JPWO2020027133A1 - 滅菌・核酸分解用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
核酸分解の試験に用いるDNAは継代培養したHeLa cells (ヒト子宮頸がん由来の細胞株:human cervical adenocarcinoma)(American Type Culture Collection: ATCC)から、DNeasy Blood & Tissue (Qiagen)のメーカープロトコールに従いgenomic DNAとして抽出精製したものを用いて実施した。
比較例1として、ホルムアルデヒドを単独で使用した場合のDNA分解能につき、ホルムアルデヒド濃度及び反応時間によるDNA分解能の検討を行なった。ホルムアルデヒド(37.0%、WAKO特級試薬)を蒸留水で希釈して、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、10%、20%、30%のホルムアルデヒド溶液を調製した。0.5 ml PCRチューブにそれぞれのホルムアルデヒド希釈濃度になるよう分取調整を行い、最後に破砕DNAサンプルを添加し、ストップウオッチにて反応時間を計測した。反応終了後、速やかにQIAquick PCR purification kitによりサンプルの洗浄・回収を行い、得られたサンプルをBioanalyzerにより解析を行った。
Upper Markerピーク値の75%以上100%以下:レベル1
Upper Markerピーク値の50%以上75%未満 :レベル2
Upper Markerピーク値の25%以上50%未満 :レベル3
Upper Markerピーク値の25%未満:レベル4
ホルムアルデヒド単独でのDNA分解能の結果を図1に示す。ホルムアルデヒド希釈液単独でのDNA分解能の評価結果は、1分の反応時間で0.1%〜5.0%の低濃度域では明らかなDNA分解効果を認めなかった。10%以上の高濃度域においても、ホルムアルデヒド希釈溶液10%[FA10%](以下、「GA」はギ酸を、「FA」はホルムアルデヒドを表す。), 1min.でレベル3(0.385)(図1(A))、3min.でもレベル4 (0.138)(図1(B))で、DNAの完全分解効果は得られなかった。[FA30%]の高濃度になると、5min.(図1(C))でDNAの完全分解効果を示した。
比較例2として、ギ酸単独での濃度、反応時間によるDNA分解能につき検討を行なった。ギ酸(98.0%、WAKO特級試薬)を蒸留水で希釈して、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、5.0%のギ酸溶液を調製した。以降は、比較例1と同様にしてDNA分解能を評価した。
ギ酸単独でのDNA分解能の結果を図2に示す。ギ酸希釈液単独でのDNA分解能の評価結果は、1分間の反応時間で0.1%濃度で若干のDNA分解効果がみられ、1.0%でもレベル3(0.296)(図2(A))とDNAの完全分解効果は得られず中程度のDNA分解能を示した。2.0%以上の高濃度域になると1分間の反応時間でDNAの完全分解効果を認めた。3分の反応時間では、0.1%濃度では若干(レベル1程度)(図2(B))のDNA分解効果がみられ、0.2%濃度でレベル2、0.3〜0.5%でレベル3と濃度依存的に中程度のDNA分解効果を示し、1.0%以上になるとDNA完全分解効果を示した(図2(C))。5分の反応時間では、0.1%濃度では若干(図2(D))のDNA分解効果がみられ、0.2〜0.5%の濃度域ではレベル1〜3と濃度依存的に中程度のDNA分解効果を示し、1.0%以上になるとDNA完全分解効果を示した。
実施例では、本発明の一実施形態に係る滅菌・核酸分解用組成物を用いてDNA分解能を評価した。ホルムアルデヒド及びギ酸の単独ではDNA完全分解効果が得られない濃度範囲において、両者を様々な濃度で混合することによりDNA分解効果の相乗効果が得られるかどうかを検討した。その結果、それぞれ単独希釈液では実現できない低濃度、短時間反応であっても、最小濃度混合比でDNA完全分解効果が得られる最適化条件を特定できた。
本発明に係るホルムアルデヒドとギ酸を併用した場合のDNA分解能の結果を表2に示す。表2中で、「n.s.」はほとんど(レベル1未満)DNAの分解効果が得られなかったことを表し、「1」〜「4」は上記レベル1〜レベル4のDNAの分解効果を表し、「CD」はほぼ完全にDNAの分解効果が得られたことを表す。ホルムアルデヒド単独での評価結果で明らかになったように、最終濃度が0.1〜4.0%の範囲ではほとんどDNA分解効果を認めなかったのに対し、低濃度のギ酸を添加することで、相乗効果によりDNAの完全分解効果を得ることが分かった。実用化においては、短時間で、残留性の少ない条件下での効能評価による運用基準が優先されることから、以下では、作用時間、濃度の面からDNA完全分解効果の得られる最適化条件の具体例を示す。
実施例1と同様にして、ホルムアルデヒド及びギ酸の混合ガスを用いて、核酸分解を検討した。DNA分解能の結果を表3に示す。
LPSの標準試料としては、ENDOSAFE(ENDOTOXIN INDICATOR; Catalog #EVV2K, コード番号513-87082)を用い、注射用水(大塚)を用いて規定の濃度に希釈したものを使用して測定した。容器や分注チップはすべてLPSフリーのものを用いた。
測定は、endosafe-PTSを使い、PTSカートリッジJP(5-0.05EU/mL)を用いて測定した。ホルムアルデヒド、ギ酸は、測定上干渉作用があり、予めリムルスES-IIシングルテストを用い検討し、endosafe-PTS測定時のホルムアルデヒド濃度は0.03%以下、ギ酸の濃度は0.003%以下になるよう濃度設定をおこない実施した。
混合ガスに暴露した際、容器に付着した微量の成分がLPS分解を起こしている可能性があるため、容器のみに気体での暴露をおこなった後、LPSを添加して60分間反応させた後、残存LPSを測定したところ、分解に対して影響はないことがわかった。また、ギ酸を加えない状況での曝露をおこなったところ、表5に示されているとおり、これもほとんどLPS分解は起こっていないことが分かった。
Claims (7)
- 核酸の分解と、滅菌することが可能な液体状態の滅菌・核酸分解用組成物であって、
少なくともホルムアルデヒドとギ酸を含有し、
前記ホルムアルデヒドの濃度が10重量%以下であり、かつ、前記ギ酸の濃度が1重量%以下である滅菌・核酸分解用組成物。 - 更に、メタノールを含み、
前記メタノール、前記ホルムアルデヒド、前記ギ酸の誘導体を任意に含む請求項1に記載の滅菌・核酸分解用組成物。 - さらにLPSを分解できることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の滅菌・核酸分解用組成物。
- 核酸の分解と、滅菌することが可能な気体状態の滅菌・核酸分解用組成物であって、少なくともホルムアルデヒドとギ酸を含有する滅菌・核酸分解用組成物。
- メタノール、前記ホルムアルデヒド、前記ギ酸、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、酸素及び/又はこれらのラジカルを含む請求項3に記載の滅菌・核酸分解用組成物。
- ホルムアルデヒドの濃度が500ppm以下でありかつギ酸の濃度が、400ppm以下であることを特徴とする請求項4又は請求項5に記載の滅菌・核酸分解用組成物。
- さらにLPSを分解できることを特徴とする請求項4乃至請求項6記載の滅菌・核酸分解用組成物。
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