JPWO2019156240A1 - グアノシン−３’，５’−ビスジホスフェートの製造方法及びその製造中間体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、グアノシン−３’，５’−ビスジホスフェートの製造方法、及びその製造中間体に関する。
Description
本発明は、グアノシン−３’，５’−ビスジホスフェート（以下で「ｐｐＧｐｐ」とも呼ぶ）の製造方法及びその製造中間体に関する。
細菌などの微生物には、アミノ酸欠乏状態による生命の危機的状況からの打開策として、生体内反応を制御する機構が備わっている。このような機構は緊縮応答と呼ばれており、緊縮応答機構の中心分子がｐｐＧｐｐであることが知られている。
微生物におけるｐｐＧｐｐの合成は、ＲｅｌＡ及びＳｐｏＴと呼ばれる２つの酵素により触媒される。これらの酵素は、ＡＴＰのβγ位のピロリン酸をＧＴＰ若しくはＧＤＰの３’端に転移することでｐｐＧｐｐを合成する。生合成されたｐｐＧｐｐは、微生物中の転写、翻訳、複製及びＧＴＰの生合成を阻害し、アミノ酸欠乏状態が解消されるまで、無駄なエネルギー消費を抑制する働きをする。アミノ酸合成酵素は阻害されないため、微生物中に徐々にアミノ酸が蓄えられる。飢餓状態を脱するとｐｐＧｐｐ合成は抑制され、生体内反応が回復する。ＲｅｌＡタンパク質はｐｐＧｐｐの合成活性のみ有しているが、ＳｐｏＴタンパク質はｐｐＧｐｐの合成活性と分解活性を有しており、飢餓状態を脱した後はｐｐＧｐｐの分解作業を担っている。
近年、植物の成長においてもｐｐＧｐｐが機能していることが明らかになった（非特許文献１及び２）。高等生物におけるｐｐＧｐｐの作用は、今後研究されるべき興味深い課題である。
ｐｐＧｐｐは市販されているが、その供給は主に酵素合成によって行われている。また、ｐｐＧｐｐを化学合成により製造する方法も報告されている（非特許文献３）。
Maekawa M. et al., Nat Plants. 2015, 1, 15167
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生物におけるｐｐＧｐｐの作用を研究する上で、ｐｐＧｐｐの安価かつ安定な供給が不可欠である。しかし、現在市販されているｐｐＧｐｐは非常に高価であり、そのことが当該研究の進展を阻害する一因となっている。
現在の主流である酵素によるｐｐＧｐｐ合成は大量合成には適していない。また、非特許文献３に記載のｐｐＧｐｐの化学合成法は、その精製工程にイオン交換クロマトグラフィーによる精製を含む。イオン交換クロマトグラフィーでは粘性の高い水系の溶媒を用いて溶出するため、流速が遅い。また、緩衝液を用いて溶出するため、精製後に脱塩処理を行う必要がある。さらに、非特許文献３に記載のグアノシン３’、５’−ビスホスフェートからｐｐＧｐｐの製造方法は、その総収率が約５％と極めて低収率である。したがって、非特許文献３の方法は低効率であり、ｐｐＧｐｐの大量合成には適していない。
したがって本発明は、ｐｐＧｐｐを効率的に製造することができる方法の提供を課題とする。
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、ｐｐＧｐｐの効率的製造に適した製造中間体を見出し、本発明に至った。
本発明は、以下の＜１＞〜＜９＞を包含する。
＜１＞
式（Ｉ）：
で表される化合物又はその塩の製造方法であって、
式（ＩＩ）：
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基である］
で表される化合物又はその塩から、Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5を除去する工程
を含む、製造方法
＜２＞
Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5を除去する前記工程が、
式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩からＲ4及びＲ5を除去して、式（ＩＩＩ）：
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩を得る工程；及び
前記（ＩＩＩ）の化合物又はその塩からＳｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）を除去して式（Ｉ）の化合物又はその塩を得る工程
から成る、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞
式（ＩＶ）：
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（Ｖ）：
［式中、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基であり、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、活性化剤の存在下で反応させて、式（ＶＩ）：
で表される化合物又はその塩を得る工程、及び
式（ＶI）の化合物又はその塩を酸化して、式（ＩＩ）の化合物又はその塩を得る工程；
をさらに含む、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞
Ｒ1及びＲ2はメチルであり、Ｒ3はｔｅｒｔ−ブチルであり、そしてＲ4及びＲ5はベンジルである、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜５＞
式（ＶＩＩ）
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立してＣ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである
Ｒ8は、ＮＨＲ9又はＮ＝ＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）であり、
Ｒ9は塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ10及びＲ11はそれぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（ＶＩＩＩ）：
［式中、
Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ14及びＲ15は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、活性化剤の存在下で反応させて、式（ＩＸ）：
で表される化合物又はその塩を得る工程；
式（ＩＸ）の化合物を酸化して、式（Ｘ）：
で表される化合物又はその塩を得る工程、及び
式（Ｘ）の化合物から、Ｒ9又はＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）、並びにＲ12及びＲ13を除去することによって、式（ＩＶ）の化合物又はその塩を得る工程
をさらに含む、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜６＞
Ｒ12及びＲ13は２−シアノエチルであり、Ｒ8はＮ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ3）2である、＜５＞に記載の製造方法。
＜７＞
式（ＩＩ）：
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基である］
で表される化合物又はその塩。
＜８＞
式（ＩＩＩ）：
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩。
＜９＞
式（ＩＶ）：
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩。
＜１＞
式（Ｉ）：
式（ＩＩ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基である］
で表される化合物又はその塩から、Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5を除去する工程
を含む、製造方法
＜２＞
Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5を除去する前記工程が、
式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩からＲ4及びＲ5を除去して、式（ＩＩＩ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩を得る工程；及び
前記（ＩＩＩ）の化合物又はその塩からＳｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）を除去して式（Ｉ）の化合物又はその塩を得る工程
から成る、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞
式（ＩＶ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（Ｖ）：
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基であり、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、活性化剤の存在下で反応させて、式（ＶＩ）：
式（ＶI）の化合物又はその塩を酸化して、式（ＩＩ）の化合物又はその塩を得る工程；
をさらに含む、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞
Ｒ1及びＲ2はメチルであり、Ｒ3はｔｅｒｔ−ブチルであり、そしてＲ4及びＲ5はベンジルである、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜５＞
式（ＶＩＩ）
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立してＣ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである
Ｒ8は、ＮＨＲ9又はＮ＝ＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）であり、
Ｒ9は塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ10及びＲ11はそれぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（ＶＩＩＩ）：
Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ14及びＲ15は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、活性化剤の存在下で反応させて、式（ＩＸ）：
式（ＩＸ）の化合物を酸化して、式（Ｘ）：
式（Ｘ）の化合物から、Ｒ9又はＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）、並びにＲ12及びＲ13を除去することによって、式（ＩＶ）の化合物又はその塩を得る工程
をさらに含む、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜６＞
Ｒ12及びＲ13は２−シアノエチルであり、Ｒ8はＮ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ3）2である、＜５＞に記載の製造方法。
＜７＞
式（ＩＩ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基である］
で表される化合物又はその塩。
＜８＞
式（ＩＩＩ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩。
＜９＞
式（ＩＶ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩。
本発明によれば、ｐｐＧｐｐを効率的に製造することが可能である。
＜＜定義＞＞
本明細書において、「Ｃ1-10アルキル」とは、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基である。Ｃ1-10アルキルには、例えばＣ1-7アルキルおよびＣ1-5アルキルなどが含まれる。Ｃ1-10アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど挙げられる。
本明細書において、「Ｃ1-10アルキル」とは、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基である。Ｃ1-10アルキルには、例えばＣ1-7アルキルおよびＣ1-5アルキルなどが含まれる。Ｃ1-10アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど挙げられる。
本明細書において、「Ｃ4-10シクロアルキル」とは、炭素数４〜１０の環状アルキル基である。Ｃ4-10シクロアルキルには、例えばＣ4-8シクロアルキルおよびＣ4-6シクロアルキルなどが含まれる。Ｃ4-10シクロアルキルの例としては、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシルなどが挙げられる。
本明細書において、「塩」は、酸付加塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、及びアミン塩を含む。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩のような無機酸塩、または酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、またはグルコン酸塩のような有機酸塩が挙げられる。アルカリ金属塩としては、例えば、カリウム塩およびナトリウム塩などが挙げられる。アルカリ土類金属塩としては、例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩などが挙げられる。アンモニウム塩としては、例えば、テトラメチルアンモニウム塩などが挙げられる。アミン塩としては、例えば、トリエチルアミン塩、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）塩、メチルアミン塩、ジメチルアミン塩、シクロペンチルアミン塩、ベンジルアミン塩、フェネチルアミン塩、ピペリジン塩、モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、リジン塩、アルギニン塩、およびＮ−メチル−Ｄ−グルカミン塩などが挙げられる。本願発明の方法によって製造されるｐｐＧｐｐ及びその製造中間体は、当業者に周知の方法で塩に変換することができる。
＜＜ｐｐＧｐｐの製造方法＞＞
本発明の一態様は、式（Ｉ）：
で表される化合物（ｐｐＧｐｐ）又はその塩の製造方法であって、
式（ＩＩ）：
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基である］
で表される化合物又はその塩から、Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5を除去する工程
を含む、製造方法である。以下で「本発明のｐｐＧｐｐの製造方法」と呼ぶ。
本発明の一態様は、式（Ｉ）：
式（ＩＩ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基である］
で表される化合物又はその塩から、Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5を除去する工程
を含む、製造方法である。以下で「本発明のｐｐＧｐｐの製造方法」と呼ぶ。
ｐｐＧｐｐの効率的合成を達成するにあたり、ｐｐＧｐｐ及びその合成中間体の精製が容易であることが好ましい。式（ＩＩ）の化合物は、５’水酸基側のβ−リン酸と５’水酸基側のβ−リン酸とが保護されているため、リン酸が保護されていない化合物と比較して脂溶性が高い。また、２’水酸基の保護基として脂溶性の高いシリル型保護基が導入されている。したがって、式（ＩＩ）の化合物は、有機溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフフィーや再沈殿など、大量合成に適した方法で効率的に精製することが可能である。また、２’水酸基のシリル型保護基は、３’水酸基に導入されたリン酸の隣接基関与により、緩和な酸性条件で除去可能である。
精製及び脱保護の容易性などの観点から、２’水酸基の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）（Ｒ1及びＲ2＝メチル；Ｒ3＝ｔｅｒｔ−ブチル）、トリエチルシリル（Ｒ1、Ｒ2及びＲ3＝エチル）、トリイソプロピルシリル（Ｒ1、Ｒ2及びＲ3＝イソプロピル）などが好ましく、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルがより好ましい。
Ｒ4及びＲ5としては特に限定されないが、例えば、酸性条件下で除去可能な保護基、塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基を使用することができる。好ましくは、塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基である。塩基性条件下で除去可能な保護基の例としては、２−シアノエチル、フルオレニルメチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチルを挙げることができる。還元条件下で除去可能な保護基の例としては、ベンジル、４−メトキシベンジル、ナフチルメチルを挙げることができる。光反応により除去可能な保護基の例としては、２−ニトロベンジル基、２−ニトロフェニルエチルを挙げることができる。精製及び脱保護の容易性などの観点から、ベンジルが好ましい。
式（ＩＩ）の化合物又はその塩から、Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5が除去される順番は、使用される保護基の性質に応じて適宜選択することができる。例えば、Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5の除去は、同時に行われてもよい。あるいは、Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）を除去した後に、Ｒ4及びＲ5を除去してもよい。あるいは、Ｒ4及びＲ5を除去して、以下の式（ＩＩＩ）の化合物又はその塩を得た後に、Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）を除去してもよい。
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである。］
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである。］
Ｒ4及びＲ5の除去条件は、使用される保護基の種類に応じて適宜選択することができる。Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）は、中性の含水有機溶媒処理、酸性処理（例えばｐＨ３以上ｐＨ７未満での処理）またはフッ化物イオン処理によって、あるいはこれらの処理を組み合わせることによって除去可能である。含水溶媒処理において、含水有機溶媒中の有機溶媒としては、水と混合する有機溶媒であればいずれも使用できる。極性有機溶媒が好ましい。極性溶媒としては、例えば、低級アルコール（例えばメタノール、エタノール）、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、アセトン、ヘキサメチルホスホリックトリアミド（ＨＭＰＡ）等が挙げられる。含水有機溶媒処理の場合、例えば２０℃〜６０℃で行われ得る。酸性処理は、特に限定されないが、例えば酢酸水を用いて行なうことができる。フッ化物イオン処理は、特に限定されないが、例えば、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、ジフルオロトリメチルケイ酸トリス（ジメチルアミノ）スルホニウム（ＴＡＳＦ）、ＨＦ−ピリジン錯体、ＨＦ−トリエチルアミン錯体）などを用いて行うことができる。Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）の除去は、好ましくは中性の含水有機溶媒処理又は酸性処理で行われる。
好ましい実施形態において、式（ＩＩ）中、Ｒ1及びＲ2はメチルであり、Ｒ3はｔｅｒｔ−ブチルであり、そしてＲ4及びＲ5はベンジルである。これらの保護基を使用した場合、除去後に生じる副生物をｐｐＧｐｐから容易に分離することができるため、ｐｐＧｐｐを首尾よく単離することができる。これらの保護基を使用する場合、例えばＰｄ触媒存在下で水素添加することによりベンジルを除去した後、中性の含水有機溶媒処理もしくは酸性処理（例えばｐＨ３以上ｐＨ７未満）によりｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルを除去することにより、ｐｐＧｐｐを製造することができる。
式（ＩＩ）の化合物は、以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を経て製造されてもよい。
（Ａ）式（ＩＶ）：
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（Ｖ）：
［式中、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基であり、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、塩基及び活性化剤の存在下で反応させて、式（ＶＩ）：
で表される化合物又はその塩を得る工程、及び
（Ｂ）式（ＶＩ）の化合物又はその塩を酸化する工程。
（Ａ）式（ＩＶ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（Ｖ）：
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基であり、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、塩基及び活性化剤の存在下で反応させて、式（ＶＩ）：
（Ｂ）式（ＶＩ）の化合物又はその塩を酸化する工程。
式（ＩＶ）の化合物又はその塩は、式（ＩＩ）の化合物を効率的に製造するために極めて有用な出発物質である。
脱離基を連結して活性化した式（ＩＶ）の化合物の３’及び５’リン酸基をリン酸と反応させると、分子内環化反応が進行して目的とする式（ＩＩ）の化合物を得ることができない。本発明者らは、式（ＩＶ）の化合物の３’及び５’リン酸基を求核剤として、ホスホロアミダイト試薬と反応させることによって、副反応を回避して目的とする式（ＩＩ）の化合物を製造できることを見出した。
工程（Ａ）で使用される式（Ｖ）のホスホロアミダイトにおいて、Ｒ6及びＲ7は、好ましくはそれぞれ独立して、エチル又はイソプロピルであるか、あるいは隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する。より好ましくはイソプロピルである。工程（Ａ）で使用される、式（ＩＶ）の化合物又はその塩と、式（Ｖ）のホスホロアミダイトとのモル比は、好ましくは１：２〜１：１０であり、より好ましくは１：４である。式（Ｖ）のホスホロアミダイトは、当業者に周知の方法によって製造することができる。また、式（Ｖ）のホスホロアミダイトとして市販品を使用してもよい。
工程（Ａ）において、塩基が使用されてもよい。塩基としては反応が進行する限り特に限定されないが、例えばトリ（ｎ−ブチル）アミン、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、N−メチルモルホリン、N−メチルピロリジン、N−メチルピペリジン、又はそれらの混合物が挙げられる。トリ（ｎ−ブチル）アミン、ＤＢＵ、又はそれらの混合物が好ましい。工程（Ａ）で使用される、式（ＩＶ）の化合物又はその塩と、塩基とのモル比は、好ましくは１：２〜１：６であり、より好ましくは１：４である。
工程（Ａ）で使用される活性化剤は、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、
ピリジン塩酸塩；
ピリジウムトリフラート等のピリジンスルホン酸塩；
ピリジウムテトラフルオロボレート等のピリジンホウ酸塩；
４，５−ジシアノイミダゾール、４，５−ジクロロイミダゾール等のイミダゾール；
５−ベンジルテトラゾール、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、１Ｈ−テトラゾール、５−（３，５−ビストリフルオロメチルフェニル）−１Ｈ−テトラゾール等のテトラゾール；
イミダゾリウムトリフラート等のイミダゾールスルホン酸塩；
５−ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート等のベンズイミダゾールスルホン酸塩；
トリアゾリウムトリフラート等のトリアゾールスルホン酸塩；
１−ヒドロキシベンズトリアゾール等のＮ−ヒドロキシトリアゾール；
トリアゾール；
Ｎ−（シアノメチル）ピロリジニウムテトラフルオロボレート等のＮ−（シアノメチル）アミンホウ酸塩；
Ｎ−（シアノメチル）ピロリジニウムトリフラート等のＮ−（シアノメチル）アミンスルホン酸塩；及び
Ｎ−（シアノメチル）ピロリジニウムヘキサフルオロホスフェート等のＮ−（シアノメチル）アミンリン酸塩
等を挙げることができる。５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールが好ましい。工程（Ａ）で使用される、式（Ｖ）のホスホロアミダイトと、活性化剤とのモル比は、好ましくは１：１〜１：６であり、より好ましくは、１：１〜１：５、１：１〜１：４、１：１〜１：３、又は１：１〜１：２である。
ピリジン塩酸塩；
ピリジウムトリフラート等のピリジンスルホン酸塩；
ピリジウムテトラフルオロボレート等のピリジンホウ酸塩；
４，５−ジシアノイミダゾール、４，５−ジクロロイミダゾール等のイミダゾール；
５−ベンジルテトラゾール、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、１Ｈ−テトラゾール、５−（３，５−ビストリフルオロメチルフェニル）−１Ｈ−テトラゾール等のテトラゾール；
イミダゾリウムトリフラート等のイミダゾールスルホン酸塩；
５−ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート等のベンズイミダゾールスルホン酸塩；
トリアゾリウムトリフラート等のトリアゾールスルホン酸塩；
１−ヒドロキシベンズトリアゾール等のＮ−ヒドロキシトリアゾール；
トリアゾール；
Ｎ−（シアノメチル）ピロリジニウムテトラフルオロボレート等のＮ−（シアノメチル）アミンホウ酸塩；
Ｎ−（シアノメチル）ピロリジニウムトリフラート等のＮ−（シアノメチル）アミンスルホン酸塩；及び
Ｎ−（シアノメチル）ピロリジニウムヘキサフルオロホスフェート等のＮ−（シアノメチル）アミンリン酸塩
等を挙げることができる。５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールが好ましい。工程（Ａ）で使用される、式（Ｖ）のホスホロアミダイトと、活性化剤とのモル比は、好ましくは１：１〜１：６であり、より好ましくは、１：１〜１：５、１：１〜１：４、１：１〜１：３、又は１：１〜１：２である。
工程（Ａ）において使用される溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン又はそれらの混合溶媒が挙げられる。工程（Ａ）における反応温度は、−７８℃〜３０℃が好ましく、０℃〜３０℃がより好ましい。
工程（Ａ）の反応における試薬の混合順序は、反応が進行する限り特に限定されない。例えば、溶媒に全ての試薬を同時に添加して混合してもよいし、溶媒に段階的に試薬を添加して混合してもよい。好ましくは、式（Ｖ）のホスホロアミダイトと活性化剤とを溶媒中で混合してホスホロアミダイトを活性化した後、当該混合溶液を、式（ＩＶ）の化合物又はその塩の溶液に添加することによって行われる。
工程（Ｂ）の反応において、酸化剤としては、例えばヨウ素、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、カンファースルホニルオキサジリジンなどを使用することができる。ヨウ素及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドが好ましい。
工程（Ｂ）において使用される溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、ジクロロメタン、ピリジン、テトラヒドロフラン又はそれらの混合溶媒が挙げられる。工程（Ｂ）における反応温度は、反応が進行する限り特に限定されないが、−７８℃〜３０℃が好ましく、０℃〜３０℃がより好ましい。
工程（Ｂ）の反応は、工程（Ａ）で得られる式（ＶＩ）の化合物を精製及び単離した後に行われてもよいし、工程（Ａ）の反応が進行した後に、当該反応液に酸化剤を添加することによって行われてもよい。
式（ＩＶ）の化合物又はその塩は、例えば以下の工程（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）を経て製造されてもよい。
（Ｃ）式（ＶＩＩ）
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ8は、ＮＨＲ9又はＮ＝ＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）であり、
Ｒ9は塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ10及びＲ11はそれぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（ＶＩＩＩ）：
［式中、
Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ14及びＲ15は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、活性化剤の存在下で反応させて、式（ＩＸ）：
で表される化合物又はその塩を得る工程；
（Ｄ）式（ＩＸ）の化合物又はその塩を酸化して、式（Ｘ）：
で表される化合物又はその塩を得る工程、及び
（Ｅ）式（Ｘ）の化合物又はその塩から、Ｒ9又はＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）、並びにＲ12及びＲ13を除去することによって、式（ＩＶ）の化合物又はその塩を得る工程。
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ8は、ＮＨＲ9又はＮ＝ＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）であり、
Ｒ9は塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ10及びＲ11はそれぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（ＶＩＩＩ）：
Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ14及びＲ15は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、活性化剤の存在下で反応させて、式（ＩＸ）：
（Ｄ）式（ＩＸ）の化合物又はその塩を酸化して、式（Ｘ）：
（Ｅ）式（Ｘ）の化合物又はその塩から、Ｒ9又はＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）、並びにＲ12及びＲ13を除去することによって、式（ＩＶ）の化合物又はその塩を得る工程。
工程（Ｃ）で使用される式（ＶＩＩ）の化合物又はその塩は、当業者に周知の方法で製造することができる。
式（ＶＩＩ）中、Ｒ8は、ＮＨＲ9又はＮ＝ＣＨ−Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）である。ここで、Ｒ9は塩基性条件下で除去可能な保護基（例えば、アシル）、還元条件下で除去可能な保護基（例えばベンジルオキシカルボニル）、又は光反応により除去可能な保護基（例えば２−ニトロベンジルオキシカルボニル）である。好ましくは塩基性条件下で除去可能な保護基であり、より好ましくはアシル（例えばイソブチリル）である。また、＝ＣＨ−Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）は塩基性条件で除去可能な保護基であり、ここでＲ10及びＲ11はそれぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、好ましくはＲ10及びＲ11はいずれもメチルである。
式（ＶＩＩ）の化合物は、好ましくは、Ｒ1及びＲ2がメチルであり、Ｒ3がｔｅｒｔ−ブチルであり、Ｒ8がＮ＝ＣＨ-Ｎ（ＣＨ3）2である化合物である。
工程（Ｃ）で使用される式（ＶＩＩＩ）のホスホロアミダイトにおいて、Ｒ14及びＲ15は、好ましくはそれぞれ独立して、エチル又はイソプロピルであるか、あるいは隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する。より好ましくは、Ｒ14及びＲ15はイソプロピルである。
工程（Ｃ）で使用される式（ＶＩＩＩ）のホスホロアミダイトにおいて、Ｒ12及びＲ13としては、塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基及び光反応により除去可能な保護基から成る群から選択される。塩基性条件下で除去可能な保護基の例としては、２−シアノエチル、フルオレニルメチル基、２−（４−ニトロフェニル）エチルを挙げることができる。還元条件下で除去可能な保護基の例としては、ベンジル、４−メトキシベンジル、ナフチルメチルを挙げることができる。光反応により除去可能な保護基の例としては、２−ニトロベンジル基、２−ニトロフェニルエチルを挙げることができる。精製及び脱保護の容易性などの観点から、２−シアノエチルが好ましい。
工程（Ｃ）で使用される、式（ＶＩＩ）の化合物又はその塩と、式（ＶＩＩＩ）のホスホロアミダイトとのモル比は、好ましくは１：２〜１：１０であり、より好ましくは、１：２〜１：５、１：２〜１：４、又は１：２〜１：３である。式（ＶＩＩＩ）のホスホロアミダイトは、当業者に周知の方法によって製造することができる。また、式（ＶＩＩＩ）のホスホロアミダイトとして市販品を使用してもよい。
工程（Ｃ）で使用される活性化剤は、工程（Ａ）で使用されたものと同様のものを使用することができる。好ましくは、１Ｈ-テトラゾールである。工程（Ｃ）で使用される、式（ＶＩＩＩ）のホスホロアミダイトと、活性化剤とのモル比は、好ましくは１：１〜１：６であり、より好ましくは１：１〜１：５、１：１〜１：４、１：１〜１：３、又は１：１〜１：２である。
工程（Ｃ）において使用される溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えばアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン又はそれらの混合溶媒が挙げられる。工程（Ｃ）における反応温度は、−７８℃〜３０℃が好ましく、０℃〜３０℃がより好ましい。
工程（Ｃ）の反応における試薬の混合順序は、反応が進行する限り特に限定されない。例えば、溶媒に全ての試薬を同時に添加して混合してもよいし、溶媒に段階的に試薬を添加して混合してもよい。好ましくは、工程（Ｃ）の反応は、好ましくは、式（ＶＩＩＩ）のホスホロアミダイトと活性化剤とを溶媒中で混合してホスホロアミダイトを活性化した後、当該混合溶液を、式（ＶＩ）の化合物又はその塩の溶液に添加することによって行われる。
工程（Ｄ）の反応において、酸化剤は工程（Ｂ）と同様のものを使用することができる。工程（Ｄ）において使用される溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、ジクロロメタン、ピリジン、テトラヒドロフラン又はそれらの混合溶媒が挙げられる。工程（Ｄ）における反応温度は、反応が進行する限り特に限定されないが、−７８℃〜３０℃が好ましく、０℃〜３０℃がより好ましい。
工程（Ｄ）の反応は、工程（Ｃ）で得られる式（ＩＸ）の化合物を精製及び単離した後に行われてもよいし、工程（Ｃ）の反応が進行した後に、当該反応液に酸化剤を添加することによって行われてもよい。
工程（Ｅ）の反応において、式（Ｘ）の化合物からＲ9又はＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）、並びにＲ12及びＲ13が除去される順番は、使用される保護基の性質に応じて適宜選択することができる。例えば、式（Ｘ）の化合物からのＲ9又はＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）、並びにＲ12及びＲ13の除去は、同時に行われてもよい。あるいは、Ｒ9又はＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）を除去した後に、Ｒ12及びＲ13を除去してもよい。あるいは、Ｒ12及びＲ13を除去した後に、Ｒ9又はＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）を除去してもよい。
保護基の除去の除去条件、使用される溶媒及び反応温度は、使用される保護基の種類に応じて適宜選択することができる。
一実施形態において、式（Ｘ）中、Ｒ1及びＲ2はメチルであり、Ｒ3はｔｅｒｔ−ブチルであり、Ｒ12及びＲ13は２−シアノエチルであり、Ｒ8はＮ＝ＣＨ-Ｎ（ＣＨ3）2である。これらの保護基を使用した場合、除去後に生じる副生物は式（ＩＶ）の化合物から容易に分離することができるため、式（ＩＶ）の化合物を首尾よく精製及び単離することができる。これらの保護基を使用する場合、アルカリ性処理（例えばアンモニア水処理、メチルアミン溶液処理、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなど金属水酸化物の水溶液処理、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの炭酸塩の水溶液処理）により、２−シアノエチル及びＣＨ-Ｎ（ＣＨ3）2を同時に除去することにより、式（ＩＶ）の化合物又はその塩を製造することができる。
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１
テトラキス（２−シアノエチル）２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−Ｎ−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン３’，５’−ジホスフェート（１）の製造
２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−Ｎ−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（４．０ｇ，８．８ｍｍｏｌ）（Chin, S. A.; Tan, W. J.; Chua K. L.; Lam, Y. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 6657-6665 に記載の方法によって製造）をピリジンで４回、トルエンで４回共沸乾燥した。残渣をアセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解し、１Ｈ−テトラゾール（１．４ｇ，１９．４ｍｍｏｌ）とビス（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（５．１ｍＬ，１９．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（５０ｍＬ）で３回、飽和食塩水（５０ｍＬ）で１回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、固体を濾過した後、濾液を減圧下濃縮した。残渣をアセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却後、５．５Ｍ ｔ−ＢｕＯＯＨ（６．４ｍＬ，３５．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応系を室温に戻して３０分撹拌した後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物５．２ｇ（７１％）を得た。
テトラキス（２−シアノエチル）２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−Ｎ−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン３’，５’−ジホスフェート（１）の製造
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.4 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 5.90 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 5.09 (m, 1H), 5.06 (m, 1H), 4.44 (m, 1H), 4.41-4.33 (m, 2H), 4.26 (m, 4H), 4.22-4.18 (m, 2H), 4.16-4.12 (m, 2H), 3.17 (s, 3H), 3.03 (s, 3H), 2.99-2.96 (m, 4H), 2.92 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.88-2.86 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 0.72 (s, 9H), -0.03 (s, 3H), -0.20 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 158.2, 158.0, 157.8, 150.4, 137.3, 120.5, 119.3, 119.2, 119.1, 86.9, 58.2, 58.1, 58.0, 57.9, 57.7, 57.6, 41.3, 35.2, 25.9, 20.1, 18.1, -4.5, -5.0.
31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ -1.04, -1.27.
HRMS (ESI-TOF) calcd for C31H46N10O11P2SiNa [M+Na] 847.2490, found 847.2502.
HRMS (ESI-TOF) calcd for C31H46N10O11P2SiNa [M+Na] 847.2490, found 847.2502.
実施例２
２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジホスフェート ２トリエチルアンモニウム塩（２）の製造
実施例１で製造したテトラキス（２−シアノエチル）２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−Ｎ−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン３’，５’−ジホスフェート（２０ｍｇ，２０μｍｏｌ）を２８％アンモニア水（１ｍＬ）に溶解し、５０℃で１３時間反応した。溶媒を減圧下留去し、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液に溶解し、逆相カートリッジカラムに充填した２％トリエチルアミン（エタノール−水，７：３，ｖ／ｖ）で溶出し、目的物を収率６２％で得た。
２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジホスフェート ２トリエチルアンモニウム塩（２）の製造
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.05 (s. 1H), 5.77 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.59 (s, 1H), 4.58 (s, 1H), 4.51 (s, 1H), 4.01 (m, 2H), 0.49 (s, 9H), -0.16 (s, 3H), -0.26 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, D2O) δ 158.6, 154.0, 151.8, 137.0, 115.7, 86.2, 83.9, 75.4, 73.8, 64.3, 25.0, 17.4, -5.6, -6.3.
31P NMR (162 MHz, D2O) δ 1.26, -0.06.
HRMS (ESI-TOF) calcd for C16H29N5O11P2Si- [M-H] 556.1035, found 556.1022
実施例３
２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジ（ジベンジル ピロホスフェート）（３）の製造
実施例２で製造した２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジホスフェート ２トリエチルアンモニウム塩（１１７μｍｏｌ）をピリジン（２ｍＬ）に溶解し、トリ（ｎ−ブチル）アミン（５６μＬ，２３４μｍｏｌ）とＤＢＵ（３５μＬ，２３４μｍｏｌ）を加えた。溶媒を減圧下留去し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）とアセトニトリル（１．２ｍＬ）を加えた。この溶液にジベンジルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（１５７μＬ，４６８μｍｏｌ）と５−エチルチオテトラゾール（６２ｍｇ，４６８μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。５．５ＭのｔＢｕＯＯＨ（３４０μＬ，１．８７ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分撹拌した。反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、目的物（８０％）を得た。
２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジ（ジベンジル ピロホスフェート）（３）の製造
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6-MeOD-d3) δ 8.11 (s, 1H), 7.30 (m, 20H), 5.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.06 (m, 8H), 4.85 (m, 1H), 4.80 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.71 (m, 1H), 4.18 (m, 2H), 0.65 (s, 9H), -0.03 (s, 3H), -0.19 (s, 3H).
31P NMR (162 MHz, DMSO-d6-MeOD-d3) δ -12.5 (d, J = 18.1 Hz, 1P), -12.9 (d, J = 18.9 Hz, 1P), -13.1 (d, J = 18.9 Hz, 1P), -13.8 (d, J = 18.1 Hz, 1P).
HRMS (ESI-TOF) calcd for C44H54N5O17P4Si- [M-H] 1076.2240, found 1076.2209.
実施例４
２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジピロホスフェート（４）の製造
実施例３で製造した２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジ（ジベンジルピロホスフェート）（７１ｍｇ，４０μｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、１０ｗｔ％Ｐｄ／Ｃを加えた。この懸濁液を水素雰囲気下、室温で４時間撹拌した。４時間後、触媒を濾過で除去し、溶媒を減圧下留去し、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、０．６Ｍ ＮａＣｌＯ4のアセトン溶液（１０ｍＬ）を加えた。この懸濁液を４°Ｃで１時間遠心分離し、その後溶媒を除去した。沈殿のうち２５μｍｏｌ分をメタノール−水（１：１，ｖ／ｖ、２ｍＬ）に溶解し、１０ｗｔ％Ｐｄ／Ｃを加えた．この懸濁液を水素雰囲気下、室温で１時間撹拌した。溶媒を留去し、目的物（3 mL水中51.262 abs, 13.4 μmol, 34%)を得た。
２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジピロホスフェート（４）の製造
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.06 (s, 1H), 5.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.24 (m, 1H), 4.16 (m, 2H), 0.56 (s, 9H), -0.05 (s, 3H), -0.10 (s, 3H).
31P NMR (162 MHz, D2O) δ -10.1 (m, 2P), -11.3 (m, 1P). -12.0 (m, 1P).
HRMS (ESI-TOF) calcd for C16H30N5O17P4Si- [M-H] 716.0362, found 716.0348.
実施例５
グアノシン３’，５’−ジピロホスフェート（５）の製造
実施例４で製造した２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジ（ジベンジル ピロホスフェート）を８％酢酸水に溶かし、２４時間放置した。反応液中に目的物を確認した。
HRMS (ESI-TOF) calcd for C10H16N5O17P4 -, [M-H] 601.9497, found 601.9512
グアノシン３’，５’−ジピロホスフェート（５）の製造
実施例４で製造した２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジ（ジベンジル ピロホスフェート）を８％酢酸水に溶かし、２４時間放置した。反応液中に目的物を確認した。
HRMS (ESI-TOF) calcd for C10H16N5O17P4 -, [M-H] 601.9497, found 601.9512
実施例６
グアノシン３’，５’−ジピロホスフェート（５）の製造及び単離
実施例４で製造した２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジ（ジベンジル ピロホスフェート）（４．７６μｍｏｌ）を８％酢酸水に（１ｍＬ）に溶かし、６時間放置した。反応の進行を逆相ＨＰＬＣ（装置名：日本ウォーターズ社製ｅ２６９５；カラム：日本ウォーターズ社製ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８ （５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）；ＵＶ検出器：Ｗａｔｅｒｓ２９９８；波長２６０ｎｍで検出）で追跡した。反応の進行終了後、重炭酸水素ナトリウム（１．４ｍｍｏｌ，１１８．４ｍｇ）を加え、中和を行い、反応を終了させた。１００ｍＭのヘキサフルオロ２−プロパノール８ｍＭトリエチルアミン緩衝溶液を用いて粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（装置名：日本分光社製ＵＶ−４０７０；カラム：日本ウォーターズ社製ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８ ＯＢＤ Ｐｒｅｐ（商標）５μｍ、１０×２５０ｍｍ）で単離し、目的物（１．２１μｍｏｌ，２５％）を得た。
グアノシン３’，５’−ジピロホスフェート（５）の製造及び単離
実施例４で製造した２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−グアノシン３’，５’−ジ（ジベンジル ピロホスフェート）（４．７６μｍｏｌ）を８％酢酸水に（１ｍＬ）に溶かし、６時間放置した。反応の進行を逆相ＨＰＬＣ（装置名：日本ウォーターズ社製ｅ２６９５；カラム：日本ウォーターズ社製ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８ （５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）；ＵＶ検出器：Ｗａｔｅｒｓ２９９８；波長２６０ｎｍで検出）で追跡した。反応の進行終了後、重炭酸水素ナトリウム（１．４ｍｍｏｌ，１１８．４ｍｇ）を加え、中和を行い、反応を終了させた。１００ｍＭのヘキサフルオロ２−プロパノール８ｍＭトリエチルアミン緩衝溶液を用いて粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（装置名：日本分光社製ＵＶ−４０７０；カラム：日本ウォーターズ社製ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８ ＯＢＤ Ｐｒｅｐ（商標）５μｍ、１０×２５０ｍｍ）で単離し、目的物（１．２１μｍｏｌ，２５％）を得た。
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 8.14 (s, 1H, H8arom), 6.00 (d, J = 6.8 Hz, 1H, H1’), 5.00-4.96 (m, 1H, H3’), 4.92-4.89 (m, 1H, H2’), 4.59-4.58 (m, 1H, H4’), 4.26-4.20 (m, 2H, H5’and H5’’).
31P NMR (202 MHz, D2O) δ -6.91 (d, J = 19.9 Hz, 1P), -8.35 (d, J = 20.2 Hz, 1P), -10.37 (t, J = 21.3 Hz, 2P).
HRMS (ESI-TOF) calcd for C10H16N5O17P4 -, [M-H] 601.9497, found 601.9512
本発明は、ｐｐＧｐｐの効率的な製造に好適に利用することができる。
Claims (9)
- 式（Ｉ）：
式（ＩＩ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基である］
で表される化合物又はその塩から、Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5を除去する工程
を含む、製造方法。 - Ｓｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）、並びにＲ4及びＲ5を除去する前記工程が、
式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩からＲ4及びＲ5を除去して、式（ＩＩＩ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩を得る工程；及び
前記（ＩＩＩ）の化合物又はその塩からＳｉ（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）を除去して式（Ｉ）の化合物又はその塩を得る工程
から成る、請求項１に記載の製造方法。 - 式（ＩＶ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（Ｖ）：
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基であり、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、活性化剤の存在下で反応させて、式（ＶＩ）：
式（ＶI）の化合物又はその塩を酸化して、式（ＩＩ）の化合物又はその塩を得る工程；
をさらに含む、請求項１又は２に記載の製造方法。 - Ｒ1及びＲ2はメチルであり、Ｒ3はｔｅｒｔ−ブチルであり、そしてＲ4及びＲ5はベンジルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
- 式（ＶＩＩ）
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立してＣ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである
Ｒ8は、ＮＨＲ9又はＮ＝ＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）であり、
Ｒ9は塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ10及びＲ11はそれぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩に、式（ＶＩＩＩ）：
Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して塩基性条件下で除去可能な保護基、還元条件下で除去可能な保護基、又は光反応により除去可能な保護基であり、
Ｒ14及びＲ15は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであるか、あるいは、隣接する窒素原子と共に、ピロリジン環、ピペリジン環又はモルホリン環を形成する］
で表されるホスホロアミダイトを、活性化剤の存在下で反応させて、式（ＩＸ）：
式（ＩＸ）の化合物を酸化して、式（Ｘ）：
式（Ｘ）の化合物から、Ｒ9又はＣＨ-Ｎ（Ｒ10）（Ｒ11）、並びにＲ12及びＲ13を除去することによって、式（ＩＶ）の化合物又はその塩を得る工程
をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。 - Ｒ12及びＲ13は２−シアノエチルであり、Ｒ8はＮ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ3）2である、請求項５に記載の製造方法。
- 式（ＩＩ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して保護基である］
で表される化合物又はその塩。 - 式（ＩＩＩ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩。 - 式（ＩＶ）：
Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立して、Ｃ1-10アルキル又はＣ4-10シクロアルキルである］
で表される化合物又はその塩。
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