JPWO2019194217A1 - 検出感度の高いインターロイキン−18タンパク質に対する抗体及びその応用 - Google Patents
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Abstract
樹立されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、IL−18に対して特異性が高いだけではなく、IL−18の機能解析を行ううえで重要であるウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色を行うことができる。特に、ウェスタンブロッティングを高感度で行うことができるので、活性型のIL−18を検出することができる。また、IL−18の機能を阻害することから、治療にも使用することができる。【選択図】図2
Description
炎症性サイトカインであるインターロイキン18(interleukin−18、以下IL−18と記載する。)タンパク質に対する抗体、及びその応用に関する。
IL−18は、IL−1βファミリーのサイトカインであり、主としてマクロファージで発現しているが、樹状細胞、上皮細胞、ケラチノサイトなど様々な細胞で発現している。また、IL−18受容体はNK細胞、NKT細胞、CD4 T細胞の他、B細胞、好中球、マクロファージ、血管内皮細胞、平滑筋細胞など様々な細胞で発現している。IL−18発現細胞、受容体発現細胞の多様性は、IL−18の機能の多様性を示しており、種々の免疫系に関与していることが知られている。
IL−18は、発見当初寄生虫や細菌感染などの病原体に対する防御機構において重要な役割を果たすことが示されてきたが、それだけではなく、アレルギー疾患や自己免疫疾患においても重要な役割を果たすことが示されている(非特許文献1、2)。
IL−18は、TNFなどのサイトカインとは異なり、mRNAレベルでの産生調節を受けず、活性のない前駆体(pro−IL−18)として細胞内に豊富に存在する。pro−IL−18は、カスペース1(caspase−1)、又はカスペース4によって前駆体が切断されることで、活性型となり細胞外に放出される。したがって、mRNA発現量や、細胞内の前駆体タンパク質の測定を行っても、IL−18の活性を測定することにはならず、IL−18の機能解析を行うためには、カスペースによって切断された活性型IL−18を解析することが必須である。
IL−18が種々の疾患において重要な役割を果たすことから、IL−18に結合する中和抗体については多数報告されている(特許文献1〜10)。しかし、いずれの文献もIL−18が関与する種々の疾患を治療することを目的として開発された中和抗体であることから、中和活性としての機能が開示されている。
Arend, W.P. et al., Immunol. Rev., 2008, Vol.223, p.20-38.
Sanders, N.L. & Mishra, A., Cytokine Growth Factor Rev., 2016, Vol.32,pp.31-39.
Kawashima, M. et al., Arthritis Rheum. 2001, Vol.44, No.3, pp.550-560.
Yoshida H, et.Al., Genes & Dev., 2015, Vol.29, pp.1649-1660.
Tsutsumi, N. et al., Nature Commun., 2014, DOI:10.1038/ncomms6340.
しかしながら、上記特許文献で開示されている抗体はいずれも中和抗体であり、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色など、IL−18の機能解析を行うのに必要な性質を備えているものではない。特に、ウェスタンブロッティングは、カスペース1、又はカスペース4により切断され活性を有するIL−18と前駆体を区別し得ることから、IL−18の機能を理解するうえで重要な実験となる。いずれの文献に開示されている抗体もウェスタンブロッティングを行い得るものであることの記載はなく、さらに、現在研究用に市販されている抗体もELISAに適した抗体であり、高感度でウェスタンブロッティングが行えるものはない。また、市販のポリクローナル抗体を使用してウェスタンブロッティングを行い、活性型IL−18を検出したとの報告があるものの(非特許文献3)、検出感度が低いことや、ポリクローナル抗体であることから、安定して同じ性質の抗体を得ることができず、すでにこの抗体は販売が中止されている。IL−18は、臨床検体では非常に低濃度で存在していることから、感度良く検出を行うことが要求されるのにも関わらず、高感度でウェスタンブロッティングを行うことができる抗体は存在していない。
本発明は、IL−18に対して特異性が高く、IL−18の機能解析を行ううえで重要であるウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色を行うことができる抗体を提供することを課題とする。さらに、研究用の試薬としてだけではなく、IL−18の機能を阻害し、治療にも使用できる抗体を提供することを課題とする。
本発明は以下のモノクローナル抗体、モノクローナル抗体の機能的断片、及びこれら抗体を含むキット、また、これら抗体、又は機能的断片をコードする遺伝子、及びヒト化抗体、医薬組成物、検査方法、治療方法に関する。
(1)ヒトIL−18のRXLFED(配列番号5)をエピトープとして認識する抗IL−18モノクローナル抗体。
(2)重鎖可変ドメインが、GYAFTKYY(配列番号23)、又はGYTFTDYY(配列番号36)のアミノ酸配列からなるCDR1H領域、INPNNGGT(配列番号24)、又はINPKNGGS(配列番号37)のアミノ酸配列からなるCDR2H領域、AKLGLDFDC(配列番号25)のアミノ酸配列からなるCDR3H領域を含み、軽鎖可変ドメインが、LLYSNGKTY(配列番号26)のアミノ酸配列からなるCDR1L領域、LVS(配列番号27)のアミノ酸配列からなるCDR2L領域、VQGTHFPYT(配列番号28)のアミノ酸配列からなるCDR3L領域を含むことを特徴とする(1)記載の抗IL−18モノクローナル抗体。
(3)H鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号12、配列番号14、配列番号16のいずれか1つであり、L鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号18、配列番号20、配列番号22のいずれか1つであることを特徴とする(1)、又は(2)記載の抗IL−18モノクローナル抗体。
(4)(2)記載のCDR配列、又は(3)記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
(5)(1)〜(3)いずれか1つ記載の抗IL−18モノクローナル抗体の機能的断片。
(6)(1)〜(3)いずれか1つ記載のモノクローナル抗体、又は(5)記載のモノクローナル抗体の機能的断片を含む、IL−18を検出、及び/又は定量するためのキット。
(7)(2)のCDR、又は(3)の可変領域とヒト定常領域を備えている抗IL−18ヒト化抗体。
(8)(1)〜(3)いずれか1つ記載のモノクローナル抗体、又は(5)記載のモノクローナル抗体の機能的断片を有効成分として含む、IL−18関連疾患の治療に用いる医薬組成物。
(9)(1)〜(3)いずれか1つ記載のモノクローナル抗体、(5)記載のモノクローナル抗体の機能的断片、又は(6)記載のキットを使用して、活性型IL−18を検出及び/又は定量することを特徴とするIL−18関連疾患の検査方法。
(10)請求項8記載の医薬組成物を用い、IL−18関連疾患を治療する方法。
(2)重鎖可変ドメインが、GYAFTKYY(配列番号23)、又はGYTFTDYY(配列番号36)のアミノ酸配列からなるCDR1H領域、INPNNGGT(配列番号24)、又はINPKNGGS(配列番号37)のアミノ酸配列からなるCDR2H領域、AKLGLDFDC(配列番号25)のアミノ酸配列からなるCDR3H領域を含み、軽鎖可変ドメインが、LLYSNGKTY(配列番号26)のアミノ酸配列からなるCDR1L領域、LVS(配列番号27)のアミノ酸配列からなるCDR2L領域、VQGTHFPYT(配列番号28)のアミノ酸配列からなるCDR3L領域を含むことを特徴とする(1)記載の抗IL−18モノクローナル抗体。
(3)H鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号12、配列番号14、配列番号16のいずれか1つであり、L鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号18、配列番号20、配列番号22のいずれか1つであることを特徴とする(1)、又は(2)記載の抗IL−18モノクローナル抗体。
(4)(2)記載のCDR配列、又は(3)記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
(5)(1)〜(3)いずれか1つ記載の抗IL−18モノクローナル抗体の機能的断片。
(6)(1)〜(3)いずれか1つ記載のモノクローナル抗体、又は(5)記載のモノクローナル抗体の機能的断片を含む、IL−18を検出、及び/又は定量するためのキット。
(7)(2)のCDR、又は(3)の可変領域とヒト定常領域を備えている抗IL−18ヒト化抗体。
(8)(1)〜(3)いずれか1つ記載のモノクローナル抗体、又は(5)記載のモノクローナル抗体の機能的断片を有効成分として含む、IL−18関連疾患の治療に用いる医薬組成物。
(9)(1)〜(3)いずれか1つ記載のモノクローナル抗体、(5)記載のモノクローナル抗体の機能的断片、又は(6)記載のキットを使用して、活性型IL−18を検出及び/又は定量することを特徴とするIL−18関連疾患の検査方法。
(10)請求項8記載の医薬組成物を用い、IL−18関連疾患を治療する方法。
本明細書に記載している抗体は、現在使用されている抗体よりも高感度にIL−18の検出を行うことができる。特に、ウェスタンブロッティングを行うことのできる高感度のモノクローナル抗体であることから、活性型のIL−18と前駆体であるpro−IL−18とを区別して検出することが可能である。また、IL−18の機能阻害活性も備えていることから、治療用に使用することも可能である。
本発明の抗体は、以下に示すIL−18のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、又は誘導体をいう。また、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の機能的断片をも含むものとする。抗体の機能的断片には、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖抗体(scFv)、ジスルフィド安定化V領域断片(dsFv)、もしくはCDRを含むペプチドなどの抗体の機能的断片が含まれる。
また、本発明で特定したIL−18のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体、ヒト化CDR移植抗体などとしたヒト化抗体、遺伝子改変マウスを用いたヒト抗体もまた本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体、ヒト抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ副作用が少なく、その治療効果が長時間持続する。
「エピトープ」とは、抗体によって認識される抗原(本発明の場合にはIL−18)の一部をいい、本明細書において開示される抗体可変領域を含むドメインが結合する抗原上の部位を意味する。例えば、IL−18のようなポリペプチドを抗原とする場合には、抗体は直線的なアミノ酸配列を認識する場合も、3次元的な立体構造を認識する場合もあるから、エプトープは、アミノ酸配列や抗原の構造によって定義することができる。
本明細書において「IL−18関連疾患」とは、活性型IL−18が過剰に細胞外に放出されることにより惹起される疾患、あるいはIL−18によって増悪する可能性のある疾患をいう。IL−18関連疾患は、IL−18の過剰発現で発症、増悪している疾患であるから、IL−18の機能を阻害することができる有効成分を含有する薬剤によって治療、もしくは予防することができる。例えば、成人スティル病(AOSD)、若年性スティル病、膵がん、肺がん、大腸がんなどの悪性腫瘍、クリオピリン関連周期熱症候群、全身性エリトマトーデス(SLE)、多発性硬化症、若年性突発性関節炎(JIA)、気管支喘息、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患(CDPD)、輸血関連肺傷害、気管支肺異形成症(BPD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、間質性肺疾患(ILD)、突発性肺線維症、嚢胞性線維症、関節リウマチ、代謝性骨疾患、肝臓及び腸管での重篤な臓器傷害、心不全、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、眼球乾燥症(DED)、角膜炎、角膜血管新生、病的眼球内血管新生、虹彩炎、緑内障、黄斑変性症、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、ベーチェット病、結膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼皮膚炎、アレルギー性鼻炎、2型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、脂肪性肝炎、虚血再灌流傷害、家族性地中海熱、TNF受容体関連周期性症候群、高IgD症候群、痛風、シュニッツラー症候群、顕微鏡的多発血管炎、肉芽腫性多発血管炎、好酸球肉芽腫性多発血管炎からなるANCA関連血管炎、橋本病、クローン病、潰瘍性大腸胃炎、免疫グロブリン−4(IgG4)関連疾患、肺動脈高血圧症、アトピー性皮膚炎などでIL−18の関与が報告されていることから、これらIL−18関連疾患ではIL−18の機能を阻害する薬剤によって治療効果が得られることが期待される。
本明細書において「キット」とは、以下の実施例で示すウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色、IL−18の機能阻害活性試験に限らず、本明細書で開示する抗体を用いてIL−18を検出、定量、あるいは、その機能を評価する目的のために、必要な試薬、器具などを構成要素とするパッケージングされた組み合わせをいう。
本発明で検査とは、サンプル中に活性型IL−18が存在するか否かを判断することを目的とする活性型IL−18の検出をいう。特に、患者サンプルを用いて活性型IL−18がサンプル中に存在するかを検出することをいう。患者サンプルとしては、血漿、血清、血液、髄液、尿などのサンプルを用いることができる。
また、医薬組成物は、投与経路に適合するように製剤化される。投与経路は、例えば、静脈内投与、皮下投与、硝子体内投与のような非経口投与だけではなく、軟膏、点眼剤などの外用薬等、疾患に適した剤形に製剤することができる。医薬組成物には、剤形に適した担体、賦形剤、溶媒、希釈剤など一般に当該分野で用いることのできる化合物を含むことができる。
以下の実施例において、本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
[実施例1]抗体の作製
ヒト炎症性サイトカインIL−18タンパク質(uniprot:Q14116)の37〜193位のポリペプチド(活性型IL−18、配列番号1)をコードする遺伝子領域をpET28HisTEV(非特許文献4)にクローニングし、大腸菌で発現させ精製した。精製したタンパク質を常法に従いマウスに免疫し、抗原に使用した精製タンパク質を用いてELISA法により選別し、ハイブリドーマを樹立した。
[実施例1]抗体の作製
ヒト炎症性サイトカインIL−18タンパク質(uniprot:Q14116)の37〜193位のポリペプチド(活性型IL−18、配列番号1)をコードする遺伝子領域をpET28HisTEV(非特許文献4)にクローニングし、大腸菌で発現させ精製した。精製したタンパク質を常法に従いマウスに免疫し、抗原に使用した精製タンパク質を用いてELISA法により選別し、ハイブリドーマを樹立した。
以下に詳述するが、同一のエピトープを認識する3種のモノクローナル抗体11−4.1モノクローナル抗体(以下、11−4.1抗体という。他の抗体も同様に記載する。)、4−18.1.4抗体、9−4.2.1抗体を産生するハイブリドーマ11−4.1、4−18.1.4、9−4.2.1を選択し解析を行った。これらモノクローナル抗体のうち、主として11−4.1抗体についてウェスタンブロッティング、免疫染色などの応用について説明するが、以下で示すように、他の2種のモノクローナル抗体もエピトープが同一であり、ウェスタンブロッティング等、同様の手法の解析に用いることができる。
[実施例2]ハイブリドーマ11−4.1が産生するモノクローナル抗体11−4.1の特異性の評価
G196タグ(アスパラギン酸−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン、DLVPR、以下、アミノ酸配列は一文字表記で表す。配列番号2)を融合したヒト炎症性サイトカインIL−1βファミリータンパク質をヒト胎児腎由来細胞株HEK−293細胞で発現させた。発現させたタンパク質を、ウェスタンブロッティングを用いて11−4.1抗体を評価した(図1)。11−4.1抗体は、IL−18タンパク質のみを認識し、IL−1βファミリーであるIL−1α、β、Ra(Receptor antagonist)、IL−33、IL−36α、β1、β2、γ、Ra、IL−37、IL−38のアイソフォームであるIL−38−1、IL−38−2とは反応しなかった。IL−1βファミリーの他のタンパク質には結合性を示さなかったことから、非常に特異性の高い抗体であるといえる。なお、G196タグは、G196モノクローナル抗体によって検出されるタグ配列である(特許文献11)。下段に示すG196モノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングは、各タンパク質が発現していることを示すためのものである。
G196タグ(アスパラギン酸−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン、DLVPR、以下、アミノ酸配列は一文字表記で表す。配列番号2)を融合したヒト炎症性サイトカインIL−1βファミリータンパク質をヒト胎児腎由来細胞株HEK−293細胞で発現させた。発現させたタンパク質を、ウェスタンブロッティングを用いて11−4.1抗体を評価した(図1)。11−4.1抗体は、IL−18タンパク質のみを認識し、IL−1βファミリーであるIL−1α、β、Ra(Receptor antagonist)、IL−33、IL−36α、β1、β2、γ、Ra、IL−37、IL−38のアイソフォームであるIL−38−1、IL−38−2とは反応しなかった。IL−1βファミリーの他のタンパク質には結合性を示さなかったことから、非常に特異性の高い抗体であるといえる。なお、G196タグは、G196モノクローナル抗体によって検出されるタグ配列である(特許文献11)。下段に示すG196モノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングは、各タンパク質が発現していることを示すためのものである。
[実施例3]11−4.1抗体の親和性の評価
汎用されている市販の2種類の抗IL−18抗体(D043−3:clone 25−2G、M156−3:clone 43A11、いずれも株式会社医学生物学研究所製)との性能比較を行った。大腸菌で発現精製させた100、33、10、3.3ng/mLの活性型IL−18タンパク質(アミノ酸37位〜193位、図中cIL−18 proteinと記載。)をWes(プロテイン シンプル社)を用いてキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。1次抗体として、各精製抗体を0.4mg/mLに調整後、表示の希釈で使用した。すなわち、1:125倍希釈は、3.2μg/mL、1:25倍希釈は16μg/mL濃度で各一次抗体を使用している。露光時間、2次抗体など他の条件はすべて同一にして行った(図2)。
汎用されている市販の2種類の抗IL−18抗体(D043−3:clone 25−2G、M156−3:clone 43A11、いずれも株式会社医学生物学研究所製)との性能比較を行った。大腸菌で発現精製させた100、33、10、3.3ng/mLの活性型IL−18タンパク質(アミノ酸37位〜193位、図中cIL−18 proteinと記載。)をWes(プロテイン シンプル社)を用いてキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。1次抗体として、各精製抗体を0.4mg/mLに調整後、表示の希釈で使用した。すなわち、1:125倍希釈は、3.2μg/mL、1:25倍希釈は16μg/mL濃度で各一次抗体を使用している。露光時間、2次抗体など他の条件はすべて同一にして行った(図2)。
11−4.1抗体は、1:25倍希釈で3.3ng/mLの濃度のタンパク質を検出可能であった。これに対し、同希釈倍率では、D043−3抗体は100ng/mL濃度のタンパク質を検出可能で、M156−3抗体はいずれの濃度でも検出できなかった。11−4.1抗体は、検出が確認されたD043−3と比較しても約60倍以上感度がよいことが判明した。
[実施例4]臨床検体を用いた評価
(1)11−4.1抗体の臨床検体を用いた評価
上述のように、IL−18は、TNFなどのサイトカインとは異なり、mRNAレベルでの産生調節を受けず、活性のない前駆体として細胞内に豊富に存在する。そのため、mRNA発現量や細胞内の前駆体タンパク質の測定は、IL−18の活性を反映しておらず、IL−18の機能解析を行うためには、活性型IL−18、すなわち切断されたIL−18タンパク質を検出することが必須である。上記実施例3で示したように、11−4.1抗体は市販の抗IL−18抗体に比べて非常に感度が高いことから臨床検体中の活性型IL−18を検出することができるか検討した。なお、以下の研究に関しては、島根大学医学部医の倫理委員会の承認を受けて行っている。
(1)11−4.1抗体の臨床検体を用いた評価
上述のように、IL−18は、TNFなどのサイトカインとは異なり、mRNAレベルでの産生調節を受けず、活性のない前駆体として細胞内に豊富に存在する。そのため、mRNA発現量や細胞内の前駆体タンパク質の測定は、IL−18の活性を反映しておらず、IL−18の機能解析を行うためには、活性型IL−18、すなわち切断されたIL−18タンパク質を検出することが必須である。上記実施例3で示したように、11−4.1抗体は市販の抗IL−18抗体に比べて非常に感度が高いことから臨床検体中の活性型IL−18を検出することができるか検討した。なお、以下の研究に関しては、島根大学医学部医の倫理委員会の承認を受けて行っている。
IL−18タンパク質が高値を示すことが報告されている成人発症スティル病(AOSD)患者血清中のIL−18タンパク質を、Wesを用いたキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。1次抗体として、11−4.1抗体を0.4mg/mLに調整後、1:125倍希釈(3.2μg/mL)で使用した。
図3に示すように、11−4.1抗体は、AOSD患者血清中の活性型IL−18を検出できる。今までモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより患者血清中の活性型IL−18を検出した報告はなく、11−4.1抗体が非常に感度が高く有用な抗体であることが示された。また、検体番号の下に示すバーは、同一患者からの検体であることを示しているが、血清中に含まれる微量の活性型IL−18を検出できるだけではなく、試料53、54(図3上)、137、138(図3下)のように同一患者における治療前後での活性型IL−18の変化や、試料64、65(図3上)のように発作時、非発作時、試料57、136(図3下)のように、発作時、治療後で活性型IL−18の変化を検出することができることから、治療の効果、病状の変化を客観的に検査することができる。すなわち、11−4.1抗体は、IL−18関連疾患の診断薬として使用できる。なお、試料52についてはAOSD症例であるという以外の患者情報が得られていない。
(2)11−4.1抗体の臨床検体を用いた評価
モノクローナル抗体11−4.1を用い、血中のIL−18タンパク質が高値を示すことが報告されている血球貪食症候群患者血清についても解析を行った。
モノクローナル抗体11−4.1を用い、血中のIL−18タンパク質が高値を示すことが報告されている血球貪食症候群患者血清についても解析を行った。
血球貪食症候群患者血清中のIL−18タンパク質を、上記と同様にWesを用いたキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。1次抗体として、11−4.1を0.4mg/mLに調整後、1:125倍希釈で使用した。内部標準タンパク質として、活性型カスペース4105−377で切断した活性型IL−18タンパク質を40、20、10、5及び2.5ng/mLの濃度で使用した。結果を図4に示す。6名中、2人の患者(#2、#5)において、活性型IL−18、すなわち、カスペースで切断された活性型IL−18と同じ位置にタンパク質が検出された。
ELISAは感度を増強してIL−18を検出することができるが、活性型IL−18を特異的に認識できる抗体がないため、活性型IL−18のみをELISAによって直接検出することはできない。キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により、分子量を確認することによって、AOSDや血球貪食症候群患者血清中で活性型IL−18を検出できることは臨床上非常に意味のあることである。
[実施例5]11−4.1抗体による免疫沈降法
活性型である37位から193位のIL−18ポリペプチドにG196タグを融合させて発現させるベクター、IL−1837−193-G196/pcDNA3ベクターをHEK−293細胞に導入し、IL−1837−193-G196タンパク質を発現させた。11−4.1抗体の免疫沈降法における有用性について、既存のG196タグ抗体と比較し評価した(図5)。11−4.1抗体、G196抗体、ネガティブコントロール抗体としてFlagタグ抗体(M2、シグマ−アルドリッチ社)を使用し、免疫沈降を行い、免疫沈降産物はG196ウサギポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングにより検出した。
活性型である37位から193位のIL−18ポリペプチドにG196タグを融合させて発現させるベクター、IL−1837−193-G196/pcDNA3ベクターをHEK−293細胞に導入し、IL−1837−193-G196タンパク質を発現させた。11−4.1抗体の免疫沈降法における有用性について、既存のG196タグ抗体と比較し評価した(図5)。11−4.1抗体、G196抗体、ネガティブコントロール抗体としてFlagタグ抗体(M2、シグマ−アルドリッチ社)を使用し、免疫沈降を行い、免疫沈降産物はG196ウサギポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングにより検出した。
11−4.1抗体は、HEK−293細胞内で発現させたIL−1837−193-G196タンパク質を、既存のG196抗体と同等に免疫沈降した。すなわち、11−4.1抗体はIL−18タンパク質を特異的に認識し効率よく免疫沈降できるモノクローナル抗体であることが明らかとなった。
[実施例6]11−4.1抗体によるIL−18機能阻害活性
大腸菌で発現精製した活性型IL−18タンパク質を急性骨髄性白血病細胞株KG−1(JCRB0065)に添加するとIFN−γが産生されることが知られている。11−4.1抗体がIL−18機能を阻害する抗体であれば、IL−18によるIFN−γ産生を阻害する。IL−18タンパク質の2〜193位のポリペプチド(pro−IL−18、配列番号3)をコードする遺伝子領域をpET28HisTEVにクローニングし、大腸菌で発現させ精製した。また、ヒトカスペース4タンパク質の105位〜377位のポリペプチド(活性型カスペース4、配列番号4)をコードする遺伝子領域をpET28HisTEVにクローニングし、大腸菌で発現させ精製した。この両者のタンパク質を混合し、活性型IL−18タンパク質(配列番号1)を精製した。3×104個/96wellのKG−1細胞に2ng/wellで上記の方法で精製した活性型IL−18と0〜2.0μg濃度で抗体を添加し、36時間後に培養上清中のIFN−γをIFN−γ検出ELISA法キット(ダイアクローン社)を用いて測定した。
大腸菌で発現精製した活性型IL−18タンパク質を急性骨髄性白血病細胞株KG−1(JCRB0065)に添加するとIFN−γが産生されることが知られている。11−4.1抗体がIL−18機能を阻害する抗体であれば、IL−18によるIFN−γ産生を阻害する。IL−18タンパク質の2〜193位のポリペプチド(pro−IL−18、配列番号3)をコードする遺伝子領域をpET28HisTEVにクローニングし、大腸菌で発現させ精製した。また、ヒトカスペース4タンパク質の105位〜377位のポリペプチド(活性型カスペース4、配列番号4)をコードする遺伝子領域をpET28HisTEVにクローニングし、大腸菌で発現させ精製した。この両者のタンパク質を混合し、活性型IL−18タンパク質(配列番号1)を精製した。3×104個/96wellのKG−1細胞に2ng/wellで上記の方法で精製した活性型IL−18と0〜2.0μg濃度で抗体を添加し、36時間後に培養上清中のIFN−γをIFN−γ検出ELISA法キット(ダイアクローン社)を用いて測定した。
図6に示すように、11−4.1抗体を活性型IL−18タンパク質と同時に培養液に添加することによって、濃度依存的にIL−18の機能を阻害する。すなわち、11−4.1抗体はIL−18の機能を阻害する中和抗体として作用する。また、IC50は14.2nMであり、非常に低濃度でIL−18の機能を阻害する活性を備えている。したがって、本発明の抗体をIL−18関連疾患の治療薬として用いることができる。
[実施例7]11−4.1抗体による免疫染色
IL−1837−193-G196/pcDNA3ベクターをHeLa細胞に導入し、IL−1837−193-G196タンパク質を発現させた。ホルマリン固定後、常法に従い11−4.1抗体を一次抗体として、二次抗体としてAlexa488標識抗マウス抗体(A−11029、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて免疫染色を行った。図7(A)に示すように、11−4.1抗体は、HeLa細胞内で一過性に発現させたIL−1837−193-G196タンパク質を細胞質に強く認識した。なお、コントロールとしては、二次抗体のみを反応させたものを示している。
IL−1837−193-G196/pcDNA3ベクターをHeLa細胞に導入し、IL−1837−193-G196タンパク質を発現させた。ホルマリン固定後、常法に従い11−4.1抗体を一次抗体として、二次抗体としてAlexa488標識抗マウス抗体(A−11029、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて免疫染色を行った。図7(A)に示すように、11−4.1抗体は、HeLa細胞内で一過性に発現させたIL−1837−193-G196タンパク質を細胞質に強く認識した。なお、コントロールとしては、二次抗体のみを反応させたものを示している。
次に、HeLa細胞で内在性のIL−18タンパク質が発現しているかどうかを検討した(図7B)。HeLa細胞における内在性IL−18タンパク質をウェスタンブロッティングで解析すると、カスペースによって切断されていない全長IL−18が主要の分子種として検出される(図7(B)左)。上記と同様に11−4.1抗体を一次抗体、二次抗体としてAlexa488標識抗マウス抗体により免疫染色を行うと、HeLa細胞の核を含めた細胞全体において顆粒状にIL−18タンパク質が検出される。すなわち、11−4.1抗体はHeLa細胞で発現している内在性のIL−18タンパク質をウェスタンブロッティングや免疫染色で検出できることを示している。なお、図7(B)の免疫染色像は、撮像後、グレースケールに変換したものをさらに白黒反転させている。
図7に示したように、本発明の抗体は、ウェスタンブロッティングと免疫染色とを同じ抗体を用いて、解析することによって、細胞内に存在するのが全長IL−18であること、さらにその局在を明らかにすることができる。従来の抗体は、高感度でウェスタンブロッティングができなかったことから、細胞内での局在を明らかにしたとしても、全長、活性型という分子種を区別することができなかった。これに対し、本発明の抗体は、種々の方法に適用することができるため、多面的な解析を行うことが可能である。
[実施例8]エピトープ解析
活性型IL−18をN末から15アミノ酸ずつGST融合タンパク質として発現するようなプラスミドをpGEX−4T−2(GEヘルスケア・ジャパン社)で構築した。各プラスミドを大腸菌で発現させ、11−4.1抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、11−4.1抗体が認識する配列の解析を行った。二次抗体はペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体(710−1332、ロックランド社)を用い、ImageQuantLAS 4000(GEヘルスケア社)により検出した。図8(A)に示すように、11−4.1抗体は、58位から72位のアミノ酸に対して強い反応性を示した。
活性型IL−18をN末から15アミノ酸ずつGST融合タンパク質として発現するようなプラスミドをpGEX−4T−2(GEヘルスケア・ジャパン社)で構築した。各プラスミドを大腸菌で発現させ、11−4.1抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、11−4.1抗体が認識する配列の解析を行った。二次抗体はペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体(710−1332、ロックランド社)を用い、ImageQuantLAS 4000(GEヘルスケア社)により検出した。図8(A)に示すように、11−4.1抗体は、58位から72位のアミノ酸に対して強い反応性を示した。
さらに、11−4.1抗体が、58位から72位の配列のどの領域を認識しているか、領域を狭めてGST融合タンパク質を作製してウェスタンブロッティングにより解析を行った(図8(B))。IL−18の58位から72位のアミノ酸をGSTと融合させたタンパク質の他、62位から72位(レーン1)、62位から70位(レーン2)、64位から72位(レーン3)のアミノ酸配列をGST融合タンパク質として発現するようなプラスミドを、pGEX−4T−2で構築した。11−4.1抗体は、62位から70位のアミノ酸配列を含むGST融合タンパク質を認識するが、64位から72位のアミノ酸配列は認識しなかった(図8(B)右)。
そこで、62位から70位のアミノ酸配列中の11−4.1抗体が認識するアミノ酸の詳細を検討した。大腸菌でGST融合タンパク質として発現させた62位から70位IL−18タンパク質の62位のアスパラギンから70位のスレオニン(NRPLFEDMT)の領域のアミノ酸をアラニンに変異させて11−4.1抗体とが認識するか解析を行った。11−4.1抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行い、ImageQuantLAS 4000により定量した。
11−4.1抗体は、図9(A)に示すように、63位のアルギニンをアラニンに変えた変異体(以下、R63A変異体という。以下、変異体は、本来のアミノ酸の種類、アミノ酸の位置、変異後のアミノ酸の種類によって同様に表記する。)、あるいは68位のアスパラギン酸をアラニンに変えた変異体(D68A)をほとんど認識できなかった。また、L65A変異体、F66A変異体、及びE67A変異体は、野生型(レーン左端)の半分程度の認識しか示さなかった。また、11−4.1抗体は、N62A変異体、P64A変異体、M69A変異体、T70A変異体は野生型ペプチドと同様の認識を示した。
上記結果や、すでに報告されているヒトIL−18の結晶構造(非特許文献5)から、11−4.1抗体は、立体構造上表面に露出している63位のアルギニン(R)及び68位のアスパラギン酸(D)を中心に65位から67位までのロイシン−フェニルアラニン-グルタミン酸(LFE)を認識しているものと考えられる。
実施例1で取得した他の2種のモノクローナル抗体、4−18.1.4抗体、9−4.2.1抗体についても認識部位の解析を行った(図9(B))。4−18.1.4抗体、9−4.2.1抗体は、11−4.1抗体と同様に、R63A変異体、D68A変異体をほとんど認識できず、L65A変異体、F66A変異体、E67A変異体を野生型の半分程度の認識しかできなかった。また、M69A変異体及びT70A変異体は野生型同様に認識した。したがって、11−4.1抗体、4−18.1.4抗体、及び9−4.2.1抗体の3種類の抗体のエピトープは同一であると考えられる。すなわち、これら3種のモノクローナル抗体はRXLFED(配列番号5)をエピトープとして認識する抗体である。
また、樹立したハイブリドーマは、IsoStrip(商標)マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(シグマ・アルドリッチ社製)を用いてアイソタイプを確認した。11−4.1抗体、4−18.1.4抗体、及び9−4.2.1抗体のアイソタイプはいずれもIgG2b、κであった。
4−18.1.4抗体、及び9−4.2.1抗体は、11−4.1抗体とエピトープが同一であり、11−4.1抗体と同様に、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色、ELISAなど種々の手法で使用することができる。また、11−4.1抗体のように、IL−18の機能阻害活性を有し、IL−18が過剰発現することによって惹起される疾患の治療など臨床面でも応用することが可能である。
[実施例9]エピトープペプチドとの親和性解析
エピトープが明らかになり、また、得られたモノクローナル抗体の親和性が非常に高いと考えられることから、表面プラズモン共鳴解析によって、親和性の測定を行った。IL−18タンパク質のエピトープを含む60位から72位の配列にスペーサーとしてリンカー配列GSGSおよびクロスリンク用CysをC末端に付加したペプチド(QGNRPLFEDMTDSGSGSC、配列番号6)をリガンドチオールカップリング法によりセンサーチップCM5(GE Healthcare、BR100012)に固定化し解析した。
エピトープが明らかになり、また、得られたモノクローナル抗体の親和性が非常に高いと考えられることから、表面プラズモン共鳴解析によって、親和性の測定を行った。IL−18タンパク質のエピトープを含む60位から72位の配列にスペーサーとしてリンカー配列GSGSおよびクロスリンク用CysをC末端に付加したペプチド(QGNRPLFEDMTDSGSGSC、配列番号6)をリガンドチオールカップリング法によりセンサーチップCM5(GE Healthcare、BR100012)に固定化し解析した。
精製抗体11−4.1を0.08nM〜50nMの範囲で5濃度、5倍希釈系列でBiacore X100(GE Healthcare)を用いてsingle−cycleで測定した(図10)。解析はbivalent analysisで行った。実測値と適合解析データがほぼ一致しており、KD:1.25x10−11M、Ka:3.3x106M−1S−1、Kd:4.1x10−5s−1であった。実験的に非常に親和性が高いことが確かめられた。
[実施例10]抗体遺伝子の解析
次に、上記3種のモノクローナル抗体の遺伝子解析を行った。ハイブリドーマ11−4.1、4−18.1.4、9−4.2.1より夫々RNAを抽出後、oligo−dTプライマーを用いて逆転写しcDNAを作成した。合成したcDNAを、H鎖及びL鎖のプライマーセットを用いて、ダイレクトシークエンス法により超可変領域の抗体遺伝子の配列、及びアミノ酸配列を決定した。
次に、上記3種のモノクローナル抗体の遺伝子解析を行った。ハイブリドーマ11−4.1、4−18.1.4、9−4.2.1より夫々RNAを抽出後、oligo−dTプライマーを用いて逆転写しcDNAを作成した。合成したcDNAを、H鎖及びL鎖のプライマーセットを用いて、ダイレクトシークエンス法により超可変領域の抗体遺伝子の配列、及びアミノ酸配列を決定した。
用いたH鎖及びL鎖のプライマーの配列は以下のとおりである。
H鎖プライマー
VH1−1S:5′-ggggatcc ag gts mar ctg cag sag tcw gg-3′(配列番号7)
s=g+c、m=a+c、r=a+g、w=a+t
IgG2−1AS:5’-gggaattc ctt gac cag gca tcc tag agt ca-3’(配列番号8)
L鎖プライマー
VK−1S:5′-ggggatcc gay att gtg mts acm car wct mca -3′(配列番号9)
y=c+t、m=a+c、s=g+c、r=a+g、w=a+t
CK−2AS:5’-gggaattc gaa gat gga tac agt tgg tgc-3’(配列番号10)
H鎖プライマー
VH1−1S:5′-ggggatcc ag gts mar ctg cag sag tcw gg-3′(配列番号7)
s=g+c、m=a+c、r=a+g、w=a+t
IgG2−1AS:5’-gggaattc ctt gac cag gca tcc tag agt ca-3’(配列番号8)
L鎖プライマー
VK−1S:5′-ggggatcc gay att gtg mts acm car wct mca -3′(配列番号9)
y=c+t、m=a+c、s=g+c、r=a+g、w=a+t
CK−2AS:5’-gggaattc gaa gat gga tac agt tgg tgc-3’(配列番号10)
H鎖の遺伝子解析によって、11−4.1抗体の塩基配列(配列番号11)、アミノ酸配列(配列番号12)、4−18.1.4抗体の塩基配列(配列番号13)、アミノ酸配列(配列番号14)、9−4.2.1抗体の塩基配列(配列番号15)、アミノ酸配列(配列番号16)を決定した。また、L鎖の遺伝子解析によって、11−4.1抗体の塩基配列(配列番号17)、アミノ酸配列(配列番号18)、4−18.1.4抗体の塩基配列(配列番号19)、アミノ酸配列(配列番号20)、9−4.2.1抗体の塩基配列(配列番号21)、アミノ酸配列(配列番号22)を決定した。
これら抗体の各相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列、遺伝子配列について以下にまとめる。
遺伝子解析の結果、ハイブリドーマ11−4.1と4−18.1.4のCDR部分のアミノ酸配列は完全に一致していた。また、11−4.1と4−18.1.4の重鎖および軽鎖の可変領域の各1箇所アミノ酸配列が異なるのみで他の領域は比較した限りおいて一致していた。ハイブリドーマ11−4.1と9−4.2.1では重鎖のCDR1及びCDR2のアミノ酸配列が一部異なっていたが、それ以外のCDRはすべて一致していた。
したがって、これらCDRを有する抗体であれば、いずれも同じエピトープに結合し、同様の性質を示すものと結論づけた。以上、示してきたように、本明細書で開示した抗体は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色など、種々の実験に用いることができるだけではなく、IL−18の機能を阻害することができることから非常に有用な抗体である。
Claims (9)
- ヒトIL−18のRXLFED(配列番号5)をエピトープとして認識する抗IL−18モノクローナル抗体。
- 重鎖可変ドメインが、GYAFTKYY(配列番号23)、又はGYTFTDYY(配列番号36)のアミノ酸配列からなるCDR1H領域、
INPNNGGT(配列番号24)、又はINPKNGGS(配列番号37)のアミノ酸配列からなるCDR2H領域、
AKLGLDFDC(配列番号25)のアミノ酸配列からなるCDR3H領域を含み、
軽鎖可変ドメインが、LLYSNGKTY(配列番号26)のアミノ酸配列からなるCDR1L領域、
LVS(配列番号27)のアミノ酸配列からなるCDR2L領域、
VQGTHFPYT(配列番号28)のアミノ酸配列からなるCDR3L領域を含むことを特徴とする請求項1記載の抗IL−18モノクローナル抗体。 - H鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号12、配列番号14、配列番号16のいずれか1つであり、
L鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号18、配列番号20、配列番号22のいずれか1つであることを特徴とする請求項1、又は2記載の抗IL−18モノクローナル抗体 - 請求項2記載のCDR配列、又は請求項3記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
- 請求項1〜3いずれか1項記載の抗IL−18モノクローナル抗体の機能的断片。
- 請求項1〜3いずれか1項記載のモノクローナル抗体、又は請求項5記載のモノクローナル抗体の機能的断片を含む、
IL−18を検出、及び/又は定量するためのキット。 - 請求項2のCDR、又は請求項3の可変領域と
ヒト定常領域を備えている抗IL−18ヒト化抗体。 - 請求項1〜3いずれか1項記載のモノクローナル抗体、又は請求項5記載のモノクローナル抗体の機能的断片を有効成分として含む、
IL−18関連疾患の治療に用いる医薬組成物。 - 請求項1〜3いずれか1項記載のモノクローナル抗体、請求項5記載のモノクローナル抗体の機能的断片、又は請求項6記載のキットを使用して、
活性型IL−18を検出及び/又は定量することを特徴とするIL−18関連疾患の検査方法。
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