comprising adenoviral protein V and/or protein VII and a mutation in an early gene , wherein said protein V and/or protein VII is fused to a heterologous molecule and said recombinant adenoviral nucleic acid is the adenoviral nucleic acid of the conditionally replicating adenoviral and/or replication-defective adenoviral vector
iv. adenoviral protein V and/or protein VII, wherein said protein V and/or protein VII is fused to a heterologous molecule, or
v. A nucleic acid molecule comprising protein V and/or protein VII and a heterologous gene , wherein said protein V and/or protein VII is optionally fused to the heterologous molecule
cell vesicles, including

前記アデノウイルス核酸が、主要カプシドタンパク質のうちの１つ又は２つ以上をもはや産生できなくなるような方法で変異されている、ここで好ましくは、前記主要カプシドタンパク質をコードする後期遺伝子のうちの１つ又は２つ以上が、ヌクレオチド配列から部分的又は完全に欠失されている、
後期遺伝子のうちの１つ又は２つ以上が、発現調節因子、好ましくは、ドキシサイクリン制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆシステムの制御下に配置されている、又は
前記アデノウイルス核酸はアデノウイルスカプシドにもはやパッケージングできないように変異しており、これは好ましくは、ｌｏｘＰ部位でアデノウイルスパッケージング（ｐｓｉ）を挟むことによって配列のＣｒｅリコンビナーゼに基づく欠失を確立することによるものである、
請求項１～４及び９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は請求項５～８及び１０のいずれか一項に記載の細胞小胞。 said adenoviral nucleic acid is mutated in such a way that it can no longer produce one or more of the major capsid proteins, wherein preferably one of the late genes encoding said major capsid proteins one or more are partially or completely deleted from the nucleotide sequence,
one or more of the late genes are placed under the control of an expression regulator, preferably a Tet-On or Tet-Off system for doxycycline-controllable gene expression, or
The adenoviral nucleic acid is mutated so that it can no longer be packaged into the adenoviral capsid, which preferably establishes a Cre recombinase-based deletion of the sequence by flanking the adenoviral packaging (psi) at loxP sites. It is due to
A recombinant adenoviral nucleic acid according to any one of claims 1-4 and 9 or a cellular vesicle according to any one of claims 5-8 and 10 .

異種プロモーターが初期アデノウイルスプロモーター、タンパク質ＩＸの中間プロモーター、又は非アデノウイルス由来の異種プロモーター、好ましくはホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）又はサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項２～４及び９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は請求項５～８及び１０のいずれか一項に記載の細胞小胞。 10. Any of claims 2-4 and 9 , wherein the heterologous promoter is the early adenovirus promoter , the intermediate promoter of protein IX, or a heterologous promoter from a non-adenovirus, preferably the phosphoglycerate kinase (PGK) or cytomegalovirus promoter . A recombinant adenoviral nucleic acid according to one claim or a cellular vesicle according to any one of claims 5-8 and 10 .

前記異種遺伝子が治療用タンパク質、イメージング用タンパク質、又は精製を可能にするタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、磁気分離のための親和性タグ、ＳＮＡＰタグ、ビオチン化配列、腫瘍抗原タンパク質若しくは腫瘍抗原ペプチド、プロドラッグ変換酵素、好ましくはチミジンキナーゼ、サイトカイン、好ましくはＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２又はＩＬ－１２、チェックポイント阻害剤、好ましくは、ＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１を標的化するもの、免疫細胞を刺激するアゴニスト抗体又はリガンド、好ましくは４－１ＢＢ、ＯＸ４０又はＣＤ４０を標的化するもの、組換え二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体、好ましくはＢｉＴＥｓ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＳ、Ｃａｓ９－ｇｕｉｄｅＲＮＡ、プロテインキナーゼを阻害するペプチド、及び抗腫瘍免疫応答を刺激するペプチド、を含む群から選択される分子、をコードするか、
前記異種分子が治療用タンパク質、イメージング用タンパク質、又は精製を可能にするタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、磁気分離のための親和性タグ、ＳＮＡＰタグ、ビオチン化配列、腫瘍抗原タンパク質若しくは腫瘍抗原ペプチド、プロドラッグ変換酵素、好ましくはチミジンキナーゼ、サイトカイン、好ましくはＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２又はＩＬ－１２、チェックポイント阻害剤、好ましくは、ＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１を標的化するもの、免疫細胞を刺激するアゴニスト抗体又はリガンド、好ましくは４－１ＢＢ、ＯＸ４０又はＣＤ４０を標的化するもの、組換え二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体、好ましくはＢｉＴＥｓ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＳ、Ｃａｓ９－ｇｕｉｄｅＲＮＡ、プロテインキナーゼを阻害するペプチド、及び抗腫瘍免疫応答を刺激するペプチド、を含む群から選択される分子、である、
請求項４又は請求項９に記載の組換えアデノウイルス核酸又は請求項５～８及び１０
のいずれか一項に記載の細胞小胞。 The heterologous gene is a therapeutic protein, an imaging protein, or a protein that allows purification , such as green fluorescent protein, red fluorescent protein, affinity tags for magnetic separation, SNAP tags, biotinylation sequences, tumor antigen proteins or targeting tumor antigen peptides, prodrug converting enzymes, preferably thymidine kinase, cytokines, preferably GM-CSF, IL-2 or IL-12, checkpoint inhibitors, preferably CTLA-4 or PD-1 , agonistic antibodies or ligands that stimulate immune cells, preferably those targeting 4-1BB, OX40 or CD40, recombinant bispecific T cell engager antibodies, preferably BiTEs, microRNAs, shRNS, Cas9-guideRNA, encoding a molecule selected from the group comprising peptides that inhibit protein kinases and peptides that stimulate anti-tumor immune responses;
The heterologous molecule is a therapeutic protein, an imaging protein, or a protein that allows purification, such as green fluorescent protein, red fluorescent protein, affinity tags for magnetic separation, SNAP tags, biotinylated sequences, tumor antigen proteins or targeting tumor antigen peptides, prodrug converting enzymes, preferably thymidine kinase, cytokines, preferably GM-CSF, IL-2 or IL-12, checkpoint inhibitors, preferably CTLA-4 or PD-1 , agonistic antibodies or ligands that stimulate immune cells, preferably those targeting 4-1BB, OX40 or CD40, recombinant bispecific T cell engager antibodies, preferably BiTEs, microRNAs, shRNS, Cas9-guideRNA, a molecule selected from the group comprising peptides that inhibit protein kinases and peptides that stimulate anti-tumor immune responses ;
Recombinant adenoviral nucleic acid according to claim 4 or claim 9 or claims 5-8 and 10
A cellular vesicle according to any one of Claims 1 to 3 .

アデノウイルスＤＮＡ、異種ＤＮＡ、異種タンパク質若しくはペプチド、又はこれらの組み合わせを細胞小胞に装填するためのタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩの使用、これにより好ましくは、 Use of protein V and/or protein VII to load adenoviral DNA, heterologous DNA, heterologous proteins or peptides, or combinations thereof into cellular vesicles, thereby preferably
１）タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子を含む核酸分子、ここで前記タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩは任意選択的に治療用タンパク質のための配列に融合しており、前記遺伝子は異種プロモーターの制御下に配置され、好ましくは前記遺伝子は異種プロモーターの制御下に配置されたタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない、並びに２）初期遺伝子に変異を有するアデノウイルス核酸及び／又は異種遺伝子を含む核酸分子、又は 1) a nucleic acid molecule comprising a gene encoding protein V and/or protein VII, wherein said protein V and/or protein VII is optionally fused to a sequence for a therapeutic protein and said gene is heterologous placed under the control of a promoter, preferably said genes do not comprise adenoviral nucleic acids other than the genes encoding protein V and/or protein VII placed under the control of a heterologous promoter; adenoviral nucleic acid and/or a nucleic acid molecule comprising a heterologous gene, or
１）タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子、ここで前記タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩは任意選択的に治療用タンパク質のための配列に融合しており、前記遺伝子は異種プロモーターの制御下に配置され、好ましくは前記遺伝子は異種プロモーターの制御下に配置されたタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする前記遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない、並びに２）初期遺伝子に変異を有するアデノウイルス核酸及び／又は異種遺伝子、を含む核酸分子、 1) a gene encoding protein V and/or protein VII, wherein said protein V and/or protein VII is optionally fused to a sequence for a therapeutic protein and said gene is under the control of a heterologous promoter preferably said gene is free of adenoviral nucleic acid other than said gene encoding protein V and/or protein VII placed under the control of a heterologous promoter and 2) an adenovirus having a mutation in the early gene a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid and/or a heterologous gene;
が細胞に導入される、前記使用。 is introduced into the cell.

好ましくはＨＥＲ９１１、ＰＥＲ．Ｃ６又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１～４、９及び１１～１３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞。 Preferably HER911, PER. A cell containing a recombinant adenoviral nucleic acid according to any one of claims 1-4 , 9 and 11-13, which is a C6 or HEK293T cell.

培地中で細胞を培養することと、
請求項１～４、９，及び１１～１３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を前記細胞に導入することと、
を含む、請求項１５に記載の細胞の製造方法。 culturing the cells in a medium;
introducing the recombinant adenoviral nucleic acid of any one of claims 1-4 , 9, and 11-13 into said cell;
The method for producing cells according to claim 15 , comprising

請求項１～４、９、及び１１～１３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む組換えアデノウイルス粒子。 A recombinant adenoviral particle comprising the recombinant adenoviral nucleic acid of any one of claims 1-4 , 9 and 11-13 .

疾患の治療に使用するための、請求項５～８及び１０～１３のいずれか一項に記載の細胞小胞を含む医薬であって、前記疾患が癌、遺伝障害、特に、脳、肝臓、又は胃腸管の遺伝障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、関節炎、及び感染性疾患からなる群から選択される、前記医薬。 A medicament comprising the cell vesicles according to any one of claims 5-8 and 10-13 for use in the treatment of diseases, said diseases being cancer, genetic disorders, in particular brain, liver, or said medicament selected from the group consisting of genetic disorders of the gastrointestinal tract, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, arthritis, and infectious diseases .

請求項５～８及び１０～１３のいずれか一項に記載の細胞小胞又は請求項１７に記載の組換えアデノウイルス粒子、及び医薬担体又は小胞、を含む、治療用組成物。 A therapeutic composition comprising a cellular vesicle according to any one of claims 5-8 and 10-13 or a recombinant adenoviral particle according to claim 17 and a pharmaceutical carrier or vesicle.

組織又は細胞培養物及びオルガノイドのインビトロでのラベリング用の染料としての、請求項５～８及び１０～１３のいずれか一項に記載の細胞小胞の使用。 Use of the cell vesicles according to any one of claims 5-8 and 10-13 as dyes for the in vitro labeling of tissue or cell cultures and organoids.

アデノウイルス核酸の検出のための、請求項５～８及び１０～１３のいずれか一項に記載の細胞小胞を含む、診断剤。 A diagnostic agent comprising a cell vesicle according to any one of claims 5-8 and 10-13 for the detection of adenoviral nucleic acids.

培地中で細胞を培養することと、
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置された組換えアデノウイルス核酸を前記細胞内に導入すること、及び前記初期遺伝子及び／又は異種遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を前記細胞内に導入すること；又は、請求項１～４、９、及び１１～１３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を前記細胞内に導入することと、
任意選択的に、前記組換えアデノウイルス核酸を含む前記細胞を細胞ストレスに供することと、
細胞外小胞を採取すること、
を含む、細胞外小胞を調製するための方法。 culturing the cells in a medium;
introducing into said cell a recombinant adenoviral nucleic acid in which a gene encoding protein V and/or a gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter , and said early gene and/or heterologous gene or introducing into said cell a recombinant adenoviral nucleic acid comprising a mutation in to introduce and
optionally, subjecting said cell containing said recombinant adenoviral nucleic acid to cellular stress;
collecting extracellular vesicles;
A method for preparing extracellular vesicles, comprising:

タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置され、前記異種プロモーターは、初期アデノウイルスプロモーター又はタンパク質ＩＸの中間プロモーターである、組換えアデノウイルス核酸。
A recombinant adenoviral nucleic acid wherein the gene encoding protein V and/or the gene encoding protein VII is placed under the control of a heterologous promoter, said heterologous promoter being the early adenoviral promoter or the intermediate promoter of protein IX.