JPWO2019117057A1 - 細胞膜透過性ペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の(1)〜(3)からなる群から選択されるペプチド:
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチド;
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチド;及び
(3)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[2]配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる、[1]に記載のペプチド。
[3]配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる、[1]に記載のペプチド。
[4]配列番号3に示されるアミノ酸配列からなる、[1]に記載のペプチド。
[5][1]に記載のペプチド及び機能性分子を含む複合体。
[6][1]に記載のペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
[7][5]に記載の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、以下の(1)〜(3)からなる群より選択されるペプチドである。
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチド;
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチド;及び
(3)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
本発明の複合体は、本発明の細胞膜透過性ペプチド及び機能性分子を含む複合体である。
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド;及び
(3)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(1)配列番号33の塩基番号274から303までの塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(2)配列番号34の塩基番号274から303までの塩基配列を含むポリヌクレオチド;及び
(3)配列番号35の塩基番号274から303までの塩基配列を含むポリヌクレオチド。
本発明の発現ベクターには、本発明の細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、本発明の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター;
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター;及び
(3)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
本発明の形質転換された宿主細胞には、本発明の細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、本発明の複合体をコードする塩基配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(3)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、当該技術分野で公知のペプチド合成法、又は、公知の遺伝子工学的手法により生産することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法(Nature、2011、Vol.480、p.471−479)が挙げられる。遺伝子工学的手法としては、例えば、Methods in Enzymol.、1987、Vol.154、p.221−533及びPhilos.Trans.A Math.Phys.Eng.Sci.、2009、Vol.367、p.1705−1726などに示されるような方法を利用することができる。
本発明の複合体は、当該分野で公知の結合方法を用いて、本発明の細胞膜透過性ペプチドと機能性分子とを結合させることで、当業者により容易に生産することができる(Nucleic Acids Res.、2009、Vol.37、p.2574−2583)。
本発明の医薬組成物には、本発明の複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
[実施例]
各種細胞膜透過性ペプチド(CPP)及びEGFPを含む蛋白質(CPP−EGFP蛋白質と称する)を以下の方法で作製した。
N末端から順にNTP及びGlutathione S−transferase(GST)を融合したEGFPを含むポリペプチド(NTP−GST−EGFPと称する。配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる)をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド(配列番号7)に対して、5’末端に制限酵素KpnIサイト及び開始コドン配列を、3’末端にストップコドン配列及び制限酵素NotIサイトをそれぞれ付加したポリヌクレオチド(配列番号6)を取得した。上記ポリヌクレオチドをKpnI及びNotI(タカラバイオ)で制限酵素処理し、pEU−E01−MCSプラスミド(セルフリーサイエンス)のマルチクローニングサイト上にあるKpnI及びNotIサイトの間に挿入した。これにより得られた発現プラスミドをpEU−E01−NTP−GST−EGFPと称する。当該発現プラスミドを既存のアガロース電気泳動法及びシークエンス解析を行うことにより、所望のDNAコンストラクトがクローニングされていることを確認した。
(1)で作製した4種類の発現プラスミド(pEU−E01−NTP−GST−EGFP、pEU−E01−NTP(I8Q)−GST−EGFP、pEU−E01−NTP(C10Q)−GST−EGFP、及びpEU−E01−NTP(ICQ2)−GST−EGFP)を鋳型として、CPP−EGFP蛋白質を以下の方法で作製し、精製した。
CPP、ヒトTERT遺伝子のエンハンサーに特異的に結合するように設計された転写活性化因子様エフェクター(TALE)及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド(CPP−TALE−Activatorと称する)を以下の方法で作製した。なお陰性対照として、TALE及び転写活性化因子を含み、かつ、CPPを含まない融合ポリペプチド(以下、TALE−Activatorとも称する)を作製した。
発現プラスミドpEU−E01−MCSのマルチクローニングサイトにGSTをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド(配列番号15)、NTPをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド(配列番号14)、TEVプロテアーゼの標的ペプチド(以下TEVと表記する)をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド(配列番号16)を5’側から順に挿入した。
配列番号19に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド(TALEの一部をコードする塩基配列及びVP64(配列番号21)をコードする塩基配列を含む。ΔTALE−VP64と称する)を、(1)で作製した発現プラスミドpEU−E01−GST−NTP−TEVの、TEVをコードする塩基配列の直後にIn−Fusion(登録商標) HD Cloning Plus kitにより組み込むことで、プラスミドpEU−E01−GST−NTP−TEV−ΔTALE−VP64Vを得た。VP64のC末端にバリンが付加されているため末尾にVを付けた名称とした。
テロメラーゼのサブユニットであるヒトTERT遺伝子(Accession No.AH007699.2)の周辺配列を公知のデータベースであるEnsembl genome browserで検索した。エンハンサーとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から下流約4万bpの遺伝子領域から、Accession No.AH007699.2の塩基番号49444〜49461までの塩基配列(配列番号20に示される塩基配列)をTALEの標的塩基配列として選択した。公知の方法(Platinum Gate TALEN construction protocol(Yamamoto lab)Ver.1.0 [2017年1月26日検索]、インターネット<URL:https://www.addgene.org/static/cms/files/Platinum_Gate_protocol.pdf>)により、配列番号20に示される塩基配列に特異的に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド(配列番号22の塩基番号429〜2064までの塩基配列を含むポリヌクレオチド)を作製した。そして、T4 DNA Ligase(Quick Ligation Kit:New England BioLabs)を用いて、(2)で作製したプラスミドpEU−E01−GST−NTP−TEV−ΔTALE−VP64Vに含まれる配列番号19の塩基番号435〜889までの塩基配列からなるポリヌクレオチドを、上述の配列番号22の塩基番号429〜2064までの塩基配列からなるポリヌクレオチドに置換した。これにより、配列番号23に示されるアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド(TALE_TERT−1とも称する)をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド(配列番号22に示される塩基配列からなる)を含むプラスミドを取得した。なお、配列番号23のアミノ酸番号7〜784までのアミノ酸配列は、配列番号20に示される塩基配列に結合するように設計された、TALEのDNA結合リピート部分及びチミン結合部分を含むポリペプチド部分である。当該プラスミドをpEU−E01−GST−NTP−TEV−TALE−VP64Vと称する。
(3)で作製した発現プラスミドpEU−E01−GST−NTP−TEV−TALE−VP64Vを鋳型として、PrimeSTAR(登録商標) Max DNA Polymerase(タカラバイオ)を用いて、配列番号24及び25に示される塩基配列からなるプライマーを使用したPCR反応を行った。これにより、TALE及びVP64をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの5’末端側にSgfIサイト配列が、3’末端側にNotIサイト配列がそれぞれ付加されたポリヌクレオチドを作製した。当該ポリヌクレオチドをTALE-VP64と称する。このTALE-VP64をSgfI及びNotIで切断し、(1)で作製した発現プラスミドpEU−E01−GST−NTP−TEVの制限酵素サイトSgfI及びNotIの間に挿入し、発現プラスミドpEU−E01−GST−NTP−TEV−TALE−VP64を作製した。
(4)で作製した各種CPP−TALE−Activatorをコードする発現プラスミド(pEU−E01−GST−NTP−TEV−TALE−VPR、pEU−E01−GST−NTP8Q−TALE−VPR、pEU−E01−GST−NTP10Q−TALE−VPR及びpEU−E01−GST−NTP(ICQ2)−TALE−VPR)を鋳型として、WEPRO7240G Expression KitによりCPP−TALE−Activatorを以下の方法で作製し、精製した。
実施例4の陰性対照として、TALE及びVPRを含み、かつ、CPPを含まない融合ポリペプチド(TALE−VPRと称する)をコードする発現プラスミドを作製した。
ヒト肺がん由来細胞A549(ATCC(登録商標) CCL−185)を10%ウシ胎児血清(GEヘルスケア)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(サーモフィッシャーサイエンティフィック)含有RPMI培地(サーモフィッシャーサイエンティフィック)に懸濁し、96ウェル培養プレート(岩城硝子)に0.2×104細胞/100μL/ウェルで播種した。36時間培養後、各ウェルに実施例1で作製したNTP−GST−EGFP、NTP(I8Q)−GST−EGFP、NTP(C10Q)−GST−EGFP及びNTP(ICQ2)−GST−EGFPの各蛋白質を最終濃度30nMになるように3−3.7μLを添加した。陰性対照としてEGFP(フナコシ)を同様に最終濃度30nMになるようにリン酸緩衝生理食塩水で濃度を調整して3μL添加した。コントロールはリン酸緩衝生理食塩水のみを3μL添加した。24時間後に各ウェル100μLのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄した。上記培地を100μL添加し、オールインワン蛍光顕微鏡BZ−8100(キーエンス)を用いて、10倍拡大検鏡下でGFPによる緑色発光が見られる細胞数を計測した。計測方法は検鏡した画像から同一の一定視野における緑色発光細胞数をカウントし、これを同じく計測した視野にある総細胞数で除し、3回計測した平均値を求めることにより、上記融合蛋白質群が細胞内に透過して作用した細胞数を比較した。
実施例2で作製したCPP−TALE−Activator(NTP−TALE−VPR、NTPICQ2−TALE−VPR、NTP8Q−TALE−VPR及びNTP10Q−TALE−VPR)を微量透析カラム(トミー)でOPTIMEM培地(サーモフィッシャーサイエンティフィック)に対して4℃で3時間透析した。精製後の濃度は50nMであった。
UC−MSCを20%ウシ胎児血清(GEヘルスケア)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(サーモフィッシャーサイエンティフィック)及び2mM L−Glutamine(サーモフィッシャーサイエンティフィック)含有DMEM培地(サーモフィッシャーサイエンティフィック)(以下、20%FCS−DMEM培地と称する)に懸濁し、96ウェル透明培養プレート(岩城硝子)へ0.4×104細胞/100μL/ウェルとなるように播種した。CO2濃度5%、37℃に設定したCO2インキュベーター内で12時間静置した。20%FCS−DMEM培地で300nMに濃度調整をしたNTP−TALE−VPRを、ウェル内終濃度が0.25nMになるように添加した。また、20%FCS−DMEM培地で300nMに濃度調整をしたCPPを付加しない陰性コントロールTALE−VPRを、ウェル内終濃度が0.25、1、3、10及び30nMになるようにそれぞれ添加した。これらを37℃、CO2濃度5%のインキュベーター内で24時間静置した。なおコントロールとして何も添加しないウェルを作製した。氷冷したリン酸緩衝生理食塩水100μLで2回洗浄した後、当該培養プレートを液体窒素で処理して細胞を凍結した。
ヒトTERTのプライマーのセットとして、TERT FAM(アプライドバイオシステムズ、Hs00972648_g1)を、ヒトACTBのプライマーのセットはACTB VIC(アプライドバイオシステムズ、Hs99999903_m1)を使用した。
図3に示す通り、TALE−VPR添加群はNTP−TALE−VPR添加の場合と異なり、細胞内のヒトTERT mRNA量の顕著な増加は見られなかった。
(1)と(2)の結果、CPP−TALE−Activatorによる細胞内のヒトTERT mRNA量の増加は、CPPによる細胞膜透過性に依存することが分かった。以上より、配列番号1、2及び3に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは細胞膜透過性を有することが示された。
実施例1で作製した各CPP−EGFP蛋白質の凝集性を検討するため、GFP−FSEC法により各蛋白質の可溶画分の分析を行った。
GFP−FSEC法は、蛍光検出機を備えた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いてGFP融合蛋白質を検出する方法である。
実施例1で作製したCPP−EGFP蛋白質、すなわち、NTP−GST−EGFP、NTP(I8Q)−GST−EGFP、NTP(C10Q)−GST−EGFP及びNTP(ICQ2)−GST−EGFPの粗製試料各25μL(CPP−EGFP蛋白質5μg含有)にリン酸緩衝液75μLを加えた。1.5mLマイクロチューブ内で混合し、4℃15分間毎分回転数15,000で遠心分離し、可溶画分の分離を行った。可溶画分をそれぞれ96ウェルプレートに移し、各試料50μLをリン酸緩衝液で平衡化したカラムに順次添加した。流速は1.0 mL/minでゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。検出したGFP融合蛋白質量を分子量に沿ってシグモイド計算ソフトFSECplotter2によりグラフ化した。
結果を図4A及び図4Bに示す。NTP−GST−EGFPは可溶画分中にほぼ検出されなかった(図4B)。一方NTP(I8Q)−GST−EGFP、NTP(C10Q)−GST−EGFP及びNTP(ICQ2)−GST−EGFPは顕著に低分子量のピークが検出された。したがってNTP−GST−EGFPと比較して、NTP(C10Q)−GST−EGFP、NTP(I8Q)−GST−EGFP及びNTP(ICQ2)−GST−EGFPの溶解性が改善されたことが認められた。
また、本実施例の検出結果においては、高分子量と低分子量に2つのピークが見られた(図4A(1)−(4))。低分子量のピークが各CPP−EGFP蛋白質であり、高分子量のピークが凝集体を示している。それらのピークの蛋白質の比率を比較すると、NTP−GST−EGFPは高分子量と低分子量のピークが同程度であるのに対して、NTP(ICQ2)−GST−EGFP、NTP(I8Q)−GST−EGFP及びNTP(C10Q)−GST−EGFPは、この順でより低分子量のピークが大きく、高分子量のピークが小さいことが確認された。
以上の結果から、NTP(C10Q)−GST−EGFP、NTP(I8Q)−GST−EGFP及びNTP(ICQ2)−GST−EGFPの各蛋白質は、NTP−GST−EGFPと比較して、高分子量の凝集体の形成が低減することが示された。
上記4種の融合蛋白質のGST−EGFP部分は同一の構造であることから、本発明の細胞膜透過性ポリペプチドNTP(I8Q)、NTP(C10Q)及びNTP(ICQ2)は、NTPと比較して、融合させた蛋白質の凝集性を低減させて溶解性を改善し、融合蛋白質の生産、精製に有用な性質を付与することが認められた。
Claims (7)
- 以下の(1)〜(3)からなる群から選択されるペプチド:
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるペプチド;
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるペプチド;及び
(3)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。 - 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号3に示されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1に記載のペプチド及び機能性分子を含む複合体。
- 請求項1に記載のペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
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